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DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA

Director: Rafael Blasco Lozano Dirección: Ctra. de la Coruña Km. 7,5

28040 Madrid Teléfono: 91 347 68 85 Fax: 91 357 31 07 Correo electrónico: secbiotec@inia.es

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PERSONAL DEL DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA

Personal en plantilla Personal Contratado Blasco Lozano, Rafael Director Alonso Blanco, Carlos Ramón y Cajal Coll Morales, Julio Investigador A1 Arroyo García, Rosa Adela Ramón y Cajal Ponz Ascaso, Fernando Investigador A1 Pelaz Herrero, Soraya Ramón y Cajal Domínguez Juncal, Fco. Javier Investigador A2 Revilla Calvo, Mª Concepción Ramón y Cajal Martínez Escribano, José Angel Investigador A2 Canto Nogues, Carmen Titulado Superior Salinas Muñoz, Julio Investigador A2 Catala Rodríguez, Rafael Titulado Superior Soler Llinares, Consuelo Investigador A2 Chamorro Pérez, Sonia Titulado Superior Alonso Marti, Carmen C. Investigador A2 Escribano Romero, Estela Titulado Superior Alonso Moreno, Fernando Investigador A2 Feito Castellano, Mª José Titulado Superior Ezquerra Martínez, Angel Investigador A3 Galindo Barreales, Inmaculada Titulado Superior Fresno Pérez, Jesús Investigador A3 García Cantalejo, Jesús Manuel Titulado Superior Ley Vega de Seoane, Victoria Investigador A3 Gómez Hernández, Nuria Titulado Superior Sánchez Sánchez, Florentina Investigador A3 Jiménez Clavero, Miguel Angel Titulado Superior Torres Pascual, José Vicente Investigador A3 López Cobollo, Rosa María Titulado Superior Jarillo Quiroga, José Antonio Investigador A3 López Fraga, Marta Titulado Superior Piñeiro Galvín, Manuel Angel Investigador A3 Moreno Mozo, Juan Ignacio Titulado Superior Saiz Calahorra, Juan Carlos Investigador A3 Pérez Filgueira, Daniel M. Titulado Superior Pozo Benito, Juan Carlos Investigador Resino Talavan, Paloma Titulado Superior Monte Herraiz, Juan Vicente Investigador N22 Rocha Roso, Ana Isabel Titulado Superior Medina Alcázar, Joaquín Téc. Superior Espec. Sánchez Puig, Juana Mª Titulado Superior Casanova Pena, Carlos Técnico esp. Grad. Med Terrada Mayor, Estela Titulado Superior Martínez de la Riva, Paloma Técnico esp. Grd. Med Titarenko Ivanova, Elena Titulado Superior Miguel Casado, Eugenio José Especialista Tecn.

Invest. Touriño Fernández, Mª Angeles Titulado Superior

Díaz Gil, Mª Gema Titulado Superior Ruiz Montejano, Sandra Técnico Superior N3 Muñoz Plaza, Alfonso Técnico Superior N3 Alvarez Vega, Mª Belen Titulado Medio Rodríguez Méndez, Esperanza Ayudante Técnico Zambrana Quesada,

Encarnación Titulado Medio

Núñez del Castillo, Carolina P. Ayudante Técnico Escudero Pérez, Eloisa Auxiliar Redondo Moreno, Adela Ayudante Laboratorio San Martín González, David Auxiliar Sánchez Navarrete, Pedro Ayudante González Gonzalez , Fermín Ayudante Serv. Generls García Mullor, Tomás Javier Auxiliar Calvo Gutiérrez, Margarita Oficial Becarios

Ballesteros Jareño, Mª. Luisa Postdoctoral CM Matesanz Rodríguez, Ruth Predoctoral INIA García Briones, Mercedes Postdoctoral CM Montes Barberá, Mónica Predoctoral INIA García-Gallo Pinto, Mónica Postdoctoral INIA Novillo Zaragoza, Fernando Predoctoral INIA Díaz García, Nardy del Valle Postdoctoral INIA Perdiguero de la Torre, Beatriz Predoctoral INIA Lunello, Pablo Postdoct CONICET Pérez Martín, Carlos Predoctoral INIA Oliverio Peppe, Karina Postdoct F. Carolina Rodríguez de la Rosa, Lourdes Predoctoral INIA Córdoba García, Laura Predoctoral INIA Lázaro Somoza, Ana Predoctoral MEC Del Olmo Montoro, Iván Predoctoral INIA Matesaz Rodríguez, Ruth Predoctoral MEC Gíl Dons, Félix Predoctoral INIA Moral Darde, Verónica Predoctoral MEC Hernáez de la Plaza, Bruno Predoctoral INIA Quetglas Mas, José I. Predoctoral MEC Hernández Verdejo, Tomasa Predoctoral INIA Gómez de Nova, Pedro J. Tecnólogo INIA Jiménez Gómez, José Mª. Predoctoral INIA Pérez Rivera, Gemma M. Tecnólogo INIA López González, Leticia Predoctoral INIA Rubio González, Vicente FINNOVA CM Mansilla Mansilla, Carmen Predoctoral INIA

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OBJETIVOS GENERALES DEL DEPARTAMENTO El departamento de Biotecnología incluye grupos de investigación que comparten la característica común de la utilización de técnicas genéticas o moleculares para conseguir objetivos innovadores aplicables a la producción agraria o industrial. El Departamento tiene dos grandes ámbitos de actuación, que se agrupan en torno al tipo de organismos usados: animales o vegetales. Así, dentro del ámbito “animal” tenemos líneas de investigación enfocadas al estudio de peces como biofactorías, líneas de trabajo centradas en virus animales, en vacunas, en la inmunología de especies ganaderas, o en el uso de virus animales como marcadores medioambientales. Dentro del ámbito “vegetal”, contamos con líneas de investigación centradas en la genética del control de la floración y de la resistencia en el estrés ambiental, y líneas de trabajo enfocadas al estudio de la función de la ruta de la ubiquitina en plantas; por su parte, otros grupos están centrados en el estudio de virus vegetales y en su aplicación para la producción de proteínas, en estudios de epidemiología y genética de poblaciones o en el posible uso de plantas como biofactorías. De igual manera, contamos con grupos implicados en la mejora genética especies vegetales como la vid, el trigo o de gramíneas silvestres españolas, para poder ser utilizadas en temas de revegetación.

GRUPOS DE INVESTIGACIÓN Peces transgénicos Poxvirus Inmunología Apoptosis Virus y contaminación ambiental Vacunas Evolución y epidemiología molecular Virus vegetales Tolerancia al estrés medioambiental Unidad de mejora genética vegetal Control genético del tiempo de floración Biología reproductiva de plantas Ciclo celular/ruta de la ubiquitina Mejora genética de la vid

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GRUPO PECES TRANSGENICOS

COMPONENTES Coll Morales, Julio Rocha Roso, Ana Isabel Ruiz Montejano, Sandra Correo electrónico: juliocoll@inia.es

OBJETIVOS

• Mejora de vectores (promotores y transposones) para vacunación DNA en peces

• Métodos de transferencia en masa para transferencia de vectores a peces • Obtención de vectores para microalgas Dunaliellas

PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I

• Vacunas DNA • Peces transgénicos • Transformación de microalgas Dunaliella

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PROYECTOS Código y título: RTA03-217. Biotecnología de peces: Mejora de la transfección y transformación de sus líneas celulares Entidad financiadora: INIA Duración: 2003-2005 Investigador responsable: Coll Morales, Julio Resumen objetivos: Estudiar la transfección y transformación de células de pez con genes marcadores y varios vectores para mejorar la vacunación DNA en peces Principales resultados: Se han obtenido por subclonajes en el plásmido pMCV1.4 y en el transposón "sleeping beauty", vectores de expresión transitoria codificando para el antibiótico neomicina. Se han subclonado en varios vectores SB (pT1, pT2 y pT3) los genes de Betagalactosidasa, puromicina, defensinas humanas hNP1 y proteína G de VHSV. Resultados preliminares apuntan a que en EPC existen transposasas activas, lo que sería de gran interes práctico para aumentar la duración de las vacunas DNA. Se han mejorado los métodos de subclonaje, producción, amplificación de plásmidos con una mayor pureza empleando columnas de vidrio diseñadas en el laboratorio. Se han completado 2 Patentes para su aplicación al campo de las vacunas DNA en Acuicultura y presentado brillantemente una tesis doctoral (Dra.Ana Rocha Roso) que se ha presentado a los premios SYVA del 2005. Código y título: CPE03-016-C4. Tecnologías de peces como biofactorias: Metodos de selección, transferencia genética en masa, métodos inducibles y expresión en mucus de defensinas humanas en peces de importancia económica en España Entidad financiadora: Plan estratégico INIA Duración: 2003-2007 Investigador responsable: Coll Morales, Julio Resumen objetivos: Optimizar el uso de transposones como vectores de peces, transfectar células de trucha, clonar defensinas humanas hNP1 y estudiar diferentes métodos de transferencia genética a embriones del pez cebra en masa Principales resultados: Se está optimizado la electroporación de EPC como método alternativo al uso de los liposomas. Aunque hasta ahora se han conseguido eficiencias de transfección menores que con liposomas, se espera optimizar estos datos con el uso de la electroporación con ondas de radiofrecuencia y extender estos métodos a la línea celular de trucha RTG2 mucho más difícil de transfectar. A pesar de su interés práctico, no existe actualmente ninguna línea celular de trucha que se pueda transfectar, muy probablemente debido a las bajas temperaturas que requieren. Se han producido y clonado líneas celulares de EPC expresando el gen de la resistencia a la neomicina y puromicina. Se espera producir clones expresando proteína G de VHSV y defensinas humanas mediante co-transformación con los plásmidos correspondientes y pMVC1.4-pac, pT1SVneo, pT2SVneo y pT3SVneo. Se ha puesto a punto un método sencillo de obtención de embriones de pez cebra con un mínimo de dedicación personal. Actualmente con 6 acuarios y unos 30-40 peces la producción obtenida es de unos 1000 embriones por semana. Todavía se trabaja en mejorar el rendimiento y la reproducibilidad así como la supervivencia de los embriones hasta la eclosión evitando contaminaciones. Se siguen realizando algunos experimentos preliminares de expresión temporal de ß-galactosidasa en embriones de 5 días utilizando como método de transferencia de DNA (pMCV1.4- ßgalactosidasa) y la electroporación con radiofrecuencia.

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PUBLICACIONES

Artículos en revistas SCI Rocha, A., Ruiz, S., Estepa, A. y Coll, J.M. Review on the application of inducible and targeted gene-strategies to produce transgenic fish. Journal Marine Biotechnology. 6(2004)118-127 Mas, V., Rocha, A., Perez, L., Coll, J.M. y Estepa, A. Reversible unhibition of spreading of infection and imbalance of viral protein accumulation at low pH in viral haemorrhagic septicemia rhabdovirus, a salmonid rhabdovirus. Journal Virology. 78 (2004)1936-1944 Rocha, A., Ruiz, S., y Coll, J.M. Characterization of the syncytia formed by VHS salmonid rhabdovirus G-gene transfected cells. Veterinay Immunolgy Immunopathology 99 (2004) 143-152 Rocha, A., Ruiz, S., y Coll, J.M. Mutational analysis around the phospholipid-binding domain of viral haemorrhagic septicemia fish rhabdovirus. Journal Virology. 78(2004)9115-9122 Patentes

• Coll, J.M. (2004) Genes G mutantes del virus de la septicemia hemorrágica de la trucha (VHSV) y aplicaciones. Patentes nº200402092.

• Coll, J.M. (2004) Construcción génica, vector y vacuna ADN para la vacunación de animales acuáticos Patentes nº200402093.

Tesis doctoral "Caracterización y localización de la región de fusión del rabdovirus de la septicemia hemorrágica de la trucha" Ana Rocha Roso. Universidad Complutense de Madrid 2004. Sobresaliente cum laude.

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GRUPO POXVIRUS COMPONENTES Blasco Lozano, Rafael Galindo Barreales, Inmaculada Matesanz Rodríguez, Ruth Nuñez del Castillo, Carolina Perdiguero de la Torre, Beatriz Rodríguez de la Rosa, Lourdes Sánchez-Puig, Juana María Correo electrónico: blasco@inia.es

OBJETIVOS El objetivo primordial del grupo es entender con detalle los mecanismos que operan en la biogénesis y la función de la envuelta en el contexto de la infección, y aplicar ese conocimiento al desarrollo de vectores vacunales más seguros e inmunogénicos. Asímismo, trabajamos en el desarrollo y optimización de estrategias de expresión genética y selección en poxvirus recombinantes. Las funciones desempeñadas por la envuelta de los Poxvirus son muy importantes a nivel del ciclo natural de infección, puesto que la envuelta determina en gran medida la transmisibilidad e inmunogenicidad del virus. Aunque se conocen con detalle los componentes de ésta membrana, se ha definido sólo parcialmente el papel que la envuelta en conjunto y cada proteína en particular juega en diferentes procesos, incluyendo 1) el envolvimiento del virus, 2) el transporte intracelular, 3) la inducción de colas de actina 4) la liberación del virus al espacio extracelular y 5) la unión a la célula y la modulación de la entrada del virus.

PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I

• Caracterización del proceso de morfogénesis y transmisión de los Poxvirus • Modulación de la transmisibilidad de los Poxvirus mediante aproximaciones

genéticas • Mejora de vectores vacunales basados en Poxvirus • Desarrollo de vectores de expresión eucarióticos

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PROYECTOS Código y título: RTA02-029 Optimización de vectores vacunales basados en Poxvirus: modulación genética de la transmisibilidad del virus. Entidad financiadora: INIA Duración: 2001-2004 Investigador responsable: Blasco Lozano, Rafael Resumen objetivos:

• Identificación de nuevos genes involucrados en la transmisión del virus célula a célula por mutagénesis al azar.

• Mutagénesis dirigida de la proteína mayoritaria de la envuelta viral, codificada por el gen F13L

• Estudio de la contribución de diferentes proteínas de la envuelta en el transporte y la transmisión de partículas virales célula a célula.

• Generación de proteínas de fusión con las proteínas B5R y F13L para el anclaje de antígenos en la envuelta viral.

Principales resultados: Se ha llevado a cabo un estudio de la transmisión célula a célula del virus vaccinia, utilizando mutagénesis al azar. De esta manera se han aislado y caracterizado una serie de virus mutantes que están afectados en su capacidad de producir placas de lisis (mutantes de placa pequeña). Se han localizado mutaciones en los genes B5R, F13L, A34R y A27L. Asímismo, se han generado mutantes que contienen mutaciones dentro del gen F13L. Se ha estudiado la capacidad que tienen dichos mutantes para llevar a cabo la adquisición de la envuelta, el transporte intracelular del virus y su transmisión a las células adyacentes. Finalmente, se ha evaluado la posibilidad de anclar antígenos en la partícula viral, mediante la generación de una serie de proteínas de fusión con proteínas de la envuelta. Todos estos resultados pueden redundar en vectores vacunales más atenuados, a la vez que más inmunogénicos.

Código y título: BMC 2002-03047 Aproximaciones genéticas a la modificación de vectores basados en el virus vaccinia. Entidad financiadora: Programa Nacional I+D+I Duración: 2002-2005 Investigador responsable: Blasco Lozano, Rafael Resumen objetivos:

• Mutagénesis al azar del genoma de vaccinia por inserción de transposones y estudio de virus mutantes de placa pequeña.

• Interacciones entre proteínas de la envuelta viral. • Amplificación de la expresión de un gen exógeno.

Principales resultados: Se ha evaluado la posibilidad de utilizar transposones para llevar a cabo una mutagénesis al azar en el genoma del virus vaccinia. La transposasa se localizó en el nucleo, por lo que, dado que la replicación del DNA viral es citoplasmática, no resulta factible la utilización de la misma. Por otro lado, se ha estudiado la contribución de las proteínas de la envuelta del virus extracelular en el transporte del virus envuelto. Es de destacar que la presencia de las proteínas A33R y A34R es necesaria para la incorporación de las proteínas F13L y B5R, respectivamente, en la envuelta. Se han identificado y caracterizado las interacciones A33R:B5R y A34R:B5R, y su importancia funcional para el correcto ensamblaje y función de la envuelta. Finalmente, se ha conseguido la expresión de proteínas exógenas, mediada por replicones de alfavirus, a partir de vaccinia recombinantes. Esta expresión permite producir una amplificación de la expresión del gen exógeno.

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Código y título: QLK2-CT-2002-01867 Increasing the potency of vaccinia MVA vaccines. Entidad financiadora: Unión Europeoa Duración: 2002-2005. Investigador responsable: Blasco Lozano, Rafael Resumen objetivos: Caracterización del rango de huésped y la morfogénesis en la cepa MVA de vaccinia Anclaje de antígenos en la envuelta del virus y su inmunogenicidad Principales resultados: Hemos construido virus vaccinia recombinantes que expresan GFP, y comprobado que se visualizan de forma muy sensible utilizando fluorescencia en cultivos celulares. Hemos demostrado la utilidad de éstos virus en estudios de tropismo, puesto que la fluorescencia en la célula infectada puede detectarse fácilmente en combinación con marcadores celulares utilizando citometría de flujo. Así, hemos determinado que en la infección de leucocitos de sangre periférica, las poblaciones más susceptibles son los monocitos, seguidos por las células B y NK. Hemos estudiado el efecto de anclar antígenos a la partícula viral, para lo que se han evaluado proteínas de fusión con proteínas de la envuelta del EEV (B5R o F13L) o de la envuelta del IMV (H3L). Nuestros resultados indican que la fusión a las proteína F13L o H3L aumentan significativamente la respuesta de anticuerpos inducida en el modelo de ratón. Por otro lado, la fusión con la proteína B5R aumenta la respuesta T en comparación con la expresión de la proteína exógena soluble. Estos resultados demuestran que la localización del antígeno modula de forma significativa la respuesta inmune inducida.

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PUBLICACIONES

Artículos en revistas SCI Lorenzo, M.M., Galindo, I., and Blasco, R. (2004). Construction and Isolation of recombinant vaccinia virus using genetic markers. Methods in Molecular Biology, 269, 15-30. Sanchez-Puig, J.M. Sánchez, L. Roy, G. and Blasco, R. (2004) Susceptibility of different leukocyte cell types to vaccinia virus infection. Virology J 2004, 1:10. Nº de ponencias, comunicaciones y poster publicados: 6 Tesis doctorales “Avances en la modulación de la expresión génica en virus vaccinia recombinantes” Juana María Sanchez Puig. Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Complutense de Madrid, 2003. Sobresaliente Cum Laude. “Análisis de las interacciones entre proteínas de la envuelta del virus vaccinia” Beatriz Perdiguero de la Torre. Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma de Madrid, 2004. Sobresaliente Cum Laude. Patentes “Virus ADN recombinante que comprenden un ADN complementario de un replicón de un virus ARN y sus aplicaciones” Número de solicitud P200301545 Fecha de presentación : 3 Julio 2003 Inventores: Juana María Sánchez Puig, María del Mar Lorenzo Gilsanz y Rafael Blasco Solicitante : INIA

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GRUPO INMUNOLOGÍA COMPONENTES Alonso Moreno, Fernando Alvarez Vega, Belén Cantó Nogués, Carmen Chamorro Pérez, Sonia Domínguez Juncal, Francisco Javier Ezquerra Martínez, Angel García Briones, Mercedes López Fraga, Marta Martínez de la Riva, Paloma Pérez Martín, Carlos Revilla Calvo, Concepción Correo electrónico: ezquerr@inia.es

OBJETIVOS

• Caracterización fenotípica y funcional de subpoblaciones de monocitos porcinos y de células dendríticas derivadas de estos

• Desarrollo de anticuerpos monoclonales frente receptores de membrana de macrófagos y células dendríticas porcinos

• Clonación de quimioquinas porcinas y evaluación de su potencial inmunomodulador en vacunas DNA

• Clonación y caracterización de receptores Toll-like porcinos • Caracterización fenotípica y funcional de subpoblaciones de linfocitos CD4,

definidas con el marcador 2E3

PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I

Inmunología porcina • Caracterización de receptores de leucocitos porcinos • Mecanismos inmunitarios implicados en protección frente infecciones

víricas. Mecanismos de evasión del patógeno. Inmunopatología • Desarrollo de estrategias que incrementen la inmunogenicidad de las

vacunas. Uso de moléculas coestimuladoras, citocinas y quimioquinas. Aplicación de receptores y ligandos de APCs para dirigir antígenos

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PROYECTOS Código y título: BIO2000-1636-C02-01 Análisis y caracterización de antígenos de diferenciación porcinos (II). Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I Duración: 2000-2003 Investigador responsable: Domínguez Juncal, Francisco Javier Resumen objetivos: Caracterización de receptores de macrófagos y células dendríticas porcinas Principales resultados: Se han clonado y caracterizado a nivel molecular los ortólogos porcinos de CD172a (correspondiente al marcador de referencia mielomonocitico SWC3) y CD107a (LAMP-1), reconocidos por los Acmo BL1H7 y 4E9/11 respectivamente. Se han identificado cuatro subpoblaciones de monocitos porcinos mediante el análisis simultáneo de los marcadores SWC3, CD163, SLA-II y CD14. Estas poblaciones difieren en la expresión de moléculas de adhesión, moléculas coestimuladoras, capacidad de producción de TNF-α y en su susceptibilidad a la infección por el virus de la Peste porcina africana. Se han caracterizado fenotípica y funcionalmente las células dendríticas porcinas derivadas de esta poblaciones de monocitos. Las DC derivadas de los monocitos CD163+ son mas eficientes que las derivadas de las células CD163- presentando antígenos de recuerdo y aloantígenos a los linfocitos T. Esta mayor eficiencia se correlaciona con una expresión mayor de moléculas SLA II y coestimuladoras.

Código y título: AGL2000-1488 Caracterización de las células porcinas infectadas por el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (SRRP) efecto sobre su función. Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I Duración: 2000-2003 Investigador responsable: Alonso Moreno, Fernando Resumen objetivos:

• Estudio de la susceptibilidad de distintas poblaciones macrofágicas porcinas a la infección por el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino.

• Estudio del efecto de la infección sobre la función del macrófago porcino. • Estudio de la modulación de marcadores porcinos por el virus del síndrome

reproductivo y respiratorio porcino. Principales resultados: El macrófago alveolar porcino es la célula diana principal del virus del SRRP, aunque otras células del sistema mononuclear-fagocítico pueden también infectarse de forma minoritaria. La presencia de sialoadhesina en la superficie celular parece ser un factor determinante. El virus del SRRP interfiere con la capacidad del macrófago alveolar porcino para producir las citoquinas inflamatorias TNF-α, IL-1β y MIP-1β en respuesta a un estímulo como el PMA. El TNF-α ejerce un efecto antivírico in vitro, reduciendo la progenie viral en casi 2 logaritmos. El virus del SRRP induce un efecto inhibidor sobre la capacidad fagocítica y sobre la actividad oxidativa (producción de radicales de oxígeno) del macrófago alveolar porcino. También reduce la expresión de los antígenos de histocompatibilidad de clase I en los macrófagos alveolares porcinos infectados. El anticuerpo monoclonal 3B11/11, que reconoce al homólogo porcino de la sialoadhesina, inhibe la infección de los macrófagos alveolares porcinos por el virus del SRRP. La distribución tisular de la sialoadhesina coincide con la de las células susceptibles a ser infectadas por este virus.

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Código y título: BIO2000-0054-P4-03 Clonaje y expresión de quimioquinas porcinas: su utilización como inmunomoduladores en vacunas de DNA en el cerdo. Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I Duración: 2001-2004 Investigador responsable: Domínguez Juncal, Francisco Javier Resumen objetivos: Clonaje y expresión de quimioquinas porcinas y evaluación de su potencial inmunomodulador en vacunas DNA. Principales resultados: Se han clonado en el plásmido pcDNA3.1 los ortólogos de las quimioquinas MIP-1β (CCL4), SDF-1 (CXCL12), MIP-3α(CCL20) y SLC (CCL21), y se ha confirmado su expresión (como moléculas de fusión con GFP) por Western blot y citometria de flujo. También se ha analizado su actividad biológica en ensayos de migración de PBMC y DCs. Las secuencias de estas quimioquinas presentan una homología mayor, tanto en nucleótidos como en aminoácidos, con las secuencias humanas que con las de rata o ratón. La capacidad adyuvante de estas quimioquinas se evaluó en un modelo de inmunización con DNA utilizando como inmunógeno, plásmidos que codifican las proteínas GP4 y N del virus PRRS. La adición de las construcciones de MIP-3α (CCL20) y SDF-1 (CXCL12) incrementaba de forma significativa los niveles de anticuerpos específicos frente al virus, mientras que con pSLC se obtuvo una mejor respuesta proliferativa. Código y título: AGL2000-1441 Análisis estructural y funcional del antigeno de diferenciacion porcino CD163: identificacion de ligandos. Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I Duración: 2001-2004 Investigador responsable: Ezquerra Martínez, Angel Resumen objetivos:

• Obtención de formas solubles de la molécula reconocida por el anticuerpo 2A10.

• Obtención de anticuerpos monoclonales frente a las moléculas aisladas. • Búsqueda de ligandos celulares y las moléculas de VPPA • Caracterización molecular de los ligandos del CD163 • Análisis de la expresión de las variantes de CD163 en tejidos porcinos.

Principales resultados: • Establecimiento de líneas celulares transfectadas con los genes de los

antígenos CD163 y CD107a porcinos. • Clonaje, secuenciación y caracterización molecular del gen del antígeno

CD107a porcino. • Obtención de anticuerpos monoclonales frente a dos epítopos diferentes de

CD163 porcino y puesta a punto de un ELISA para detección y cuantificación de esta molécula.

• Caracterización de una variante molecular del antígeno CD163 porcino. • Obtención de clones de baculovirus con el segmento que codifica la porción

extracelular del antígeno CD163 porcino y su proteína de fusión con GFP, para la obtención de cantidades suficientes de estos polipéptidos para su uso como reactivos para la identificación y caracterización de ligandos.

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Código y título: PTR-1995-0573-OP Desarrollo de anticuerpos monoclonales frente a antígenos de diferenciación de leucocitos porcinos. Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I PETRI Duración: 2002-2004 Investigador responsable: Dominguez Juncal, Francisco Javier Resumen objetivos: Desarrollar Acmo frente antígenos de activación de leucocitos porcinos y finalizar la caracterización de Acmo frente antígenos de diferenciación obtenidos en proyectos previos, con vistas a su comercialización. Principales resultados: Se ha transferido a BIOVET-UCO para su comercialización una colección de hibridomas productores de Acmo frente SLA I, SLA-DR, SLA-DQ, CD5, CD11a, CD11R3, CD18, CD25, CD45, CD45RA, CD46, CD107a, CD163, SWC3, SWC7, y otros antígenos con expresión restringida a monocitos/macrófagos o de activación cuyo ortólogo humano o murino no ha podido ser identificado. Se ha caracterizado un Acmo (2E3) que reconoce una molécula restringida a una subpoblación de linfocitos CD4+ en sangre periférica. Los análisis fenotípicos y funcionales indican que la población CD4+2E3+, aunque incluye una proporción importante de células CD4+CD8α+, está integrada por células “naive”, mientras que dentro de la población CD4+2E3- se localizan las células efectoras o de memoria. Esta población CD4+2E3- presenta, a su vez, cierto grado de heterogeneidad cuando se analiza la expresión de marcadores como CD8α, CD45RA o SLA-II. Esta heterogeneidad parece reflejar la existencia de diferentes estadios en el desarrollo de las células de memoria, aunque también puede corresponderse con una diversidad funcional.

Código y título: RTA03-215 Clonaje y caracterización de los receptores “Toll like” porcinos. Entidad financiadora: INIA Duración: 2003-2005 Investigador responsable: Dominguez Juncal, Francisco Javier Resumen objetivos:

• Clonación, expresión y caracterización de los genes que codifican el TLR2, TLR4, TLR6 y TLR9 porcinos

• Producción y caracterización de Acmo frente estos receptores • Estudio de la expresión y función de estos receptores en poblaciones

leucocitarias. Principales resultados:

• Clonación en diferentes plámidos de las secuencias completas de TLR2, TLR4, TLR6, TLR9 y MD2 porcinos.

• Obtención de baculovirus recombinantes que expresan la región correspondiente al ectodominio del TLR4 fusionado al epítopo V5 y a una cola de histidinas.

• Caracterización de la expresión de estos TLRs en diferentes tejidos porcinos y poblaciones leucocitarias por RT-PCR.

• Obtención de transfectantes estables de TLR2 en la línea CHO • Inmunización de ratones con TLR2 y TLR4 y puesta a punto de un sistema

de “screening” para la obtención de Acmo.

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CONVENIOS Código y título: CC01-0035. Convenio para la transferencia de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales frente antígenos de diferenciación de leucocitos porcinos, inmunoglobulinas de trucha y virus de la IPN Entidad financiadora: INIA, BIOVET-UCO Duración: 1996-2003 Investigador responsable: Domínguez Juncal, Francisco Javier Resumen objetivos: Transferencia de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales frente antígenos de diferenciación de leucocitos porcinos, inmunoglobulinas de trucha y virus de la IPN.

CONTRATOS Código y título: CON03-010. Investigación y desarrollo de agentes terapeúticos y de diagnóstico en dos patologías porcinas de gran importancia técnica y económica: 1) Síndrome Respiratorio y Reproductor Porcino (PRRS) y 2) Disentería Porcina. Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I PROFIT Duración: 2003- 2006 Investigador responsable: Alonso Moreno, Fernando Resumen objetivos: Construcción de VLPs quiméricas de parvovirus con epítopos de la proteína GP5 del virus del SRRP implicados en una respuesta inmune protectora frente al virus. Código y título: CON04-020 Agreement between INIA and SEROTEC to regulate the production and commercial exploitation of monoclonal antibodies against porcine leukocyte differentiation antigens. Entidad financiadora: INIA, SEROTEC Duración: 2004-2007 Investigador responsable: Dominguez Juncal, Francisco Javier Resumen objetivos: Regular la elaboración y explotación comercial de anticuerpos monoclonales frente antigenos de diferenciación de leucocitos porcinos.

PARTICIPACIÓN EN PROYECTOS LIDERADOS POR OTRAS INSTITUCIONES Código y título: QLK2-CT-2002-01304 Optimizing DNA based vaccination against FMDV in sheep and pigs Entidad financiadora: UE Duración: 2002-2005 Investigador responsable: Bernard Charley, Francisco Sobrino Resumen objetivos: Desarrollo de una vacuna DNA para fiebre aftosa basada en la utilización de minigenes que codifican epitopos T y B del VFA asociados a señales que los dirigen a diferentes compartimentos celulares.

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PUBLICACIONES

Artículos en revistas SCI N. Domenech, M.P. Rodríguez-Carreño, M. P. Filgueira, B. Alvarez, S. Chamorro, J. Domínguez. 2003.Identification of porcine macrophages with monoclonal antibodies in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Vet. Immunol. Immunopathol. 94, 77-81. N. Domenech, B. Alvarez, R. Bullido, F. Alonso, A. Ezquerra, J. Domínguez. 2003.A new epitope on swine CD5 molecule detected by monoclonal antibody 5F12/9. Hybridoma and Hybridomics. 22, 179-182. F. Chianini, N. Majó, J. Segalés, J. Domínguez, M. Domingo. 2003.Immunohistological characterisation of PCV2 associate lesions in lymphoid and non-lymphoid tissues of pigs with natural postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). Vet. Immunol. Immunopathol. 94, 63-75. C. Sánchez-Torres, P. Gómez-Puertas, M. Gómez del Moral, F. Alonso, J.M. Escribano, A. Ezquerra, J. Domínguez. 2003. Expression of porcine CD163 on monocytes/macrophages correlates with permissiveness to African swine fever infection. Arch. Virol. 148, 2307-2323. C. Revilla, M.P. Rodríguez-Carreño, B. Alvarez, S. Chamorro, L.M. Alonso, A. Ezquerra, F. Alonso, J. Domínguez. 2004. 2E3, a new marker that selectively identifies porcine CD4+ naive T cells. Dev. Comp. Immunol. 28, 229-237. J. Segalés, M. Domingo, F. Chianini, N. Majó, J. Domínguez, L. Darwich, E. Mateu. 2004. Immunosuppression in postweaning multisystemic wasting syndrome affected pigs. Vet. Microbiol. 98, 151-158. N. Domenech, R. Bullido, B. Alvarez, E. Campos, MP. Rodríguez-Carreño, M. Gómez del Moral, F. Alonso, , A. Ezquerra, J. Domínguez. 2004. Characterization of a novel activation antigen on porcine lymphocytes recognized by monoclonal antibody 5A6/8. Res. Vet. 35, 339-348. E. Campos, C. Revilla, S. Chamorro, B. Alvarez, , A. Ezquerra, J. Domínguez, F. Alonso. 2004. In vitro effect of classical swine fever virus on a porcine aortic endothelial cell line. Res. Vet. 35, 625-633. S. Chamorro, C. Revilla, N. Gomez, B. Alvarez, , F. Alonso, A. Ezquerra, J. Domínguez. 2004. In vitro differentiation of porcine blood CD163- and CD163+ monocytes into functional dendritic cells. Immunobiology, 209, 57-65.

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Tesis doctorales Título: Interacciones del virus de la peste porcina clásica con las células del sistema inmune porcino Doctorando: Emilia Campos Ramos Director: Fernando Alonso Moreno Universidad: Complutense de Madrid Facultad/Escuela: Veterinaria Calificación: Sobresaliente “cum laude” Fecha: 2003-02-01 Secuencias de genes depositadas en bases de datos

1. AJ577084 Sus scrofa mRNA for putative CCL20 chemokine (CCL20 gene) gi—

57283132— emb—AJ577084.1— SSC577084 [57283132] 2. AJ577083 Sus scrofa mRNA for putative CXCL12 chemokine (CXCL12 gene)

gi—57283130— emb—AJ577083.1— SSC577083 [57283130] 3. AJ544724 Sus scrofa mRNA for swine workshop cluster 3 antigen precursor (swc3

gene) gi—57283100— emb—AJ544724.1— SSC544724 [57283100] 4. AJ620414 Sus scrofa mRNA for lysosome-associated membrane glycoprotein 1

(LAMP=1 gene) gi—57282793— emb—AJ620414.1— [57282793] 5. AJ585194 Sus scrofa mRNA for putative CCL21 chemokine (CCL21 gene) gi—

57282610— emb—AJ585194.1— [57282610] 6. AJ851240 Sus scrofa partial mRNA for C-X-C chemokine receptor type 3 (CXCR3

gene) gi—54606510— emb—AJ851240.1— [54606510] 7. AJ628065 Sus scrofa mRNA for Toll-like receptor 4 (TLR4 gene).

OTRAS ACTIVIDADES

Cursos Inmunología porcina. XII Curso Internacional sobre Enfermedades exóticas animales. Centro de Investigación en Sanidad Animal (INIA). Valdeolmos (Madrid), Noviembre 2003 (Javier Domínguez) Enzimoinmunoensayos: Fundamentos y aplicaciones en la cuantificación de citoquinas, metaloproteasas y prostaglandinas Curso de Biología Molecular para Médicos-Residentes. Hospital Juan Canalejo. A Coruña Noviembre 2003. (Javier Domínguez) Inmunología porcina. XIII Curso Internacional sobre Enfermedades exóticas animales. Centro de Investigación en Sanidad Animal (INIA). Valdeolmos (Madrid), Noviembre 2004 (Javier Domínguez) Curso de Doctorado (UCM): TEMAS DE INVESTIGACIÓN EN INMUNOLOGÍA. Inmunología Porcina. Marzo 2003 (Angel Ezquerra)

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GRUPO APOPTOSIS COMPONENTES Alonso Martí, Carmen Covadonga Díaz Gil, Gema García–Gallo Pinto, Mónica Hernáez de la Plaza, Bruno Quetglas Mas, Jose Ignacio Correo electrónico: calonso@inia.es

OBJETIVOS • Conocer los mecanismos de entrada y salida en la célula de diversos virus

animales, entre ellos el virus de la Peste porcina africana (VPPA) • Establecer los mecanismos de interacción virus-célula responsables de la

patogénesis inducida por los virus • Definición de dianas terapéuticas y diseño de inhibidores de transporte para

el bloqueo de la infección viral

PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I

• Estudio de los mecanismos moleculares de patogenicidad de virus animales • Estudios proteómicos de la interacción virus-célula • Mecanismos de regulación de la apoptosis por virus • Aplicaciones biotecnológicas de los genes víricos. Vías de la apoptosis como

dianas terapeúticas.

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PROYECTOS Código y título: BIO2004-00690. Estudio de las interacciones patógeno- hospedador del virus de la Peste porcina africana mediante técnicas de proteómica y microscopía confocal. Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I Duración: 2004-2005 Investigador responsable: Alonso Martí, Carmen Covadonga Resumen objetivos: El análisis de las interacciones entre las proteínas del virus y determinados sistemas celulares, permiten una caracterización de la regulación específica del virus de dichos sistemas como son el equilibrio celular redox, las proteínas de choque térmico y la regulación de la apoptosis. Partimos de la hipótesis de que estas proteínas pueden permitirnos conocer los mecanismos moleculares de la patogénesis del virus y constituir dianas para silenciamiento génico mediante siRNA con efectos esperables sobre la replicación vírica, sobre la inducción de la apoptosis por el virus y sobre la patogénesis que este agente produce. Principales resultados: Se ha caracterizado la p54 como la primera proteína del VPPA inductora de apoptosis, aunque se sabe que la muerte celular por apoptosis es uno de los eventos patogénicos principales de la infección y solo se han podido caracterizar proteínas con actividad inhibidora de la apoptosis (homólogos a bcl2, IAPs, etc.) Se ha continuado la realización de un catálogo de proteínas celulares cuya expresión se regula negativamente en las primeras fases de la infección mediante electroforesis bidimensional y espectrometría de masas.. Se ha caracterizado por proteómica la modificación posttraduccional de una proteína vírica (pE120R) que se acetila. Esta proteína es esencial para el transporte de salida del virus a la superficie de la célula durante la exocitosis. Para estudiar este proceso se ha construido un virus verde fluorescente que se visualiza con gran sensibilidad en infecciones en cultivo. Código y título: AGL2002-00668. Estudio de la interacción virus-célula mediante análisis proteómico de la infección por el virus de la Peste porcina africana. Entidad financiadora: Programa Nacional de Ganadería Duración: 2003-2005 Investigador responsable: Alonso Martí, Carmen Covadonga Resumen objetivos: Se trata de abordar el estudio de las interacciones moleculares del VPPA con la célula infectada, y la caracterización funcional de la regulación de la supervivencia celular por el virus mediante: Catalogación e identificación mediante análisis proteómico (electroforesis 2-D y MALDI-TOF) de los cambios en el perfil protéico de la célula infectada por el VPPA. Principales resultados: Se realizó el primer análisis de las interacciones virus- huésped para el VPPA mediante proteómica con el objetivo de identificar dianas para estudios de patogenia. Estudiamos los cambios en el perfil de expresión protéica de las células tras la infección viral mediante electroforesis bidimensional. Posteriormente, las proteínas que presentaban cambios significativos fueron identificadas por MALDI- TOFF. Los cambios mas significativos se encontraron en 12 proteínas sobreexpresadas relacionadas con el equilibrio Redox, proteínas de choque térmico, miembros del complejo Ran- Gppnhp- Ranbd1 y apolipoproteínas. Estas modificaciones de las proteínas celulares parecen jugar un papel determinante en la infección, en los mecanismos de apoptosis y en los mecanismos de modulación transcripcional.

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Código y título: QLK3-2000-00362. The potential and application of virus host evasion genes that modify apoptosis and cytokine responses. Entidad financiadora: Unión Europea Duración: 2000-2003 Investigador responsable: Alonso Martí, Carmen Covadonga Resumen objetivos:

1. Identificación de dianas celulares víricas para el homologo bcl2 A179L, DP71 L and E183L

2. Definir las cascadas intracelulares modificadas por los genes reguladores de la apoptosis y las respuestas de TNF del VPPA

Principales resultados: El homólogos vírico a Bcl2 del VPPA A179L interacciona las proteínas celulares proapoptóticas Bcl2, llamadas “BH3 only proteins”: Bad, Blk, Bik, Bim, Bmf, PUMA, DP5, etc por lo que A179L es capaz de bloquear la apoptosis celular inducida por muy diversos estímulos. No interacciona con la proteína Bid en su forma completa o inactiva y si con su forma activa o truncada (tBid). Confirmamos la especificidad de la interacción mediante coimmunoprecipitación y colocalización de ambas proteínas en microscopía confocal. Demostramos que A179L bloquea la apoptosis inducida por Bid durante su expresión transitoria en células Vero, señalando que la acción de este gen es capaz de bloquear la via de apoptosis inducida por receptores de muerte (TNF, Fas) en un paso posterior a la activación de la caspasa 8. Caracterización del mecanismo de acción del gen de VPPA homólogo al supresor de la apoptosis ICP34,5 de herpes simplex. Interacción con la fosfatasa celular PP1. Caracterización de la interacción de la proteína P30 del VPPA con la ribonucleoproteína K, encargada del transporte nucleocitoplásmico de mRNAs, que media el “shut- off” celular. Código y título: BMC2000-1003. Caracterización de los ligandos celulares de los genes reguladores de la apoptosis del virus de la Peste porcina africana. Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I Duración: 2000-2003 Investigador responsable: Alonso Martí, Carmen Covadonga Resumen objetivos:

• Identificar las proteinas diana celulares que interaccionan con los genes del virus de la Peste porcina africana

• Caracterizar las consecuencias funcionales de estas interacciones en la regulación de la supervivencia de la célula huésped

Principales resultados: Utilizando proteómica funcional, mediante ensayos de doble híbrido en levaduras hemos caracterizado la interacción de la proteína p54 del VPPA a la proteína celular dineína. La proteína p54 del VPPA, producto del gen E183L, es una proteína mayoritaria del virión externamente expuesta en la partícula vírica. Hemos encontrado que la p54 interacciona con una proteína motora microtubular, la dineína en su cadena ligera de 8kd (DLC8), facilitando el transporte de entrada del virus hacia el interior de la célula. Se ha caracterizado la secuencia mínima necesaria para la interacción de la proteína vírica con DLC8 y esta secuencia de unión es compartida por otros virus tanto DNA como RNA según nuestros estudios y los de otros autores. La inhibición funcional de la dineína por expresión transitoria de mutantes dominantes negativos o inhibidores específicos que actúan sobre el complejo motor microtubular es capaz de bloquear la infección inhibiendo la producción de proteínas víricas tanto tempranas como tardías. Por lo tanto, la dineína es una proteína candidata para las tecnologías de silenciamiento génico siRNA constituyendo una posible diana para drogas antivirales.

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PUBLICACIONES

Artículos en revistas SCI B. Hernáez, G. Díaz- Gil, M. García-Gallo, J.I. Quetglas, I. Rodríguez-Crespo, L. Dixon, J.M. Escribano and C. Alonso. The African swine fever virus dynein-binding protein p54 induces infected cell apoptosis. FEBS Letters 569: 224-228, 2004 Alfonso P., J. Rivera, B. Hernaez, C. Alonso and J. M. Escribano. Identification of cellular proteins modified in response to African swine fever virus infection by proteomics. Proteomics 7 (4), 2037- 2046, 2004. Tejera N, D Gómez-Garre , A. Lázaro, J. Gallego-Delgado, C Alonso, J Blanco, A Ortiz, J Egido. Persistent proteinuria upregulates angiotensin II type 2 receptor and induces apoptosis in proximal tubular cells. American Journal of Pathology 164: 1817- 1826, 2004 Soto K., D. Gómez- Garre, R. Largo, J. Gallego- Delgado, N. Tejera, M.P. Catalán, A. Ortiz, J.J. Plaza, C. Alonso and J. Egido. Tight blood pressure control decreases apoptosis during renal damage. Kidney International 65(3): 811-822, 2004 Alfonso P., J. Rivera, B. Hernaez, C. Alonso and J. M. Escribano. Identification of cellular proteins modified in response to African swine fever virus infection by proteomics. Proteomics 7 (4), 2037- 2046, 2004. M. Martínez Moreno, I Navarro- Lérida, F. Roncal, J.P. Albar, C. Alonso, F. Gavilanes and I. Rodríguez- Crespo. Recognition of novel viral sequences that associate to the dynein light chain LC8 identified through a Pepscan technique. FEBS Letters 544: 262-267, 2003 Libros y capítulos de libros Covadonga Alonso.Viruses and Apoptosis.Serie Progress in Molecular and Subcellular Biology Series Vol 36. Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York.ISSN 0079-6484 ISBN 3-540-20228-5 B. Hernáez, J. M. Escribano and C. Alonso. Switching on and off the cell death cascade: African swine fever virus apoptosis regulation. Viruses and Apoptosis. (Ed) 2004 Progress in Molecular and Subcellular Biology Series. Springer- Verlag Berlin, Heidelberg, New York Nº de ponencias, comunicaciones y poster publicados: 15 Tesis doctorales dirigidas Estudio de los mecanismos de regulación de la apoptosis relacionados con proteínas proapoptóticas de la familia Bcl-2, en la infección por el virus de la Peste porcina africana (4/06/2003). Patricia Fernández- Zapatero. Universidad Autónoma de Madrid (Facultad de Ciencias)

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Caracterización de ligandos celulares de proteínas del virus de la Peste porcina africana involucradas en etapas tempranas de la infección. (31/10/2004). Bruno Hernáez de la Plaza. Universidad Complutense de Madrid (Facultad: Ciencias Biológicas)

OTRAS ACTIVIDADES

Participación en comités y representaciones internacionales

• Título del Comité: CSF and ASF Laboratories Annual Meeting. Grange- Dublin, Irlanda

• Entidad de la que depende: European Comission Food and Veterinary Laboratories Office (FVO) Tema: Peste porcina clásica y africana Fecha: Mayo 2004

• Examinador Externo para el grado de doctor, PhD degree, School of Biomedical and Molecular Sciences, University of Surrey, U.K. 2005

Cursos

• Profesora del PhD programme in Biomedicine, Virology Course Gulbenkian Foundation. Oeiras, Lisboa 2000- 2004

• Profesora del curso de doctorado de la Universidad Pública de Navarra: Técnicas inmunológicas y de biología molecular para estudios vacunales y de patogenicidad 2003

• Profesora del curso de doctorado UAM "Sistema inmune y agentes infecciosos" Centro Nacional de Biotecnología, 2002-2005

• Evaluador para Revistas científicas y Proyectos de Investigación de Agencias Nacionales e Internacionales

• Evaluador del British Research Council (bbsrc) • Agencia Nacional Argentina de Promoción Científica y Tecnológica • ANEP, Agencia Nacional Española de Promoción Científica y Tecnológica • Agencia Nacional de Evaluación del Fondo de Investigaciones Sanitarias del

Instituto Carlos III (ISCIII)

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GRUPO VIRUS Y CONTAMINACION AMBIENTAL

COMPONENTES Córdoba García, Laura Escribano Romero, Estela Gómez Hernández, Nuria Jiménez Clavero, Miguel Angel Ley Vega de Seoane, Victoría Saiz Calahorra, Juan Carlos Correo electrónico: jcsaiz@inia.es

OBJETIVOS

• Puesta a punto de sistemas moleculares de detección de virus entéricos animales en muestras animales (sueros, heces, .....) y medioambientales (aguas, lodos, ....).

• Determinación de la prevalencia de virus entéricos animales en muestras de ganado y en aguas superficiales.

• Estudio de la utilidad de la detección de virus entéricos animales como marcadores de contaminación medioambiental.

• Comparación de las técnicas moleculares desarrolladas para la detección de virus entéricos animales con las metodologías habitualmente utilizadas en la determinación de contaminación medioambiental (detección de materia orgánica y compuestos químicos: nitritos, nitratos, potasio, cobre,.... ).

• Estudio de los mecanismos de entrada del virus de la enfermedad vesicular del cerdo en la célula.

• Estudios de la estructura tridimensional del virus de la enfermedad vesicular del cerdo.

• Estudios estructurales de los cambios evolutivos originados en el virus de la enfermedad vesicular del cerdo durante su adaptación al cerdo.

PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I • Estudio, análisis y caracterización de virus entéricos animales. • Utilización de virus entéricos animales como marcadores de contaminación

medioambiental. • Estudio del virus de la enfermedad vesicular del cerdo. • Estudio y caracterización de virus zoonóticos emergentes y re-emergentes

(virus de la hepatitis E, virus del Nilo Occidental, ....)

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PROYECTOS Código y título: RTA02-35. Detección de Enterovirus animales en muestras ambientales. Entidad financiadora: INIA Duración: 2000-2004 Investigador responsable: Ley Vega de Seoane, Victoria; Saiz Calahorra, Juan Carlos Resumen objetivos: Puesta a punto de sistemas de detección molecular de virus entéricos animales (Enterovirus, Teschovirus, Rotavirus, Astrovirus,....) en muestras animales y medioambientales de distintas regiones de España. Principales resultados: Dada la baja concentración de virus en aguas, se han puesto a punto sistemas de concentración de dichos patógenos en aguas superficiales. Mediante filtración a través de filtros electropositivos y posterior ultracentrifugación se ha conseguido un factor de concentración de entre 25 y 50 veces la concentración inicial. Se han desarrollado metodologías para la detección molecular de virus entéricos. Para ello se han desarrollado sistemas de detección mediante RT-PCR convencionales y anidadas, así como mediante sistemas a tiempo real. Se ha determinado la prevalencia de Teschovirus porcinos en muestras de origen animal y medioambiental. Se han obtenido datos preliminares sobre la prevalencia de otros virus entéricos (enterovirus, rotavirus, astrovirus, ....) en muestras animales y de aguas. Se ha confirmado la utilidad de la detección de virus entéricos animales como marcadores de contaminación medioambiental. Código y título: 07M/0023/02. Contaminación medioambiental por virus entéricos animales derivada de residuos de explotaciones ganaderas de la Comunidad de Madrid. Entidad financiadora: Comunidad de Madrid Duración: 2003-2004 Investigador responsable: Ley Vega de Seoane, Victoria; Saiz Calahorra, Juan Carlos Resumen objetivos: Puesta a punto de sistemas de detección molecular de Enterovirus bovinos y Teschovirus porcinos en muestras de origen animal y medioambiental de la Comunidad de Madrid. Principales resultados: Se han aplicado las metodologías desarrolladas en el laboratorio para la detección molecular de virus entéricos al estudio de la prevalencia de dichos virus en muestras de origen animal y medioambiental de la Comunidad de Madrid. Se ha demostrado la utilidad de la detección de virus entéricos animales (Enterovirus bovinos y Teschovirus porcinos) como marcadores de contaminación medioambiental. Mediante análisis comparativos, se ha demostrado que la detección de Teschovirus porcinos es una técnica mas sensible y específica que las metodologías habitualmente utilizadas en la determinación de contaminación medioambiental (detección de materia orgánica y compuestos químicos: nitritos, nitratos, potasio, cobre,.... )

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PARTICIPACIÓN EN PROYECTOS LIDERADOS POR OTRAS INSTITUCIONES Código y título: Providing tools to prevent emergence of enteric viruses (EVENT). Entidad financiadora: Unión Europea Duración: 2004-2008 Investigador responsable: Marion Koopmans (Holanda); Saiz Calahorra, Juan Carlos (INIA) Resumen objetivos: Proporcionar las herramientas de laboratorio necesarias para la creación de una red de vigilancia (epidemiológica) de brotes de enfermedades víricas relacionados con el agua y los alimentos, hepatitis A y otras enfermedades raras y emergentes (atribuibles a virus entéricos, como el de la hepatitis E, etc...)

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PUBLICACIONES

Artículos en revistas SCI Escribano-Romero, E., Jiménez-Clavero, M.A., Gomes, P., García-Ranea, J.A., and Ley, V. Heparan sulfate mediates swine vesicular disease virus attachment to the host cell. (2004). Journal of general Virology. 85: 653-663. Jiménez-Clavero, M.A., Fernández, C., Ortiz, J.A., Pro, J., Carbonell, G., Tarazona, J.V., Roblas, N.,and Ley, V., (2003). Teschoviruses as indicators of fecal contamination of water. Appl Environ Microbiol. 69: 6311-5. Jiménez-Clavero, M.A., Ley, V.. Fita, I. and Verdaguer, N. Crystallization and preliminary X-ray analysis of swine vesicular disease virus. (2003). Acta Crystallographica 359 :541-543. Verdaguer, N., Jiménez-Clavero, M.A., Fita, I. and Ley, V. (2003). Structure of swine vesicular disease virus : mapping of changes occurring during adaptation of human coxsackie B5 virus to infect swine. (2003). Journal of Virology 77 : 9780-9789.

OTRAS ACTIVIDADES Patentes Método para determinar la contaminación medioambiental mediante la detección de enterovirus bovino (EVB) o porcino (EVP). Inventores: Ley, V.; Jiménez Clavero, M.A. Europa, nº EP336 663 A3. USA application 2004/0058312 A1.

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GRUPO VACUNAS COMPONENTES Gil Dones, Félix Gómez Casado, Eduardo Martínez Escribano, Jose Angel Moreno Echanove, Ignacio Pérez Filgueira, Mariano Resino Talaván, Paloma Titarenko Ivanova, Elena Correo electrónico: eescribano@inia.es

OBJETIVOS

• Desarrollo de sistemas no fermentativos para la producción de vacunas y reactivos de diagnóstico (plantas transgénicas y larvas de insecto)

• Virus de la Peste porcina africana: desarrollo de una vacuna, nuevos métodos diagnósticos e interacción virus-célula

PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I

• Diseño de alternativas moleculares que mejoren la producción de proteínas recombinantes en diferentes sistemas y su funcionalidad

• Desarrollo de moléculas que mejoren la inmunogenicidad de las vacunas recombinantes

• Definición de las proteínas relevantes en la protección frente al virus de la Peste porcina africana y de sistemas que permitan su correcta presentación al sistema inmune

• Desarrollo de vacunas recombinantes frente a diversos patógenos animales cuyas proteínas relevantes están bien definidas

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PROYECTOS Código y título: RTA01-057. Desarrollo de vacunas recombinantes mejoradas Entidad financiadora: INIA Duración: 2002-2004 Investigador responsable: Martínez Escribano, Jose Angel Resumen objetivos: Desarrollo de estrategias genéricas para incrementar la inmunogenicidad de vacunas recombinantes mediante direccionamiento de las proteínas vacunales a células presentadoras de antígeno (APCs). Para ello proponemos fusionar tres diferentes antígenos vacunales, pertenecientes a tres modelos víricos, a estructuras diméricas conteniendo la molécula CTLA4 (cytotoxic T lymphocyte antigen 4) que se une al CD80 y CD86 de las APCs, o a un anticuerpo recombinante de cadena única (scFv), generado a partir del anticuerpo monoclonal 1F12, el cual reconoce la cadena β del antígeno de clase II tipo DR de las APCs. Se espera que el direccionamiento de estos antígenos vacunales a las APCs incremente su poder inmunogénico en diferentes especies animales, pudiendo definir así dos estrategias genéricas para la obtención de vacunas recombinantes de alta eficacia inmunizante. Principales resultados: Obtención de un anticuerpo recombinante que fusionado a proteínas vacunales incrementa el potencial inmunogénico de estas en diferentes especies animales a través de su direccionamiento a células presentadoras de antígeno. Código y título: BIO2001-0370. Utilización de plantas como biofactorías. Desarrollo de sistemas de sobreproducción de xenoproteínas de interés vacunal. Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I Duración: 2001-2003 Investigador responsable: Martínez Escribano, Jose Angel Resumen objetivos:

1. Expresión de proteínas vacunales en semillas utilizando un promotor específico 2. Utilización de ubiquitina y formas mutadas de la misma como proteínas de

fusión 3. Obtención de proteínas de fusión con polipéptidos vegetales abundantes o de

probada eficacia de expresión y acumulación 4. Multimerización de antígenos para prevenir la acción de las proteasas celulares 5. Transformación con múltiples copias del transgén en el mismo o diferentes loci

Principales resultados: • Desarrollo de un sistema eficiente de expresión de proteínas recombinantes

en semillas de tabaco • Producción de la proteína VP60 del RHDV en plantas transgénicas con alto

rendimiento y formación de VLPs • Desarrollo de un sistema de tetramerización de antígenos vacunales

recombinantes en plantas transgénicas que favorece su acumulación y aumenta su capacidad inmunogénica

• Desarrollo de un sistema de direccionamiento de proteínas vacunales a células presentadoras de antígeno mediante un anticuerpo monoclonal recombinante de cadena sencilla (APCH1)

• Expresión de un péptido de rotavirus en plantas transgénicas y su utilización con éxito como vacuna oral

• Expresión de alto rendimiento de un péptido vacunal del virus de la fiebre aftosa fusionado a la proteína beta-glucuronidasa

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Código y título: PETRI 95-0624-OP. Producción de reactivos para el control y profilaxis del síndrome respiratorio y reproductivo del ganado porcino (PRRS) en un sistema libre de cultivos celulares. Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I Duración: 2003-2005 Investigador responsable: Martínez Escribano, Jose Angel Resumen objetivos: El proyecto consiste en mejorar los resultados de inmunogenicidad alcanzados con esta proteína expresada en baculovirus por otros autores mediante fusión traduccional con una molécula denominada CTLA4 (cytotoxic T lymphocyte antigen 4). El CTLA4 direccionará la proteína vacunal hacia células presentadoras que expresen las moléculas CD80/CD86 en sus superficie (macrófagos y células dendríticas), potenciando su inmunogenicidad. Adicionalmente se expresará la ORF7 del virus, la cual codifica para una proteína de 15 kDa (p15) empleada para el diagnóstico serológico por su estabilidad antigénica entre diferentes aislados. Tanto la GP5 como la p15 se producirán mediante baculovirus en larvas de Trichoplusia ni, un sistema de alta eficiencia y bajo coste, que elimina la necesidad de utilizar sistemas fermentativos basados en cultivos celulares. Principales resultados: Obtencion de un kit diagnóstico para el estudio de la serología del virus PRRS basado en la proteína p15 (ORF 7) basado en la expresión de esta proteína en larvas de Trichoplusia ni. Código y título: CPE03-022-C5. Desarrollos biotecnológicos para la utilización rentable de plantas como biofactorías Entidad financiadora: INIA Duración: 2004-2007 Investigador responsable: Martínez Escribano, Jose Angel Resumen objetivos: El presente proyecto tiene como principal objetivo el desarrollo de diferentes estrategias para mejorar la utilización biotecnológica de plantas como biofactorías. Los diferentes grupos integrantes de la propuesta plantean propuestas basadas tanto en vectores víricos de plantas como en la transformación genética nuclear o cloroplástica. En el caso de los vectores virales, el proyecto contempla la utilización del tobamovirus del mosaico del tabaco (tobacco mosaic virus, TMV), del potyvirus del mosaico del nabo (turnip mosaic virus, TuMV) y del potyvirus de la sharka (plum pox virus, PPV). Principales resultados:

• Utilización de secuencias de dimerización o tetramerización que permitirían obtener estructuras complejas de cada proteína recombinante aumentando su estabilidad en la célula vegetal.

• Empleo de secuencias SEKDEL de retención en retículo endoplásmico. • Utilización de secuencias que permitan el transporte de las proteínas

recombinantes a cloroplastos. • Obtención de fusiones a un gen de ubiquitina mutado que permite su

procesamiento proteolítico y favorece la acumulación de las xenoproteínas. • Utilización del promotor de la fitohemaglutinina de judia para dirigir la

acumulación de proteína en semillas (compartimento que almacena de forma muy estable las proteínas recombinantes).

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PUBLICACIONES

Artículos en revistas SCI Hernaez B, Fernandez-Zapatero P, Garcia-Gallo M, Rodriguez-Crespo I, Alvarez A, Dixon LK, Escribano JM, and Alonso C. Proapoptotic BH3- only protein Bim translocation triggers apoptosis by a bcl-2 dependent pathway in African swine fever virus infection. FEBS Letters 569, 224-228. 2004 Wigdorovitz A, Mozgovoj M, Dus Santos MJ, Parreño V, Gómez C, Pérez-Filgueira DM, Trono KG, Ríos RD, Franzone PM, Fernández F, Carrillo C, Escribano JM, and Borca MV. Protective lactogenic immunity conferred by a peptide bovine rotavirus edible vaccine produced in transgenic plants. J. Gen. Virol 85, 1825-1832. 2004 Hernaez B, Escribano JM, Alonso C. Switching on and off the cell death cascade: African swine fever virus apoptosis regulation. Prog Mol Subcell Biol36:57-69. 2004 Alfonso P, Rivera J, Hernaez B, Alonso C, and Escribano JM. Identification of cellular proteins modified in response to ASFV infection determined by proteomics. Proteomics 4 2037-2046. 2004 Alfonso P, Catalá-Rodríguez M, Rico-Morales ML, Durante-Rodríguez G, Moro-Rodríguez E, Fernández-García H, Escribano JM, Alvarez-Fernandez E, García-Poblete E. Proteomic análisis of lung biopses: differential protein expresión profile from peritumoral to tumoral tissue. Proteomics 4:442-447. 2004 Hernáez B, Escribano JM, and Alonso C. Switching on and off the cell death cascade: African swine fever virus apoptosis. Viruses and apoptosis. Series “Progress in molecular and subcellular biology. Springer-Verlag. Ed. Covadonga Alonso. 2004. Sanchez-Torres C, Gomez-Puertas P, Gomez del Moral M, Alonso F, Escribano JM, Ezquerra A, and Domínguez J, Expresión of porcine CD163 on monocytes/macrophages correlates with permissiveness to African swine fever virus infection. Arch. Virol. 148: 2307-2323. 2003 Nº de ponencias, comunicaciones y poster publicados: 13 Tesis doctorales

• Desarrollo de estrategias de sobreexpresión de antígenos vacunales en plantas transgécicas. Doctorando: Félix Gil Dones. Universidad Complutense de Madrid. 2003. Apto Cum Laude

• Caracterización de ligandos celulares de proteínas del virus de la Peste porcina africana involucradas en etapas tempranas de la infección. Doctorando: Bruno Hernáez de la Plaza. Universidad Complutense de Madrid 2004. Apto Cum Laude.

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Patentes Inventores (p.o. de firma): José A. M. Escribano y Félix Gil Dones Título: Sistema para producir péptidos y proteínas multiméricos y sus aplicaciones N. de solicitud: 200302845 País de prioridad: España Fecha de prioridad: Diciembre 2003 Entidad titular: INIA Inventores (p.o. de firma): José A. M. Escribano, Félix Gil y Javier Dominguez Título: Proteína de fusión con direccionamiento de antígenos vacunales a células presentadoras de antígeno y sus aplicaciones N. de solicitud: 200302958 País de prioridad: España Fecha de prioridad: Diciembre 2003 Entidad titular: INIA

OTRAS ACTIVIDADES

• Participación como experto en las ponencias CICYT de seguimiento de proyectos y concesión de proyectos en el área de Biotecnología

• Pertenecer al editorial board de la revista Journal of General Virology (desde Enero de 2002)

• Evaluador de proyectos científicos para el ANEP, Agencia Nacional de Evaluación Argentina, USDA Americano, proyectos BBSRC Inglaterra y para la Comisión Europea

• Evaluador habitual de trabajos científicos para las revistas científicas internacionales Journal of Virology, Journal of General Virology, Journal of Virological Methods, Veterinary Immunology and Immunopathology, Archives of Virology, etc..

• Profesor de diferentes cursos de doctorado de la Universidad Autónoma de Madrid.

• Participación como miembro de tribunal de tesis doctorales en la Universidad Complutense y Autónoma de Madrid y Universidad Pública de Navarra

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GRUPO EVOLUCION Y EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR

COMPONENTES Malpica Romero, Jose Mª Correo electrónico: malpica@inia.es

OBJETIVOS

• Encontrar modelos predictivos en epidemiología.

PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I • Epidemiología y genética de poblaciones: hacia una síntesis.

PUBLICACIONES

Artículos en revistas SCI Moreno, I. M., J. M. Malpica, J. A. Diaz-Pendon, E. Moriones, A. Fraile et al., 2004 Variability and genetic structure of the population of watermelon mosaic virus infecting melon in Spain. Virology 318: 451-460. Nº de ponencias, comunicaciones y poster publicados: 2

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GRUPO VIRUS VEGETALES

COMPONENTES Calvo Gutierrez, Margarita Fresno Pérez, Jesús Lunello, Pablo Mansilla Mansilla, Carmen Montes Barberá, Mónica Ponz Ascaso, Fernando Sánchez Sánchez, Florentina Touriño Fernández, Mª Ángeles Zambrana Quesada, Encarnación Correo electrónico: fponz@inia.es

OBJETIVOS Las actividades de I+D del grupo se insertan en el ámbito de la Biotecnología de los Virus Vegetales. En este contexto biotecnológico, los objetivos son variados, enlazados por nexos tecnológicos comunes.

PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I Los objetivos biotecnológicos aludidos comportan varias actividades que van desde el desarrollo de nuevas aplicaciones biotecnológicas para el diagnóstico y la tipificación virales, en su vertiente más aplicada, hasta la investigación de los mecanismos moleculares y celulares subyacentes a los procesos de infección de las plantas por los virus y fenómenos asociados de expresión de enfermedad o resistencia, en la más fundamental. En situaciones intermedias se sitúan los trabajos de desarrollo de vectores virales para la utilización de plantas como biofactorías y la producción de biomoléculas de interés industrial. También se mantiene un tipo de actividad tradicional en el grupo como el de la prospección viral en determinados cultivos y caracterización molecular de nuevos virus y aislados virales, lo que además de proporcionar un tipo de información que resulta útil en sí misma, proporciona un buen banco de pruebas de los métodos de diagnóstico y tipificación desarrollados. Además, en los últimos años una pequeña parte del grupo ha estado desarrollando aplicaciones automatizadas de los marcadores moleculares en el terreno agroalimentario, tanto en los proyectos de I+D propios del grupo como ofreciendo un servicio a otros grupos de investigación.

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PROYECTOS Código y título: BIO2002-02191. Biomoléculas vegetales implicadas en la mediación del movimiento viral y macromolecular en plantas. Entidad financiadora: Plan Nacional de I+D+I Duración: 2002-2005 Investigador responsable: Ponz Ascaso, Fernando Resumen objetivos: El objetivo principal del proyecto es la identificación de genes de Arabidopsis thaliana implicados en la mediación del movimiento viral. Los objetivos concretos son los siguientes:

• Caracterización molecular detallada de las líneas transgénicas para el gen 29k de ORMV capaces de complementar el movimiento viral

• Escrutinio de mutantes EMS de la línea transgénica que expresa la proteína 29k de ORMV alterados en su capacidad de complementación del movimiento viral

• Caracterización genética y mapeo de los mutantes • Clonaje posicional de los genes afectados en los mutantes seleccionados • Interacción entre mutantes que limitan el movimiento viral y silenciamiento.

Principales resultados: Se ha realizado una caracterización genética de las líneas transgénicas, estableciéndose que la línea trangénica funcional para la complementación del movimiento viral es portadora de un único locus de inserción, que se encuentra en homocigosis. Se ha localizado el transgen en el cromosoma 1 de Arabidopsis, ligado a los marcadores NGA111 (115,55cM) y ATPASE (117,86cM). Se ha realizado una caracterización fisiológica de dicha línea transgénica: se observa una alteración del tiempo de floración, y la expresión de la proteína 29k de ORMV no implica alteraciones en el reparto de biomasa o de azúcares. La caracterización genética inicial de los mutantes EMS de dicha línea transgénica afectados en su capacidad de complementar el movimiento viral indica que el fenotipo de la mutación es recesivo. Código y título: QLK1 CT2001-02373. Development of quantitative and qualitative methods to identify plant and animal species in foods. Entidad financiadora: Unión Europea Duración: 2001-2004 Investigador responsable: Ponz Ascaso, Fernando Resumen objetivos: El objetivo principal del proyecto es el desarrollo de sistemas basados en PCR para la detección específica de frutos secos (almendra, avellana y nuez) en alimentos procesados. Las diferentes fases de dicho objetivo son: desarrollo de la detección cualitativa, desarrollo de la detección cuantitativa y la validación de dichos desarrollos. Principales resultados: Se han desarrollado cebadores específicos para las tres especies de frutos secos a partir de amplificaciones con cebadores de marcadores tipo SCAR (specific sequence characterized amplified region). Se ha demostrado que la amplificación con estos cebadores es específica de especie, no presentando reactividad cruzada. Asimismo los cebadores son universales para la especie, al ser capaces de amplificar todas las variedades ensayadas de cada especie. Se ha demostrado su aplicabilidad a alimentos procesados: se detecta la presencia específica de almendra o avellana en los diferentes alimentos ensayados (turrón, cereales de desayuno, muesli y galletas). Se ha desarrollado un método de detección cuantitativa, en base a los cebadores específicos anteriores, mediante PCR cuantitativa en tiempo real con una sonda TaqMan. La

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validación de los análisis se ha realizado en colaboración con el Dr. Kuchta (Bratislava), experto en análisis de alimentos, confirmándose los resultados de los desarrollos. Código y título: RTA01-037-C2-1. Influencia del grado de adaptación de aislados de PVY, de su propensión vectorial y de la actividad vectorial de los pulgones sobre la virosis asociada en cultivos al aire libre de plantas solanáceas. Entidad financiadora: INIA Duración: 2001-2003 Investigador responsable: Ponz Ascaso, Fernando Resumen objetivos: Determinación de la competencia y la dispersión entre aislados de PVY transmisibles genéticamente distintos y, determinación del grado de adaptación de aislados de PVY no transmisibles (NAT) en prevalencia y dispersión en presencia de aislados transmisibles. Principales resultados: Los análisis de competencia entre aislados de PVY transmisibles han establecido que los aislados con distancias genéticas relativamente altas no compiten entre sí y se mantienen en infecciones mixtas indefinidamente, produciéndose competencia entre aislados a partir de una distancia genética umbral; en general, se puede apreciar una jerarquía clara de aislados en cuanto a su capacidad de desplazar a otros ya que existen aislados con un alto grado de adaptación que tienen un fuerte potencial de convertirse en prevalentes de una población. Los estudios realizados con aislados NAT indican que dichos aislados se transmiten eficientemente en presencia de otro aislado transmisible en la misma planta (infección mixta) y poco eficientemente si los virus están en plantas distintas. Los análisis para determinar el grado de adaptación de aislados NAT para prevalencia y dispersión en estos ensayos se han visto limitados por el bajo número de aislados de PVY NAT caracterizados. Código y título: BIO2003-04516. Caracterización de factores determinantes de la enfermedad causada por potyvirus en el patosistema Arabidopsis thaliana-virus del mosaico del nabo. Entidad financiadora: Plan Nacional de I+D+I Duración: 2003-2006 Investigador responsable: Sánchez Sánchez, Florentina Resumen objetivos: Los objetivos generales de este proyecto son, por una parte, el análisis de los factores virales y, por otra, el análisis de los factores del huésped, determinantes de los síntomas causados por la infección de TuMV en Arabidopsis thaliana. En el análisis de los factores virales el objetivo concreto es la identificación del gen/determinante de síntomas y el estudio de la influencia del título viral en la aparición de dichos síntomas, en base a los síntomas diferenciales producidos en la infección por dos aislados (UK1 y JPN1). Entre los factores del huésped se estudiarán la influencia de las hormonas y del fotoperiodo en los síntomas y se analizarán diferentes mutantes del huésped para evaluar la incidencia de determinadas mutaciones en los síntomas. Principales resultados: En cuanto a los factores virales determinantes de síntomas, los análisis de los síntomas inducidos por los diferentes recombinantes entre el clon infectivo de UK1 y regiones equivalentes del genoma de JPN1 indican que el determinante de síntomas reside en la proteína P3. Los datos de título viral indican que los títulos de JPN1 se mantienen a la mitad de los títulos de UK1 y existe una variación temporal de los títulos de ambos aislados en parte aérea y en raíz con cinéticas diferentes. Respecto a los factores del huésped determinantes de síntomas, no se han encontrado efectos del fotoperiodo ni por

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el tratamiento externo con auxinas o giberelinas en los síntomas típicos inducidos por cada uno de los aislados, manteniéndose el enanismo grave en plantas infectadas con UK1 y el enanismo ligero en plantas infectadas con JPN1.

CONVENIOS Código y título: CC01-0008. Realización de un proyecto de obtención de variedades de fresa. Entidad financiadora: INIA Duración: 2001-2005 Investigador responsable: Ponz Ascaso, Fernando Resumen objetivos: Desarrollo de marcadores moleculares para la identificación de variedades de fresa. Principales resultados: Se han desarrollado marcadores moleculares de tipo ISSR (regiones inter-microsatélites) para fresa. Estos marcadores permiten distinguir las diferentes variedades de fresa ensayadas, entre ellas la variedad "Aguedilla" de gran importancia en este proyecto.

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PUBLICACIONES

Artículos en revistas SCI Jenner, C.E., Wang, X., Tomimura, K., Ohshima, K., Ponz, F., Walsh, J. 2003. The dual role of the potyvirus P3 protein of turnip mosaic virus as a symptom and avirulence determinant in brassicas. Molecular Plant-Microbe Interactions 16:777-784. García-González, F., Núñez, Y., Ponz, F., Roldán, E.R.S., Gomendio, M. 2003. Sperm competition mechanisms, confidence of paternity, and the evolution of paternal care in the golden egg bug (Phyllomorpha laciniata). Evolution 57:1078-1088. Mansilla, C., Sánchez, F., Ponz, F. 2003. The diagnosis of the tomato variant of pepino mosaic virus: an IC-RT-PCR approach. European Journal of Plant Pathology 109:139-146. Sánchez, F., Wang, X., Jenner, C.E., Walsh, J., Ponz, F. 2003. Strains of turnip mosaic virus as defined by the molecular analysis of the coat protein gene of the virus. Virus Research 94:33-43. Núñez, Y., Ponz, F., Gallego, F.J. 2004. Microsatellite-based genotyping of the Swine Lymphocyte Alloantigens (SLA) in miniature pigs. Research in Veterinary Science 77: 59-62. Lunello, P., Mansilla, C., Conci, V., Ponz, F. 2004. Ultra-sensitive detection of two garlic potyviruses using a real-time fluorescent (TaqMan) RT-PCR assay. Journal of Virological Methods 118: 15-21. Núñez, Y., Fresno, J., Torres, V., Ponz, F., Gallego, F:J. 2004. Practical use of microsatellite markers to manage Vitis vinifera germplasm: Molecular identification of grapevine samples collected blindly in D.O. “El Bierzo” (Spain). Journal of Horticulture Science & Biotechnology 79: 437-440. Otros artículos Lunello, P., Ponz, F. 2004. Production of virus-free vegetativelly propagated crops: The garlic case as a reference system. Recent Research Developments in Plant Pathology 3:67-83. Libros y capítulos de libros Luis-Arteaga, M., Ponz, F. 2003. Potato virus Y. Compendium of Pepper Diseases, pp. 35-36. APS Press, St. Paul, Minnesota. Estados Unidos. ISBN 0-89054-300-3. Nº de ponencias, comunicaciones y poster publicados: 10 Patentes Barbosa, G., de Blas, C., Borja, MJ., Ponz, F., Torres, V. Orden alfabético de firma. Procedure for the detection and identification of viral and subviral pathogens Canadian Intellectual Property Office. Patente Nº 2098270. Concesión: 23/9/2003

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OTRAS ACTIVIDADES

Cursos y Conferencias Invitadas Varios miembros del grupo han participado como profesores en los Cursos Internacionales de Diagnóstico de Virus Vegetales que se celebraron en el INIA en 2003 y 2004, organizados conjuntamente por INIA y AECI. A lo largo de los años 2003 y 2004, Fernando Ponz fue invitado a pronunciar conferencias o impartir seminarios por las siguientes organizaciones externas al INIA: Amgen/Ciemat. Madrid. Aplicaciones de la Biotecnología Recombinante Vegetal a la Terapéutica Humana. Sociedad Española de Patologías Respiratorias. Cáceres. Aplicaciones de la Biotecnología Vegetal: alternativas al uso de las plantaciones de tabaco. Foro Nueva Economía. The Wall Street Journal Europe. Madrid. Un escenario para la Agrobiotecnología en el futuro de la Agricultura Española. Reunión Nacional de Virología Vegetal. Javea, Alicante. Resistencias naturales a virus: genes de resistencia. Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas. UPV-CSIC. Valencia. Interacciones potyvirus/agentes biológicos. Academia China de Ciencias Agrarias. Diversas ciudades de China. Plant Virus Biotechnology.

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GRUPO TOLERANCIA AL ESTRÉS MEDIOAMBIENTAL

COMPONENTES Ballesteros Jareño, Mª Luisa Catalá Rodriguez, Rafael Hernández Verdeja, Tamara López Cobollo, Rosa Medina Alcázar, Joaquín Moreno Mozo, J. Ignacio Novillo Zaragoza, Fernando Redondo Moreno, Adela Salinas Muñoz, Julio Correo electrónico: salinas@inia.es

OBJETIVOS • Caracterización funcional de RCI2A, un gen de Arabidopsis cuya expresión

se induce en respuesta a temperaturas bajas, deshidratación, NaCl y ABA, y no pertenece al regulón de los CBFs.

• Identificación de intermediarios en las vias de señalización que median la expresión de RCI2A.

PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I • Mecanismos moleculares que controlan la respuesta de las plantas a

situaciones ambientales (abióticas) extremas.

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PROYECTOS Código y título: BIO2001-0344. Disección genética y molecular de los mecanismos de señalización qe median el proceso de aclimatación a las temperaturas bajas y la respuesta a diferentes tipos de estrés abiótico en Arabidopsis. Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I Duración: 2001-2004 Investigador responsable: Salinas Muñoz, Julio Resumen de objetivos: Caracterización molecular y funcional de genes implicados en la respuesta de las plantas a estreses abióticos. Principales resultados: Identificamos una serie de mutantes de Arabidopsis afectados en la regulación de la expresión de RCI2A que definen la existencia de una nueva red de señalización que regula la respuesta de Arabidopsis a distintas situaciones de estrés ambiental. Las mutaciones correspondientes definen intermediarios en las diferentes vias de señalización que componen esa red. Confirmamos que la proteína RCI2A está localizada en la membrana plasmática y juega un papel fundamental en la respuesta de Arabidopsis a distintas situaciones de estrés ambiental. El análisis del genoma de Arabidopsis reveló que en Arabidopsis hay 8 genes RCI2 (RCI2A-H) que, a pesar de su alto nivel de homología, no tienen la misma función. Los genes RCI2 se encuentran ampliamente distribuidos entre numerosos organismos, incluyendo bacterias, hongos, plantas y animales inferiores. Todos los genes RCI2 y las correspondientes proteínas están muy conservados y parecen tener un origen evolutivo común. Código y título: BIO2004-00628. Caracterización molecular y funcional de nuevos intermediarios en la señalización del proceso de aclimatación a las temperaturas bajas implicados en el metabolismo de RNA mensajeros. Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I Duración: 2004-2007 Investigador responsable: Salinas Muñoz, Julio Resumen de objetivos: Caracterización molecular y funcional de las proteinas LSMs de Arabidopsis Principales resultados: Caracterización molecular y funcional de las proteinas LSMs de Arabidopsis Código y título: CPE03-006-C6-1. Cultivos halotolerantes para una agricultura sostenible. Entidad financiadora: INIA Duración: 2004-2008 Investigador responsable: Salinas Muñoz, Julio Resumen de objetivos: Caracterización funcional de RCI2A

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CONTRATOS Código y título: CON03-043. Explotación de la tecnología CBF2. Entidad financiadora: FuturaGene Inc. Duración: 2003-2008 Investigador responsable: Salinas Muñoz, Julio Resumen de objetivos: Caracterización funcional de CBF2 Código y título: CON04-019. Aislamiento y caracterización de proteínas sintetizadas en respuesta a heladas en especies frutales. Entidad financiadora: Agroseguro Duración: 2004-2007 Investigador responsable: Salinas Muñoz, Julio Resumen de objetivos: Identificación de proteínas específicas de helada en frutales.

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PUBLICACIONES

Artículos en revistas SCI R. Catalá, E. Santos, J. M. Alonso, J. R. Ecker, J. M. Martínez-Zapater and J. Salinas (2003). Mutations in the Ca2+/H+ transporter CAX1 increase CBF/DREB1 expression and the cold acclimation response in Arabidopsis. Plant Cell 15: 2940-2951. S. Sugano, H. Kaminaka, Z. Rybka, R. Catalá, J. Salinas, K. Matsuy, M. Ohme-Takagi and H. Takatsuji (2003). Stress-responsive zinc finger gene ZPT2-3 plays a role in drought tolerance in petunia. Plant J. 36: 830-841. F. Novillo, J. M. Alonso, J. R. Ecker and J. Salinas (2004). CBF2/DREB1C is a negative regulator of CBF1/DREB1B and CBF3/DREB1A expression, and plays a central role in stress tolerance in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101: 3985-3990. M. González-Guzmán, D. Abía, J. Salinas, R. Serrano and P. L. Rodríguez (2004). Two new alleles of the abscisic aldehyde oxidase 3 gene reveal its role in abscisic acid biosynthesis in seeds. Plant Physiol. 135: 325-333. Nº de ponencias, comunicaciones y poster publicados: 3 Tesis doctorales Título: Identificación de nuevas rutas de señalización en la respuesta de aclimatación a las temperaturas bajas en Arabidopsis thaliana L. Rafael Catalá Rodríguez (2003). Universidad Complutense de Madrid. (Facultad/Escuela: CC. Biológicas) Sobresaliente “Cum Laude”

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GRUPO UNIDAD DE MEJORA GENÉTICA VEGETAL

COMPONENETES Casanova Pena, Carlos Gómez de Nova, Pedro José Monte Herráiz, Juan Vicente Soler Llinares, Mª Consuelo Correo electrónico: llinares@inia.es

OBJETIVOS El grupo posee una amplia trayectoria de trabajo en el campo de la mejora genética vegetal, preferentemente de cereales de invierno. Asimismo, tiene amplia experiencia en la utilización de gramíneas silvestres tanto para su utilización en la mejora de formas cultivadas afines, como en la obtención de nuevos cultivos a partir de ellas mediante selección y domesticación.

PRINICPALES LÍNEAS DE I+D+I

• Obtención de trigos panaderos selectos, mediante métodos convencionales y citogenéticos, utilización de la variación genética extraespecífica y de la androgénesis y más recientemente de la transformación. Selección asistida por marcadores moleculares. Análisis de la regulación y expresión genética de los caracteres relacionados con la calidad.

• Obtención de triticales hexaploides secundarios mediante métodos convencionales y, especialmente mediante utilización de la androgénesis.

• Obtención de variedades de gramíneas a partir de poblaciones heterogéneas de gramíneas anuales autóctonas, para su utilización como cubiertas vegetales en suelos de cultivos leñosos, preferentemente de olivar.

• Selección de gramíneas anuales y perennes para su utilización en temas de revegetación y en la recuperación de zonas degradadas y deterioradas.

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PROYECTOS Código y título: AGL2000-0762-C02. Búsqueda y caracterización de genes de calidad y su utilización para la mejora convencional y por transformación, utilizando androgénesis y cultivo de embriones inmaduros en cereales de ciclo normal y staygreen. Entidad financiadora: Plan Nacional de I+D+I Duración: 2001-2003 Investigador responsable: Nicolas Jouve; Soler Llinares, Mª Consuelo Resumen objetivos: Con su realización se pretendía contribuir a la mejora del trigo panadero en España mediante la obtención de nuevas formas selectas productivas y de calidad, adaptadas principalmente a las tradicionales zonas cerealistas de secano. Para el cumplimiento de este objetivo, las técnicas convencionales de mejora se apoyaron en técnicas tales como introducción de variación genética extraespecífica, cultivos "in vitro" y androgénesis y la selección del material segregante se llevó a cabo mediante la utilización de marcadores bioquímicos, moleculares y de FISH. Asimismo se pretendía desarrollar un protocolo para la utilización posterior de la transformación en trigos Principales resultados: Obtención de varios trigos panaderos de calidad y alta producción; obtención de varios triticales androgenéticos competitivos; caracterización alélica de los principales genes que codifican las proteínas del endospermo; cuantificación de las diferentes fracciones proteicas dependientes de dichos genes; determinación de los parámetros que intervienen en las propiedades de amasado de la harina y en la formación del gluten y análisis de su relación con la composición alélica y la cantidad de proteínas; estudio de la influencia de la introducción de genes de centeno en la calidad y producción final de los trigos; desarrollo de un protocolo para la aplicación de la transformación (biolística, Agrobacterium) en trigos; análisis de transformación y su detección en plantas transformadas mediante la aplicación de FISH y técnicas moleculares Código y título: CAO-00-019-C5-3. Manejo de cubiertas vegetales en olivar y su incidencia medioambiental Entidad financiadora: FAGA-FEOGA garantía Duración: 2000-2005 Investigador responsable: Soler Llinares, Mª Consuelo Resumen objetivos: Se pretendía luchar contra la pérdida de suelo en los cultivos del olivo mediante la utilización de cubiertas vegetales de gramíneas anuales que se siembran en el olivar y que se obtienen mediante selección y domesticación a partir de poblaciones autóctonas genéticamente heterogéneas. Principales resultados: Se ha puesto de manifiesto que un modo muy eficaz para luchar contra la erosión del suelo en el olivar es el de la utilización de cubiertas vegetales compuestas por gramíneas seleccionadas a partir de poblaciones naturales heterogéneas y que se implantan en los olivares. Se han determinado las especies de gramíneas más favorables para la obtención de estas cubiertas, tras un proceso de selección genética y domesticación. Se han obtenido algunas variedades que han mostrado sus buenas características para ser utilizadas puesto que protegen eficazmente el suelo y no entran en competencia con el olivo.

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Código y título: RTA02-038. Obtención de variedades de Gramíneas para su utilización en temas de revegetación y de lucha contra la erosión en suelos alterados y deteriorados. Entidad financiadora: INIA Duración: 2002-2005 Investigador responsable: Soler Llinares, Mª Consuelo Resumen objetivos: Se pretendía la recuperación de suelos deteriorados y alterados mediante la siembra en ellos de variedades de gramíneas españolas, obtenidas a partir de poblaciones heterogéneas de gramíneas autóctonas, principalmente perennes. Principales resultados: Se ha formado una amplia colección de gramíneas españolas, perennes y anuales, que encierran un gran potencial para su utilización en temas de revegetación y de lucha contra la erosión; se ha estudiado la variabilidad genética de las poblaciones recolectadas y el modo de su utilización; se han determinado y se ha trabajado con varias especies con el fin de obtener variedades que se puedan explotar comercialmente; cabe destacar en este sentido los estudios y obtenciones llevados a cabo con poblaciones pertenecientes a varias especies de festucas, Elymus y Stipa Código y título: AGL2003-08128-C02. Mejora de la calidad de trigo y triticale por métodos convencionales y transformación Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I Duración: 2003-2006 Investigador responsable: Nicolás Jouve; Soler Llinares, Mª Consuelo Resumen objetivos: Supone una continuación y ampliación de los objetivos del proyecto AGL2000-00762-C02.

CONVENIOS Código y título: CC02-0024. Desarrollo de cubiertas vegetales a partir de gramíneas seleccionadas Entidad financiadora: INIA, CIFA de Córdoba y AGROSA. Duración:2002-2005 Investigador responsable: Soler Llinares, Mª Consuelo Resumen objetivos: Llevar a cabo una serie de ensayos, en diferentes ubicaciones de olivar, de variedades de gramíneas obtenidas por el grupo de investigación, con el fin de seleccionar las mas adecuadas para su explotación comercial en la lucha contra la erosión del suelo de olivar. Principales resultados: Se encuentra en trámites en el Registro Europeo de Variedades vegetales la inscripción de dos variedades de gramíneas para su explotación comercial

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PUBLICACIONES

Otros artículos Bernardo A, Peña E, De Bustos A, Soler C, Jouve N. Using AS-PCR and HPLC in characterizing glutenin genes of a collection of Spanish common wheats. Ewac Newsletter. Volumen 12, 40-43. (2003) UK Jouve N, Peña E, bernardo A, Cuadrado A, Soler C. Obtención de línea de trigo, Triticum aestivum L., con sustituciones cromosómicas 1RS/1AL (1A), 1RS/1BL (1B) y 1R (1D). Caracterización agronómica y utilización para la mejora de la calidad Actas de Horticultura. Volumen 41, 53-56. (2004) España. Soler C, Casanova C, Rojo A. Desarrollo de cubiertas vegetales a partir de gramíneas seleccionadas, para su explotación en tierras de olivar. Actas de Horticultura. Volumen:41, 97-100 (2004) España Libros y capítulos de libros Soler C, Casanova C, Monte JV, Saavedra M, García P. Obtención de variedades de gramíneas para ser utilizadas como cubiertas vivas en el olivar. Investigación y Transferencia de Resultados de Investigación al sector oleícola. 257 -261 (2003).Junta de Andalucía. ISBN 84-95083-80-9. Sevilla Nº de ponencias, comunicaciones y poster publicados: 5 Tesis doctorales Título: “El género Festuca en España : estudios de variabilidad y de relaciones entre las especies” Pedro José Gómez de Nova (Julio 2003). Directores tesis: Consuelo Soler y Juan Vicente Monte. Universidad de Alcalá de Henares. (Facultad/Escuela: Facultad de C. Biológicas). Calificación: Sobresaliente cum laude

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GRUPO CONTROL GENÉTICO DEL TIEMPO DE FLORACIÓN

COMPONENTES Jarillo Quiroga, Jose Antonio Lázaro Somoza, Ana Miguel Casado, Eugenio José Oliverio Peppe, Karina Andrea Olmo Montoro, Iván del Correo electrónico: jarillo@inia.es

OBJETIVOS

• Estudio del control genético del tiempo de floración en Arabidopsis • Estudio del papel de la remodelación de la cromatina en la regulación de

transiciones de desarrollo en plantas • Estudio del papel de proteínas ligadoras de ubiquitina tipo E3 en el control

del tiempo de floración • Disección genética y genómica de las rutas de la represión floral

PRINCIPALES LÍNEAS DE I + D + I • Control del tiempo de floración en Arabidopsis • Análisis genético y genómico de la rutas represoras de la floración • Función de proteínas ligadoras de ubiquitina tipo E3 en el control del tiempo

de floración • Remodelación de cromatina y desarrollo

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PROYECTOS Código y título: BIO2002-00753 Análisis genético y molecular de la interacción de la luz con las rutas de la floración en Arabidopsis. Caracterización del locus regulador negativo ESD1. Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I Duración: 2002-2005 Investigador responsable: Jarillo Quiroga, Jose Antonio Resumen objetivos: El objetivo general del presente proyecto es la caracterización genética y molecular del locus ESD1, un posible represor del tiempo de floración en Arabidopsis, que parece participar en la vía de la transmisión de la señal de luz roja. Principales resultados: Además del fenotipo de floración temprana, las mutaciones esd1 provocan efectos pleiotrópicos que afectan a la morfología general de la planta, así como al desarrollo de flores y frutos. En paralelo, observamos que la mutación esd1 provocaba una pérdida parcial de sensibilidad a la luz roja y hemos demostrado la existencia de una relación epistática de phyB sobre esd1 en la respuesta de elongación del hipocotilo en tales condiciones. Con el fin de establecer la relación entre el locus ESD1 y las rutas de regulación del tiempo de floración establecidas en los modelos genéticos propuestos, hemos construido y analizado plantas dobles mutantes portadoras de mutaciones en el locus ESD1 y en otros loci representativos de la ruta. Únicamente el análisis del tiempo de floración de los dobles mutantes esd1fve y esd1fca reveló la existencia de una relación de epistasia. Nosotros hemos demostrado que las mutaciones esd1 afectan al nivel de expresión de FLC, y que por lo tanto el locus ESD1 es necesario para la correcta expresión del gen. Sin embargo, las mutaciones esd1 también afectan al tiempo de floración de forma independiente de FLC. El locus ESD1 ha sido clonado y codifica una proteína relacionada con actina (ARP6), que probablemente participa en complejos remodeladores de la cromatina. Código y título: QLK3-CT2002-01973. Developing Single Nucleotide Polymorphic (SNP) markers for adaptive variation in forest trees (TREESNIPs). Entidad financiadora: Unión Europea Duración: 2002-2006 Investigador responsable: Cervera Goy, Mª Teresa Resumen objetivos: El objetivo del proyecto es el estudio de la variación adaptativa en diversas especies forestales europeas, empleando SNP (polimorfismos de nucleótidos sencillos). En concreto, en el caso del pino rodeno (P. pinaster), este proyecto permitirá estudiar la función de genes candidatos seleccionados en la tolerancia al estrés hídrico. Principales resultados: Para su ejecución se han diseñado ensayos procedencias – progenies que cuentan con 12 individuos de 20-30 familias de unas 20 poblaciones que representan la clina pluviométrica de la especie. Se ha empleado un panel de descubrimiento de 50 individuos (5 megagametofitos de 10 poblaciones de la clina) para detectar polimorfismos (SNPs e INDELs) en la secuencia de 6 genes candidatos y 2 genes control, con los que se han definido haplotipos. En base a dichos haplotipos se está procediendo a la caracterización molecular de las madres del ensayo de procedencias-progenies, que se completa con su genotipado con microsatélites nucleares, marcadores neutros que proporcionan información sobre los procesos históricos, así como con su evaluación fenotípica, para estimar los efectos fenotípicos de alelos individuales y genotipos.

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PARTICIPACIÓN EN PROYECTOS LIDERADOS POR OTRAS INSTITUCIONES Código y título: A genomic approach to the identification of the genetic and environmental components underlying berry quality in grapevine. Entidad financiadora: Fundación Genoma España GRAPEGEN Duración: 2004-2007 Investigador responsable: Martinez Zapater, José Miguel Resumen objetivos: El objetivo general de este proyecto es desarrollar herramientas derivadas de la genética, genómica y proteómica para investigación básica y aplicada en viticultura.

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PUBLICACIONES

Artículos en revistas SCI Ausin, I, Alonso-Blanco, C, Jarillo, J.A., Ruiz, L y Martinez-Zapater, J. M (2004). Regulation of flowering time by FVE, a retinoblastoma-associated protein. Nature Genetics 36,162-166 Otras publicaciones Capel J, Lozano, R, Martinez-Zapater, J.M., Jarillo, J.A.(2003). Ritmos y relojes circadianos de las plantas. Ecosistemas 12, 1-9 Libros y capítulos libros Jarillo J.A, Capel J, y Cashmore A.R (2004). Physiological and molecular characteristics of plant circadian clocks En Molecular Biology of Circadian Rhythms, John Wiley and Sons Inc, USA. pp. 185-209. Nº de ponencias, comunicaciones y poster publicados: 4 Tesis Doctorales Caracterización fisiológica y molecular de ESD1 (early in short days 1), un locus regulador del tiempo de floración en Arabidopsis. Doctorando: Maria del Mar Martin Trillo. Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma de Madrid, 2004. Sobresaliente Cum Laude

OTRAS ACTIVIDADES

• Organizador del curso de Doctorado: "Respuesta de las plantas a factores mediombientales y a estreses abioticos" Universidad de Almería Curso 2002-2003

• Profesor participante en el curso correspondiente al Programa de Doctorado del Departamento de Biología de la Universidad Autónoma de Madrid “Biología Vegetal: Aspectos moleculares, fisiológicos y biotecnológicos”. Clases impartidas sobre el tema “Respuestas de las plantas a la luz: fotomorfogénesis”

• Miembro experto en la comisión evaluadora del programa BIO-2003 (CICYT)

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GRUPO BIOLOGIA REPRODUCTIVA DE PLANTAS

COMPONENTES López González, Leticia Miguel Casado, Eugenio Piñeiro Galvín, Manuel Teresa Matamoros, Libertad Correo electrónico: pineiro@inia.es

OBJETIVOS • Profundizar en el conocimiento de los circuitos génicos reguladores que

controlan el inicio de la floración con especial énfasis en aquellos factores que reprimen la floración hasta que la planta se encuentra en condiciones medioambientales óptimas o alcanza un nivel de desarrollo adecuado.

• Analizar el papel de la remodelación de la cromatina en el control de transiciones de desarrollo en plantas. Estamos particularmente interesados en procesos de desarrollo con potencial biotecnológico tales como el inicio de la floración y la dormición/germinación de semillas.

PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I

• Control genético del tiempo de floración. • Identificación de nuevos represores de la transición floral. • Papel de la cromatina en el establecimiento de patrones de expresión génica

implicados en el control del desarrollo de plantas. • Identificación y análisis de la regulación de genes maestros de procesos de

desarrollo con potenciales implicaciones biotecnológicas.

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PROYECTOS Código y título: 07B/0004/2002. Análisis genético y molecular de la represión del inicio de la floración. Entidad financiadora: Comunidad de Madrid Duración: 2003-2004 Investigador responsable: Piñeiro Galvín, Manuel Resumen objetivos: El momento de inicio de la floración es crucial para determinar el éxito reproductivo de especies vegetales y la productividad de especies agrícolas. Para comprender mejor como se regula este proceso hemos abordado el estudio de rutas genéticas que reprimen la floración en Arabidopsis; en concreto, empleando aproximaciones genéticas y bioquímicas, hemos analizado la ruta en la que participa el represor floral EBS. Además, hemos investigado la existencia en otras especies vegetales de circuitos reguladores homólogos al mediado por EBS en Arabidopsis, lo que podría facilitar la manipulación del tiempo de floración en especies de interés agrícola. Principales resultados: Hemos identificado diversas mutaciones que suprimen el fenotipo de floración temprana de mutantes ebs, y que por tanto podrían participar en la ruta de represión floral mediada por EBS. Asimismo hemos iniciado la caracterización molecular del complejo proteico represor del que forma parte EBS; finalmente disponemos de resultados que sugieren la existencia de sistemas de represión mediados por proteínas EBS-like en otras especies vegetales tales como tabaco, donde estarían implicadas en el control de diversos aspectos del desarrollo. Código y título: BIO2004-00494. Regulación del desarrollo y cromatina en plantas. Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I Duración: 2004-2007 Investigador responsable: Piñeiro Galvín, Manuel Resumen objetivos: La remodelación de la cromatina tiene un papel fundamental en la regulación de procesos de desarrollo en plantas. Nosotros estamos analizando los mecanismos epigenéticos que controlan algunos de estos procesos, en particular aquellos que inciden sobre la productividad de especies agrícolas como el inicio de la floración y la germinación de semillas. Nos proponemos caracterizar el papel de la remodelación de la cromatina en la represión de genes centrales en el control del tiempo de floración y de la germinación de la semilla en Arabidopsis. Abordaremos también la caracterización funcional de familias de proteínas reguladoras de la expresión génica a través de remodelación de la cromatina y cuyo papel en el control del desarrollo de la planta es desconocido. El conocimiento de la regulación de estos procesos facilitará el desarrollo de programas que permitan su manipulación en especies cultivadas. Principales resultados: Hemos llevado a cabo una búsqueda de mutantes que nos permitan identificar genes implicados en la represión del gen integrador floral FT. Hemos aislado diversos mutantes que producen una aceleración de la floración en condiciones de fotoperíodos no inductivos. Asimismo estamos desarrollando herramientas moleculares que nos permitan identificar factores implicados en la remodelación de la cromatina y que regulen la germinación de la semilla. Finalmente, hemos analizado la función de la proteína SHL, relacionada con factores remodeladores de cromatina y hemos demostrado que participa en la represión de la floración y en la regulación de otros procesos de desarrollo. Estos estudios ilustran el papel de la cromatina en el control del tiempo de floración y otros aspectos del desarrollo de la planta.

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PARTICIPACIÓN EN PROYECTOS LIDERADOS POR OTRAS INSTITUCIONES Código y título: A genomic approach to the identification of the genetic and environmental components underlying berry quality in grapevine. Entidad financiadora: Fundación Genoma España GRAPEGEN Duración: 2004-2007 Investigador responsable: Martinez Zapater, José Miguel Resumen objetivos: El objetivo general de este proyecto es desarrollar herramientas derivadas de la genética, genómica y proteómica para investigación básica y aplicada en viticultura.

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PUBLICACIONES

Artículos en revistas SCI Piñeiro, M., Gómez-Mena, C., Schaffer, R., Martínez-Zapater, J.M. and Coupland, G. (2003) EARLY BOLTING IN SHORT DAYS is related to chromatin remodeling factors and regulates flowering in Arabidopsis by repressing FT. Plant Cell 15, 1552-1562. An, H., Roussot, C., Corbesier, L. Vincent, C., Suárez-López, P., Piñeiro, M., Hepworth, S., Mouradov, A., Justin, S., Turnbull, C. and Coupland, G. (2004) CONSTANS regulates a systemic signal that induces photoperiodic flowering of Arabidopsis. Development, 131, 3615-3626. Piñeiro, M. and Martínez-Zapater, J.M. (2003). Vernalization. En Encyclopedia of Applied Plant Sciences. Eds.: Thomas, B., Murphy, D., and Murray, B., pp 1056-1063. Academic Press.

OTRAS ACTIVIDADES

Cursos impartidos Participante (cuatro horas) en el curso “Biología Molecular de Plantas” correspondiente al Programa de Doctorado del Departamento de Biología de la Universidad Autónoma de Madrid “Biología Vegetal: Aspectos moleculares, fisiológicos y biotecnológicos”. Clases impartidas sobre el tema “Fase reproductiva del desarrollo en plantas. Floración”

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GRUPO CICLO CELULAR/RUTA DE LA UBIQUITINA

COMPONENTES Pozo Benito, Juan Carlos del Correo electrónico: pozo@inia.es

OBJETIVOS Nuestro grupo está interesado en el estudio de la función de la ruta de la ubiquitina en plantas. Esta ruta juega un papel muy importante en estos organismos, regulando una gran variedad de procesos durante el desarrollo de la plantas. Nosotros estamos interesados en la regulación de la división y diferenciación celular a través de la ruta de la ubiquitina. Hemos identificado dos enzimas E3 ligasas de ubiquitina (SCFAtSKP2) que están regulando la división celular mediante la degradación de factores transcripcionales e inhibidores de ciclinas entre otros. En estos momentos estamos intentando identificar más dianas de estas enzimas E3 y su relación con la respuesta a ambientes externos adversos, ya que ambos genes se regulan diferencialmente frente a diversas condiciones de crecimiento adversas, tales como la salinidad o la deficiencia nutricional. Por otro lado, nuestro grupo está desarrollando una protocolo de purificación de proteínas poli-ubiquitinadas para su posterior identificación mediante espectrometría de masas. Por último, también estamos muy interesados en el desarrollo radicular de las plantas. Las raíces laterales (RL) se generan a partir de divisiones de las células del periciclo que están paradas en G1. Hasta la fecha se conoce que la señal que dispara la formación de las RL es la acumulación puntual de la fitohormona auxina. Asimismo, se conocen muchos genes implicados en la formación y desarrollo de las LRs. Sin embargo, hasta la fecha se desconoce el control genético que determina que grupo de células del periciclo desarrollan una LR y por que otras no lo hacen. Nosotros estamos intentando responder esta pregunta, y para ello estamos llevando acabo diversos experimentos genéticos y moleculares.

PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I

• Desarrollo: División y diferenciación celular en plantas. Papel de la ruta de la ubiquitina en el control de la proliferación celular.

• Biotecnología de plantas: mejora del sistema radicular para una mejor adaptación de la s plantas a los diferentes medioambientes.

• Proteómica: identificación de proteínas degradadas a través de la ruta de la ubiquitina en plantas

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PROYECTOS Código y título: BMC-2001-2292. Control del Ciclo Celular en Plantas a través de la Ruta de al Ubiquitina. Utilización de la Proteómica para el Estudio de la Función del Complejo SCFAtSKP2 Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I Duración: 2001-2004 Investigador responsable: Pozo Benito, Juan Carlos del Resumen objetivos:

• Estudio de los factores de ciclo celular E2Fc y DPb. Analisis de su función dentro de la proliferación y diferenciación celular en plantas.

• Identificación y estudio de complejos SCF que regulan la división celular. Principales resultados: En este proyecto hemos estudiado la regulación de los factores transcripcionales E2Fc y DPc que están implicados en el control del ciclo celular. Asimismo, hemos identificado dos proteínas con motivo F-box que tienen una alta homología a la SKP2 de humanos. Estas dos proteínas con motivo F-box de Arabidopsis, AtSKP2A y AtSKP2B, forman parte de los complejos SCF que funcionan como enzimas ligasas de ubiquitina. En este proyecto hemos encontrado que la estabilidad de ambas proteínas, E2Fc y DPb se regulan a través de la ruta de la ubiquitina-SCF(SKP2). Asimismo, mediante dos-híbridos hemos identificado otras proteínas que interaccionan con AtSKP2A y en estos momento nos hayamos en el proceso de estudiar las implicaciones de dicha interacción (analizar si son sustratos de los complejos SCF(AtSKP2). Código y título: BIO2004-01749. La Ruta de la Ubiquitina en Plantas. Análisis proteómico y funcional de los complejos SCF(AtSKP2) Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I Duración: 2004-2007 Investigador responsable: Pozo Benito, Juan Carlos del Resumen objetivos: Estudio de la función de los complejos SCF(SKP2) en la división celular y en respuesta a estímulos externos, tales como salinidad o deficiencia nutricionales. Estudio de la relevancia de la ruta de la ubiquitina-SCF en el desarrollo radicular y en la formación de primordios laterales radiculares. Principales resultados: La ruta de la ubiquitina juega un papel crucial en el control de la estabilidad de diversas proteínas, muchas de las cuales desempeñan funciones importantes en diferentes circuitos reguladores, tanto durante desarrollo programado de los organismos como durante las respuestas a estímulos externos del medio ambiente. Datos preliminares nos han indicado que la expresión de los genes AtSKP2 se modula en respuesta a diferentes estímulos externos que afectan a división celular. Esto, junto al echo que los complejos SCF(SKP2) regulan proteínas que controlan el ciclo celular, nos ha sugerido que la degradación de ciertas proteínas dianas a través de la actividad de los complejos SCF(SKP2) puede ser una de las vías de conexión entre el ambiente externo y la capacidad y/o decisión de crecimiento de las plantas. En este proyecto proponemos, utilizando como sistema modelo Arabidopsis, estudiar la regulación y función específica de los complejos SCFSKP2, identificar las proteínas dianas reguladas por estos complejos y determinar la función biológica de estas dianas. Por otro lado, utilizando una aproximación proteómica, pretendemos llevar a acabo un análisis global de las proteínas dianas que se regulan a través de la ruta de la ubiquitina en determinados procesos. Para ello, se llevará a cabo diferentes tipos de abordajes experimentales, utilizando técnicas bioquímicas, genéticas y proteómicas funcionales.

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PUBLICACIONES

Artículos en revistas SCI J.C. del Pozo, A. Lopez-matas, E. Ramírez-Parra, and C. Gutierrez. (2004) Hormonal control of the plant cell cycle Physiologia Plantarum 123: 173-183.

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GRUPO MEJORA GENETICA DE VID COMPONENTES Arroyo García, Rosa Perez Rivera, Gemma Mª Correo electrónico: rarroyo@inia.es

OBJETIVOS El objetivo general del grupo es la Mejora Genética de la Vid (Vitis vinifera L)

PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I

• Identificación varietal y clonal. • Diversidad genética en poblaciones naturales. • Aplicación de la selección asistida por marcadores moleculares para la

mejora genética de uva de mesa. • Desarrollo de herramientas genómicas y estudios de genómica funcional en

poblaciones naturales y variedades cultivadas.

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PROYECTOS Código y título: RF02-010-C3. Caracterización Agronómica y Molecular de vides silvestres españolas. Entidad financiadora: INIA Duración: 2002-2005 Investigador responsable: Arroyo García, Rosa Resumen objetivos: Los objetivos generales de este proyecto son: La recolección, conservación, evaluación agronómica y molecular de vides silvestres españolas Vitis vinifera subsp sylvestris (C.C. Gmelin) Hegi. Principales resultados: En el presente proyecto se han analizado 47 de las 51 poblaciones recogidas que corresponden a 300 individuos de la P. Ibérica. En el análisis de los 9 microsatélites cloroplásticos polimórficos se obtuvo un haplotipo mayoritario que se le denomino A. Estos resultados refuerzan los estudios realizados previamente (Arroyo et al., 2002) en los que coinciden el haplotipo A como mayoritario en las poblaciones cultivadas de la Península Ibérica. Es posible que, al contrario de lo establecido por la teoría dominante sobre el origen de la domesticación de la vid, en la cual indica que la domesticación de la vid tuvo lugar en la región trascaucásica y se extendió a la cuenca Mediterránea pudo ocurrir eventos independientes de domesticación en toda el área de distribución. En el análisis con 17 microsatélites nucleares se observo una mayor diferenciación genética entre poblaciones que dentro de poblaciones. Por otro lado, establecimos las relaciones genéticas entre poblaciones silvestres y variedades de vinificación de manera individual. Los resultados obtenidos se puede observar tres grupos uno correspondiente a accesiones silvestres, otro a cultivadas españolas y un tercer grupo correspondiente a accesiones silvestres y cultivadas. Dentro de las variedades cultivadas de este tercer grupo se encuentran variedades autóctonas españolas. La evaluación agronómica de estas poblaciones silvestres se realizará durante este año. Código y título: COREGRAPEGENE, Convenio Trilateral Europeo Entidad financiadora: Ministerio de Educación y Ciencia Duración: 2004-2007 Investigador responsable: Martinez Zapater, José Miguel; Arroyo García, Rosa Resumen objetivos: El principal objetivo del proyecto es el desarrollo de una colección nuclear de genotipos de vid (cultivados y silvestres) que representen la máxima diversidad alélica y fenotípica que se encuentra en los bancos de germoplasma Europeos. Esta colección nuclear se explotará en la identificación de genes responsables de caracteres de calidad y resistencia en vid utilizando una estrategia de genética inversa. Principales resultados: Hasta el momento se ha desarrollado una colección nuclear de variedades cultivadas mediante el análisis de 20 microsatelites nucleares. Se ha partido de 2300 accesiones de variedades de vinificación y uva de mesa reduciéndose a 100 variedades que representan la máxima diversidad alélica. Con respecto a las accesiones silvestres se ha partido de 400 accesiones y estamos en el proceso de completar el análisis de los microsatélites nucleares. En el futuro se va a realizar el análisis fenotípico de las variedades cultivadas y accesiones silvestres con el fin de desarrollar la colección nuclear con caracteres morfológicos. Por otro lado, estamos realizando la selección de genes candidatos para el análisis funcional en estas colecciones.

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Código y título: P2004 MA01. Estudios de la diversidad genética en vides silvestres y cultivadas de Marruecos. Entidad financiadora: AECI Duración: 2004-2005 Investigador responsable: Martinez Zapater, José Miguel; Arroyo García, Rosa Resumen objetivos: Dentro del objetivo general, el proyecto se enfocará en los siguientes objetivos específicos:

1. Evaluación de la diversidad genética disponible en los genotipos de vides cultivadas y silvestres usando microsatelites nucleares y cloroplásticos.

2. Caracterización de la diversidad fenotípica para caracteres de calidad y resistencia.

3. Establecimiento de las relaciones genéticas entre genotipos de variedades cultivadas, entre genotipos de cultivados y silvestres, también entre genotipos procedentes de Marruecos y cultivares del resto de la cuenca Mediterránea.

Principales resultados: Durante este tiempo se han analizado 40 variedades autóctonas de Marruecos y 20 accesiones silvestres con 7 microsatelites nucleares. Los resultados mostraron que las relaciones filogenéticas de las accesiones silvestres como un grupo entremezclado con las variedades autóctonas. Esto podría indicar que las accesiones silvestres son escapes de variedades cultivadas ó ha existido una alta contribución del germoplasma local en el desarrollo de las variedades autoctonas. En el análisis de las variedades autóctonas de Marruecos nos encontramos un numero elevado de sinonimias (variedades genotipicamente idénticas con nombres distintos). La comparación de las variedades de Marruecos con variedades de uva de mesa comercial y variedades de Túnez mostraron una alta similitud genética con las variedades de Túnez. En la actualidad se están realizando los análisis con microsatélites cloroplasticos y se han recolectado 7 poblaciones silvestres.

PARTICIPACIÓN EN PROYECTOS LIDERADOS POR OTRAS INSTITUCIONES Código y título: A genomic approach to the identification of the genetic and environmental components underlying berry quality in grapevine. Entidad financiadora: Fundación Genoma España Duración: 2004-2007 Investigador responsable: Martinez Zapater, Jose Miguel Resumen objetivos: El objetivo general de este proyecto es desarrollar herramientas derivadas de la genética, genómica y proteómica para investigación básica y aplicada en viticultura.

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PUBLICACIONES

Artículos en revistas SCI J.A. Cabezas, M.T. Cervera, R. Arroyo-García, J. Ibáñez, I. Rodríguez, J. Borrego, F. Cabello and J. M. Martínez-Zapater. Garnacha and Garnacha Tintorera: Genetic relationships and origin of teintourier varieties cultivated in Spain. American Journal Enology Viticulture Vol. 54,237-245. (2003) Snoussi, H., Harbi Ben Slimane, M., Ruiz-García, L. Martínez-Zapater, JM and Arroyo-García, R. Genetic relationships between Tunisian cultivated and wild grapevine accessions show two group genetically separated suggesting and independent origin. Genome. Vol47, 1211-1219. (2004) R. Arroyo- García and JM Martínez-Zapater. Characterization of new polymorphic simple repeat loci in grape (Vitis vinifera L). Vitis. Vol 43 (4), 175-178 (2004)