Anexo 3 Etg-007 Procedimiento General Faena Pozos de Extracción de Aguas Subterraneas
Desarrollo de un procedimiento técnico para la extracción ...
1
CSIC Desarrollo de un procedimiento técnico para la extracción y cuantificación de ADN microbiano de bilis Natalia Molinero 1 , Ana Belén Campelo 1 , Carmen García Bernardo 2 , José Ignacio Rodríguez 3 , Abelardo Margolles 1 , Susana Delgado 1 1 Instituto de Productos Lácteos de Asturias (IPLA-CSIC), Departamento de Microbiología y Bioquímica de Productos Lácteos, Villaviciosa-Asturias, 2 Hospital Universitario Central de Asturias (HUCA), Oviedo-Asturias 3 Hospital de Cabueñes, Gijón-Asturias. Acknowledgements This work was financed by the Spanish “Plan Nacional I+D+i” through the project AGL2013-44761-P 1. Introducción La bilis es un fluido biológico sintetizado en el hígado, que se almacena y se concentra en la vesícula biliar, y que se libera en el duodeno después de la ingesta de alimentos. Mientras que la microbiota del estómago e intestino han sido caracterizadas con detalle, las microbiotas endógenas de la bilis y el tracto biliar apenas han sido estudiadas, fundamentalmente debido a las dificultades para acceder al material biológico y a la falta de técnicas moleculares adecuadas. De hecho, a pesar de los avances que las técnicas de secuenciación masiva han supuesto para la descripción del microbioma de muestras humanas complejas, existen aún claras limitaciones en fluidos, como la sangre o la bilis, con una carga microbiana reducida. En este trabajo se ha optimizado un protocolo de extracción y purificación de ADN total de bilis, y se ha desarrollado un método de discriminación y cuantificación de ADN bacteriano basado en PCR cuantitativa (qPCR) utilizando como modelo muestras de bilis de cerdo. Posteriormente, esta metodología se ha aplicado a muestras de bilis humana, tanto de pacientes con alguna patología (colelitiasis) como de sujetos sanos. 2. Objetivo 3. Metodología 5. Conclusiones Bilis cerdo Bilis humana b) Rotura mecánica RNasa Proteinasa K Baño 37ºC Tratamiento con Glass-beads Fast-prep Muestra Equivalentes genómicos/mL M1 2,67E+07 M2 No determinado M3 1,14E+05 M4 3,63E+05 M5 1,96E+06 M6 3,15E+07 En la bilis de cerdo encontramos del orden de 10 5 equivalentes genómicos/ml en la cuantificación de ADN bacteriano, mientras que el análisis del ADN eucariota dio como resultado 10 8 equivalentes genómicos/ml. La suplementación de la bilis de cerdo con suspensiones bacterianas de concentración inferior a la que se encuentra de forma natural presente en la bilis de cerdo (<10 5 bacterias/ml) no produce incrementos significativos en la cuantificación por qPCR del ADN extraído. En el presente trabajo hemos desarrollado un procedimiento para extraer y cuantificar ADN bacteriano de muestras de bilis, el cual se ha mostrado eficaz para concentraciones superiores a 10 3 células procariotas/ml. Nuestros resultados han corroborado la existencia de bacterias en la bilis de cerdo (10 5 bacterias/ml), tal y como se había descrito previamente. Hemos encontrado presencia de ADN bacteriano en muestras de bilis humanas, siendo su concentración mas baja que en la bilis de cerdo y muy cercana al límite de detección/cuantificación del procedimiento. Según esta metodología la bilis estaría mas enriquecida (varios órdenes de magnitud) en ADN eucariota, lo que puede dificultar el acceso al análisis de su microbioma. El análisis por qPCR del ADN eucariota en las distintas muestras de bilis humanas dio como resultado en torno a 10 6 equivalentes genómicos/ml. 1,66E+05 4,70E+06 1,21E+06 2,48E+05 7,93E+04 7,83E+04 8,66E+04 1,00E+00 1,00E+01 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 1,00E+07 Equivalentes genómicos/ml Muestra Bilis cerdo + L. lactis NZ9000 Bilis cerdo Figura 2. Cuantificación por qPCR del ADNr 16S de una muestra de bilis de cerdo y la misma enriquecida con distintas concentraciones de L. lactis NZ9000 (10 8 -10 3 ufc/ml). En las muestras de bilis humana encontramos una concentración bacteriana inferior que en la bilis de cerdo, del orden de 10 2 equivalentes genómicos/ml (límite de detección de la técnica establecido). Tabla 1. Cuantificación por qPCR del ADNr 18S de distintas muestras de bilis humana (M1-M6). Al igual que lo observado anteriormente, el método de extracción y cuantificación propuesto se mostró adecuado para una carga microbiana de entre 10 6 y 10 3 bacterias/ml, concentración mas alta que la que parecen estar presentes de forma habitual en la bilis humana. Email: [email protected] c) Fenolización Moles, L., M. Gómez, H. Heilig, G. Bustos, S. Fuentes, W. de Vos, et al. 2013. Bacterial diversity in meconium of preterm neonates and evolution of their fecal microbiota during the first month of life. PLoS One 8:e66986. Para la discriminación y cuantificación de ADN bacteriano las muestras de ADN extraído se analizaron por qPCR utilizando cebadores generales para el gen del ARNr 16S (ADN procariota) y el gen del ARNr 18S (ADN eucariota). Para la cuantificación se crearon rectas patrón a partir de ADN de la cepa Lactococcus lactis NZ9000 y de la línea celular HT-29 (10 9 células/ml). Con el fin de determinar la eficiencia del método, a partir de un cultivo líquido de la cepa de L. lactis de concentración 10 9 ufc/ml se realizaron diluciones decimales de base 10 y se extrajo el ADN que se analizó por qPCR. Además, se enriqueció la bilis con estas suspensiones de concentración bacteriana en rango de 10 8 -10 3 ufc/ml para testar el efecto matriz. 4. Resultados Para la optimización del protocolo de extracción de ADN se utilizaron muestras de 1ml de bilis de cerdo. El método se basó en el previamente descrito por Moles y cols. (2013) e incluye dos pasos de lisis y una extracción fenólica. a) Rotura enzimática Detergente (SDS) Lisis enzimática (lisozima, lisostafina y mutanolisina) Baño 37ºC qPCR Lactococcus lactis NZ9000 (10 9 ufc/ml) Línea celular HT-29 (10 9 células/ml) y = -3,3763x + 45,44 R² = 0,9993 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Ct log concentración DNA Recta patrón ADNr 18S y = -3,5071x + 36,855 R² = 0,9996 0 5 10 15 20 25 30 35 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ct log concentración DNA Recta patrón ADNr 16S Enriquecimiento bilis El método de extracción de ADN funciona bien en bacterias Gram+, siendo más eficiente en concentraciones entre 10 6 -10 3 ufc/ml, con una diferencia aproximada de 3 Cts entre las diluciones. Suspensiones bacterianas L. lactis NZ9000 Figura 1. Resultado de la qPCR para distintas concentraciones (ufc/ml) de L. lactis NZ9000. Rn Ciclo 10 6 10 3 10 2 10 5 10 7 10 4 Cultivo L. lactis 10 9 ufc/ml Dilución 1/10 10 8 ufc/ml 10 7 ufc/ml 10 6 ufc/ml 10 5 ufc/ml 10 4 ufc/ml 10 3 ufc/ml 10 9 ufc/ml 10 2 ufc/ml 10 1 ufc/ml Extracción ADN y análisis por qPCR 1,96E+01 1,41E+01 1,07E+02 1,31E+02 1,39E+02 7,83E+01 6,13E+05 3,06E+04 1,59E+03 1,26E+02 1,00E+00 1,00E+01 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 Equivalentes genómicos/ml Muestra Figura 3. Cuantificación por qPCR del ADNr 16S de distintas muestras de bilis humana (M1-M6), así como de una de ellas enriquecida con distintas concentraciones de L. lactis NZ9000 (10 6 -10 3 ufc/ml). Bilis humana + L. lactis NZ9000 Bilis humana Límite de detección
Transcript of Desarrollo de un procedimiento técnico para la extracción ...
CSIC
Desarrollo de un procedimiento técnico para la extracción y cuantificación deADN microbiano de bilis
Natalia Molinero1, Ana Belén Campelo1, Carmen García Bernardo2, José Ignacio Rodríguez3, Abelardo Margolles1, Susana Delgado1
1 Instituto de Productos Lácteos de Asturias (IPLA-CSIC), Departamento de Microbiología y Bioquímica de Productos Lácteos, Villaviciosa-Asturias, 2 Hospital Universitario Central de Asturias (HUCA), Oviedo-Asturias
3 Hospital de Cabueñes, Gijón-Asturias.
Acknowledgements This work was financed by the Spanish “Plan Nacional I+D+i”
through the project AGL2013-44761-P
1. Introducción
La bilis es un fluido biológico sintetizado en el hígado, que se almacena y se concentra en la vesícula biliar, y que se libera en el duodeno después de la ingesta de
alimentos. Mientras que la microbiota del estómago e intestino han sido caracterizadas con detalle, las microbiotas endógenas de la bilis y el tracto biliar apenas han
sido estudiadas, fundamentalmente debido a las dificultades para acceder al material biológico y a la falta de técnicas moleculares adecuadas. De hecho, a pesar de los
avances que las técnicas de secuenciación masiva han supuesto para la descripción del microbioma de muestras humanas complejas, existen aún claras limitaciones
en fluidos, como la sangre o la bilis, con una carga microbiana reducida.
En este trabajo se ha optimizado un protocolo de extracción y
purificación de ADN total de bilis, y se ha desarrollado un método de
discriminación y cuantificación de ADN bacteriano basado en PCR
cuantitativa (qPCR) utilizando como modelo muestras de bilis de
cerdo. Posteriormente, esta metodología se ha aplicado a muestras de
bilis humana, tanto de pacientes con alguna patología (colelitiasis)
como de sujetos sanos.
2. Objetivo
3. Metodología
5. Conclusiones
Bilis cerdo
Bilis humana
b) Rotura mecánica
RNasa Proteinasa K
Baño 37ºCTratamiento con
Glass-beads
Fast-prep
MuestraEquivalentes
genómicos/mL
M1 2,67E+07
M2 No determinado
M3 1,14E+05
M4 3,63E+05
M5 1,96E+06
M6 3,15E+07
En la bilis de cerdo encontramos del orden de 105 equivalentes genómicos/ml en la
cuantificación de ADN bacteriano, mientras que el análisis del ADN eucariota dio como
resultado 108 equivalentes genómicos/ml.
La suplementación de la bilis de cerdo
con suspensiones bacterianas de
concentración inferior a la que se
encuentra de forma natural presente
en la bilis de cerdo (<105 bacterias/ml)
no produce incrementos significativos
en la cuantificación por qPCR del ADN
extraído.
En el presente trabajo hemos desarrollado un procedimiento para extraer y cuantificar
ADN bacteriano de muestras de bilis, el cual se ha mostrado eficaz para
concentraciones superiores a 103 células procariotas/ml. Nuestros resultados han
corroborado la existencia de bacterias en la bilis de cerdo (105 bacterias/ml), tal y como
se había descrito previamente.
Hemos encontrado presencia de ADN bacteriano en muestras de bilis humanas, siendo
su concentración mas baja que en la bilis de cerdo y muy cercana al límite de
detección/cuantificación del procedimiento. Según esta metodología la bilis estaría mas
enriquecida (varios órdenes de magnitud) en ADN eucariota, lo que puede dificultar el
acceso al análisis de su microbioma.
El análisis por qPCR del ADN eucariota en las distintas
muestras de bilis humanas dio como resultado en torno
a 106 equivalentes genómicos/ml.
1,66E+05
4,70E+06
1,21E+06
2,48E+057,93E+04 7,83E+04 8,66E+04
1,00E+00
1,00E+01
1,00E+02
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
Equ
ival
en
tes
gen
óm
ico
s/m
l
Muestra
Bilis cerdo + L. lactis NZ9000
Bilis
cerdo
Figura 2. Cuantificación por qPCR del ADNr 16S de una muestra de bilis de
cerdo y la misma enriquecida con distintas concentraciones de L. lactis NZ9000
(108-103 ufc/ml).
En las muestras de bilis humana encontramos una concentración bacteriana inferior
que en la bilis de cerdo, del orden de 102 equivalentes genómicos/ml (límite de
detección de la técnica establecido).
Tabla 1. Cuantificación por qPCR del ADNr 18S de
distintas muestras de bilis humana (M1-M6).
Al igual que lo observado
anteriormente, el método de
extracción y cuantificación
propuesto se mostró
adecuado para una carga
microbiana de entre 106 y 103
bacterias/ml, concentración
mas alta que la que parecen
estar presentes de forma
habitual en la bilis humana.
Email: [email protected]
c) Fenolización
Moles, L., M. Gómez, H. Heilig, G. Bustos, S. Fuentes, W. de Vos, et al. 2013. Bacterial diversity in meconium of preterm neonates and evolution of their fecal
microbiota during the first month of life. PLoS One 8:e66986.
Para la discriminación y cuantificación de ADN bacteriano las
muestras de ADN extraído se analizaron por qPCR utilizando
cebadores generales para el gen del ARNr 16S (ADN procariota) y el
gen del ARNr 18S (ADN eucariota). Para la cuantificación se crearon
rectas patrón a partir de ADN de la cepa Lactococcus lactis NZ9000 y
de la línea celular HT-29 (109 células/ml).
Con el fin de determinar la eficiencia del método, a partir de un cultivo
líquido de la cepa de L. lactis de concentración 109 ufc/ml se realizaron
diluciones decimales de base 10 y se extrajo el ADN que se analizó
por qPCR. Además, se enriqueció la bilis con estas suspensiones de
concentración bacteriana en rango de 108-103 ufc/ml para testar el
efecto matriz.
4. Resultados
Para la optimización del protocolo de extracción de ADN se utilizaron
muestras de 1ml de bilis de cerdo. El método se basó en el
previamente descrito por Moles y cols. (2013) e incluye dos pasos de
lisis y una extracción fenólica.
a) Rotura enzimática Detergente
(SDS)
Lisis enzimática
(lisozima, lisostafina y
mutanolisina)
Baño 37ºC
qPCR
Lactococcus lactis NZ9000
(109 ufc/ml)
Línea celular HT-29
(109 células/ml)
y = -3,3763x + 45,44R² = 0,9993
05
10152025303540
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Ct
log concentración DNA
Recta patrón ADNr 18S
y = -3,5071x + 36,855R² = 0,9996
0
5
10
15
20
25
30
35
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Ct
log concentración DNA
Recta patrón ADNr 16S
Enriquecimiento
bilis
El método de extracción de
ADN funciona bien en
bacterias Gram+, siendo más
eficiente en concentraciones
entre 106-103 ufc/ml, con una
diferencia aproximada de 3
Cts entre las diluciones.
Suspensiones bacterianas L. lactis NZ9000
Figura 1. Resultado de la qPCR para distintas concentraciones (ufc/ml) de L. lactis NZ9000.
Rn
Ciclo
106 103 102105107 104
Cultivo L. lactis
109 ufc/ml
Dilución
1/10
108 ufc/ml 107 ufc/ml 106 ufc/ml 105 ufc/ml 104 ufc/ml 103 ufc/ml109 ufc/ml 102 ufc/ml 101 ufc/ml
Extracción ADN y
análisis por qPCR
1,96E+011,41E+01
1,07E+02 1,31E+02 1,39E+02 7,83E+01
6,13E+05
3,06E+04
1,59E+03
1,26E+02
1,00E+00
1,00E+01
1,00E+02
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
Equ
ival
en
tes
gen
óm
ico
s/m
l
Muestra
Figura 3. Cuantificación por qPCR del ADNr 16S de distintas muestras de bilis humana
(M1-M6), así como de una de ellas enriquecida con distintas concentraciones de L. lactis
NZ9000 (106-103 ufc/ml).
Bilis humana + L. lactis NZ9000
Bilis humana
Límite de
detección
