Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección … · 2013-10-16 · Desarrollo y...

VII Edición del Máster en Gestión Sostenible y Tecnologías del Agua

Trabajo fin de máster:

Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR de Legionella spp. en muestras ambientales

Autora: Nuria Ferrando Monllor

Tutor: Pedró José Varó Galvañ

Alicante, Septiembre de 2013

CERTIFICADO “D. PEDRO JOSÉ VARÓ GALVAÑ, Profesor del Departamento de I.U. AGUA Y CIENCIAS AMBIENTALES, Certifica que el presente Trabajo Fin de Master titulado “Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR de Legionella spp. en muestras ambientales.” ha sido realizado en la empresa LABAQUA. S.A bajo mi supervisión, por Dña. NURIA FERRANDO MONLLOR, y que reúne las condiciones de calidad y rigor científico para que pueda ser presentado y defendido ante la Comisión correspondiente”.

Alicante, 16 de septiembre de 2013

Mi más sincero agradecimiento a la empresa LABAQUA S.A por permitirme realizar este trabajo en sus instalaciones, y especialmente a Ana, Victoria, Carlos, Israel, Alicia, Lorena y Jose del Departamento de Microbiología por su ayuda durante todo el proyecto, a Carmen por compartir conmigo sus conocimientos de Biología Molecular y sobre todo a Adela por guiarme en este trabajo, por su paciencia y la dedicación de ese tiempo que no tenía.

ÍNDICE

1. RESUMEN…………………………………………………………………………..1

2. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………..............3

2.1 Importancia de su estudio………………………………………….............3

2.2 Aspectos clínicos……………………………………………………............4

2.2.1 Sintomatología de la enfermedad…………………….....................4

2.2.1.1 Fiebre de Pontiac……………………………………………..4

2.2.1.2 Neumonía por Legionella o enfermedad del Legionario…………………………………………………......4

2.2.2 Grupos de riesgo……………………………………………………....5

2.2.3 Vías de transmisión…………………………………………..............5

2.2.4 Tratamiento de la neumonía por Legionella pneumophila……......5

2.3 Ecología del microorganismo…………………………………………….…6

2.3.1 El reservorio medioambiental……………………………………….6

2.3.2 Acceso a redes internas y proliferación en ambientes determinados…………………………………………………….…...6

2.4 Métodos de detección tradicionales……………………………………..…7

2.5 Métodos de detección basados en biología molecular………….…….….9

2.6 Validación de métodos: Normas ISO relacionadas con Legionella……………………………………………………………………12

2.6.1 Normas ISO para el cultivo de Legionella………………………...13

2.6.2 Normas ISO para la detección por qPCR de Legionella………..13

2.7 Legislación, prevención y control de la legionelosis…………………….13

3. OBJETO Y ALCANCE DEL TRABAJO………………………………………..16

4. PROCEDIMIENTO………………………………………………………………..17

4.1 Búsqueda de secuencias específicas de género: Diseño de cebadores y sondas………………………………………………………..17

4.2 Cultivo de cepas bacterianas………………………………………………19

4.3 Extracción y purificación de DNA………………………………………….23

4.4 Cálculo de la concentración de DNA……………………………………...24

4.5 Condiciones de la reacción de qPCR……………………………………..24

4.6 Diseño y construcción del patrón interno…………………………………27

4.7 Diseño de validación: Parámetros de validación………………………...30

4.8 Procesado de muestras naturales………………………………………...31

4.8.1 Preparación de la muestra…………………………………………...31

4.8.2 Concentración de la muestra………………………………….……..32

4.8.3 Eliminación de inhibidores…………………………………………...33

4.8.4 Amplificación…………………………………………………………..33

5. RESULTADOS…………………………………………………………………….34

5.1 Conceptos estadísticos……………………………………………………..34

5.2 Optimización de las condiciones de amplificación y optimización del patrón interno………………………………………………………………..35

5.3 Estudio de especificidad, sensibilidad, falsos positivos y falsos negativos…………………………………………………………………….36

5.4 Límite de detección y límite de cuantificación…………………………...38

5.5 Curva estándar y eficiencia de la reacción……………………………….40

5.6 Reproducibilidad y repetitividad……………………………………………41

5.7 Cuadro resumen de validación…………………………………………….42

5.8 Aplicación del diseño en muestras naturales y comparación con el método tradicional de cultivo…………………………………………...….43

6. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES……………………………………………….44

7. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………..………….48

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 4.1. Parámetros establecidos en el programa Primer Express para el diseño de cebadores y sondas para experimentos de detección mediante sondas TaqMan……………………………………………..18

Tabla 4.2. Cebadores y sonda diseñados para la amplificación específica del género Legionella por qPCR………………………………………….19

Tabla 4.3. Cepas bacterianas analizadas en este estudio……………….…….20

Tabla 4.4. Temperatura de incubación y medios de cultivo utilizados para el aislamiento de cepas bacterianas de otros géneros……………….22

Tabla 4.5. Mezcla de reacción para la amplificación de Legionella spp………25

Tabla 4.6. Programa de la amplificación por qPCR para el análisis de muestras…………………………………………………………………26

Tabla 4.7. Cebadores para la síntesis del patrón interno……………………….28

Tabla 4.8. Programa de amplificación por PCR para la construcción del patrón interno……………………………………………………………………28

Tabla 4.9. Reactivos para la amplificación por PCR para la construcción del patrón interno…………………………………………………………...28

Tabla 4.10. Mezcla de reacción para la amplificación de Legionella spp……...34

Tabla 5.1. Optimización de la concentración de cebadores…………………...35

Tabla 5.2. Optimización de la concentración de patrón interno (IPC)………...36

Tabla 5.3. Cebadores y sondas diseñados para la amplificación específica del género Legionella por qPCR…………………………………………36

Tabla 5.4. Generación de los conceptos VP, FP, VN y FN…………………….37

Tabla 5.5. Análisis de la especificidad y la sensibilidad de los cebadores y la sonda…………………………………………………………………….37

Tabla 5.6. Clasificación de los resultados VP, FP, VN y FN…………………...38

Tabla 5.7. Fórmulas y resultados de la sensibilidad, especificidad, falsos positivos y falsos negativos de los cebadores y la sonda…….…...38

Tabla 5.8. Límite de detección del método de qPCR…………………………..39

Tabla 5.9. Reproducibilidad y repetitividad del gen rDNA 16S en qPCR……42

Tabla 5.10. Resumen de la validación…………………………………….………42

Tabla 5.11. Comparación de la detección de Legionella spp. por cultivo tradicional y qPCR para muestras de agua de torre de refrigeración……………………………………………………….……44

Tabla 5.12. Comparación de la detección de Legionella spp. por cultivo tradicional y qPCR para muestras de agua potable…………….….44

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 2.1. Fotografía en microscopio de barrido de la bacteria Legionella…..3

Figura 2.2. Medio BCYE específico para el cultivo de Legionella……………...8

Figura 2.3. Etapas de la PCR………………………………………………………9

Figura 2.4. Etapas de la electroforesis horizontal en gel de agarosa………...10

Figura 2.5. Etapas para la emisión de fluorescencia en las sondas………….12

Figura 2.6. Esquema de las posibilidades de desarrollo de Legionella a diferentes temperaturas y en diferentes instalaciones…………...14

Figura 4.1. Estudio de especificidad teórica de Legionella mediante BLAST 17

Figura 4.2. Ejemplo de diseño de cebadores y sondas para la detección de Legionella, obtenida con el programa Primer Express…………..18

Figura 4.3. Bloque térmico utilizado en este trabajo…………………………...23

Figura 4.4. Bio-espectrofotómetro utilizado en este trabajo…………………..24

Figura 4.5. Reactivos y detector para la qPCR…………………………………25

Figura 4.6. Ejemplo de una curva de reacción…………………………….…...26

Figura 4.7. Perfil térmico y procesos de la amplificación………………….…..27

Figura 4.8. Procedimiento para la preparación del gel de agarosa……….….29

Figura 4.9. Fragmentos híbridos visualizados en el gel de agarosa………....29

Figura 4.10. Diagrama ilustrativo de la construcción de patrones internos…...30

Figura 4.11. Sistema de filtración por membrana………………………………..32

Figura 4.12. Cartucho filtrante Amicon Ultra-15 (Millipore) empleado para la concentración de muestras biológicas………………………….….32

Figura 4.13. Procedimiento de purificación de DNA……………………………..33

Figura 5.1. Recta de calibrado de Legionella pneumophila……………….…..40

Figura 5.2. Recta estándar del gen rDNA 16S de Legionella spp……………41

GLOSARIO DE TÉRMINOS

Alineamiento: Término de bioinformática, que consiste en representar y comparar dos o varias secuencias o cadenas de DNA, RNA o estructuras primarias de proteínas para destacar sus zonas de similitud, que podrían indicar relaciones funcionales o evolutivas.

Amplicón: Fragmento de DNA sintetizado mediante técnicas de amplificación.

Cebador: Secuencia corta de ácido nucleico que forma pares de bases complementarios a una hebra molde y actúa como punto de partida para la replicación del DNA.

Cepa: En microbiología, variante genética o subtipo de un microorganismo.

Electroforesis en gel: Técnica consistente en la separación de moléculas por propiedades como el tamaño, forma o punto isoeléctrico según su movilidad en un campo eléctrico.

Fagocito: Células presentes en la sangre y otros tejidos, capaces de captar microorganismos y restos celulares, introduciéndolos en su interior para eliminarlos en un proceso llamado fagocitosis.

Gen ribosómico rDNA 16S: Sección de DNA procariótico encontrado en las bacterias y arqueas.

G + C: Porcentaje de bases nitrogenadas en una molécula de DNA que son guanina y citosina.

ISO 17025: Norma internacional, aplicada a las empresas que realizan ensayos y/o calibraciones. Asegura la calidad de los procesos desarrollados.

Máster Mix: Reactivos de la PCR, que proporciona un ambiente químico adecuado para una óptima actividad y estabilidad de la DNA polimerasa.

Morbilidad: Dato estadístico, definido como la cantidad de individuos considerados enfermos y víctimas de una enfermedad en un espacio y tiempo determinados.

Plásmido: DNA linear o circular de doble cadena que es capaz de replicarse independientemente del DNA cromosómico.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): Técnica de biología molecular consistente en la amplificación in vitro de múltiples copias de un fragmento de DNA o RNA específico.

PCR Cuantitativa (qPCR): Variante de la PCR convencional, capaz de amplificar y cuantificar mediante fluorescencia el producto de amplificación de DNA en tiempo real.

Taq. Polimerasa: Enzima sintetizada por la bacteria Thermus aquaticus, capaz de soportar elevadas condiciones de temperatura (95 ºC). Es un tipo de DNA polimerasa que se utiliza en las técnicas de PCR.

Temperatura de anillamiento (Ta): Temperatura a la cual el cebador se unirá a la secuencia de DNA molde.

Temperatura de fusión (Tm): Temperatura en la cual la mitad del dúplex de DNA se disociará y pasará a ser de una sola hebra. Es un indicador de la estabilidad de la doble cadena.

Serogrupo: Clasificación de un microorganismo según los antígenos que presenta en su superficie celular.

Sonda: En biología molecular, se trata de un fragmento de DNA de pequeño tamaño utilizado para detectar la presencia de DNA o RNA de una secuencia complementaria. En la qPCR se encuentran marcadas mediante fluorescencia.


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1. RESUMEN

La enfermedad del legionario, caracterizada por presentar severas neumonías, es una patología causada por la bacteria Legionella, cuyas repercusiones sanitarias y socioeconómicas han provocado que su vigilancia y control esté en aumento los últimos años. Encontrándose de forma natural en el medio ambiente, Legionella puede incorporarse en diversas instalaciones que requieran agua, causando infecciones debido a la proliferación de la bacteria en lugares que reúnan las condiciones óptimas para ello. Por este motivo, se ha llevado a cabo la creación de normas y decretos con el objetivo de prevenir y controlar los brotes de legionelosis, así como tratamientos para su erradicación. Esta necesidad de control, requiere del desarrollo de métodos de detección rápidos y precisos. Durante muchos años el cultivo en medio selectivo ha sido la técnica más utilizada, pero el elevado tiempo de incubación debido a la baja tasa de crecimiento de la bacteria, la imposibilidad de detectar las colonias viables no cultivables y la dificultad de su aislamiento en muestras con una elevada contaminación, han hecho que se precise de otras metodologías más rápidas y eficaces. Los avances en el campo de la tecnología de ácidos nucleicos han permitido la detección de Legionella utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), permitiendo la amplificación de múltiples copias de un fragmento de DNA o RNA. Sin embargo surge el problema de ser una técnica cualitativa, que sólo informa de la presencia o ausencia de la bacteria y no de su cantidad. Es por ello que en este trabajo, se ha desarrollado y validado un nuevo método de detección de Legionella en muestras ambientales por la amplificación del gen rDNA 16S utilizando la metodología de la PCR cuantitativa “a tiempo real” basada en el empleo de sondas fluorescentes, que nos permitirá conocer la carga bacteriana presente en las muestras de agua. Para ello se diseñaron cebadores y sondas que amplificaban simultáneamente un fragmento de 386 pares de bases del gen rDNA 16S de Legionella y un fragmento recombinante que incluía una secuencia específica del gen gyrB de Aeromonas hydrophila como control interno positivo. En el proceso de validación, se analizó la especificidad y la sensibilidad de los cebadores y sondas, las cuales amplificaron solamente las cepas de Legionella spp. pero ninguna otra especie bacteriana de las 28 que se ensayaron. El límite de detección fue establecido en un valor mínimo de 25 copias en 10 µL de muestra y el límite de cuantificación en 32.38 copias. Se construyó una recta robusta estándar para la cuantificación de las muestras analizadas y el ensayo mostró un rango lineal de 6-log10 y una eficiencia de la reacción que obtuvo un valor de 1. Por último la repetitividad presentó unos valores de coeficiente de variación (CV) en los Ct y número de copias de 1.08% y 46.08% respectivamente, y la reproducibilidad valores de coeficiente de variación (CV) de 1.19% y 20.19%. Finalmente para demostrar la validez del método se realizaron diversos ensayos para comparar los resultados obtenidos mediante qPCR y empleando el método de cultivo que tradicionalmente se emplea en el laboratorio. Para ello se analizaron 5 muestras de agua potable y 5 muestras de agua de torre de refrigeración. Todas las muestras que fueron positivas por la técnica de cultivo tradicional, también fueron positivas por qPCR, aunque los resultados de esta última técnica fueron más elevados,


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encontrándose la diferencia de 3.82 en el caso de agua potable y de 2.21 en el caso de aguas de torres de refrigeración.

Los parámetros de validación obtenidos demostraron que el método de qPCR desarrollado en este trabajo era preciso, sensible, y específico para una rápida cuantificación de Legionella spp. en las muestras de agua.


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2. INTRODUCCIÓN

Legionella es una bacteria englobada dentro de la familia Legionellacea. Posee forma bacilar con un tamaño de 0.3 a 0.9 µm de ancho y de 2 a 20 µm de largo, que se tiñe débilmente con tinción de Gram (organismo gram negativo). Es aerobia y con flagelos que favorecen su motilidad. La flagelación puede ser polar, subpolar y/o lateral, aunque ocasionalmente pueden encontrarse cepas no móviles. A pesar de que no presenta formas de resistencia (esporas), es capaz de sobrevivir a un amplio rango de temperaturas, multiplicándose entre 20º C y 45º C, aunque su temperatura óptima de crecimiento se sitúa entre los 35º - 37º C. Es tolerante a pequeñas concentraciones de CO2. En el laboratorio necesita un medio de cultivo con L-cisteína, carbón activo y α-cetoglutarato. Su equipo enzimático comprende la presencia de una catalasa, de una citocromo oxidasa y de una gelatinasa, destacando la ausencia de actividad ureasa y nitrato reductasa (Moreno, 2002).

Figura 2.1. Fotografía en microscopio de barrido de la bacteria Legionella

La bacteria es llamada así, debido a que se presentó de forma epidémica por primera vez en la LVIII Convención Anual de la Legión Americana del estado de Pensilvania, afectando a 221 personas, de la cuales 34 fallecieron.

2.1 Importancia de su estudio

El género Legionella comprende más de 50 especies y más de 70 serogrupos distintos (García, 2009). De entre ellas, Legionella pneumophila es la que más se asocia a patologías en humanos, siendo el serogrupo 1 el encontrado con mayor frecuencia en aislamientos clínicos y de origen ambiental. La bacteria fue aislada por primera vez en Enero de 1977 por Fraser y Mc.Dade, bautizándola con el nombre de ‘’pneumophila’’ puesto que en algunos pacientes se manifestaba en forma de neumonía (Yañez et al., 2005).

La importancia de su estudio es debida a sus implicaciones sanitarias, ya que es la bacteria causante de neumonías severas, siendo también importantes sus implicaciones socioeconómicas, ya que puede afectar a grandes colectividades en forma de brote epidémico, incidiendo sobre múltiples sectores industriales tales como el turismo, comercio, petroquímica…entre otros (Moreno, 2002).


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2.2 Aspectos clínicos

La importancia clínica de L. pneumophila reside en que es el agente patógeno causal de la legionelosis, que puede presentar dos formas clínicas fundamentalmente, la fiebre de Pontiac y la neumonía por Legionella o enfermedad del legionario.

2.2.1 Sintomatología de la enfermedad

2.2.1.1 Fiebre de Pontiac

La fiebre de Pontiac consiste en un cuadro pulmonar no neumónico caracterizado por fiebre, tos, cefalea, intensas mialgias y síntomas sistémicos similares a los de la gripe. Presenta un corto periodo de incubación, apareciendo la sintomatología entre 24 y 48 horas tras la exposición, afecta a más del 95% de los individuos expuestos y desaparece espontáneamente y sin secuelas en algunos días (Pascual et al., 1987).

2.2.1.2 Neumonía por Legionella o enfermedad del legionario

La enfermedad del legionario es un cuadro clínico neumónico, con una importante tasa de morbilidad y mortalidad; sin embargo tiene una menor tasa de afectación que la fiebre de Pontiac y su periodo de incubación es próximo a diez días (Bouza, 1984).

En cuanto a síntomas y severidad existen variaciones, pero se puede establecer un patrón aproximado en el que la enfermedad comienza con síntomas inespecíficos que incluyen malestar, mialgias, cefalea, sudores, escalofríos y fiebre. Normalmente en los primeros días aparece la tos que suele ser seca y posteriormente puede hacerse productiva. El cuadro progresa en 24-48 horas y una vez producida la infección, L. pneumophila es fagocitada por los macrófagos alveolares donde continúa su multiplicación, produciendo una alveolitis intensa y en algunos casos graves puede dar lugar a una diseminación hematógena y extensión de las lesiones hacia otros órganos. Los síntomas extrapulmonares son frecuentes, con fatigas, mialgias y artralgias. Es frecuente la existencia de molestias torácicas y síntomas gastrointestinales que incluyen naúseas, diarreas, vómitos y dolor abdominal, pudiendo verse afectado el sistema nervioso central y dándose en un 50% de los pacientes estados de confusión mental y delirio (Woodhead & Macfarlane, 1987; Stout & Yu, 1997; Yu, 2000; Akbas & Yu, 2001; Mülazimoglu & Yu, 2001).

La muerte se produce generalmente por insuficiencia respiratoria progresiva. La enfermedad no suele dejar secuela a largo plazo en los pacientes que sobreviven, siendo la recuperación completa normalmente.

Se ha identificado a Legionella micdadei como segundo agente productor de neumonías severas casi siempre de adquisición nosocomial y que afecta preferentemente a pacientes con inmunodepresión grave.


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2.2.2 Grupos de riesgo

La neumonía por L.pneumophila afecta preferentemente a varones de avanzada edad (superior a 50 años). En la mayoría de epidemias, la tasa de ataque por esta bacteria ha sido de 2 a 4 veces superior en hombres que en mujeres, donde en niños o adolescentes no es una neumonía habitual (Sturm et al., 1981). Otros factores de riesgo, son el consumo de alcohol, tabaquismo y la existencia de patologías previas en los individuos infectados, como inmunodepresión crónica, insuficiencia cardíaca, neoplasia, enfermedad crónica pulmonar e insuficiencia renal crónica, seguidos de diabetes mellitus y cirugías previas.

2.2.3 Vías de transmisión

El único medio documentado de diseminación de Legionella es a través del aire. Su transmisión se produce mediante la formación de aerosoles a partir de depósitos de agua contaminada, pudiendo estar presente también en el polvo de tierras removidas. La inhalación y el impacto que producen estas partículas a nivel del alveolo pulmonar es lo que puede desencadenar la infección. Se destaca que no se ha descrito transmisión interhumana (Martí Viudes et al., 1986).

2.2.4 Tratamiento de la neumonía por Legionella pneumophila

A pesar de que L. pneumophila es susceptible in vitro a una amplia gama de agentes antimicrobianos, los resultados in vivo difieren en muchos casos debido a la localización intrafagocítica de la bacteria, por lo que los únicos agentes antimicrobianos que serán clínicamente útiles serán aquellos que logren altas concentraciones intracelulares.

Sólo se han completado unos pocos estudios para el tratamiento de la neumonía por Legionella, por lo que la evidencia de las recomendaciones del tratamiento es limitada (Thornsberry, Baker & Kirven., 1978; Yoo et al., 2004; Yu et al., 2004). Durante muchos años el tratamiento de elección fue mediante eritromicina, sin embargo un pequeño estudio clínico demostró que el tratamiento con fluoroquinolona pefloxacina daba a los pacientes una mayor tasa de supervivencia que el tratamiento mediante eritromicina (Dournon et al., 1986; Dournon & Rajagopalan, 1988).

Los nuevos antibióticos macrólidos, tales como claritromicina y azitromicina, muestran mayor eficacia en la actividad in vitro y una mejor penetración intracelular y del tejido que la eritromicina, al igual que las quinolonas. Los antibióticos beta-lactámicos no son eficaces contra la neumonía por Legionella. Cuando no es posible verificar la enfermedad mediante una prueba diagnóstica rápida, las personas son tratadas con macrólidos más antibióticos beta-lactámicos, puesto que un retraso en la aplicación de una terapia apropiada para la neumonía por L.pneumophila aumenta significativamente la mortalidad (Stout & Yu, 1997).


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2.3 Ecología del microorganismo

2.3.1 Reservorio medioambiental

Legionella se puede encontrar en aguas naturales y artificiales de todo el mundo y sobrevivir a una amplia gama de condiciones ambientales (Fliermans et al., 1979). Las bacterias son ácido-tolerantes (pueden soportar la exposición a pH 2.0 durante periodos cortos) y se han aislado de fuentes ambientales que van desde un pH de 2.7 a 8.3 (Sheehan et al., 2005). Se ha detectado la presencia de Legionella en fuentes tan diversas como el agua de las plantas en los bosques, agua subterránea (Riffard et al., 2001; Brooks et al., 2004) y el agua de mar (Ortiz-Roque & Hazen, 1987). La bacteria también sobrevive en fuentes artificiales de agua salada (Heller et al., 1998). Se ha descrito también que el suelo y el polvo de las tierras removidas puede constituir un reservorio para la bacteria, originado por las excavaciones o situaciones similares y que podrían facilitar su difusión. Sin embargo, no se conocen brotes de legionelosis asociados a ríos, arroyos o lagos, ya que en estos medios naturales Legionella está presente a muy bajas concentraciones (Moreno, 2002).

2.3.2 Acceso a redes internas y proliferación en ambientes determinados

Legionella puede incorporarse a la red de distribución de agua potable desde reservorios acuáticos naturales, sobreviviendo a los tratamientos de cloración convencionales puesto que es una bacteria con una resistencia elevada.

Ya en la red de agua potable, la bacteria puede colonizar sistemas internos de agua doméstica u otras instalaciones que requieran la utilización de agua. En estos sistemas, Legionella puede encontrar un nicho ecológico apropiado, pudiendo llegar a unas concentraciones que causen casos aislados o brotes epidémicos.

Numerosos grupos de investigación han centrado sus estudios en la localización de estos puntos causantes de infecciones, como la red de agua sanitaria de hospitales, hoteles, gimnasios (Colbourne et al., 1984; Campo, & Apraiz, 1988; Wadovsky et al., 1982), torres de refrigeración y condensadores evaporativos de sistemas de aire acondicionado (Witherell et al., 1988) equipos de climatización, aguas termales, sistemas de riego, fuentes ornamentales (Moreno., 2002), entre otros.

En el brote epidémico, sin embargo, interfieren además de la presencia del microorganismo, el organismo huésped y las condiciones del entorno. Es decir, el incremento en la concentración de Legionella debido a unas óptimas condiciones ambientales, junto a la virulencia de la cepa, la generación de aerosoles óptimos y, por último, la presencia de huéspedes susceptibles son los factores que, interrelacionados, causan la aparición del a enfermedad.


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2.4 Métodos de detección tradicionales

Antes del desarrollo de un medio de cultivo que permitiera el crecimiento in vitro de Legionella (Feeley et al., 1979), ésta sólo podía crecer mediante el aislamiento en conejillos de indias o huevos de gallina (McDade et al., 1977). En un principio, también se utilizaba este método para la detección de muestras ambientales. Sin embargo este método presentaba las desventajas de ser caro, lento y laborioso, precisando de 2 a 3 semanas para obtener resultados. Por otro lado, era efectivo por su elevada selectividad.

Posteriormente, esta técnica se sustituyó por el aislamiento en medios de cultivo selectivos. El primer aislamiento de Legionella spp. fue llevado a cabo utilizando un agar específico para Legionella que contenía L-cisteína, así como agar de carbón tamponado y extracto de levadura que contenía α-cetoglutarato (BCYE). Legionella es una bacteria con altas exigencias en su crecimiento, por lo que el medio debe contener unas condiciones oṕtimas de pH y temperatura, así como requerimientos específicos de la bacteria como carbón activo, L-cisteína, hierro y α-cetoglutarato.

El agar BCYE se basa en la modificación de Edelstein a medios anteriores (Edelstein, 1981; Wadowsky & Yee, 1981; Bopp et al., 1981; Dennis et al., 1984). En 1979, Feely et al describieron el agar CYE (agar de carbón y extracto de levadura) como una modificación del agar de Feeley-Gorman, reemplazando el almidón de este agar por el carbón activado y sustituyendo el extracto de levadura por hidrolizado de caseína, lo que permitió una mejor recuperación de L.pneumophila. En 1980, Pasculle hizo saber que el agar CYE podía mejorarse añadiendo tampón ACES al medio. Un año después Edelstein aumentó todavía más la sensibilidad del medio añadiendo α-cetoglutarato (Agar BCYE).

En resumen, el agar BCYE es un medio enriquecido para el aislamiento y cultivo de las especies de Legionella spp. El extracto de levadura suministra proteína y otros nutrientes necesarios para favorecer el crecimiento. L-cisteína es un aminoácido esencial y el pirofosfato férrico soluble es un suplemento de hierro, ambos se incorporan para satisfacer los requisitos nutritivos específicos de la bacteria. El α-cetoglutarato se añade para estimular el crecimiento. El carbón activado descompone el peróxido de hidrógeno, que es un producto tóxico del metabolismo para las especies de Legionella y también puede recoger dióxido de carbono, que modificaría la presión superficial. Por último, el tampón ACES se añade para mantener el pH óptimo, necesario para obtener un crecimiento adecuado.


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Figura 2.2. Medio BCYE específico para el cultivo de Legionella

Aislar Legionella tanto de muestras clínicas como medioambientales, está a menudo condicionada por la presencia de microbiota acompañante, siendo distinta en las muestras de aspirados traqueales o de pulmón que en las muestras de agua. Esta microbiota acompañante está constituida por bacterias de crecimiento más rápido que Legionella por lo que el éxito en el aislamiento estará relacionado con la cantidad de estos microorganismos acompañantes. Cuanto más elevado sea su número, al tener un crecimiento más rápido, habrá mayor probabilidad de enmascarar el crecimiento de Legionella. Por ello, surge la necesidad de suplementar los medios de cultivo con antibióticos y otros agentes selectivos para reducir la cantidad de esta flora acompañante. Además, se ha propuesto el pretratamiento de la muestra mediante lavado ácido (Bopp et al., 1981) o el tratamiento con calor (Dennis et al., 1984).

En 1993 Kusnetsov et al. realizaron un estudio para comparar la eficacia de aislamiento de los tres medios de cultivo más utilizados hasta esa fecha: el medio BCYE-α (Edelstein,1981), el medio Modified Wadowsky Yee (MWY) (Wadowsky-Yee,1981) y el medio Cefalotina, Colistina, Vancomicina y Cicloheximida (CCVC) (Bopp et al.,1981). Se concluyó que el medio BCYE-α suplementado con glicina, vancomicina, polimixina B y cicloheximida (GVPC), propuesto por Dennis et al. (1984), podía sustituir por su mayor selectividad a los demás medios ensayados. Además, se recomendó la concentración de las muestras medioambientales y la descontaminación de estas por tratamiento ácido para obtener un mayor rendimiento en su aislamiento.

A pesar de la selectividad de esta técnica, se han detectado algunos inconvenientes, como el prolongado tiempo de espera para la obtención de resultados (de 10 a 14 días), la imposibilidad de detectar las bacterias viables no cultivables, la necesidad de tomar precauciones con las muestras para asegurar la viabilidad de los microorganismos y la dificultad para aislar la bacteria en muestras con elevada contaminación microbiana.


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2.5 Métodos de detección basados en biología molecular

Para solucionar los inconvenientes descritos en el aislamiento por cultivo y aprovechando la tecnología de los ácidos nucleicos, se han ido desarrollando diversos métodos de hibridación de DNA que emplean sondas específicas marcadas enzimática o isotópicamente (VanKetel et al., 1984; Grimont et al., 1985; Engleberg et al., 1986).

Con el fin de aumentar la sensibilidad de las técnicas de hibridación, se comenzó a aplicar la técnica de amplificación de ácidos nucleicos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), técnica con una gran sensibilidad, especificidad y versatilidad. La PCR es una técnica que fue desarrollada por Kary Mullis a mediados de los años 80 (Mullis & Falloona, 1987). Consiste en la amplificación in vitro de múltiples copias de un fragmento de DNA o RNA específico. Se basa en la actividad de la enzima DNA polimerasa termorresistente (Taq polimerasa) que es capaz de sintetizar una cadena de DNA complementaria a otra ya existente.

Para amplificar DNA se requieren dos oligonucleótidos iniciadores, también conocidos como cebadores homólogos, pues su secuencia es complementaria a una región iniciadora específica del DNA. El proceso consta de tres etapas: desnaturalización por calor del DNA en presencia de los cebadores, hibridación de éstos con el DNA, y síntesis de nuevas cadenas gracias a la colaboración de la DNA polimerasa.

Figura 2.3. Etapas de la PCR


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El ciclo puede repetirse de nuevo, empleando esta vez las nuevas hebras como molde. De este modo se da lugar a un incremento exponencial del número de copias del fragmento de DNA amplificado, que puede detectarse más tarde por hibridación con una sonda de DNA, en un proceso de separación de moléculas por aplicación de una diferencia de potencial eléctrico conocido como electroforesis horizontal en gel de agarosa.

Figura 2.4. Etapas de la electroforesis horizontal en gel de agarosa (Molecular Station.com)

A pesar de las ventajas que ofrece la PCR convencional, presenta dos inconvenientes principales. Uno es la posibilidad de obtener falsos resultados negativos en muestras ambientales por la presencia de ácidos húmicos, fúlvicos y metales que actúan como inhibidores. El segundo es que la PCR convencional consiste en un ensayo cualitativo, que informa solamente de la presencia o la ausencia del microorganismo (Yañez et al., 2005). Se han descrito varios métodos que permiten obtener DNA purificado carente de inhibidores, como la rápida filtración en gel para eliminar las sustancias húmicas (Abbaszadegan et al., 1993), filtración a través de resinas queladas de intercambio iónico para eliminar iones metálicos (Hurt et al,. 2001; Tsai et al., 1993) o la adición de polivinilpirrolidona para eliminar los polifenoles (Koonjul et al., 1999), entre otros. También se ha descrito otro método para solucionar el problema de la inhibición de la PCR consistente en la inclusión de un patrón interno, siendo un fragmento de DNA que se amplifica con el mismo juego de cebadores que el fragmento diana, pero con un tamaño diferente a este (Kolk et al., 1994).

Esta técnica, ha sido aplicada por varios autores para la detección de Legionella spp. y L. pneumophila. Engleberg et al. secuenciaron por primera vez en 1988 un fragmento de 650 pares de bases perteneciente al gen


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potenciador de la infectividad de macrófagos (mip) de L. pneumophila. Los amplificados de dicho gen, se detectaron mediante la hibridación con sondas marcadas enzimáticamente e isotópicamente (Starnbach et al., 1989; Mahbubani et al., 1990).

En 1992 Mahbubani fue capaz de detectar de 10 a 100 bacterias de múltiples especies de Legionella por PCR en 100 – 1000 mL de muestras de agua.

La tecnología de la PCR fluorescente (PCR en ‘’tiempo real’’) basada en sondas, ha llevado al desarrollo del ensayo de forma cuantitativa. En la PCR, el producto que se genera se marca con un fluorocromo “reporter”, y la cantidad de luz fluorescente que se libera durante la amplificación será directamente proporcional a la cantidad del producto sintetizado, estimándose el número inicial de copias a partir de la acumulación del producto en la fase exponencial, lo que le otorga una elevada precisión y exactitud en la cuantificación.

Los fluorocromos o fluoróforos con los que se marca el producto de PCR, son componentes de una molécula que hacen que esta sea fluorescente. Es un grupo funcional de la molécula que absorberá energía de una longitud de onda específica y conducirá al fluoróforo a un estado excitado. Al volver de este estado al fundamental, se emitirá una luz a una energía más baja (mayor longitud de onda) que a la que fue captada.

Existen compuestos fluorescentes como el SYBR Green (Morrison et al., 1998) que se intercalan en el DNA de doble cadena sintetizado. Son muy sensibles, pero su señal no es dependiente del amplicón, por lo que dímeros de cebadores y otros artefactos de PCR pueden conducir a falsos resultados positivos. Para hacer frente a este problema, se utilizan métodos más específicos de detección por PCR en ‘’tiempo real’’ (qPCR), como las sondas complementarias a las reacciones que se hibridan con el amplicón de una forma dependiente de la secuencia. (VanGuilder et al., 2008; Mackay et al., 2004). Estas sondas de DNA están marcadas comúnmente por dos fluorocromos, uno de alta energía (Reporter) en 3', y otro de baja energía (Quencher) en 5', como por ejemplo en las sondas TaqMan (Lee et al., 1993). Esta sonda hibridará cerca del molde de PCR para permitir la detección por FRET (Fluorescense resonance energy transfer). En las sondas TaqMan no hibridadas, la señal del fluoróforo estará inhibida por el ''quencher' debido a su cercanía y emitirá una señal de fondo baja. Cuando la Taq polimerasa digiera la sonda por la actividad exonucleasa (3' → 5') producirá que el fluorocromo se libere en el extremo 5' de la acción del ''quencher'' y empiece a emitir fluorescencia. De esta manera, durante los ciclos de PCR, la cantidad de fluorescencia se irá acumulando e indicará la concentración de DNA obtenido (Hanami T., et al (2013).


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Figura 2.5. Etapas para la emisión de fluorescencia en las sondas

En ocasiones, cuando no hay suficiente secuencia diana para hibridar con la sonda TaqMan, se ha sintetizado una modificación de esta denominada sonda TaqMan-MGB, que son más cortas y pueden hibridarse con un número menor de pares de bases (13 – 18 pb). Estas sondas no poseen ''quencher'' sino un brazo extensible de DNA que al estar cerca del fluoróforo lo cubrirá inhibiendo la fluorescencia, por este motivo no emite fluorescencia basal. Es capaz de aumentar la temperatura de fusión (Tm) de la sonda por su habilidad de unión al surco pequeño.

Varios autores han realizado detecciones de Legionella spp. y L.pneumophila utilizando la tecnología de qPCR. Rantakokko & Jalava (2001) y Wilson et al., (2003) emplearon la qPCR para detectar DNA de Legionella spp. y L.pneumophila respectivamente, en muestras respiratorias y Yáñez et al., (2005) detectaron DNA de L.pneumophila en muestras ambientales.

2.6 Validación de métodos: Normas ISO relacionadas con Legionella.

La ISO (International Standarization Organization) es la entidad internacional encargada de favorecer la normalización en el mundo. Tienen valor indicativo y de guía, y la finalidad principal de sus normas es orientar, coordinar, simplificar y unificar los usos para conseguir menores costes y mayor efectividad.


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2.6.1 Normas ISO para el cultivo de Legionella

En el campo de Legionella, encontramos la norma internacional ISO 11731: 1998 que describe un método de cultivo para el aislamiento de los organismos de Legionella y para su recuento en muestras ambientales. En esta norma se encuentran las pautas a seguir desde la preparación de los medios de cultivo, toma y transporte de muestras, aparatos y material, procedimiento de análisis y expresión de los resultados, tomando especial atención en la temperatura del agua y en la naturaleza, volumen o masa y tiempo de transporte de la muestra. Este método es aplicable a toda clase de muestras, comprendiendo aguas potables, industriales, naturales y materiales asociados tales como sedimentos, depósitos y lodos.

Una variante de esta norma es ISO 11731-2: 2004 centrada solamente en aguas con bajas densidades bacterianas, puesto que un crecimiento excesivo de otras colonias puede inhibir el crecimiento de Legionella. Especifica un método de control para la detección y recuento de esta en aguas destinadas al consumo humano y aguas de baño tratadas.

2.6.2 Norma ISO para la detección por qPCR de Legionella.

La norma ISO/TS 12869 describe el método para la detección y cuantificación de Legionella spp. y Legionella pneumophila en muestras de agua utilizando la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Esta norma especifica los requisitos generales, requisitos metodológicos y los requisitos de control de calidad. Está destinada a la investigación bacteriológica de todos los tipos de agua (aguas potables, aguas industriales…). En resumen, esta norma ISO ofrece las pautas para validar un método de detección y cuantificación de Legionella spp y L. pneumophila mediante qPCR.

2.7 Legislación, prevención y control de la legionelosis

Legionella forma parte de ríos, estanques y lagos, y desde estos reservorios naturales es capaz de colonizar los sistemas de abastecimiento de las ciudades a través de la red de distribución del agua, incorporándose a los sistemas de agua sanitaria (fría o caliente) u otros sistemas que requieren agua para su funcionamiento como las torres de refrigeración. Si estas instalaciones están mal diseñadas, no se mantienen o el mantenimiento es inadecuado, se favorece el estancamiento del agua y la acumulación de nutrientes y, si la temperatura es adecuada (entre 20 y 45º C), Legionella será capaz de multiplicarse hasta alcanzar la dosis infectiva para el ser humano.

Los lugares donde puede encontrarse más fácilmente son los circuitos de distribución de agua caliente sanitaria (grifos, cabezales de ducha, sifones, tramos ciegos, etc.), sistemas de climatización y torres de refrigeración, aguas termales de centros de rehabilitación y recreo, equipos médicos de aerosolterapia, y fuentes decorativas. Si existe en la instalación un mecanismo de producción de aerosoles, la bacteria se dispersa por el aire pudiendo penetrar por inhalación en el aparato respiratorio. La supervivencia y


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multiplicación de la bacteria en estos sistemas se relaciona, además de con la existencia de una temperatura óptima para su desarrollo, con la presencia de lodos, materiales de corrosión y otros microorganismos (amebas, algas y otras bacterias), que le sirven de sustrato y le ofrecen una cierta protección frente a los tratamientos de desinfección del agua que, habitualmente, consisten en la elevación de la temperatura y en el uso de desinfectantes químicos. En la figura 1.7.1 se muestra la relación entre las temperaturas de diseño de diferentes equipos, el estado de desarrollo de la bacteria y la probabilidad del riesgo de multiplicación asociado a los diferentes equipos. Según este esquema, los focos de contaminación más probables son: las torres de refrigeración, los cabezales de las duchas y los jacuzzis, dado que sus temperaturas habituales de trabajo coinciden con las de máxima multiplicación de la bacteria.

Figura 2.6. Esquema de las posibilidades de desarrollo de Legionella a diferentes temperaturas y en diferentes instalaciones

Por ello, se hace necesaria la existencia de unas medidas de prevención y control. Estas medidas se conocen como preventivas cuando van destinadas a mantener la concentración de la bacteria dentro de unos límites previamente establecidos como aceptables, o como de erradicación si el brote ya se ha iniciado.

A pesar de la existencia de Legionella en el medio acuático natural, nunca se ha descrito un caso o brote de esta proveniencia debido a su baja concentración. Es en los ambientes creados por el hombre donde se hace necesario el control de la bacteria, habiendo normas en multitud de países


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destinadas a este fin. Estas medidas contemplan dos fases de actuación, por una parte durante el montaje y diseño de los sistemas y por otra durante la fase de explotación de las instalaciones, mediante un mantenimiento adecuado. En España existe una norma UNE (100-030-94), sobre "Prevención de la Legionella en instalaciones y edificios", además de legislaciones de comunidades autónomas en las que se encuentran procedimientos explícitos. Por otro lado, a raíz de los grandes brotes de legionelosis ocurridos en nuestro país en los últimos años, se aprobó el Real Decreto 865/2003, del 4 de julio, por el que se establecen los criterios higiénico-sanitarios para la prevención y control de la legionelosis. Este decreto es aplicable a sistemas de agua caliente sanitaria, sistema de agua fría de consumo humano, torres de refrigeración, condensadores evaporativos, equipos de terapia respiratoria, humidificadores y humectadores, conductos de aire acondicionado, piscinas climatizadas, instalaciones termales, fuentes ornamentales, sistemas de riego por aspersión, sistemas de agua contra incendios, elementos de refrigeración por aerosolización al aire libre y otros aparatos que acumulen agua y puedan producir aerosoles. En este Real decreto el método de referencia para el aislamiento de Legionella en muestras ambientales es el cultivo.

Asimismo, muchos países han producido directivas o guías para el control de la legionelosis en las torres de refrigeración. Esto es debido a que las torres de refrigeración están relacionadas con muchos casos de la enfermedad del legionario, ya que son un excelente amplificador y diseminador de Legionella (Miller et al., 1979; Breiman et al., 1990; lkedo et al., 1986), debido a que reúnen una serie de condiciones apropiadas para ello, como son la elevada temperatura del agua (28-38°C, sobre todo en verano), la humedad, el incremento en la tensión de oxígeno en las superficies agua-aire y la acumulación de nutrientes.

En España, la norma UNE 100-030-94 y el Real Decreto 909/2001 también establecen una serie de acciones relativas a las torres de refrigeración, que en líneas generales consisten en situar estos aparatos en lugares aislados, lejos de zonas frecuentadas, colocándolos a sotavento en relación con los vientos predominantes en la zona de emplazamiento. Con el objetivo de facilitar la limpieza, los componentes serán de fácil acceso, sus superficies interiores lisas y resistentes a altas concentraciones de cloro. Además se recomienda la inspección periódica de las torres para comprobar su estado respecto al crecimiento de algas, deterioro de los materiales, daño de los componentes, efectos de corrosión y correcto funcionamiento de motores y bombas, y un sistema permanente de tratamiento por medio de agentes biocidas.

Por otro lado, las medidas de erradicación comprenden una acción coordinada de biocidas junto con choques térmicos para lograr una descontaminación selectiva de L. pneumophila. Comúnmente, la hipercloración es el método elegido para, junto con un aumento controlado de la temperatura, erradicar la bacteria de la fuente de contaminación. El problema al que nos enfrentamos empleando este método es la elevada corrosión, que provoca importantes pérdidas económicas en maquinaria, a pesar de que estos ya se eligen sabiendo que, en caso de contaminación por esta bacteria, habrá que


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enfrentarse a la posibilidad de la corrosión. Es por ello que se están intentando desarrollar otros métodos que puedan actuar de la misma manera, pero sin ofrecer el inconveniente corrosivo. Estos son la luz ultravioleta, el peróxido de hidrógeno y el ozono.

Estudios efectuados hasta la fecha señalan que, en principio, los más adecuados podrían ser el ozono y el peróxido de hidrógeno (Domingue et al., 1988). Se comparó el efecto biocida del ozono, peróxido de hidrógeno y cloro sobre suspensiones de L. pneumophila a diferentes pH y temperaturas, y el ozono resultó ser el biocida más potente, produciendo la muerte del 99% de las bacterias después de una exposición de 5 min a una concentración de ozono de 0,1-0,3 mg/L. La acción del ozono no se vio afectada en ningún momento ni por cambios en el pH o la temperatura, siendo necesario incubar durante 30 y 5 min para obtener una reducción comparable de L. pneumophila después del tratamiento con 0,3 y con 0,4 mg/L de cloro. En el caso del peróxido de hidrógeno, se necesitó incubar con 1.000 mg/L durante 30 min para obtener un resultado similar al ozono, aunque presentó, sin embargo, una mayor acción residual.

A la vista de estos resultados, tanto el ozono como el peróxido de hidrógeno son una alternativa segura al empleo de cloro, ya que sus productos de descomposición (oxígeno y agua) son inocuos. Además, el peróxido de hidrógeno presenta la ventaja de su mayor acción residual.

Por otro lado, en estudios anteriores de Muraca et al., (1987), se comparó la eficacia del ozono (1-2 mg/L), luz ultravioleta, e hipercloración (4-6 mg/L) con la elevación de la temperatura (50-60°C) para erradicar L. pneumophila. Los cuatro métodos empleados resultaron eficaces en la eliminación de la bacteria, pero la luz ultravioleta y la elevación de la temperatura fueron más rápidos.

En cualquier caso, la aplicación de estos métodos estudiados in vitro a sistemas de distribución de agua in vivo es un gran paso y, como cualquier otro estudio in vitro, el resultado de dicha aplicación aún no se conoce.

3. OBJETO Y ALCANCE DEL TRABAJO La incidencia de Legionella sobre la salud pública, y su repercusión económica, hace necesario disponer de métodos de detección rápidos y sensibles. Las legislaciones vigentes en los distintos países, incluyen el aislamiento en medios de cultivo selectivos (BCYE-α) para detectar y cuantificar la presencia de esta bacteria en muestras ambientales. Sin embargo, esta técnica presenta los inconvenientes de necesitar tiempos largos de incubación debido a la baja tasa de crecimiento de la bacteria, la imposibilidad de detectar las bacterias viables no cultivables y la dificultad de su aislamiento en muestras contaminadas con grandes concentraciones de microorganismos. El uso de la PCR para su detección fue un gran avance para solventar los problemas del cultivo, aunque seguía presentando inconvenientes como ser una técnica cualitativa, que sólo informaba de la presencia o ausencia del microorganismo y no de la cantidad. La aplicación de la qPCR para la detección y cuantificación


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de Legionella solventa muchos de los problemas de las dos técnicas anteriores. Durante la última década se han publicado muchos artículos científicos basados en qPCR para la detección de este microorganismo, pero la mayoría de estudios no están adecuadamente validados para poder ser implementados en un laboratorio de diagnóstico ambiental acreditado bajo la norma ISO 17025. Es por ello que el objetivo de este estudio será la validación de un método de detección y cuantificación de Legionella, empleando qPCR.

4. PROCEDIMIENTO

4.1 Búsqueda de secuencias específicas de género: Diseño de cebadores y sondas.

En la primera fase del proyecto se llevó a cabo la búsqueda de regiones o genes específicos de Legionella, que servirían como diana de amplificación utilizando qPCR. Para ello, se realizó una revisión bibliográfica a través de servicios de búsqueda especializados como Pubmed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed) y Scirus (http://www.scirus.com/srsapp/). Para la obtención de secuencias de nucleótidos se empleó la base de datos biológicos GenBank del NCBI (National Center for Biotechnology Information).

Se seleccionaron como dianas específicas de Legionella secuencias del gen DNA ribosómico 16S (rDNA 16S) y se realizaron múltiples alineamientos empleando programas informáticos como el ClustalW disponible en el enlace (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) del European Bioinformatics Institute. Se trataba de buscar una región común en todo el género que a la vez fuera distinta al resto de microorganismos. Esto se consiguió comparando las zonas conservadas del género con toda la base de datos utilizando el programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul,1997), disponible en la página web (www.ncbi.nlm.nih.gov), del NCBI. (Fig. 4.1.)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/#_blank

http://www.scirus.com/srsapp/

http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/


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Figura 4.1. Estudio de especificidad teórica de Legionella mediante BLAST

Finalmente, los cebadores y las sondas fueron analizados empleando un software específico, el Primer Express (Applied Biosystems) para garantizar que cumplieran con los requerimientos específicos para trabajar en qPCR.

Figura 4.2. Ejemplo de diseño de cebadores y sondas para la detección de Legionella, obtenida con el programa Primer Express

En la Tabla 4.1 se muestran los parámetros establecidos por el programa:

Tabla 4.1. Parámetros establecidos en el programa Primer Express para el diseño de cebadores y sondas para experimentos de detección mediante sondas TaqMan.

Cebadores

Parámetro Valor Tm mínima 58 ºC Tm máxima 60 ºC Diferencia máxima entre Tm de cebadores 2 %G+C mínimo 30 %G+C máximo 80 Longitud mínima 9 nt Longitud máxima 40 nt Longitud óptima 20 nt


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Sonda

Parámetro Valor Tm mínima 68 ºC Tm máxima 70 ºC %G+C mínimo 30 %G+C máximo 80 Longitud mínima 13 nt Longitud máxima 30 nt

Amplicón

Parámetro Valor Tm mínima 68 ºC Tm máxima 70 ºC Longitud mínima 13 nt Longitud máxima 30 nt

Los oligonucleótidos amplificaron una porción de 386 pb (451-837) del gen rDNA 16S. Los cebadores y la sonda como resultado de este estudio aparecen en la siguiente tabla que fue descrita por Jonas et al. (1995):

Tabla 4.2. Cebadores y sonda diseñados para la amplificación específica del género Legionella por qPCR.

Código Secuencia (5' → 3')

16S1-A CCAACAGCTAGTTGACATCG

16S2-A AGGGTTGATAGGTTAAGAGC

16S1-S AGTGGCGAAGGCGGCTACCT-FAM

Todos los cebadores diseñados en este trabajo fueron sintetizados por Sigma-Aldrich.

Una vez diseñados los cebadores y sonda para la detección de Legionella, y comprobada su especificidad teórica, se realizaron ensayos de especificidad experimental mediante qPCR con el mayor número de microorganismos posibles relacionados evolutivamente con Legionella y muy especialmente con todos aquellos que pudieran encontrarse en las muestras ambientales a analizar. También se sometieron a estudio el mayor número de especies de Legionella posibles, para comprobar la especificidad en la detección de los cebadores. Para detectar esto último, se procedió a construir un patrón interno que se explicará más adelante.

4.2 Cultivo de cepas bacterianas

Las cepas empleadas en los estudios de especificidad tanto de Legionella como de otros géneros bacterianos aparecen en la Tabla 4.3. Las cepas de Legionella se hicieron crecer en Buffered Charcoal Yeast Extract, conteniendo


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un 0.1% de α-cetoglutarato, ajustado a un pH 6.9 con KOH y suplementado (por litro) con 0.4 gramos de L-cisteína y 0.25 gramos de pirofosfato férrico (BCYE-α). Para el aislamiento de Legionella de muestras ambientales se utilizó medio GVPC. Se trata del medio BCYE suplementado con 3 g de glicina, 1 mg de vancomicina, 50.000 IU de polimixina B y 80 mg de cicloheximida, que son añadidos a 1 litro de medio BCYE. Las placas inoculadas se incubaron a 37ºC en una atmósfera humidificada conteniendo un 5% de dióxido de carbono.

Tabla 4.3. Cepas bacterianas analizadas en este estudio

Organismo Identificación de cepa Fuente

Legionella parisiensis

Legionella tucsonensis

Legionella pansingensis

NCTC 11983

NCTC 12439

NCTC 12830

Colección

Colección

Colección

Legionella maceachernii NCTC 11982 Colección

Legionella wadsworthii NCTC 11532 Colección

Legionella adeladensis NCTC 12735 Colección

Legionella birmininghamensis NCTC 12437 Colección

Legionella jordanis NCTC 11533 Colección

Legionella longbeacheae NCTC 11530 Colección

Legionella israeliensis NCTC 12010 Colección

Legionella gormanii NCTC 11401 Colección

Legionella feeleii NCTC 12022 Colección

Legionella anisa NCTC 1974 Colección

Legionella cherrii NCTC 1976 Colección

Legionella bozemanii NCTC 11360 Colección

Legionella micdadei NCTC 11371 Colección

Legionella pneumophila ATCC 43736 Colección




Legionella spp. L6242 Ambiental



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Aeromononas hydrophila

Alcaligenes faecalis

Bacillus subtillis

Burkholderia cepacia

Candida albicans

Citrobacter freundii

Clostridium perfringens

Enterobacter aerogenes

Enterococcus faecium

Escherichia coli

Klebsiella oxytoca

Listeria monocytogenes

Micrococcus luteus

Proteus vulgaris

Pseudomonas sp. V226



Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas fluorescens

Pseudomonas putida

CECT 839

CECT928

CECT4522

CECT4137

CECT 1001

CECT 401

CECT 376

CECT4078

CECT410

CECT 434

CECT 860

CECT 4031

CECT 4057

CECT165

Ambiental

Ambiental

Ambiental

CECT108

CECT378T

CECT 324

Colección


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Salmonella enterica

Serratia marcescens

Shigella flexneri

Staphylococcus aureus

Stenotrophomonas maltophila

Yersinia enterocolítica

CECT409

CECT 846

CECT 585

CECT82

CECT 115

CECT 754

Las cepas del resto de géneros bacterianos se hicieron crecer en los medios y las temperaturas que aparecen resumidos en la Tabla 4.4.

Tabla 4.4. Temperatura de incubación y medios de cultivo utilizados para el aislamiento de cepas bacterianas de otros géneros

Especie Medio de cultivo Tº de incubación (ºC)

Aeromononas hydrophila Agar soja y tripticaseína (TSA)

28º

Alcaligenes faecalis Agar nutritivo (AN) + MnSO4

37º

Bacillus subtillis Agar LB 37º

Burkholderia cepacia TSA 37º

Candida albicans Agar glucosado Sabouraud 37º

Citrobacter freundii Tergitol 37º

Clostridium perfringens Peptona levadura y glucosa (PYG)

37º

Enterobacter aerogenes Tergitol 30º-37º

Enterococcus faecium AN o agar sangre 37º

Escherichia coli TSA, McConkey 37º

Klebsiella oxytoca Tergitol 37º

Listeria monocytogenes Agar sangre 30º-35º


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Micrococcus luteus TSA 25º-30º

Proteus vulgaris Agar McConkey 37º

Pseudomonas spp. Cetrimida 30º-37º

Salmonella enterica Agar McConkey 37º

Serratia marcescens TSA 20º-35º

Shigella flexneri Agar McConkey 37º

Staphylococcus aureus TSA 35º

Stenotrophomonas maltophila

Agar McConkey 35º

Yersinia enterocolítica TSA 28º

4.3 Extracción y purificación de DNA

Las colonias bacterianas procedentes de los cultivos, se resuspendieron en 200 µl de la resina Chelex 100 al 20% (Laboratorios Bio-Rad, Richmond, CA). El DNA fue extraído mediante choque térmico, realizando tres ciclos alternativos de 10 min de congelación a – 70 ºC y descongelación en un bloque térmico a 94ºC.

Figura 4.3. Bloque térmico utilizado en este trabajo

Los restos celulares fueron eliminados por centrifugación a 10.000xg durante 1 min. La cantidad de DNA en las muestras se midió espectrofotométricamente por triplicado a 260 nm (Eppendorf, Biophotometer plus), que es la longitud de onda a la que absorben los ácidos nucleicos, y se comprobó la pureza del DNA mediante la relación A260/A280 de acuerdo con Maniatis et al., (1982). Las proteínas absorben a una longitud de onda de 280 nm, y una relación A260/A280 de 1.8 o superior indica que el DNA es puro. Una relación inferior a 1.6 significa que en la muestra hay presencia de proteínas contaminantes o trazas de fenoles.


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Figura 4.4. Bio-espectrofotómetro utilizado en este trabajo

4.4 Cálculo de la concentración de DNA

El número de copias de la secuencia de rDNA 16 S se calculó asumiendo una masa molecular media de 660 Da para 1 pb de DNA de doble cadena (PCR Applications Manual, 2nd ed., Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, 1999). El cálculo fue efectuado utilizando la siguiente ecuación:

Las masa media del genoma de L. pneumophila se calculó a partir del tamaño medio del genoma, que se asume que es 3.9 Mb (Bender et al., 1990). Según este dato y teniendo en cuenta el número de Avogadro, una unidad genómica de Legionella equivale a 3.73 x 10-15 g.

4.5 Condiciones de la reacción de qPCR.

La reacción de amplificación fue realizada en placas ópticas de 96 pocillos usando un volumen total de 25 µl. La mezcla de reacción contenía 1x TaqMan universal PCR master mix (Lif Tecnologies) que contenía Buffer de PCR, deoxynucleótidos Trifosfatos [dNTPs], AmpliTaq Gold polimerasa, 6-carboxy-x-rhodamina [ROX], Amp Erase uracil N-glycosilase [UNG], MgCl2, 100 µM de cada uno de los cebadores y 50 µM de la sonda. La sonda específica para Legionella que se empleó era una sonda TaqMan MGB marcada con FAM (Carboxyfluorescein) como fluorocromo. FAM presenta una longitud de onda de excitación de 495 nm y una de emisión a 515 nm.


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Figura 4.5. Reactivos y detector para la qPCR

Para realizarla, se preparó en cada pocillo la mezcla de la reacción según la siguiente composición por muestra:

Tabla 4.5. Mezcla de reacción para la amplificación de Legionella spp.

Reactivos Volumen / Reacción (µl)

AgPath-ID Master Mix 12.5

Cebador LegF (100µM) 0.125

Cebador LegR (100µM) 0.125

Sonda Leg (50µM) 0.125

Taq Polimerasa 1

Agua 1.125

15µl / reacción

Las reacciones de amplificación se realizaron utilizando el detector de secuencias ABI Prism 7000 (Applied Biosystems). Este sistema permite la cuantificación de los productos de PCR en ‘’tiempo real’’, detectado por el incremento en la señal de fluorescencia por una actividad nucleasa – 5' durante el proceso de amplificación. En la figura 4.6 se representa un ejemplo de la curva de reacción.


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Figura 4.6. Ejemplo de una curva de reacción

En la curva se ven reflejados tres conceptos:

Línea base: Representa los ciclos iniciales de la qPCR, donde no hay cambios significativos en la señal de fluorescencia. Determina la fluorescencia basal.

Umbral o Threshold: Nivel situado en la región exponencial de la gráfica de amplificación, situado por encima de la línea base y que determina el nivel de fluorescencia significativamente superior a la fluorescencia basal. Se emplea para la determinación de los Ct.

El ciclo umbral (Ct): Ciclo en el cual la fluorescencia de la muestra aumenta por encima de un umbral definido, y es inversamente proporcional a la cantidad inicial de ácidos nucleicos. El umbral (Ct) para cada reacción se representa frente al log10 de la cantidad inicial de DNA para generar una curva estándar.

Se utilizó un pocillo de la placa óptica por muestra, donde se añadieron 15 µl de la mezcla de reacción y 10 µl de la muestra, previamente preparada en el apartado 4.3. Las condiciones de la amplificación se muestran en la Tabla 4.6.

Tabla 4.6. Programa de la amplificación por qPCR para el análisis de muestras.

Nº de ciclos Temperatura (ºC) Tiempo (min.)

1 50 2

1 95 10

40

95

60

0.15

1

Umbral o Threshold

Línea base Valor de Ct


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En la siguiente figura se ilustra el perfil térmico de la amplificación junto con el proceso asociado a cada fase:

Figura 4.7. Perfil térmico y procesos de la amplificación

4.6 Diseño y construcción del patrón interno

Uno de los problemas principales que se plantean en el desarrollo de sistemas de detección de microorganismos basados en la amplificación enzimática de DNA a partir de muestras de orígenes diversos, es la variabilidad observada como consecuencia de la presencia en la matriz de sustancias que interfieren en la reacción, pudiendo originar falsos negativos. Para evitar esos posibles errores en la interpretación de los resultados, es necesaria la inclusión en el diseño de un patrón interno (IPC) que permita discernir una ausencia de microorganismos de una reacción inhibida (Kolk et al., 1994).

En este trabajo se realizó la construcción de un patrón interno para el diseño propuesto con la finalidad de controlar en todo momento la presencia de inhibidores en las muestras a analizar, eliminando así falsos negativos. Estos patrones internos amplifican con los mismos cebadores, de una forma simultánea con el DNA diana, empleando para ello un molde de DNA recombinante.

Para la construcción del patrón interno se utilizó un fragmento del gen gyrB de Aeromonas hydrophila (Colección Española de Cultivos Tipo, CECT 839). Se sintetizaron cebadores híbridos para gyrB y para el DNA diana del microorganismo a detectar de forma que el amplicón resultante de la reacción de PCR convencional es un fragmento del gen gyrB de A.hydrophila (de 161 pb) flanqueado a ambos extremos por secuencias de los genes diana. Las secuencias de los cebadores para construir el patrón interno se indican en la Tabla 4.7.

1. Se produce la activación de UNG

2. Activación de Taq y desnaturalización de UNG

3. Desnaturalización del dsDNA

4. Anillamiento y extensión de cebadores.


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Tabla 4.7. Cebadores para la síntesis del patrón interno


16S1-A-gyrBF AGGGTTGATAGGTTAAGAGCcaaggcgttcgtcgaatacc

16S2-A-gyrBR: CCAACAGCTAGTTGACATCGgctgcggaatgttgttggt

* Mayúscula Legionella 16S rDNA , Minúscula parte de la girasa de A. hydrophila.

Los componentes y las condiciones de la reacción de amplificación por PCR para la construcción del patrón interno se muestran en las siguientes tablas:

Tabla 4.8. Programa de amplificación por PCR para la construcción del patrón interno.

Número de ciclos Temperatura (ºC) Tiempo (seg.)

10 94 30

10 60 30

10 72 60

35 94 30

1 72 420

Tabla 4.9. Reactivos para la amplificación por PCR para la construcción del patrón interno.


PCR buffer 10X 4

MgCl12 (1.5 mM) 1.2

dNTPs (20 µM) 0.3

Cebador Forward (500 nM) 0.2

Cebador Reverse (500 nM) 0.2

Taq polimerasa 0.2

H2O 31.9

38 µl / reacción


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A continuación, se verificó el tamaño de los fragmentos de PCR híbridos (gyrB – diana), mediante electroforesis horizontal en gel de agarosa (Pronodisa al 1.8%), utilizándose como patrón de peso molecular pBR322-DNA/Hae III.

Figura 4.8. Procedimiento para la preparación del gel de agarosa

Tras preparar el gel (incluyendo el bromuro de etidio para su visualización posterior), se añadió a cada pocillo, 5 µL de tampón de carga + 10 µL de muestra y se efectuó la electroforesis a un voltaje de 4-5 V/cm. Por último se visualizó sobre un analizador de imagen.

Figura 4.9. Fragmentos híbridos visualizados en el gel de agarosa

Seguidamente, los fragmentos de PCR híbridos (gyrB – diana), una vez verificado su tamaño mediante electroforesis en gel, se purificaron con el sistema GenElute PCR (SigmaAldrich) y se clonaron en un vector plasmídico (pCR2.1, de 3.9 Kb) mediante el sistema comercial para clonar productos de PCR TOPO-TA cloning kit (Invitrogen). Se transformó una cepa de Escherichia coli, y se llevó a cabo la selección de clones conteniendo el inserto de patrón interno en presencia de antibiótico (ampicilina) y X-Gal. De los clones seleccionados, se purificó el DNA plasmídico en todos los casos mediante el método de lisis alcalina empleando columnas comerciales (Sigma- Aldrich).


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Figura 4.10. Diagrama ilustrativo de la construcción de patrones internos.

Para emplear el patrón interno en qPCR, se diseñó una sonda TaqMan marcada con el fluoróforo VIC específica de la región del gen gyrB empleada. Esta misma sonda se empleó para todos los microorganismos diana (pero el plásmido recombinante era distinto para cada uno de ellos). El fluoróforo VIC presenta unas longitudes de onda de excitación y de emisión de 538 y 554 respectivamente y como inhibidor o ''quencher'' TAMRA. Esta sonda presentó una buena combinación con la sonda de Legionella marcada con FAM, ya que las longitudes de onda de los dos fluoróforos estaban muy alejadas.

Las concentraciones de DNA de patrón interno se ajustaron empíricamente con el fin de minimizar la competición en la amplificación del DNA diana y el patrón interno.

4.7 Diseño de validación: Parámetros de validación

Una validación consiste en un procedimiento para evaluar las características de un proceso de medida y verificar que esas características cumplen una serie de requisitos preestablecidos. La validación de los métodos empleados en un laboratorio de diagnóstico ambiental es necesaria ya que es necesario demostrar que los métodos empleados funcionan de forma correcta. Además la validación de los métodos es obligatoria cuando el laboratorio está acreditado por ENAC bajo la norma ISO 17025: Evaluación de la conformidad. Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y de calibración.

Para un correcto proceso de validación, hay una serie de parámetros que es necesario calcular con los resultados obtenidos:

Límite de detección experimental: En el caso de métodos moleculares, se calcula teniendo en cuenta la concentración más baja de unidades genómicas que pueden ser detectadas con la probabilidad del 100%.

Límite de cuantificación: Se calcula como tres veces la desviación estándar en el límite de detección.


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Sensibilidad/Especificidad: Se define respectivamente como la fracción total del número de resultados positivos asignados correctamente y la fracción de resultados negativos asignados correctamente con el método analizado.

Falsos positivos/Falsos negativos: Definidos como el número de resultados positivos asignados de forma errónea y el número de resultados negativos asignados de forma errónea, respectivamente.

Linealidad: Se define como el grado de ajuste de los puntos experimentales a una recta.

Eficiencia de la reacción (E): Se trata de un valor relacionado con la pendiente de la reacción de amplificación. Se calcula mediante la fórmula E = (10-

1/pendiente) – 1. Una eficiencia del 100% genera pendientes de – 3.32 y tiene una eficiencia de 1. Las reacciones con diferentes niveles de eficiencia pueden afectar a los Ct y generar curvas con pendientes variables.

Repetitividad/Reproducibilidad: Se define repetitividad como el grado de concordancia de los resultados obtenidos al ejecutar el método de ensayo repetidas veces por el mismo analista y bajo las mismas condiciones. Reproducibilidad, en cambio, consiste en el grado de concordancia de los resultados obtenidos al ejecutar el método de ensayo repetidas veces por dos analistas independientes.

4.8 Procesado de muestras reales

4.8.1 Preparación de la muestra

Para preparar muestras inoculadas, se hizo crecer L. pneumophila NCTC 11192 (National Collection of Type Cultures,England) durante tres días en medio BCYE-α. Pasado ese tiempo, se recogió la biomasa y se resuspendió en 10 mL de agua estéril. Se realizaron diluciones seriadas en base 10, añadiendo a 45 mL de agua estéril, 5 mL de la dilución anterior y por último se empleó la técnica de filtración por membrana con las diluciones 10-6, 10-7 y 10-8, que contenían 810, 81 y 8 copias/mL de L. pneumophila respectivamente. Se filtró 1 mL de cada dilución mediante filtros de membrana estéril de éster de celulosa de 0.45 µm de tamaño de poro y 47 mm de diámetro (Millipore, MZHAWG), transfiriendo la membrana sobre el medio de cultivo BCYE-α contenido en una placa Petri e incubándola a las condiciones óptimas para Legionella descritas anteriormente.


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Figura 4.11. Sistema de filtración por membrana

Para este estudio se analizaron muestras de agua potable y muestras de agua de torres de refrigeración. Como control positivo, se añadieron 2 mL de las diluciones 10-4, 10-5 y 10-6 (conteniendo 81000, 8100 y 810 copias/mL respectivamente) a 1L de agua corriente y 2 mL de las mismas diluciones para medio litro de agua de torres de refrigeración. Como control negativo se utilizaron 50 mL de agua estéril que se procesaron de la misma manera que las muestras a analizar.

4.8.2 Concentración de la muestra

Se filtró la totalidad de la muestra a través de una membrana filtrante de policarbonato de 47 mm de diámetro y 0.45 µm de tamaño de poro (Millipore, GTTP). A continuación se colocó la membrana en un tubo de plástico estéril al que se le añadieron 12 mL de agua estéril, agitándose en vortex durante 2 min. La suspensión se transfirió a un cartucho filtrante Amicon Ultra-15 (Millipore Molsheim, Francia) y se concentró la muestra por centrifugación a 20.000 xg en centrífuga (Beckman, Avanti J-25), durante 20 min. Transcurrido ese tiempo, se procedió a efectuar la lisis bacteriana del sedimento obtenido procediendo de la misma forma que en el apartado 4.3.

Figura 4.12. Cartucho filtrante Amicon Ultra-15 (Millipore) empleado para la concentración de muestras biológicas.


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4.8.3 Eliminación de inhibidores

En el caso de las muestras de agua potable no fue necesario pero en la mayoría de casos de aguas de torres de refrigeración, al tratarse de muestras con una elevada contaminación, es conveniente realizar un tratamiento de purificación del DNA previo a la reacción de PCR para eliminar los inhibidores que puedan estar presentes en la muestra (materia orgánica como ácidos fúlvicos y húmicos y metales). Para ello, se utilizó el Kit de Preparación de Muestras de Aguas “sucias” (Ielab), basado en una etapa de lisis celular seguido de una etapa de purificación del DNA mediante una columna de exclusión molecular.

Figura 4.13. Procedimiento de purificación de DNA

4.8.4 Amplificación

Una vez extraído y purificado el DNA, para la amplificación por qPCR, se procedió del mismo modo que en el apartado 4.5 con la salvedad que el patrón interno ya estaría añadido a la mezcla de reacción. La actualización de los reactivos y volúmenes se muestran en la siguiente Tabla 4.10.


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Tabla 4.10. Mezcla de reacción para la amplificación de Legionella spp.


AgPath-ID Master Mix 12.5

Cebador LegF (100µM) 0.125

Cebador LegR (100µM) 0.125

Sonda Leg (50µM) 0.125

Sonda PI (50µM) 0.125

DNA PI 1

Taq Polimerasa 1

15µl / reacción

5. RESULTADOS

5.1 Conceptos estadísticos

Con el objetivo de facilitar la comprensión de los resultados, se describirán brevemente algunos conceptos estadísticos convenientes.

Promedio (Χ): Cantidad o valor medio que resulta de dividir la suma de todos los valores entre el número de estos.

Desviación típica (S): Es una medida de dispersión, que informa como de alejados se encuentran los datos alrededor de la media.

Desviación estándar relativa (RSD): Es la relación entre la desviación típica y su media.

Coeficiente de variación (CV): Es el valor de RSD expresado en porcentaje. Un porcentaje bajo indica que la dispersión de los datos es pequeña.

Los parámetros y cálculos realizados están basados en las normas ISO/TS 12869: Detección y cuantificación de Legionella spp. y L. pneumophila en muestras de agua utilizando la qPCR, ISO 17025: Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y de calibración e ISO 13843: Orientación sobre la validación de métodos microbiológicos, entre otras.


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5.2 Optimización de las condiciones de amplificación y optimización del patrón interno

Para conseguir la concentración óptima de trabajo de los cebadores diseñados, se realizó un batería de ensayos con distintas concentraciones de cada uno de los cebadores empleando una concentración fija de DNA patrón, 6 pg de DNA de L.pneumophila NCTC 11192 (National Collection of Type Cultures, England). Estos ensayos permitieron determinar la concentración de cebadores que proporcionaban los menores valores de Ct y la mayor intensidad de fluorescencia. Las concentraciones de cebadores ensayadas fueron de 300 a 900 nM. El resto de parámetros permaneció constante, incluyendo la temperatura de anillamiento y la concentración de la sonda TaqMan-MGB (que siempre se emplea una concentración por exceso de 250 nM). Los valores obtenidos de Ct, en todos los ensayos, fueron aproximadamente los mismos con todas las combinaciones, por lo que se utilizó la menor concentración (300 nM) de cada cebador.

Tabla 5.1. Optimización de la concentración de cebadores

Reverse

Forward 300 nM 500 nM 900 nM

300 nM

23.40

22.13

22.09

22.21

22.07

21.76

21.89

21.75

21.90

500 nM

21.71

21.43

21.57

21.69

21.43

21.58

21.65

21.56

21.43

900 nM

21.61

21.75

21.79

21.46

21.77

21.37

21.47

21.35

21.41

La concentración del patrón interno positivo se optimizó para minimizar la competencia con la diana de Legionella spp. Se combinaron diluciones seriadas en base 10 del patrón interno positivo con diferentes concentraciones de DNA de Legionella spp. y se realizó la amplificación con los cebadores 16S1-A y 16S2-A. La concentración en la que ya no se observó competencia con la diana de Legionella, fue la que se seleccionó para utilizar en todas las


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reacciones de amplificación, fue la que contenía 38 copias del patrón interno positivo. Los resultados se muestran en la Tabla 5.2.

Tabla 5.2. Optimización de la concentración de patrón interno (IPC)

Nº de copias rDNA 16S de

Legionella spp.

Ct de las sondas del gen rDNA 16S y del IPC al número de copias de IPC indicado.

380 38 0

IPC rDNA 16S IPC rDNA 16S IPC rDNA 16S

1000 35.48 30.79 37.55 30.83 - 30.68

100 36.22 34.18 36.19 32.71 - 32.67

10 34.09 36.70 35.64 36.34 - 35.11

0 34.19 - 34.40 - - -

Las regiones seleccionadas fueron analizadas en el programa Primer Express (Life Technologies) con el fin de que cumplieran los requisitos impuestos por la qPCR. Los cebadores y sondas incluyendo el patrón interno aparecen en la Tabla 5.3.

Tabla 5.3. Cebadores y sondas diseñados para la amplificación específica del género Legionella por qPCR.


16S1-A CCAACAGCTAGTTGACATCG

16S2-A AGGGTTGATAGGTTAAGAGC

16S1-S AGTGGCGAAGGCGGCTACCT-FAM

gyrB-S AACAAGACCCCGATCCACCCGAAG-VIC

5.3 Estudio de especificidad, sensibilidad, falsos positivos y falsos negativos

Los cebadores y la sonda fueron diseñados en una región conservada para todo el género Legionella del gen rDNA 16S. Para verificar su especificidad las secuencias de los cebadores y las sondas fueron comparadas con todas las


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secuencias depositadas en las bases de datos de nucleótidos del GenBank (NCBI) empleando la aplicación BLAST. Los alineamientos obtenidos demostraron que las regiones eran específicas del género Legionella, ya que en ninguno de los alineamientos aparecían secuencias de otros microorganismos. Además, el programa calculó la significancia estadística de las coincidencias (Altschul et al.,1990). Con este estudio se demostró la especificidad teórica de los cebadores y la sonda diseñados.

La especificidad experimental de los cebadores y de la sonda se realizó probando el diseño desarrollado con las especies enumeradas en la Tabla 4.3.

Con todos los datos obtenidos en estos experimentos se calcularon los siguientes parámetros (Tabla 5.4): verdadero positivo (VP), falso positivo (FP), verdadero negativo (VN) y falso negativo (FN), tal y como aparece en la norma ISO/TR: 13843.

Tabla 5.4. Generación de los conceptos VP, FP, VN y FN.

Patrón de referencia

Prueba

Positivo Negativo

Positivo Verdadero positivo (a) Falso positivo (b)

Negativo Falso negativo (c) Verdadero negativo (d)

El concepto de verdadero positivo se define como la proporción de muestras positivas que contienen el microorganismo. Por el contrario, verdadero negativo se define como la proporción de muestras negativas que no contienen el microorganismo.

El set de cebadores y la sonda amplificaron todas las cepas de Legionella spp. pero ninguna otra bacteria analizada en este trabajo (Tabla 5.5).

Tabla 5.5. Análisis de la especificidad y la sensibilidad de los cebadores y la sonda

Legionella spp. Otros géneros

Amplifica + -

No amplifica - +

A continuación, a partir de los resultados obtenidos en la tabla anterior y, según lo descrito en la Tabla 5.4. se obtuvo la siguiente clasificación final:


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Tabla 5.6. Clasificación de los resultados VP, FP, VN y FN

Clasificación Total

a 1

b 0

c 0

d 1

Total 2

Finalmente, a partir de las fórmulas específicas, se calcularon los valores de sensibilidad, especificidad, falsos positivos y falsos negativos (Tabla 5.7) siguiendo la norma ISO/TR: 13843.

Tabla 5.7. Fórmulas y resultados de la sensibilidad, especificidad, falsos positivos y falsos negativos de los cebadores y la sonda

Parámetro Fórmula Resultado

Sensibilidad a/(a+b) 1

Especificidad d/ (d+c) 1

Falsos positivos c/(a+c) 0

Falsos negativos b/(b+d) 0

Los resultados demostraron que los cebadores y la sonda analizados, poseían una elevada sensibilidad y especificidad para la detección de Legionella spp. no encontrándose falsos positivos ni falsos negativos en las cepas analizadas en este trabajo.

5.4 Límite de detección y límite de cuantificación

Para calcular el límite de detección del método de qPCR se utilizaron concentraciones bajas de DNA de L. pneumophila NCTC 11192 (National Collection of Type Cultures,): 10 réplicas de 100 copias, 10 réplicas de 50 copias, 10 réplicas de 25 copias y 10 réplicas de 10 copias.

Los resultados mostraron que las réplicas que contenían 100, 50, y 25 copias se detectaron en el 100% de los casos, mientras que las réplicas de 10 copias tan sólo se detectaron en un 50%. Por otro lado, se observó una marcada


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disminución entre el número de copias inicial y el número de copias detectadas en las cuatro concentraciones. Por lo tanto, puesto que el límite de detección experimental se define como la concentración más baja de unidades genómicas que pueden ser detectadas con la probabilidad del 100%, en este método, la concentración más baja se situaría en el límite de 25 copias.

Tabla 5.8. Límite de detección del método de qPCR

100 50 25 10

Ct Copias Ct Copias Ct Copias Ct Copias

29.38 85.26 31.49 19.78 33.24 5.86 34.69 0.1

30.01 55.08 32.50 9.78 32.69 8.58 34.80 1.99

29.63 71.68 32.02 13.64 32.19 12.14 - -

29.35 87.05 31.62 18.01 34.09 3.25 35.19 1.52

30.56 37.61 31.92 14.62 32.18 12.23 - -

29.69 68.76 32.56 9.47 33.19 6.07 - -

30.44 40.87 31.52 19.35 32.58 9.26 - -

30.07 52.83 32.20 12.06 33.45 5.07 34.91 1.83

29.86 61.11 31.64 17.79 34.24 2.93 - -

31.19 24.30 32.68 8.67 33.20 6.02 34.48 2.49

X

Detección (%)

30.02 58.45 32.01 22.30 33.14 7.14 34.84 1.59

100 100 100 50

Debido a la baja reproducibilidad que se obtiene a bajas concentraciones, el límite de cuantificación fue calculado a partir de la desviación estándar de los valores de los Ct en el límite de detección, es decir, la desviación estándar obtenida en los Ct de 25 copias de concentración. Por esta razón, cuando a la media del valor de los Ct a esa concentración se le incrementó 3 veces el valor de la desviación estándar, el nuevo valor de Ct resultó en 30.77. Por lo tanto, de


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acuerdo con la curva estándar, el número de copias calculadas fue de 32.38, lo que indicaba que la cuantificación es posible por encima de este límite.

5.5 Curva estándar y eficiencia de la reacción.

En qPCR cuantificar es sinónimo de determinar el número de copias de un gen diana presente en una muestra, para ello es necesario utilizar una recta patrón. Esta se obtuvo mediante la preparación de diluciones seriadas en base 10 de dos concentraciones conocidas de DNA de L.pneumophila. En el gráfico de amplificación de una serie de diluciones, el valor de Ct es inversamente proporcional a la concentración del DNA diana inicial. (Figura 5.1).

Puesto que el número inicial de copias del gen diana en una muestra desconocida se determina interpolando su valor de Ct en la ecuación de la recta patrón obtenida, es necesario que esta sea lo suficientemente precisa para utilizarla en distintas reacciones. Es por ello, que el uso de una recta patrón obtenida a partir de una única reacción no es recomendable puesto que no refleja las variaciones que se pueden producir durante la amplificación, como alteraciones en la temperatura (afectando al anillamiento y/o desnaturalización) o análisis de concentraciones diferentes producidas por errores en el pipeteo, entre otras.

Para solucionar este problema, se llevaron a cabo 6 experimentos diferentes de amplificación por triplicado, obteniendo un total de 120 puntos para la elaboración de una recta más robusta y por tanto más precisa al incluir los factores de variación.

Figura 5.1. Recta de calibrado de Legionella pneumophila

Al finalizar la amplificación, se realizó un análisis de regresión lineal, enfrentando en un gráfico los valores obtenidos de los Ct frente al logaritmo del número de copias del gen rDNA 16S, obteniendo una recta robusta con un coeficiente de correlación (r) de -0.990 (R2=0.980). La ecuación resultante de la


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curva de regresión obtenida fue Ct = - 3.32 log10 [número de copias] + 35.79, teniendo un rango lineal de 6-log10. Por último, la eficiencia de la reacción se determinó a partir de la pendiente de la porción lineal de la recta robusta, utilizando la fórmula E = (10-1/pendiente) – 1 y resultando en una eficiencia de 1.00. Esta eficiencia coincide con el valor del máximo teórico (1.00), que indica que la cantidad del producto de amplificación se duplica en cada ciclo. Reacciones con diferentes eficiencias afectarán a los Ct y producirán rectas de calibrado con distintas pendientes (Bustin et al., 2009).

Figura 5.2. Recta estándar del gen rDNA 16S de Legionella spp.

5.6 Reproducibilidad y repetitividad

La reproducibilidad y la repetitividad son términos de la validación, que tienen como objetivo la normalización de un método de ensayo.

La repetitividad determina la proximidad entre los resultados de mediciones sucesivas, efectuadas en las mismas condiciones. Se incluye el mismo procedimiento de medición, mismo analista, instrumentos, lugar y repeticiones dentro de un periodo corto de tiempo (Llamosa et al., 2007).

La reproducibilidad en cambio, refleja la proximidad entre los resultados de las mediciones pero efectuadas bajo condiciones de medición diferentes. Estos cambios incluyen el analista, instrumentos, lugar, condiciones de uso y tiempo, entre otros. Sus resultados determinarán si se podrá llevar a cabo el mismo procedimiento obteniendo resultados similares.

Para elaborar una evaluación de las variaciones que se producen en los múltiples ensayos, tanto durante (intra-ensayo) como entre ellos (inter-ensayo), se llevó a cabo la preparación de diluciones seriadas en base 10 de un DNA diana y se efectuó el ensayo con 6 concentraciones de DNA de Legionella realizando el experimento dos veces, una por cada analista. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 5.9.


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Tabla 5.9. Reproducibilidad y repetitividad del gen rDNA 16S en PCR cuantitativa.

Nº de copias

Coeficiente de variación (%)

Intra-ensayo Inter-ensayo

Ct Nº de copias Ct Nº de copias

1235000 0.42 5.2 0.67 8.2

123500 1.4 19.22 1.84 25.32

12350 1.06 18.07 1.28 23.07

1235 0.83 15.79 0.76 14.1

123.5 1.68 33.61 1.52 30.59

12.35 0.45 11.41 0.35 8.36

El coeficiente de variación para los Ct fue 1.08% en el estudio intra-ensayo (repetitividad) y 1.19% en el estudio inter-ensayo (reproducibilidad). En contraste, cuando las variaciones del intra- y el inter-ensayo fueron calculadas teniendo en cuenta el número de copias del DNA diana, los valores fueron 46.08% y 20.19% respectivamente, que es superior que los valores de Ct. Por otro lado, las diferencias se encontraron para ambos (intra- e inter-ensayo), en las muestras que contenían elevados y bajos números de copias: cuando el número de copias disminuía, el valor del coeficiente de variación aumentaba.

5.7 Cuadro resumen de validación

En la siguiente tabla (Tabla 5.10) se muestra un resumen de todos los resultados de la validación del método de qPCR:

Tabla 5.10. Resumen de la validación

Microorganismo Legionella spp.

Proceso Amplificación por qPCR con cebadores y sonda específicos.


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Control de la amplificación Interno (competitivo con la diana en la misma reacción)

Parámetros de validación

Especificidad Legionella spp.

Analizado con 29 cepas de Legionella spp. y 28 cepas de diferentes géneros

Falsos positivos/ Falsos negativos No detectados

Linealidad Rango de 6-log10

Eficiencia de la reacción 1

Límite de detección (LOD) 25 copias (100%)

Límite de cuantificación (LOQ) 32.38 copias (100%)

Repetitividad / Reproducibilidad Repetitividad: (Ct) 1.08%

(DNA) 46.08%

Reproducibilidad: (Ct) 1.19%

(DNA) 20.19%

5.8 Aplicación del diseño en muestras naturales y comparación con el método tradicional de cultivo.

Para acabar la validación, el método fue ensayado en muestras naturales. La detección de Legionella. spp mediante qPCR fue utilizada para analizar 5 muestras de agua potable y 5 muestras de agua de torre de refrigeración. Todas las muestras fueron procesadas en paralelo para la técnica tradicional, aislamiento de Legionella spp. mediante cultivo y qPCR. Todas las muestras ensayadas dieron resultados positivos para los dos métodos. En todos los casos los resultados obtenidos empleando qPCR (ug) fueron más altos que los obtenidos mediante cultivo (CFU). La media de la diferencia encontrada entre cultivo de qPCR para muestras de agua potable fue de 3.82 y en el caso de aguas de torres de refrigeración fue 2.21 (Tabla 5.11).


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Tabla 5.11. Comparación de la detección de Legionella spp. por cultivo tradicional y qPCR para muestras de agua de torre de refrigeración

Cultivo (ufc/L) qPCR (UG/L)

3.86 4.08

2.86 3.66

4.86 5.05

3.86 4.21

2.86 3.51

Ʃ= 18.29 Ʃ=20.50

Tabla 5.12. Comparación de la detección de Legionella spp. por cultivo tradicional y qPCR para muestras de agua potable

Cultivo (ufc/L) qPCR (UG/L)

4.86 5.66

3.86 4.73

4.86 5.57

3.86 4.66

2.86 3.49

Ʃ=20.29 Ʃ=24.11

6. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

La amplificación de ácidos nucleicos por PCR y más recientemente por qPCR ha demostrado que es capaz de detectar la presencia de las especies de Legionella en muestras ambientales, solucionando los problemas que presenta el aislamiento mediante cultivo como la rapidez y la sensibilidad (Ballard et al., 2000; Hayden et al., 2001; Rantakokko-Jalava et al., 2001; Wellinghausen et


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al., 2001). Sin embargo, todos los trabajos de este campo describen el diseño de sondas y cebadores y ninguno de ellos presenta una validación completa del sistema incluyendo amplios estudios de especificidad y sobretodo aplicaciones en muestras naturales. Esto hace que estas metodologías sean complicadas de implementar en laboratorios de rutina ya que para que una nueva metodología pueda ser implementada es necesario realizar una validación completa y sobretodo es muy importante realizar ensayos comparativos dónde el método alternativo se compare con el método que se utiliza habitualmente en el laboratorio y que suele ser el que está aceptado en todas las legislaciones y normas. Es necesario demostrar que el método alternativo que se propone es igual o mejor que el empleado habitualmente. En este trabajo se ha validado un método de qPCR en el gen rDNA 16 S para la detección y cuantificación de Legionella spp. .

La especificidad de los cebadores y la sonda MGB fue confirmada llevando a cabo múltiples búsquedas en bases de datos de nucleótidos y analizando 29 especies de Legionella spp. y 28 especies de otros géneros evolutivamente relacionados o comúnmente presentes en muestras ambientales.

Se construyó una recta estándar de DNA de L. pneumophila empleando la tecnología de qPCR, ya que para conocer el número de copias del gen de interés en una muestra desconocida es necesario interpolar el valor de los Ct

obtenidos con una recta estándar. Sin embargo, una recta obtenida a partir de una sola reacción no resultaría viable al no incluir los posibles errores durante la preparación y amplificación. Es por ello, que la recta se generó a partir de una amplia gama de concentraciones que se analizaron por triplicado y se repitieron varias veces, obteniendo un total de 120 puntos. De esta manera, se proporcionó un método fácil, rápido y barato de cuantificar DNA de una manera precisa y reproducible por esta metodología.

El límite de detección en el ensayo fue de 25 copias del DNA diana, siendo comparable con otros autores que obtuvieron límites de detección similares como Wilson et al. (2003) que detectaron 10 copias del DNA de L.pneumophila y Yañez et al., (2005) que detectaron 6.73 copias. Este valor del límite de detección resultó óptimo ya que indicaba que el método era capaz de detectar especies de Legionella presentes en muestras ambientales aunque estuvieran en bajas concentraciones.

La reproducibilidad de este método de qPCR se evaluó empleando los valores del coeficiente de variación de varios intra- e inter-ensayos. El coeficiente de variación se calculó para los Ct, así como también para el número de copias. Sin embargo, a causa de la naturaleza exponencial de la amplificación de qPCR, la concentración y los Ct tienen una relación logarítmica-lineal, lo que


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ocasiona que los coeficientes de variación esperados para los Ct sean inferiores a los de las concentraciones.

Una vez que se calcularon todos los parámetros de validación se realizó un pequeño estudio de la aplicación del método desarrollado en muestras ambientales y sus resultados se compararon con el método aplicado tradicionalmente en el laboratorio. Los resultados obtenidos indicaron que los datos de qPCR siempre eran más elevados que los obtenidos por cultivo. Estos resultados son normales ya que cuando se realiza la amplificación de DNA estamos detectando el total de células que hay en una muestra: estamos detectando el DNA de las células vivas, de las células muertas y de las células que son viables y no cultivables, en el caso del cultivo sólo se detectan las células que son capaces de crecer en el medio de cultivo (viables cultivables). Además en el caso de Legionella, las tasas de recuperación del cultivo son normalmente bajas (70-60% de la población cultivable) debido a los requisitos específicos de crecimiento, crecimiento excesivo de otras bacterias (que enmascaran el crecimiento de Legionella) y la pérdida de Legionella por daños ocasionados durante la preparación de la muestra. Por estos motivos, el número de células calculadas por qPCR será siempre mayor que el número de CFU de los cultivos (Huijsdens et al., 2002; Wellinghausen et al., 2001). Sin embargo, este método presenta la limitación de no poder diferenciar las células muertas de las células vivas que son las causantes de la enfermedad, hecho que impide obtener una información precisa de la población infectiva. Es conveniente apuntar, que en este trabajo se efectuó el análisis de 10 muestras solamente y que para hacer un buen estudio de correlación entre dos métodos y obtener unos resultados reproducibles, es recomendable analizar un mínimo de 70-80 muestras.

Las muestras ambientales contienen generalmente la presencia de inhibidores de la qPCR tales como, metales pesados y materia orgánica. Se han descrito diferentes métodos de purificación de DNA (Abbaszadegan et al., 1993; Hurt et al., 2003; Koonjul et al., 1999; Tsai et al.,1993), que han intentado eliminar estos inhibidores, pero a pesar de sus ventajas, en algunas muestras problemáticas se continúan detectando inhibiciones. Por esta razón, el uso en la qPCR de un control positivo interno es muy importante para controlar la presencia de esos inhibidores en las muestras, pudiendo así evaluar la posible presencia de falsos resultados negativos. En este trabajo, se ha desarrollado un método de qPCR que utiliza los mismos cebadores para la amplificación del gen rDNA 16 S de Legionella y para el control positivo interno. Este método ha sido utilizado por autores como Kolk et al. (1994) que utilizaron como control positivo interno una cepa de Mycobacterium smegmatis en su estudio para la detección de la secuencia IS6110 de Mycobacterium tuberculosis o Yañez et al. (2005) que emplearon la bacteria Aeromonas hydrophila en su estudio de


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detección del fragmento del gen dotA de L.pneumophila. Este método tiene la ventaja de una rápida detección tanto del DNA diana como de un posible inhibidor mientras se mantiene la sensibilidad del ensayo de qPCR.

En los últimos años, los métodos de PCR se están ya incluyendo en las normas ISO, favoreciendo la normalización de métodos oficiales para su uso en laboratorios de diagnóstico. Estos métodos de referencia han sido exhaustivamente estudiados y describen de forma clara y exacta la realización del ensayo. Como ya se ha descrito, el uso de métodos alternativos al método de referencia está permitido, aunque para ello es indispensable desarrollar un protocolo de validación exhaustivo así como comparar que sus resultados son equivalentes o mejores que el método de referencia.

Las conclusiones de este trabajo se pueden resumir en 4:

1. Se ha diseñado y validado un método de qPCR para la detección y cuantificación de qPCR.

2. Los parámetros de validación obtenidos indican que el método puede ser aplicado para la detección y cuantificación de Legionella spp. en muestras ambientales.

3. Como ya se había demostrado en trabajos anteriores se presenta como un método más rápido (5-6 horas) frente al método tradicional empleado (14 días para obtener resultados por cultivo) y con mayor sensibilidad y especificidad.

4. Los resultados obtenidos en muestras reales indican que los recuentos empleando qPCR siempre son superiores ya que la información que ofrece proviene de la amplificación del DNA de células viables, viables no cultivables y células muertas. Por ello es necesario el desarrollo de un método que pueda informar de la presencia de células vivas que son las que indican la presencia de células infectivas.


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