1

CENTRO DE INVESTIGACION DE MATERIALES AVANZADOS, S.C.

DIVISION DE ESTUDIOS DE POSGRADO

DESARROLLO Y CARACTERIZACIÓN DE

NANOCOMPUESTO PVA/HAP POR ELECTROHILADO Y

SU RESPUESTA BIOLÓGICA

T E S I S

PARA OBTENER EL GRADO DE

DOCTOR EN CIENCIA EN MATERIALES

PRESENTA

ROSALIA RUIZ SANTOS

DIRECTOR DE TESIS

Dr. JOSÉ GUADALUPE CHACÓN

CHIHUAHUA, CHIH. 14 DE DICIEMBRE 2016

2

Índice de Figuras Figura 1 Estructura Cristalina de la Hidroxiapatita Pag. 14

Figura 2. Imagen Tem de nanofibras porosas Li, L., & Hsieh, Y. L. (2006). [40] Pag 23

Figura3 Imagen Esem de nanofibras planas Lyons, J., Li, C., & Ko, F. (2004). [41]. Pag 23

Figura 4. Imagen Sem de nanofibras huecas (a, b) Bazilevsky, A.V et al. (2007) [42], (c,d)

Li, D., McCann, J. T., & Xia, Y. (2005). [43]. Pag 24

Figura 5. Imagen Sem de nanofibras ramificadas Choi, S.S., et al. 2004 [44]. Pag 25

Figura 6. Imagen Sem de nanofibras helicoidales Weng, S.,et al. (2010) [45]. Pag 26

Figura 7. Estructura Quimica del Polivinyl Alcohol Pag 31

Figura 8 Influencia del peso molecular en las propiedades del PVA. Pag 33

Figura 9. Influencia del peso molecular en las propiedades del PVA. Pag 33

Figura 10. Método de obtención HAp estado sólido Pag 40

Figura 11 Síntesis de HAp por mecoquimica Pag 41

Figura 12 Esquema de la Molienda de Alta Energia. Pag 41

Figura 13.Obtencion de Hidroxipatita método de precipitación convencional. Pag 43

Figura 14. Obtención de Hidroxipatitia método Hidrotérmico Pag 45

Figura 15.Efecto de las condiciones hidrotermales sobre la morfología de HAp Pag 45

Figura 16. Obtención de Hidroxiapatita por el método de Combustión. Pag 46

Figura 17. Método de Pirolisis para la obtención de Hidroxiapatita Pag 47

Figura 18. Método de obtención de síntesis basados en fuentes biogenicas. Pag 48

Figura 19. Anatomía del hueso cortical y esponjoso . Pag 50

3

Figura 20.Representación esquemática de los componentes del hueso desde escala

nanoscópica hasta macroscópica. . Pag 52

Figura 21. Fases del remodelado óseo en la superficie del hueso trabecular. Origen y

localización de las células óseas. . Pag 56

Figura 22.Digrama de flujo para la preparacion de los polvos de Hidroxipatita a partir de

femur de puerco Pag 61

Figura 23 Imágenes de la materia prima de hueso a hidroxiapatita Pag 62

Figura 24. Molino Alta Energía Spex modelo M8000. Pag 63

Figura 25. Diagrama de flujo para el proceso de alta energía de la materia prima HAp a

partir de hueso de puerco Pag 63

Figura 26. Diagrama de proceso para la preparación de soluciones de PVA y HAp Pag 65

Figura 27.Solución del Compostito PVA/HAp. Pag 67

Figura 28. Fotografías del equipo de electrohiladura Nonobond Standar Untit NEU-01

China a) Vista del panel de Control, b) Substrato Colector, c) Sistema de alimentación de

sustancias poliméricas, d) Otra perspectiva del sustrato colector. Pag 68

Figura 29. Velos de nanofibras composito de PVA/HAp Pag 68

Figura 30 Diagrama de Proceso para elaboración de fibras de PVA/HAp. Pag 69

Figura 31. Protocolo anestésico Pag 70

Figura 32. Protocolo de cuidados posoperatorios Pag 72

Figura 33. Protocolo quirúrgico, a) Extracción, b) Inducción fractura c) Colocación del

composito de fibras de PVA con HAp. Pag 72

Figura 34. Método de Extracción de Muestra a) fémur control y b) fémur con fibras PVA y

HAp. Pag 75

4

Figura 35. Ensayo in vitro Pag 74

Figura 36. Resumen Esquemático de las pruebas de respuesta biológica al material

composito de fibras PVA-HAp Pag 76

Figura 37 Micrografias SEM con Hueso de Puerco sin tratamiento térmico Pag 78

Figura 38 Micrografias SEM de Hueso de puerco con tratamiento térmico Pag 79

Figura 39 EDS de muestras de hueso de puerco después de tratamiento térmico Pag 80

Figura 40.DRX Hueso de puerco e Hidroxipatita. Pag 81

Figura 41.Tamaño de Partícula polvo de Hidroxipatita Pag 82

Figura 42. DRX Polvos de hidroxipatita realizados después de la molienda de alta energía

Pag 83

Figura 42. DRX Polvos de hidroxipatita realizados después de la molienda de alta energía

Pag 83.

Figura 43. Viscosidad de PVA en función de la concentración Pag 85

Figura 44 DRX Composito de nanofibras Pag.87

Figura 45 Termograma de las nanofibras composito HAp/PVA Pag 88

Figura 46 Micrografias SEM de nanofibras al 10% de PVA Pag 89

Figura 47 Micrografias SEM con 15% de PVA Pag 90

Figura 48 Micrografias SEM compostio HAp/PVA con 10% en peso. a) y b) imágenes a

10,000 aumentos, c) y d) imágenes a 15,000 aumentos Pag 91

Figura 49 Micrografias SEM compostio HAp/PVA con 10% en peso. a) imagen a 27,000

aumentos , b) y c) imágenes a 30000 aumentos Pag 92

Figura 50 Mapeo de composito de HAp/PVA Pag.93

Figura 51. Imagen de composito HAp/PVA al 10% en peso y perfil de rugosidades. La

línea indica el perfil seleccionado. Pag 94

5

Figura 52. Imagen de composito HAp/PVA al 15% en peso y perfil de rugosidades. La

línea indica el perfil seleccionado Pag 95

Figura 53. a) Imagen SEM fibras composito PVA-HAp 15%, b) Histograma de frecuencias

diámetros de fibra Pag 96

Figura 54. a) Imagen SEM fibras PVA, b) Histograma de frecuencias diámetros de fibra

Figura 55. Imagen SEM Prueba in vivo 7 días, a) control,b) hueso con compositos de

nanofibras PVA-HAp Pag 97

Figura 56 Imagen SEM pruebas in vitro 21 días, a) Control, b) hueso de rata. Pag 98

Figura 57 Imagen SEM por electrones retrodispersados de las pruebas in vitro 21 días, a)

Control, b) hueso de rata. Pag 98

Figura 58 Imagen SEM pruebas in vitro 21 días. Pag 99

Figura 59 Evaluación Clínica de ratas wistar, después de la colocación del nanocomposito.

Figura 60. Imágenes de la extracción del fémur de la rata wistar después de 7 días, a)

Fémur con composito recuadro negro área de incisión y colocación del implante, b)

acercamiento a la región de acción del composito de fibras. Pag 100

Figura 61. Imágenes SEM, a) Control hueso de rata tibia a 7 días prueba in vivo, b) Hueso

de rata tibia con fibras PVA-HAp 15% Pag

101

Figura 62. Imágenes SEM, a) Control hueso de rata fémur a 7 días prueba in vivo, b)

Hueso de rata fémur con fibras PVA-HAp 15%

Pag 101

Figura 63. Imágenes SEM, a) Fibras de PVA-HAp 15%, b) acercamiento 6500000

aumentos de la misma zona. Pag 102

6

Figura 64. Imágenes SEM, a) Control hueso de rata, b) Hueso de rata con fibras de PVA-

HAp Pag

103

Figura 65. Imágenes SEM, a 1500000 aumentos hueso de rata con fibras PVA-HAp 15%

Pag 103

Figura 66. Mecanismo propuesto de regeneración en el hueso de rata cepa wistar. Pag 105

7

Índice de Tablas Tabla 1 Condiciones de operación del equipo de Electrohiladura. Pag 68

Tabla 2. Reactivos con sus respectivas cantidades y pureza para la preparación de SBF [22].

Tabla 3Relación Ca/P en polvo de hidroxipatia. Pag 81

Tabla 4 Parámetros de temperatura y humedad de la solución precursora de electrohilado.

Tabla 5 Parámetros de operación del equipo de electrohilado para solucione con 10% PVA

y 15% de PVA pag 86

8

Acrónimo Significado

AFM Microscopia Fuerza Atómica

DRX Difracción de Rayos X

EDS Espectroscopia de energía dispersiva de rayos X

HAp Hidroxiapatita

KV KiloVolts

PVA Poli vinil Alcohol

SBF Fluido Fisiológico Simulado

SEI Electrones secundarios

SEM Microscopia Electrónica de Barrido

TGA Análisis termogravimétrico

WD Distancia de trabajo

g gramos

mA microAmperes

mg miligramos

ml mililitros.

9

10

1. INTRODUCCION

1.1 Biomaterial

Biomaterial se define como ―cualquier sustancia o combinación de sustancias distinta a los

fármacos, que en su origen ya sean sintéticos o naturales pueden ser utilizados en cualquier

tejido, órgano o función del cuerpo, con el fin de mantener o mejorar la calidad de vida del

individuo‖ [1]. Se han encontrado evidencia que las civilizaciones antiguas como la egipcia

utilizaban ojos, orejas y dientes artificiales [2]. Indios y chinos utilizaban ceras, gomas y

tejidos en la reconstrucción de piezas faltantes o defectuosas del cuerpo a través de los

siglos, los avances en materiales sintéticos, las técnicas quirúrgicas y métodos de

esterilización han permitido el uso de biomateriales en muchos sentidos [3].

Actualmente la práctica médica utiliza los biomateriales en un gran número de implantes

(ligamentos, injertos vasculares, válvulas cardíacas, lentes intraoculares, implantes

dentales, etc) y en dispositivos médicos (marcapasos, biosensores, corazones artificiales,

etc) los cuales son utilizados para reemplazar y/o restaurar la función de un tejido u órganos

degenerado y por lo tanto mejorar la calidad de vida de los pacientes.

En los primeros días se utilizaron todo tipo de materiales naturales como de madera,

pegamento, goma, así como metales tales como el hierro, oro zinc y el vidrio. Los

materiales biológicos, tales como la placenta fueron utilizados desde la década de 1900. El

celuloide fue el primer plástico artificial utilizado en defectos craneales y el polimetacrilato

de metilo fue aceptado como material médico a partir de la Segunda Guerra Mundial.

Sin embargo se observó lo siguiente: bajo ciertas condiciones algunos materiales fueron

tolerados por el cuerpo mientras que otros fueron rechazados en otras condiciones. Por lo

tanto durante los últimos 30 años se han logrado avances considerables para entender las

11

interacciones entre los tejidos y los materiales. Generando así el concepto de

biocompatibilidad.

En 1999 Willams [1] definió la biocompatibilidad como ―capacidad de un material para

llevar a cabo una respuesta apropiada donde el huésped es sometido a una situación

específica‖. Aunque esta definición parece vaga, representa un gran salto para lo que

anteriormente se creía. La opinión que precedía a esta definición era que los materiales

―exitosos‖ jugaron en gran medida papeles inertes en el cuerpo.

Una larga lista de propiedades habían evolucionados para los biomateriales ―exitosos‖, los

cuales se definen a partir de una serie de observaciones médicas, ya que el material no debe

inducir su separación, reacción inflamatoria o de cuerpo extraño, no debe provocar

respuestas del sistema inmunológico, no debe ser bioabsorbible al extremo de su

destrucción en el medio biológico siendo eliminado naturalmente, ni debe alterar

genéticamente las células adyacentes [4].

Teniendo en cuenta que el cuerpo humano trabaja en ambientes biológicos complejos, la

idea de colocar un material extraño sin ningún tipo de respuesta parece ingenua.

Basado en la reacción del tejido, los biomateriales se pueden clasificas en tres categorías

distintas [5]:

Biotolerantes: El organismo no produce respuesta inflamatorio al implante aunque

interacciona en este encapsulándolo mediante una capa de tejido fibroso conjuntivo.

Como ejemplo de esto podemos citar el Polimetilmetacrilato PMMA (cemento óseo), acero

inoxidable utilizado en placas y otros materiales de osteosíntesis y las aleaciones de

Cromo-Cobalto.

Bioinertes: Estos biomateriales no causan ninguna respuesta de su huésped y esto se debe

generalmente a que no producen ningún tipo de reacción química entre ambos; esto es

porque la mayoría de estos materiales son metales con su superficie recubierta de una capa

de óxido estable. Como resultado de esto las células pueden estar en contacto directo con el

material pero sin formar ningún tipo de unión entre ambos, a su vez no se produce

12

inhibición de la osteogenesis. Ejemplo de estos pueden ser la Alúmina, Zirconio y el

Titanio.

Bioactivos: Son biomateriales de más reciente desarrollo. Tienen la capacidad de reaccionar

con el tejido adyacente y formar enlaces químicos directos con el mismo. Normalmente las

células crecen directamente junto al biomaterial y en algunos casos van formando tejido

especializado dentro del mismo. Ejemplo: Cerámicas de Fosfato de Calcio, Cerámicas de

óxido de Silicio o Biovidrios.

La otra clasificación de biomateriales la podemos según su composición química, y los

dividiremos en:

Metales

Polímeros

Cerámicas

Compositos

1.1.1 Bioceramicas

Los materiales cerámicos son usados industrialmente en una sorprendente gama de

aplicaciones. El procesamiento de cerámicas involucra usualmente polvos, y para impedir

la introducción de defectos durante el procesamiento de este se deben de tomar rigurosos

cuidado. En años recientes ha existido un creciente interés en los principios que gobiernan

la composición, arquitectura y métodos de ensamblaje de una gran variedad de cerámicas

biológicas tales como la que se encuentra en huesos y dientes [6].

Podemos decir que las cerámicas utilizadas en medicina son materiales biocompatibles.

Presentan propiedades la de ser mas rígidos y resistentes que el acero cuando se someten a

fuerzas de compresión, soportan más calor y corrosión que los metales o los polímeros,

tienen una densidad menor que la mayoría de los metales y sus aleaciones; y sus materias

primas son abundantes y baratas.

13

Por el contrario debemos decir que son materiales muy quebradizos, es decir que no tienen

deformación plástica y que tienen una escasa resistencia a las fuerzas de tracción, flexión o

cizallamiento.

Las biocerámicas se clasifican:

Según su estructura

Sólidos Cristalinos

Policristalinos por chorro de plasmas

Sólidos Amorfos

Composición química

Óxidos cerámicos

Biovidrios

Fosfatos de calcio

Actividad Biologica [7]

Bioinertes (alúmina, zirconia)

Bioactivos (hidroxiapatita, biovidrio, biovitrocerámicas)

Reabsorvibles (fosfato de calcio)

1.1.2 Hidroxiapatita

Entre las diferentes clases de biocerámicas, la hidroxiapatita (Hap) es ampliamente

utilizada en diversas aplicaciones biomédica, principalmente en ortopedia y odontología

[8]. Posee un excepcional biocompatibilidad y una bioactividad única [9,10].

El término ―apatita‖ se aplica a un grupo de compuestos (no solo fosfatos cálcicos) con una

formula general M10(XO4)6Z2, donde M2+

es un metal y la especies XO4-3

y Z- son aniones.

El nombre particular de cada apatito depende de los elementos o radicales M, X y Z. En

estos términos, la Hap tiene la estructura molecular de la apatita donde M es el calcio

(Ca2+

), X es el fósforo (P5+

) y Z es el radica hidroxilo (OH-). Esto se conoce como

hidroxiapatita estequiometria y su relación atómica Ca/P es 1.67. Su fórmula química es

Ca10(PO4)6(OH)2, con el 39% en peso de Ca, 18.5% en P y 3.38% de OH.

14

La hidroxiapatita cristaliza en un sistema hexagonal, aunque con alguna excepción en un

sistema monoclínico [11,12]. El sistema pertenece al grupo espacial P63 hexagonal/m,

simetría de rotación hexagonal y un plano de reflexión m, y con parámetros a=b= 9.418 Å y

c=6.88 Å. La figura 1 muestra la celda unitaria de la hidroxipatita.

El esqueleto de la celda unitaria de la HAp, lo constituye el arreglo tetraédrico de los

fosfatos (PO4-3

). Dos de los oxígenos están alineados con el eje c

Figura 1. Estructura cristalina de la Hidroxiapatita [12].

Aunque se utilice la hidroxipatita estequimetrica como modelo, hay que destacar que las

hidroxipatitas producidas biológicamente tiene una estequiometria más complicada, con

una relación Ca/P menor a 1.67. La relación estequiometria varía de acuerdo al tipo

específico de tejido, que se relaciona con las propiedades y la bioactividad de la HAp.

Si la relación estequimetrica de Ca/P se acerca al valor 1.67, mayor la estabilidad del

material en el interior del cuerpo humano y tiende a ser inerte, por otro lado si el valor de la

relación Ca/P disminuye la Hap tendrá una mejor bioactividad.

Otro aspecto que se debe considerar es el grado de cristalinidad. Se ha observado que la

cristalinidad en los tejidos, para el esmalte de los dientes es muy alta, mientras que en los

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huesos y en la dentina, es muy pobre. Esto significa que la reactividad depende del grado de

cristalinidad, ya que la reactividad en la dentina y el hueso es mayor que el esmalte de

dientes.

Se han desarrollado un gran número de investigaciones para producir hidroxiapatita

sintética, ya sea por precipitación acuosa, síntesis hidrotermal, procesada en sólido,

hidrólisis y sol-gel entre otras. Los procedimientos o condiciones bajo las cuales se sintetiza

pueden influir en sus características físicas y químicas [13].

1.13 Aplicaciones de la Hidroxiapatita

La aplicación principal HAp es como relleno de hueso, ya que este material no soporta altas

cargas mecánicas. La idea es crear vínculos fisicoquímicos entre la cerámica y el tejido

óseo, promoviendo su integración y el crecimiento de nuevo tejido [14].

Otro factor a considerar es el fenómeno llamado osteoconductividad, que se produce en

materiales con alta afinidad con el tejido óseo, que promueven la formación de nuevo

tejido, pero también son capaces de dirigir su crecimiento, dependiendo de la estructura que

tienen.

Es conocido que estos materiales deben tener alta porosidad (del orden de cientos de

micras) para permitir el desarrollo del hueso dentro y a través de ellos. Esta propiedad ha

sido utilizada para el desarrollo de cementos con aditivos HAp [15].

Otra aplicación importe es tomar a la Hap como recubrimiento de prótesis metálicas, que se

realiza para dar a la superficie un aspecto adecuado y reconocible para el tejido dadas su

características y biocompatibilidad.

En todos los casos, estos materiales proporcionan una superficie adecuada para la adhesión

celular, que por acción enzimática permanece en largo plazo. El comportamiento in vivo de

los implantes de fosfato de calcio depende de varios factores: la relación Ca/P, la estructura

16

cristalina y la porosidad. El entorno fisiológico también puede tener una influencia decisiva

en la respuesta biológica.

1.2 Electrohilado

El electrohilado ha sido reconocido como una técnica eficaz para la fabricación de

nanofibras de polímeros. Varios polímeros han sido exitosamente maquinados en fibras

ultrafinas en los últimos años. Las cuales tienen un gran potencial de aplicaciones

específicamente como refuerzo en el desarrollo de nanocompuestos [16].

1.2.1 Procesamiento

La figura 1 muestra un diagrama esquemático del funcionamiento del electrohilado. Hay

que cumplir básicamente con tres componentes: un alto voltaje, un tubo capilar con una

pipeta o aguja de diámetro pequeño, y una pantalla de metal como colector de fibras.

La alta tensión se utiliza para generar una alta carga eléctrica, donde la solución

viscoelastica se somete a un estiramiento coaxial por efecto del voltaje, donde antes de

llegar al colector el hilo de la solución se evapora o se solidifica depositándose en la

pantalla una red interconectada de pequeñas fibras [17,18].

La técnica consiste en hacer girar soluciones de polímero a través de altos campos

eléctricos, se basa en aplicar suficientes fuerzas eléctricas que superan las fuerzas de la

tensión superficial en la solución de polímero cargado, de esta forma a un voltaje

determinado, finos chorros de solución son expulsados desde el capilar hasta el plato

colector. Posteriormente el chorro se mueve en la dirección del campo eléctrico,

elongándose de acuerdo a las fuerzas externas e internas y experimentado inestabilidad en

algunas ocasiones. El disolvente se evapora y los segmentos de fibra son depositados en el

sustrato [19].

17

EL electrohilado puede ser desarrollado de forma horizontal o vertical según lo desee, el

principal inconveniente al trabajar en posición vertical es la posible salida de gotas de

solución desde el capilar hacia el plato colector las cuales pueden caer sobre las fibras

depositadas haciendo defectuosa la superficie de las mismas e interrumpiendo el proceso.

Para impulsar la solución a través del capilar puede utilizarse una bomba de infusión; si se

trabaja de forma horizontal, la salida de la solución puede estar determinada por la fuerza

de gravedad ligada a la viscosidad de la solución.

Para el inicio del proceso, el polímero debe estar diluido en el o los disolventes que

permitan una dilución completa del mismo (debe ser completa, para evitar el taponamiento

del capilar durante el proceso) pero que a la vez promuevan la obtención de fibras

homogéneas. Los polímeros son dieléctricos, en presencia de un campo eléctrico pueden

considerarse como un arreglo de dipolos eléctricos microscópicos compuestos por cargas

positivas y negativas cuyos centros no coinciden perfectamente [20], se mantiene en su

lugar por acción de las fuerzas atómicas y moleculares, y solo pueden cambiar su posición

ligeramente en respuesta a fuertes campos eléctricos externos, lo que explica por qué ocurre

el estiramiento de la solución en el proceso. Son llamadas cargas ligadas en contraposición

a cargas libres que determinan la conductividad en otro material ―conductor‖ [21].

Una vez que se tiene la solución en el lugar sea jeringa o cono se inicia la aplicación de alto

voltaje, cuando este potencial eléctrico se aplica, las cargas se acumulan promoviendo la

formación de una gota en la punto del capilar, a medida que la intensidad del campo

eléctrico se incrementa, la gota se alarga para crear una forma cónica conocida como cono

de Taylor [22-24].

La fuerza de campo eléctrica supera las fuerzas de cohesion de la solución de polímero

inicia un viaje desde la punta del capilar hasta el plato colector; en su viaje, el chorro de

solución polimérica es alargado debido a las interacciones electrostáticas entre las carga

cercanas a segmentos del mismo chorro, mientras tanto, el disolvente se evapora,

finalmente, las fibras se solidifican a su llegada al plato colector [25].

18

1.2.2Parámetro del material a considerar en el proceso de

electrohilado.

En el proceso de electrohiladura intervienen una serie de variables, las cuales deben ser en

primera instancia estudiadas con detalle y seguidamente determinadas y optimizadas para

cada polímero.

El primer grupo de variables está relacionado directamente con la química precursor de las

nanofibras. Al hacer referencia a la química de los polímeros. Es condición indispensable

conseguir disolver el polímero, para obtener nanofibras de este mismo. El proceso de

disolución del polímero lleva asociado el estudio de la temperatura de disolución, la adición

de cargas, la presión de vapor del disolvente, la concentración del polímero, la viscosidad,

la tensión superficial, la constante dieléctrica y conductividades resultantes, centrándose

especialmente en la viscosidad, la tensión, y la conductividad eléctrica. [26,27].

Peso Molecular y Viscosidad de la disolución.

El peso molecular de los polímeros está en función de la longitud de la cadena polimérica,

ya que es la suma de los pesos moleculares de los monómeros que lo conforman, y afecta

directamene a la viscosidad de la disolución resultante. Generalmente al tratarse de un

mismo polímero, cuanto más alto sea el peso molecular del polímero, mayor será la

viscosidad de la disolución. Otra manera de aumentar la viscosidad de la disolución es

aumentar la concentración del polímero [28].

Viscosidades altas en la disolución, suponen una mayor interacción entre las moléculas del

polímero y las del disolvente, por lo que las moléculas del disolvente se distribuyen

enmarañadamente junto con las del polímero. Sin embargo cuando la viscosidad es baja, las

moléculas del disolvente tienden a congregarse bajo la acción de la tensión superficial.

La viscosidad dela disolución es necesaria para que tenga lugar el proceso de electrohilado.

Cuando las viscosidades son bajas, se encontrarán agregados en forma de anillo a lo largo

de toda la nanofibra. No obstante, cabe remarcar que una viscosidad demasiado alta puede

llegar a imposibilitar el proceso de electrohiladura.

19

Tensión Superficial

Cuando una gota cae en el aire generalmente adopta una forma esférica, las propiedades

superficiales del líquido que provocan este fenómeno es lo que se conoce como tensión

superficial de un líquido. Se debe a que las fuerzas que afectan a cada molécula son

diferentes en el interior del líquido y en la superficie. Mientras que en el seno de un líquido

cada moléculas está sometida fuerzas de atracción que en promedio se anulan, en la

superficie hay una fuerza neta hacia el interior del líquido [29]

La tensión superficial tiene como principal efecto la tendencia del líquido a disminuir en lo

posible su superficie para un volumen dado, de aquí que un líquido en ausencia de gravedad

adopte la forma esférica, que es la que tiene menor relación área/volumen.

Energéticamente, las moléculas situadas en la superficie tienen una mayor energía

promedio que las situadas en el interior, por lo tanto la tendencia del sistema será a

disminuir la energía total, y ello se logra disminuyendo el número de moléculas situadas en

la superficie, a ahí la reducción de área hasta el mínimo posible.

En el proceso de electrohilado, las cargas de la solución del polímero deben ser lo

suficientemente altas como para vencer la tensión superficial de la misma. Cuando la

disolución se carga eléctricamente y es acelerada hacia la placa colectora, la fibra debe fluir

de forma continua, sin embargo la tensión superficial de la disolución puede ser

responsable de desintegrarla en pequeñas gotas, provocando el fenómeno de

electrosprayado en vez de la electrohiladura, también puede ser responsable de la

formación de defectos en forma de anillos en las nanofibras obtenidas.

Conductividad

La electrohiladura está muy relacionada con la repulsión entre cargas que se crea en la

superficie de la disolucion. A mayor conductividad de la disolución del polímero, mayor

facilidad tendrá para cargarse y formar finas fibras de polímero [30]. Además la adición de

sales y polielectrolitos facilitaran paralelamente el estirado de la nanofibra durante su

formación [31].

20

Otro de los factores que se ven favorecidos directamente en el proceso de electrohiladura,

como consecuencia de un aumento de la conductividad de la disolucion, es que el voltaje

crítico, para que tenga lugar la formación de nanofibras, se ve reducido notablemente. No

obstante, también es necesario señalar que, el aumento de la conductividad en la disolución

mediante la adicion de iones, puede ser la causa de un aumento de la viscosidad a niveles

no deseados.

Presión de Vapor

La presión de vapor o presión de saturación es aquella, para una temperatura dada, en la

que la fase líquida y la fase vapor se encuentran en equilibrio dinámico [29]. Este

parámetro es el responsable de que el disolvente que forma parte de la disolución

precursora, se evapore rápidamente si bien, dejando el tiempo necesario para dar lugar a la

formación de los filamentos de polímero

1.2.2.Parámetro de control del proceso de electrohilado

Intensidad del voltaje aplicado.

La aplicación de alto voltaje a la disolución es indispensable para superar la tensión

superficial de la misma, dotarla de carga y establecer un campo eléctrico entre los dos

electrodos. La intensidad de voltaje a aplicar es específica en cada caso, existe una

intensidad óptima que produce las nanofibras con las dimensiones y morfología buscadas

[32].

Cuanto más alta la intensidad del voltaje, menor es el diámetro de las fibras obtenidas, no

obstante cabe resaltar que un exceso de intensidad en el voltaje aplicado, también es la

causa de formación de chispas eléctricas, que van a provocar la aparición de

macroagregado de polímero en la placa colectora, dando lugar a la aparición de importantes

defectos y la pérdida de todas las propiedades técnicas en la zona de recubrimiento

formado.

Otra de las propiedades que se ve modificada en función de la intensidad del voltaje

aplicado es la cristalinidad de la nanofibra polimérica obtenida, el campo electrostático

21

provoca ordenación de las moléculas del polímero durante el proceso de electrohilado,

induciendo un mayor grado de cristalinidad, sin embargo, el aplicar una intensidad de

voltaje demasiado alta puede llegar a provocar el efecto contrario. El aumento de la

intensidad del voltaje acelera el proceso de formación de las nanofibras, por lo que al

depositarse en forma de velo sobre la superficie de la placa colectora, deben tener el tiempo

necesario para que se alineen ellas mismas [27].

Velocidad de alimentación de la disolución.

La cantidad de disolución disponible para el proceso de electrohilado por unidad de tiempo

es lo que conocemos como velocidad de alimentación. Para un voltaje determinado, existe

una velocidad de alimentación óptima si se quiere garantizar la estabilidad del cono de

Taylor. Cuando la velocidad de alimentación crece, hay un aumento evidente de la cantidad

de disolución, que se traduce en un aumento del diámetro de fibras y de la formación de

gotas.

Si la velocidad es alta, el chorro encontrará muchos problemas para evaporarse. Por lo

tanto, el disolvente que acarrea cada fibra, no tiene tiempo de evaporarse y se deposita

sobre el colectro de forma amalgamada y fusionada. Las velocidades de alimentación bajas

son más deseables porque proporcionan más tiempo para que se evaporen los disolventes

[33].

Distancia ente electrodos.

La separación entre electrodos debe ser lo suficientemente corta como para generar

corriente entre ambos y permitir que las fibras se depositen en la placa colectora, pero al

mismo tiempo deben estar lo suficientemente separados, para permitir la evaporación del

disolvente y la formación de fibras con una longitud que se considere aceptable. Cuando la

distancia entre electrodos es demasiado corta, el exceso de disolvente no evaporado es la

causa de un velo con una estructura amalgamada, en el que las fibras se fusionan unas entre

otras [34].

Condiciones Ambientales

22

Cualquier interacción entre el ambiente y la disolución del polímero o entre el ambiente y

el campo electrostático, puede ser causa de un cambio en la morfología de los filamentos

poliméricos. Agentes externos por los que se puede ver alterado el proceso de

electrohiladura.

Polvo. Es indispensable que el proceso de electrohilado tenga lugar en un ambiente

libre de polvo.

Temperatura. La temperatura afecta la viscosidad de la disolución y a la proporción

del disolvente evaporado, por lo que un aumento de la temperatura permitirá

acelerar el proceso de producción de fibras. Las imperfecciones morfológicas

durante la formación de las fibras pueden mejorarse con un incremento de la

temperatura de la disolución precursora [35].

Humedad. En el caso de trabajar con disoluciones en base acuosa, es recomendable

mantener un grado de humedad constante para favorecer la formación de fibras. La

humedad relativa no debe ser nunca inferior al 30%, ni superior al 50%. Sin

embargo cuando se trabaja con disolventes volátiles la presencia de humedad en el

interior de la cámara de electrohilado no resulta ventajosa, hasta el punto de que en

algunos casos, es necesario incorporar en el interior de la cámara una corriente de

aire seco para disminuir dicha humedad [36].

1.3 Tipos de nanofibras.

Nanofibras sin aditivos.

La introducción de pequeñas modificaciones en las diferentes variables que entran en juego

en el proceso de electrohilado, son las responsables de obtener importantes variaciones en

la morfología de las nanofibras, no obstante también se puede tener en cuenta el cambio de

otros elementos influyentes dando lugar a nanofibras porosas, nanofibras planas, nanofibras

huecas, nanofibras ramificadas y nanofibras helicoidales [37,38,39].

Nanofibras Porosas

23

Los poros en las nanofibras pueden ser el resultado de una humedad relativa en el interior

de la cámara demasiado elevada, sin embargo existen otros factores que pueden influir en la

formación de poros durante el proceso de electrohilado. Durante la fase de evaporación del

disolvente, la disolución es termodinámicamente inestable, hecho que resulta ser ventajoso

en la obtención de nanofibras porosas figura2, puesto que se establecen dos fases; una

formada por el disolvente mayoritariamente y otra por el polímero. Al evaporarse

definitivamente el disolvente da lugar a la matriz, mientras que la fase pobre en polímero,

da lugar a los poros.

Figura 2. Imagen Tem de nanofibras porosas Li, L., & Hsieh, Y. L. (2006). [40].

El control de la presión de vapor del disolvente va a permitir la obtención de este tipo de

nanofibras de forma regular [40,41].

Nanofibras planas.

La obtención de este tipo de nanofibras se consigue con disoluciones concentradas de

polímero de alto peso molecular, las nanofibras llegan al substrato colector húmedas y al

impactar se aplanan. En algunos casos pueden llegar a crearse puentes planos entre las

fibras cilíndricas. Figura 3.

24

a b

c d

Figura 3. Imagen Esem de nanofibras planas Lyons, J., Li, C., & Ko, F. (2004). [41].

Nanofibras huecas.

La obtención de fibras huecas mediante el proceso de electrohilado se llevan a cabo

mediante el uso de cabezal de electrohiladura coaxial para crear una estructura del tipo

core-shell [42]. El componente exterior suele ser el polímero y como componente interior

se ha de buscar un compuesto inmiscible con el polímero, normalmente se hace uso de

aceites minerales que se eliminan con facilidad [43].

25

Figura 4. Imagen Sem de nanofibras huecas (a, b) Bazilevsky, A.V et al. (2007) [42],

(c,d) Li, D., McCann, J. T., & Xia, Y. (2005). [43].

Nanofibras ramificadas.

Este tipo de nanofibras se obtienen a partir de la formación de pequeños chorros de

disolución que surgen de la superficie de los chorros primarios o iniciales. Este efecto se

consigue ejerciendo un control total sobre el balance de fuerzas electrostáticas que entrar en

juego en el campo eléctrico generado y de la tensión superficial de la misma disolución del

polímero [44].

Figura 5. Imagen Sem de nanofibras ramificadas Choi, S.S., et al. 2004 [44].

Nanofibras helicoidales

La formación de fibras helicoidales se lleva a cabo partiendo de disoluciones de más de un

polímero y además uno de los dos debe ser un polímero conductor; por ejemplo polianilina

quiral (PANI). En la formación de los ciclos helicoidales entran en juego dos variables

principalmente; la concentración del polímero no conductor, que va ser la responsable del

26

a b

diámetro del bucle y las propiedades conductores del otro polímero, deben establecerse un

equilibrio entre las fuerzas de repulsión y las fuerzas viscoelásticas de hilado de este mismo

polímero [45]

Figura 6. Imagen Sem de nanofibras helicoidales Weng, S.,et al. (2010) [45].

Nanofibras funcionalizadas con aditivos

La técnica de electrohilado permite funcionalizar las nanofibras obtenidas, adicionando

previamente la disolución polimérica precursora. Esto es posible si se utilizan una

dispersión coloidal en medio similar a la disolución polimérica, que puedan ser fácilmente

mezcladas y homogenizadas conjuntamente. Las nanoparticulas pasan a formar parte dela

estructura del velo, mejorando las propiedades mecánicas del mismo con el fin de poder ser

utilizadas como material de refuerzo en los compostios (nanowiskers de -quinina) [46], en

los andamiso de bioingeniería de tejidos (nanoparticulas de montmorillonita) [47] o

confiriendo propiedades antimicrobianas (nanoparticulas de plata, plata ionica), absorción

térmica (nanoesferes de vidrio huecas)[48].

La adición debe llevarse a cabo con partículas de tamaño nanométrico, que puedan ser

arrastradas por la acción del campo eléctrico creado y quedando atrapadas en las nanofibras

con una distribución uniforme y perfectamente funcional sobre todo el velo formado

[49,50].

27

Nanofibras conductoras

Los velos de nanofibras con propiedades conductoras se pueden obtener por dos caminos;

directamente un polímero conductor, como en el caso de la polianilina, el polipirrol o el

poliisopreno, cuyas aplicaciones son limitadas debido a su alto costo, o mediante la adición

de nanoparticulas conductoras de cobre o de negro de carbón en polímeros más económicos

con es el caso del polivinil alcohol [51].

Las nanoparticulas de negro de carbón o de cobre deben ser inferiores al diámetro de las

nanofibras, alrededor de los 30nm y la preparación de la disolución con las partículas en

dispersión deben hacerse con agua osmotizada a 85°C. La proporción de nanoparticulas del

material conductor en la disolución está en función de la aplicación final del velo de las

nanofibras, aunque se electrohilan velos de nanofibras con concentraciones del 2% hasta el

10% con respector al peso del alcohol de polivinilo en la disolución [52, 53].

Nanofibras antimicrobianas

Los velos de nanofibras con propiedades antimicrobianas se pueden obtener mediante la

adición a la disolución de diferentes sustancias y elementos, entre los que se destacan las

nanopartículas de plata, plata iónica o el quitosano cuaternizado [54-57].

Entre los polímeros utilizados para este tipo de aplicaciones destaca la poliamida por su

resistencia que confiere a los velos de nanofibras y por la posibilidad de conseguir

nanofibras de diámetros más finos que permiten aumentar el grado de porosidad del velo.

El alcohol de polivinilo vuelve a ser un polímero especialmente indicado para adicionarlo

con este tipo de elementos, su solubilidad en agua permite obtener mezclas muy

homogéneas con las sales de los iones indicados [58].

28

1.7 Aplicaciones de las nanofibras

Es una tecnología que se encuentra en pleno desarrollo experimental. La figura 2.4.1

muestra los porcentajes dedicados en investigación y desarrollo a la obtención de

nanofibras mediante la técnica de electrohilado [32].

Caracterización: Es el porcentaje más alto de dedicación en cuanto a

investigación y desarrollo, se centra en la caracterización de las nanofibras el cual

corresponde al estudio de las propiedades morfológicas, estructurales, químicas y

mecánicas.

Proceso: Dedicado al desarrollo del equipamiento y proceso, se incluye el

modelado y la ingeniería.

Aplicaciones: Dentro de este porcentaje se incluye la investigación y desarrollo

para los campos:

Ingeniería mediambiental y biontecnología. (filtración, materiales

barrera, materiales antimicrobiano) [59,60].

Bioingeniería, medicina, ingeniería de regeneración de tejidos

celulares o andamios, vendas, apósitos etc [61].

Defensa y seguridad [62,63].

Compositos, formando parte de material de refuerzo [64-66].

2.4.1 Filtración

Este tipo de estructuras creadas a partir de fibras de diámetros nanométricos, permiten el

paso de compuestos moleculares como el oxígeno o el vapor de agua, al tiempo que

impiden el paso de microorganismos, por ello tiene un importante potencial como medios

29

filtrantes y/o materiales barrer, en los que se refiere a aplicaciones destinadas al cuidado de

la salud, ejercito e incluso en la industria automotriz [67,68].

En la industria farmacéutica la calidad, pureza y seguridad en el proceso de elaboración de

los medicamento es la garantía de su eficacia y lo mismo ocurre con los campos y salas

quirúrgicas en las que los medios filtrantes utilizados aseguran la purificación del aires con

la ausencias de partículas sólidas; microorganismos, polvo, polen y partículas en estado

líquido; humos, humedad, disolventes y productos químicos evaporados [69].

Las principales ventajas del uso de nanofibras como medios filtrantes se resumen en dos;

alta eficiencia de filtración con una baja resistencia de paso al aire y la posibilidad de

retener microgotas de líquido [70,71].

1.4.2 Salud y medicina.

Dos de cada tres aplicaciones relacionadas con las nanofibras, obtenidas a partir del proceso

de electrohilado, se desarrollan en el campo de la salud y medicina.

Las nanofibras presentan un importante potencial como sistemas de liberación de

medicamentos de forma gradual. La disolución del polímero se funcionaliza

adecuadamente con el medicamento que pasará a formar parte del velo de la nanofibra,

utilizado posteriormente como parche cutáneo, vendas funcionalizadas o mediante un

encapsulado farmacéutico, que se distribuirá a partir del sistema digestivo del paciente. La

distribución del medicamento en el cuerpo humano va a depender tanto de la

biodegradabilidad del polímero como del tamaño de las nanofibras, de forma que, la

distribución es tanto más rápida cuanto más pequeño y más biodegradable es el soporte que

incluye el principio activo [72-74].

Siguiendo el mismo principio, pueden desarrollarse soluciones en el ámbito dela cosmética

y la salud, utilizando activos aromaterápicos y dermoestéticos [75].

30

1.4.3 Bioingeniería de tejidos.

De nuevo la especificidad de estas estructuras va a condicionar las aplicaciones en la

ingeniería tisular, ya que son estructuras similares a las estructuras de los tejidos vivos,

incluyendo los tejidos del cuerpo humano, por ello se proponen aplicaciones del tipo:

apósitos para regeneración de úlceras, reconstrucción de tejidos y de huesos mediante el

uso de andamios [76,77].

Los andamios en bioingeniería se utilizan para reparar los tejidos dañados, y se definen

como la construcción provisional que soporta la secuencia constructiva de un armado

complejo, dando estabilidad al proceso de armado definitivo. Utilizando las nanofibras

como andamios, las células sembradas se adhieren y crecen entre las nanofibras inmersas

en el medio nutriente, posteriormente, los andamios con las células, son implantados en los

tejidos dañados. Siguiendo esta teoría y como consecuencia de la estructura que caracteriza

a las nanofibras, es posible desarrollar andamios para todo tipo de tejidos humanos, entre

los que destacan: tejidos para reparar vasos sanguíneos, cartílagos, huesos, nervios y piel

[78].

En el desarrollo de andamios celulares, los intersticios que forman parte de los velos de las

nanofibras, deben tener el tamaño adecuado para permitir que las células sembradas quepan

y colonicen el tejido homogéneamente siguiendo los caminos marcados por las nanofibras,

tanto superficialmente como tridimensionalmente.

1.4.4 Energía y electrónica.

Entre las distintas opciones de generación de energías limpias, cabe hacer una especial

mención a las baterías poliméricas, conformadas por polímeros conductores utilizados

como gel en disoluciones electrolíticas. Las nanofibras obtenidas por el proceso de

electrohilado vuelven a ser una opción interesante para sustituir este tipo de materiales

poliméricos. Debido a su estructura porosa y de gran superficie por la que se caracterizan,

actúan como materiales conductores y resistencia interfacial, aportando estabilidad

electroquímica al sistema [62,79].

31

-[CH-CH2-]

n

OH

|

En el campo de la electrónica se están introduciendo las nanofibras como materiales para

desarrollar todos tipos de sensores, sensores de gas, químicos, ópticos y biosensores. De

nuevo la alta relación superficie/volumen que presentan los velos de nanofibras, vuelve a

ser la variable que los hace atractivos para este tipo de aplicaciones. En alguno caso se está

reemplazando el material convencional que actúa de interfase por velos y/o membranas de

nanofibras [37].

En este mismo campo se está estudiando la posibilidad de desarrollar células fotovoltaicas

para la captación de la energía solar, a partir de velos de nanofibras funcionalizados

mediante compuestos inorgánicos como dióxido de titanio [80,81]

1.7Polivinil Alcohol (PVA)

Estructura y obtención del PVA

Alcohol de polivinilo (PVA) es un polímero sintético lineal producido a través de la

hidrólisis parcial o total de acetato de polivinilo para eliminar el grupo acetato figura 7. La

cantidad de hidroxilación determina las características físicas y químicas, así como las

propiedades mecánicas del polímero [82].

Figura 7. Estructura Quimica del Polivinyl Alcohol

Esta ruta química da como resultado un producto altamente soluble en agua, pero resistente

a la mayoría de los disolventes orgánicos. Cuanto mayor sea el grado de hidroxilación y de

polimerización, menor es la solubilidad en agua y más difícil de cristalizar [83].

32

Debido a su solubilidad en agua, PVA necesita ser reticulado para para formar hidrogeles

[84]. Los hidrogeles son redes poliméricas tridimensionales capaces de absorber grandes

cantidades de líquidos, sin disolverse en ellos y con el tiempo liberarlos [85,86]. Esta

característica junto con su biocompatibilidad con los tejidos humanos, permeabilidad y bajo

coeficiente de fricción [87], los han hecho aptos para ser usados en aplicaciones médicas

[88].

Estas redes tridimensionales están compuestas de una fase sólida, fluido intersticial y

especies iónicas como se aprecia en la figura 3; se les ha considerado materiales

biointeligentes ya que responden variando su volumen, a estímulos del medio ambiente,

tales como: cambios de pH, temperatura, concentración de especies, biomoléculas (glucosa

y proteínas) [89], radiaciones y campo eléctrico [90].

Características Generales del PVA.

Las propiedades del PVA se encuentran fuertemente influenciadas por el método de síntesis

empleado. El grado de polimerización, las condiciones de hidrólisis y la etapa de secado

afectan las propiedades finales del producto [91]. Las propiedades físicas y químicas del

PVA dependen en primer lugar del peso molecular (figura 8) y en segundo lugar del

contenido de grupos acetil o grado de hidrólisis (figura 9). La solubilidad del PVA va a

estar en función del peso molecular y del grado de polimerización, de forma que cuanto

mayor es el peso molecular, más insoluble en agua es el polímero. El polímero totalmente

hidrolizado es insoluble en agua a temperatura ambiente, sin embargo se solubiliza

perfectamente por encima de los 85°C [92]. La presencia de grupos hidroxil aumentan las

interacciones por puente de hidrógeno, tanto intramolecular como intermolecularmente,

disminuyendo la solubilidad en agua, mientras que la presencia residual de grupos acetil

disminuye el número de interacciones por puente de hidrógeno, permitiendo la solubilidad

en agua del polímero a temperaturas más bajas.

33

Figura 8 Influencia del peso molecular en las propiedades del PVA.

34

Figura 9. Influencia del peso molecular en las propiedades del PVA.

Otras propiedades físicas que lo hacen interesante, es que el PVA es parcialmente

cristalino, mientras que la mayoría de los compuestos de polivino como el poliestireno o el

acetato de polivinilo son amorfos.

El PVA también se caracteriza por su buena resistencia química a compuestos del tipo

hidrocarburo, hidrocarburos halogenados, ésteres de ácidos carboxílicos, grasas y aceites

vegetales o animales. La resistencia a disolventes orgánicos aumenta con el grado de

hidrolisis [92].

El PVA además es una excelente barrera al oxígeno gaseoso en bajas condiciones humedad,

disminuyendo esta propiedad con el aumento de humedad relativa.

El punto de fusión del PVA estará en función de todas las propiedades descritas

anteriormente, dependerá tanto del grado de polimerización como el peso molecular y en

mayor medida dependerá de la distribución de zonas amorfas y cristalinas, ya que el

tamaño de los cristales determina directamente el punto de fusión de dicho polímero. De

acuerdo a la bibliografía consultada aparece un amplio rango de puntos de fusión

documentados; desde 220°C hasta 267°C. Cuando el alcohol de polivinilo se calienta

gradualmente sin disolverse durante un largo periodo, se produce su descomposición

gaseosa alrededor de los 110°C, dependiendo de la intensidad y la duración del proceso de

calentamiento[93].

Finalmente cabe señalar la bidegradabilidad del PVA, ya que es uno de los pocos polímeros

sintéticos realmente degradables, obteniéndose como productos de degradación de agua y

dióxdo de carbono[94]. Al menos 55 especies o variedades de microorganismos muestran

procesos de degradación de este polímero en diferentes entornos como son los fangos

activados, digestores anaeróbios, sistemas sépticos, compostaje, sistemas acuáticos y

lagunaje. El tiempo de degradación del PVA por la acción de los microorganismos vuelve

a depender de sus propiedades físicas y de lo adaptado que estén dichos microorganismos

para degradar este tipo de polímeros. El PVA es rápidamente biodegradable mediante el

proceso de fangos activados, si la biomasa está acostumbrada a la aportación regular de este

polímero[95].

35

2.6 Proceso de electrohilado de PVA en disolución acuosa.

La obtención de velos de nanofibras es relativamente sencilla si se compara con otros tipos

de polímeros debido a su solubilidad en agua. Esto permite trabajar en condiciones

atmosféricas, evitando el sistema de acondicionamiento y extracción de la cámara de

electrohilado, siempre y cuando se trabaje con humedades relativas entre 20% y 50%

[96,50].

Tal como se ha detallado a nivel general en el apartado 2.2.2 las variables que intervienen

directamente en el proceso de electrohilado incluyen: la conductividad de la disolución, la

presión de vapor del disolvente, el peso molecular del polímero el cual se determinará junto

con la concentración del mismo, la viscosidad de la disolución y la tensión superficial. En

cuanto a las variables del proceso en sí, destacan la distancia entre los electrodos, la

intensidad del voltaje aplicado y las condiciones ambientales de temperatura y humedad

principalmente.

Peso molecular y viscosidad de la disolución: el peso molecular de los polímeros

en disolución será responsable de las propiedades reológicas de las nanofibras, y lo

que es más importante aún, será el que determine el resto de las propiedades del

proceso, por ejemplo a mayor peso molecular mayor será la intensidad de voltaje a

aplicar. Se han conseguido electrohilar nanofibras de PVA de un amplio rango de

pesos moleculares [97].

Tensión Superficial: las cargas de la solución del polímero deber los

suficientemente altas como para vencer la tensión superficial de la misma. La

tensión superficial no se ve afectada por la adicion de cargas en forma de

electrolitos [98].

Conductividad: el proceso de electrohilado está íntimamente relacionado con la

repulsión de cargas que se crea en la superficie de la disolución. A mayor

conductividad de diolución del polímero, mayor facilidad tendrá para cargarse y

formar finas fibras de polímero. En el caso del PVA, el pH de la disolución afecta

36

notablemente las propiedades del velo obtenido, obteniéndose mejores resultados en

cuanto a uniformidad y tamaño de las nanofibras si se trabaja a pH extremos (2-12

pH) [31].

Intensidad del voltaje aplicado: la intensidad del voltaje aplicado depende como

se ha detallado en las propiedades de la disolución, empezando por el peso

molecular del polímero, su concentración, tensión superficial y viscosidad. También

depende de la distancia entre los electrodos. Cuanto mayor es el voltaje, menor es el

diámetro de las nanofibras y mayor cristalinidad del polímero a una vez

electrohilado en forma de velo de nanofibras [99].

Distancia entre electrodos: la distancia es una de las variables del proceso a

determinar exactamente, ya que de ella no sólo dependen las propiedades finales del

velo, sino que pueden llegar a formarse o no las nanofibras si la distancia entre

electrodos no está optimizada. Para que se evapore el agua que forma parte del

filamento de PVA electrohilado, es necesario una distancia mínima a partir de la

cual, si se va incrementando, se obtendrán nanofibras de diámetros más finos, hasta

alcanzar la distancia en la que se rompe el campo eléctrico entre los dos electrodos

y los filamentos dejan de fluir [30].

Velocidades de proceso: entre las que se incluyen la velocidad de paso del

substracto colector y la velocidad de alimentación de la disolución o flujo. Estas dos

variables van a interferir principalmente en el gramaje del recubrimiento y espesor

del mismo. A medida que aumenta la velocidad de paso del substrato colector,

disminuye el espesor del velo de nanofibras. Por el contrario, cuanto mayor es la

velocidad de alimentación del polímero, mayor número de nanofibras están

formándose para unas condiciones dadas de proceso, obteniéndose velos de mayor

espesor y gramaje.

Condiciones ambientales: humedad y temperatura. La humead tiene una enorme

influencia en el proceso de electrohilado ya que determina la proporción de

evaporación del disolvente de la disoluición polimérica. En el caso del electrohilado

de PVA, aunque se puede trabajar en cierto rango de humedades (HR%: 30-50%),

la concentración de humedad en el interior de la cámara deber ser controlada y

estabilizada de forma constante, con el fin de conseguir un entramado de fibras

37

óptimo y homogéneo. El exceso de humedad en la cámara o saturación hará que las

nanofibras que se forman no lleguen secas al substrato colector y al entrar en

contacto con el enmarañado de nanofibras depositadas previamente, provocarán su

disolución, generando un velo de nanofibras de mala calidad [100].

En cuanto a la temperatura, provoca dos efectos en la cámara de electrohilado, afectando la

viscosidad de la disolución y a la proporción de evaporación. Cuanto mayor es la

temperatura se obtienen nanofibras de menor diámetro, sin embargo, un exceso de

temperatura provoca una evaporación demasiado rápida, colapsando el proceso e

impidiendo que las nanofibras alcancen substrato colector. [35,101]

2.7 Substratos del Colector

El substrato colector debe mantener el campo eléctrico formado entre dos electrodos, y en

última instancia entre la disolución cargada y el propio substrato. Al encontrarse en

contacto con el electrodo superior, debe facilitar la transmisión de cargas y evitar rotura del

campo eléctrico.

Como las fibras electrohiladas se encuentran cargadas y se colocan sobre el colector, se

acumulan cargas sobre la malla de fibras, lo que puede llegar a tener una gran influencia

sobre el proceso de electrohilado, especialmente cuando se producen muchas fibras.

El campo eléctrico resultante eléctrico resultante provoca el movimiento de las cargas hacia

los puntos en equilibrio, donde la suma de las fuerzas de las repulsiones que se generan es

igual a cero. Las cargas del interior del substrato se moverán hacia la superficie de manera

que el campo en cualquier punto del interior del substrato sea igual a cero. Las carga de la

superficie se orientan según el campo eléctrico, perpendicularmente a la superficie, como el

substrato no tiene una superficie lisa y perfecta, se acumulan alrededor de los bordes o

protuberancias de la superficie.

Estas irregularidades del campo eléctrico sobre la superficie pueden provocar agujeros en el

velo de nanofibras depositado, por tanto, es necesario que el substrato presente cierta

38

regularidad superficial, y que tenga capacidad de facilitar el movimiento de cargas.

Cuando se trabaja con PVA se necesitan conductividades superficiales del orden de los 108

Ohm.

39

2.8 Métodos de Obtención de Hidroxiapatita. Durante la última década, se han desarrollado diferentes métodos para preparar

nanopartículas HAp. M. Sadat-Shojai et al [106] en 2013 ha clasificaron los métodos de

preparación en cinco grupos.

Método vía Seca.

Métodos vía Húmeda.

Procesos de Alta Temperatura.

Métodos de Síntesis basados en Fuentes Biogénicas.

Procedimientos de Combinación.

Método vía Seca.

El método por vía seca no utiliza solventes. Según la bibliografía, las características de un

polvo sinterizado por este método no requieren condiciones controladas de proceso.

Haciéndolas adecuadas para la producción en masa de polvos. Las técnicas para obtener

HAp por vía seca más utilizadas son: síntesis en estado sólido y proceso de mecano

química.

Síntesis en estado sólido

Una reacción en estado sólido, es un procedimiento que puede ser empleado para la

producción de polvos en masa [107-110]. Los precursores primero se muelen y luego se

calcinan a una temperatura muy alta [107]. La figura 10 muestra que los precursores

pueden ser productos químicos que contienen calcio y fosforo o simplemente una sal de

CaP. La alta temperatura de calcinación conduce a la formación de una estructura

cristalina. Una de las desventajas, es que un polvo sinterizado por una reacción de estado

sólido a menudo exhibe una heterogeneidad en su composición de fase, debido a los

pequeños coeficientes de difusión de iones dentro de su fase sólida [108,109].

40

Figura 10. Método de obtención HAp estado sólido

Mecano química.

El proceso de mecanoquímica, a veces conocida como mecánica aleación, es un método

simple para la fabricación en seco de diversos materiales avanzados, tales como aleaciones

nanocristalina y cerámicas [111,112]. Contrario con el método de estado sólido donde las

partículas de HAp heterogenias se producen por lo general de forma irregular, en cambio

un polvo sinterizado utilizando una ruta mecanoquímica generalmente posee una estructura

bien definida. Esto debido a la perturbación ocasionada en las superficies de las especies

químicas, así como un estudio previo del efecto termodinámico y cinética de la reacción

entre los sólidos [113-117].

El proceso mecanoquimica tiene las ventajas de simplicidad y reproducibilidad de síntesis

figura 11. Los materiales se muelen en un molino planetario mientras que la relación molar

entre los reactivos se mantiene estequimetricamente [118,119].

Las principales variables de procesamiento incluyen: el tipo de reactivos, la clase de medio

de molienda, el tipo y diámetro de las bolas de molienda, tipo de atmosfera, duración de las

etapas de molienda, intervalo de pausas, así como la proporción de polvo, masa de bola y la

velocidad rotacional figura 12.

41

Figura 11 Sintesis de HAp por mecoquimica [114]

Figura 12 Esquema de la Molienda de Alta Energia.

Método vía Húmeda

Convencionalmente se han aplicado los métodos húmedos para la preparación de partículas

HAp a escalas nanométricas con una morfología normal. Las ventajas del método por via

húmeda es su capacidad para controlar la morfología, el tamaño promedio de polvo siendo

una de las técnicas más prometedoras para la fabricación de nanohidroxiapatia.

42

Precipitación Quimica Convencional.

Entre los diversos métodos de procesamiento húmedo la precipitación química

convencional es la ruta química más sencilla para la síntesis de HAp nanometrica. La

precipitación química se basa en el hecho de que, a temperatura ambiente y pH 4.2, HAp es

menos soluble y por lo general la fase de CaP es más estable en una solución acuosa. La

reacción de precipitación es llevada a cabo a valores de pH superiores a 4.2 y temperaturas

cercanas al punto de ebullición del agua.

Para producir nanopartículas de HAp, la precipitación química se puede lograr usando

varios reactivos con contenido de calcio y fosfato, por ejemplo, hidróxido de calcio o

nitrato de calcio como fuente de Ca2+

y ácido ortofosfórico o hidrógeno-fosfato de

diamonio como fuente de PO43-

. Un procedimiento típico implica la adición gota a gota de

un reactivo a otro bajo agitación continua y suave, mientras que la relación molar de los de

los elementos (Ca/P) se mantiene estequiometricamente de acuerdo con su relación en

HAp. Como último paso, la suspensión resultante se lava inmediatamente, se filtra, es

secada y triturada en polvo. Figura 13.

Para obtener cristales de HAp, con alta pureza de fase, la reacción de precipitación se lleva

a cabo normalmente a valores de pH y temperarua. Cada vez que el valor de pH debe ser

rebajado (por ejemplo, para lograr una morfología especifica), la temperatura debe elevarse

y viceversa. Esto conduce a una dramática disminución en la generación de impurezas de

fase (por ejemplo dicálcico anhidro (DCPA) y fosfato octacálcico (OCP) lo que resulta en

HAp como una fase dominante.

Además de otros parámetros, la velocidad de mezcla de los reactivos, la temperatura de

calcinación, el método de secado, el sistema disolvente y la concentración de los reactivos

han sido reportadas como elementos que afectas las características del polvo final. Por

ejemplo, la velocidad de mezcla determina la velocidad de la reacción y por lo tanto la

estructura quimica del polvo. Por lo general, una titulación lenta se recomienda para

mejorar la homogeneidad química y la estequiometria del producto final. Por otra parta, la

43

velocidad de adición está fuertemente relacionada con el pH obtenido al final de la síntesis

y para la estabilidad de la suspensión.

Figura 13.Obtencion de Hidroxipatita método de precipitación convencional.

El método de secado, determina tanto la morfología como la dispersabilidad del producto

final. El tamaño de las partículas secadas en condiciones atmosféricas, es ligeramente más

pequeño que el producto del secado por congelación. Además, las partículas secadas en

condiciones de vacío son casi esféricas, con algunas barras, y su dispersabilidad es más

pobre. La mejor metodología de secado, constituye la liofilización, dado que genera

estructuras ultrafinas con la mejor dispersabilidad.

Método Hidrotermico.

El proceso hidrotérmico, como uno de los métodos más comunes para la preparación de

HAp, se identifica generalmente por la reacción en una solución acuosa a temperatura y

presión elevadas. También, puede considerarse como una precipitación química en la que

se lleva a cabo en la etapa de envejecimiento a una temperatura alta en el interior de la

autoclave. Se ha demostrado que las nanoparticulas de HAp obtenidas a partir de las

condiciones hidrotermales, son altamente cristalinas y estequiometricas. Por otra parte la

pureza de la fase y la relación Ca/P en HAp aumentan significativamente con el incremento

de la temperatura.

También es posible, sintetizar ―nanobastones‖ de HAp, de alta critalinidad, en condiciones

neutras, seguido por un tratamiento hidrotérmico a 200°C durante 60 horas. En este caso,

las nanoparticulas muestran estabilidad y alta dipersion, lo que indica su elevada carga de

superficie y baja tendencia a la aglomeración.

44

La formación de cristales en forma de varilla a través de la cristalización hidrotérmica,

comprende dos etapas principales: el paso de nucleación, en el que una reacción iónica

forma pequeños núcleo cristalino en un medio sobresaturado y el paso hidrotérmico, en el

que los núcleos consolidan su crecimiento hasta adquirir la forma de varilla. Figura 14

Figura 14. Obtención de Hidroxipatitia método Hidrotérmico

Por otra parte, se ha demostrado que la temperatura y el pH son factores más importantes

que afectan a las características estructurales y morfológicas de las nanopaticulas de HAp.

el aspecto fibroso de las nanoparticulas disminuye, de modo abrupto, con el aumento del

pH. La Figura 15, muestra el efecto delas condiciones hidrotermales sobre la mofología de

la HAp.

45

Figura 15.Efecto de las condiciones hidrotermales sobre la morfología de HAp

De acuerdo con la figura, un alto valor de pH genera un crecimiento isotrópico anisotrópico

débil, es decir, los cristales pueden crecer para formar nanoparticulas esféricas o en la

mayoría de nanobastones varillas muy cortas. Sin embargo, con una disminución en el

valor de pH de la suspensión se produce un crecimiento anisotrópico, es decir, critalitos

crecerán en nanobastones unidimensionales o nanoplacas bidimensionales. Además, las

formas más complicadas, incluyendo la estructura tridimensional plumosa, microcubos

tridimensionales y microfibras tridimensionales, solo se obtienen si el valos de pH

disminuye a 4.0.

Procesos Alta Temperatura.

Estos métodos se caracterizan por grabar o quemar a los precursores, dadas las elevadas

temperaturas. Sus procesos son Combustión y Pirolisis.

Combustión

Es un proceso convencional para preparar diversas cerámicas de óxido y es considerado un

método prometedor para la preparación de nanocristales de CaP. La base de la técnica de

combustión, proviene de los conceptos termoquímicos utilizados en los campos de los

propulsores y los explosivos. La característica clave de la síntesis de HAp por combustión,

es su capacidad para producir rápidamente polvos de alta pureza en una sola operación. Por

otra parte, el método hace uso de materiales de bajo costo, la preparación es relativamente

simple y proporciona gran homogeneidad química del polvo sinterizado. Como se ilustra en

la figura 16, la solución en combustión para el procesamiento de HAp implica una reacción

redox exotérmica autosostenida y rápida entre los agentes oxidantes (nitrato de calcio y

ácido nítrico) y un combustible orgánico adecuado (por ejemplo, glicina, urea, sacarosa,

ácido cítrico o ácido succínico), en una fase acuosa.

Para esto, las soluciones acuosas madre de Ca(NO3)2 y (NH4)2HPO4 se mezclan, seguido

por la adición del HNO3 concentrado para disolver el precipitado blanco resultante; una

mezcla de dos o más combustibles se incorporan posteriormente en la solución resultante.

46

La reacción puede ser iniciada por el calentamiento de la mezcla en un horno a una

temperatura bastante baja (por ejemplo 300°C); este es seguido por un aumento repentino

de la temperatura, como resultado de la combustión, a un valor máximo. El paso final, es le

enfriamiento rápido de la mezcla para inducir la nucleación máxima y para prevenir

cualquier crecimiento de las partículas mayor al deseado. La exotermicidad de la reacción

de combustión suministra el calor necesario para mantener la temperatura del sistema, y

una vez iniciada, no se necesita calentamiento externo.

El producto resultante es, generalmente, un aglomerado blando de partículas muy finas. Los

parámetros de procesamiento, incluyendo la relación de combustible/oxidante, la

temperatura inicial del horno, la naturaleza del combustible y la cantidad del precursor

inicial, afectan la temperatura máxima de reacción y en consecuencia las características del

polvo final.

Figura 16. Obtención de Hidroxiapatita por el método de Combustión.

Pirolisis

El método de pirolisis, conocido también como ―spray pirolisis‖, implica la pulverización

de las soluciones precursoras en una llama o en una zona caliente de un horno eléctrico

utilizando un generador de ultrasonidos. Esto es seguido por una reacción de los vapores y

gases generados a altas temperaturas para producir un polvo final, formando aglomerados.

[ref]. El manejar altas temperaturas permite la evaporación completa del precursor, además

de la nucleación y crecimiento de las nanoparticulas en la fase gas.

47

La figura 17 muestra la ilustración esquemática del equipo. De acuerdo a la figura, el

tamaño de las partículas depende fuertemente del tamaño de las gotas generadas durante el

proceso.

Figura 17. Método de Pirolisis para la obtención de Hidroxiapatita

Como desventaja, el proceso de pirolisis, se forman agregaciones secundarias, lo que

resulta una disminución del área superficial específica.

48

Métodos de Síntesis basados en Fuentes Biogénicas.

Las partículas de HAp, generadas, pacial o totalmente, a partir de fuentes biogénicas, es un

propósito dela comunidad científica dada su similitud con la apatita humana. La figura 18 revela

cinco grupos diferentes de fuentes naturales, incluyendo la extracción de minerales de los

residuos biológicos, síntesis a partir de cascaras de huevo, síntesis a partir del exoesqueleto de

organismos marinos, con la ayuda de síntesis de biomoléculas naturales y la síntesis usando las

biomembranas

Figura 18. Método de obtención de síntesis basadas en fuentes biogenicas.

49

2.9 Materia Prima: Hueso de Puerco

El tejido óseo está compuesto de diferente estructuras como: el hueso compacto o cortical,

que está ubicado en la parte externa, es duro, denso y su grosor depende de la exigencia

mecánica; otro es el hueso esponjoso o trabecular, que generalmente se ubica en la parte

interna de los huesos y se caracteriza por ser liviano y por tener una forma de enrejado

trabecular, con espacios óseos en los cuales se aloja la medula ósea.

Las diferencias entre ambos tipos de hueso no sólo son estructurales, sino son funcionales.

El hueso cortical tiene una mayor función mecánica de soporte y de protección, mientras el

hueso trabecular tiene una mayor función metabólica, manteniendo la homeostasis iónica

de los fluidos corporales [123]

Tanto el hueso cortical como trabecular están compuestos por 60% en peso de mineral

inorgánico, 30% en peso de material orgánico y 10% en peso de agua. La fase inorgánica

consiste en nanocristales (2-3 nm de espesor por 25-50 nm de largo o ancho) de fosfatos de

calcio, principalmente Hidroxiapatita [124,125] Ver figura 19.

50

Figura 19. Anatomía del hueso cortical y esponjoso [124].

Estructura Microscópica del Tejido Óseo

Desde el punto de vista microscópico, el hueso se divide en tres tipos: plexiforme,

haversiano y laminar [126].

Hueso Plexiforme

Corresponde a un hueso inmaduro que se encuentra en el tejido óseo esponjoso y cortical

de los individuos en crecimiento, por lo que durante la maduración es sustituto

gradualmente por hueso laminar. Este tipo de hueso está ausente en el esqueleto adulto,

aunque se puede formar cuando se acelera la producción de matriz ósea, como ocurre en los

callos de fractura y tumores óseos.

51

El hueso plexiforme carece de una relación estable entre el contenido mineral y el

colágeno, de tal manera que su densidad mineral es muy variable, a diferencia de los huesos

haversiano y laminar, los cuales mantienen una relación fija entre estos elementos.

Hueso Haversiano

Se encuentra constituido por un conjunto de láminas concéntricas, denominadas osteonas o

sistemas de Havers, con un diámetro de alrededor de 200 m y una longitud de 1-2 cm

poseen un eje neurovascular central, denominado canal haversiano, que está recubierto por

osteoblastos y células osteoprogenitoras. Las osteonas están conformadas por alrededor de

4-20 láminas óseas, entre las cuales se localizan los osteocitos. A nivel de la unión entre las

osteonas vecinas se encuentra una delgada línea de cementación, que está compuesta

principalmente por sustancia fundamental calcificada.

La microestructura de tipo osteonal o haversiana está presente en el hueso cortical maduro

y se forma como resultado de la invasión vascular del tejido óseo ya existente, por lo que

posee una menor resistencia mecánica y un sistema circulatorio menos eficiente que el del

hueso laminar.

Hueso Laminar

Las trabérculas del hueso esponjoso y los sistemas circunferenciales del hueso compacto

están compuestos por una serie de láminas óseas paralelas entre sí. Las láminas tienen un

espesor que oscila entre 3-7 m, ya están formadas por fibras de colágeno dispuestas

paralelamente unas con otras, aunque presentan una orientación distinta al respecto de la

fibras de láminas vecinas. En la interfase entre las láminas ósea se encuentran las cavidades

osteocitarias con sus correspondientes células, cuya nutrición depende de los canalículos

existentes en la matriz ósea, los que permiten el intercambio de moléculas e iones entre los

capilares sanguíneos y osteocitos.

La figura 20 muestra los niveles jerárquicos de la estructura ósea, comenzando por cristales

nanoscópicos de hidroxiapatia, los cuales se encuentran orientados y alineados en el interior

de fibras autoensambladas de colágeno; fibras de colágeno se encuentras arregladas en

52

capas paralelas formando lamelas, las cuales están orientadas concéntricamente alrededor

de vasos sanguíneos formando osteonas; finalmente, las osteronas se encuentran

densamente empacadas formando hueso compacto o formando una red trabercular de hueso

microporoso, dando lugar a las fases de hueso cortical y esponjoso [127].

Figura 20.Representación esquemática de los componentes del hueso desde escala

nanoscópica hasta macroscópica. Pasteris et al. [127]

.

53

Composición Química del Hueso.

Fase orgánica

Está constituida por fibras de colágeno tipo 1, que representan entre un 85-90% de la

fracción orgánica, y que se encuentran rodeadas por sustancia fundamental interfibrilar. Las

moléculas de colágeno son sintetizadas en el retículo endoplásmatico de los osteoblastos, y

luego son secretas a la matriz extracelular donde se organizan y asocian en fibras. Las

fibras de colágeno están compuestas por fibrillas de estructura periódica de 500-700Å de

grosor, que se encuentran íntimamente mezcladas con la fase mineral y se disponen en

paralelo en las laminillas óseas, proporcionando al hueso su estructura laminar.

Fase Inorgánica

Está conformada principalmente por fosfato cálcico de tipo amorfo, relativamente parecido

a la hidroxiapatia mineral, la cual se presenta como pequeños cristales con forma de aguja,

y estructura hexagonal de 2-7nm de diámetro y de 5-10nm de longitud con la fórmula

Ca10(PO4)6(OH)2. Esta fracción tiene una estructura sólida continua, y los cristales de

hidroxiapatita se orientan con su eje paralelo al de las fibras de colágeno tipo 1, en las que

se encuentran nucleados.

Los iones que contiene el tejido óseo son Ca+2

, Mg+2

, Na+1

, Fe+3

, CO3-2

,PO4-3

y OH-1

y hay

otros elementos en trazas[128].

También tiene pequeñas cantidades de fluoruros, sulfatos y cloruros.

Las características mecánicas de la fase mineral del tejido óseo dependen de su porosidad,

que para el hueso cortical es proporcionada por los canales de Havers y Volkmann y las

cavidades de reabsorción, y para el caso del hueso esponjoso, por los espacios

intertrabeculares. Las propiedades mecánicas del tejido óseo varían significativamente de

acuerdo a su contenido de agua, existiendo un grado de hidratación critica, ya que entre 37

y 48mg de H2O/g de hueso, el agua puede liberarse de su ligadura a la estructura ósea.

54

En conclusión, las fibras de colágeno proporcionan al tejido óseo flexibilidad y resistencia a

la tensión, mientras que las sales minerales le confieren dureza, rigidez y resistencia a la

compresión.

Histología ósea.

Fisiológicamente, cuatro tipos de células óseas son las principales responsables directas de

su formación y mantenimiento: pericitos, osteoclastos, osteoblastos y osteocitos, que

representan entre 2-5% del peso total del hueso.

Pericitos. Células planas similares a los fibroblastos, las cuales forman una membrana

continua que recubre por completo las superficies libres del hueso [129].

Osteoblastos y osteocitos. Son células que pertenecen al mismo linaje celular y derivan de

las células mesenquimales pluripotenciales de la célula ósea. Se les denomina

osteoprogenitoras por su capacidad de proliferación y diferenciación. Son células grandes

(20-30 ), de forma poliédrica, con citoplasma basófilo y con aparato de Golgi y retículo

endoplásmico rugoso de tamaño importante; su vida media oscila entre 1-10 semanas, al

término de las cuales desaparecen por apoptosis o se transforman en osteocitos (15%), o en

células limitantes o de revestimiento. Su principal función es la síntesis (matriz or´ganica u

osteoide a un ritmo de 2-3 /día), secreción, depósito y orientación de las proteínas de la

fase orgánica; posteriormente, desencadena cambios que permiten al componente proteico

formar pequeñas depresiones (100 ) sobre la matriz ósea, las cuales se rodearán por

parte de la membrana plasmática de esta célula, rica en enzimas como fosfatasa alcalina y

pirofosfatasa, lo que aumenta la concentración local de fosfato y calcio, creando centro de

nucleación de las sales que le permite su mineralización ( a un ritmo de 1 a 2 /día); una

vez que esto sucede, el osteoblasto se programa para su apoptosis [130].

Los osteocitos son en realidad osteoblastos que han concluido su función de síntesis de

matriz, tomando la responsabilidad de registrar la tensión que soporta el hueso circundante,

el envío de señales a células vecinas para iniciar la remodelación ósea, así como llevar a

cabo el proceso de osteólisis osterocítica, en el cual se reabsorben las sales amorfas de

calcio y de fosfato depositadas en la fase minera. Estas células se encuentran inmersas en la

MEC, es decir, se encuentran inmersas en lagunas osteocíticas bañadas por líquido tisular

55

en la superficie de tejido óseo. Se constituyen como las células más abundantes del hueso,

son de forma estrellada lo que les permite organizarse como un sincitio interconectadas

formado una única estructura.

Osteoclastos. Células multinucleadas, grandes (100 ), ricas en mitocondrias y vacuolas

con especificidad tisular localizadas en la superficie del tejido y que pertenecen al sistema

mononuclear fagocítico, ya que son originadas de las colonias formadoras de granulocitos y

macrófagos provenientes de la células tallo hematopoyética como resultado de su

interacción con precursores de los osteoblastos, cuya principal función es la resorción ósea,

la cual se lleva a cabo mediante la acción de enzimas ácidas y proteolíticas mismas que

disuelven el mineral y digieren la matriz proteica.

Los osteoclastos presentan dos características especiales en su membrana: un borde en

cepillo, donde tiene lugar la resorción y una zona clara rica en microfilamentos que le sirve

de anclaje a la matriz, lo que le permite movilizarse a la zona para reabsorber y

posteriormente la adhesión a la superficie mineralizada.

Ciclo de remodelación ósea.

Las fases de regeneración ósea se dividen en las siguientes fases (figura 21):

1.- Fase quiescente. Se le denomina así al estado de reposo del hueso. En esta fase, cierto

número de osteroblastos involucrados en la remodelación pueden ser incorporados en la

matriz ósea y diferenciarse de osterocitos, otros quedan sobre la superficie ósea como

células de revestimiento y otra parte de ellos mueren por apoptosis [131].

2.- Fase de activación. Fase previa a la resorción, determinada por la presencia de

microfracturas detectadas sobre las células limitantes que recubren la superficie del hueso

(osteoblastos). Cuando estas células se retraen, permiten la digestión de la membrana

endostica por acción de las colagenasas, provocando la atracción de los osteoclastos

provenientes de los vasos sanguíneos al quedar expuesta la superficie mineralizada.

56

3.- Fase de resorción. Inicia cuando los osteoclastos se adhieren a la superficie del hueso y

comienza a reabsorber hueso en dos etapas: primero disolviendo la matriz mineral

(solubilizándola) y posteriormente digestión de la matriz osteoide, provocando su

descomposición, la que permite liberar factores de crecimiento.

4. Fase de formación. En las zonas de resorción, se produce agrupamiento de

preosteoblastos, los cuales son atraídos por los factores de crecimiento previamente

liberados. Estos preosteoblastos sintetizan una sustancia cementante sobre la cual se adhiere

el nuevo tejido, expresando proteínas morfogenéticas óseas responsables de la

diferenciación celular. Posteriormente, los osteroblastos ya diferenciados sintetizan la

sustancia osteoide que llenará las zonas horadadas por los osteoclastos, para que después de

11 dias comience la fase de mineralización del osteoide, rellenando completamente la

cavidad aproximadamente entre 2-3 meses.

5. Fase de minerilización. Ocurre a los 30 días del depósito osteoide, finalizando a los 130

días en el hueso cortical y a los 90 para trabecular. Culminada esta etapa,comienza

nuevamente la fase quiescente.

Figura 21. Fases del remodelado óseo en la superficie del hueso trabecular. Origen y

localización de las células óseas. Evia [129].

57

Hipótesis

Las fibras de hidroxiapatia obtenidas por el proceso de electrospinning tomando

como precursor hueso de puerco, permitirá obtener estructuras con características de

porosidad y fibras imiten la regeneración ósea en una fractura inducida en huesos de

rata.

Objetivos

• Determinar los parámetros de proceso para la elaboración de fibras de hidroxiapatita

a través de electrospinnig.

• Caracterización química, morfológica de compuesto de nanofibras

• Evaluar las características de biocompatibilidad y degradación a través de un fluido

corporal simulado y en ratas .

58

2. MARCO TEORICO

La última década se ha caracterizado, por la aparición de una nueva clase de materiales

basados en especies orgánicas e inorgánicas combinadas en una escala nanométrica los

cuales han obtenido atención recientemente. Estos nuevos materiales, denominados

nanocompuestos o hibridos organico-inorganico, tienen la posibilidad de convertirse en el

nuevo material que tenga lo mejor de los dos mundos, la ventaja de un material orgánico

como peso ligero, flexibilidad y buena moldeabilidad y la alta resistencia mecánica, térmica

y química de los materiales inorgánicos.

En 2002 Shao et al [91], obtuvieron fibras de polivinil alcohol (PVA)/ sílice por medio de

la técnica de electrohilado. En este trabajo se investigaron sus propiedades físicas como

morfología, cristalinidad, grado de adherencia entre el material inorgánico y orgánico.

La investigación se enmarco dentro de un proyecto factible. Materiales económicos y

fáciles de conseguir. Mostrando las condiciones de operación del sistema de electrohilado.

Las técnicas utilizadas para caracterizar su composito fueron Microscopia Electrónica de

Barrido, Espectro Infrarrojo, Difracción de Rayos X y la Calorimetría Diferencial de

Barrido.

La conclusión más relevante de este trabajo es el análisis que hacen sobre la sensibilidad de

agua al momento de preparar el composito PVA/silica. Su estudio mostro el grado de

solubilidad e hinchazón de cada una de sus muestras preparadas. Determinaron que la

solubilidad del PVA disminuye por la adicion del compuesto organico y esta solubilidad

disminuyo drásticamente cuando el contenido de sílice se encontraba por encima del 34%

en peso de material inorgánico.

Este trabajo se relaciona con la investigación de Shao et al [91], con los parámetros de

carga del material inorgánico que en nuestro caso es la hidroxiapatia y el vehiculo utilizado

para realizar el electrohilado PVA.

59

En 2006 Jia et al [134] desarrollo fibras de pva con chitosan por el método de

electrospining, buscando producir una membrana con nanofibras de PVA/Chitosan donde

su aplicación más importante es utilizarlo como soldadura biomédica.

Estudio los efectos de la proporción de volumen del PVA al Chitosan analizando factores

como diámetro y morfología de las nanofibras. Asi como la influencia de los parámetros de

procesamiento en el aparato de electrospinnig.

En su trabajo realizo una serie de mezclas de PVA con Chitosan (3% al 30% en peso de

chitosan) caracterizándolas por las siguientes técnicas: Microscopia Electrónica de barrido

(SEM), Transformada de Fourier de Infrarrojo (FTIR), Rayos X (XRD) y Calorimetría

Diferencial de Barrido (DSC).

Sus resultados indicaron que el diámetro medio de la fibra disminuyo gradualmente con el

aumento en el contenido de Chitosan del 10% al 30%. Pon encima del 30% de Chitosan en

la mezcla, las nanofibras no se podían formar. De acuerdo con la morfologia una

concentración menor al 3% en Chitosan solo generó aglomerados, las formación de fibras

continuas empezaron a partir de concentraciones del 9%, sin embargo a partir de un 10% de

concentración de Chitosan el proceso de electospining fue más difícil por la alta viscosidad

de la solución. Los análisis FTIR y XRD demostraron que hay fuertes enlaces de hidrogeno

entre el Chitosan y el PVA. La Calorimétria Diferencial de Barrido mostró la

microestructura cristalina de la mezcla de PVA/Chitosan no se desarrolló bien en

comparación de las fibras que solo tienen PVA. Esto debido a que la mayoría de las

cadenas se encuentran en un estado no cristalino debido a la solidificación rápida del

material a causa del estiramiento de la solución que produce el electrospining.

La relación de este trabajo con el de Jia [134] nos ayudó a establecer las concentraciones de

soluto-solvente (Hidroxiapatita/ PVA). Garantizando la formación de estas en el aparato de

electrospining.

Ruksudajrit obtuvo nanohidroxiapatita a partir de hueso de bovino mediante el método de

molino de vibración. El hueso de bovino fue desproteinizado con agua caliente se calcino a

800°C durante 3 horas. El producto resultante lo trituro. El material triturado se sometió a

diferentes tiempos de molienda (2h, 4h y 8h). Caracterizó los polvos por Difracción de

60

Rayos X, Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM), Microscopia Electrónica de

Barrido (SEM) y Dispersión de Rayos X (EDS).

Determino que el método de molienda de vibración fue una ruta muy simple para la síntesis

de polvo nanocristalino de HAp a partir de hueso de bovino. Se encontró que el periodo

óptimo fue alrededor de 2-4 horas que puede separar y dispersar los cristales de HAp.

La aportación de Ruksudajrit en este trabajo fue los rangos de tiempo de residencia para la

molienda de alta energía para la reducción de tamaño de partícula la HAp tomando como

precursor al hueso de puerco.

Teng et al [135] proponen en el 2008 un método diferente para la producción de fibras de

hidroxiapatita tomando como vehículo de transporte al Colágeno. Si se ha informado de

que las propiedades de la solución tales como la viscosidad conductividad y la tensión

superficial, juegan un papel importante durante el proceso de electrospinnig para materiales

poliméricos. Así que Teng et al [135] propusieron que el estado del precursor sea una

emulsión, para que sea un factor básicamente significativo para la producción uniforme de

nanopartículas llena de fibras de polímero en este caso el Colágeno.

El método convencional, el precursor se presenta en polvo precipitado y secado, se utilizan

para mezclar con soluciones de polímero. Sin embargo, durante el proceso en seco, la

aglomeración entre las nanopartículas debido a su alta energía superficial, lo que sería

desventajoso para la dispersión de partículas en la solución de polímero. En su estudio,

propusieron preparar soluciones de compuestos homogéneos, tanto del precursor de HAp, y

Colágeno.

Las nanopartículas de HAp fueron preparados por un titulación simultanea de Ca(OH)2 y

H3PO4. Después de mezclado y un proceso de centrifugación y lavado posterior, el gel

precipitado se mezcla directamente con una solución de colágeno, seguido de agitación

continua durante 24 horas. El precursor de nanocompuesto resultante se dejó reposar hasta

varios días.

Se probaron distintas formulaciones se logró un 30% en peso de HAp, una concentración

muy alta con referencia a la literatura reportada entre un 10 y 12% en peso [134].

61

Las soluciones del material compuesto homogéneo fueron sometidas a un proceso de

electrospinnig, para formar fibras.

Las fibras preparadas tuvieron un diámetro de 60 nm, y los cristales de nanohidroxiapatia

fueron incrustadas en la matriz de colágeno sin ninguna aglomeración. El procedimiento

modificado demostró una mayor eficiencia en la preparación de nanofibras inorgánicas

uniformes con compuestos orgánicos en comparación al método convencional.

Parte de la aportación de este trabajo que se está presentando, es preparar la materia prima

de una manera natural a partir de hueso de puerco. Por lo que hay que considerar lo

publicado por Sobczak-Kupiec en 2011 [135]. Estudió el efecto de la temperatura de

calcinación y el contenido de CaO libre en la hidroxipatita de origen natural obtenida a

partir de huesos de cerdo mediante tres etapas: hidrólisis con aplicación de ácido láctico,

pre-calcinación a 600° y calcinación dentro de un rango de temperatura de 750-950°C. La

calcinación se llevó a cabo en un horno de cámara estacionaria calentado eléctricamente en

atmósfera de aire, en un horno rotatorio a escala de laboratorio equipado con un quemador

de gas.

La presencia de CaO en la hidroxiapatita diseñada para aplicaciones médicas no puede ser

aceptada. En contacto con moléculas de agua CaO, que se encuentra en la hidroxiapatita se

conviere en Ca(OH)2. Eso da a lugar a tensiones y grietas en el material cerámico

generando una fuerte alcalinidad en el entorno del implante. Este es problema de la

presencia de óxido de calcio en la HAp de origen animal es significativa con respecto a sus

aplicaciones como biomaterial. Sobczak-Kupiec et al investigaron el efecto de los

parámetros de calcinación en el calcio libre contenido en la hidroxiapatia obtenida a partir

de hueso de puerco.

Con este trabajo consideramos primordial calcular el contenido de CaO libre en la

producción natural de HAp a partir de fémur de hueso de puerco con técnicas como EDS o

DRX al momento de caracterizar nuestra materia prima.

62

3.-Metodología Experimental

Preparación de Materia Prima.

Como se mencionó anteriormente en este trabajo utilizamos como precursor de

hidroxipatita hueso de puerco, enfocándonos en el fémur de cerdo.

El fémur se hirvió en agua durante 5 horas, a fin de eliminar todos los tejidos suaves, grasa

y componentes externos. Limpio y seco el hueso, se sumerge por 24 horas en una solución

de H3PO4 17mg/100g . Después 2 horas en la estufa a 250°C. La inmersión en la solución

de H3PO4 y el tratamiento térmico en la estufa permite a la muestra hacerla quebradiza,

para que el hueso sea manipulado en los siguientes procesos

Después el hueso es sometido a un atricionador de baja velocidad donde se obtienen

astillas.

Los polvos obtenidos son secados a 250°C por 2.5h y sinterizada a 1050°C por 2.5h. El uso

de altas temperaturas nos garantiza un material seguro, idóneo para evitar cualquier tipo de

contaminación microbiana, la alta temperatura también ayuda a descomponer y volatizar

componentes orgánicos, proporcionando la cristalinidad característica de la HAp. Como lo

muestra la siguiente figura 22.

Figura 22.Digrama de flujo para la preparacion de los polvos de Hidroxipatita a

partir de femur de puerco.

63

En la figura 23 se puede ver claramente la diferencia en color y textura de astillas de hueso

con polvo de hidroxipatita despues a tratamiento térmico.

Figura 23 Imágenes de la materia prima de hueso a hidroxiapatita

Distribucion de Tamaño de Particula

La molienda de alta energía es el proceso que la partícula se fractura en pequeñas partículas

sin cambiar su estado de agregación. Además de obtener un tamaño específico de partícula

incrementa el área superficial e induce defectos dentro de su red cristalina que favorecen

regiones alta actividad [137].

Un tamaño de partícula adecuado permite la homogenización de la HAp dentro de la

solución de PVA (polivinil alcohol) y esto permite que la salida de la solución por el

orificio de aguja sea manera fluida en el electrospinnig.

Utilizando un molino de alta energía tipo Spex modelo M800. Se trabajó la HAp a

diferentes tiempos de residencia (1h, 2h, 3h). Figura 24.

Empleando como medio de molienda 3 bolas de acero inoxidable de 12.66 milímetros de

diámetro con un peso de 8.37 gramos, 3 bolas de acero inoxidable de 11.05 milímetros de

diámetro con un peso de 5.56 gramos. La carga al contenedor fue de 5 gramos de Hap.

64

Figura 24. Molino Alta Energía Spex modelo M8000.

Una vez terminado el tiempo de residencia en el molino de alta energía, la muestra se

limpia con una solución al 10% de HCl en agitación constante con el fin de eliminar trazas

de fierro provenientes de los medios de molienda. Se filtra con papel filtro y embudo, el

lodo se deja secar; obteniendo un polvo de HAp

Siguiendo la metodología descrita en la siguiente figura 25

Figura 25. Diagrama de flujo para el proceso de alta energía de la materia prima HAp

a partir de hueso de puerco.

Preparación de la solución de PVA.

El uso de polímeros naturales, se ve con particular interés ya que sus productos de

degradación pueden ser incorporados en formas de trayectorias metabólicas normales del

65

huésped evitando efectos secundarios. Al mismo tiempo, los polímeros naturales presentan

una excelente adhesión celular, la proliferación y diferenciación. [138]

EL PVA está aprobado para uso en diversas aplicaciones médicas incluyendo parches

transdérmicos, la preparación de jaleas que se secan rápidamente cuando se aplica sobre la

piel, y en formulaciones de comprimidos de liberación inmediata y sostenida. En soluciones

oftálmicas, como lágrimas sintéticas, contienen PVA ya que proporciona una buena

dispersión y revestimiento de sus propiedades. [139]

Se utilizó PVA de la marca J.T. Baker 99-99.8% Hidrolizado, con un peso molecular

promedio de MW= 77000 – 79000. En la disolución de PVA se debe de tener cuidado de no

formar grumos o una película delgada en la superficie del recipiente. Por ello se utilizó un

baño de agua caliente a la temperatura de 85°C bajo agitación constante y se consideró

disuelto cuando se obtuvo una solución transparente homogénea.

Se prepararon 60 ml de PVA a diferente porcentaje en peso con agitación constante a una

temperatura de 80°C adicionando 1 gramo de HAp.. Figura 26

66

Figura 26. Diagrama de proceso para la preparación de soluciones de PVA y HAp.

Se buscó la formación de una emulsión blanca, la cual posteriormente se aplicó en el

aparato de electrospining para formar las fibras. Figura 27

Figura 27.Solución del Compostito PVA/HAp

67

Preparación de fibras Composito de PVA/HAp

El proceso de electrohiladura permite obtener a partir de una emulsion de PVA/HAp, las

nanofibras en forma de velo recogido sobre un substrato de hoja de aluminio.

La solución se colocó en una jeringa con una aguja de acero inoxidable de calibre 9.

Utilizando el Equipo Nonobond Standar Untit NEU-01 China.

La instalación típica de electrohiladura consta de dos electrodos entre los que se aplica una

corriente de alto voltaje. En este caso, el electrodo superior es la aguja donde se encuentra

la solución polimerica con hidroxipatita. Por otro lado, el electrodo receptor, cargado con

signo contrario, se sitúa en la parte inferior de la máquina y se mantiene en contacto con el

substrato colector.

Los controles están disponible en la cara frontal del equipo, mientras que la unidad de alto

voltaje está situada en el interior de la máquina figura 28. Por último destacar que la cabina

de electrohiladura está sellada durante la marcha del equipo, y en ella se genera una

corriente de aire que mantiene la ventilación apropiada.

La estructura principal del equipo se distingue 3 partes bien diferenciadas:

Área de electrohiladura. Se compone de la cabina en la parte intermedia del equipo,

donde tiene lugar el proceso de electrohiladura y la formación sobre substrato del

velo de nanofibras.

Área de alimentación. Situada al costado derecho del equipo, se encuentran las

jeringas de alimentación de las soluciones poliméricas.

Parte Inferior se ubica el panel de mando exterior para el control de todos los

parámetros del proceso (velocidades, voltaje intensidad…), además del cableado e

instalación eléctrica interior.

68

Figura 28. Fotografías del equipo de electrohiladura Nonobond Standar Untit NEU-01

China a) Vista del panel de Control, b) Substrato Colector, c) Sistema de alimentación

de sustancias poliméricas, d) Otra perspectiva del sustrato colector.

El equipo dispone además de un sistema de descarga de electricidad de la cabina de

electrohiladura, la cual queda cargada de electricidad residual al terminar cada proceso.

El voltaje aplicado y la distancia entre la punta de aguja y el colector fueron 20KV y 15 cm

respectivamente. La velocidad de alimentación de la solución de HAp fue de 0.3 ml/hora.

Para conseguir el electrohilado de los velos de nanofibras se sigue el procedimiento

adjunto:

1.- Se prepara el substrato, la hoja de aluminio se debe de encontrar perfectamente

extendida.

2.- Se controlan las condiciones ambientales dentro de la cabina de electrohiladura.

3.-Se fijan las condiciones de alimentación de la solución polimérica.

4.- Se somete la alta tensión

69

5.- Una vez terminado el proceso de electrohilado se checa por seguridad que todo el

equipo este descargado.

Condiciones de operación para el proceso de electrohilado.

Parámetros

Voltaje 20 KV

Distancia aguja-colector 15 cm

Velocidad de flujo. 0.3 ml/hora

Tabla 1 Condiciones de operación del equipo de Electrohiladura.

Después de un tiempo de residencia de 30 minutos se obtienen un velo abundante de

nanofibras que se observan a simple vista, su textura es suave y se deshacen al tacto. Figura

29.

Figura 29. Velos de nanofibras composito de PVA/HAp

70

El diagrama de flujo muestra las técnicas de caracterización a las que se van a someter los

velos de PVA/HAp. Figura 30.

Figura 30 Diagrama de Proceso para elaboración de fibras de PVA/HAp.

Una vez de tener los velos de nanofibras se prepara la siguiente fase de pruebas biológicas

y evaluar la regeneración de hueso de rata.

Pruebas Biológicas.

Animales de Experimentación. Fueron seleccionadas 10 ratas Wistar (Rattus norvergicus

albinus) cuyo peso varió entre 180 y 200 gramos, las cuales fueron desparasitadas y

alojadas en una jaula durante 15 días, antes de la intervención quirúrgica con el propósito

de que se adaptaran.

Condiciones de Estabulación. La cirugía, mantenimiento y sacrificio de los animales se

realizó en el laboratorio de materiales en la Facultad de Odontología de la Universidad

Autónoma de Chihuahua, según los requisitos éticos y legales vigentes.

Las ratas fueron mantenidas en 2 jaulas cada quien según el grupo de estudio al que

pertenecían. Todas las ratas fueron mantenidas en las condiciones ambientales regladas

para estabulación de animales de laboratorio: 12 horas de luz y 12 de oscuridad, 20-24°C

de rango de temperatura y un grado de humedad relativa en el rango de 55±10%.

71

Normativas éticas y de bienestar. Todas las ratas utilizadas en el estudio recibieron un

trato digno, de acuerdo a la norma mexicana NOM-062-ZOO-1999.

Comité ético de bienestar animal. El estudio se obtuvo el permiso necesario para la

experimentación animal en el comité de experimentación bioética animal de la Facultad de

Medicina de la Universidad Autónoma de Chihuahua.

Ensayos In Vivo

Protocolo anestésico: para la intervención, cada rata fue anestesiada con una solución de

ketanina (Ketolar, 125mg/kg), diazepam (Valium, 10 mg/kg), y atropina (o.05 mg/Kg)

administrada por vía intrapertoneal. (0.5 ml de solución con 2 mg de ketamina). En caso de

precisar más tiempo quirúrgico se administran inyecciones de 0.1 ml de la misma solución.

Figura 31.

Figura 31. Protocolo anestésico

Protocolo analgésico. Tras la intervención cada individuo recibió una dosis profiláctica de

analgésicos y antibióticos: 5 mg de enroflaxicna (Baytril, 5-10 mg/kg) en dosis única por

via subcutánea.

Protocolo de cuidados posoperatorios. Se reintrodujo la dieta líquida a las 4 horas y

sólida pasadas 12 horas tras la cirugía. Durante la primera hora posoperatoria el espécimen

72

permaneció en una jaula asilada. Una vez recuperada y comprobando la estabilidad de sus

funciones vitales, la rata se introdujo con las otras de su mismo grupo. Figura 32.

Figura 32. Protocolo de cuidados posoperatorios.

Protocolo quirúrgico

Colocación del Xenoinjerto (Composito de PVA y Hap, nanofibras) induciendo fractura.

Con la rata en decúbito lateral se procede al rasurado y limpieza de la zona a operar. Se

realiza un abordaje sobre la cara lateral de la pata de la rata. El abordaje de los planos

musculares se realiza a través de las fascias sin necesidad de realizar ninguna sección

muscular que haría especialmente dolorosa la recuperación del animal. Se realiza una

osteotomía con una fractura continua diafisaria a unos 10 mm de la interlinea articular. Para

reproducir las condiciones fisiológicas de la fractura, esta se realizó mediante sierra de

Gillies, dejando como patrón de fractura una oblicua larga con mínima conminución. Se

introduce el material composito de nanofibras de PVA y HAp en la fractura inducida.

Posteriormente se procede al lavado de la superficie ósea con suero fisiológico y cierre por

plano de las heridas quirúrgicas, con material reabsorbible (Vicryl 3/0 para el plano

muscular y de 4/0 par tejido celular subcutáneo y piel). Figura 33.

73

Figura 33. Protocolo quirúrgico, a) Extracción, b) Inducción fractura c) Colocación

del composito de fibras de PVA con HAp

Cada intervención tuvo un tiempo de duración de aproximadamente 30 minutos.

Protocolo Eutanásico. Tras cumplir el tiempo determinado según el grupo, las ratas fueron

sacrificadas mediante una inyección intraperitoneal diluida en suero de 0.4 mg de

pentobarbital.

Método de obtención de muestras. Una vez sacrificadas, según el protocolo eutanásico, se

extrajeron las siguientes estructuras Figura 33.

1. Fémur

2. Tibia

Estas muestras fueron extraidas, para posteriormente limpiarlas de tejido muscular y

fijados en formaldehido al 10%, para poder ser deshidratados. Figura 34.

74

Figura 34. Método de Extracción de Muestra a) fémur control y b) fémur con fibras PVA y

HAp.

Ensayo In Vitro

Se siguieron los mismos protocolos descritos en la sección anterior, a excepción que el la

tibia y el fémur fueron sumergidos en Fluido Corporal Simulado dentro de una incubadora

a 37°C figura 35.

Para la preparación del fluido corporal simulado (SBF) se utilizó el protocolo publicado por

KoKubo et al. Tabla 2 [22].

75

Figura 35. Ensayo in vitro

Tabla 2. Reactivos con sus respectivas cantidades y pureza para la preparación de SBF

[22].

76

Figura 36. Resumen Esquemático de las pruebas de respuesta biológica al material

composito de fibras PVA-HAp.

Caracterización estructural y morfológica.

Se presentan las diferentes técnicas de caracterización, así como los detalles del protocolo

usado para la evaluación los materiales elaborados.

Análisis térmicos.

Se llevaron a cabo análisis Termogravimétrico (TGA) utilizando una atmósfera de gas

argón, calentando las muestras desde temperatura ambiente (25 ºC) hasta 800ºC, con una

rampa de 10 ºC / min utilizando crisoles de alúmina. Se utilizó el equipo TA SDT Q 600 de

la marca TA instruments.

La técnica consiste en registrar las pérdidas de peso de la muestra conforme se sigue un

programa de calentamiento.

77

Difracción de rayos X.

Se utilizó la técnica de difracción de rayos X de polvos para determinar la estructura de los

materiales. Se utilizó un difractómetro Panalytical modelo XPert PRO con detector X

Celerator y una radiación monocromática emitida por Cu Kα (λ = 1.5406 Ǻ). El ángulo

inicial fue de 2θ = 20º y el ángulo final de 80º, con un paso de 0.05º y iempo de 10 s,

voltaje = 40 kV y corriente de 30 mA. Los patrones fueron comparados con las cartas

cristalográficas de hidroxiapatita.

Microscopía electrónica de barrido y EDS.

Las micrografías obtenidas se realizaron con un microscopio electrónico de barrido

Jeol JSM5800-LV con filamento de tungsteno y con un microscopio de barrido de emisión

de campo Jeol JSM7401F. El porcentaje atómico elemental de los materiales se determinó

con el sistema de microanálisis EDX- mod DX. La preparación de las muestras consistió en

fijarlas sobre cinta de cobre. Las micrografías fueron tomadas utilizando diferentes voltajes

de aceleración y con diferentes distancias de trabajo (WD). Se utilizaron las señales de

electrones secundarios (SEI) y electrones retrodispersados (COMPO).

Microscopia de Fuerza Atómica

Las pruebas texturales de las fibras se analizaron mediante la técnica de microscopia de

fuerza atómica VEECO Instruments Multimode IVA .

La técnica de AFM se basa en el efecto piezoeléctrico inverso, que es un acoplamiento

lineal entre las propiedades eléctricas y mecánicas de un material. Es decir, cuando la

muestra se encuentre expuesta a un campo eléctrico, el material presentara cambios en sus

dimensiones. Por lo tanto, un microscopio de fuerza atómica es operado en modo contacto

con una tensión alterna aplicada en la punta.

La punta se mueve sobre la superficie de la muestra. El campo eléctrico generado en la

muestra, hace que los dominios con polarización paralela al campo eléctrico se expandan y

con polarización opuesta se contraigan.

78

Si el vector de polarización es perpendicular al campo eléctrico, no hay deformación

piezoeléctrica a lo largo de la dirección del campo, sino una deformación de corte, dando

lugar a desplazamientos de la superficie de la muestra paralelas a si misma a lo largo de la

dirección de la polarización.

La punta de la sonda al estar en contacto con estos desplazamientos, ocasiona movimientos

verticales o de torsión en el voladizo de AFM. La dirección de esta desviación depende de

la orientación del campo eléctrico y la polarización del dominio. En caso general, mediante

el análisis de las amplitudes y fases de las vibraciones de torsión o movimiento verticales

del voladizo se puede reconstruir las estructuras de los dominios de la muestra.

Tamaño de Partícula

El tamaño de partícula se mide mediante difracción laser para distintos tiempos de

residencia de 1, 2 y 3 horas en el SPEX 8000. El equipo utilizado fue Mastersizer 2000

Malvern Instruments.

79

4.- Resultados y Discusión

Polvos de Hidroxiapatita.

Antes de usar el polvo de hidroxiapatita para la preparación de los compositos de fibras se

realiza un análisis SEM/EDS a dichos polvos para determinar la relación Ca y P

determinado la relación estequiométrica nos indicará si el material es adecuado para

implantes y regeneración de hueso.

La figura 37 muestra la morfología de hueso de puerco previo al tratamiento térmico, se

puede observar una superficie rugosa sin evidencia del granos.

Figura 37 Micrografias SEM con Hueso de Puerco sin tratamiento térmico.

80

Se tomaron fotografías después del tratamiento térmico (temperatura de 1050°C) y se

observó partículas más limpias, aglomerados conformados por granos esféricos lisos,

evidencia de que se formó una estructura simétrica figura 38 Las micrográficas se tomaron

en un rango de 5000 a 15000 aumentos.

Figura 38 Micrografias SEM de Hueso de puerco con tratamiento térmico.

Mediante la dispersión de rayos X, usando el sistema acoplado al SEM, se analizó la

proporción de cada uno de los elementos. Las fotografías de la figura 39 muestran las

zonas donde se analizó la relación Ca/P.

Todas las mediciones se encuentran dentro del rango aceptable (1.30 a 1.80) un promedio

de 1.40, de acuerdo con la relación teórica de Ca/P de 1.67. Esto se debe a la naturaleza del

material, fémur de puerco, la alimentación y las condiciones de crianza del animal pueden

afectar la calidad mineral de sus huesos.

81

Figura 39 EDS de muestras de hueso de puerco después de tratamiento térmico.

Un análisis DRX confirma la presencia de hidroxipatita, en la figura 40 se muestra la

estructura de un hueso sin tratamiento térmico, se puede observar un material semi

amorfizado y una vez con el tratamiento térmico a 1050°C se refinan los picos

característicos de la HAp. El pico principal de la Hap a 2 = 31.67 corresponde al plano

(211), los picos secundarios de menor intensidad 2 = 32 y 2 = 33 pertenecen a los planos

(112) y (300) respectivamente y para confirmar la presencia de Hap este en el polvo, se

compara con la base de datos JCPDS file # 09-0432.

El CaO en un análisis de rayos X se ubica en la posición 32.34° 2 , JCPDS file # 37-1497;

la figura 26 muestra que en dicha posición 2 no hay pico, por lo tanto con la temperatura

de calcinación de 1050°C no hay formación de óxido de calcio en el material que se tomara

como materia prima para la fabricación del composito de HAp/PVA.

,

82

Tabla 3Relación Ca/P en polvo de hidroxipatia.

Figura 40.DRX Hueso de puerco e Hidroxipatita.

Para seguir con la fabricación del composito de nanofibras, fue necesario someter al polvo

de hidroxipatita a una molienda de alta energía con el fin de conseguir un tamaño adecuado

83

de particular para el polvo y garantizar así una mayor suspensión de hidroxiapatita dentro

de la solución de PVA.

La figura 41 muestra la distribución de partícula antes de la molienda la cual fue de ±

115.63 la molienda reduce el tamaño de partícula de ± 115. 63 a ±38.53 .

Podemos observar que el tamaño de partícula no cae drásticamente entre los tiempos

establecidos de residencia. Por lo tanto una 1 hora de molienda es un tiempo óptimo para

obtener un tamaño de partícula que facilite la operación del electrospinnig

Figura 41.Tamaño de Partícula polvo de Hidroxipatita.

84

Figura 42. DRX Polvos de hidroxipatita realizados después de la molienda de alta

energía.

Como se puede observar en la figura 42 la posición de los picos no cambia, solo la

intensidad de ellos, lo que indica que por la acción de la molienda de alta energía el

material se va amorfizando. Se determinó que el tiempo de molienda de alta energía para

los polvos será de 1 hora.

Composito de Nanofibras HAp/PVA.

En el proceso de obtención y deposición de los velos de nanofibras, mediante

electrohiladura sobre un substrato metálico, se distiguen tres variables con las que trabajar:

el sustrato colector, la disolución del polímero, precursora del velo de nanofibras y el

proceso de fabricación del velo de nanofibras.

Sustrato Colector: la influencia del susbtrato colector del velo de nanofibras en el proceso

de electrohiladura es determinante, hasta el punto que puede llegar a no tener lugar el

proceso si el substrato no reúne las condiciones adecuadas como colector de las nanofibras.

85

Disolución precursora del velo de nanofibras: este grupo de variables está relacionado con

la química del PVA y más concretamente con su solubilidad en agua, ya que es condición

indispensable conseguir disolver el polímero para obtener velos de nanofibras de dicho

polímero. El proceso de disolución del polímero lleva asociado el estudio de las

condiciones de concentración y viscosidad.

Proceso de Electrohiladura: en el proceso de electrohiladura intervienen principalmente

cuatro variables; la intensidad de voltaje aplicado, velocidad de alimentación de la

disolución, la distancia entre electrodos y la velocidad de paso del substrato colector. No

obstante en el presente trabajo se establecen como fijas: la intensidad del voltaje aplicado,

velocidad de alimentación y la distancia de los electrodos.

Efecto de la concentración de PVA sobre los parámetros de la disolución

En este apartado se procede a evaluar la influencia de la incorporación de diferentes

cantidades de PVA a la disolución. Para la caracterización de la disolución precursora del

velo de nanofibras se realizan pruebas de viscosidad.

Se realizaron el estudio de dos concentraciones diferentes, las cuales van a permitir

observar la tendencia de la influencia de cada variable.

86

Figura 43. Viscosidad de PVA en función de la concentración.

La figura 43se representa la tendencia de la viscosidad en función de la concentración para

una concentración del 10% PVA se tuvo en promedio 276 cps y 15% de PVA con un

promedio de 374 cps.

Una vez determinada la viscosidad más adelante se observará el efecto de la concentración

para suspender polvo de hidroxiapatia.

Efecto de la concentración de PVA sobre la producción de nanofibras.

Una vez estudiado y caracterizado el efecto que la concentración del polímero ejerce sobre

los parámetros de la disolución precursora del velo de nanofibras, en este apartado, se lleva

a cabo el estudio dela influencia que este mismo parámetro ejerce sobre los velos

electrohilados.

Antes de empezar a exponer el estudio y caracterización de los velos de nanofibras, es

necesario presentar el resto de los parámetros que intervienen en el proceso de

electrohiladura para la obtención de dichos velos.

Hay que tener en cuenta, las condiciones ambientales de humedad y temperatura así como

la temperatura propia de la disolución las cuales se muestran en la tabla 4

87

Referencia Temperatura de

Disolución

Temperatura de

Operación

Humedad %

Solución 10%

PVA

80°C

25°C 22

Solucion 15%

PVA

80°C 25°C 22

Tabla 4 Parámetros de temperatura y humedad de la solución precursora de electrohilado.

El resto de las variables que intervienen en el electrohilado de los velos de nanofibras,

corresponden a los parámetros del propio proceso; voltaje, intensidad, distancia entre

electrodos, flujo de alimentación de la disolución. Todos estos parámetros se muestran en la

tabla 5, para cada una de las concentraciones de PVA estudiadas.

Referencia Voltaje Distancia aguja-colector Velocidad de flujo

Solución 10%

PVA

20 KV

15 cm 0.3 ml/hora

Solucion 15%

PVA

20KV 15 cm 0.3 ml/hora

Tabla 5 Parámetros de operación del equipo de electrohilado para solucione con 10% PVA

y 15% de PVA

88

Caracterización Identificación

Una manera de asegurar la formación del composito a los velos de nanofibras fue

realizando un análisis de rayos X tomando como referencia el polvo de hidroxipatita y una

muestra donde solo se electrohilo una solución de PVA al 10 % en peso

Figura 44 DRX Composito de nanofibras.

El patrón de XRD de las fibras compuestas revelo los picos característicos tanto de la HAp

como el PVA Figura 44. La ampliación la superposición de los picos de difracción se

atribuyó a la cristalinidad y el tamaño de cristales de HAp Sin embargo, el grado de

cristalinidad de HAp en las fibras compuestas permaneció sin cambios con respecto a la del

polvo de HAp que sirvió como materia prima

Caracterización Térmica

La caracterización térmica de los velos se lleva a cabo con el fin de conocer la carga de

HAp de los velos y como ésta se ve modificada con la variación de las diferentes variables

89

que entran en juego en el proceso de electrohiladura, incluyendo las variables asociadas a la

disolución de partida. Durante el proceso de electrohilado y debido al estiramiento que

sufre el polímero en el vuelo entre electrodo y electrodo, tiene lugar cierto grado de

ordenación de las cadenas poliméricas.

Se muestran las curvas calométricas del TGA de los velos electrohilados, para cada una

delas concentraciones de polímeros de PVA estudiadas. Figura 45

Figura 45 Termograma de las nanofibras composito HAp/PVA

La medición se realizó hasta la temperatura de 700°C. El termograma muestra que la mayor

concentración de PVA puede suspender más cantidad de HAp. La solución de 15% de PVA

deja una carga de 15% sólidos en el composito.

Caracterización Microscópica

Mediante la caracterización microscópica se llevará a cabo el estudio de la morfología de

los velos, las caracterización del diámetro de las nanofibras y la caracterización dela

topografía y rugosidad de la superficie de los mismos.

90

El estudio dela morfología de los velos se llevó a cabo mediante microscopía electrónica de

barrido (SEM). Se estudian los velos de nanofibras a 5000 hasta 300000 aumentos. Al

analizar los velos a menores aumentos, se examina el conjunto del velo, su homogeneidad y

morfología identificando la aparición de agujeros y macroagregados de mayor tamaño. El

estudio a mayores aumentos permite conocer al detalle la estructura que forman las

nanofibras y sus imperfecciones.

Para empezar elaboraron nanofibras de PVA a 10 y 15% en peso con el fin de tener un

patrón en blanco de la conformación del velo del composito.

Tanto la concentración de 10% y 15 % en peso de PVA presentaron nanofibras

perfectamente definidas aunque en un 15% de peso de PVA la cantidad de fibras es mayor.

La morfología de los velos es homogénea. Se observan agregados de polímero debido a que

las nanofibras de polímero no llegan secas al substrato colector, sino que arrastran parte del

agua de la disolución precursora, por lo que acaban disolviéndose y uniéndose unas con

otras. Figura 46.

Figura 46 Micrografias SEM de nanofibras al 10% de PVA

91

Con una concentración de 15% en peso se presentó una morfología bastante homogénea,

sin agujeros y con nanofibras perfectamente perfiladas, ausencia de agregados de polímero.

Figura 47

Figura 47 Micrografias SEM con 15% de PVA

Se tomaron fotografías de los compositos de HAp/PVA a 10% y 15% en peso. El objetivo

es observar que tanta cantidad de polvo de HAp se logró suspender dentro de las fibras de

PVA. Las fotografías muestran figura 48 y figura 49muestran fibras con 10% de PVA en

peso perfectamente perfiladas y con inscrustaciones de HAp dentro del entramado de la

fibra. Aunque se ve muy poca cantidad de HAp en el composito.

Un mapeo figura 50 confirma la presencia de elementos Ca y P dentro de la red de fibras.

92

Figura 48 Micrografias SEM compostio HAp/PVA con 10% en peso. a) y b) imágenes

a 10,000 aumentos, c) y d) imágenes a 15,000 aumentos.

93

Figura 49 Micrografias SEM compostio HAp/PVA con 10% en peso. a) imagen a

27,000 aumentos , b) y c) imágenes a 30000 aumentos

94

Figura 50 Mapeo de composito de HAp/PVA.

95

Caracterización de la topografía y rugosidad de la superficie de los velos

del composito de nanofibras.

La segunda parte dela caracterización microscópica se lleva a cabo mediante AFM, esta

técnica de análisis completa la información obtenida a partir del SEM, ya que permite el

estudio de la topografía y rugosidad de la superficie de los velos de nanofibras. El perfil de

rugosidades se ha seleccionado evitando en la medida de lo posible la imperfecciones, ya

sean agujeros o del tipo macroagregados de polímero.

Las imágenes de AFM, confirman lo observado y comentado en las imágenes del SEM a

diferentes aumentos. Las imágenes de las concentraciones de 10% de PVA y 15% PVA en

los compositos de HAp mostraron una superficie bastante homogéneas, sin porosidades en

su fabricación. Figura 51

Figura 51. Imagen de composito HAp/PVA al 10% en peso y perfil de rugosidades. La

línea indica el perfil seleccionado.

96

La figura 52 presenta la topografía de las fibras al 15% de PVA donde también las

nanofibras no presentaron ningún defecto como poros o aglomerados en su fabricación.

Figura 52. Imagen de composito HAp/PVA al 15% en peso y perfil de rugosidades. La

línea indica el perfil seleccionado.

La muestra del composito de HAp con 15% de PVA, fue le velo mejor procesado, según las

imágenes durante el proceso de caracterización, por lo que a partir del AFM se concluye

que es la muestra en las nanofibras están mejor perfiladas.

Caracterización del diámetro de las Nanofibras.

Para la caracterización y medida del diámetro del diámetro de las nanofibras se tomaron

entre 15 y 20 medidas de diámetros de nanofibras. Para cada una de las microfotografías de

los velos de las nanofibras entre 10,000 y 15,000 aumentos, evitando las imperfecciones,

agujeros y agregados de polímero y centrándose únicamente en aquellas zonas en las que se

observa un enmarañado de nanofibras más o menos regular.

Para la primera muestra referenciada nanofibras PVA al 15% debido a que se mostró una

mayor cantidad de agregados de hidroxiapatita suspendidos en las fibras. En la micrografía

correspondiente a la condición de 15% de PVA figura 53, muestran nanofibras muy bien

perfiladas, de hecho el histograma de frecuencias muestra que la mayoría de los diámetros

se encuentran entre 302 y 344 nanómetros. En la micrografía de fibras de solo polímero

97

PVA figura 54, donde también se observan fibras bien perfiladas se encuentran diámetros

medios entre 243 y 273 nanómetros.

Figura 53. a) Imagen SEM fibras composito PVA-HAp 15%, b) Histograma de

frecuencias diámetros de fibra.

Figura 54. a) Imagen SEM fibras PVA, b) Histograma de frecuencias diámetros de

fibra

Aunque estudios anteriores registran que a mayor conductividad de la disolución de

polímero, mayor facilidad presenta la solución de cargarse y formar finas fibras de

polímero [140]. En este caso el agregar partículas de un cerámico, en este caso

Hidroxiapatita aumentan el diámetro de fibra, es el efecto de la formación del composito.

98

Caracterización de la respuesta biológica del composito de nanofibras

PVA-HAp.

Pruebas in Vivo Caracterización Microscópica.

De acuerdo con lo mencionado en el aparatado de metodología, las pruebas in vitro como in

vivo se registraron a los 7 y 21 días. Primeramente tenemos los resultados evaluados en la

prueba in vivo. La figura 55 muestra los primeros 7 días del composito en el hueso, llevado

a condiciones artificiales en la incubadora bajo fluido corporal simulado.

Figura 55. Imagen SEM Prueba in vivo 7 días, a) control,b) hueso con compositos de

nanofibras PVA-HAp

Se puede observar que no existe rechazo, ni desprendimiento del material, así que esta

primera fase de la prueba nos confirma que el material huésped es perfectamente

biocompatible con su anfitrión el hueso de rata.

Veintiún días después, se realizaron los siguientes análisis SEM para mostrar el progreso

del composito en el hueso. Las imágenes de la figura 56 y 57 revelan que el acoplamiento

de las fibras con el hueso de rata fue exitoso, de hecho en la figura 58 una imagen con

acercamiento se puede observar la regeneración de material óseo sobre la superficie de las

fibras.

99

Figura 56 Imagen SEM pruebas in vitro 21 días, a) Control, b) hueso de rata.

Figura 57 Imagen SEM por electrones retrodispersados de las pruebas in vitro 21

días, a) Control, b) hueso de rata.

100

Figura 58 Imagen SEM pruebas in vitro 21 días.

Pruebas in vivo

Después de la intervención quirúrgica en la rata wistar, se realizaron evaluaciones clínicas

de las pruebas in vivo. Las variables evaluadas durante todo el experimento comprendieron:

dolor, inflamación, edema, fistulas y dehiscencia.

Ninguna rata mostró complicaciones postoperatorias, la reacción inflamatoria

postquirúrgica fue normal, no se observaron cambios de salud en los animales. No se

presentaron signos de rechazo o infección en los sitios del implante, así como movimiento

del mismo. Por lo que se puede decir que los implantes fueron clínicamente tolerados por

las ratas ver figura 59.

Figura 59 Evaluación Clínica de ratas wistar, después de la colocación del nanocomposito.

101

Caracterización Microscópica. Prueba in vivo 7 días.

Se realizaron imágenes SEM para evaluar la respuesta biología del composito de PVA-HAp

el primer juego de muestras se extrajeron 7 días después de la operación. En la figura 60 se

puede observar a simple vista la rasgadura que se indujo sobre el hueso así como la

colocación del velo de nanofibras sobre dicha incisión.

Figura 60. Imágenes de la extracción del fémur de la rata wistar después de 7 días, a)

Fémur con composito recuadro negro área de incisión y colocación del implante, b)

acercamiento a la región de acción del composito de fibras.

A simple vista se puede ver una herida cerrada y con un acoplamiento entre el hueso y el

composito de fibras de PVA/HAp.

Para observar con más detalle el comportamiento de las nanofibras bajo condiciones in

vivo, se realizaron pruebas en microscopio electrónico de barrio y así no perder de vista la

respuesta del material dentro de la rata. Y si hay evidencia de una consolidación ósea

primaria. Fin de la fase reactiva, las células van muriendo [141] los fibroblastos sobreviven

y comienzan a multiplicarse formado un agregado celular que, junto pequeños vasos

sanguíneos, forman el tejido granular [141].

A siete días de interacción a 20000 aumentos podemos observar la formación de un callo

óseo inmaduro en la tibia figura 61 como en el fémur figura 62.

102

Figura 61. Imágenes SEM, a) Control hueso de rata tibia a 7 días prueba in vivo, b)

Hueso de rata tibia con fibras PVA-HAp 15%

Figura 62. Imágenes SEM, a) Control hueso de rata fémur a 7 días prueba in vivo, b)

Hueso de rata fémur con fibras PVA-HAp 15%

103

Imágenes tomadas a mayores aumentos, 75000 aumentos la integración de las fibras fue

favorable, se pueden ver indicios de osteointegración un buen indicador para la siguiente

fase de consolidación: la formación de un callo maduro en hueso de rata. Figura 63.

Figura 63. Imágenes SEM, a) Fibras de PVA-HAp 15%, b) acercamiento 6500000

aumentos de la misma zona.

Caracterización Microscópica. Prueba in vivo 21 días.

A 21 días de pruebas por medio de la microscopia se observó el inicio de la formación de

un callo óseo maduro. El abultamiento de tejido fibrocartilaginoso termina cerrando la

fractura y mineralización [141]. A 20000 aumentos figura 64

104

Figura 64. Imágenes SEM, a) Control hueso de rata, b) Hueso de rata con fibras de

PVA-HAp

Imágenes SEM a 1500000 aumentos muestran la integración del composito y formación de

un callo maduro en el hueso de la rata figura 65.

Figura 65. Imágenes SEM, a 1500000 aumentos hueso de rata con fibras PVA-HAp

15%

.

105

Mecanismo de regeneración

La cinética de reabsorción de la HAp es puede ser modulada por parámetros texturales

como

o El área superficial disponible; orden descendente de reactividad: polvo> solido

poroso> sólido compacto

o El tamaño de los cristales que conforman el material; menor tamaño mayor

rectividad

o El contenido de imperfecciones de la celda cristalina; mayor número de

imperfecciones y vacantes más reactivo.

La principal propiedad de la HAp como material de regeneración de lesiones óseas no es

probablemente su similitud composicional con la fase mineral ósea, ni su susceptibilidad de

ser reabsorbida por el organismo. Su característica más importante es la bioactividad [142].

La bioactividad se define como la capacidad de un material para unirse a través de un

enlace directo con el tejido óseo que lo rodea. Por lo tanto, un material bioactivo crea un

microambiente compatible con la osteogénesis [143,144]. In vitro la bioactividad se

determina por la formación de una capa o película apatitica sobre la superficie del material

cuando es sumergido en el fluido fisiológico simulado (SBF)[] y el mismo comportamiento

fue observado en las pruebas in vivo.

Se propone que este mecanismo de formación de la capa apatitica está dominado por la

teoría clásica de la nucleación, de tal forma que tanto el incremento de la concentración

iónica local, como la disminución de la energía superficial de la HAp, producirá un mayor

número de núcleos que espontáneamente crecerán sobre la superficie. Debido a que

estamos trabajando con un HAp no estequiometria por la tanto más reactiva.

La figura 66 muestra de manera gráfica el mecanismo propueto.

106

Figura 66. Mecanismo propuesto de regeneración en el hueso de rata cepa wistar.

Por lo tanto el mecanismo controlante de regeneración está controlado por mecanismos de

transporte como la difusión de los iones en la superficie de HAp de puerco o factores

termodinámicos como la saturación local de iones en el SBF o en fluido corporal de la rata.

Los diferentes componentes tanto en la fase líquida como en la sólida, pueden modificar la

cinética de la reacción, originando diferentes morfologías de los cristales precipitados y por

lo tanto diferentes propiedades del material.

107

5.- Conclusiones

Se fabricaron por Electrohilado fibras compuestas PVA / HAp.

La hidroxiapatita se obtuvo a partir de un precursor natural hueso de cerdo.

Se estudió y evaluó el efecto de la concentración de PVA sobre la morfología y la

cantidad de partículas HAp dispersadas en las fibras compuestas PVA / HAp .A una

concentración de PVA al 15%, se obtuvo una mejor dispersión de partículas de

HAp, en comparación con la encontrada para la concentración de PVA al 10%.

Los resultados indicaron que, cuando se comparan entre sí, el diámetro medio de las

fibras de electrohilado PVA y las fibras compuestas electrohilado PVA / HAp

formadas no cambia significativamente

Pruebas Biológicos: Esta técnica es conocida como Xenoinjerto, en el cual se toma

material ajeno al huésped y se evalúa su integración ósea fenómenos de

ontogénesis, ortoclasa y osteoconductivdad

En los experimentos in vitro en suero corporal simulado se logró la integración de

las fibras, obteniendo resultados positivos que favorecen la estimulación de la

actividad osteoplastia en hueso de rata

El composito de PVA con HAp a partir de hueso de puerco ha demostrado ser una

opción viable para la regeneración de hueso.

Se propone un mecanismo simple de regeneración de hueso

108

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