Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de ...

Desarrollo de un complejo de inclusión

molecular de fármacos a partir de

almidón nativo

Alexander Puentes Parra

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias

Área Curricular de Farmacia

Bogotá D.C., Colombia

Agosto de 2020

Desarrollo de un complejo de inclusión

molecular de fármacos a partir de

almidón nativo

Alexander Puentes Parra

Químico

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:

Magíster en Ciencias Farmacéuticas

Directora

Claudia Elizabeth Mora Huertas

Química Farmacéutica., MBA, Ph.D.

Departamento de Farmacia


Línea de Investigación:

Farmacotecnia

Grupo de Investigación en Diseño y Calidad de Productos Farmacéuticos, GIDECA


Facultad de Ciencias

Área Curricular de Farmacia

Bogotá D.C., Colombia

Agosto de 2020

A mis padres; Maria Oliva Parra, Eduardo Puentes y hermanos que han sido durante toda

mi vida un apoyo fundamental en todos los aspectos, familia, amigos, mi tía Martha y

Cristóbal. Un sinergismo que forjó este logro.

Yo había saltado desde el borde y entonces, en

el último instante, algo me cogió en el aire. Ese

algo es lo que defino como amor. Es la única

cosa que puede detener la caída de un hombre,

la única cosa lo bastante poderosa como para

invalidar las leyes de la gravedad.

Paul Benjamin Auster. “El palacio de la luna”

Agradecimientos

Es axiomático el conjunto de gratitudes que tengo que procurar a todas aquellas personas

que hicieron de este viaje en el tren de la existencia algo imperecedero y apacible, espero

tan solo no ser fugaz. He aludido textualmente la vida como una analogía, el tren, ese

pasmoso tren que transita sin rumbo fijo, cambiando de trayectoria y conviniendo sus vías

de acuerdo a su meta, en dicha trayectoria se suben personas que nos acompañan por un

breve trayecto, otras por un extenso recorrido, en esa dinámica algunas personas tienen

que descender, olvidando adrede su equipaje, otras bajan y se aseguran de no dejar a las

espaldas absolutamente nada, a tal punto de pasar inadvertidas, como si en absoluto se

hubiesen subido, y están aquellas que nos acompañan hasta el concluyente caminar. Esos

equipajes los llamo recuerdos y momentos inolvidables que han quedado guardados en el

tren de mi vida, dichosamente el tren se ha saturado de equipajes y personas en el trayecto

de esta meta.

Quiero agradecer a la Universidad Nacional de Colombia por acogerme en sus brazos, por

convertirse en un pilar fundamental en mi desarrollo profesional y personal.

Al Departamento de Farmacia junto con su personal administrativo y de laboratorios. Al

grupo de investigación GIDECA por permitirme hacer parte de él, a sus integrantes que se

convirtieron en amigos y en un apoyo fundamental con sus sugerencias y observaciones. A

la profesora Claudia Elizabeth Mora Huertas por depositar su confianza en mí, por su

apoyo y colaboración incondicional, por sus correcciones, aportes y exigencias, que sin

ellas los resultados no hubiesen sido lo que son. Al profesor Jorge Ariel Martínez por su

colaboración.

A mis amigos y vecinas de laboratorio, a Don Jorg por su espíritu colaborativo.

Resumen y abstract IX

Resumen

El almidón es un polímero biodegradable y biocompatible cuyas investigaciones durante los

últimos años lo proyectan como un material de partida prometedor para el desarrollo de

sistemas de entrega de moléculas en el campo farmacéutico. En este contexto, en la presente

investigación se extrae y caracteriza el almidón de una fuente poco convencional como el

bambú y se evalúa su posible uso como hospedador en la formación de complejos de

inclusión molecular con el ibuprofeno, de igual manera se empleó almidón de maíz con fines

comparativos.

El almidón de bambú está constituido de gránulos con formas irregulares y un tamaño medio

de 15 µm ± 1.0 µm, con un contenido de amilosa de 18.3% ± 1.2%, exhibe un patrón

cristalográfico correspondiente al polimorfo A con una alta temperatura de gelatinización

(79.1 °C) y una baja entalpía (ΔH = 8.8 J g-1). Por su parte, el almidón de maíz presenta el

mismo patrón cristalográfico del polimorfo A y en contraste con el almidón de bambú, tiene

un menor contenido de amilosa (16.30% ± 2.24%), una menor temperatura de gelatinización

(71.10 °C) y una mayor entalpía (ΔH = 22.35 J g-1).

Para la formación de los complejos molécula activa - almidón se emplearon tres métodos:

acidificación de una solución alcalina, calentamiento - sellado y calentamiento - sellado por

rotaevaporación, siendo este último una propuesta de esta tesis. Las cantidades de agua y los

tiempos de reacción utilizados en cada procedimiento influencian el rendimiento de los

complejos obtenidos; los que se encuentran entre 16.3% y 89.6% para el almidón de bambú

y entre 30.3% y 74.5% para el almidón de maíz. Igualmente, la eficiencia de complejación

es influenciada por dichas variables alcanzando valores de hasta 10.30% ± 0.02% cuando se

trabaja almidón de bambú y de hasta el 22.35% ± 0.04% en el caso de almidón de maíz. Las

estructuras semicristalinas de los complejos obtenidos evidencian algunas diferencias

X Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo

importantes, principalmente en sus comportamientos térmico y de liberación del activo. Los

complejos parecen mantener una estructura más compacta en condiciones gástricas

simuladas pH 1.2 con porcentajes de liberación bajos obtenidos por un transporte de difusión

predominantemente Fickiana. Por otro lado, en condiciones simuladas del intestino (pH 6.8

y 7.2) en presencia de amilasa pancreática, se observó una liberación de aproximadamente

el 90% al cabo de 6 h con una cinética de liberación principalmente de primer orden,

probablemente como consecuencia de la escisión de los enlaces α(1-4) en cualquier punto

de las cadenas poliméricas.

Estos resultados sugieren que los almidones investigados podrían ser empleados como

sistemas transportadores de moléculas activas cuya liberación sea requerida a nivel

intestinal, lo cual abre posibilidades de generación de valor agregado a fuentes nativas de

almidón, especialmente para el diseño de nuevos sistemas de entrega de fármacos.

Palabras clave: Almidón, bambú, complejos de inclusión molecular, ibuprofeno, liberación

de activos, encapsulación molecular.

Resumen y abstract XI

Abstract

Starch is a biodegradable and biocompatible polymer whose recent research projects it as a

promising starting material for the development of drug delivery systems in the

pharmaceutical field. In this context, the present investigation extracts and characterizes the

starch from an unconventional source such as bamboo and evaluates its possible use as a

host in the formation of molecular inclusion complexes with ibuprofen, in the same way

corn starch was used for comparative purposes.

Bamboo starch consists of granules with irregular shapes, an average size of 15 µm ± 1.0

µm, an amylose content of 18.3% ± 1.2%, and a crystallographic pattern corresponding to

polymorph A exhibiting a high gelatinization temperature (79.1 ° C) and a low enthalpy (ΔH

= 8.8 J g-1). On its part, corn starch presents the same crystallographic pattern of polymorph

A but in contrast to bamboo starch, characterizes by a lower amylose content (16.30% ±

2.24 %), a lower gelatinization temperature (71.10 ° C) and a higher enthalpy (ΔH = 22.35

J g-1).

Three methods were used to form the drug - starch complexes: acidification of an alkaline

solution, heating - sealing and heating - sealing by rotavaporation, the latter being proposed

in this thesis. The amounts of water and the reaction times used in each procedure influence

the yield of the complexes obtained which varies between 16.3% and 89.6% for bamboo

starch and 30.3% and 74.5%, for the corn starch. Likewise, the complexing efficiency is

influenced by these variables reaching values of up to 10.30% ± 0.02% when bamboo starch

was used and of up to 22.35% ± 0.04% for corn starch. The semicrystalline structures of the

obtained complexes show some important differences, mainly in their thermal and drug

release behaviors. Probably, the complexes maintain a more compact structure under

simulated gastric conditions pH 1.2 with low release percentages delivered predominantly

by Fickian diffusion transport. On the other hand, under simulated conditions of the intestine

(pH 6.8 and 7.2) in the presence of pancreatic amylase, a drug release of approximately 90%

was observed after 6 h mainly following a first order release kinetics, probably because of

the excision of the α (1-4) bonds at any point in the polymer chains.

XII Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo

These results suggest that the investigated starches could be used as carriers for active

molecules whose release is intended at the intestinal level which offers attractive

possibilities for generating added value to native starch source, particularly to design of new

drug delivery systems.

Key words: Starch, bamboo, molecular inclusion complexes, ibuprofen, active release,

molecular encapsulation.

Contenido XIII

Contenido

Resumen .............................................................................................................................. IX

Lista de figuras ................................................................................................................... XV

Lista de tablas .................................................................................................................. XIX

Lista de símbolos y abreviaturas .................................................................................... XXIII

Introducción .......................................................................................................................... 1

1 Marco teórico ................................................................................................................. 5

1.1 Amilosa .................................................................................................................. 6

1.2 Amilopectina .......................................................................................................... 8

1.3 Estructura interna del gránulo de almidón ........................................................... 10

1.4 Complejos de inclusión basados en almidón........................................................ 14

2 Objetivos ...................................................................................................................... 23

2.1 Objetivo general ................................................................................................... 23

2.2 Objetivos específicos............................................................................................ 23

3 Extracción y caracterización del almidón de bambú ................................................... 25

3.1 Métodos y materiales ........................................................................................... 26

3.1.1 Extracción del almidón ................................................................................. 26

3.1.2 Caracterización del almidón de bambú ......................................................... 27

3.2 Resultados y discusión ......................................................................................... 35

4 Preparación y caracterización de complejos de inclusión molecular a base de almidón

nativo................................................................................................................................... 46

4.1 Métodos y materiales ........................................................................................... 47

4.1.1 Preparación de los complejos de inclusión molecular .................................. 47

4.1.1.1 Método de acidificación de una solución alcalina .................................... 48

4.1.1.2 Método de calentamiento - sellado............................................................ 50

4.1.1.3 Método de calentamiento - sellado por rotaevaporación .......................... 50

4.1.1.4 Preparación de los controles y las mezclas físicas .................................... 51

4.1.2 Caracterización de los complejos de inclusión molecular ............................ 52

4.1.2.1 Determinación de la cantidad de ibuprofeno complejado ......................... 52

4.1.2.2 Microscopía electrónica de barrido (SEM) ............................................... 53

4.1.2.3 Calorimetría diferencial de barrido de alta presión (HP-DSC) ................. 53

4.1.2.4 Espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier (FTIR) ................ 53

XIV Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo

4.1.2.5 Difracción de rayos X (XRD) ................................................................... 54

4.1.2.6 Evaluación del comportamiento de liberación .......................................... 54

4.1.2.7 Modelos cinéticos de liberación ................................................................ 55

4.2 Resultados y discusión ......................................................................................... 56

4.2.1 Rendimiento, porcentaje de activo complejado y eficiencia de

complejación…. ........................................................................................................... 60

4.2.2 Caracterización de los complejos por SEM, DSC, FTIR, XRD ................... 65

4.2.3 Liberación del activo..................................................................................... 79

5 Conclusiones y recomendaciones ................................................................................ 89

5.1 Conclusiones ........................................................................................................ 89

5.2 Recomendaciones ................................................................................................. 90

A. Anexo: Determinación del contenido de amilosa aparente ......................................... 93

B. Anexo: Observaciones de impurezas por microscopía óptica y SEM ......................... 95

C. Anexo: Distribución del tamaño de partícula .............................................................. 97

D. Anexo: Validación de la metodología analítica por HPLC ......................................... 99

D.1 Condiciones cromatográficas de partida .............................................................. 99

D.2 Preparación de las muestras ................................................................................. 99

D.3 Validación de la metodología analítica .............................................................. 100

D.4 Resultados y discusión ....................................................................................... 103

E. Anexo: Datos de liberación en condiciones simuladas del tracto gastrointestinal ... 113

6 Bibliografía ................................................................................................................ 117

Contenido XV

Lista de figuras

Figura 1-1. Representación estructural de la amilosa. ......................................................... 6

Figura 1-2. Representación estructural de la amilopectina. ................................................. 9

Figura 1-3. Clasificación de las cadenas de amilopectina. Los círculos representan las

unidades de glucosa, las líneas horizontales representan los enlaces α(1→4) y las líneas

curvas los enlaces α(1→6), el círculo con una línea cruzada representa el grupo terminal

reductor. Todas las cadenas A son cadenas externas, por otro lado las cadenas B consisten

de un segmento externo y un segmento interno, este último es definido como las unidades

entre los puntos de ramificación sin tener en cuenta toda la longitud de la cadena y que es

representado en la figura mediante los círculos con un punto en su interior (Adaptado de

Pérez y Bertoft, 2010). ........................................................................................................ 10

Figura 1-4. Modelos estructurales propuestos para representar la organización de la

amilopectina dentro de los gránulos de almidón. Los gránulos de almidón consisten en

anillos de crecimiento con una alternancia entre laminillas cristalinas (C) y amorfas (A) que

son observadas en mayor detalle en la parte inferior de la imagen. Los detalles de las dobles

hélices (cilindros) y bloques de construcción (círculos grises) se representan en la figura

central, los círculos en blanco y negro representan las unidades de glucosa. Los segmentos

interbloques (S-IB) y los segmentos interclúster (S-IC) se encuentran en ambos modelos, la

unidad principal en el modelo de clúster es el clúster y en el modelo de columna vertebral

de bloques de construcción es el bloque de construcción el cual es mucho más pequeño y

estrechamente ramificado. Una diferencia importante entre los modelos es que en el modelo

de clúster las cadenas de amilopectina penetran las laminillas mientras que en el modelo de

columna vertebral de bloques de construcción no sucede (adaptado de Vamadevan y Bertoft,

2015). .................................................................................................................................. 11

Figura 1-5. Representación esquemática de la estructura interna de los gránulos de almidón

desde los anillos de crecimiento: (A) imagen TEM sección fina de un gránulo de almidón;

(B) alternancia de los anillos de crecimiento amorfos y semicristalinos; (C) modelado de la

estructura de la amilopectina. Las líneas en puntos describen las laminillas amorfas y

cristalinas (repetición de 9-10 nm) que corresponden a los puntos de ramificación; (D)

detalle de un clúster que muestra la formación de doble hélices de las cadenas ramificadas

cortas de la amilopectina (adaptado de Buléon et al., 2007). ............................................. 12

XVI Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo

Figura 1-6. Modelos moleculares de hélices, proyecciones de las celdas unitarias y el patrón

cristalográfico correspondiente a: (A) polimorfo A; (B) polimorfo B y (C) polimorfo Vh -

amilosa (adaptado de Buléon et al., 1998 y Kong et al., 2014c). ....................................... 13

Figura 3-1. Pasos para el pretratamiento del material vegetal de bambú previo a la

extracción del almidón. ....................................................................................................... 27

Figura 3-2. Pasos para la extracción de almidón a partir de tallos de bambú. ................... 28

Figura 3-3. Procedimiento para la preparación de las muestras para la curva de calibración

y posterior determinación del contenido de amilosa........................................................... 32

Figura 3-4. Registro de presencia de Rhipidocladum cf. Harmonicum (Parodi) Mcclure en

América (adaptado de GBIF Backbone Taxonomy, 2019). ............................................... 36

Figura 3-5. Micrografías SEM del parénquima celular en fibras de bambú. ..................... 37

Figura 3-6. Micrografías de los gránulos del almidón de bambú, observado en: Microscopio

electrónico de barrido (A y B); microscopio óptico sin luz polarizada con una magnificación

de 100x (C); microscopio óptico de luz polarizada con una magnificación de 100x (D). . 39

Figura 3-7. Distribución en densidad de volumen del tamaño de partícula del almidón de

bambú (A); distribución del tamaño de partícula del almidón de bambú en términos de área

superficial (B). .................................................................................................................... 41

Figura 3-8. Termograma obtenido para el almidón de bambú mediante HP-DSC (A);

espectro infrarrojo obtenido para el almidón de bambú (B). .............................................. 43

Figura 3-9. Patrón de difracción de rayos X del almidón de bambú. ................................ 44

Figura 3-10. Poder de hinchamiento del almidón de bambú (A); porcentaje de sólidos

solubles (%SS) e insolubles (%SI) lixiviados en el almidón de bambú (B). ...................... 45

Figura 4-1. Representación de la estructura química de la mezcla racémica del ibuprofeno

(ácido 2-(4-isobutilfenil) propiónico). ................................................................................ 46

Figura 4-2. Obtención de los complejos de inclusión molecular por el método de

acidificación de una solución alcalina. ............................................................................... 49


calentamiento - sellado. ...................................................................................................... 50


calentamiento - sellado por rotaevaporación. ..................................................................... 51

Figura 4-5. Determinación del comportamiento de liberación de los complejos. ............. 55

Figura 4-6. Mecanismo de reacción propuesto para la formación de complejos de inclusión

molecular mediante el método de acidificación de una solución alcalina. Dispersión de

almidón en solución básica (A); inicio de la lixiviación de los componentes estructurales del

almidón como consecuencia de la ionización de los grupos hidroxilo y el aumento de la

temperatura (B); componentes estructurales en solución posterior a la ruptura del gránulo de

almidón (C); enfriamiento y protonación de los grupos hidroxilo de las cadenas poliméricas

que van adoptando una conformación helicoidal con el huésped incluido en la cavidad de la

misma (D). .......................................................................................................................... 58

Contenido XVII


molecular mediante el método de calentamiento - sellado. Dispersión de almidón en agua

destilada (A); inicio de la lixiviación de los componentes estructurales del almidón como

consecuencia del aumento de la temperatura (B); componentes estructurales en solución

posterior a la ruptura del gránulo de almidón (C); enfriamiento de la solución y

conformación helicoidal de las cadenas poliméricas con el huésped incluido en la cavidad

interna de la misma (D)....................................................................................................... 59


molecular mediante el método de calentamiento - sellado. Dispersión de almidón en agua

destilada (A); inicio de la lixiviación de los componentes estructurales del almidón como

consecuencia del aumento de la temperatura (B); componentes estructurales en solución

posterior a la ruptura del gránulo de almidón (C); evaporación del solvente gradualmente,

acompañado de la conformación helicoidal de las cadenas poliméricas con el huésped

incluido en la cavidad interna de las mismas (D y E). ........................................................ 60

Figura 4-9. Micrografías SEM correspondientes a los complejos de inclusión molecular.

Almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación

de una solución alcalina (ASA); método calentamiento - sellado (CS); método calentamiento

- sellado por rotaevaporación (RE). .................................................................................... 66

Figura 4-10. Termogramas correspondientes a los complejos de inclusión molecular, los

controles y las mezclas físicas de dichos materiales. Almidón de bambú (AB); almidón de

maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación de una solución alcalina (ASA);

método calentamiento - sellado (CS); método calentamiento - sellado por rotaevaporación

(RE); control (CT); ibuprofeno (IBU); mezcla física (MF). ............................................... 70

Figura 4-11. Espectros FTIR correspondientes a los complejos de inclusión molecular, los

controles y las mezclas físicas de dichos controles. Almidón de bambú (AB); almidón de

maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación de una solución alcalina (ASA);


(RE); control (CT); ibuprofeno (IBU); mezcla física (MF). ............................................... 73

Figura 4-12. Difractogramas de rayos X correspondientes a los complejos de inclusión

molecular, los controles y las mezclas físicas. Almidón de bambú (AB); almidón de maíz

(AM); amilosa de papa (A); método acidificación de una solución alcalina (ASA); método

calentamiento - sellado (CS); método calentamiento - sellado por rotaevaporación (RE);

control (CT); ibuprofeno (IBU); mezcla física (MF). ......................................................... 75

Figura 4-13. Perfiles de liberación de ibuprofeno a partir de los diferentes complejos

investigados en condiciones gástricas simuladas pH 1.2. Almidón de bambú (AB); almidón

de maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación de una solución alcalina (ASA);


(RE). .................................................................................................................................... 80


investigados en condiciones simuladas del intestino pH 6.8. Almidón de bambú (AB);

XVIII Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo

almidón de maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación de una solución alcalina

(ASA); método calentamiento - sellado (CS); método calentamiento - sellado por

rotaevaporación (RE). ......................................................................................................... 82


investigados en condiciones simuladas del intestino pH 6.8 en presencia de pancreatina.









Figura A-1. Espectros de absorción obtenidos en la determinación de la cantidad de yodo

necesaria para la cuantificación de amilosa. ....................................................................... 93

Figura A-2. Curva de calibración para la determinación del contenido aparente de amilosa.

............................................................................................................................................. 94

Figura A-3. Espectros de absorción correspondientes a la curva de calibración en la

determinación del contenido aparente de amilosa. ............................................................. 94

Figura B-1. Micrografía SEM de los sólidos insolubles presentes en el almidón (A);

micrografía óptica del almidón con una magnificación de 100x (B). ................................. 95

Figura C-1. Comportamiento de los datos y los ajustes en la determinación del tamaño de

partícula............................................................................................................................... 97

Figura D-1. Espectro de absorción del ibuprofeno obtenido mediante HPLC. ............... 100

Figura D-2. Cromatograma correspondiente al estándar de ibuprofeno (5 µg/mL) obtenido

mediante HPLC. ................................................................................................................ 103

Figura D-3. Cromatogramas obtenidos para la evaluación de la selectividad mediante

HPLC: matriz de almidón de bambú enriquecido con ibuprofeno 5 µg/mL (A); matriz de

almidón de bambú (B); matriz de almidón de maíz (C); fase móvil (D). ......................... 105

Figura D-4. Determinación de la pureza del pico correspondiente al ibuprofeno, datos

procesados con el software Agilent ChemStation con un límite de umbral de 990. ........ 105

Figura D-5. Curva de calibración del sistema obtenida mediante HPLC, datos ajustados a

un modelo de regresión lineal simple. .............................................................................. 106

Contenido XIX

Lista de tablas

Tabla 1-1. Enzimas y sustratos empleados para la síntesis in vitro de la amilosa (Ohdan

et al., 2006). .......................................................................................................................... 8

Tabla 1-2. Agentes complejantes y sus diferentes hospedadores empleados en el estudio de

los complejos de inclusión molecular. ................................................................................ 16

Tabla 1-3. Clasificación de las estructuras cristalinas de los complejos de inclusión

molecular con sus respectivas dimensiones de las celdas unitarias y la localización de la

molécula huésped (adaptado de Putseys et al., 2010). ........................................................ 18

Tabla 3-1. Proporciones de amilosa - amilopectina empleadas en la curva de calibración

requerida para la determinación del contenido de amilosa en almidón. ............................. 30

Tabla 3-2. Condiciones de medida utilizadas para la determinación de la distribución del

tamaño de partícula del almidón de bambú mediante difracción láser. .............................. 33

Tabla 3-3. Propiedades térmicas del almidón de bambú. .................................................. 42

Tabla 3-4. Cristalinidad relativa estimada para el almidón de bambú. .............................. 44

Tabla 4-1. Características fisicoquímicas obtenidas para el almidón de maíz. .................. 47

Tabla 4-2. Condiciones de reacción empleadas para la preparación de complejos de

inclusión molecular basados en almidón. ........................................................................... 48

Tabla 4-3. Modelos matemáticos de liberación empleados para lograr una aproximación al

mecanismo de liberación del activo a partir de los complejos............................................ 55

Tabla 4-4. Porcentajes de rendimiento, porcentaje de ibuprofeno complejado y eficiencia

de complejación determinados para los diferentes complejos. ........................................... 62

Tabla 4-5. Temperaturas y entalpías de disociación de los complejos de inclusión, de los

controles y de las mezclas físicas de dichos controles. ....................................................... 71

Tabla 4-6. Indexación del d-espaciado observado en los respectivos complejos con

ibuprofeno en las celdas unitarias reportadas en la literatura. ............................................ 77

Tabla 4-7. Ajuste a los diferentes modelos cinéticos de los perfiles de liberación de los

diferentes complejos investigados en condiciones gástricas simuladas pH 1.2. ................. 81


diferentes complejos investigados en condiciones simuladas del intestino pH 6.8. ........... 83


diferentes complejos investigados en condiciones simuladas del intestino pH 6.8 en

presencia de pancreatina. .................................................................................................... 86

XX Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo


diferentes complejos investigados en condiciones simuladas del intestino pH 7.2 en

presencia de pancreatina. .................................................................................................... 87

Tabla C-1. Residuales de la curva de datos, ajuste e índices de refracción y absorción

utilizados en la determinación del tamaño de partícula. ..................................................... 97

Tabla D-1. Niveles de concentración seleccionados para evaluar la linealidad del sistema

en la validación de la metodología analítica mediante HPLC. ......................................... 101

Tabla D-2. Datos de idoneidad del sistema obtenidos mediante HPLC. ......................... 104

Tabla D-3. Datos primarios para la evaluación de la linealidad del sistema en la validación

de la metodología analítica mediante HPLC. ................................................................... 107

Tabla D-4. Prueba t de Student para el intercepto y la pendiente empleada para la evaluación

de la linealidad del sistema en la validación de la metodología analítica mediante HPLC.

........................................................................................................................................... 108

Tabla D-5. ANOVA para la evaluación del modelo de regresión lineal empleado en la

validación de la metodología analítica mediante HPLC. .................................................. 108

Tabla D-6. Datos primarios para la evaluación de la repetibilidad de la metodología analítica

mediante HPLC. ................................................................................................................ 109

Tabla D-7. Evaluación de la repetibilidad y prueba de hipótesis estadística C de Cochran

empleados en la validación de la metodología analítica mediante HPLC. ....................... 109

Tabla D-8. Datos primarios para la evaluación de la precisión intermedia de la metodología

analítica mediante HPLC. ................................................................................................. 110

Tabla D-9. ANOVA para la evaluación de la precisión intermedia de la metodología

analítica mediante HPLC. ................................................................................................. 110

Tabla D-10. Evaluación de la exactitud y prueba t de Student realizadas en la validación de

la metodología analítica mediante HPLC. ........................................................................ 111

Tabla D-11. Límite de detección y límite de cuantificación obtenidos con datos de la curva

de calibración correspondiente a la metodología analítica mediante HPLC. ................... 111

Tabla E-1. Datos del porcentaje de liberación acumulado en condiciones gástricas

simuladas pH 1.2. .............................................................................................................. 113

Tabla E-2. Datos del porcentaje de liberación acumulado en condiciones simuladas del

intestino pH 6.8. ................................................................................................................ 113


intestino pH 6.8 en presencia de pancreatina. ................................................................... 114


intestino pH 7.2 en presencia de pancreatina. ................................................................... 114

Tabla E-5. Factor de similitud (f2) correspondiente a los perfiles de liberación obtenidos

para los complejos de inclusión molecular en condiciones gástricas simuladas pH 1.2. . 115


para los complejos de inclusión molecular en condiciones simuladas del intestino pH 6.8.

........................................................................................................................................... 115

Contenido XXI


para los complejos de inclusión molecular en condiciones simuladas del intestino pH 6.8 en

presencia de pancreatina. .................................................................................................. 116


para los complejos de inclusión molecular en condiciones simuladas del intestino pH 7.2 en

presencia de pancreatina. .................................................................................................. 116

Contenido XXIII

Lista de símbolos y abreviaturas

Símbolos con letras latinas Símbolo Término

ΔH Entalpía de gelatinización

k0 Constante de velocidad de liberación de orden cero

k1 Constante de velocidad de liberación de primer orden

kH Constante de velocidad de liberación de Higuchi

kkC Constante de velocidad de liberación de Korsmeyer - Peppas

nKP Exponente n del modelo matemático de Korsmeyer - Peppas

Abreviaturas Abreviatura Término

AFM Microscopía de fuerza atómica (Atomic Force Microscopy)

AOAC

International

Asociación de Colaboración Analítica Oficial Internacional

(Association of Official Analytical Collaboration (AOAC)

International)

ASA Acidificación de una solución alcalina (Alkaline Solution

Acidification)

ATR Reflectancia total atenuada (Attenuated Total Reflectance)

BSE Electrones retrodispersados (Back-Scattered Electrons)

CS Calentamiento - sellado

DP Grado de polimerización (Degree of Polymerization)

XXIV Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo

DSC Calorimetría diferencial de barrido (Differential Scanning

Calorimetry)

FTIR Espectrometría infrarroja por transformada de Fourier (Fourier-

Transform Infrared Spectroscopy)

FMI Perspectivas del mercado futuro (Future Market Insights)

GP Glucógeno fosforilasa (Glycogen Phosphorylase)

G-1-P Glucosa 1-fosfato (Glucose 1-Phosphate)

HP-DSC Calorimetría diferencial de barrido de alta presión (High Pressure

Differential Scanning Calorimetry)

IBU Ibuprofeno

NMR Resonancia magnética nuclear (Nuclear Magnetic Resonance)

RE Rotaevaporación

SANS Dispersión de neutrones de ángulo pequeño (Small-Angle Neutron

Scattering)

SAXS Dispersión de rayos X de ángulo pequeño (Small-Angle X-Ray

Scattering)

SE Electrones secundarios (Secondary Electrons)

SEM Microscopía electrónica de barrido (Scanning Electron Microscopy)

S-IB Segmentos interbloques

S-IC Segmentos interclúster

TEM Microscopía electrónica de transmisión (Transmission Electron

Microscopy)

WAXS Dispersión de rayos X de ángulo amplio (Wide-Angle X-Ray

Scattering)

XRD Difracción de rayos X (X - Ray Diffraction)

Introducción

El almidón es uno de los carbohidratos naturales más abundantes en las plantas en donde es

biosintetizado en forma de gránulos semicristalinos, almacenado como fuente de energía en

diferentes órganos incluidos los frutos, semillas, hojas, tubérculos, raíces, y es transformado

en hidratos de carbono simples durante periodos de actividad fotosintética reducida. El

contenido de almidón, así como el tamaño, la forma geométrica, la composición y la

estructura de los polímeros constituyentes de los gránulos, varían dependiendo de las

condiciones ambientales del cultivo, la edad de la planta y la fuente botánica (Lawton, 2015).

Los almidones comercialmente disponibles son aislados principalmente de cereales como el

maíz y el trigo, y de tubérculos como la papa y la yuca, siendo el maíz la fuente más

importante con una producción mundial del 83% (Lawton, 2015). Dentro de las aplicaciones

del almidón como excipiente en la industria farmacéutica se destacan su uso como

desintegrante, aglutinante, absorbente, viscosante, diluente y deslizante, entre otras (Qi y

Tester, 2019). En el campo cosmético es frecuentemente utilizado como diluente en polvos

faciales, absorbente en talcos y estabilizante en emulsiones.

Las diferentes propiedades del almidón debidas especialmente a la fuente botánica motivan

la exploración de nuevas fuentes de este carbohidrato que permitan obtener características

funcionales únicas. Debido a su biodegradabilidad, biocompatibilidad y disponibilidad, el

almidón se ha convertido en un material de partida para desarrollar excipientes con nuevas

funcionalidades, como es el caso de los almidones modificados que han sido empleados en

la preparación de emulsiones de Pickering (Albert et al., 2019)

Igualmente, los almidones han sido investigados como transportadores de moléculas activas

con el propósito de aportar alternativas de solución a los retos de disminuir los efectos

secundarios de algunas moléculas activas, protegerlas frente a condiciones ambientales

2 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo

adversas, entregarlas en el sitio de acción y de forma controlada, así como satisfacer la

exigencia de emplear como excipientes materiales biodegradables y biocompatibles. Con

este propósito se han desarrollado técnicas de encapsulación empleando almidones tales

como el secado por aspersión (Ocampo-Salinas et al., 2020; Rocha et al., 2012), la extrusión

(Hassanzadeh et al., 2017; Xie et al., 2020), el recubrimiento por lecho fluidizado (Li et al.,

2019), y la coacervación (Fiedler et al., 2020; Zaki Rizkalla et al., 2013), entre otros

(Saifullah et al., 2019). Dentro de estas últimas, la encapsulación por inclusión resulta de

interés para la presente investigación. Esta técnica permite la asociación supramolecular de

un ligando o huésped en un hospedador que contiene una cavidad interna donde se aloja

finalmente el huésped estabilizado por puentes de hidrógeno y fuerzas de van der Waals o

bien, por el efecto hidrofóbico impulsado por la entropía (Gouin, 2004).

Se ha demostrado que el almidón puede formar complejos de inclusión helicoidales con

moléculas orgánicas como alcoholes y ácidos grasos (Le Bail et al., 2005; Obiro et al., 2012;

Takeo et al., 1973; Wulff et al., 2005), así como con moléculas inorgánicas (Tomasik y

Schilling, 1998). La adición de ligandos complejantes induce la formación de hélices

simples denominadas V-amilosa, especialmente en las cadenas lineales de amilosa y en las

cadenas que hacen parte de la estructura ramificada de la amilopectina (Conde-Petit et al.,

2006). Estas hélices presentan una cavidad hidrófoba y una superficie hidrofílica, que

permiten la complejación de compuestos bioactivos lipofílicos en su interior. Estos

complejos de inclusión presentan propiedades interesantes con aplicaciones potenciales en

la industria farmacéutica y de alimentos. Por ejemplo, los complejos formados con amilosa

y lípidos modulan las propiedades reológicas y de resistencia a la hidrólisis ácida, así como

a la degradación enzimática, siendo empleados principalmente en la industria de alimentos

para disminuir el envejecimiento del pan. Adicionalmente, debido a la similitud de las

estructuras tipo V-amilosa con las ciclodextrinas, el uso de estos complejos puede brindar

protección a las moléculas activas frente a diferentes condiciones ambientales del tracto

gastrointestinal disminuyendo los efectos secundarios y permitiendo la entrega del activo en

el intestino.

La estructura V-amilosa se puede obtener en diferentes formas macromoleculares tales como

fibras, monocristales lamelares y esferulitas que dependen principalmente de las

Introducción 3

condiciones de cristalización. El estudio de los alomorfos se ha llevado a cabo

principalmente mediante difracción de rayos X (XRD), donde se han propuesto modelos

moleculares de hélices-zurdas simples (Buléon et al., 1990; Helbert y Chanzy, 1994; Putseys

et al., 2010; Rappenecker y Zugenmaier, 1981; Yamashita et al., 1973). Sin embargo, varios

detalles de dichas estructuras, como la influencia de la molécula huésped en la conformación

helicoidal, la disposición del empaquetamiento cristalino, la forma como se ubica la

molécula huésped dentro o entre las hélices, el mecanismo por medio del cual se da la

complejación y los parámetros de cristalización que afectan la estructura final, entre otros,

permanecen sin ser resueltos.

La mayoría de investigaciones en este tema se han centrado en la complejación de amilosa

con ácidos grasos de interés para la industria alimentaria (Conde-Petit et al., 2006;

Cozzolino y Degner, 2016; Cui y Oates, 1999; Crowe et al., 2000; Kim et al., 2017; Putseys

et al., 2010; Wang et al., 2019), pero muy poco se ha abordado en el campo farmacéutico

como una alternativa de sistema de entrega de fármacos (Yang et al., 2013; Zhang et al.,

2016; Carbinatto et al., 2016; Zhang et al., 2011; Cohen et al., 2008, 2011; Marinopoulou

et al., 2019). Como un aporte en este sentido, la presente tesis investiga la formación de

complejos de inclusión entre almidón y una molécula modelo (ibuprofeno) y con el

propósito de generar valor agregado a los recursos naturales disponibles en Colombia, se

empleó como hospedador un almidón nativo extraído del bambú. Así, la primera parte de

este trabajo se centra en la obtención de dicho almidón y la caracterización de sus

propiedades estructurales y fisicoquímicas de interés en su función como agente

complejante. Posteriormente, en la segunda parte se investigó la preparación de los

complejos de inclusión empleando el almidón nativo de bambú e ibuprofeno. Como

referencia, también fueron preparados complejos entre el activo y el almidón de maíz. Este

es un primer paso dentro del grupo de investigación en Desarrollo y Calidad de Productos

Farmacéuticos y Cosméticos -GIDECA- hacia el empleo del almidón como material de

partida para el diseño de medicamentos en los que además, se aprovechen fuentes no

convencionales de este excipiente.

1 Marco teórico

El almidón es un carbohidrato no estructural, insoluble en agua, compuesto por dos

homopolímeros con unidades de D-glucosa conocidos como amilosa y amilopectina, los que

representan alrededor del 98% de su peso en base seca y cuya relación varía según la fuente

botánica (Tester et al., 2004). En las plantas, el almidón existe como gránulos

semicristalinos insolubles biosintetizados mediante un proceso complejo llevado a cabo en

varios tejidos de órganos tales como hojas, raíces, brotes, frutas, granos y tallos (Bertoft,

2017; Preiss, 2018). Las diferencias entre las proporciones de amilosa y amilopectina y la

forma en la que se organizan al interior de los gránulos varía dentro y entre las diferentes

especies, repercutiendo en su forma, tamaño y propiedades como absorción de agua,

hinchamiento, gelificación y susceptibilidad a la degradación enzimática, entre otras (Wang

y Copeland, 2013). Esta variabilidad se origina principalmente en los procesos biosintéticos

dado que se involucran genes que están sujetos a controles de desarrollo e influencias

ambientales (Wang y Copeland, 2013). Igualmente el método de aislamiento del almidón y

las técnicas analíticas empleadas para su caracterización pueden explicar algunas diferencias

entre ellos (Vamadevan y Bertoft, 2015).

La mayoría de los almidones nativos se caracterizan por un contenido de amilosa que varía

entre el 20% y el 30%, aunque pueden existir variantes naturales fuera de este rango (Chung

y Liu, 2009; Wang y Copeland, 2013). Por otra parte, los gránulos de almidón pueden

contener pequeñas cantidades de proteínas ubicadas a nivel superficial, así como minerales

y lípidos (Vamadevan y Bertoft, 2015). Estos últimos representan la fracción asociada más

importante en los gránulos de almidón; así, en algunos almidones de cereales como el de

trigo se encuentran porcentajes entre 0.8% y 1.2% y para almidón de maíz, entre 0.6% y

0.8% (Buléon et al., 1998). Algunos gránulos de almidón contienen poros en la superficie y

canales internos que varían en términos de su ubicación, dimensión y extensión y que


podrían estar conectados entre sí y con la cavidad interna del gránulo como ocurre en los

almidones de maíz y sorgo (Jane, 2009; Qi y Tester, 2019); dichos poros han sido empleados

para la incorporación de moléculas activas tales como clorhidrato de tiamina, riboflavina,

ácido gálico, caquetina, leucina, isoleucina, metionina, lisina, ibuprofeno, benzocaína,

sulfapiridina, curcumina y ácido ascórbico (Han et al., 2015; Janaswamy, 2014; WeiRong

y HuiYuan, 2002; Zhu, 2017b) dentro de los gránulos de almidón en su forma nativa,

planteándose como una alternativa a los sistemas transportadores convencionales. De igual

manera, es posible inducir la formación de los poros cuando éstos están ausentes en los

almidones nativos mediante hidrólisis ácida o por métodos enzimáticos, favoreciendo la

carga de la molécula de interés (Qi y Tester, 2019).

1.1 Amilosa

La amilosa es una molécula lineal con un rango de peso molecular de aproximadamente 105

g mol-1 y 106 g mol-1 y un grado de polimerización (DP) entre 1000 y 10000 unidades de

glucosa (Copeland et al., 2009; Gidley et al., 2010). Como se muestra en la Figura 1-1,

dichas unidades de glucosa están unidas principalmente por enlaces α(1→4) de D-

glucopiranosa. No obstante, se encuentran puntos de ramificación con enlaces α(1→6) que

varían según el origen botánico (Gunning et al., 2003; Takeda et al., 1987).

Figura 1-1. Representación estructural de la amilosa.

La localización de la amilosa dentro de los gránulos de almidón aún no se conoce muy bien.

En este sentido, se han propuesto varias hipótesis que indican que algunas cadenas de

amilosa participan en interacciones con la amilopectina; por otro lado, que la amilosa podría

estar en mayor proporción en la periferia que en el núcleo amorfo de los gránulos. Sin

embargo, una hipótesis contradictoria indica que la amilosa forma la mayor parte del núcleo

O

H

H

OH

OHOH

H

H

H

CH2OH

O

O

H

H

OH

OH

H

H

H

CH2OH

O

O

H

H

OH

OH

H

H

H

CH2OH

O

O

H

H

OH

OH

H

H

H

CH2OH

OH

n

1

23

4

5

6

1

23

4

5

6

Marco teórico 7

amorfo de los gránulos y una pequeña cantidad de sus cadenas se intercalan entre los grupos

de amilopectina orientados hacia la superficie de dichos gránulos actuando como columnas

de refuerzo (Blazek y Gilbert, 2011; Wang y Copeland, 2013).

La amilosa obtenida de los gránulos de almidón es heterogénea en cuanto a su tamaño

molecular, no es completamente lineal y puede estar contaminada por moléculas de

amilopectina. A diferencia de ésta, la amilosa obtenida mediante síntesis presenta ciertas

ventajas que incluyen el lograr cadenas de peso molecular más homogéneo y completamente

lineales, lo que es de gran importancia en la complejación con moléculas huésped.

La amilosa puede ser sintetizada enzimáticamente tratando de imitar la capacidad de la

naturaleza en dicho proceso (Wulff et al., 2005). Algunas de las enzimas y sustratos

empleados con este propósito se presentan en la Tabla 1-1, dentro de ellas, las más utilizadas

son la isoamilasa y la glucógeno fosforilasa. La isoamilasa cataliza la escisión de los enlaces

α(1→6) presentes en las cadenas de amilosa y amilopectina siendo una alternativa para la

obtención de cadenas lineales de amilosa principalmente a partir de la amilopectina. Sin

embargo, a pesar de que es un método económico, no permite obtener cadenas con el DP

deseado. Además, el tamaño promedio de las cadenas depende de las características

estructurales de la amilopectina (Doblado-Maldonado et al., 2017; Ohdan et al., 2006). Por

su parte, la síntesis empleando la enzima glucógeno fosforilasa (GP) y su sustrato glucosa

1-fosfato (G-1-P) permite tener control sobre el tamaño molecular de la amilosa con altos

rendimientos (> 60%); sin embargo, es una metodología poco económica (Ohdan et al.,

2006; Yanase et al., 2005).

Existen diferentes métodos para el fraccionamiento de la amilosa a partir de los gránulos de

almidón, los que se pueden dividir en cuatro grupos según su principio de separación

(Hanashiro, 2015): (I) lixiviación y separación acuosa de amilosa después de someter los

gránulos de almidón a un proceso de gelatinización (Banks et al., 1959; Doblado-Maldonado

et al., 2017; Meyer et al., 1940; Greenwood y Thomson, 1962; Hizukuri, 1991; Schoch,

1945), (II) precipitación de un complejo insoluble de amilosa con agentes complejantes

(Banks y Greenwood, 1967; Bourne et al., 1948; Kuge y Takeo, 1968; Klucinec y

Thompson, 1998; Schoch, 1942, 1945), (III) cromatografía de permeación en gel (Karve et


al, 1981; Kobayashi et al., 1985; Kennedy et al., 1992; Klucinec y Thompson, 1998;

Yamada y Taki, 1976) y (IV) separación de la amilosa soluble después de la precipitación

de un complejo insoluble de la amilopectina con concanavalina A o lectina (Matheson y

Welsh, 1988; Matheson, 1996; Yun y Matheson, 1990). Cada método presenta sus ventajas

y desventajas en términos de rendimiento y pureza.

Tabla 1-1. Enzimas y sustratos empleados para la síntesis in vitro de la amilosa (Ohdan et al., 2006).

Enzima Sustrato

Almidón (glucógeno) sintasa ADP-glucosa (UDP-glucosa)

Isoamilasa Almidón

Ciclodextrina glicosil transferasa (CGTasa) Ciclodextrina

D-enzima Maltrodextrina

Amilosucrasa Sacarosa

Glucógeno fosforilasa (GP) Glucosa 1-fosfato (G-1-P)

Sacarosa fosforilasa + glucógeno fosforilasa Sacarosa

Celobiosa fosforilasa + glucógeno fosforilasa Celobiosa

1.2 Amilopectina

La amilopectina (Figura 1-2) comprende aproximadamente el 70% del peso del gránulo de

almidón; no obstante, a diferencia de la amilosa, es una molécula altamente ramificada con

enlaces glucosídicos α(1→4) presentando aproximadamente de 4% a 5% de puntos de

ramificación con enlaces α(1→6) (Preiss, 2018; Vamadevan y Bertoft, 2015). La

amilopectina tiene un rango de peso molecular entre 107 g mol-1 y 109 g mol-1 (Gidley et al.,

2010) y un grado de polimerización (DP) que oscila entre 5.6 x 105 y 5.6 x 107 con un

número promedio de cadenas por molécula entre 180 y 1800 (Tang et al., 2006). Al igual

que en el caso de la amilosa, estas características de la amilopectina difieren con la fuente

botánica.

La organización de la molécula de amilopectina se describe en términos de las cadenas A,

B y C, donde las cadenas A son cadenas externas que están unidas a cadenas internas (B) a

través de enlaces α(1→6). Por otra parte, las cadenas B llevan otras cadenas A y B como

Marco teórico 9

ramificación a través de enlaces α(1→6). Cada macromolécula posee una única cadena C

de la que se desprenden otras cadenas (A y B) como ramificación y que está caracterizada

por la presencia de un grupo terminal reductor (Figura 1-3). Hanashiro et al. (1996) indican

que las cadenas de amilopectina pueden ser agrupadas según sus unidades de glucosa en

cadenas A: cadenas cortas con un DP entre 6 - 12; cadenas B1: cadenas cortas con un DP

entre 13 - 24; cadenas B2: cadenas cortas con un DP entre 25 - 36; y cadenas B3: cadenas

largas con un DP > 37 (Bertoft, 2004). Aunque la relación de cadenas A y B, así como su

longitud, varían según el origen botánico, de forma general la amilopectina tiene un número

mayor de cadenas A que de cadenas B, con proporciones que varían de 1.0:0 a 1.5:1 (Buléon

et al., 1998; Bertoft, 2004; Vamadevan y Bertoft, 2015).

Figura 1-2. Representación estructural de la amilopectina.

A partir de los resultados de la determinación de las longitudes de las cadenas de

amilopectina se han propuesto varios modelos respecto a la organización de la amilopectina

dentro del gránulo de almidón, de los cuales, el modelo de grupo (clúster) y el modelo de

columna vertebral de bloques de construcción (building block backbone) (Bertoft, 2015) son

los más aceptados (Figura 1-4). El primero propone que las cadenas cortas de amilopectina

se organizan en grupos paralelos, interconectados por cadenas largas y caracterizados por

presentar segmentos internos con una longitud menor a 9 unidades de glucosa. Por su parte,

el modelo de columna vertebral de bloques de construcción sugiere que los grupos se forman

a

1

23

4

5

6

1

23

4

5

6

c

1

23

4

5

6

1

23

4

5

6

b

1

23

4

5

6

CH2OH

OH

O

H

H

OH

OH

H

H

H

CH2OH

O

O

H

H

OH

OH

H

H

H

CH2OH

O

O

H

H

OH

OH

H

H

H

CH2OH

O

H

H

OH

OHOH

H

H

H

CH2OH

O

O

H

H

OH

OH

H

H

H

CH2

O

O

H

H

OH

OH

H

H

H

CH2OH

O

O

H

H

OH

OH

H

H

H

CH2OH

O

H

H

OH

OHOH

H

H

H

O

O

H

H

OH

OH

H

H

H

CH2OH

OH


a partir de unidades estructurales más pequeñas llamadas “bloques de construcción”,

ubicadas perpendicularmente a un esqueleto formado por las cadenas largas de amilopectina

con un segmento interno de 1 a 3 unidades de glucosa (Vamadevan y Bertoft, 2015; Wang

y Copeland, 2013). Sin embargo, la determinación de las longitudes de las cadenas de

amilopectina no indican la organización estructural de dichas cadenas, por lo que hasta el

momento no existe evidencia científica que permita distinguir entre los dos modelos. Por

ello el modelo que se considera aplicable en un determinado momento depende de su

capacidad para explicar las diferentes propiedades funcionales del almidón (Vamadevan y

Bertoft, 2015).

Figura 1-3. Clasificación de las cadenas de amilopectina. Los círculos representan las unidades de glucosa,

las líneas horizontales representan los enlaces α(1→4) y las líneas curvas los enlaces α(1→6), el círculo con

una línea cruzada representa el grupo terminal reductor. Todas las cadenas A son cadenas externas, por otro

lado las cadenas B consisten de un segmento externo y un segmento interno, este último es definido como las

unidades entre los puntos de ramificación sin tener en cuenta toda la longitud de la cadena y que es representado

en la figura mediante los círculos con un punto en su interior (Adaptado de Pérez y Bertoft, 2010).

1.3 Estructura interna del gránulo de almidón

Los gránulos de almidón son resistentes a la degradación por parte de la mayoría de enzimas

amilolíticas, lo que limita su estudio empleando métodos por degradación enzimática. Por

tal motivo, la mayoría de información se ha obtenido mediante métodos de caracterización

física como XRD, microscopía electrónica de barrido (SEM), microscopía electrónica de

transmisión (TEM), microscopía de fuerza atómica (AFM) (Copeland et al., 2009) y

química como la espectroscopía de resonancia magnética nuclear (NMR) (Manners, 1989).

La arquitectura interna de los gránulos de almidón nativo es compleja y depende

principalmente del origen botánico.

Marco teórico 11

Figura 1-4. Modelos estructurales propuestos para representar la organización de la amilopectina dentro de

los gránulos de almidón. Los gránulos de almidón consisten en anillos de crecimiento con una alternancia entre

laminillas cristalinas (C) y amorfas (A) que son observadas en mayor detalle en la parte inferior de la imagen.

Los detalles de las dobles hélices (cilindros) y bloques de construcción (círculos grises) se representan en la

figura central, los círculos en blanco y negro representan las unidades de glucosa. Los segmentos interbloques

(S-IB) y los segmentos interclúster (S-IC) se encuentran en ambos modelos, la unidad principal en el modelo

de clúster es el clúster y en el modelo de columna vertebral de bloques de construcción es el bloque de

construcción, el cual es mucho más pequeño y estrechamente ramificado. Una diferencia importante entre los

modelos es que en el modelo de clúster las cadenas de amilopectina penetran las laminillas mientras que en el

modelo de columna vertebral de bloques de construcción no sucede (adaptado de Vamadevan y Bertoft, 2015).

En términos generales se considera que la amilopectina se caracteriza por formar anillos de

crecimiento (Baker et al., 2001; Ridout et al., 2003, 2006; Zhu, 2017a) con un núcleo amorfo

que corresponde a capas concéntricas semicristalinas de 120 nm a 400 nm de espesor,

separadas por regiones amorfas que involucran la presencia de amilosa (Figura 1-5A). Las

capas cristalinas consisten en una alternancia regular entre laminillas amorfas y cristalinas

(Figura 1-5B) con una distancia de repetición de 9 nm a 10 nm (Buléon et al., 2007; Wang

y Copeland, 2013), y debido a sus propiedades birrefringentes pueden ser observadas por


microscopía de luz polarizada mostrando una cruz de malta (Gallant et al., 1997). La

disposición de las cadenas externas ramificadas y no ramificadas de la amilopectina

contribuyen a la cristalinidad de los gránulos mediante la formación de dobles hélices

organizadas en grupos cristalinos (Wang y Copeland, 2013).

A) B) C) D)

Figura 1-5. Representación esquemática de la estructura interna de los gránulos de almidón desde los anillos

de crecimiento: (A) imagen TEM sección fina de un gránulo de almidón; (B) alternancia de los anillos de

crecimiento amorfos y semicristalinos; (C) modelado de la estructura de la amilopectina. Las líneas en puntos

describen las laminillas amorfas y cristalinas (repetición de 9-10 nm) que corresponden a los puntos de

ramificación; (D) detalle de un clúster que muestra la formación de doble hélices de las cadenas ramificadas

cortas de la amilopectina (adaptado de Buléon et al., 2007).

La estructura helicoidal de los componentes del almidón fue propuesta en 1937 y seis años

después (1943) surge la primera evidencia cristalográfica para dichas estructuras (Hancock

y Tarbet, 2000). Los modelos más recientes se basan en hélices bicatenarias paralelas,

diestras o zurdas, y empaques antiparalelos o paralelos en la celda unitaria. Energéticamente

es más favorable la hélice de mano izquierda en comparación con la de mano derecha

(Imberty et al., 1991). De otro lado, a partir de análisis por XRD se ha identificado que los

gránulos de almidón exhiben polimorfos que dependen de la disposición de las dobles

hélices dentro de los grupos cristalinos (clústers). El polimorfo A, el cual está más

densamente empaquetado, es característico de los cereales y el polimorfo B, menos denso o

con una estructura más abierta, predomina en los almidones de tubérculos, de raíces y de

almidones con alto contenido de amilosa (Wang y Copeland, 2013). Por otra parte, el

polimorfo C predomina en las leguminosas y algunas raíces y frutas. De igual manera se ha

identificado la estructura cristalina Vh - amilosa, característica de los complejos con ácidos

grasos y monoglicéridos formados tras el proceso de gelatinización del almidón. Si bien

estos complejos están presentes en los almidones nativos, rara vez son detectados. Solo se

Marco teórico 13

dispone de evidencia mediante NMR en estado sólido, de complejos amorfos de amilosa -

lípidos presentes en almidones nativos de maíz, arroz y avena (Morrison et al., 1993).

Las diferencias entre los polimorfos A y B surgen del contenido de agua y la manera en que

éstos se empaquetan en los respectivos cristales (Figura 1-6). De acuerdo con el modelo de

dobles hélices, en el polimorfo A, que se caracteriza por una altura de paso (distancia entre

dos giros sucesivos de la hélice) de 2.08 nm a 2.38 nm, las cadenas se empaquetan con el

grupo espacial B2 en una celda unitaria monoclínica (a = 2.124 nm, b = 1.172 nm, c = 1.069)

con ocho moléculas de agua por celda unitaria (Figura 1-6A) y en el polimorfo B, las hélices

dobles se empaquetan con el grupo espacial P61 en una celda unitaria hexagonal (a = b =

1.85 nm, c =1.04 nm) con treinta y seis moléculas de agua por celda unitaria (Figura 1-6B)

(Buléon et al., 1998; Pérez et al., 2009).

Figura 1-6. Modelos moleculares de hélices, proyecciones de las celdas unitarias y el patrón cristalográfico

correspondiente a: (A) polimorfo A; (B) polimorfo B y (C) polimorfo Vh - amilosa (adaptado de Buléon et al.,

1998 y Kong et al., 2014c).


1.4 Complejos de inclusión basados en almidón

Un complejo de inclusión se define como un arreglo molecular en el que un componente

hospedador o anfitrión forma una cavidad que contiene espacios en forma de túneles en los

que se ubican entidades moleculares de una especie química conocida como huésped. El

complejo se caracteriza porque no existe ningún enlace covalente entre el hospedador y el

huésped y la interacción se debe principalmente a fuerzas de van der Waals y puentes de

hidrógeno. Si los espacios en la estructura del hospedador están enrejados, la especie

huésped está atrapada como en una jaula; en estos casos el complejo resultante se denomina

clatrato o compuesto enjaulado (McNaught y Wilkinson, 2009).

Dentro de las ventajas que ofrece la tecnología de complejación molecular en el ámbito

farmacéutico se incluyen:

• Incremento de la solubilidad: La complejación produce un aumento de la solubilidad

acuosa de fármacos lipofílicos dado que el complejo resultante tiene una cavidad interior

donde se ubica la mayor parte de la funcionalidad hidrófoba de la molécula, mientras

que los grupos hidrófilos se orientan en la superficie externa permaneciendo expuestos

al entorno; como resultado se obtiene un complejo hospedador - fármaco soluble en agua

(Lee y Lee, 1995; Moriwaki et al., 2008; Hu et al., 2012; Auda, 2014; Sharma y Baldi,

2016; Loh et al., 2016; Pacheco et al., 2018).

• Mejora de la absorción: Cuando la baja biodisponibilidad de una molécula se debe a su

baja solubilidad, los complejos aumentan su velocidad de disolución y en consecuencia,

su absorción. Se ha reportado que el aumento de la solubilidad también mejora la

absorción percutánea o rectal de un fármaco (Choudhury y Nelson, 1992; Auda, 2014;

Nair et al., 2014; Sharma y Baldi, 2016; Jacob y Nair, 2018; Lima et al., 2019a, 2019b).

• Aumento de la estabilidad: La complejación permite la protección de un activo frente a

diferentes ambientes fisiológicos e impide su degradación al ser expuesto al oxígeno, el

agua, la radiación y el calor (Hu et al., 2012; Sharma y Baldi, 2016; Yildiz et al., 2018a,

2018b; Rajbanshi et al., 2020).

Marco teórico 15

• Reducción de la irritación: Algunas moléculas activas pueden generar irritación en el

estómago, la piel y los ojos; por lo tanto, su administración como complejos de inclusión

molecular permite disminuir estos efectos debido a que se reduce la concentración local

del fármaco libre por debajo del umbral de irritación (Sharma y Baldi, 2016; Zhao et al.,

2016; Muankaew y Loftsson, 2018).

• Prevención de incompatibilidades: Las moléculas activas a menudo son incompatibles

entre sí o con los excipientes en una formulación. Así, la complejación de moléculas

estabiliza las formulaciones separando físicamente los componentes para evitar posibles

incompatibilidades físicas o químicas (Sharma y Baldi, 2016).

• Enmascaramiento de olores y sabores: Los olores desagradables o sabores amargos de

las moléculas activas o excipientes dentro de una formulación se pueden enmascarar por

complejación debido a que se ocultan las moléculas o los grupos funcionales causantes

de dichos sabores u olores frente a los receptores sensoriales; el resultado es un complejo

con el activo que tiene poco o ningún sabor u olor siendo más aceptable para el usuario

(Marques, 2010; Sharma y Baldi, 2016).

• Favorece la manipulación de materiales: Sustancias como aceites, que se caracterizan

por ser líquidos a temperatura ambiente, pueden generar problemas cuando se pretende

su uso en formas de dosificación sólidas estables. En este sentido, a través de la

complejación, tales sustancias se convierten en polvos que pueden incorporarse en este

tipo de productos (Sharma y Baldi, 2016).

La amilosa tiende a formar complejos de inclusión helicoidales con una variedad de agentes

complejantes tales como lípidos y ligandos pequeños como alcoholes y compuestos de

sabor, que pueden inducir la formación de hélices simples (Tabla 1-2) caracterizadas por un

patrón de XRD tipo Vh (Putseys et al., 2010; Lourdin et al., 2015).

Dependiendo del tamaño de la molécula huésped, la amilosa puede adoptar una estructura

helicoidal con seis, siete u ocho unidades de glucosa por turno, donde la estructura con seis

unidades de glucosa ha sido ampliamente investigada empleando ácidos grasos y alcoholes

lineales. Un modelo ampliamente aceptado indica que la parte alifática de dichas moléculas


se ubican en el interior de la hélice mientras que el grupo polar se ubica fuera de ella (Pérez

y Bertoft, 2010; Obiro et al., 2012; Cheng et al., 2018).

Tabla 1-2. Moléculas huésped y sus diferentes hospedadores empleados en el estudio de los complejos de

inclusión molecular.

Molécula huésped Hospedador Referencia Hexanal Amilosa de maíz, amilosa de arroz,

amilosa de papa, almidón de papa, almidón de maíz

Jouquand et al. (2006), Ma et al. (2019), Wulff et

al. (2005)

(E)-2-Decenal, (E)-2-nonenal, octenol Amilosa de maíz Wulff et al. (2005)

Decanal Amilosa de maíz, almidón de papa, amilosa de papa

Le Bail et al. (2005), Nuessli et al. (1995), (1997), Wulff et al. (2005)

Guaiacol, fentona Amilomaiz Wulff et al. (2005)

(E)-2-Octenal, (E,E)-2,4-decadienal, (Z)-

4-decenal, (E)-4-decenal

Amilosa de papa Wulff et al. (2005)

Mentona Amilosa de papa, amilosa sin

especificación

Conde-Petit et al. (2006), Le Bail et al. (2005)

Timol, mentol, alcanfor, geraniol,

carvona, δ-heptalactona, δ-nonalactona, δ-

decalactona, δ-dodecalactona, γ-

decalactona, γ-dodecalactona

Amilosa sin especificación Conde-Petit et al. (2006)

α-Naftol Amilosa de papa, amilosa sin

especificación

Conde-Petit et al. (2006), Le Bail et al. (2005)

Linalol, 2-hexanona Amilomaiz Wulff et al. (2005)

Butanol Amilosa de papa Helbert y Chanzy (1994), Le Bail et al. (2005)

Ácido caprílico Amilosa de papa Godet et al. (1995)

Ácido láurico Amilosa de papa, almidón de maíz, amilomaiz

Fanta et al. (1999), Godet et al. (1995), Meng et al. (2014)

Ácido palmítico Amilosa de papa, almidón de maíz,

amilomaiz, amilosa de guisante, Hylon® VII

Bhosale y Ziegler (2010), Fanta et al. (1999), Godet

et al. (1995), Kong y Ziegler (2014a), Marinopoulou et al. (2016a), (2016b), (2016c), Meng et al. (2014a),

(2014b), Raphaelides et al. (2015)

Pentanol Amilosa de papa Helbert y Chanzy (1994)

Ácido decanoico Amilosa de papa, amilosa de guisante, Hylon® VII

Biais et al. (2006), Marinopoulou et al. (2016a), (2016b), (2016c)

Ácido hexanoico Amilosa de papa Biais et al. (2006)

Ibuprofeno Amilosa de papa, amilosa sintética Yang et al. (2013), Zhang et al. (2016)

Praziquantel, nimesulida Hylon® VII Carbinatto et al. (2016)

Ácido mirístico Almidon de maíz, amilomaiz, amilosa de guisante, Hylon® VII

Fanta et al. (1999), Marinopoulou et al. (2016a),

(2016b), (2016c), Meng et al. (2014b), Raphaelides

et al. (2015) Acido esteárico

Almidón de maíz, amilomaiz, amilosa de guisante, Hylon® VII

Fanta et al. (1999), Marinopoulou et al. (2016a), (2016b), (2016c), Meng et al. (2014b)

Ácido oleico Almidón de maíz, amilosa de

guisante, Hylon® VII

Marinopoulou et al. (2016a), (2016b), (2016c),

Meng et al. (2014)

Ácido linoleico Almidón de maíz, amilosa de

guisante, Hylon® VII

Marinopoulou et al. (2016a), (2016b), Meng et al.

(2014b), Seo et al. (2016)

Monoestearato de glicerina Almidón de semillas de loto Chen et al. (2017)

Palmitato de ascorbilo Amilosa de papa, Hylon® VII Ma et al. (2011), Kong y Ziegler (2014a), (2014b)

Palmitato de retinilo, ésteres de fitosterol Hylon® VII Ma et al. (2011)

Ácido salicílico Amilomaiz, amilosa sintética Oguchi et al. (1998), Wang et al. (2017)

Quercetina Almidón de maíz Zhang et al. (2011)

Ácido ferúlico Almidón de yuca Hung et al. (2013)

Genisteína Amilosa de papa, Hylon® VII Cohen et al. (2008), (2011)

2-Naftol Amilosa sintética Uchino et al. (2001)

Indometacina Amilosa de guisante, almidón de guisante

Marinopoulou et al. (2019)

Marco teórico 17

La cavidad interna de la hélice está revestida con grupos metileno y enlaces glucosídicos

dando como resultado una cavidad hidrófoba, mientras que los grupos hidroxilo se ubican

en el exterior de la hélice generando una superficie externa hidrofílica (Immel y

Lichtenthaler, 2000; Obiro et al., 2012). Debido a las fuerzas de van der Waals y a los

puentes de hidrógeno, se generan enlaces intramoleculares e intermoleculares entre los

residuos de glucosa a lo largo de las hélices, el agua y el ligando, permitiendo cierta

estabilidad a la hélice simple (Putseys et al., 2010; Obiro et al., 2012). Por lo tanto, la

cavidad interna puede contener moléculas de agua que están unidas entre sí, pero no a la

amilosa, y se localizan principalmente en los espacios interhelicoidales donde forman una

red mediante puentes de hidrógeno en un modo bidentado glucosil-O···H-O-H···O-glucosil,

generando cierto grado de estabilidad a la estructura helicoidal (Obiro et al., 2012). Los

complejos entre la amilosa y lípidos tales como ácidos grasos, lisofosfolípidos y

monoacilglicéridos, pueden modificar significativamente las propiedades y funcionalidades

de los almidones. Por ejemplo, se logra reducir la solubilidad del almidón en agua, alterar

sus propiedades reológicas, disminuir su capacidad de hinchamiento, incrementar su

temperatura de gelatinización, debilitar la estructura del gel, retardar la retrogradación y

aumentar su resistencia a la degradación enzimática (Copeland et al., 2009).

Los complejos V-amilosa se pueden clasificar en dos grupos dependiendo de sus

propiedades térmicas y cristalinas. Los complejos tipo I, que se generan debido a una rápida

nucleación en el proceso de cristalización, se caracterizan por presentar una transición

endotérmica cercana a 100 °C y un patrón de XRD amorfo (Tufvesson et al., 2003). Por otra

parte, los complejos tipo II, que pueden ser divididos en IIa y IIb, requieren el empleo de

una mayor temperatura en su formación y se caracterizan por presentar transiciones

endotérmicas alrededor de 115 °C y 125 °C y un patrón de XRD de tres picos característicos

de una estructura más ordenada en comparación con la del tipo I (Obiro et al., 2012; Wang

y Copeland, 2013; Doblado-Maldonado et al., 2017).

De otro lado, cuando los complejos de amilosa se analizan mediante difracción de rayos X

de ángulo amplio (WAXS) es posible lograr diferencias en su estructura cristalina que han

servido de base para proponer una clasificación según el tamaño de la hélice y la ubicación

más probable de la molécula huésped (Tabla 1-3). Es importante tener en cuenta que, aunque


algunas de estas propuestas están sustentadas en aproximaciones cristalográficas obtenidas

mediante estudios computacionales, otras solo corresponden a hipótesis (Lourdin et al.,

2015).

Tabla 1-3. Clasificación de las estructuras cristalinas de los complejos de inclusión molecular con sus

respectivas dimensiones de las celdas unitarias y la localización de la molécula huésped (adaptado de Putseys

et al., 2010).

Estructura Localización del

ligando

Dimensiones de la celda unitaria

a (nm) b (nm) c (nm)

Vh V6I Cavidad helicoidal 1.36 - 1.37 2.37 - 2.58 0.78 - 0.81

Va Cavidad helicoidal 1.30 - 1.32 2.25 - 2.70 0.79

Vbutanol V6II Cavidad helicoidal y

espacio intersticial 2.74 2.65 0.80

Visopropanol V6III Cavidad helicoidal y

espacio intersticial 2.82 2.93 0.80

V7 Cavidad helicoidal y

espacio intersticial 3a 2.83a 0.78a

a(Yamashita et al., 1973). Debido a que no existe un consenso respecto a la nomenclatura

empleada para hacer referencia a las diferentes estructuras cristalinas se presentan los dos

tipos usados comúnmente en la literatura.

Cuando el tamaño de la hélice corresponde al de seis unidades de glucosa por turno se tienen

las estructuras tipo V61 o Vh, donde el ligando está incluido dentro de la cavidad helicoidal

que presenta un diámetro de aproximadamente entre 13.0 Å y 13.7 Å y una cavidad interna

entre 5.0 Å y 5.4 Å. Bajo condiciones de secado de la estructura Vh se genera una estructura

anhidra denominada Va, la que presenta unas dimensiones de celda más pequeñas con un

diámetro externo entre 13.0 Å y 13.3 Å, las moléculas que inducen este tipo de estructuras

son los ácidos grasos y los alcoholes lineales. La estructura V6II también denominada como

Vbutanol, hospeda el ligando no solo dentro de las hélices sino también en los espacios

intersticiales generando un aumento en las dimensiones de las celdas unitarias. Por otra

parte, en la estructura V6III o Visopropanol el ligando también está ubicado dentro de las hélices

y en los espacios intersticiales; sin embargo, se diferencia de la estructura V6II en que el

espacio intersticial es mayor y por ende, las dimensiones de su celda unitaria. No obstante,

Marco teórico 19

en presencia de ligandos voluminosos las cadenas poliméricas adoptan una conformación

helicoidal con siete u ocho unidades de glucosa por turno. En efecto, moléculas como

mentona y fentona inducen la formación de estructuras V7 y el naftol estructuras V8 (Conde-

Petit et al., 2006; Putseys et al., 2010; Obiro et al., 2012).

La formación de los complejos V-amilosa se ve afectada por el tipo de almidón, el DP de

sus componentes estructurales (amilosa y amilopectina), el tipo de ligando, la relación

almidón o amilosa - ligando, la temperatura de complejación, el tiempo de complejación y

el pH del medio, entre otras (Putseys et al., 2010; Obiro et al., 2012; Seo et al., 2016).

Recientemente, se ha demostrado que la cooperatividad positiva es una característica

importante de los complejos de inclusión donde un primer ligando influencia el aumento de

la afinidad de unión de un segundo ligando. Al respecto, Carbinatto et al. (2016)

evidenciaron la cooperatividad positiva de un ácido graso (ácido palmítico) en la formación

de complejos de inclusión molecular con dos moléculas farmacológicamente activas

(praziquantel y nimesulida) y almidón de maíz con alto contenido de amilosa (Hylon® VII).

Asimismo, el empleo de modificaciones químicas tales como la degradación enzimática del

almidón de partida puede ser una alternativa importante para lograr mayor afinidad entre el

huésped y el hospedador. En este sentido Arijaje y Wang (2016) demostraron que después

de someter los almidones de maíz y de papa a una degradación enzimática empleando

isoamilasa y un tratamiento adicional con β-amilasa para disminuir el peso molecular de las

cadenas de amilosa y amilopectina, se incrementa la capacidad de complejación de los

almidones debido a que se generan cadenas de amilosa y amilopectina con longitudes más

favorables para la formación de complejos de inclusión molecular. Igualmente, Reddy et al.

(2018) reportan resultados similares empleando pululanasa como enzima desramificadora.

Teniendo en cuenta que los complejos a base de almidón son insolubles en agua, Conde-

Petit et al. (2006) reportaron que la hidroxipropilación de la amilosa y la amilopectina en un

bajo grado favorece su incorporación en sistemas acuosos, lo que puede resultar de interés

en su aplicación como portadores de moléculas activas.

Para la preparación de los complejos de inclusión molecular basados en almidón han sido

reportados diferentes métodos, que de acuerdo con Putseys et al. (2010) pueden clasificarse


en tres grupos: (I) formación a partir de almidón y un ligando, (II) a partir de amilosa y un

ligando y (III) síntesis de la amilosa en presencia de un ligando. La formación de los

complejos con los métodos II y III genera estructuras más puras y monodispersas.

Desde otro punto de vista, Obiro et al. (2012) proponen una clasificación considerando el

procedimiento empleado en la obtención de los complejos. Así, también se reconocen tres

categorías: (I) métodos clásicos, (II) métodos enzimáticos y (III) métodos termomecánicos.

Los métodos clásicos se basan en la mezcla de una dispersión de almidón y el ligando en

condiciones de calentamiento. Para tal fin, el almidón es previamente disuelto a una

temperatura entre 40 °C y 130 °C garantizando su completa disolución en solventes tales

como el agua, también denominado método de calentamiento - sellado (Oguchi et al., 1998;

Heinemann et al., 2001; Uchino et al., 2001; Wulff et al., 2005; Biais et al., 2006; Bhosale

y Ziegler, 2010; Hung et al., 2013; Kong y Ziegler, 2014b; Carbinatto et al., 2016; Seo et

al., 2016; Wang et al., 2017; Feng et al., 2018; Kumar y Loos, 2019), en una solución de

hidróxido de potasio (KOH), denominado método de acidificación de una solución alcalina

(Lalush et al., 2005; Cohen et al., 2008, 2011; Yang et al., 2013; Marinopoulou et al., 2016a,

2016b, 2017c, 2019; Zhang et al., 2016) o en dimetilsulfóxido (DMSO) (Godet et al., 1995;

Lalush et al., 2005; Lay Ma et al., 2011b; Kong y Ziegler, 2014b). Luego, el ligando es

adicionado y la dispersión es sometida a calentamiento empleando temperaturas elevadas

(entre 70 °C y 170 °C) para facilitar la formación del complejo. Dependiendo del medio

empleado se realiza un ajuste de pH hasta aproximadamente 4.5 y en todos los casos se lleva

a cabo un proceso de enfriamiento para permitir la cristalización (Panyoo y Emmambux,

2017).

Respecto a los métodos enzimáticos, éstos se pueden clasificar en dos grupos: métodos

completamente enzimáticos que involucran la síntesis de las cadenas poliméricas de amilosa

a partir de unidades de glucosa (Kaneko y Kadokawa, 2005; Yang et al., 2013) y métodos

parcialmente enzimáticos en los que se emplean las cadenas poliméricas como punto de

partida para, mediante un proceso de degradación enzimática, generar cadenas poliméricas

con el DP de interés (Wongprayoon et al., 2018).

Marco teórico 21

Finalmente, los métodos termomecánicos requieren el empleo simultáneo de procesos de

calentamiento y fuerzas de cizallamiento para la formación de complejos V-amilosa, dentro

de los que se incluyen la cocción a chorro de vapor (Fanta et al., 1999; Kenar et al., 2016),

la homogeneización (Meng et al., 2014a, 2014b; Chen et al., 2017), la extrusión

(Raphaelides et al., 2015) y recientemente, la formación de complejos de inclusión

molecular mediante electrohilado (Kong y Ziegler, 2014b).

2 Objetivos

2.1 Objetivo general

Contribuir al diseño de un nuevo sistema de administración de fármacos mediante el

desarrollo de un complejo de inclusión helicoidal con al menos una molécula

farmacológicamente activa y utilizando almidón nativo como material de partida.

2.2 Objetivos específicos

• Obtener almidón a partir de bambú (Rhipidociadum Harmonicum (Parodi) McClure)

como fuente alternativa disponible en Colombia y caracterizar algunas propiedades

fisicoquímicas de interés para el desarrollo de un complejo de inclusión molecular.

• Formar y caracterizar fisicoquímicamente un complejo de inclusión helicoidal a partir

del almidón obtenido en cumplimiento del objetivo anterior y al menos una molécula

farmacológicamente activa.

3 Extracción y caracterización del almidón de

bambú

De acuerdo con Future Market Insights (FMI), el mercado global para el bambú estaba

valorado en 3.600 millones de dólares a finales del 2017 (Chen et al., 2020). Esto se debe a

que el bambú se ha utilizado principalmente como material de construcción desde la

antigüedad (Hong et al., 2020) y como sustituto de la madera debido a que es un material

económico, ecológico y sostenible. Por otro lado, los culmos de bambú se comercializan

como productos alimenticios en forma de brotes de bambú enlatados o envasados al vacío

para ser utilizados en diferentes preparaciones alimenticias, dado su carácter dulce y su

contenido de vitaminas A, B6, C y E, de fitoesteroles y de 17 aminoácidos de los cuales

ocho son esenciales para el cuerpo humano (Felisberto et al., 2017). Asimismo, el elevado

contenido de fibra del bambú lo convierte en una fuente para la extracción de fibra dietética

que es comercializada en productos como Jelucel®BF, Nutriloid®, Bamboo Fiber® y

CreaFibe® (Felisberto et al., 2018).

Desde el punto de vista agrícola, el bambú es un cultivo que no requiere pesticidas y no tiene

antecedentes de propagación de plagas como los cultivos de soja, maíz, trigo o caña de

azúcar. Adicionalmente, es un cultivo económicamente viable debido a que sus culmos son

perennes y asexuales, por lo que no requiere un proceso de recultivo (Felisberto et al.,

2017b), con un crecimiento de aproximadamente 36 m en 6 meses (Luo et al., 2019).

Como se ha mencionado, el presente proyecto busca generar valor agregado al bambú a

través de la investigación de su posible aplicación como excipiente farmacéutico para el

diseño de sistemas de liberación de activos. En este orden de ideas, inicialmente se realizó

su extracción y posteriormente se avanzó en su caracterización, considerando

principalmente la aplicación prevista.


3.1 Métodos y materiales

Como material de partida para el desarrollo de la presente investigación se utilizaron

almidón nativo obtenido de una fuente poco convencional como el bambú y almidón nativo

de maíz gentilmente donado por Ingredion Colombia S.A. Para el caso del almidón de

bambú, el material vegetal de partida fue colectado en el Departamento de Boyacá

(Municipio de Garagoa, Vereda Caldera Abajo, Finca La Casita. Alt. 1685 m.s.n.m.) para

su posterior identificación taxonómica en el Herbario Nacional de Colombia ubicado en la

Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá, con número de colecta 610329. Con el

propósito de identificar los gránulos de almidón dentro de la estructura del bambú, algunas

muestras del material fueron observadas por microscopía electrónica de barrido (FEI Quanta

200, operado al vacío a una presión de 5.3 x 10-5

Pa y una energía de aceleración del haz de

electrones de 30 kV).

3.1.1 Extracción del almidón

Inicialmente, se realizó un pretratamiento al material vegetal (Figura 3-1) que consistió en

la eliminación manual de las hojas y la corteza de los tallos. Posteriormente, los tallos fueron

cortados con una sierra industrial hasta obtener ortoedros con un tamaño aproximado de

3*1*1 cm y se procedió a la disminución del tamaño de partícula utilizando un molino

(Erweka KU1).

Para la extracción del almidón (Figura 3-2), 200 mL de una solución de cloruro de sodio al

1%, a una temperatura de 4 °C, y 100 g del material vegetal se licuaron durante 60 s

(licuadora industrial Vitamix 62825) para favorecer la desintegración del parénquima

cortical de los tallos y permitir la liberación de los gránulos (Cailliau et al., 2007). La

suspensión obtenida fue filtrada utilizando tela garza y el material retenido se sometió al

mismo procedimiento de licuado las veces necesarias hasta no detectar almidón en el

filtrado, lo que se verificó mediante una prueba cualitativa utilizando una solución de yodo

- yoduro de potasio (2.5 x 10-3 M I2 / 6.5 x 10-3 M KI).

Métodos y materiales 27

Figura 3-1. Pasos para el pretratamiento del material vegetal de bambú previo a la extracción del almidón.

Los filtrados obtenidos fueron colectados en botellas de vidrio a una temperatura de 4 °C y

se permitió la sedimentación del almidón por gravedad durante 18 h. Con el objetivo de

evitar algún proceso biológico de fermentación originado por la actividad microbiana, se

utilizó como preservante azida de sodio (NaN3, Sigma-Aldrich) a una concentración de 20

ppm. Pasadas las 18 h se realizaron tres lavados del material sedimentado descartando el

sobrenadante y resuspendiendo dicho sedimento en agua destilada. Finalmente, el almidón

obtenido se filtró al vacío (Bomba de vacío R-400), se lavó tres veces con etanol al 96%

(Merck Millipore) y por último con acetona (Merck Millipore), se secó a una temperatura

de 45 °C (Jouan IG 150) durante 12 h hasta peso constante (Ohaus® PA214). La torta de

material sólido se trituró con la ayuda de un mortero y se almacenó en recipientes de vidrio

sellados herméticamente para su posterior caracterización y utilización.

3.1.2 Caracterización del almidón de bambú

Una vez obtenido el almidón de bambú, se evaluó su morfología e integridad física mediante

microscopías óptica, de luz polarizada y electrónica de barrido, con el fin de determinar que


el proceso de extracción no había afectado la estructura macro de los gránulos de almidón

debido a los diferentes esfuerzos cortantes a los cuales fue sometido.

Figura 3-2. Pasos para la extracción de almidón a partir de tallos de bambú.

El contenido de humedad, cenizas, fibra cruda y lípidos de las muestras de almidón se

determinaron usando los métodos AOAC (2003) 925.10, 923.03, 962.09, 945.16,

respectivamente, con algunas modificaciones. Todos los análisis se realizaron por triplicado.

Igualmente, se determinó el contenido de amilosa por espectrofotometría UV, se caracterizó

el almidón por DSC, FTIR, XRD y se investigó su comportamiento de hinchamiento.

• Contenido de humedad

El porcentaje de humedad se determinó mediante un método termogravimétrico utilizando

un analizador de humedad halógeno (Radwag® PMX 50). El contenido de humedad se

calculó comparando el peso inicial de la muestra respecto al peso final (Ecuación 3-1).

% Humedad = Peso inicial (g) - Peso final (g)

Peso inicial (g) * 100 (3-1)


• Cenizas

Las cenizas hacen referencia al remanente inorgánico como resultado de una ignición u

oxidación completa de la materia orgánica. La determinación se realizó teniendo en cuenta

la pérdida de masa (Ohaus® PA214) después de la incineración de las muestras (2 g)

depositadas en crisoles de porcelana y posteriormente introducidas en una mufla a una

temperatura de 600 °C durante 3 h. El porcentaje de cenizas se calculó usando la Ecuación

3-2.

% Cenizas = Peso residuo (g)

Peso inicial muestra (g) * 100 (3-2)

• Contenido de lípidos

Se determinó el porcentaje de lípidos en las muestras de almidón mediante una extracción

con solventes orgánicos utilizando un equipo Soxhlet. Para tal fin, se depositaron 30 g de

muestra en un dedal de extracción y se sometieron a reflujo durante 8 h utilizando 200 ml

de una mezcla de acetato de etilo (Merck Millipore) - metanol (Merck Millipore) (1:1).

Posteriormente se evaporaron los solventes con la ayuda de un rotaevaporador (Heidolph

Hei-VAP, temperatura de 60 °C, presión de 200 mbar, velocidad de rotación de 80 rpm). El

material remanente en el balón se extrajo con acetona (Merck Millipore) para ser sometido

a un secado en una estufa (Jouan IG 150) durante 12 h a 45 °C hasta peso constante (Ohaus®

PA214). La proporción de lípidos se calculó a partir de la Ecuación 3-3.

% Lípidos = Peso residuo (g)


• Contenido de fibra cruda

Para la determinación de la fibra cruda, 3 g de almidón se sometieron a digestión con una

solución de KOH 0.1 N (300 mL) a una temperatura de 90 °C (IKA® C-Mag HS 7) durante


4 h con agitación continua (250 rpm). Posteriormente, la solución se filtró al vacío (bomba

de vacío R-400) en caliente, el residuo se lavó dos veces con agua destilada y se secó en una

estufa (Jouan IG 150) durante 24 h a una temperatura de 45 °C hasta peso constante (Ohaus®

PA214). El porcentaje de fibra o sólidos insolubles se calculó mediante la Ecuación 3-4.

% Fibra cruda = Peso residuo seco (g)


• Contenido de amilosa

El contenido de amilosa se determinó espectrofotométricamente siguiendo el procedimiento

descrito por McGrance et al. (1998), con ligeras modificaciones. Inicialmente, se preparó

una curva de calibración con seis niveles de relación amilosa - amilopectina en diferentes

proporciones (Tabla 3-1) utilizando estándares de amilosa de papa (A0512 Sigma-Aldrich)

y amilopectina de papa (10118 Fluka Biochemika) previamente secados en una estufa

(Jouan IG 150) durante 12 h a 45 °C, hasta peso constante (Ohaus® PA214).

Tabla 3-1. Proporciones de amilosa - amilopectina empleadas en la curva de calibración requerida para la

determinación del contenido de amilosa en almidón.

Nivel 1 2 3 4 5 6

% Amilosa 0 10 25 50 75 100

% Amilopectina 100 90 75 50 25 0

Así, 20 mg de muestra de la mezcla amilosa - amilopectina correspondiente se dispersaron

en 6 mL de DMSO (Merck Millipore) usando viales de vidrio sellados herméticamente.

Dicha mezcla fue sometida a calentamiento durante 1 h a una temperatura de 90 °C (IKA®

C-Mag HS 7) en un baño de agua con agitación continua (250 rpm). Posteriormente, las

muestras se enfriaron a temperatura ambiente y la solución obtenida se llevó a un volumen

total de 10 mL en un balón aforado utilizando agua destilada. Se tomaron 500 µL de dicha

dilución y se llevaron a un volumen total de 25 mL en un balón aforado utilizando agua

destilada. Para determinar la cantidad de solución de yodo - yoduro de potasio (2.5 x 10-3 M

I2 / 6.5 x 10-3 M KI) necesaria para el análisis, es decir aquella cantidad en la que la


absorbancia de la muestra no se ve afectada dado que se garantiza la complejación completa

del yodo con la amilosa, se eligió el nivel 6 de la curva de calibración donde se tiene el 100%

de amilosa. Así, 1.4 mL de la solución de amilosa se depositaron en tubos Eppendorf con

capacidad de 1.5 mL. A cada uno de ellos se les adicionó un volumen específico de la

solución de yodo - yoduro de potasio (40, 60, 80 y 100 µL), se agitó en vortex (LB PRO

MX-S) durante 1 min y se dejaron en reposo durante 15 min para su posterior análisis. Los

espectros de absorbancia se tomaron en un rango de 250 nm a 950 nm en un

espectrofotómetro UV-Vis (Shimadzu UV-1800) utilizando celdas de cuarzo con una

longitud de 1 cm, una velocidad de escaneo media y un intervalo de muestreo de 0.5 nm.

Como blanco se empleó agua destilada.

De acuerdo con los espectros obtenidos (Anexo A) se concluyó que la cantidad necesaria de

yodo para la determinación de amilosa en el almidón era de 100 µL y que la longitud de

onda más adecuada correspondía a 620 nm.

Para la determinación del contenido de amilosa de las muestras de almidón se siguió

exactamente el mismo procedimiento descrito previamente en la elaboración de la curva de

calibración y resumido gráficamente en la Figura 3-3. Se realizaron tres réplicas para cada

medición

• Morfología del almidón

Microscopía óptica: Se utilizó un microscopio óptico (Olympus® BX51-P) en modo normal

y de luz polarizada. Las muestras se dispersaron en agua destilada y se sometieron a

ultrasonido (baño Elma S15H) durante 1 min a una frecuencia de 37 kHz para favorecer su

dispersión. Posteriormente se tomó una gota de dicha dispersión con ayuda de una pipeta

Pasteur, se depositó en un portaobjetos y se cubrió con una laminilla cubreobjetos para

realizar la observación al microscopio.

Microscopía electrónica de barrido: Las micrografías electrónicas de barrido de los

almidones fueron tomadas con un microscopio electrónico de barrido (FEI Quanta 200),

equipado con un filamento de tungsteno convencional como fuente de electrones, detectores

de electrones secundarios (SE), electrones retrodispersados (BSE) y de rayos X de


dispersión de energía, además de una cámara interna. Las muestras de almidón fueron

recubiertas con oro al 99.9% de pureza, utilizando un revestidor de pulverización catódica

con bomba rotativa (Q150R ES), durante 30 s a una corriente de pulverización de 60 mA.

El microscopio se operó utilizando vacío a una presión de 5.3 x 10-5

Pa y una energía de

aceleración del haz de electrones de 30 kV.

Figura 3-3. Procedimiento para la preparación de las muestras para la curva de calibración y posterior

determinación del contenido de amilosa.

• Tamaño y distribución de partícula

Se determinó la distribución del tamaño de partícula del almidón de bambú utilizando la

técnica de difracción láser (Mastersizer 3000, Malvern). Debido a la dificultad del almidón

de bambú para ser dispersado, presentando una fuerte tendencia a formar agregados, se

utilizó ultrasonido durante la medición después de verificar la integridad de los gránulos

mediante microscopía óptica. Para todas las mediciones se utilizaron 20 mg de almidón

generando una obscuración entre 5% y 6%. En la Tabla 3-2 se especifican las condiciones

de medida empleadas.

• Calorimetría diferencial de barrido de alta presión (HP-DSC)


La temperatura de transición vítrea y la entalpía de dicha transición en los almidones se

determinó en un calorímetro de alta presión (HP DSC 1 Mettler Toledo®), previamente

calibrado con estándares de indio y paladio. Se utilizaron crisoles estándar de aluminio con

capacidad de 40 µL, se pesó 1 mg de muestra en los crisoles y se adicionaron 5 µL de agua

destilada, posteriormente los crisoles fueron sellados herméticamente y se les realizó una

pequeña perforación en la tapa. El equipo se operó bajo una atmósfera de nitrógeno a una

presión de 1 MPa, con una velocidad de calentamiento de 10 °C/min en un rango de

temperatura de 25 °C a 130 °C, como referencia se utilizó un crisol vacío. El tratamiento de

los datos se realizó utilizando el software STARe, las gráficas y el tratamiento para la línea

base se realizaron con el software OriginPro® 9.

Tabla 3-2. Condiciones de medida utilizadas para la determinación de la distribución del tamaño de partícula

del almidón de bambú mediante difracción láser.

Material Almidón bambú (20 mg)

Índice de refracción 1.52

Índice de absorción 0.18

Densidad 1 (g/cm3)

Tipo de partículas No esférico

Dispersante Agua (500 mL) Índice de refracción 1.33

Medida

Duración de la medida del fondo 60 s

Duración de la medida de la muestra 60 s

Evaluación de la estabilidad del fondo 180 s

Velocidad de agitación 2100 rpm

Ultrasonido Pre medida 1200 s al 100%

Desgasificación después de ultrasonido Si

Alineación después de ultrasonido Si

Número de medidas 5

Modelo de análisis Uso general

Modelo de dispersión Mie

• Espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier (FTIR)

Los espectros vibracionales de las muestras se tomaron en un espectrofotómetro (IR-

Affinity-1S SHIMADZU) equipado con accesorio ATR. Las medidas se llevaron a cabo en


un rango de 3500 cm-1 a 400 cm-1 con una resolución de 4 cm-1, las gráficas y el tratamiento

para la línea base se realizaron con el software OriginPro® 9.

• Difracción de rayos X (XRD)

Los patrones cristalográficos de los almidones se determinaron en un difractómetro de rayos

X PANalytical modelo X´PERT PRO MPD, configuración óptica de Bragg – Brentano,

equipado con un detector de estado sólido de alta velocidad (PIXcel) y un tubo generador

de rayos X con ánodo de cobre. Las condiciones de medida fueron: longitud de onda: 1.54

Å, filtro de níquel, voltaje: 45 kV y corriente: 40 mA, región de escaneo con ángulo dos

theta (2θ) de 7° a 100°, tamaño de paso: 0.0263°, tiempo de paso: 100 s. El porcentaje de

cristalinidad relativa se determinó mediante la relación de la proporción de las áreas

cristalinas y el área total correspondiente a las áreas cristalinas más la contribución de las

áreas amorfas, siguiendo el procedimiento descrito por Lopez-Rubio et al. (2008). El

tratamiento de los datos y el ajuste de la curva se realizó utilizando el software HighScore

plus (versión 3.0c) con una función gaussiana.

• Poder de hinchamiento y solubilidad

Para evaluar el poder de hinchamiento del almidón de bambú se siguió la metodología

propuesta por Li and Yeh (2001), con ligeras modificaciones. Así, 100 mg de muestra (W1)

se depositaron en tubos falcon con capacidad de 50 mL previamente pesados, se adicionaron

10 mL de agua destilada y se sellaron herméticamente. La dispersión de cada tubo se sometió

a calentamiento en un baño de agua durante 1 h con agitación continua (250 rpm) a diferentes

temperaturas: 50 °C, 60 °C, 70 °C, 80 °C y 90 °C (IKA® C-Mag HS 7). Finalizado el tiempo,

la solución se dejó enfriar a temperatura ambiente y se centrifugó a 8000 rcf durante 20 min

(Thermo Scientific™ Heraeus™ Megafuge™ 16), el sobrenadante fue separado

cuidadosamente del sedimento por vertido y transferido a cajas de Petri previamente

pesadas, las que fueron ubicadas en un horno (IKA® Oven 125), a 100 °C, para evaporar el

agua hasta peso constante (Ohaus® PA214). El material residual obtenido luego del secado


corresponde al almidón soluble (Ws). De igual forma, se determinó el peso del sedimento

húmedo (Wa) y después de ser sometido a secado bajo las mismas condiciones previamente

mencionadas (Wo). El poder de hinchamiento expresado en porcentaje (% PH), el porcentaje

de sólidos solubles (% SS) y el porcentaje de sólidos insolubles (% SI) se estimaron mediante

las Ecuaciones 3-5, 3-6 y 3-7. Se realizaron tres réplicas para cada medición.

% SS = Ws

W1

* 100 (3-5)

% SI = W0

W1

* 100 (3-6)

% PH = Wa

W1(100 - % SS) * 100 (3-7)

3.2 Resultados y discusión

De acuerdo con la información suministrada por el Herbario Nacional de Colombia, la

especie de bambú empleada en este estudio como fuente de partida de almidón, se identificó

como perteneciente a la familia Poaceae, con nombre científico Rhipidocladum cf.

Harmonicum (Parodi) Mcclure. Esta especie se distribuye principalmente en Colombia,

Ecuador, Perú, Bolivia y Costa Rica (Figura 3-4). En Colombia, los cultivos se ubican en

los departamentos de Boyacá, Putumayo, Santander y Cundinamarca (GBIF Backbone

Taxonomy, 2019).


Figura 3-4. Registro de presencia de Rhipidocladum cf. Harmonicum (Parodi) Mcclure en América (adaptado

de GBIF Backbone Taxonomy, 2019).

Dentro de la descripción botánica del bambú empleado se destaca que, a diferencia de

parénquimas celulares caracterizados por sus células de tamaño casi uniforme como aquellos

presentes en el arroz, maíz y otras plantas, el bambú presenta células de parénquima cortas

y largas que están posicionadas verticalmente. Las células largas del parénquima se

caracterizan por sus paredes gruesas, polilameladas y lignificadas, y es allí donde se

almacena la energía en forma de gránulos de almidón. Por otro lado, las células del

parénquima cortas se encuentran dispersas entre las células largas y se caracterizan por sus

paredes delgadas, su citoplasma denso y la evidencia de la actividad enzimática de la

peroxidasa en sus paredes (He et al., 2002).

La Figura 3-5 muestra la ubicación de los gránulos de almidón en el bambú y como se

observa, las paredes del parénquima presentan pequeños orificios que juegan un papel

importante en el flujo de savia bruta desde la raíz hasta las hojas de la planta (Luo et al.,

2019).

Ecuador Colombia Perú Bolivia Costa Rica0

10

20

30

40

50

60

70

80

Reg

istr

o d

e pre

senci

a de

espec

ies

Resultados y discusión 37

Figura 3-5. Micrografías SEM del parénquima celular en fibras de bambú.

El rendimiento de extracción del almidón fue de 22.9% ± 1.0% en base seca, excluyendo la

humedad (5.5% ± 1.7%) y los porcentajes de lípidos (0.2% ± 0.1%), cenizas (0.1% ± 0.1%)

y fibra (9.7% ± 0.2%) presentes en el mismo. Este rendimiento se considera elevado

comparado con los valores reportados por otros investigadores para almidón extraído a partir

de diferentes especies de bambú. Por ejemplo, Felisberto et al. (2018) reportan porcentajes

de extracción de 11.6%, 15.2% y 14.6% correspondientes a la parte inferior, media y

superior, respectivamente, de un culmo de bambú (Dendrocalamus asper) de tres años de

edad. Por su parte, Toledo et al. (1987) reportan un porcentaje de extracción de 8.5% para

la especie de bambú Guadua flabellata. Estas diferencias en la cantidad de almidón extraído

podrían ser atribuidas al procedimiento utilizado para la extracción. Igualmente, la edad de

la planta puede tener influencia. En este sentido, se ha encontrado que culmos de bambú

Phyllostachys viridiglaucescens no contienen almidón durante la fase de crecimiento debido

a que todos los nutrientes de la planta deben utilizarse inmediatamente para sus procesos

metabólicos. Por otro lado, en culmos de mayor edad, el almidón está presente incluso hasta

los 12 años (Liese y Weiner, 1996). Asimismo, las diferencias botánicas y las condiciones

climáticas y geológicas propias de la región donde es cultivado el bambú podrían afectar de

forma importante el contenido de almidón en la planta (Asaoka et al., 1984, 1985, 1989).

El contenido aparente de amilosa presente en el almidón de bambú fue de 18.3% ± 1.2%,

que es característico de los almidones nativos y se encuentra en el rango entre 12% y 30%

HV Mag Sig WD 300.0µm

30.0 kV 1000x --- 9.3 mm Universidad Nacional de Colombia




reportado para otras especies de bambú (Ai et al., 2016; Felisberto et al., 2018; Toledo et

al., 1987).

Como se observa en la Figura 3-6A, los gránulos de almidón de bambú exhiben formas

irregulares, algunos de ellos con bordes poliédricos. Esta morfología es similar a la

observada para otras especies de bambú, tales como Dendrocalamus asper (Felisberto et al.,

2018), Guadua flabellata (Toledo et al., 1987) y para semillas de bambú Phyllostachys

heterocycla var. pubescens (Mazel) Ohwi (Ai et al., 2016). Igualmente, estas formas

irregulares del gránulo se han reportado para almidones extraídos a partir de maíz normal y

ceroso (Jane, 2009).

De otro lado, en el almidón de bambú se observa la presencia de gránulos compuestos los

que se forman mediante el ensamblaje de varios gránulos simples presentes en el

aminoplasto. La familia Poaceae, dentro de la cual se encuentran el bambú, el arroz, el maíz,

el sorgo, la cebada y el trigo, entre otros, se caracteriza por presentar este tipo de gránulos,

lo que podría estar relacionado con un recurso que utiliza la planta en la biosíntesis del

almidón, posiblemente para lograr un mayor almacenamiento en los aminoplastos

(Matsushima et al., 2015). Además, es evidente la presencia de algunas impurezas (Figuras

3-6B y 3-6C) atribuidas principalmente a fibras remanentes del proceso de extracción

(Anexo B), y que es consistente con el elevado contenido de fibra determinado en el análisis

químico (9.7% ± 0.2%).

Respecto a las observaciones de los gránulos mediante luz polarizada (Figura 3-6D), se

destaca la birrefringencia propia de las regiones semicristalinas presentes en los gránulos

confirmando así la integridad de la estructura macroscópica del almidón, es decir, el proceso

de extracción no causa alteraciones en este sentido.


Figura 3-6. Micrografías de los gránulos del almidón de bambú, observado en: Microscopio electrónico de

barrido (A y B); microscopio óptico sin luz polarizada con una magnificación de 100x (C); microscopio óptico

de luz polarizada con una magnificación de 100x (D).

Para la determinación de la distribución del tamaño de partícula del almidón de bambú,

inicialmente se determinaron sus índices de refracción y de absorción utilizando para ello

un simulador para la optimización de las propiedades ópticas del material, incluido en el

software V3.62 y la gráfica de datos y ajuste. Como se observa en el Anexo C, Figura C-1

los datos obtenidos en la medición y los datos pronosticados por el modelo se superponen y

mediante el valor de los residuales se verifica su ajuste (Beekman et al., 2005).

Adicionalmente, se demostró la idoneidad de los índices de refracción y de absorción

estimados mediante la comparación de las concentraciones teórica y real del sistema de

partículas suspendidas en el dispersante a través del coeficiente de extinción medido por el

equipo según la teoría Mie de dispersión de luz y la teoría de Lambert Beer. En este caso, la

diferencia entre las dos concentraciones debe ser de máximo un 20%, el que como se reporta

C D

A


30.0 kV 5000x SE 9.7 mm Universidad Nacional de Colombia

B




en el Anexo C, Tabla C-1 es muy superior al valor de 0.0003% obtenido en esta

investigación (Beekman et al., 2005).

El almidón de bambú se caracteriza por una distribución de tamaño de partícula bimodal

(Figura 3-7A), con tamaños pequeños en el rango entre 0.6 µm y 2.5 µm y tamaños grandes

entre 2.5 µm y 100 µm, datos que se pueden observar con mayor claridad en términos de

área superficial o de dos dimensiones (Figura 3-7B). Consistente con las observaciones por

microscopía electrónica de barrido (Figura 3-6 y Anexo B), tamaños de partícula menores a

1 µm se podrían atribuir a diminutos gránulos de almidón o a pequeños fragmentos de fibra

remanentes del proceso de obtención, dado que el análisis no puede discriminar entre

partículas de almidón y algunas impurezas irregulares que el modelo asume como esferas,

dentro del concepto de esferas equivalentes. Por su parte, los tamaños de partícula mayores

a 36 µm pueden corresponder a fibras presentes en el almidón o a agregados de gránulos;

por ello, es indispensable el proceso de sonicación y agitación durante la medición para

minimizar los factores que pueden afectar el análisis de los resultados. Sin embargo, como

se observa en la Figura 3-7A estas distribuciones de tamaño de partícula tienen porcentajes

de densidad en volumen por debajo del 1.5%, lo que indica que tan solo el 1.5% del volumen

total medido proviene de esos diámetros de partícula y el mayor aporte al volumen total

corresponde a los diámetros de partícula entre ~3.6 µm y ~36 µm.

De acuerdo con lo anterior, los datos que se consideraron más prácticos para representar el

rango de tamaños de partícula del almidón de bambú fueron el D10 y el D90, los que

corresponden a los diámetros a partir de los cuales el 10% y el 90% de la población de

partículas se encuentra por debajo, respectivamente. De acuerdo con esto, el almidón de

bambú presenta una distribución de tamaño en volumen en el rango de 3.1 µm ± 0.1 µm a

34.4 µm ± 2.1 µm.


Figura 3-7. Distribución en densidad de volumen del tamaño de partícula del almidón de bambú (A);

distribución del tamaño de partícula del almidón de bambú en términos de área superficial (B).

Para efectos de comparación, es necesario representar el tamaño de partícula a través de

valores únicos tales como el diámetro medio de De Brouckere (D4,3), el valor medio de

Sauter (D3,2), la mediana (D50) y el span. No existe consenso sobre el valor apropiado y

representativo que debe reportarse para describir el tamaño de partícula de una distribución,

por tal motivo se reporta el valor estimado para todos los parámetros mencionados. Como

se observa, el almidón tiene un diámetro medio D4,3 de 15.0 µm ± 1.0 µm en términos de

volumen; cuando la distribución se analiza en términos de área superficial, el valor medio

D3,2, el cual es sensible a la presencia de partículas finas en la distribución de tamaño, es de

6.0 µm ± 0.1 µm. La mediana D50, que corresponde al valor medio a partir del cual reside

la mitad de la población tanto por encima como por debajo de dicho valor fue de 9.3 µm ±

0.4 µm. Finalmente, el span, que es una forma de representar mediante un único valor el

ancho de la distribución permitiendo evaluar la homogeneidad en el tamaño de las partículas,

fue de 3.4, un valor elevado que sugiere una distribución amplia, es decir, poca

homogeneidad de la muestra.

El coeficiente de variación correspondiente a los valores D10, D50, D90 (3%, 3%, y 4%,

respectivamente) son un indicativo de la reproducibilidad de las mediciones. Dicha

reproducibilidad se verificó mediante los límites de aceptación definidos por la norma ISO

13320-1 incluidos en el software del equipo (Mastersizer v3.62). Así, en términos generales,

1 10 1000

1

2

3

4

5

6

7

8

Den

sidad

en v

olu

men

(%

)

Diámetro de partícula (m)

0.1 1 10 100

0

1

2

3

4

5

6

7

Den

sidad

par

a el

are

a su

per

fici

al (

%)

Diámetro de partícula (m)

A B


todas las mediciones fueron reproducibles con una variabilidad dentro de los límites

establecidos por la norma ISO (D10 y D90 ≤ 5%, D50 ≤ 3%)

De otro lado, el almidón de bambú presenta elevada temperatura y baja entalpía de

gelatinización (Tabla 3-3, Figura 3-8A) comparado con almidones de otras fuentes botánicas

como el maíz y la papa, cuyas temperaturas y entalpías de gelatinización varían entre 62.5

°C y 71 °C, y entre 11.07 J g-1 y 19.8 J g-1, respectivamente (Srichuwong et al., 2005; Alvani

et al., 2011; Rocha et al., 2011; Jiang et al., 2020). Esto podría estar relacionado con las

características de las cadenas ramificadas de la amilopectina donde las cadenas de dobles

hélices estables podrían favorecer el empaquetamiento de las cadenas de amilopectina en

regiones cristalinas, confiriendo estabilidad térmica a estas estructuras, tal como lo propone

Felisberto et al. (2018) para el almidón de bambú Dendrocalamus asper y por Ai et al.

(2016) para el almidón de semillas de bambú (Phyllostachys heterocycla var. pubescens

(Mazel) Ohwi), donde los valores de temperatura y entalpía de gelatinización se encontraron

entre 73.4 °C y 84.7 °C y 4.2 J g-1 y 14.2 J g-1, respectivamente.

Tabla 3-3. Propiedades térmicas del almidón de bambú.

Gelatinización

Almidón Ti (°C) Tp (°C) Tf (°C) ΔH (J g-1)

Bambú 75.8 79.1 82.9 8.8

Temperatura de inicio (Ti); temperatura del pico (Tp); temperatura final (Tf);

entalpía de gelatinización (ΔH).

El espectro FTIR del almidón de bambú se muestra en la Figura 3-8B. Los picos

característicos para los grupos -OH de los residuos de glucosa y el agua presente en la

muestra aparecen en ~3280 cm-1 y en ~1648 cm-1, que se asignan a las vibraciones de

estiramiento y flexión, respectivamente. La vibración de estiramiento del enlace C-O

aparece en ~1150 cm-1, C-O-C en ~997 cm-1 y C-O-H en ~1078 cm-1. Por su parte la

vibración de estiramiento correspondiente al enlace C-H se observa en ~2930 cm-1.

El patrón de XRD del almidón de bambú investigado se muestra en la Figura 3-9. Como se

observa, este almidón se caracteriza por un patrón cristalino de tipo A con picos

característicos en ángulos de Bragg (2θ) de 15.3°, 17.2°, 18.1° y 23°, observaciones que son


consistentes con lo reportado por Felisberto et al. (2018) que han caracterizado el almidón

de otra especie de bambú (15.1°, 16.8° y 22.3° en 2θ). De acuerdo con Tian et al. (2010) y

Ye et al. (2018), el pico de difracción en el ángulo 2θ de ~20° podría ser atribuido a la

presencia de una estructura cristalina endógena del tipo V-amilosa que se asocia a la

presencia de complejos amilosa - lípidos. El patrón de cristalinidad tipo A es característico

de los almidones de cereales tales como el arroz (Srichuwong et al., 2005; Bertoft et al.,

2008; Kong et al., 2015), maíz (Cheetham y Tao, 1998; Ngobese et al., 2018; Jiang et al.,

2020), centeno (Bertoft et al., 2008), trigo (Ao y Jane, 2007) y cebada (Ao y Jane, 2007;

Bertoft et al., 2008), entre otros. No obstante, es importante destacar que a pesar de que en

dichos cereales el almidón es extraído a partir de un gránulo y el de bambú de un culmo,

estos pertenecen a la misma familia Poaceae, lo que podría explicar la relación en el patrón

cristalográfico tipo A. Igualmente, el almidón extraído de géneros como Manioh, Ipomea,

Dioscórea, Colocasia y Coleus también presentan este tipo de cristalinidad (Gallant et al.,

1982).

Figura 3-8. Termograma obtenido para el almidón de bambú mediante HP-DSC (A); espectro infrarrojo

obtenido para el almidón de bambú (B).

El patrón cristalográfico obtenido para el almidón de bambú da indicios sobre la distribución

de sus cadenas ramificadas de amilopectina. En este sentido, es probable que la estructura

correspondiente al polimorfo A se caracterice por tener un DP ≥ 37, una baja proporción de

cadenas largas con un grado de polimerización (DP) de 25 – 36 y una elevada proporción

de cadenas cortas con DP 6 - 12 y DP 13 - 24 (Felisberto et al., 2018). Esto resulta de gran

30 40 50 60 70 80 90 100

F

lujo

de

calo

r en

doté

rmic

o

Temperatura (°C)

A

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Tra

nsm

itan

cia

(%)

Longitud de onda (cm-1)

B


importancia para esta investigación dado que influencia la capacidad de la amilopectina para

formar complejos de inclusión molecular. Como ha sido reportado por Godet et al. (1995),

la amilopectina forma este tipo de complejos siempre y cuando la longitud de las cadenas

ramificadas tengan un DP mayor a 20.

Figura 3-9. Patrón de difracción de rayos X del almidón de bambú.

Respecto al comportamiento de hinchamiento del almidón, éste se encuentra relacionado

con su gelatinización, es atribuido principalmente a la amilopectina y su valor varía en

función inversa al contenido de amilosa (Cozzolino et al., 2013). Como se observa en la

Figura 3-10A, el poder de hinchamiento del almidón de bambú aumenta con la temperatura

presentando un incremento pronunciado en la región de 70 °C a 90 °C. Un comportamiento

similar es observado para los sólidos solubles o índice de solubilidad (Figura 3-10B), el que

corresponde al porcentaje de materia seca presente en el sobrenadante, principalmente

amilosa.

Tabla 3-4. Cristalinidad relativa estimada para el almidón de bambú.

Almidón Patrón cristalográfico Cristalinidad (%)

Bambú Tipo A 21.7

La cantidad de sólidos solubles lixiviados aumenta significativamente en el rango entre 80

°C y 90 °C debido a que en estos valores se encuentra la temperatura de gelificación como

se evidencia en el análisis térmico (Figura 3-8A). En este punto, la estructura del almidón

10 15 20 25 30 35 40 45

Inte

nsi

dad

2 (°)


sufre una transición orden - desorden que genera la ruptura del grano y la lixiviación

completa de sus componentes (Hoover, 2001). Respecto a los sólidos insolubles (Figura 3-

10B), que hace referencia al porcentaje de materia seca presente en el sedimento, como era

de esperarse disminuye en función de la temperatura debido a que parte de la amilosa del

gránulo ha lixiviado.

Figura 3-10. Poder de hinchamiento del almidón de bambú (A); porcentaje de sólidos solubles (%SS) e

insolubles (%SI) lixiviados en el almidón de bambú (B).

De acuerdo con los comportamientos obtenidos para el almidón de bambú respecto al

porcentaje de sólidos solubles y sólidos insolubles, para garantizar la formación del

complejo de inclusión molecular por el método de calentamiento sellado es necesaria una

temperatura superior a 80 °C debido a que la formación de dicho complejo ocurre

principalmente con la amilosa y es indispensable que ésta se encuentre disponible en el

medio de disolución para que interactúe con la molécula huésped.

50 60 70 80 904

6

8

10

12

14

16

18

20

Poder

de

hin

cham

iento

(%

)

Temperatura (°C)

50 60 70 80 90

5

10

15

20

25

% SS

% SI

Temperatura (°C)

% S

S

80

85

90

95

100

105

% S

I

A B

4 Preparación y caracterización de complejos de

inclusión molecular a base de almidón nativo

Los complejos de inclusión molecular ofrecen ventajas tales como el incremento de la

solubilidad, la mejora de la biodisponibilidad, el aumento de la estabilidad, la reducción de

la irritación generada en el tracto gastrointestinal y el enmascaramiento de olores y sabores

de moléculas activas (Sharma y Baldi, 2016). Con el propósito de explorar la posible

aplicación de estos sistemas específicamente en el diseño de productos con

biodisponibilidades que respondan a las necesidades terapéuticas, en esta investigación se

da un primer paso en el que se evalúa la capacidad del almidón de bambú para formar

complejos con ibuprofeno, un fármaco que fue seleccionado como molécula modelo dada

su baja solubilidad en agua (0.021 mg mL-1 a 20 °C) y sus dimensiones moleculares: ancho

4.265 Å y largo 9.7 Å (Yang et al., 2013). El ibuprofeno (Figura 4-1) es un ácido

monocarboxílico derivado de la sustitución del hidrógeno unido al carbono en la posición 2

del ácido propiónico por un grupo 4-isobutilfenil, es una molécula ópticamente activa con

dos isómeros S y R, donde el isómero S es el más activo biológicamente (Pubchem, 2016).

Figura 4-1. Representación de la estructura química de la mezcla racémica del ibuprofeno (ácido 2-(4-

isobutilfenil) propiónico).

Este fármaco se clasifica dentro de los antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) y actúa

inhibiendo la producción de prostaglandinas, mediadores que están relacionados con la

1

2

6

3

5

2 O

OH

CH3

1

2

CH3

CH3

R3

3

1

4

1

2

6

3

5

2 O

OH

CH3

1

2

CH3

CH3

3

3

1

4

S

y


inflamación y el dolor. Igualmente, se utiliza como antipirético (Pereva et al., 2020) y en el

tratamiento de la artritis reumatoide aguda y crónica (Liu y Gao, 2012). Al administrar este

activo por la vía oral se generan ciertos efectos adversos en su paso por el tracto

gastrointestinal superior, tales como erosión gástrica, úlcera péptica y sangrado

(Marinopoulou et al., 2019). De esta forma los complejos de inclusión podrían ser una

alternativa interesante para la entrega dirigida al intestino mejorando su desempeño

terapéutico. Asimismo, teniendo en cuenta que los complejos de inclusión se forman

principalmente con amilosa, se utilizó un estándar de amilosa de papa (A0512 Sigma-

Aldrich) como control positivo. De otro lado, para lograr un análisis comparativo del

almidón de bambú como portador del activo de interés, también fueron preparados

complejos a partir de almidón nativo de maíz previamente caracterizado siguiendo las

metodologías descritas en el capítulo anterior (Tabla 4-1). Como se observa, los almidones

de bambú y de maíz presentan similitudes en sus características fisicoquímicas.

Tabla 4-1. Características fisicoquímicas obtenidas para el almidón de maíz.

Ensayo Resultados

Caracterización química

Humedada (%) 5.13 ± 0.74

Cenizasa (%) 0.17 ± 0.05

Fibra (%) ND

Lípidosa (%) 0.18 ± 0.02

Amilosaa (%) 16.30 ± 2.24

Difracción de rayos X Patrón cristalográfico Tipo A

Cristalinidad (%) 14.70

Propiedades térmicas Temperatura de gelificación (°C) 71.10

ΔH (J/g) 22.35 a Datos presentados como el promedio ± intervalo de confianza de 3 réplicas; no detectable

(ND); entalpía de gelatinización (ΔH).

4.1 Métodos y materiales

4.1.1 Preparación de los complejos de inclusión molecular

En la presente investigación, los complejos de inclusión molecular se prepararon bajo

diferentes condiciones de tiempo de complejación, concentración de almidón y método de

complejación (Tabla 4-2), con el fin de evidenciar la influencia de estos parámetros en las


características fisicoquímicas del complejo. En todos los casos donde se empleó almidón de

maíz o almidón de bambú se utilizó el activo en una relación almidón - ibuprofeno 50:1.

Cuando se trabajó con amilosa de papa, la relación amilosa - activo fue de 1:10. Esto

teniendo en cuenta que el estándar de amilosa es esencialmente libre de amilopectina. Se

utilizaron tres métodos de complejación: acidificación de una solución alcalina (ASA),

calentamiento - sellado (CS) y calentamiento sellado por rotaevaporación (RE).

Tabla 4-2. Condiciones de reacción empleadas para la preparación de complejos de inclusión molecular

basados en almidón.

Complejo Método

Cantidad

de agua

(mL)

Tiempo de

reacción

(h)

Cantidad

de almidón

(g)

Cantidad de

ibuprofeno

(mg)

AB-1%-ASA

Acidificación de

una solución

alcalina

300 3 3 60

AM-1%-ASA 300 3 3 60

AM-1%-ASA* 300 0.5 3 60

AB-1.5%-ASA 200 3 3 60

AM-1.5%-ASA 200 3 3 60

A-0.6%-ASA 200 3 1.2 120

AB-4%-CS

Calentamiento -

sellado

10 3 0.4 8

AB-4%-CSPG 10 3 0.4 8

AB-8%-CS 5 3 0.4 8

AM-8%-CS 5 3 0.4 8

AB-5%-RE

Calentamiento -

sellado por

Rotaevaporación

60 3 3 60

El rótulo correspondiente a cada almidón tiene la siguiente estructura XX-X%-XX; la primera abreviatura

hace referencia al tipo de almidón o en su defecto al estándar de amilosa, los caracteres numéricos

especifican el porcentaje (p/v) del almidón o en su defecto del estándar de amilosa y las últimas

abreviaturas indican el método de preparación de los complejos. Almidón de bambú (AB), almidón de

maíz (AM), amilosa (A), método acidificación de una solución alcalina (ASA), método calentamiento

sellado (CS), método calentamiento sellado utilizando rotaevaporación (RE), almidón pregelatinizado

(XPG), (X*) menor tiempo de complejación.

4.1.1.1 Método de acidificación de una solución alcalina

La complejación por el método de acidificación de una solución alcalina se realizó siguiendo

el procedimiento descrito por Marinopoulou et al. (2019), con ligeras modificaciones. Así,

inicialmente se preparó una dispersión de almidón (1%, 1.5%, o 0.6% según el ensayo) en

KOH 0.1 N a la que se adiciono ibuprofeno en una relación almidón-ibuprofeno 50:1.


Posteriormente la solución se sometió a calentamiento (IKA® C-Mag HS 7) durante 3 h a

una temperatura de 90 °C con agitación constante (250 rpm); para evitar la excesiva pérdida

de agua por evaporación se improvisó una tapa de papel aluminio para cubrir el vaso de

precipitados (Figura 4-2). La solución se dejó enfriar a temperatura ambiente con agitación

constante (180 rpm) y se ajustó a pH 4.5 utilizando HCl al 8% y al 1%, esta última para

facilitar el ajuste del pH deseado. La dispersión obtenida se mantuvo durante 24 h con

agitación constante (150 rpm) a temperatura ambiente, tiempo al cabo del cual las muestras

fueron centrifugadas a 3075 rcf durante 20 min (Hermle Z206 A). El sobrenadante fue

descartado cuidadosamente por vertido y el precipitado se lavó tres veces con una mezcla

etanol (Merck Millipore) - agua destilada 1:1 y por último, con etanol absoluto (Merck

Millipore) agitando en vortex durante 20 s (LB PRO MX-S). Los complejos se secaron

durante 12 h a una temperatura de 45 °C ± 2 °C hasta peso constante (Jouan IG 150). Las

muestras sólidas se trituraron con la ayuda de un mortero y se almacenaron en viales de

vidrio sellados herméticamente para su posterior caracterización.

Figura 4-2. Obtención de los complejos de inclusión molecular por el método de acidificación de una solución

alcalina.


4.1.1.2 Método de calentamiento - sellado

Los complejos de inclusión molecular por la técnica de calentamiento sellado se formaron

siguiendo la metodología descrita por Uchino et al. (2001), con algunas modificaciones

(Figura 4-3). Inicialmente, en un vial de vidrio sellado herméticamente se preparó una

dispersión de almidón (4% y 8% según el ensayo) en agua destilada, a la que se adicionó

ibuprofeno en una relación almidón - ibuprofeno 50:1. Posteriormente la solución se sometió

a calentamiento en un baño de aceite (IKA® C-Mag HS 7) a una temperatura de 90 °C ± 0.2

°C durante 3 h con agitación constante (250 rpm). Finalizado el tiempo de calentamiento, la

dispersión se dejó enfriar a temperatura ambiente y se siguieron los procedimientos de

centrifugación, lavado, secado, trituración y envase previamente descritos en el método de

acidificación de una solución alcalina (Sección 4.1.1.1).

Figura 4-3. Obtención de los complejos de inclusión molecular por el método de calentamiento - sellado.

4.1.1.3 Método de calentamiento - sellado por rotaevaporación

Para la formación de los complejos por el método de calentamiento - sellado por

rotaevaporación se empleó como fuente de calentamiento un rotaevaporador (Heidolph Hei-

VAP). Así, como se presenta en la Figura 4-4, 3 g de almidón se depositaron en un matraz

de evaporación junto con 60 mL de agua destilada y 60 mg de ibuprofeno. La mezcla se

sometió a calentamiento durante 3 h a una temperatura de 90 °C con una velocidad de


rotación de 80 rpm y una presión de 751 mbar, fue necesaria la utilización de aceite industrial

en el baño termostático debido a la temperatura de trabajo. Cumplidas las 3 h de

calentamiento se disminuyó gradualmente la presión hasta alcanzar 90 mbar y una vez

evaporada toda el agua del sistema, el sólido obtenido se retiró del matraz de evaporación y

se realizaron los procedimientos de centrifugación, lavado, secado, trituración y envase

previamente descritos en el método de acidificación de una solución alcalina (Sección

4.1.1.1).

Figura 4-4. Obtención de los complejos de inclusión molecular por el método de calentamiento - sellado por

rotaevaporación.

Los rendimientos de los complejos obtenidos mediante las diferentes metodologías fueron

calculados empleando la Ecuación 4-1.

Rendimiento complejo (%) = Peso precipitado (g)

peso ibuprofeno (g) + almidón (g) * 100 (4-1)

4.1.1.4 Preparación de los controles y las mezclas físicas

Los controles correspondientes a los almidones de bambú y de maíz se prepararon

sometiendo éstos a un tratamiento de acidificación de una solución alcalina (Figura 4-2), en

ausencia de ibuprofeno. Por su parte, las mezclas físicas se prepararon mezclando una


cantidad determinada de los controles previamente obtenidos y una cantidad de ibuprofeno

disuelta en un pequeño volumen de etanol absoluto (Merck Millipore), de tal manera que la

concentración del activo en la mezcla física correspondiera al 0.05%. Posteriormente, el

etanol se evaporó a una temperatura de 45 °C ± 2 °C (Jouan IG 150) durante 1 h y finalmente

la mezcla sólida se trituró con la ayuda de un mortero.

4.1.2 Caracterización de los complejos de inclusión molecular

4.1.2.1 Determinación de la cantidad de ibuprofeno complejado

En viales de vidrio se prepararon 3 mL de una solución de pancreatina (40 unidades/mL)

(A3176 Sigma-Aldrich) en buffer fosfato pH 6.9. A dicha solución le fueron adicionados 30

mg de los complejos y la muestra se sometió a digestión enzimática en un baño de agua a

una temperatura de 37 °C ± 0.2 °C (IKA® C-Mag HS 7) durante 24 h con agitación constante

(150 rpm). Luego, se dejó enfriar a temperatura ambiente y la dispersión resultante se llevó

a un volumen total de 10 mL con etanol absoluto (Merck Millipore). La mezcla fue

centrifugada durante 5 min a 3428 rcf (Hermle Z216 M), filtrada (filtros Millipore Corp), y

analizada mediante cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) utilizando una

metodología previamente validada (Anexo D). El contenido de ibuprofeno presente en los

complejos, así como la eficiencia de complejación se calcularon mediante las Ecuaciones 4-

2 y 4-3, respectivamente.

IBU complejado (%) = IBU en el complejo (g)

Peso complejo (g) * 100

(4-2)

Eficiencia de complejación (%) =IBU en el complejo (g)

IBU de partida (g) * 100 (4-3)


4.1.2.2 Microscopía electrónica de barrido (SEM)

Las micrografías electrónicas de barrido de los complejos fueron tomadas con un

microscopio electrónico de barrido (FEI Quanta 200), equipado con un filamento de

tungsteno convencional como fuente de electrones, detectores de electrones secundarios

(SE), de electrones retrodispersados (BSE) y de rayos X de dispersión de energía, además

de una cámara interna. Las muestras de los complejos fueron recubiertas con oro al 99.9%

de pureza, utilizando un revestidor de pulverización catódica con bomba rotativa (Q150R

ES), durante 30 s a una corriente de pulverización de 60 mA. El microscopio se operó

utilizando vacío a una presión de 5.3 x 10-5

Pa y una energía de aceleración del haz de

electrones de 30 kV.

4.1.2.3 Calorimetría diferencial de barrido de alta presión (HP-DSC)

La entalpía, así como la temperatura de disociación de los complejos, se determinó en un

calorímetro de alta presión (HP DSC 1 Mettler Toledo®) previamente calibrado con

estándares de indio y paladio. Se utilizaron crisoles estándar de aluminio con capacidad de

40 µL, se pesaron 6 mg de muestra en los crisoles y se les adicionaron 10 µL de agua

destilada. Posteriormente, los crisoles fueron sellados herméticamente y se les realizó una

pequeña perforación en la tapa. El equipo se operó bajo una atmósfera de nitrógeno a una

presión de 1 MPa con una velocidad de calentamiento de 10 °C/min en un rango de

temperatura de 25 °C a 130 °C; como referencia se utilizó un crisol vacío. El tratamiento de

los datos se realizó utilizando el software (STARe), las gráficas y el tratamiento para la línea

base se realizaron con el software OriginPro® 9.

4.1.2.4 Espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier (FTIR)

Los espectros vibracionales de los complejos se tomaron en un espectrofotómetro (IR-

Affinity-1S SHIMADZU) equipado con accesorio ATR. Las medidas se realizaron en un

rango de 3500 cm-1 a 400 cm-1 con una resolución de 4 cm-1; las gráficas y el tratamiento

para la línea base se realizaron con el software OriginPro® 9.


4.1.2.5 Difracción de rayos X (XRD)

Los patrones cristalográficos de los complejos se determinaron en un difractómetro de rayos

X PANalytical modelo X´PERT PRO MPD, configuración óptica de Bragg – Brentano,

equipado con un detector de estado sólido de alta velocidad (PIXcel) y un tubo generador

de rayos X con ánodo de cobre. Las condiciones de medida fueron: longitud de onda: 1.54

Å, filtro de níquel, voltaje: 45 kV y corriente: 40 mA, región de escaneo con ángulo dos

theta (2θ) de 7° a 100°, tamaño de paso: 0.0263°, tiempo de paso: 100 s. El tratamiento de

los datos y el ajuste de la curva se llevaron a cabo utilizando el software HighScore plus

(versión 3.0c). De igual manera la indexación de los datos en las diferentes celdas unitarias

se realizó empleando dicho software, el que permitió calcular los picos, así como los valores

de los índices de Miller (h, k y l) con los respectivos parámetros de red.

4.1.2.6 Evaluación del comportamiento de liberación

Los comportamientos de liberación in vitro del ibuprofeno a partir de los complejos

preparados se evaluaron por el método de diálisis (Figura 4-5) empleando medios que

simulan algunas condiciones gastrointestinales y que fueron preparados según las

indicaciones de la Farmacopea de los Estados Unidos (The United States Pharmacopeia,

2019). Así, para simular las condiciones gástricas se empleó solución buffer de ácido

clorhídrico pH 1.2; las condiciones simuladas del intestino delgado se lograron con solución

buffer fosfato pH 6.8, con solución buffer fosfato pH 6.8 conteniendo 35 unidades/mL de

pancreatina (A3176 Sigma-Aldrich) y con solución buffer fosfato pH 7.2 conteniendo 35

unidades/mL de pancreatina (A3176 Sigma-Aldrich). Inicialmente, los tubos de diálisis de

celulosa (D9777-100FT Sigma-Aldrich) se hidrataron en sus respectivos medios 12 h previo

a la realización del ensayo. Luego, 30 mg del complejo junto con 2 mL del medio de

liberación fueron depositados en las bolsas de diálisis para luego ser selladas y ubicadas en

20 mL del respectivo medio a una temperatura de 37 °C ± 0.2 °C (IKA® C-Mag HS 7) con

agitación continua (100 rpm). Se realizó el muestreo con remplazo de alícuotas de 500 µL

del compartimento externo en diferentes intervalos de tiempo (15, 30, 60, 90, 180 y 360

min), las muestras se filtraron (filtros Millipore Corp., tamaño de poro 0.45 µm) y se

analizaron mediante HPLC con una metodología previamente validada (Anexo D).


4.1.2.7 Modelos cinéticos de liberación

Los datos de liberación del ibuprofeno se procesaron aplicando diferentes modelos

matemáticos (Tabla 4-3); para ello se empleó una herramienta libre de Excel (DDSolver)

desarrollada por Zhang et al. (2010). Para los modelos de Korsmeyer - Peppas y Weibull se

trabajaron los datos con una tasa de liberación menor al 60%.

Figura 4-5. Determinación del comportamiento de liberación de los complejos.

Por otro lado, con el fin de evidenciar diferencias en los perfiles de liberación de los

respectivos complejos se realizó la prueba del factor de similitud (f2), definida según la

Ecuación 4-4 como una transformación logarítmica de la raíz cuadrada media de la suma de

las distancias cuadradas en todos los puntos (Costa y Sousa Lobo, 2001). En efecto, valores

entre 50 y 100 indican similitud entre dos perfiles con una variación promedio ≤ 10%; por

el contrario, valores inferiores a 50 indican que no existe similitud entre los dos perfiles con

una variación promedio > 10% (Xie et al., 2015). Los cálculos se realizaron utilizando la

herramienta libre de Excel (DDSolver).

f2 = 50 * log {[1 + 1

n∑ (Rt - Tt)

2

n

t =1

]

-0.5

* 100} (4-4)

Tabla 4-3. Modelos matemáticos de liberación empleados para lograr una aproximación al mecanismo de

liberación del activo a partir de los complejos.

Modelo Ecuacióna Ecuación linealizadaa


Orden ceroa [A] - [𝐴]0 = K0 t [A] = K0 t + [𝐴]0

Primer ordena [A] - [𝐴]0 = 100(1 - e - K1t) ln (1 - [A]

100) = - K1 t + ln [A]0

Higuchia [A] = KH √t log[A] = 0.5 log t + log KH

Korsmeyer - Peppasa [A] = KKP tn ln[A] = n ln t + ln KKP

Weibullb [A] = 100 (1 - e - atb) log [- ln (1 - [A]

100) ] = b log t - log a

Hixson - Crowella [A] = 100[1 - (1 - KKCt)3] 1 - (1 - [A]

100)

13

= KKC 𝑡

a [A] es el porcentaje acumulado liberado en el tiempo t; [A]0 es la cantidad inicial de activo en la solución

(la mayoría de las veces [A]0 = 0) Kp K0, K1, KH y KKC las constantes de velocidad de liberación para

cada modelo; n exponentes de liberación. b a es el parámetro de escala que define la escala del

tiempo del proceso, b es el parámetro de forma que caracteriza la curva.

4.2 Resultados y discusión

Como se ha mencionado, la presente investigación fue orientada hacia la evaluación del

almidón de bambú como una posible alternativa para el transporte de moléculas activas a

través de la formación de complejos entre éste y el ibuprofeno elegido como fármaco

modelo. Teniendo en cuenta que éste es el primer trabajo de investigación sobre la obtención

de complejos almidón - activo realizado en el grupo de investigación en Desarrollo y Calidad

de Productos Farmacéuticos y Cosméticos -GIDECA-, a medida que avanzaba la

investigación se fueron seleccionando los diferentes métodos para la preparación de los

complejos. Particularmente, se buscaban los mejores resultados en términos de eficiencia de

complejación. Por tal razón se emplearon dos técnicas reportadas en la literatura para éste

propósito (acidificación de una solución alcalina y calentamiento - sellado) y se propuso un

método basado en la evaporación del solvente mediante rotaevaporación. Como referencia

se emplearon el almidón de maíz y la amilosa de papa, lo que permitió un punto vista

comparativo respecto a la capacidad del almidón de bambú para formar este tipo de

complejos.

Como se representa en la Figura 4-6, cuando se emplea el método de acidificación de una

solución alcalina, inicialmente, debido a las condiciones básicas del medio el gránulo de


almidón se hincha. Se ha propuesto que esto es causado por la desprotonación de los grupos

hidroxilo de las unidades de anhidro glucosa generando repulsión electrostática entre las

cadenas poliméricas. Esto ocasiona la disrupción de las regiones cristalinas de la estructura

del almidón, facilitando la lixiviación de sus componentes estructurales al medio de

disolución y la reorganización de las cadenas poliméricas de amilosa y amilopectina en una

estructura de bobina extendida (Banks y Greenwood, 1971); estos procesos son catalizados

por el suministro de energía al sistema en forma de calor. Cuando la molécula huésped es

adicionada a la solución y el pH del medio es disminuido lentamente, los grupos hidroxilo

ionizados se protonan de manera que las cadenas poliméricas adoptan nuevamente una

estructura helicoidal mediada por puentes de hidrógeno; la molécula huésped posiblemente

es incluida en las cavidades internas impulsada por el efecto hidrofóbico, dicho en otras

palabras, por la tendencia del activo y del hospedador a minimizar el contacto con el agua.

Finalmente, para completar la complejación y el plegamiento de las cadenas poliméricas se

requiere de agitación leve durante un periodo de tiempo prolongado dado que posiblemente,

éste no es un proceso instantáneo.

De acuerdo con lo anterior, parámetros como la velocidad a la que la solución es acidificada,

el tiempo de estabilización al final del proceso y la concentración del hidróxido de potasio,

el que está directamente relacionado con el tiempo necesario para garantizar la disolución

completa del almidón sin que se afecten las características estructurales de la amilosa y la

amilopectina, son parámetros que podrían jugar un rol importante en el proceso de

complejación. Igualmente, a partir de la hipótesis de que la principal fuerza impulsora para

que se dé la formación del complejo es el efecto hidrofóbico, resulta conveniente conocer la

influencia de la cantidad de agua garantizando en cualquier caso, que no se afecte la

disolución del almidón. Es importante tener en cuenta que la temperatura utilizada en la

preparación de los complejos está directamente relacionada con la plastificación de las

cadenas poliméricas y es un parámetro que influye en la estructura cristalina macro de los

complejos de inclusión molecular (Cai y Shi, 2013). En esta investigación la temperatura

fue un parámetro que se fijó en 90 °C considerando la temperatura de gelatinización del

almidón de bambú (79.1 °C).


Figura 4-6. Mecanismo de reacción propuesto para la formación de complejos de inclusión molecular

mediante el método de acidificación de una solución alcalina. Dispersión de almidón en solución básica (A);

inicio de la lixiviación de los componentes estructurales del almidón como consecuencia de la ionización de

los grupos hidroxilo y el aumento de la temperatura (B); componentes estructurales en solución posterior a la

ruptura del gránulo de almidón (C); enfriamiento y protonación de los grupos hidroxilo de las cadenas

poliméricas que van adoptando una conformación helicoidal con el huésped incluido en la cavidad de la misma

(D).

Por su parte, mediante el método de calentamiento - sellado (Figura 4-7) los gránulos de

almidón son inicialmente sometidos a gelatinización y de acuerdo con la hipótesis propuesta

por Jenkins y Donald (1998) el proceso inicia con la entrada del agua en los anillos de

crecimiento amorfo generando cierto grado de hinchamiento, el estrés disruptivo es

transmitido a través de las moléculas de las regiones amorfas a las cristalinas y la amilosa

empieza a lixiviarse de los gránulos. De acuerdo con Banks y Greenwood (1971), a medida

que avanza el proceso las cadenas poliméricas van quedando en solución adoptando una

conformación de bobina aleatoria en la que coexisten segmentos completamente extendidos

y segmentos helicoidales donde inicialmente las moléculas del activo podrían ser alojadas.

Finalmente, cuando la solución es enfriada a temperatura ambiente y debido a una

disminución de la solubilidad del activo y a la reorganización de las cadenas poliméricas,

posiblemente se genera la asociación huésped - ibuprofeno, principalmente en los segmentos

extendidos de dichas cadenas.

A B C

D



mediante el método de calentamiento - sellado. Dispersión de almidón en agua destilada (A); inicio de la

lixiviación de los componentes estructurales del almidón como consecuencia del aumento de la temperatura

(B); componentes estructurales en solución posterior a la ruptura del gránulo de almidón (C); enfriamiento de

la solución y conformación helicoidal de las cadenas poliméricas con el huésped incluido en la cavidad interna

de la misma (D).

Debido a que las moléculas de amilosa y amilopectina en solución neutra no presentan una

conformación de bobina extendida, el almidón de bambú se pregelatinizó para evidenciar si

dicho proceso favorecía su dispersión y de esta manera la cantidad de ibuprofeno

complejado. De igual manera, teniendo en cuenta el efecto hidrofóbico, se modificó la

cantidad de agua empleada para corroborar si dicha variable favorecía la complejación. Se

considera que posiblemente las variables más importantes son aquellas que están

relacionadas con la completa gelatinización y disolución del almidón.

De acuerdo con los resultados de encapsulación del activo mediante las metodologías de

acidificación de una solución alcalina y de calentamiento - sellado, se propuso un método

no reportado en la literatura empleando un rotaevaporador a fin de lograr la evaporación del

solvente de forma gradual, generando un plegamiento inducido de las cadenas poliméricas

donde se espera que las moléculas de ibuprofeno quedan atrapadas (Figura 4-8).

Adicionalmente, la evaporación del agua de manera controlada podría aumentar el efecto

hidrofóbico del activo y del almidón favoreciendo posiblemente la complejación. Por otra

parte, la nucleación inducida por la evaporación del solvente podría generar tamaños de

A B C

D


cristal más pequeños permitiendo un mejor estudio de sus características cristalográficas,

dificultad que como se discutirá más adelante, fue evidenciada en la caracterización de los

complejos obtenidos por los otros dos métodos. De otro lado, mediante esta metodología la

variable que podría tener más influencia es la velocidad de evaporación gradual del agua y

una de las grandes ventajas es la posibilidad de emplear una mayor cantidad de la misma

favoreciendo la disolución del almidón.


mediante el método de calentamiento - sellado. Dispersión de almidón en agua destilada (A); inicio de la

lixiviación de los componentes estructurales del almidón como consecuencia del aumento de la temperatura

(B); componentes estructurales en solución posterior a la ruptura del gránulo de almidón (C); evaporación del

solvente gradualmente, acompañado de la conformación helicoidal de las cadenas poliméricas con el huésped

incluido en la cavidad interna de las mismas (D y E).

4.2.1 Rendimiento, porcentaje de activo complejado y eficiencia de

complejación

Los complejos preparados según las metodologías descritas corresponden al precipitado

seco cuyos rendimientos, porcentajes de ibuprofeno complejado y eficiencia de

complejación son reportados en la Tabla 4-4. Para el caso del método de acidificación de

una solución alcalina, que fue el primero ensayado en esta tesis, se verificó que

efectivamente permitía la formación de los complejos empleando como control positivo

A B C

E D


amilosa de papa, dado que no se encuentran reportes de la complejación de ibuprofeno con

almidones nativos.

Aunque se confirma la factibilidad de obtener este tipo de complejos, los resultados fueron

bajos comparados con los reportados en la literatura. Así, Zhang et al. (2016) lograron

porcentajes entre 7% y 14.1% usando amilosa de papa, que dependieron de la relación

amilosa - ibuprofeno; Yang et al. (2013) informan porcentajes de 12.8%, 18.4% y 4.3%

empleando amilosa de papa, almidón de maíz con alto contenido de amilosa (70%) y amilosa

- ibuprofeno mediante una síntesis in situ. Por otro lado, en cuanto a la complejación de

ibuprofeno con ciclodextrinas, Hussein et al. (2007) reportan porcentajes entre 2.8% y 5.4%

empleando β-ciclodextrina. Trabajando con otros activos, Cohen et al. (2008) reportaron

porcentajes de genisteina entre 1.4% y 11.3% en complejos empleando amilosa de papa, la

que depende de la relación amilosa - activo, asimismo, empleando almidón de maíz con alto

contenido de amilosa alcanzaron un porcentaje de genisteina de 9.3%. Al trabajar con

moléculas lineales como los ácidos grasos, Lalush et al. (2005) reportaron porcentajes entre

3.8% y 1.9% de ácido linoleico conjugado en complejos formados con amilosa y Ma et al.

(2011), empleando ésteres para la formación de complejos con almidón de maíz con alto

contenido de amilosa (Hylon® VII), reportaron la complejación de 6.3%, 1.4% y 0.7% de

palmitato de ascorbilo, palmitato de retinilo y ésteres de fitosterol, respectivamente. En

adición Arijaje y Wang (2016) empleando almidón normal de maíz y de papa sometidos

previamente a un tratamiento de desramificación enzimática, obtuvieron porcentajes entre

1.4% y 5.6 % de ácido esteárico complejado.

Cuando se preparan los complejos con los almidones de bambú y de maíz mediante la

metodología de acidificación de una solución alcalina, los rendimientos, cantidad de activo

complejado y eficiencia de complejación incrementan al emplear un menor porcentaje de

agua (ensayos AB-1%-ASA y AM-1%-ASA en los que se emplearon 300 mL de agua

comparados con los ensayos AB-1.5%-ASA y AM-1.5%-ASA utilizando 200 mL). Aunque

se desconoce el mecanismo por medio del cual se da la formación de los complejos con el

almidón o específicamente con la amilosa, se cree que la solubilidad de la molécula huésped

y su tendencia a evitar la interacción con el agua juegan un rol importante (Heinemann et

al., 2001; Conde-Petit et al., 2006). Seguramente al utilizar una menor cantidad de agua, el


efecto hidrofóbico impulsado por la entropía aumenta, es decir, se genera una estructuración

local del agua alrededor de las superficies hidrofóbicas de las moléculas de amilosa,

amilopectina e ibuprofeno y por lo tanto, más moléculas de activo buscarán un lugar en la

cavidad interna de las cadenas de amilosa y amilopectina, asociándose en segmentos

helicoidales cuya interacción es energéticamente más favorable que las interacciones de los

tipos huésped - agua u hospedador - agua. Como resultado, la complejación podría

favorecerse (Conde-Petit et al., 2006; Immel y Lichtenthaler, 2000).

Tabla 4-4. Porcentajes de rendimiento, porcentaje de ibuprofeno complejado y eficiencia de complejación

determinados para los diferentes complejos.

Complejo Rendimiento del

complejo (%)

IBU en el complejo

(%)

Eficiencia de

complejación (%)

AB-1%-ASA 35.90 0.05 ± 0.01 0.72 ± 0.02

AM-1%-ASA 30.30 0.11 ± 0.01 1.67 ± 0.01

AM-1%-ASA* 60.10 0.02 ± 0.01 0.60 ± 0.01

AB-1.5%-ASA 70.50 0.07 ± 0.02 2.11 ± 0.02

AM-1.5%-ASA 74.50 0.60 ± 0.02 22.35 ± 0.04

A-0.6%-ASA 24.70 0.48 ± 0.01 5.93 ± 0.02

AB-4%-CS 75.90 0.29 ± 0.02 9.11 ± 0.02

AB-4%-CSPG 89.60 0.27 ± 0.01 10.30 ± 0.02

AB-8%-CS 72.50 0.23 ± 0.01 6.89 ± 0.02

AM-8%-CS 66.30 0.53 ± 0.01 17.57 ± 0.01

AB-5%-RE 16.30 0.19 ± 0.01 1.30 ± 0.01

Almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa (A); método

acidificación de una solución alcalina (ASA); método calentamiento - sellado (CS);

método calentamiento - sellado por rotaevaporación (RE).

Sin embargo, Le (2019) menciona que existe una concentración crítica de complejación para

cada molécula huésped y por tal motivo, el aumento de la concentración de la molécula

activa no garantiza una mayor asociación con el agente complejante. Por su parte, Conde-

Petit et al. (2006) indican que a altas concentraciones de agente complejante, la calidad

termodinámica del agua como disolvente podría verse afectada ocasionando la precipitación

de la amilosa no inducida por la formación del complejo.

Por otro lado, el tiempo de reacción parece influir en la cantidad de molécula huésped

complejada, como es evidente en el ensayo AM-1%-ASA* donde se obtuvo un porcentaje


bajo de ibuprofeno complejado (0.02% ± 0.01%), debido posiblemente al comportamiento

de las cadenas de almidón en solución alcalina y al tiempo necesario para que se dé la

ionización completa de los grupos hidroxilo de la amilosa y la amilopectina y se logre la

conformación de bobina extendida generada por las repulsiones electrostáticas (Erlander y

Purvinas, 1968), la que es indispensable para garantizar la inclusión de la molécula huésped

dentro de la cavidad helicoidal (Yamashita, 1965). Esto podría resolverse aumentando la

concentración del KOH como lo demuestra Ragheb et al. (1995) al investigar el efecto de la

concentración de NaOH en la gelatinización del almidón de maíz. A temperatura ambiente

(25 °C) el almidón gelatiniza en un tiempo menor a 20 min cuando se emplean

concentraciones de NaOH entre 0.3 N y 2.5 N. En línea con lo anterior, al haber empleado

en esta investigación una solución de KOH 0.1 N y 30 min para la gelatinización del almidón

de maíz, es probable que dicho proceso ocurra de forma parcial.

En cuanto al método de calentamiento - sellado es evidente la influencia de la

pregelatinización del almidón de bambú (ensayo AB-4%-CSPG) favoreciendo el rendimiento

de complejación (89.60%) y por ende la eficiencia de complejación (10.30% ± 0.02%). Esto

contrasta con el almidón de bambú sin pregelatinizar (ensayo AB-4%-CS) donde se

alcanzaron valores de 75.90% y 9.11% ± 0.02% para el rendimiento de complejación y la

eficiencia de complejación, respectivamente. Por otra parte, cuando se utiliza una menor

cantidad de agua en la formación de los complejos preparados por este método CS (ensayo

AB-8%-CS), tanto el rendimiento del complejo (72.50%), el porcentaje de ibuprofeno en el

mismo (0.23% ± 0.01%) y la eficiencia de complejación (6.89% ± 0.02%) disminuyen

ligeramente en comparación con el complejo formado empleando una mayor cantidad de

agua (ensayo AB-4%-CS). Este comportamiento es consistente con lo hallado por Conde-

Petit et al. (2006) quienes indican que a menor cantidad de agua se requiere una mayor

temperatura para lograr la plastificación de la amilosa, es decir, la lixiviación completa de

la amilosa y un aumento en la flexibilidad de las cadenas en solución, necesaria para

garantizar la formación de los complejos.

De otro lado, resulta interesante que al emplear el método de acidificación de una solución

alcalina, la disminución de la cantidad de agua favorece la complejación del ibuprofeno con

los almidones. No obstante, cuando se utiliza el método de calentamiento - sellado la


disminución de la cantidad de agua, aunque podría favorecer el efecto hidrofóbico,

posiblemente influencia en mayor grado la gelatinización del almidón y la conformación de

las cadenas poliméricas en solución; por tal razón, el porcentaje de complejación del

ibuprofeno y la eficiencia de complejación disminuyen.

Independientemente del método, ASA o CS, los mayores porcentajes de ibuprofeno

complejado se obtuvieron utilizando como hospedador el almidón de maíz. Teniendo en

cuenta que el almidón de maíz presentó un menor porcentaje de amilosa aparente (16.30 ±

2.24%) en comparación con el almidón de bambú (18.30 ± 1.20%), lo que no puede

considerarse significativo, la mayor capacidad del almidón de maíz para complejar el activo

podría atribuirse a las características estructurales de sus componentes. Al respecto, Conde-

Petit et al. (2006), Gelders et al. (2004) y Godet et al. (1995) indican que la capacidad de

unión de una molécula huésped por la fracción lineal del almidón depende de la longitud de

la cadena de amilosa, siendo mayor a medida que la longitud de la cadena aumenta.

En términos generales, el método de calentamiento sellado parece ser la metodología que

permite mejores resultados empleando el almidón de bambú. En contraste, trabajando con

almidón de maíz, la técnica de acidificación de una solución alcalina resulta más

prometedora. A partir de los resultados obtenidos no es posible explicar este

comportamiento; la susceptibilidad por parte del almidón de bambú a un proceso de

degradación química acelerado por temperatura podría tener alguna influencia, dado que

durante el proceso de gelificación en condiciones básicas se observó un color amarillo como

posible indicador físico de dicho proceso.

Por lo que refiere a las ventajas y desventajas del método de acidificación de una solución

alcalina se destaca la posibilidad de no requerir temperaturas por encima de los 90 °C para

garantizar la formación de los complejos, como resultado de la utilización de una menor

cantidad de agua, como fue evidente en las cantidades empleadas en esta investigación (300

mL y 200 mL), por el contrario, el empleo de una base fuerte como el hidróxido de potasio

podría generar una degradación de las cadenas poliméricas de amilosa y amilopectina

repercutiendo en la capacidad de complejación de las mismas. Por otra parte, mediante el

método de calentamiento - sellado se requieren temperaturas por encima de los 90 °C cuando


se emplean pequeñas cantidades de agua, esto para evitar que la plastificación de las cadenas

poliméricas se vea posiblemente afectada, asimismo, el aumento excesivo de la cantidad de

agua para favorecer dicho proceso, debido al incremento de la calidad termodinámica del

agua podría dificultar la formación y precipitación de los complejos de inclusión molecular.

De acuerdo con lo anterior y como un aporte en la búsqueda de una mejor estrategia para

preparar los complejos almidón - activo, en la presente investigación se propuso un método

basado en rotaevaporación. Como se discutió previamente en el mecanismo de formación

de los complejos, quizás la evaporación controlada del agua podría impulsar el efecto

hidrofóbico de la molécula huésped generando una mayor complejación del almidón y el

huésped. Los resultados obtenidos muestran que se logró un porcentaje de complejación de

ibuprofeno de 0.19% ± 0.01% y comparada con la metodología ASA utilizando almidón de

bambú fue superior en todos los casos (entre 0.04 y 0.06%). Por otro lado, en contraste con

el método CS, el rendimiento del complejo, el porcentaje de ibuprofeno en el complejo y la

eficiencia de complejación no permitieron ninguna ventaja de interés. Estos datos sugieren

la necesidad de investigar a fondo la influencia de la velocidad de evaporación del solvente

con el objetivo de evidenciar la posibilidad de obtener porcentajes mayores de ibuprofeno

en los complejos.

4.2.2 Caracterización de los complejos por SEM, DSC, FTIR, XRD

Como se observa en la Figura 4-9, los complejos obtenidos corresponden a estructuras

supramoleculares organizadas que difieren en su forma y tipo según la metodología y las

condiciones de preparación. Así, se observan estructuras ligeramente esféricas posiblemente

como consecuencia de la generación de esferulitas a nivel interno, que sugieren la

reorganización de las cadenas poliméricas de almidón en arquitecturas similares a las de los

gránulos de almidón nativo (Fanta et al., 2002) especialmente, en los complejos formados

mediante el método CS y RE (ensayos AB-4%-CS, AB-4%-CSPG, AM-8%-CS, AB-5%-

RE). Igualmente, se identifica la presencia de una cavidad central acorde con lo reportado

por otros investigadores (Nordmark y Ziegler, 2002; Lay Ma et al., 2011a).

Respecto a los complejos AB-1%-ASA, AM-1%-ASA, AM-1%-ASA*, AB-1.5%-ASA,

AM-1.5%-ASA, A-0.6%-ASA y AB-8%-CS se observan estructuras granulares compactas


y rígidas con formas poligonales. Observaciones similares fueron reportadas por

Marinopoulou et al. (2019) y Pereva et al. (2016) que trabajaron con complejos empleando

ibuprofeno como activo y amilosa y β-ciclodextrinas como agentes hospedantes. De igual

manera, estas estructuras han sido reportadas empleando como molécula huésped el ácido

ferúlico (Van Hung et al., 2013) y en presencia de lípidos (Fanta et al., 2002).

Figura 4-9. Micrografías SEM correspondientes a los complejos de inclusión molecular. Almidón de bambú

(AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación de una solución alcalina (ASA);

método calentamiento - sellado (CS); método calentamiento - sellado por rotaevaporación (RE).

AB-1%-ASA AB-1%-ASA







AM-1%-ASA



AM-1%-ASA

AM-1%-ASA*



AM-1%-ASA*




Figura 4-9. Micrografías SEM correspondientes a los complejos de inclusión molecular (continuación).

Almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación de una solución

alcalina (ASA); método calentamiento - sellado (CS); método calentamiento - sellado por rotaevaporación

(RE)

AB-1.5%-ASA



AB-1.5%-ASA



AM-1.5%-ASA



AM-1.5%-ASA



A-0.6%-ASA A-0.6%-ASA





AB-4%-CS


30.0 kV 10000x BSE 9.8 mm Universidad Nacional de Colombia

AB-4%-CS




Figura 4-9. Micrografías SEM correspondientes a los complejos de inclusión molecular (continuación).

Almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación de una solución

alcalina (ASA); método calentamiento - sellado (CS); método calentamiento - sellado por rotaevaporación

(RE).

AB-4%-CSPG



AB-4%-CSPG



AB-8%-CS



AB-8%-CS


30.0 kV 10000x BSE 9.1 mm Universidad Nacional de Colombia

AM-8%-CS



AM-8%-CS



AB-5%-RE



AB-5%-RE




Las diferencias en las estructuras supramoleculares de los complejos se atribuyen a las

diferentes condiciones de reacción empleadas, tales como la cantidad de agua y el tiempo

de reorganización de las cadenas poliméricas. Adicionalmente, es importante tener en cuenta

que la velocidad de enfriamiento y la temperatura de cristalización podrían influenciar la

estructura del sólido obtenido (Cai y Shi, 2013). Igualmente, otras variables que podrían

tener alguna influencia incluyen la naturaleza del solvente, el grado de ramificación y la

concentración del almidón (Lourdin et al., 2015), la agitación durante el enfriamiento y el

pH de la dispersión (Bhosale y Ziegler, 2010).

Como lo reportan Ma et al. (2011), las estructuras supramoleculares de los complejos pueden

ser formadas bien por la cristalización inducida de complejos de inclusión molecular o por

el enfriamiento rápido de una dispersión de almidón calentada por encima de los 170 °C, el

cual no requiere la presencia de un agente complejante. De acuerdo con esto, y dado que

ninguno de los procedimientos de preparación de los complejos trabajados en esta

investigación requiere temperaturas superiores a 170 °C, es probable que las estructuras

supramoleculares obtenidas sean consecuencia de la formación de los complejos de

inclusión molecular.

El comportamiento térmico de los complejos, los controles y las correspondientes mezclas

físicas se presentan en la Figura 4-10. El ibuprofeno exhibe una señal en 71.7 °C

correspondiente al punto de fusión, con una entalpía de 110.86 J/g, resultados que son

consistentes con lo reportado en la literatura (Maxwell y Chickos, 2012). Los controles de

almidón de bambú y de maíz (CTAB, CTAM) muestran una señal endotérmica amplia en

96.20 °C y 92.30 °C, respectivamente, que estaría relacionada con la temperatura de

disociación de los complejos formados entre los componentes estructurales del almidón y

los lípidos endógenos. Por su parte, Kugimiya et al. (1980) en sus observaciones mediante

DSC acerca del comportamiento térmico de los complejos almidón - lípidos endógenos,

reportan un evento térmico en 93 °C y 99 °C para almidones de maíz y de trigo,

respectivamente, después de ser sometidos a gelatinización, lo que es atribuido a los

complejos de inclusión molecular. De otro lado, las entalpías de los eventos térmicos

exhibidos por los almidones de bambú y de maíz (Tabla 4-5) fueron relativamente bajas

sugiriendo la baja presencia de estructuras tipo V-amilosa.


Figura 4-10. Termogramas correspondientes a los complejos de inclusión molecular, los controles y las

mezclas físicas de dichos materiales. Almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa (A);

método acidificación de una solución alcalina (ASA); método calentamiento - sellado (CS); método

calentamiento - sellado por rotaevaporación (RE); control (CT); ibuprofeno (IBU); mezcla física (MF).

Las mezclas físicas de los almidones con el activo (MFAB, MFAM) exhiben una señal

adicional correspondiente a la temperatura de fusión del ibuprofeno. Para las mezclas con el

almidón de bambú dicha señal ocurre a 69.33 °C y para muestras almidón de maíz - activo

a 69.44 °C. Esta señal no fue detectada para los complejos almidón - activo, lo que sugiere

que no hay interacción netamente física entre los almidones y el ibuprofeno. Los complejos

preparados con los almidones y el ibuprofeno en el método ASA donde se emplea un tiempo

de 3 h en la etapa de gelatinización del almidón, exhiben dos eventos térmicos a temperaturas

entre 86.80 °C y 121.80 °C (Tabla 4-5). Este comportamiento podría estar relacionado con

la formación simultánea de dos tipos de estructuras cristalinas con seis y siete unidades de

30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

IBU

CTAB

CTAM

IBU

IBU

MFAB

MFAM

AB-1%-ASA

AM-1%-ASA

AM-1%-ASA*

AB-1.5%-ASA

AM-1.5%-ASA

A-0.6%-ASA

Flu

jo d

e ca

lor

exo

térm

ico

AB-4%-CS

AB-4%-CSPG

AB-8%-CS

AM-8%-CS

Temperatura (°C)

AB-5%-RE


glucosa por turno en la hélice (Kugimiya et al., 1980) o la ubicación del ibuprofeno intra e

interhelicoidal.

Igualmente, teniendo en cuenta que la molécula huésped juega un papel importante en el

diámetro interno de la hélice (Takeo et al., 1973) y que la asociación cooperativa positiva

entre las moléculas favorece la formación del complejo de inclusión, debido a que la unión

de un ligando aumenta la afinidad de unión de un segundo ligando (Conde-Petit et al., 2006),

no se descarta que los lípidos presentes en los almidones den lugar a estructuras helicoidales

mediante asociaciones lípido - lípido o lípido - ibuprofeno, dado que estos dos eventos

térmicos no fueron evidentes en el complejo donde se empleó un estándar de amilosa (A-

0.6%-ASA).

Tabla 4-5. Temperaturas y entalpías de disociación de los complejos de inclusión, de los controles y de las

mezclas físicas de dichos controles.

Endoterma (°C) ΔH (J g-1)

Muestra 1 2 1 2

IBU 71.70 110.86

CTAB 96.20 0.95

CTAM 92.30 0.86

MFAB 69.33 97.33

MFAM 69.44 92.70

AB-1%-ASA 99.70 113.70 1.73 1.22

AM-1%-ASA 96.20 121.80 1.65 2.14

AM-1%-ASA* ND ND

AB-1.5%-ASA 86.80 98.50 1.53 1.85

AM-1.5%-ASA 91.50 114.80 3.60 1.36

A-0.6%-ASA 118.30 3.42

AB-4%-CS 82.20 1.80

AB-4%-CSPG 81.00 1.52

AB-8%-CS 78.60 1.95

AM-8%-CS 92.70 2.92

AB-5%-RE 81.00

1.67

Almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa

(A); método acidificación de una solución alcalina (ASA); método

calentamiento - sellado (CS); método calentamiento - sellado por

rotaevaporación (RE); control (CT); ibuprofeno (IBU); mezcla

física (MF); entalpía de disociación (ΔH).


De otro lado, los análisis realizados por DSC confirman que el tiempo de gelificación es un

factor determinante para la formación de los complejos. Así, para el ensayo AM-1%-ASA*,

donde solo se permitieron 30 min de hinchamiento, no se observó ningún evento entálpico

debido posiblemente al bajo porcentaje de ibuprofeno complejado (Tabla 4-4) y al tiempo

de reacción, el que aunque es suficiente para garantizar la ruptura de la estructura interna de

los gránulos de almidón, no permite una eficiente complejación.

Respecto a los complejos formados mediante los métodos de calentamiento - sellado y

calentamiento sellado por rotaevaporación; los termogramas obtenidos evidencian un solo

evento térmico, lo que sugiere un cierto grado de homogeneidad en las estructuras cristalinas

que podría estar asociado a los procesos de precipitación que implican la formación de la

hélice, la nucleación y el crecimiento cristalino (Eliasson, 1988). Es importante destacar que

los complejos formados utilizando almidón de bambú presentan temperaturas de disociación

bajas (entre 78.60 °C y 82.20 °C) en comparación con el complejo formado empleando

almidón de maíz (AM-8%-CS), el que presentó una temperatura de disociación de 92.70 °C.

Quizás las diferencias en las características estructurales de los almidones, tales como las

longitudes de las cadenas de amilosa y amilopectina podría tener alguna influencia. Los

resultados obtenidos en esta investigación para los complejos preparados por los métodos

de acidificación de una solución alcalina y calentamiento - sellado, en especial lo

correspondiente a las bajas entalpías de disociación, se encuentran en línea con lo

previamente reportado en la literatura (Nuessli et al., 1997; Heinemann et al., 2001; Le Bail

et al., 2005; Marinopoulou et al., 2016b; Seo et al., 2016; Dries et al., 2017).

Por otra parte, los espectros FTIR de los controles, las mezclas físicas y los complejos de

inclusión se muestran en la Figura 4-11. El ibuprofeno exhibe una banda de absorción

característica en ~1711 cm-1 que se asigna a la vibración de estiramiento C=O y dos bandas

a ~778.9 cm-1 y ~667.7 cm-1 propias de la vibración de deformación de los enlaces C-H del

anillo aromático. Los controles correspondientes a los almidones de bambú y de maíz

(CTAB y CTAM) presentan tres bandas características en ~1150 cm-1, ~1078 cm-1 y ~998

cm-1 atribuidas a la vibración de estiramiento del anillo de anhídrido glucosa C-O, C-O-H y

C-O-C, respectivamente.


Figura 4-11. Espectros FTIR correspondientes a los complejos de inclusión molecular, los controles y las

mezclas físicas de dichos controles. Almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa (A);

método acidificación de una solución alcalina (ASA); método calentamiento - sellado (CS); método

calentamiento - sellado por rotaevaporación (RE); control (CT); ibuprofeno (IBU); mezcla física (MF).

En las mezclas físicas del activo con los almidones (MFAB y MFAM) se observan unas

bandas características del ibuprofeno en la región entre 1980 cm-1 y 1300 cm-1. No se detecta

claramente la banda característica del enlace C=O del ibuprofeno en ~1711 cm-1, debido

posiblemente a la cantidad de ibuprofeno en la mezcla y al número de osciladores presentes

en el almidón. Así, el espectro estaría dominado por las bandas vibracionales de las cadenas

poliméricas donde la banda amplia de los almidones alrededor de los 1655 cm-1 podría tener

influencia. Por otra parte, se observa una banda muy pronunciada en ~668 cm-1

correspondiente a la vibración de deformación de los enlaces C-H del anillo aromático del

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600

IBU

CTAB

CTAM

MFAB

MFAM

AB-1%-ASA

AM-1%-ASA

AM-1%-ASA*

AB-1.5%-ASA

AM-1.5%-ASA

A-0.6%-ASA

AB-4%-CS

AB-4%-CSPG

AB-8%-CS

AM-8%-CS

Inte

nsi

dad

AB-5%-RE

Longitud de onda (cm-1

)


ibuprofeno. Respecto a los complejos, se evidencian las mismas bandas presentes en las

mezclas físicas, lo que confirma la presencia de ibuprofeno y es esperado dado que las

interacciones entre el huésped y el hospedador no son de tipo covalente. En este sentido, el

espectro infrarrojo del complejo de inclusión molecular no debería diferir apreciablemente

del espectro correspondiente a la mezcla física, tal como ha sido reportado por Braga et al.

(2003) al investigar el comportamiento de los complejos de inclusión molecular empleando

β-ciclodextrina e ibuprofeno.

De otro lado, como se muestra en la Figura 4-12, los análisis por XRD evidencian el patrón

cristalográfico altamente cristalino característico del ibuprofeno con picos en 2θ; 24.6°,

22.3°, 20.1°, 19.4°, 17.5°, 16.6°, 12.2° y un pico a 6.1° atribuido a la mezcla racémica (Byrn

et al., 1997). Los controles correspondientes a los almidones de bambú (CTAB) y de maíz

(CTAM) exhiben un patrón semicristalino con tres picos anchos en 2θ de 20.78°, 11.76°,

6.67° y 20.08°, 11.99°, 6.67°, respectivamente. Por su parte, la mezcla física entre los

controles y el ibuprofeno, en una concentración de 0.05%, muestra los picos característicos

del ibuprofeno en 2θ; 22.3°, 20.1°, 17.5°, 16.6°, 12.2° y 6.1°, con una intensidad

relativamente baja. Estos picos no son observados en los difractogramas obtenidos a partir

de los complejos, lo que sugiere que el patrón semicristalino observado para estas muestras

corresponde a los complejos almidón - activo formados. Aunque es posible que exista una

fracción de activo no complejado, ésta ocurre en un bajo porcentaje que no alcanza a ser

detectado por la resolución del equipo.

Los picos de los controles, al igual que los de los complejos almidón - ibuprofeno, son

anchos debido probablemente a la poca periodicidad de los átomos en los cristales o al

tamaño del cristal. Dado que la trayectoria del haz de rayos X dispersados por los primeros

dos planos de átomos difiere muy poco en el desfasamiento que se puede tolerar, el plano

de átomos que dispersa el haz de rayos X exactamente en desfase con respecto a los primeros

planos estaría ubicado en el interior del cristal. Cuando el cristal es tan pequeño, que este

plano de átomos no existe, no se cancelarán completamente todos los rayos X dispersos y

de esta manera, el haz sufrirá una pequeña divergencia angular debido al tamaño del cristal

en ángulos cercanos pero no iguales al ángulo perfecto de Bragg, haciendo que el pico no

sea agudo (Cullity y Stock, 2014).


Figura 4-12. Difractogramas de rayos X correspondientes a los complejos de inclusión molecular, los

controles y las mezclas físicas. Almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa (A); método

acidificación de una solución alcalina (ASA); método calentamiento - sellado (CS); método calentamiento -

sellado por rotaevaporación (RE); control (CT); ibuprofeno (IBU); mezcla física (MF).

Este comportamiento es evidente en la simulación computarizada mediante el software PDF-

4 desarrollado por Rodríguez-García et al. (2018) para evaluar la influencia del tamaño del

cristal de amilosa (20 nm - 2 nm) a partir de la forma de los picos de difracción de rayos X.

Los resultados evidencian picos de difracción amplios a medida que el tamaño del cristal

5 10 15 20 25 30 35 40 5 10 15 20 25 30 35 40

IBU

Intensidad

AB

AM

CTAB

CTAM

MFAB

MFAM

AB-1%-ASA

AM-1%-ASA

AM-1%-ASA*

AB-1.5%-ASA

AM-1.5%-ASA

A-0.6%-ASA

AB-4%-CS

AB-4%-CSPG

AB-8%-CS

AM-8%-CS

AB-5%-RE

2 (°)

2 (°)


disminuye de 10 nm a 2 nm, y picos altamente definidos a media que el tamaño del cristal

aumenta desde 10 nm a 20 nm.

Teniendo en cuenta que en el metodo CS empleado para la obtención de los complejos se

induce su precipitación por enfriamiento, el tamaño de los cristales está fuertemente

influenciado por la velocidad y la temperatura de dicha etapa de enfriamiento. Al respecto

Marinopoulou et al. (2019) indican que cuanto mayor es la diferencia entre la temperatura

utilizada en la disolución del almidón y la posterior adición del activo respecto a la

temperatura a la que se enfrió el sistema, la formación de los cristales ocurre de forma más

rápida y menor es su tamaño.

Los patrones cristalográficos de los controles se catalogaron como tipo V6II (Zobel, 1988;

Putseys et al., 2010) y pueden ser indexados usando una celda ortorrómbica con dimensiones

a = 2.74 nm, b = 2.65 nm y c = 0.8 nm (Tabla 4-6) como ha sido reportado por Helbert y

Chanzy (1994). Esta estructura tipo V6II se caracteriza por presentar una hélice con seis

unidades de glucosa por turno, donde el ligando podría estar ubicado dentro y entre las

hélices; su espacio intersticial entre las hélices es mayor que el de la estructura Vh-amilosa.

Debido a que los almidones no fueron sometidos a desengrasado con el objetivo de dar uso

al almidón nativo sin ningún tratamiento previo, estas estructuras se pueden atribuir a la

presencia de lípidos en los almidones, los que al ser tratados con agua como plastificante,

forman complejos amilosa - lípido (Conde-Petit et al., 2006, Marinopoulou et al., 2019).

Como se ha mencionado, estos lípidos podrían favorecer la complejación de la molécula

huésped de interés; sin embargo, esto depende también de las características estructurales

de dicha molécula (Carbinatto et al., 2016).

De otro lado, los complejos AB-1%-ASA, AM-1%-ASA, AB-4%-CSPG y AB-5%-RE

exhiben tres picos característicos de los complejos de inclusión molecular tipo V6III (Tabla

4-6), indexados en una celda ortorrómbica con dimensiones a = 2.826 nm, b = 2.93 nm y c

= 0.801 nm, caracterizada por presentar seis unidades de glucosa por turno con el huésped

ubicado entre y dentro de las hélices y un mayor espacio intersticial que la estructura V6II,

debido posiblemente a las características estructurales del ibuprofeno. Esta estructura ha


sido previamente reportada por Buléon et al. (1990) investigando los complejos de amilosa

con isopropanol y acetona.

Tabla 4-6. Indexación del d-espaciado observado en los respectivos complejos con ibuprofeno en las celdas

unitarias reportadas en la literatura.

Muestra 2θ Obs d Obs d Cal Δd h l k Estructura

CTAB

6.666 13.250 13.250a 0.000 0 2 0

V6II 11.762 7.518 7.520a 0.002 3 2 0

20.767 4.274 4.279a 0.005 5 2 1

CTAM

6.666 13.250 13.250a 0.000 0 2 0

V6II 11.991 7.375 7.376a 0.001 1 1 1

20.079 4.419 4.418a 0.001 0 5 1

AB-1%-ASA

6.953 12.703 12.727b 0.024 2 1 0

V6III 12.080 7.320 7.325b 0.005 0 4 0

20.694 4.289 4.293b 0.004 4 4 1

AM-1%-ASA

6.952 12.706 12.727b 0.021 2 1 0

V6III 12.074 7.324 7.325b 0.001 0 4 0

19.848 4.470 4.475b 0.005 5 4 0

AM-1%-ASA*

7.422 11.901 11.850c 0.051 0 2 0

12.955 6.828 6.825c 0.003 2 0 0 V6I

19.861 4.467 4.468c 0.001 3 1 0

AB-1.5%-ASA

6.901 12.799 12.798d 0.002 1 2 0

V7 11.788 7.501 7.500d 0.001 4 0 0

19.752 4.491 4.499d 0.008 2 6 0

AM-1.5%-ASA

6.901 12.799 12.798d 0.001 1 2 0

V7 11.789 7.501 7.500d 0.001 4 0 0

19.720 4.498 4.499d 0.001 2 6 0

A-0.6%-ASA

8.584 10.293 10.293d 0.000 2 2 0

V7 17.036 5.181 5.162d 0.019 1 4 1

22.728 3.909 3.909d 0.000 4 5 1

23.881 3.723 3.723d 0.000 7 1 1

AB-4%-CS

6.901 12.799 12.798d 0.001 1 2 0

V7

12.891 6.862 6.862d 0.000 3 3 0

18.002 4.926 4.924d 0.002 6 1 0

20.083 4.418 4.418d 0.000 6 3 0

21.566 4.117 4.117d 0.000 5 5 0

22.510 3.946 3.947d 0.001 5 4 1

AB-4%-CSPG

6.939 12.728 12.727b 0.001 2 1 0

V6III 12.583 7.029 7.028b 0.001 0 2 1

19.650 4.514 4.510b 0.004 4 5 0

AB-8%-CS

6.901 12.799 12.798d 0.001 1 2 0

V7 12.125 7.292 7.294d 0.002 1 1 1

22.246 3.993 3.993d 0.000 4 6 0

AM-8%-CS

6.901 12.800 12.798d 0.002 1 2 0

V7 12.464 7.096 7.075d 0.021 0 4 0

20.084 4.418 4.418d 0.000 6 3 0

22.474 3.953 3.947d 0.006 5 4 1

AB-5%-RE

8.720 10.133 10.170b 0.038 2 2 0

V6III 17.021 5.205 5.214b 0.009 4 1 1

22.257 3.991 3.999b 0.008 2 6 1 a d-espaciado calculado usando una celda unitaria reportada por Helbert and Chanzy (1994); b Buléon

et al. (1990); c Rappenecker and Zugenmaier (1981); d Yamashita et al. (1973). Observado (d Obs);


calculado (d Cal); diferencia del d-espaciado observado y el calculado (Δd); índices de Miller (h l k);

almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación de una

solución alcalina (ASA); método calentamiento - sellado (CS); método calentamiento - sellado por

rotaevaporación (RE); control (CT); ibuprofeno (IBU); mezcla física (MF).

Cuando el tiempo de reacción en la formación de los complejos disminuye de 3 h a 0.5 h,

como en el caso del complejo AM-1%-ASA*, la indexación de los picos observados en 2θ;

19.86°, 12.95° y 7.42° (Tabla 4-6) usando una celda ortorrómbica con dimensiones a =

1.365 nm, b = 2.37 nm y c = 0.805 nm, podría corresponder a una estructura del tipo Vh -

amilosa o V6I. Considerando las características estructurales del ibuprofeno, esto explicaría

la baja presencia de moléculas de activo complejadas. Aunque en estas muestras se pierde

el patrón cristalográfico tipo A de los almidones nativos (Figura 4-12), los picos obtenidos

son escasamente resueltos. Probablemente, el tiempo de reacción es suficiente para

garantizar la ruptura de la estructura interna de los gránulos, pero no adecuado para lograr

la completa conformación de bobina extendida en la amilosa y amilopectina, que es

necesaria para que ocurra la complejación huésped - hospedador.

Por otra parte, en los difractogramas correspondientes a los complejos AB-1.5%-ASA, AM-

1.5%-ASA, A-0.6%-ASA, AB-4%-CS, AB-8%-CS, AM-8%-CS, se observan picos

característicos de una estructura V7 que pueden ser indexados en una celda ortorrómbica con

dimensiones a = 3.0 nm, b = 2.83 nm y c = 0.78 nm (Yamashita et al., 1973). La

conformación helicoidal en estas estructuras corresponde a siete unidades de anhidro

glucosa por turno con un diámetro interno de 0.63 nm, la que ha sido reportada para

alcoholes de cadena ramificada tales como el isopropílico, el isobutílico, el sec-butílico y el

tert-butílico (Takeo y Kuge, 1969; Yamashita et al., 1973; Nishiyama et al., 2010), para el

ácido propiónico (Takeo et al., 1973) y para cetonas alifáticas incluyendo acetona,

metiletilcetona, dietilcetona, acetonilacetona y metil-n-butilcetona (Takeo y Kuge, 1971).

El diámetro externo de la hélice en presencia de ligandos voluminosos, o en su defecto con

un anillo aromático como parte de su estructura, es de aproximadamente 1.47 nm con siete

u ocho unidades de glucosa por turno (Putseys et al., 2010), como fue evidente en algunas

estructuras obtenidas con el ibuprofeno como molécula huésped. En los casos en los que no

se logró este tipo de estructura, probablemente las diferencias procedimentales y las

condiciones empleadas según el método de preparación tuvieron alguna influencia, lo que


se plantea como hipótesis dado que la literatura al respecto es escasa. En adición, la

presencia de los dos tipos de ligandos (ibuprofeno y lípidos) y los diferentes componentes

estructurales del almidón (amilosa y amilopectina) podrían jugar un papel importante en las

estructuras obtenidas. No obstante, la respuesta a dichos interrogantes se sale del alcance de

esta investigación.

En síntesis, teniendo en cuenta los resultados de caracterización de las diferentes

macroestructuras obtenidas en el presente trabajo, en particular, mediante el método

acidificación de una solución alcalina, se obtienen complejos de estructuras granulares con

formas poliédricas que se caracterizan por presentar dos eventos entálpicos. Por otro lado,

no es evidente una tendencia clara respecto a las estructuras cristalográficas obtenidas

mediante la indexación de los picos de difracción de rayos X. Mediante los métodos CS y

RE se obtienen en su mayoría macroestructuras ligeramente esféricas que, a diferencia de

las obtenidas mediante el método ASA, presentan una única señal endotérmica indicando

posiblemente la homogeneidad de dichas estructuras.

4.2.3 Liberación del activo

Teniendo en cuenta el interés de aprovechar los complejos almidón - activo como sistemas

de liberación de fármacos, los diferentes complejos obtenidos en esta investigación se

caracterizaron respecto a su comportamiento de liberación. Así, como se observa en la

Figura 4-13, en términos generales los complejos bajo estudio lograron porcentajes máximos

de liberación entre el 4.2% ± 0.5% y el 8.9% ± 0.8% al cabo de 360 min en condiciones

gástricas simuladas (Anexo E). Posiblemente, a estas condiciones de pH las estructuras

helicoidales impiden el acceso del medio de disolución a la cavidad interna como

consecuencia de una estructura más compacta.

Por su parte, también trabajando con un medio de liberación de pH 1.2, el complejo AM-

1%-ASA* presenta una liberación de ibuprofeno mayor al 13% al cabo de 90 min de iniciado

el estudio. Como se ha discutido previamente, quizás el ibuprofeno no se incluyó

completamente en la cavidad interna de la hélice dado que el tiempo de reacción en la etapa

de formación del complejo no fue suficiente (30 min). En adición, el tipo de estructura


cristalográfica (Vh) probable para este complejo no posee las dimensiones requeridas para

alojar dentro de la hélice a la molécula de ibuprofeno.

Al comparar los perfiles de liberación del activo a partir de los complejos obtenidos en esta

investigación, los factores de similitud se encuentran entre 50 y 100, indicando que no

existen diferencias en los comportamientos bajo estas condiciones (Anexo E). No obstante,

los valores de f2 correspondientes al complejo AM-1%-ASA* tienen los valores

marcadamente más bajos, entre 55 y 65, respecto al rango entre 73 y 99 en el que se ubican

los valores f2 para las demás comparaciones.

Figura 4-13. Perfiles de liberación de ibuprofeno a partir de los diferentes complejos investigados en

condiciones gástricas simuladas pH 1.2. Almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa

(A); método acidificación de una solución alcalina (ASA); método calentamiento - sellado (CS); método

calentamiento - sellado por rotaevaporación (RE).

En cuanto al mecanismo de liberación, la mayoría de los complejos se ajustaron

adecuadamente al modelo cinético de liberación propuesto por Higuchi (Tabla 4-7),

sugiriendo una liberación dirigida por procesos difusivos. Los complejos obtenidos en los

ensayos AM-1%-ASA*, AB-4%-CSPG, AB-8%-CS y AB-5%-RE presentaron un mejor

ajuste al modelo propuesto por Weibull, con un valor para el coeficiente b entre 0.406 y

0.636. En este modelo, valores del coeficiente b inferiores a 0.75 estarían relacionados con

la difusión Fickiana y valores entre 0.75 y 1 indican que la liberación ocurre tanto por

0 50 100 150 200 250 300 350 4000

2

4

6

8

10

12

14

16

Can

tid

ad l

iber

ada

acu

mu

lad

a (%

)

Tiempo (min)

AB-1%-ASA

AM-1%-ASA

AM-1%-ASA*

AB-1.5%-ASA

AM-1.5%-ASA

A-0.6%-ASA

AB-4%-CS

AB-4%-CSPG

AB-8%-CS

AM-8%-CS

AB-5%-RE


difusión Fickiana como por transporte caso II (Carbinatto et al., 2014). A pesar de la

diferencia en el ajuste de los modelos para los diferentes complejos, los resultados en todos

los casos sugieren que el transporte está regido por la ley de Fick.

Tabla 4-7. Ajuste a los diferentes modelos cinéticos de los perfiles de liberación de los diferentes complejos

investigados en condiciones gástricas simuladas pH 1.2.

Modelo cinético de liberación

Complejo Orden cero Primer orden Higuchi r2 K0 r2 K1 r2 KH

AB-1%-ASA 0.665 0.029 0.688 0.000 0.990 0.471

AM-1%-ASA 0.480 0.031 0.514 0.000 0.957 0.525

AM-1%-ASA* 0.020 0.055 0.066 0.001 0.800 0.963

AB-1.5%-ASA 0.678 0.020 0.694 0.000 0.966 0.325

AM-1.5%-ASA 0.628 0.018 0.644 0.000 0.992 0.289

A-0.6%-ASA 0.727 0.028 0.749 0.000 0.988 0.460

AB-4%-CS 0.663 0.018 0.676 0.000 0.973 0.288

AB-4%-CSPG 0.815 0.013 0.823 0.000 0.988 0.212

AB-8%-CS 0.468 0.024 0.494 0.000 0.965 0.406

AM-8%-CS 0.579 0.015 0.594 0.000 0.986 0.253

AB-5%-RE 0.501 0.015 0.516 0.000 0.961 0.248

Korsmeyer - Peppas Weibull Hixson - Crowell

r2 nKP KKP r2 b r2 Ks

AB-1%-ASA 0.987 0.515 0.443 0.988 0.526 0.681 0.000

AM-1%-ASA 0.945 0.516 0.501 0.950 0.528 0.503 0.000

AM-1%-ASA* 0.902 0.387 1.784 0.908 0.406 0.039 0.000

AB-1.5%-ASA 0.854 0.618 0.142 0.859 0.727 0.689 0.000

AM-1.5%-ASA 0.990 0.474 0.320 0.988 0.526 0.639 0.000

A-0.6%-ASA 0.983 0.550 0.341 0.977 0.613 0.742 0.000

AB-4%-CS 0.971 0.518 0.266 0.971 0.525 0.672 0.000

AB-4%-CSPG 0.989 0.630 0.110 0.990 0.636 0.821 0.000

AB-8%-CS 0.967 0.487 0.447 0.969 0.496 0.486 0.000

AM-8%-CS 0.985 0.499 0.260 0.985 0.505 0.589 0.000

AB-5%-RE 0.970 0.466 0.302 0.971 0.471 0.511 0.000



- sellado por rotaevaporación (RE).

De otro lado, los complejos investigados en condiciones simuladas del intestino a pH 6.8

(Figura 4-14) se caracterizan por una cantidad máxima de liberación entre 49.93% ± 2.54%

y 57.20 ± 0.5% al cabo de 6 h. Al igual que lo obtenido en condiciones gástricas simuladas,

el complejo AM-1%-ASA* presentó un mayor porcentaje de liberación del activo (>50%)

al cabo de 90 min de iniciado el estudio. Como se discutió previamente este comportamiento

puede ser atribuido a las condiciones de proceso y a la ubicación del ibuprofeno dentro de

la estructura cristalina donde no es incluido completamente en el interior de las hélices de


amilosa. De hecho, este complejo se caracteriza por los menores valores de carga de activo

y eficiencia de complejación de todas las opciones investigadas.


condiciones simuladas del intestino pH 6.8. Almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa

(A); método acidificación de una solución alcalina (ASA); método calentamiento - sellado (CS); método

calentamiento - sellado por rotaevaporación (RE).

En la Tabla 4-8 se presentan los resultados del ajuste de los datos a los respectivos modelos

cinéticos de liberación. En general los complejos AB-1%-ASA, AM-1%-ASA, AB.1.5%-

ASA, AM-1.5%-ASA, A-0.6%-ASA, AB-4%-CSPG y AB-5%-RE presentan un ajuste

adecuado al modelo propuesto por Weibull con valores para el coeficiente b inferiores a

0.75, lo que sugiere que la liberación en estas muestras estuvo regida por un mecanismo de

difusión Fickiana. Por su parte, los complejos AB-4%-CS, AB-8%-CS y AM-8%-CS tienen

un mejor ajuste al modelo de Higuchi indicando de igual manera que los procesos difusivos

gobiernan el mecanismo de liberación. El complejo AM-1%-ASA* se ajustó mejor al

modelo de Korsmeyer - Peppas con un valor de 0.582 para el exponente n, que

correspondería a un transporte anómalo donde la liberación se da por procesos difusivos y

de hinchamiento.

De otro lado, según el factor de similitud el complejo AM-1%-ASA* difiere en el

comportamiento de liberación del activo respecto a los demás complejos, con valores de f2

0 50 100 150 200 250 300 350 4000

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Can

tid

ad l

iber

ada

acu

mu

lad

a (%

)

Tiempo (min)

AB-1%-ASA

AM-1%-ASA

AM-1%-ASA*

AB-1.5%-ASA

AM-1.5%-ASA

A-0.6%-ASA

AB-4%-CS

AB-4%-CSPG

AB-8%-CS

AM-8%-CS

AB-5%-RE


inferiores a 50 (Anexo E). Asimismo, el complejo AB-1%-ASA presenta diferencias en el

comportamiento de liberación respecto al complejo AM-8%-CS con un valor de f2 de 49. El

complejo AM-8%-CS se caracteriza por presentar una estructura tipo V7 donde el porcentaje

de liberación máximo fue menor en contraste con la estructura tipo V6III del complejo AB-

1%-ASA, es decir, la estructura V7 podría favorecer la ubicación del ibuprofeno dentro de

la hélice confiriendo posiblemente una mayor interacción entre el huésped y hospedador.


investigados en condiciones simuladas del intestino pH 6.8.


Complejo Orden cero Primer orden Higuchi r2 K0 r2 K1 r2 KH

AB-1%-ASA 0.086 0.210 0.448 0.004 0.787 3.660

AM-1%-ASA 0.123 0.212 0.589 0.005 0.840 3.661

AM-1%-ASA* 0.372 0.277 0.898 0.007 0.931 4.658

AB-1.5%-ASA 0.036 0.192 0.451 0.004 0.798 3.327

AM-1.5%-ASA 0.463 0.197 0.738 0.004 0.914 3.292

A-0.6%-ASA 0.325 0.201 0.678 0.004 0.889 3.413

AB-4%-CS 0.501 0.208 0.780 0.004 0.893 3.467

AB-4%-CSPG 0.279 0.199 0.623 0.004 0.891 3.377

AB-8%-CS 0.291 0.205 0.654 0.004 0.832 3.489

AM-8%-CS 0.669 0.187 0.835 0.003 0.956 3.042

AB-5%-RE 0.021 0.192 0.415 0.004 0.776 3.341

Korsmeyer - Peppas Weibull Hixson - Crowell

r2 nKP KKP r2 b r2 Ks

AB-1%-ASA 0.901 0.387 6.835 0.941 0.482 0.266 0.001

AM-1%-ASA 0.887 0.421 5.885 0.918 0.588 0.432 0.001

AM-1%-ASA* 0.992 0.582 3.813 0.988 0.724 0.816 0.002

AB-1.5%-ASA 0.857 0.414 5.586 0.884 0.563 0.277 0.001

AM-1.5%-ASA 0.821 0.622 1.867 0.915 0.733 0.633 0.001

A-0.6%-ASA 0.871 0.516 3.296 0.928 0.623 0.537 0.001

AB-4%-CS 0.731 0.706 1.279 0.879 0.832 0.672 0.001

AB-4%-CSPG 0.911 0.458 4.360 0.925 0.625 0.475 0.001

AB-8%-CS 0.727 0.632 1.682 0.780 0.837 0.521 0.001

AM-8%-CS 0.848 0.717 1.050 0.940 0.827 0.790 0.001

AB-5%-RE 0.853 0.384 6.628 0.888 0.527 0.236 0.001



- sellado por rotaevaporación (RE).

El aumento en la cantidad máxima liberada de ibuprofeno para todos los complejos a pH 6.8

en comparación con la obtenida en condiciones gástricas simuladas pH 1.2, podría atribuirse

a la sinergia entre el pH del medio y la temperatura empleada. Como lo indican Hayashi y


Miyake (1981) a partir de sus trabajos con amilosa en solución neutra a temperaturas entre

35 °C y 60 °C, el aumento de la temperatura podría favorecer la formación de puentes de

hidrógeno entre el agua y las cadenas poliméricas de amilosa acelerando el proceso de

hinchamiento de la estructura del complejo, que se espera sea mayor a pH basico. De igual

manera, el incremento en la liberación podría deberse a un porcentaje de ibuprofeno ubicado

en regiones amorfas de la estructura del complejo, es decir, dentro de cadenas poliméricas

no agrupadas en empaquetamientos cristalinos que bajo estas condiciones facilitan su salida

hacia el medio de liberación.

Cuando se evalúa el comportamiento de liberación a pH 6.8 en presencia de pancreatina

(Figura 4-15), los porcentajes de activo liberado al cabo de 360 min (entre 81.7% ± 4.1% y

97.2% ± 0.6%) aumentan entre un 19% y un 44% en comparación con la liberación en

ausencia de la misma (Figura 4-14 y Anexo E), siendo evidente la influencia de la actividad

enzimática de la amilasa. Como se observa en la Tabla 4-9, los comportamientos de

liberación obtenidos para los diferentes complejos se ajustaron al modelo de primer orden,

es decir, el porcentaje de liberación es directamente proporcional a la concentración del

activo incorporado en la estructura del almidón. Esto podría estar relacionado con la

degradación enzimática en masa que ocasiona un aumento en la cantidad del activo liberado

como consecuencia de la escisión de los enlaces α(1→4) en cualquier punto de las cadenas

poliméricas. Resultados similares fueron reportados por Carbinatto et al. (2016) estudiando

los complejos entre el almidón de maíz con alto contenido de amilosa (Hylon® VII) y dos

moléculas farmacológicamente activas (praziquantel y nimesulida), en presencia de ácido

palmítico. De otro lado, es importante aclarar que los datos correspondientes al

comportamiento de liberación en condiciones simuladas del intestino a pH 6.8 en presencia

de pancreatina no fueron ajustados a los modelos propuestos por Korsmeyer - Peppas y

Weibull debido a que estos modelos se aplican principalmente cuando se tienen porcentajes

de liberación menores al 60% (Costa y Sousa, 2001; Lao et al., 2011; Carbinatto et al.,

2014).

Respecto a la comparación de los comportamientos de liberación de activo a partir de los

complejos investigados a pH 6.8 en presencia de pancreatina, según los factores de similitud,

el complejo AM-1%-ASA* presenta diferencias en el perfil de liberación con valores de f2


inferiores a 50 respecto a los complejos AB-1.5%-ASA, A-0.6%-ASA y AM-8%-CS, los

que se caracterizan por presentar una estructura tipo V7 reiterando nuevamente la estabilidad

de dicha estructura, en este caso posiblemente expresada en términos de resistencia a la

degradación enzimática, con lo cual el porcentaje de activo liberado fue menor que para el

complejo AM-1%-ASA*.


condiciones simuladas del intestino pH 6.8 en presencia de pancreatina. Almidón de bambú (AB); almidón de

maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación de una solución alcalina (ASA); método calentamiento

- sellado (CS); método calentamiento - sellado por rotaevaporación (RE).

Finalmente, los comportamientos de liberación del ibuprofeno a partir de los diferentes

complejos empleando condiciones simuladas del intestino a pH 7.2 en presencia de

pancreatina, al igual que para el medio de pH 6.8/pancreatina, se ajustan a una cinética de

primer orden (Tabla 4-10), con una cantidad máxima de activo liberado entre el 83.8% ±

3.2% y el 99.0% ± 1.8 % (Figura 4-16). Al parecer, el aumento del pH del medio no

influencia en gran medida la liberación comparado con lo obtenido en condiciones

simuladas del estómago pH 6.8 en presencia de pancreatina (Figura 4-15), dado que este

cambio leve del pH podría no alterar en gran medida la actividad enzimática de la α-amilasa

y el hinchamiento de la estructura del complejo.

0 50 100 150 200 250 300 350 4000

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

AB-1%-ASA

AM-1%-ASA

AM-1%-ASA*

AB-1.5%-ASA

AM-1.5%-ASA

A-0.6%-ASA

AB-4%-CS

AB-4%-CSPG

AB-8%-CS

AM-8%-CS

AB-5%-RE

Can

tid

ad l

iber

ada

acu

mu

lad

a (%

)

Tiempo (min)


Por otra parte, el complejo AM-1%-ASA* presenta diferencias en el perfil de liberación

respecto a los obtenidos para los complejos AB-1.5%-ASA, A-0.6%-ASA y AM-8%-CS,

comportamiento que es similar al observado en condiciones simuladas del intestino a pH 6.8

en presencia de pancreatina. Además, el complejo AB-1%-ASA presenta diferencias en el

comportamiento de liberación respecto al complejo AM-8%-CS; este último complejo se

caracteriza por presentar una estructura tipo V7 donde la tasa de liberación fue menor en

contraste con la estructura tipo V6III del complejo AB-1%-ASA. Probablemente, la

estructura V7 presenta cierto grado de resistencia a la degradación enzimática en contraste

con las estructuras V6III atribuida al complejo AB-1%-ASA.




Complejo Orden cero Primer orden Higuchi Hixson - Crowell r2 K0 r2 K1 r2 KH r2 KHC

AB-1%-ASA 0.033 0.346 0.974 0.016 0.829 5.986 0.849 0.003

AM-1%-ASA 0.091 0.340 0.881 0.012 0.806 5.909 0.760 0.003

AM-1%-ASA* 0.134 0.360 0.942 0.024 0.781 6.278 0.800 0.003

AB-1.5%-ASA 0.333 0.321 0.970 0.012 0.895 5.440 0.939 0.003

AM-1.5%-ASA 0.007 0.341 0.949 0.019 0.811 5.928 0.821 0.003

A-0.6%-ASA 0.332 0.326 0.976 0.012 0.906 5.518 0.946 0.004

AB-4%-CS 0.144 0.339 0.966 0.016 0.871 5.812 0.925 0.004

AB-4%-CSPG 0.024 0.350 0.974 0.017 0.835 6.060 0.856 0.003

AB-8%-CS 0.148 0.342 0.973 0.016 0.864 5.871 0.935 0.004

AM-8%-CS 0.125 0.306 0.879 0.009 0.863 5.260 0.783 0.002

AB-5%-RE 0.009 0.351 0.961 0.018 0.822 6.086 0.828 0.003

Almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación de una


rotaevaporación (RE).

De acuerdo con todo lo anterior, a través de caracterizaciones por SEM, DSC, FTIR y XRD

se corrobora la formación de los complejos por las diferentes metodologías ensayadas y sus

comportamientos de liberación indican que las condiciones del medio (pH y presencia de

enzima) son determinantes para facilitar el hinchamiento del complejo y la escisión de las

cadenas poliméricas modulando la entrega del fármaco. Al parecer, de las propiedades

investigadas a los complejos, la estructura cristalina y la facilidad para plastificar las cadenas

poliméricas o por la cantidad de activo complejado, son la que influencian en mayor grado

la entrega del activo al medio de liberación. Igualmente, si el activo se logra incorporar


completamente en la hélice de amilosa o amilopectina, así como la fuerza de interacción

huésped - hospedador podrían facilitar o no la liberación de la molécula complejada. Esto,

a la vez que evidencia la necesidad de trabajos de investigación adicionales para entender la

estructura de los complejos y optimizar el proceso de incorporación de activos en ellos,

plantea expectativas interesantes respecto a su posible aplicación en el transporte de

moléculas activas, especialmente cuando se pretende una liberación en el tracto

gastrointestinal a nivel de intestino.


condiciones simuladas del intestino pH 7.2 en presencia de pancreatina. Almidón de bambú (AB); almidón de

maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación de una solución alcalina (ASA); método calentamiento

- sellado (CS); método calentamiento - sellado por rotaevaporación (RE).




Complejo Orden cero Primer orden Higuchi Hixson - Crowell r2 K0 r2 K1 r2 KH r2 KHC

AB-1%-ASA 0.053 0.353 0.960 0.022 0.793 6.159 0.832 0.003

AM-1%-ASA 0.106 0.350 0.955 0.021 0.788 6.119 0.803 0.003

AM-1%-ASA* 0.089 0.376 0.965 0.021 0.793 6.539 0.869 0.004

AB-1.5%-ASA 0.374 0.323 0.976 0.010 0.899 5.461 0.950 0.003

AM-1.5%-ASA 0.026 0.337 0.944 0.019 0.817 5.849 0.821 0.003

A-0.6%-ASA 0.086 0.353 0.983 0.018 0.835 6.100 0.922 0.004

AB-4%-CS 0.198 0.346 0.986 0.015 0.879 5.926 0.937 0.004

AB-4%-CSPG 0.104 0.343 0.971 0.016 0.858 5.908 0.923 0.004

0 50 100 150 200 250 300 350 4000

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Can

tid

ad l

iber

ada

acu

mu

lad

a (%

)

Tiempo (min)

AB-1%-ASA

AM-1%-ASA

AM-1%-ASA*

AB-1.5%-ASA

AM-1.5%-ASA

A-0.6%-ASA

AB-4%-CS

AB-4%-CSPG

AB-8%-CS

AM-8%-CS

AB-5%-RE


AB-8%-CS 0.102 0.341 0.971 0.016 0.855 5.873 0.867 0.003

AM-8%-CS 0.021 0.323 0.867 0.010 0.801 5.625 0.762 0.003

AB-5%-RE 0.053 0.328 0.863 0.010 0.790 5.716 0.753 0.003

Almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación de una


rotaevaporación (RE).

5 Conclusiones y recomendaciones

5.1 Conclusiones

El trabajo de investigación desarrollado en la presente tesis ofrece un aporte en la generación

de valor agregado a los recursos naturales disponibles en Colombia, en este caso, las fuentes

nativas no convencionales de almidón y su posibilidad de ser empleadas en el desarrollo de

sistemas transportadores de activos. De acuerdo con los resultados obtenidos, el bambú

(Rhipidocladum cf. harmonicum (Parodi) Mcclure) podría ser una fuente alternativa

importante de almidón teniendo en cuenta el porcentaje de extracción (22.9% ± 1.0%), su

hábito de crecimiento (36 m en 6 meses) y su alta producción de biomasa por unidad de

área, que ha sido poco aprovechada en nuestro medio.

De otro lado, los complejos de inclusión molecular entre los almidones de bambú y de maíz,

y el ibuprofeno como molécula activa, fueron preparados exitosamente empleando tres

metodologías diferentes; acidificación de una solución alcalina (ASA), calentamiento -

sellado (CS) y calentamiento - sellado por rotaevaporación (RE), demostrando la posibilidad

de emplear almidones nativos con este propósito. Se obtuvieron los porcentajes más altos

de ibuprofeno complejado empleando almidón de maíz y el método ASA; por el contrario,

al utilizar almidón de bambú, la metodología CS presentó mejores resultados. La

disminución de la cantidad de agua empleada durante la preparación de los complejos

favorece el porcentaje de molécula activa incorporada mediante el método ASA; sin

embargo, esta variable no es determinante cuando se trabaja con el método CS. Por otra

parte, mediante el método RE, propuesto en esta investigación, cuando se empleó almidón

de bambú se lograron porcentajes de incorporación de ibuprofeno superiores a los obtenidos

con el método ASA pero menores que con la técnica CS. No obstante, podría resultar

prometedor debido a que facilita un mayor control del proceso, formando los precipitados

almidón - activo en menor tiempo con estructuras cristalinas mas definidas. Asimismo, se


destaca la posibilidad de emplear una mayor cantidad de agua para favorecer la

plastificación de las cadenas poliméricas.

Los análisis de los diferentes complejos mediante DSC, FTIR y XRD y liberación de activo

evidenciaron la interacción entre el ibuprofeno y los respectivos almidones generando

diferentes tipos de estructuras cristalinas de las cuales, al parecer, la estructura V7 presenta

una mayor estabilidad en contraste con las estructuras V6I y V6III. Todos los complejos

presentaron poca liberación de fármaco bajo condiciones gástricas simuladas pH 1.2, donde

la liberación se rige principalmente por un transporte de difusión Fickiana. De otro lado, con

el aumento del pH se evidencia un aumento en la cantidad de activo liberado, asimismo, los

complejos fueron sensibles a la degradación enzimática por parte de la pancreatina

permitiendo un aumento en la cantidad máxima liberada del ibuprofeno siguiendo una

cinética especialmente de primer orden. Por consiguiente, este tipo de sistemas de

encapsulación podrían ser potencialmente interesantes para la entrega dirigida de moléculas

activas al intestino.

5.2 Recomendaciones

Esta investigación corresponde a una primera aproximación respecto al empleo de

almidones nativos como sistemas transportadores de moléculas activas. Los resultados de

complejación de ibuprofeno y los comportamientos de liberación obtenidos resultan

prometedores, por lo que es importante que a partir de ellos se optimicen las condiciones de

trabajo con el propósito de obtener porcentajes mucho más elevados de complejación de la

molécula huésped, por ejemplo, aumentando la cantidad inicial de ligando, lo que

adicionalmente podría favorecer la complejación con la amilopectina tal como lo sugieren

Conde-Petit et al. (2006). Por otra parte, como lo demuestra Arijaje y Wang (2016)

sometiendo los almidones a un proceso de desramificación empleando isoamilasa y β-

amilasa, se pueden generar cadenas de amilosa y amilopectina con una mayor capacidad de

complejación. Igualmente, se hace necesario evidenciar la influencia positiva o negativa de

los lípidos presentes en los almidones, debido a que muchos de estos pueden estar asociados

a complejos tipo V-amilosa endógenos deben implementarse procesos de desengrasado que

permitan disponer de una calidad adecuada. Es necesario profundizar en el entendimiento

Recomendaciones 91

del proceso de formación de los complejos y de sus características estructurales empleando

técnicas instrumentales que complementen las ya empleadas en este trabajo, tales como la

resonancia magnética nuclear en estado sólido (NMR) (Morrison et al., 1993; Kawada y

Marchessault, 2004; Le Bail et al., 2005; Tozuka et al., 2006; Zabar et al., 2009, 2010;

Gidley, 2014; Zhu, 2017c; Feng et al., 2018), la microscopía electrónica de transmisión

(TEM) (Buléon et al., 1990; Cardoso et al., 2007; Nishiyama et al., 2010; Nuessli et al.,

2003; Putaux et al., 2008), la espectroscopía Raman (Cael et al., 1975; Yang et al., 2013;

Marinopoulou et al., 2019), la microscopía de fuerza atómica (Tian et al., 2010; Yang et al.,

2013; Zabar et al., 2010), la distribución de las cadenas ramificadas de amilopectina (Ao y

Jane, 2007; Zhang y Hamaker, 2012; Felisberto et al., 2018) y el peso molecular de las

cadenas poliméricas (Yoo y Jane, 2002; Chen y Bergman, 2007; Harding et al., 2016). Esto

ampliará las posibilidades de trabajo con otras moléculas activas, facilitará la optimización

de los métodos de complejación y se podrá lograr una alternativa de bajo costo para el diseño

de sistemas de liberación de moléculas activas basada en almidones nativos, considerando

la poca disponibilidad comercial de amilosa y de almidones con un elevado contenido de

amilosa. De otro lado, durante la extracción del almidón a partir de bambú, fue evidente el

elevado contenido de fibra que posee esta planta. Sobre esta base, podrían desarrollarse

investigaciones que aprovechen este subproducto y que generen valor agregado a esta planta.

A. Anexo: Determinación del contenido de

amilosa aparente

• Determinación de la cantidad de yodo y longitud de máxima

absorbancia

Como se observa en la Figura A-1, a partir de 80 µL de la solución de yodo/yoduro de

potasio no se evidencia un cambio en el valor de la absorbancia, la longitud de onda de

absorbancia máxima es de 620 nm y fue la seleccionada para realizar la lectura de las

muestras.

Figura A-1. Espectros de absorción obtenidos en la determinación de la cantidad de yodo necesaria para la

cuantificación de amilosa.

• Curva de calibración

La curva de calibración preparada para la determinación del contenido de amilosa aparente

presentó un coeficiente de determinación (R2) de 0.9988 (Figura A-2). Es importante resaltar

300 400 500 600 700 800 9000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Ab

sorb

anci

a

Longitud de onda (nm)

40 L I2/KI

60 L I2/KI

80 L I2/KI

100 L I2/KI


que el nivel 1 de la curva de calibración que contiene una proporción del estándar de

amilopectina del 100%, presenta una absorbancia de 0.144 (Figura A-3). Esto estaría

relacionado con el complejo de amilopectina - yodo, debido posiblemente a las longitudes

de las cadenas ramificadas de la misma.

Figura A-2. Curva de calibración para la determinación del contenido aparente de amilosa.

Figura A-3. Espectros de absorción correspondientes a la curva de calibración en la determinación del

contenido aparente de amilosa.

0 20 40 60 80 1000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Amilosa (%)

Ab

sorb

anci

a Ecuación y = 0.0091x - 0.13

R 0.9994

R^2 0.9988

Valor Error estándar

Intercepto 0.13 0.0042

Pendiente 0.0091 7.564E-05

300 400 500 600 700 800 900

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Ab

sorb

anci

a


0%

10%

25%

50%

75%

100%

B. Anexo: Observaciones de impurezas por

microscopía óptica y SEM

Micrografías de los sólidos insolubles en la determinación de fibra, después de someter el

almidón a una digestión básica donde se observa la fibra remanente del proceso de

extracción (A). Su presencia se confirma por los pequeños orificios observados en las

micrografías tomadas al parénquima celular (Figura 3-5). De otro lado, la micrografía óptica

normal con una magnificación de 100x confirma la presencia de pequeñas partículas de

fibras (B).

Figura B-1. Micrografía SEM de los sólidos insolubles presentes en el almidón (A); micrografía óptica del

almidón con una magnificación de 100x (B).

A B

C. Anexo: Distribución del tamaño de

partícula

Figura C-1. Comportamiento de los datos y los ajustes en la determinación del tamaño de partícula.

Tabla C-1. Residuales de la curva de datos, ajuste e índices de refracción y absorción utilizados en la

determinación del tamaño de partícula.

Índice de refracción de la partícula 1.52

Índice de absorción de la partícula 0.18

Índice de refracción del dispersante 1.33

Residual 0.34%

Residual ponderado 0.66%

Concentración teórica 0.004%

Concentración real 0.0043%

5 10 15 20 25 30 35 40 450

5

10

15

20

25

30

35

En

erg

ía d

e la

lu

z

Número de detector

Datos

Ajuste

D. Anexo: Validación de la metodología

analítica por HPLC

D.1 Condiciones cromatográficas de partida

Se realizaron análisis preliminares para ajustar las condiciones cromatográficas

(Cromatógrafo Agilent 1260 Infinity Quaternary LC) partiendo de las recomendaciones de

la Farmacopea de los Estados Unidos (The United States Pharmacopeia, 2019). Se

seleccionó como longitud de onda de lectura 220 nm según el espectro de absorción obtenido

(Figura D-1) y se trabajó con un volumen de inyección de 100 µL con el objetivo de obtener

una respuesta significativa que permitiera cuantificar pequeñas cantidades de analito. De

igual manera, en los ensayos preliminares se empleó una columna cromatográfica marca

Luna® C18(2) con longitud y diámetro interno de 150 x 4.6 mm y tamaño de partícula de 5

µm. Los análisis se llevaron a cabo en condiciones isocráticas a una temperatura de 30 °C,

la fase móvil consistió en una mezcla de agua (pH 2.5 empleando ácido ortofosfórico) y

acetonitrilo (1:1) a un flujo de 1.5 mL/min.

D.2 Preparación de las muestras

• Preparación del estándar de ibuprofeno

Para desarrollar la validación de la metodología analítica se preparó una solución madre de

ibuprofeno (SMI) a una concentración de 200 µg/mL:

SMI =10 mg Ibuprofeno

50 mL (agua pH 2.5 - acetonitrilo (1:1)) =

0.2 mg

mL =

200 μg

mL


Figura D-1. Espectro de absorción del ibuprofeno obtenido mediante HPLC.

• Preparación de las muestras correspondientes a los complejos de

inclusión

Las muestras se sometieron a una degradación enzimática como se describe en la

Sección 4.1.2.1.

• Idoneidad del sistema

Previo al desarrollo de la validación de la metodología analítica, se evaluó la idoneidad del

sistema. Con este propósito se inyectó una muestra del estándar de ibuprofeno a una

concentración de 5 µg/mL, leída seis veces para determinar los siguientes parámetros

cromatográficos: tiempo de retención, factor de capacidad, resolución, factor de asimetría y

factor de selectividad.

D.3 Validación de la metodología analítica

La validación del método se realizó tomando como referencia los lineamientos establecidos

por la Conferencia Internacional de Armonizacion ICH (2005). Teniendo en cuenta que se

trata de un método que se empleará para cuantificar el activo, los parámetros evaluados

incluyeron: especificidad, linealidad y rango, exactitud, repetibilidad, precisión intermedia,

límite de cuantificación y límite de detección.

220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

0

20

40

60

80

100

Inte

nsi

dad

(m

AU

)


D. Anexo: Validación de la metodología analítica por HPLC 101

• Especificidad

Con el fin de determinar la especificidad del sistema se analizaron los componentes de la

fase móvil, de la matriz de almidón de bambú y de maíz después de ser sometidos a un

tratamiento de degradación enzimática (Sección 4.1.2.1), y de estas últimas enriquecidas

con el analito. Como criterios de aceptación se tuvieron en cuenta el tiempo de retención

(Tr) y la pureza del pico dado por el software del equipo (Agilent ChemStation 3.2).

• Linealidad

La evaluación de la linealidad del sistema se llevó a cabo mediante la preparación de una

curva de calibración en el rango entre 0.05 ppm y 20 ppm utilizando soluciones

correspondientes a ocho niveles de concentración del estándar de ibuprofeno (Tabla D-1),

que fueron preparadas por triplicado a partir de la SMI, y cada una leída por triplicado para

un total de 72 mediciones. Como criterios de aceptación se tuvieron en cuenta el coeficiente

de determinación (R2) después del ajuste de los datos mediante un modelo lineal, que debe

cumplir con el valor de aceptación R2 > 0.998, el análisis de varianza (ANOVA) para

comprobar estadísticamente la relación lineal entre las dos variables con un intervalo de

confianza del 95% y pruebas de hipótesis estadísticas t de Student de dos colas para el

intercepto y la pendiente, con un intervalo de confianza del 95%.

Tabla D-1. Niveles de concentración seleccionados para evaluar la linealidad del sistema en la validación de

la metodología analítica mediante HPLC.

Nivel 1 2 3 4 5 6 7 8

Concentración (µg/mL) 0.05 0.08 0.1 0.5 1 3 10 20

• Precisión

La precisión del sistema se determinó mediante la evaluación de la repetibilidad utilizando

tres niveles de concentración (0.05, 5 y 20 µg/mL). Se realizaron tres réplicas para cada

medición. La precisión intermedia se determinó con tres niveles de concentración (0.05, 5 y

20 µg/mL) utilizando el mismo equipo. De igual manera, se realizaron tres réplicas para


cada medición. Las lecturas se llevaron a cabo intra-día e inter-día, cada nivel por triplicado.

Como criterio de aceptación se tuvo en cuenta el coeficiente de variación promedio

ponderado obtenido mediante la prueba C de Cochran con un valor de aceptación de %RSD

≤ 2%.

• Exactitud

La exactitud del sistema se determinó utilizando la matriz de bambú enriquecida con una

solución del estándar de ibuprofeno en tres niveles de concentración (0.05, 5 y 20 µg/mL).

Como criterio de aceptación se consideraron el porcentaje de recuperación (%R) con valores

de aceptación entre el 90% - 110% y una prueba de hipótesis estadística t de Student de dos

colas, con un intervalo de confianza del 95%, para verificar si existían diferencias

significativas entre el porcentaje medio de recuperación experimental y el 100%

(Quattrocchi et al., 1992). El valor de t calculado se determinó mediante la Ecuación D-1.

tcal = (% R ̅- 100) √n

CV (D-1)

Dónde: %R̅ es el porcentaje de recuperación medio; CV el coeficiente de variación y n el

número de medidas.

• Límites de detección y cuantificación

Los límites de detección (LD) y de cuantificación (LC) del sistema se estimaron a partir de

los datos obtenidos en la curva de calibración realizada en la evaluación de la linealidad

(Quattrocchi et al., 1992), utilizando las Ecuaciones D-2 y D-3, respectivamente.

LD = a + 3Sa

b *√ n (D-2)

LC = a + 10Sa

b *√ n (D-3)

Dónde: Sa es el error estándar del intercepto; a el intercepto; b la pendiente y n el número

de medidas.


D.4 Resultados y discusión

La Figura D-2 muestra el cromatograma obtenido para el ibuprofeno con las condiciones de

trabajo mencionadas previamente. El tiempo de retención del analito fue de 6.06 min ± 0.10

min (Tabla D-2) el que corresponde al tiempo transcurrido desde la inyección del soluto

hasta la elución del mismo obteniendo una máxima señal de respuesta (Quattrocchi et al.,

1992).

Figura D-2. Cromatograma correspondiente al estándar de ibuprofeno (5 µg/mL) obtenido mediante HPLC.

Como se observa en la Tabla D-2, el factor de capacidad, que está relacionado con la

distribución del analito en ambas fases, cumple con los valores de aceptación dado que su

valor se encuentra en el rango de 2 a 10, que es el recomendado para mezclas de pocos

componentes (Quattrocchi et al., 1992). La eficiencia y el poder de separación de una

columna se mide en función de sus platos teóricos de acuerdo con el modelo propuesto por

Martin y Singer en 1941 (Quattrocchi et al., 1992) y que explica el equilibrio del analito

entre la fase móvil y la fase estacionaria en el proceso de separación. Aunque no existe un

consenso universal sobre un valor definido que indique las cualidades de una columna

debido a los múltiples factores que influyen en la misma, se espera que a mayor número de

platos teóricos, su eficiencia y poder de separación aumenten. Según los resultados

obtenidos en los diferentes parámetros (Tabla D-2), los que estuvieron dentro de los valores

de aceptación, se considera que el sistema cromatográfico es idóneo para llevar a cabo la

0 1 2 3 4 5 6 7

0

10

20

30

40

50

60

70

Inte

nsi

dad

(m

AU

)

Tiempo (min)Ib

up

rofe

no


validación de la metodología analítica y la posterior cuantificación del ibuprofeno presente

en los complejos.

Tabla D-2. Datos de idoneidad del sistema obtenidos mediante HPLC.

Parámetros Abreviatura Ecuación

Valor

experimental

Valor de

aceptación

Tiempo de retención (min) tR 6.06 ± 0.10

Tiempo muerto (min) tM 0.59 ± 0.20

Número de platos teóricos N N = 16 * (tR

W𝑏)

2

24055 ± 993

Altura de plato teórico (µm) H H = L

N 6.00

Factor de capacidad k' k

'=

tR - tM

tM 9.20 ± 0.50 k

' > 2

Factor de asimetría As As =b

a 1.05 As ≤ 2

Para evaluar la selectividad de la metodología analítica se analizó el comportamiento

cromatográfico de: (i) la matriz del almidón de bambú y de maíz sin presencia del analito,

(ii) la fase móvil y (iii) la matriz de almidón de bambú enriquecida con ibuprofeno. Todas

las muestras se sometieron al mismo tratamiento de degradación enzimática con el fin de

evidenciar la influencia de éste en la selectividad del método. Como se observa en la Figura

D-3, ninguno de los componentes de las matrices o de la fase móvil presenta señales de

interferencia y se tiene un tiempo de retención de 6.06 min ± 0.10 min correspondiente al

ibuprofeno.


Figura D-3. Cromatogramas obtenidos para la evaluación de la selectividad mediante HPLC: matriz de

almidón de bambú enriquecido con ibuprofeno 5 µg/mL (A); matriz de almidón de bambú (B); matriz de

almidón de maíz (C); fase móvil (D).

De otro lado, la matriz de almidón de bambú, que fue seleccionada por su complejidad, no

presenta un efecto de matriz significativo cuando se analizan muestras enriquecidas con un

estándar de ibuprofeno a una concentración de 5 ppm. En adición, la Figura D-4 muestra

que el estándar de ibuprofeno adicionado a la matriz de almidón se encuentra dentro de los

límites de pureza procesados con el software del equipo (Agilent ChemStation) con un factor

de pureza de 999.926 (61 de 61 espectros están dentro del límite del umbral (990)). De

acuerdo con los criterios previamente mencionados, se concluye que el método es selectivo.

Figura D-4. Determinación de la pureza del pico correspondiente al ibuprofeno, datos procesados con el

software Agilent ChemStation con un límite de umbral de 990.

0 1 2 3 4 5 6 7

2 3 4 5 6

D

C

B

Inte

nsi

dad

Tiempo (min)

A

A

A

C

Tiempo (min)

B


La Figura D-5 muestra los datos ajustados a un modelo de regresión lineal simple para

evidenciar la relación entre la media de la variable dependiente (área) y la variable

independiente (concentración). El valor del coeficiente de determinación (R2) de 0.99968

indica que el 99.97 % de la variación en las áreas de los picos se debe a la concentración de

las muestras analizadas (Ross, 2010).

Figura D-5. Curva de calibración del sistema obtenida mediante HPLC, datos ajustados a un modelo de

regresión lineal simple.

Debido a que el modelo de regresión lineal simple es capaz de explicar la mayor parte de la

variación en los datos de respuesta y cumple con el criterio de aceptación R2 > 0.998, se

concluye que los datos (Tabla D-3) se ajustan adecuadamente al modelo. En adición, los

resultados de las pruebas de hipótesis estadística t de Student de dos colas para el intercepto

y la pendiente, con un intervalo de confianza del 95% (Tabla D-4) rechazan la hipótesis nula

(Ho) indicando que la pendiente es significativamente diferente de cero, es decir, existe una

relación positiva entre las dos variables que no puede ser atribuida al azar.

Respecto al intercepto (α), el tcal fue inferior al ttab, por consiguiente, se acepta la hipótesis

nula indicando que el intercepto, valor en el cual la línea de regresión cruza el eje y, no es

significativamente diferente de cero.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

Are

a (m

AU

)

Concentración (g/mL)

Ecuación y = 144.12x - 0.39

R 0.99984

R^2 0.99968

Valor Error estándar

Intercepto -0.39 2.45

Pendiente 144.12 0.31


Tabla D-3. Datos primarios para la evaluación de la linealidad del sistema en la validación de la metodología

analítica mediante HPLC.

Nivel Concentración (µg/mL) Áreas

1 0.05

8.30 8.72 7.00

8.94 8.33 7.23

10.65 8.48 7.59

2 0.08

17.38 14.78 13.12

17.75 13.96 13.19

17.95 14.21 13.30

3 0.1

16.47 15.77 17.41

16.41 15.92 19.04

16.29 16.28 18.46

4 0.5

77.57 62.31 68.62

76.25 64.01 68.03

76.36 63.31 68.39

5 1

138.16 145.08 139.89

138.08 145.52 139.50

138.16 145.31 139.54

6 3

407.54 425.38 419.87

408.23 424.71 419.72

408.11 425.07 419.33

7 10

1455.88 1464.96 1459.41

1447.76 1464.90 1458.56

1448.28 1465.14 1458.99

8 20

2918.91 2889.70 2823.84

2915.46 2889.15 2819.04

2916.59 2889.05 2818.73

Por su parte, el análisis de varianza (ANOVA) utiliza la varianza de los datos para

determinar si es posible aplicar el modelo de regresión lineal. Como se observa en la Tabla

D-5, el valor del F calculado (Fcal) fue mayor que el F tabulado (Ftab), por consiguiente, se

rechaza la hipótesis nula indicando que la variabilidad en el modelo de regresión lineal no

es significativa y se concluye que el sistema tiene un comportamiento lineal en el rango de

concentración estudiado.


Tabla D-4. Prueba t de Student para el intercepto y la pendiente empleada para la evaluación de la linealidad

del sistema en la validación de la metodología analítica mediante HPLC.

Coeficiente H0 Condición tcal ttab

Pendiente β = 0 tcal > ttab se rechaza la hipótesis nula. 469.23 1.99

Intercepto α = 0 tcal < ttab se acepta la hipótesis nula. -0.16 1.99

Se determinó la precisión evaluando la repetibilidad a tres niveles de concentración (0.05, 5

y 20 µg/mL), estudiados bajo las mismas condiciones de operación en un mismo día (Tabla

D-6)

Tabla D-5. ANOVA para la evaluación del modelo de regresión lineal empleado en la validación de la

metodología analítica mediante HPLC.

GL SC CM H0 Condición Fcal Ftab

Regresión 1 67201700 67201700

La variabilidad

del modelo de

regresión es

estadísticamente

significativa.

Fcal > Ftab

se rechaza

la

hipótesis

nula.

220175.12 3.98

Error 70 21365.34 305.22

Total 71 67223000

SC: suma de los cuadrados, CM: cuadrados medios, GL: grados de libertad.

La desviación estándar y el coeficiente de variación correspondiente a las diferentes

concentraciones indican el grado de dispersión de las tres mediciones respecto a su media,

lo que es un indicativo de precisión de una medida (’t Lam, 2010). Como se presenta en la

Tabla D-7, los porcentajes del coeficiente de variación (CV) para cada una de las

concentraciones investigadas estuvieron por debajo del criterio de aceptación del 2%, por lo

tanto, no se identifican variaciones atípicas en los resultados de las mediciones.

En adición, con el fin de determinar si las variaciones en las medidas con respecto a las

diferentes concentraciones son homogéneas (Tabla D-7), se realizó la prueba unilateral C de

Cochran con una probabilidad del 95%. El valor calculado G (Gcal) fue menor que el valor

crítico tabulado de Cochran (Gtab), por tal motivo se acepta la hipótesis nula indicando que

no hay diferencias significativas en las varianzas, en otras palabras, existe homogeneidad en


las variaciones. Lo anterior permite concluir que el método cumple con los criterios

establecidos de precisión.

Tabla D-6. Datos primarios para la evaluación de la repetibilidad de la metodología analítica mediante HPLC.

Nivel Concentración (µg/mL) Área

1 0.05

7.38

7.22

7.19

2 5

721.65

728.72

729.51

3 20

2806.42

2814.15

2817.60

La precisión intermedia se evaluó utilizando tres niveles de concentración (0.05, 5 y 20

µg/mL), con dos analistas bajo las mismas condiciones de operación, en tres días diferentes

(Tabla D-8). Se utilizó ANOVA para determinar si las variaciones respecto al analista, a los

días y a las réplicas, eran estadísticamente significativas (Tabla D-9).

Tabla D-7. Evaluación de la repetibilidad y prueba de hipótesis estadística C de Cochran empleados en la

validación de la metodología analítica mediante HPLC.

Concentración

(µg/mL) Promedio S CV H0 Condición Gcal Gtab

0.05 7.26 0.10 1.44 No hay

diferencias

significativas

en las varianzas

Gcal > Gtab se

rechaza la

hipótesis

nula

0.64 0.87 5 721.65 4.33 0.60

20 2812.72 5.72 0.20

El F calculado (Fcal) fue menor que el F tabulado (Ftab) en los análisis de las varianzas

respecto al cambio de analista, réplicas y días, por tal motivo no se rechaza la hipótesis nula

y se interpreta que las variabilidades en los resultados no son estadísticamente significativas.

Con el cumplimiento de los parámetros establecidos previamente para la repetibilidad y la

precisión intermedia se concluye que el método es preciso.


Tabla D-8. Datos primarios para la evaluación de la precisión intermedia de la metodología analítica mediante

HPLC.

Analista 1 Analista 2

Concentración (µg/mL) Concentración (µg/mL)

0.05 5 20 0.05 5 20

Área

Día 1

7.50 721.65 2826.42 7.48 758.71 2839.75

7.22 728.72 2814.15 7.12 771.62 2840.01

7.49 739.51 2817.60 7.09 749.52 2856.86

Día 2

7.71 720.42 2815.21 7.48 724.86 2834.27

7.45 720.99 2814.11 7.35 724.57 2830.49

7.78 721.80 2815.83 7.53 734.18 2833.43

Día 3

7.38 736.70 2831.47 7.73 741.39 2863.99

7.68 737.37 2859.12 7.51 731.82 2865.05

7.49 736.26 2858.51 7.45 741.45 2858.51

La exactitud de la metodología analítica fue evaluada utilizando la matriz de almidón de

bambú enriquecida con una solución estándar de ibuprofeno en tres niveles de concentración

(0.05, 5 y 20 µg/mL), sometidas al mismo tratamiento de degradación enzimática utilizado

para las muestras de los complejos (Sección 4.2.1.1), con el fin de evidenciar que dicho

proceso no tiene incidencia en las mediciones. Como se observa en la Tabla D-10, los

porcentajes de recuperación se encuentran dentro del rango establecido (90% – 110%), lo

que sugiere que el ibuprofeno fue estable durante los tratamientos a los que fue sometido y

que las desviaciones estándar relativas (CV) observadas pueden ser atribuidas a errores

sistemáticos y aleatorios.

Tabla D-9. ANOVA para la evaluación de la precisión intermedia de la metodología analítica mediante HPLC.

Origen de las

variaciones GL SC CM H0 Condición Fcal Ftab

Analistas 1 1490.24 1490.24 Las variabilidades

en los datos no son

estadísticamente

significativas.

Fcal > Ftab se

rechaza la

hipótesis

nula.

9.97E-04 4.04

Días 2 2098.00 1049.00 6.88E-04 3.19

Réplicas 2 64.49 32.25 2.12E-05 3.19

Error 48 7.77E+07 1.62E+06

Total 53 7.78E+07

Suma de los cuadrados (SC); Cuadrados medios (CM); Grados de libertad (GL).


El valor de t calculado fue inferior al t tabulado, por tal motivo se acepta la hipótesis nula

que establece que no existen diferencias significativas entre el porcentaje de recuperación

medio obtenido y el 100%. Debido a la concordancia entre el valor medido y el valor de

referencia, se concluye que la exactitud es apropiada.

Tabla D-10. Evaluación de la exactitud y prueba t de Student realizadas en la validación de la metodología

analítica mediante HPLC.

CT

(µg/mL) Áreas

CE

(µg/mL) %R H0 Condición tcal ttab

0.05

7.00 0.0513 102.52

No existen

diferencias

significativas

entre el

porcentaje de

recuperación

medio y el 100%

tcal > ttab se

rechaza la

hipótesis

nula

0.43 2.04

7.23 0.0529 105.74

7.19 0.0525 105.10

5

699.33 4.85 97.10

718.05 4.98 99.70

723.24 5.00 100.42

20

2823.84 19.60 97.98

2819.04 19.56 97.82

2818.73 19.56 97.80

Promedio 100.46

CV 3.26

Concentración teórica (CT); concentración experimental (CE); porcentaje de recuperación (%R);

coeficiente de variación (CV).

El límite de detección corresponde a la menor concentración de analito que puede detectarse,

pero no necesariamente cuantificarse. Por otro lado, el límite de cuantificación se refiere a

la menor concentración que puede determinarse con precisión y exactitud (The United States

Pharmacopeia, 2019). Teniendo en cuenta las bajas concentraciones utilizadas en la curva

de calibración, los límites de detección y de cuantificación fueron determinados a partir de

los datos obtenidos en el modelo de regresión lineal.

Tabla D-11. Límite de detección y límite de cuantificación obtenidos con datos de la curva de calibración

correspondiente a la metodología analítica mediante HPLC.

Error estándar

Intercepto -0.39 2.45

Pendiente 144.12

LD (µg/mL) 0.0057

LQ (µg/mL) 0.0197

E. Anexo: Datos de liberación en condiciones

simuladas del tracto gastrointestinal

Tabla E-1. Datos del porcentaje de liberación acumulado en condiciones gástricas simuladas pH 1.2.

Complejo Cantidad acumulada liberada de ibuprofeno (%)

15 min 30 min 60 min 90 min 180 min 360 min

AB-1%-ASA 1.62 ± 0.27 2.64 ± 0.19 3.98 ± 0.11 4.91 ± 0.29 5.87 ± 0.42 8.94 ± 1.99

AM-1%-ASA 1.80 ± 0.58 2.78 ± 0.10 4.93 ± 2.00 5.72 ± 1.27 7.55 ± 1.11 8.96 ± 0.79

AM-1%-ASA* 4.37 ± 2.13 6.69 ± 0.96 9.31 ± 0.70 13.18 ± 1.97 13.26 ± 0.89 14.70 ± 1.32

AB-1.5%-ASA 0.51 ± 0.12 1.61 ± 0.17 3.01 ± 0.21 3.27 ± 0.28 4.51 ± 0.21 5.96 ± 1.01

AM-1.5%-ASA 1.01 ± 0.03 1.58 ± 0.48 2.45 ± 0.89 2.85 ± 0.43 4.06 ± 0.54 5.24 ± 0.76

A-0.6%-ASA 1.32 ± 0.06 2.07 ± 1.25 3.64 ± 0.63 4.51 ± 0.47 6.60 ± 0.41 8.54 ± 0.15

AB-4%-CS 0.85 ± 0.54 2.14 ± 1.35 2.19 ± 0.75 2.87 ± 0.73 3.53 ± 0.29 5.55 ± 0.26

AB-4%-CSPG 0.55 ± 0.01 0.98 ± 0.23 1.51 ± 0.45 2.03 ± 0.60 2.87 ± 0.10 4.16 ± 0.55

AB-8%-CS 1.48 ± 0.43 2.41 ± 0.39 3.62 ± 0.48 4.45 ± 0.12 5.72 ± 0.25 6.96 ± 0.33

AM-8%-CS 0.95 ± 0.75 1.39 ± 0.55 2.19 ± 0.88 2.57 ± 0.46 3.56 ± 0.46 4.51 ± 0.32

AB-5%-RE 0.87 ± 0.94 1.94 ± 3.01 1.88 ± 0.51 2.67 ± 1.64 3.31 ± 0.64 4.44 ± 0.44

Tabla E-2. Datos del porcentaje de liberación acumulado en condiciones simuladas del intestino pH 6.8.



AB-1%-ASA 15.50 ± 1.45 27.49 ± 2.24 39.89 ± 3.36 45.20 ± 1.75 52.31 ± 1.42 54.81 ± 2.47

AM-1%-ASA 11.23 ± 4.99 25.99 ± 2.08 37.80 ± 1.80 45.20 ± 5.89 53.53 ± 0.44 56.16 ± 0.57

AM-1%-ASA* 19.69 ± 1.82 24.67 ± 0.71 41.56 ± 3.34 54.24 ± 1.90 69.02 ± 1.31 76.42 ± 3.03

AB-1.5%-ASA 10.12 ± 1.57 24.52 ± 2.06 34.21 ± 1.84 43.86 ± 1.62 47.95 ± 3.23 49.93 ± 2.54

AM-1.5%-ASA 7.27 ± 0.30 17.86 ± 1.03 28.43 ± 5.04 37.84 ± 2.38 52.10 ± 1.41 53.52 ± 0.73

A-0.6%-ASA 11.59 ± 2.47 17.87 ± 0.28 30.59 ± 1.52 42.29 ± 2.47 52.85 ± 0.38 53.68 ± 0.43

AB-4%-CS 6.45 ± 3.36 13.68 ± 0.25 29.72 ± 2.10 44.85 ± 1.96 52.71 ± 2.30 57.20 ± 1.86

AB-4%-CSPG 9.27 ± 2.58 22.14 ± 2.62 35.02 ± 0.24 40.10 ± 0.08 47.49 ± 0.08 54.60 ± 0.16

AB-8%-CS 4.52 ± 1.13 19.52 ± 0.77 36.72 ± 3.41 44.83 ± 2.24 52.99 ± 0.05 53.71 ± 6.72

AM-8%-CS 5.39 ± 2.21 13.46 ± 2.99 23.55 ± 1.47 33.86 ± 2.26 45.50 ± 2.66 54.14 ± 5.04

AB-5%-RE 12.54 ± 1.62 20.83 ± 0.64 38.38 ± 1.28 42.97 ± 0.34 48.68 ± 2.26 49.28 ± 4.48


Tabla E-3. Datos del porcentaje de liberación acumulado en condiciones simuladas del intestino pH 6.8 en

presencia de pancreatina.



AB-1%-ASA 27.64 ± 3.81 37.92 ± 0.89 61.77 ± 3.98 75.32 ± 2.82 86.59 ± 1.87 97.19 ± 0.64

AM-1%-ASA 28.17 ± 0.34 49.17 ± 0.38 59.54 ± 0.81 71.06 ± 0.76 82.23 ± 2.85 91.00 ± 5.59

AM-1%-ASA* 29.27 ± 1.78 50.76 ± 1.16 64.30 ± 1.57 80.00 ± 1.67 86.24 ± 0.73 95.34 ± 1.66

AB-1.5%-ASA 15.39 ± 1.45 29.86 ± 0.31 54.60 ± 1.16 64.33 ± 2.60 81.71 ± 0.94 86.75 ± 0.86

AM-1.5%-ASA 23.84 ± 2.01 40.15 ± 0.18 63.08 ± 0.15 75.35 ± 2.01 85.36 ± 1.92 89.39 ± 3.45

A-0.6%-ASA 17.25 ± 0.42 32.68 ± 0.20 51.90 ± 1.29 64.76 ± 6.56 83.53 ± 2.36 88.17 ± 3.91

AB-4%-CS 24.17 ± 1.67 38.05 ± 0.13 58.00 ± 1.51 70.22 ± 0.23 84.14 ± 4.33 90.93 ± 1.13

AB-4%-CSPG 27.99 ± 0.58 40.81 ± 2.51 63.41 ± 1.00 73.47 ± 3.08 87.30 ± 1.76 92.91 ± 0.59

AB-8%-CS 22.94 ± 3.08 38.20 ± 4.41 59.26 ± 3.54 69.89 ± 5.86 87.55 ± 6.52 90.69 ± 5.63

AM-8%-CS 21.29 ± 0.86 35.18 ± 2.72 53.15 ± 2.28 63.34 ± 1.58 76.63 ± 0.26 81.69 ± 4.08

AB-5%-RE 24.84 ± 0.64 48.66 ± 4.04 64.94 ± 3.62 70.92 ± 2.72 86.24 ± 5.22 93.77 ± 2.56

Tabla E-4. Datos del porcentaje de liberación acumulado en condiciones simuladas del intestino pH 7.2 en

presencia de pancreatina.



AB-1%-ASA 25.07 ± 5.28 44.98 ± 2.05 65.25 ± 6.00 77.00 ± 0.99 90.43 ± 0.01 91.40 ± 7.95

AM-1%-ASA 29.42 ± 1.87 43.96 ± 3.45 65.10 ± 2.63 75.57 ± 3.63 89.01 ± 1.73 91.03 ± 1.97

AM-1%-ASA* 28.89 ± 5.65 57.90 ± 3.56 61.86 ± 7.01 78.89 ± 3.19 94.74 ± 2.66 99.01 ± 1.82

AB-1.5%-ASA 15.02 ± 2.94 29.04 ± 4.01 49.56 ± 1.40 67.81 ± 1.85 82.72 ± 5.00 87.46 ± 4.38

AM-1.5%-ASA 22.63 ± 4.79 40.19 ± 5.05 62.03 ± 3.50 73.02 ± 2.46 85.33 ± 1.02 88.19 ± 2.07

A-0.6%-ASA 22.31 ± 2.47 40.80 ± 2.38 64.84 ± 4.81 74.07 ± 1.79 90.06 ± 4.03 92.77 ± 3.78

AB-4%-CS 22.10 ± 1.04 37.90 ± 3.48 58.80 ± 6.13 71.14 ± 8.16 87.12 ± 2.72 92.94 ± 7.46

AB-4%-CSPG 24.70 ± 4.94 39.53 ± 1.95 60.16 ± 0.92 71.18 ± 0.85 85.95 ± 1.52 91.50 ± 1.44

AB-8%-CS 23.82 ± 0.39 39.90 ± 3.92 59.78 ± 2.97 70.66 ± 3.20 85.87 ± 4.82 90.66 ± 7.99

AM-8%-CS 21.94 ± 4.29 40.39 ± 0.63 59.61 ± 4.83 70.38 ± 2.99 82.58 ± 2.40 83.84 ± 3.17

AB-5%-RE 22.67 ± 1.17 41.53 ± 3.35 61.81 ± 3.43 72.28 ± 6.83 82.19 ± 7.63 85.32 ± 9.77

E. Anexo: Validación de la metodología analítica por HPLC 115

Tabla E-5. Factor de similitud (f2) correspondiente a los perfiles de liberación obtenidos para los complejos

de inclusión molecular en condiciones gástricas simuladas pH 1.2.

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1 95 63 87 83 98 83 77 95 80 80

2 65 82 79 94 78 73 90 76 76

3 58 57 62 57 55 61 56 56

4 98 88 97 90 93 95 94

5 85 99 94 90 99 98

6 84 78 96 81 81

7 94 89 98 98

8 82 98 97

9 86 86

10 99

AB-1%-ASA (1); AM-1%-ASA (2); AM-1%-ASA* (3); AB-1.5%-ASA (4); AM-

1.5%-ASA (5); A-0.6%-ASA (6); AB-4%-CS (7); AB-4%-CSPG (8); AB-8%-CS (9);

AM-8%-CS (10); AB-5%-RE (11).


de inclusión molecular en condiciones simuladas del intestino pH 6.8.

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1 82 48 69 57 63 56 67 63 49 70

2 48 72 62 67 61 71 71 52 70

3 42 42 45 44 43 45 38 43

4 66 70 62 79 70 56 80

5 79 72 71 68 70 64

6 75 73 71 62 70

7 65 70 62 61

8 72 60 75

9 56 69

10 55



AM-8%-CS (10); AB-5%-RE (11).



de inclusión molecular en condiciones simuladas del intestino pH 6.8 en presencia de pancreatina.

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1 65 63 55 83 57 76 86 76 55 65

2 67 51 67 54 66 69 64 54 74

3 45 63 47 57 66 57 46 69

4 56 84 63 53 62 69 51

5 58 75 80 76 56 69

6 66 55 65 69 52

7 73 88 62 65

8 74 53 72

9 59 66

10 51



AM-8%-CS (10); AB-5%-RE (11).


de inclusión molecular en condiciones simuladas del intestino pH 7.2 en presencia de pancreatina.

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1 65 71 50 75 52 64 77 67 49 73

2 67 51 67 54 66 69 64 54 74

3 45 63 47 57 66 57 46 69

4 56 84 63 53 62 69 51

5 58 75 80 76 56 69

6 66 55 65 69 52

7 73 88 62 65

8 74 53 72

9 59 66

10 51



AM-8%-CS (10); AB-5%-RE (11).

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