Aracely García Cuan, Anahí Barros Martínez,
Anny Miranda Cárdenas, Andrés De la Hoz Pabola,
Juan Lara Cobos, Franklin Torres Jiménez
©2019
DETECCIÓN DE Helicobacter pylori POR PCR ANIDADA EN MUESTRAS NO INVASIVAS
Universidad Libre Seccional Barranquilla Facultad de Ciencias de la Salud Programa de Medicina
Editora: Ana Mercedes Medina Buelvas
Compiladores: Celia Rossi, Anahí Barros
Coordinador Editorial: Juan Carlos Miranda
Ediciones Corporación Universidad Libre Barranquilla
Barranquilla
www.unilibrebaq.edu.co
Tel. 6020808
Bogotá, D.C. , Colombia
Detección de Helicobacter pylori por PCR anidada en muestras no invasivas : guía práctica / Aracely García Cuan … [et al.]. -- editora, Ana mercedes Medina Buelvas ; compiladores, Celia Rossi, Anahí Barros. -- Barranquilla : Corporación Universidad Libre Barranquilla, 2019.
96 p. : il., gráficas
ISBN Digital: 978-958-9145-77-7
Contenido: C.1 Extracción del ADN Genómico -- C.2 Cuantificación de ADN por Espectrofotometría -- C.3 Electrofóresis en Gel de Agarosa -- C.4 Electrofóresis en Gel de Poliacrilamida -- C.5 Preparación de un control interno para PCR Anidada -- C.6 Determinación de parámetros de desempeño de la PCR anidada para la amplificación del producto externo e interno del gen ureA en Helicobacter pylori -- C.7 Amplificación del gen Cag A en Helicobacter pylori mediante PCR convencional -- C.8 Aplicación de la técnica de PCR anidada para la detección de Helicobacter pylori en placas arterioescleróticas – Apéndices -- Bibliografía.
1. Helicobacter pylori – Diagnóstico - Guías -- 2. Úlcera péptica -- 3. Enfermedades del aparato digestivo. -- I. García Cuan, Aracely-- II. Universidad Libre Seccional Barranquilla. Facultad de Ciencias de la Salud. Centro de Investigaciones
616.3 -- dc23
Guía práctica
Universidad Libre Seccional Barranquilla Facultad de Ciencias de la Salud
Programa de Medicina Centro de investigaciones
DETECCIÓN DE Helicobacter pylori
DIRECTIVA NACIONAL
DIRECTIVA SECCIONAL
Censor: PATRICIA OLIVARES BOLIVAR Directora Centro de Investigaciones: WENDY ROSALES RADA
Decano: SALVADOR RADA JIMÉNEZ Director Centro de investigación de facultad: JESÚS IGLESIAS ACOSTA Directora programa de Medicina: LUCIANA HERNÁNDEZ MALDONADO
CONTENIDO
Capítulo 2
Capítulo 3
Capítulo 4
Capítulo 5
Capítulo 6
Determinación de parámetros de desempeño de la PCR anidada para la amplificacion del producto externo e interno del gen ureA en Helicobacter pylori ..........…….......................... 55
Capítulo 7
Amplificación del gen Cag A en Helicobacter pylori mediante PCR convencional ........……................................................... 65
Capítulo 8
Aplicación de la técnica de PCR anidada para la detección de Helicobacter pylori en placas arterioescleróticas ............. 69
APENDICES Apéndice 1
Recomendaciones previas para preparar medios de cultivo y soluciones ........……................................................................ 76
Apéndice 2
Apéndice 3
Apéndice 4
Apéndice 5
Apéndice 6
Anexo 1
Anexo 2
Bibliografía ........…….................................................................................... 93
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Resultados de la cuantificación de ADN obtenido a partir de una muestra de saliva ...................................................... 33
Tabla 2. ADN de diferentes microorganismos y diferentes concentraciones ............................................................................. 38
Tabla 3. Porcentajes de concentración de agarosa sugeridos para la visualización de moléculas de ADN ..................................... 39
Tabla 4. Reactivos para preparación del gel de poliacrilamida ..................... 45
Tabla 5. Reactivos y concentraciones necesarias para preparar un tubo de reacción Control Interno del gen UreA para la PCR anidada (Primera amplificación) ........………...................... 49
Tabla 6. Perfil de temperatura para la PCR anidada del Control Interno del gen UreA (Primera amplificación) ................................. 50
Tabla 7. Reactivos y concentraciones necesarios para preparar un tubo de reacción Control Interno del gen UreA para la PCR anidada (Segunda amplificación, Master Mix comercial) .................................................................. 58
Tabla 8. Reactivos y concentraciones necesarios para preparar un tubo de reacción Segmento Externo del gen UreA para la PCR anidada (Primera amplificación, Master Mix no comercial) .............................................................. 58
Tabla 9. Perfil de temperatura para PCR anidada del Segmento Externo del gen UreA (Primera amplificación) ........……………......... 59
Tabla 10. Reactivos y concentraciones necesarios para preparar un tubo de reacción Segmento Interno del gen UreA para la PCR anidada (Segunda amplificación) ............….............. 59
Tabla 11. Perfil de temperatura para PCR anidada del Segmento Interno del gen UreA (Segunda amplificación) .............................. 60
Tabla 12. Reactivos y concentraciones necesarios para preparar un tubo de reacción del gen CagA para PCR convencional ................................................................................ 67
Tabla 13. Perfil de temperatura para PCR convencional del gen CagA .............. 67
Tabla 14. Oligonucleótidos seleccionados para la estandarización de la prueba de PCR anidado para la detección de H. pylori ....................................................................................... 87
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Curva de absorbancia de ADN obtenido a partir de una muestra de saliva ......................................................................... 33
Figura 2. Cuantificación de ADN método de dots ......................................... 41
Figura 3. Efecto sonrisa, por lo general causado por variaciones del voltaje, temperatura o incorrecta solidificación de la agarosa .................................................................................... 41
Figura 4. Corrido electroforético de ADN degradado ..................................... 41
Figura 5. Corrido electroforético de fragmento externo de muestras de saliva ........................................................................ 52
Figura 6. Corrido electroforético en gel de poliacrilamida de ADN genómico de Helicobacter pylori y Control Interno (CI) a 100 copias ................................................................................... 52
Figura 7. Corrido electroforético de fragmento externo de muestras de saliva ........................................................................ 53
Figura 8. Corrido electroforético de fragmento interno de muestras de saliva ....................................................................... 62
Figura 9. Corrido electroforético de PCR realizada a partir de muestras de ADN de distintos orígenes .................................... 63
Figura 10. Curva del límite de detección de la PCR anidada a partir de soluciones de ADN de cantidades conocidas ............... 63
Figura 11. Corrido electroforético de fragmento CagA en muestras de saliva ....................................................................... 68
Figura 12. Ateroma obtenido de arteria carótida interna ............................... 74
Figura 13. Ateroma obtenido a partir de la arteria coronaria derecha ......................................................................... 74
Figura 14. Corrido electroforético de PCR realizada a partir de muestras de ADN extraídas de placas de ateroma, obtenidas de pacientes con diversas patologías cardiovasculares .......................................................... 75
Figura 15. Verificación de ADN CI .................................................................. 86
Figura 16. Cromatograma de la secuenciación del fragmento interno de H. pylori ........................................................................ 90
Figura 17. Cromatograma de la secuenciación del fragmento interno de H. pylori ........................................................................ 91
ABREVIATURAS
• CN: Control negativo
• CP: Control positivo
• g: Gramos
• H2O TI: Agua Ultrapura Tipo I
• ICONTEC: Instituto Colombiano de Normas Técnicas
• ISO: Organización Internacional para la Estandarización
• KH2PO4: Fosfato de potasio monobásico
• L: Litro
• lb: Libras
• M: Molar
• PK: Proteinasa K
• TEMED: Tetrametiletiléndiamina
• TG: Tampón de lisis
A los patrocinadores: Gobernación del Atlántico (SGR), Convenio 0103*2015*000031, Universidad Libre Seccional Barranquilla.
Centros de Gastroenterología: CEVIED, Clínica de la Costa, Jorge Carreño. Laboratorio de docencia en Microbiología y Biología Molecular de la Universidad Libre Seccional Barranquilla, Grupo de Infecciones Nosocomiales y Resistencias Microbianas de la Universidad Simón Bolívar, Grupo de Investigación en Genética y Biología Molecular de la Universidad del Norte.
MD gastroenterólogos: Jorge Carreño Rueda, Carlos Quin Quin, Jesús Pérez Orozco, Alberto Villegas Sanguino, por sus asesorías y el suministro de las muestras del estudio.
Al Director Científico de la Clínica de la Costa: Eduardo Martínez por el apoyo otorgado durante el proceso de recolección de datos y muestras.
Compiladores: Celia Rossi Trespalacios. Químico farmacéutica Universidad de Cartagena, Magister en Microbiología convenio Universidad Pontificia Javeriana- Universidad del Norte.
Anahí Barros Martínez. Microbióloga Universidad Libre Seccional Barranquilla.
Fotografías en la portada: Mario Peña Freyle, Laura Martínez Parra con su aporte con la imagen "Coloración Epifluorescencia del Helicobacter pylori."
PRÓLOGO
El propósito de esta guía es describir técnicas para la detección de Helicobacter pylori aplicando nuevas tecnologías basadas en el método de PCR anidado en material biológico tomado de manera no invasiva como saliva y heces. De acuerdo con los resultados obtenidos en este trabajo, el método ha demostrado buena sensibilidad y especificidad.
En esta guía hemos querido sintetizar los requerimientos mínimos y las técnicas utilizadas y validadas, estas últimas descritas paso a paso, para que el profesional de laboratorio pueda implementarlas en su trabajo.
La obra se compone de las técnicas de extracción, purificación y cuantificación de ADN genómico, aplicable a las muestras de saliva, sangre, biopsia y heces fecales teniendo en cuenta las modificaciones pertinentes en los protocolos, específicas para cada matriz; se describen los parámetros de desempeño de la PCR anidada para la amplificación del producto externo e interno del gen ureA y PCR convencio- nal para el gen cagA en Helicobacter pylori, la técnica de electroforesis en gel de agarosa utilizada para la confirmación de la presencia de ambos genes, la prepa- ración de las soluciones reactivos y medios de cultivo incluidos en la sección en los Apéndices; además, recomendaciones para mejorar el desempeño de la técnica.
Al final, también se incluye la aplicación de la técnica para detectar H. pylori en formas extragástricas (placas de ateroma).
INTRODUCCIÓN
Helicobacter pylori es un bacilo, microaerófilo y agente etiológico asociado con la enfermedad ácido-péptica en humanos. Actualmente se le conoce responsable del 85-95 % de las úlceras duodenales, 70- 80 % de las úlceras gástricas y tiene protagonismo relevante en el 60- 70 % de los casos de cáncer gástrico, neoplasias más frecuentes a nivel mundial (1,2). En zonas costeras de Colombia (Barranquilla, Cartagena y Santa Marta), un estudio realizado a partir de biopsias gástricas reportó una frecuencia de infección por H. pylori de 77,9% (3).
El riesgo de desarrollo, distribución y la severidad de las patologías relacionadas con infección por H. pylori depende de una variedad de factores: la patogenicidad y virulencia de la bacteria, la susceptibilidad del huésped y el nivel socio-económico, entre otros (4–8).
Hoy se emplean diversidad de técnicas para el diagnóstico del H. pylori: cultivos microbiológicos, estudios histopatológicos, test del aliento, test rápido de la ureasa, test serológicos, test de antígeno en heces y más recientemente pruebas molecula- res de ADN y ARN. Sin embargo, las técnicas convencionales se caracterizan por su complejidad, escaso valor predictivo y costos elevados (9–11).
La PCR es la prueba molecular más extensamente usada por su sensibilidad, espe- cificidad y aplicabilidad para detectar microorganismos de difícil aislamiento, como es el caso de H. pylori (12).
Detección de Helicobacter pylori por PCR Anidada en muestras no invasivas
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La PCR anidada es una variante en la cual el fragmento externo resultante de una primera ronda de amplificación contiene sitios de hibridación para un segundo par de cebadores, los cuales inician la síntesis del segmento interno reconocido. Debido al mayor número de ciclos se aumenta la sensibilidad y verifica la especificidad de la primera reacción (13,14), y ha sido empleada para la detección de Helicobacter pylori en muestras con poca densidad microbiana como saliva, biopsia, heces y sangre humana (15–18).
El presente documento es un producto resultado del proyecto de investigación: “Identificación de Helicobacter pylori mediante prueba molecular no invasiva, y factores de riesgo asociados en el departamento del Atlántico” del Sistema General de Regalías (SGR), el cual desarrolla en forma detallada las técnicas moleculares utilizadas para detectar Helicobacter pylori en distintas matrices, a fin de facilitar la comprensión del lector. Se incluyen los requerimientos de materiales, insumos y equipos, además de recomendaciones en la práctica de laboratorio para obtener mejores resultados. Además, se realizaron pruebas de calidad interna y externa, acorde con las normas de acreditación reglamentadas por el Sistema General de Seguridad Social en Salud para Colombia (Decreto 1011 del 3 de abril de 2006) para laboratorios prestadores de servicio; los estándares ISO/IEC 17025: 2005 para Laboratorio de Ensayo y Calibración (19) y la Resolución 1619 de 2015 que describen los estándares de calidad en salud pública (20). Asimismo, los procedimientos se apoyan en fotografías derivadas del desarrollo del proyecto.
CAPÍTULO 1
EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO Andrés Felipe De la Hoz Pabola, Anny Paola Miranda Cárdenas,
Anahí María Barros Martínez.
La extracción de ácido desoxirribonucleico (ADN) genómico es el punto de partida de una serie de técnicas de biología molecular, por la cual es posible aislar y ca- racterizar genes que no han podido determinarse por métodos tradicionales y que pueden emplearse en el diagnóstico de enfermedades y trastornos genéticos. La técnica de extracción consiste en separar el ADN de las células (y demás organelos) o virus en las que normalmente reside.
Palabras clave: extracción de ADN, ADN, saliva, heces, biopsia, sangre.
Detección de Helicobacter pylori por PCR Anidada en muestras no invasivas
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Objetivo Describir las pautas para realizar la extracción de ADN total a partir de saliva, heces, biopsia y sangre, utilizando métodos de extracción tradicionales y kits comerciales, con el fin de obtener un material íntegro y libre de inhibidores de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).
Definiciones ADN genómico: molécula de doble hélice presente en todas las células nucleadas, que guarda las instrucciones para el funcionamiento de los seres vivos y su rela- ción con el entorno. Por ello, su extracción y purificación son el primer paso para cualquier experimento que implique su estudio (21).
Materiales, insumos y equipos • Bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes desechables
• Tubos de centrífuga de 1.5 mL estériles
• Puntas de micropipetas estériles y libres de desoxirribonucleasa (ADNsas)
• Gradillas
• Dodecilsulfato sódico (SDS) al 10%
• Cloruro de sodio (NaCl) al 5M
• Isopropanol puro
Guía Práctica
• Pipetas automáticas
• Tubos de recolección de 2 mL
• Columnas
• Proteinasa K (liofilizada) (PK)
• Tampón para proteinasa PR (PR)
Nota: Para ver preparación de los reactivos de los kits, ir a Apéndice 5. Preparación de los reactivos comerciales.
Procedimiento
SALIVA Recolección de muestra mediante hilo dental
1. Frotar suavemente el hilo dental entre los dientes del paciente.
2. Depositar el hilo en un tubo de centrífuga previamente esterilizado y en el cual se han dispensado 500 µL de agua peptonada o PBS.
3. Codificar los tubos en la tapa y rótulo con el número de paciente, institución hospitalaria y fecha en que fue tomada la muestra.
Detección de Helicobacter pylori por PCR Anidada en muestras no invasivas
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Preparación de la muestra
4. Dejar reposar las muestras a temperatura ambiente (entre 25- 28°C) durante 5 minutos.
5. Humedecer las pinzas con alcohol al 70%.
6. Flamear en un mechero y dejar enfriar.
7. Sujetar con las pinzas el hilo dental por un extremo y hacer presión contra la tapa y la boca del tubo, con la finalidad de extraer la saliva impregnada.
8. Homogeneizar usando el vórtex y adicionar 50 µL de PBS.
9. Continuar con las instrucciones en “Obtención de ADN (lisado de células)”.
Recolección de muestra mediante esputo
1. Depositar saliva directamente desde la boca al tubo de centrífuga hasta com- pletar 2 mL.
2. Codificar los tubos en la tapa y rótulo con el número de paciente, institución hospitalaria y fecha en que fue tomada la muestra.
Preparación de la muestra
3. Depositar 150 µL de saliva en un tubo de centrífuga estéril de 1,5 mL.
4. Completar con 50 µL de PBS para un total de 200 µL.
5. Mezclar en vórtex por 5 minutos y un spin (10 segundos) en microcentrífuga.
6. Llevarlas a baño serológico por 10 minutos a 37 °C.
7. Centrifugar a 12000 RPM por 5 minutos.
8. Continuar con las instrucciones en “Obtención de ADN (lisado de células)”
Obtención de ADN (lisado de células)
1. Adicionar 200 µL de BL, 4 µL de lisozima y 150 µL de SDS al 10%. Homogenei- zar con vórtex por 10 segundos e incubar durante 1 hora a 37 °C.
Remoción de contaminantes y separación de fases
2. Agregar 400 µL de NaCl al 5M.
3. Incubar durante 10 minutos a 4 °C.
Guía Práctica
4. Centrifugar a 12000 RPM por 10 minutos.
5. Transferir el sobrenadante a un tubo de reacción nuevo y estéril libre de desoxirri- bonucleasa (DNasas) y ribonucleasas (RNasas).
Limpieza del ADN
6. Añadir 800 µL de isopropanol puro.
7. Centrifugar por 5 minutos a 13000 RPM y 4 °C.
8. Descartar sobrenadante y lavar el pellet con 500 µL de etanol al 70%.
9. Mezclar suavemente por inmersión y centrifugar por 5 minutos a 13000 RPM y 4 °C.
10. Descartar el sobrenadante y dejar secar con calor seco a 50 °C.
Reconstitución y almacenamiento del ADN
11. Adicionar 50 µL de H2O TI, cuantificar el ADN (ver Capítulo 2. Cuantificación de ADN por espectrofotometría) y distribuir en alícuotas.
12. Almacenar en congelador a -20 °C o a menor temperatura si es posible.
Nota: El protocolo original fue obtenido de (1)the amount of human DNA (as mea- sured by a TaqMan-based assay.
MATERIA FECAL Recolección de muestra
1. Depositar una muestra de materia fecal suficiente en un frasco coprológico. Este paso debe realizarlo el paciente.
2. Transportar la muestra en refrigeración entre 4-9°C hasta el laboratorio para su procesamiento.
3. Transferir 0,5 g de materia fecal aproximadamente a tres tubos de centrífuga estériles de 1,5 mL y llevar a congelación a – 80° C (incluido el recipiente original).
Preparación de muestra (lavado)
4. Descongelar tres tubos de centrífuga, adicionar 1000 µL de PBS y mezclar con vórtex vigorosamente para homogeneizar.
Detección de Helicobacter pylori por PCR Anidada en muestras no invasivas
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5. Centrifugar a 3000 rpm durante 15 minutos y luego transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 mL.
6. Adicionar PBS hasta capacidad del tubo, centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos y transferir sobrenadante a un nuevo tubo.
7. Centrifugar a 13000 rpm por 5 minutos y descartar sobrenadante.
8. Adicionar 700 µL de PBS y mezclar con vórtex vigorosamente para homogeneizar.
9. Centrifugar a 13000 rpm por 5 minutos y continuar con la obtención del ADN.
Obtención de ADN (lisis celular)
10. Resuspender el pellet obtenido en el lavado en 50µL de BL, 50µL de SDS 10% y 50µL de lisozima.
11. Incubar a 37°C durante 10 minutos.
12. Incubar a 100°C en baño maría por 30 minutos.
13. Adicionar 1000 µL de fenol-cloroformo.
14. Centrifugar a 13.000 rpm por 5 minutos.
15. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga de 2 mL. Repetir el paso 34 dependiendo del estado de limpieza del pellet (opcional).
Limpieza del ADN
16. Adicionar 600 µL de etanol absoluto frío (4°C).
17. Centrifugar a 13.000 rpm por 5 minutos.
18. Decantar y desechar el etanol.
19. Incubar mínimo 30 minutos a 56°C para evaporación del etanol y secado de la muestra.
Reconstitución y almacenamiento del ADN
20. Adicionar 50 µL de H2O TI, cuantificar la cantidad de ADN (ver Capítulo 2. Cuantificación de ADN por espectrofotometría) y distribuir en alícuotas.
21. Almacenar en congelador a -20 °C o a menor temperatura si es posible.
Guía Práctica
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Nota: Se sugiere utilizar un pellet entre incoloro a blanco. Pellets de color amarillo, marrón o negro indican presencia de contaminantes que pueden inhibir la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).
Nota: El método fue extraído de (1)the amount of human DNA (as measured by a TaqMan-based assay y modificado durante el desarrollo del proyecto.
SANGRE Recolección de muestra
Nota: El siguiente procedimiento debe ser realizado por un profesional en bacteriología o en áreas afines y que ha sido capacitado para ello.
1. Preparar los elementos necesarios.
2. Identificar al paciente y explicarle el procedimiento que se va a realizar. El paciente debe permanecer sentado y en reposo.
3. Lavar las manos de acuerdo con el procedimiento establecido y colocarse los guantes.
4. Ubicar el torniquete por encima del sitio que se va a punzar para que la vena sea más visible.
5. Localizar la vena mediante inspección. Esto se facilita si el paciente cierra y abre su puño.
6. Desinfectar el área que se va a punzar con el algodón y alcohol.
7. Punzar la vena en dirección contraria al flujo sanguíneo utilizando la palomilla de seguridad.
8. Retirar el torniquete cuando la sangre empiece a brotar. Conectar el tubo vacutainer suplementado con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (tapa lila). Recoger en tres tubos vacutainer, 3 mL de sangre en cada uno.
9. Sacar la aguja y aplicar presión suave con un algodón.
10. Colocar un apósito en el sitio que fue punzado.
11. Etiquetar los tubos.
13. Registrar el procedimiento en los formatos designados.
Detección de Helicobacter pylori por PCR Anidada en muestras no invasivas
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Almacenamiento de las muestras
Para la obtención de ADN, las muestras de sangre se conservan a temperatura ambiente por algunos días o semanas y a 4°C y hasta por más de 1 año. Se obtienen mejores resultados si el material fresco se procesa lo antes posible, o si es almacenado a -20°C o -70°C. La sangre almacenada a esta temperatura permitirá la obtención de ADN por años.
Observación: El procedimiento descrito a continuación corresponde al protocolo de extracción de ADN disponible en el inserto del Kit comercial BIOLINE ISOLATE II Blood DNA BIO-52064. Para ver insertos originales en inglés, remitirse a los enlaces de las páginas en línea citadas en las recomendaciones.
Lisado de células sanguíneas
14. Agregar 200 µL de sangre en un tubo de centrifuga de 1,5 mL, 25 µL de PK, 200 µL de G3 y aplicar vórtex de 10 a 20 segundos.
15. Incubar las muestras a 70 °C en baño termorregulador de 10 a 15 minutos.
Unión del ADN
16. Agregar 210 µL de etanol (96-100%) y realizar vórtex por 10 segundos.
17. Colocar la columna que provee el kit en un tubo de colección de 2 mL y cargar la muestra del tubo de centrífuga en la columna.
18. Centrifugar por 1 minuto a 11.000 x g. Repetir este paso a una mayor gravedad si la muestra no se filtra completamente a través de la matriz. Se recomienda centrifugar por 2 minutos, en caso tal, la muestra no atraviese la membrana.
19. Descartar el tubo y llevar la columna a un nuevo tubo de colección de 2 mL.
Lavado de la membrana de sílica
20. Adicionar 500 µL del GW1 y centrifugar por 1 minuto a 11.000 x g, y transferir la columna a un tubo de colección.
21. Agregar 600 µL del GW2 y centrifugar por 1 minuto a 11.000 x g. Descartar el líquido sobrenadante y colocar la columna de nuevo en el tubo de colección.
Secado de la membrana de sílica
22. Incubar los tubos a 56 °C de 30 a 60 minutos para facilitar la evaporación del etanol.
Guía Práctica
23. Precalentar el G a 70 °C.
24. Adicionar directamente en la membrana de sílica 30 µL del G precalentado a 70 °C e incubar por 1 minuto a temperatura ambiente3.
25. Centrifugar por 1 minuto a 11.000 x g.
26. Repetir los pasos 24 y 25.
27. Descartar la columna con la membrana de sílica y conservar el producto cen- trifugado a -20 °C.
Reconstitución y almacenamiento del ADN
28. Adicionar 50 µL de H2O TI, cuantificar la cantidad de ADN (ver Capítulo 2. Cuan- tificación de ADN por espectrofotometría) y distribuir en alícuotas.
29. Almacenar en congelador a -20 °C o a menor temperatura si es posible.
BIOPSIA Recolección de las muestras
La recolección de las muestras debe ser realizada por endoscopia por el médico gastroenterólogo endoscopista; las muestras se sumergen en 2 mL de PBS en tubo Falcon con tapa rosca, debidamente etiquetados para una buena identificación por el laboratorio.
Preparación de muestras
1. Cortar el tejido en trozos de 25 mg y depositar en tubos de centrífuga de 1,5 mL.
2. Adicionar entre 50-70 µL de PBS y homogeinizar
El procedimiento descrito a continuación corresponde al protocolo de extracción de ADN disponible en el inserto del kit comercial BIOLINE ISOLATE II Genomic DNA BIO- 52067. Para ver insertos originales en inglés, remitirse a los enlaces de las páginas en línea citadas en las recomendaciones.
Pre Lisado de células de tejido
3. Adicionar 180 µL de GL, 25 µL de PK y aplicar vórtex de 10 a 20 segundos.
3 Modificación del kit, realizada durante el desarrollo del ensayo.
Detección de Helicobacter pylori por PCR Anidada en muestras no invasivas
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4. Incubar las muestras a 56 °C en incubadora de 1 a 3 horas. Agitar y aplicar vórtex cada 30 minutos hasta observar la completa disolución del tejido. Las muestras pueden dejarse incubando durante la noche si es necesario.
Lisado de células de tejido
5. Adicionar 200 µL de G3, mezclar con vórtex e incubar las muestras a 70 °C en baño termorregulador por 10 a 15 minutos.
Nota: Si se observan partículas, centrifugar durante 5 minutos a alta velocidad y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga.
Unión del ADN
6. Agregar 210 µL de etanol (96-100%) y realizar vórtex por 10 segundos.
7. Colocar la columna que provee el kit en un tubo de colección de 2 mL y adicionar la muestra del tubo de centrífuga en la columna.
8. Centrifugar por 1 minuto a 11.000 x g. Cuando la muestra no atraviese la membrana, centrifugar por 2 minutos adicionales, a una mayor gravedad.
9. Descartar el líquido sobrenadante y colocar la columna de nuevo en el tubo de colección.
Lavado de la membrana de sílica
10. Adicionar 500 µL del GW1 y centrifugar por 1 minuto a 11.000 x g, y transferir la columna a un tubo de colección.
11. Agregar 600 µL del GW2 y centrifugar por 1 minuto a 11.00 x g. Descartar el líquido precipitado y rehusar el tubo de colección.
Secado de la membrana de sílica
12. Incubar los tubos a 56 °C durante 30 a 60 minutos para facilitar la evaporación del etanol.
13. Descartar la columna con la membrana de silica y conservar el producto centrifugado a -20°C
Elución del ADN
Guía Práctica
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15. Adicionar directamente en la membrana de sílica 30 µL del G precalentado a 70 °C e incubar por 1 minuto a temperatura ambiente4.
16. Centrifugar por 1 minuto a 11.000 x g.
17. Repetir los pasos 24 y 25.
18. Descartar la columna con la membrana de sílica y conservar el producto cen- trifugado a -20°C.
Reconstitución y almacenamiento del ADN
19. Adicionar 50 µL de H2O TI, cuantificar la cantidad de ADN (ver Capítulo 2. Cuan- tificación de ADN por espectrofotometría) y distribuir en alícuotas.
20. Almacenar en congelador a -20 °C o a menor temperatura si es posible.
Procedimiento para purificación de ADN (opcional)
1. Centrifugar a 3.000 rpm durante 1 minuto los viales con las muestras de ADN
2. Adicionar, por cada 20 µL de ADN, 5 µL de EDTA 125 mM y 60 µL de etanol al 100%. Verificar que el EDTA llegue al fondo del vial.
3. Mezclar por inversión e incubar a temperatura ambiente y en oscuridad durante 15 minutos.
4. Centrifugar a 14.000 RPM y 4 °C durante 5 minutos.
5. Descartar suavemente el sobrenadante y escurrir sobre papel absorbente
6. Adicionar 60 µL de etanol al 70%, centrifugar a 10.000 RPM y 4 °C durante 5 minutos.
7. Descartar sobrenadante y centrifugar a 5.000 RPM durante 1 minuto.
8. Repetir pasos 6 y 7, hasta observar limpieza del pellet.
9. Dejar evaporar totalmente el etanol a 56 °C
10. Adicionar 50µL de agua H 2O TI
11. Almacenar inmediatamente las muestras a -20 °C.
Nota: No se recomienda utilizar este procedimiento en muestras que contengan una cantidad de ADN muy baja.
4 Modificación del kit, realizada durante el desarrollo del ensayo.
Detección de Helicobacter pylori por PCR Anidada en muestras no invasivas
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Recomendaciones A. Evitar intercambiar las micropipetas, puntas para micropipetas y todo lo que
sea necesario para la realización de la técnica a otras áreas de trabajo. Utilizar etanol grado molecular. Otros podrían contener aditivos como acetona y meta- nol.
B. Verificar la evaporación total del etanol durante el secado de las muestras pues- to que puede inhibir la PCR.
C. Utilizar un control negativo (CN) al final de la línea de muestras para garantizar que no hubo contaminación por arrastre de puntas con la micropipeta automá- tica o durante la manipulación de las muestras.
D. Almacenar el ADN extraído a -80 y -20 °C para su conservación a largo plazo. Si el ADN se va a utilizar a corto plazo, se sugiere almacenar a 4 °C, para evitar que sufra daño tras sucesivas congelaciones y descongelaciones. De acuerdo con las observaciones realizadas en el laboratorio, se ha podido almacenar el ADN a 4°C durante un mes sin afectar su calidad.
E. Diluir el ADN en varias alícuotas para evitar la generalización de una posible contaminación y la congelación-descongelación del vial stock de ADN, puesto que favorece su degradación.
F. Evitar tener cerca fuentes de aerosoles durante el proceso de extracción que pueda contaminar las muestras.
G. Revisar el Apéndice 4 (“Preparación de soluciones para procedimientos de bio- logía molecular”) para revisar los protocolos de preparación de los reactivos
H. Leer los insertos originales en inglés de los kits BIOLINE ISOLATE II Genomic DNABIO-52067 en: https://www.bioline.com/us/isolate-ii-genomic-dna-kit. htmL y BIOLINE ISOLATEII Blood DNA BIO-52064 en https://www.bioline.com/ downloads/dl/file/id/875/isolate_ii_blo od_dna_kit_product_manual.pdf.
CAPÍTULO 2
CUANTIFICACIÓN DE ADN POR ESPECTROFOTOMETRÍA
Andrés Felipe De la Hoz Pabola, Anny Paola Miranda Cárdenas, Anahí María Barros Martínez, Aracely García Cuan.
El método espectrofotométrico proporciona una estimación sencilla y precisa de la concentración de una muestra de ADN. Después de la extracción del ácido desoxirri- bonucleico (ADN), se hacen necesarios la cuantificación y el análisis de la calidad del material obtenido. El análisis consiste en la medición de la absorción UV, puesto que los nucleótidos presentan un máximo de absorción alrededor de 260 nm; si la muestra se encuentra pura, la proporción OD 260 nm/ OD 280 nm es mayor a 1,6.
Palabras clave: extracción de ADN, cuantificación del ADN, absorción UV, NanoDrop.
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Objetivos Describir las directrices para cuantificar ADN mediante la técnica de espectrofotometría, que se realizan después de los procedimientos de extracción de ADN genómico y amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Definiciones Espectrofotometría: técnica de análisis óptico que permite determinar la concentración de un compuesto en una solución. La técnica se fundamenta en la ley de Lambert-Beer, que explica la relación proporcional entre la cantidad de luz absorbida de un compuesto y su concentración en una solución (2).
Materiales, insumos y equipos • Micropipetas
• Puntas de micropipetas
• Muestras de ADN
• Papel absorbente (que no tenga pelusa)
• Espectrofotómetro
Procedimiento 1. Dejar reposar las muestras a temperatura ambiente (entre 25-28 °C).
2. Ajustar la ratio de las absorbancias a A260/A280 nm del equipo.
3. Leer el blanco que corresponde a H 2O TI y luego las muestras a una longitud de
onda de A260/A280 nm.
4. Determinar la concentración y pureza de ADN teniendo en cuenta las siguientes formulas:
• Concentración ADN (µg/mL) = Densidad óptica (DO) a 260 nm x factor de dilución x 50 (µg/mL).
• Pureza de ADN = A260/A280 nm.
Guía Práctica
Recomendaciones Tener en cuenta lo siguiente:
A. La ratio de absorbancia entre 260 y 280 nm es utilizada para medir la pureza de los ácidos nucleicos. La ratio de 1,8 es generalmente aceptado como “puro” para ADN. Si la ratio es menor que eso, puede indicar la presencia de proteínas, fenol y otros contaminantes que tiene fuerte absorción cercana o igual a 280 nm. Si se busca medir la pureza en la ratio de absorbancia entre 260 y 230 nm, entre 1,8 y 2,2 es aceptado como puro. Valores fuera de esos rangos indica contaminación por nucleótidos libres, tampones, proteínas o componentes de los colorantes. Observar el ejemplo en la Tabla 1 y Figura 1. Una curva ideal debería verse de la siguiente manera:
Tabla 1. Resultados de la cuantificación de ADN obtenido a partir de una muestra de saliva. Equipo: NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometers.
nm = longitud de onda(λ) en nanómetros.
Concentración de ADN
260(λnm) 260/280 (λnm)
264,1 ng/µL 5,283 1,87
Fuente: Autores del proyecto.
Figura 1. Curva de absorbancia de ADN obtenido a partir de una muestra de saliva.
Fuente: Datos del proyecto. Gráficos obtenidos mediante el equipo NanoDrop 2000/2000C
Spectrophotometers.
B. Cantidades residuales en las muestras de guanidina, fenol y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), reactivos utilizados en los de extracción de
Detección de Helicobacter pylori por PCR Anidada en muestras no invasivas
34
ADN, contribuyen a la absorbancia entre 230 nm y 280 nm, lo cual puede afectar los resultados de la medición
C. Revisar el inserto del equipo, tener en cuenta los límites de detección del espectrofotómetro.
D. La calibración de la absorbancia = 0, se realiza con la solución tampón utilizada para suspender el analito de interés. La solución tampón debe tener el mismo pH y fuerza iónica que la solución analito. Se recomienda realizar un ciclo de calibración con el blanco para valorar si la absorbancia es alta en las ondas de análisis (por lo general en 260 nm), que puedan afectar las mediciones.
E. Agitar las muestras en vórtex y realizar un spin de 5 segundos antes de cuantificar. Evitar la creación de burbujas durante la mezcla y el pipeteo. Este protocolo se ejecutó usando el equipo NanoDrop One de Thermo Scientific. El manual para la utilización del equipo está disponible en: https://assets.thermofisher. com/PBS-Assets/CAD/manuals/3091-NanoDrop-One-User-Guide-v1.3-sw- SPANISH.pdf.
CAPÍTULO 3
ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA Andrés Felipe De la Hoz Pabola, Anny Paola Miranda Cárdenas,
Anahí María Barros Martínez, Aracely García Cuan.
La electroforesis en gel de agarosa es utilizada para separar macromoléculas como ácidos nucleicos y grandes complejos proteicos. La calidad de las moléculas de Ácido desoxirribonucleico (ADN) es analizada aplicando este método. El ADN está cargado de forma negativa a pH neutro, permaneciendo constante la relación carga/masa. La velocidad del ADN en la matriz de agarosa depende del tamaño y conformación del ADN, la concentración de agarosa y el voltaje aplicado.
Palabras clave: electroforesis en gel de agarosa, electroendosmosis, cámara de electroforesis, método dots.
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Objetivo Describir las pautas para ejecutar la técnica de electroforesis en gel de agarosa con el fin de verificar la cantidad, calidad e integridad del ADN y visualizar los fragmentos de interés posterior a un procedimiento de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).
Definiciones Electroforesis: técnica utilizada para separar, analizar y caracterizar ácidos nucleicos de distintas procedencias, a través de una matriz sólida de acuerdo con su tamaño y carga eléctrica mediante la aplicación de un campo eléctrico (22,23).
Agarosa: polímero natural, polisacárido formado por galactosas alfa y beta, físicamente resistentes y alto grado de electroendósmosis. Se emplean para el análisis de ácidos nucleicos y proteínas. En la electroforesis, se comporta como un tamiz molecular y permite separar moléculas cargadas en función de su tamaño, forma y carga eléctrica (22,24).
Marcador de peso molecular: fragmento de ADN de tamaño conocido. Se utiliza para calcular los pesos moleculares de las muestras de ADN problema.
Materiales, insumos y equipos • Papel parafina
• Puntas de micropipetas con filtro
• Agarosa de grado de biología molecular, libre de ADNsas y Ribonucleasas (ARNsas)
• Agua ultrapura tipo I (H2O TI)
• Tampón de carga “5X Green GoTaq® Flexi Buffer”
• Tampón de corrido TAE o TBE al 5X, 1X y 0.5X
• Marcador de peso molecular de 100 pb Promega
• Tampón de carga del marcador de peso “Blue/Orange 6X Loading Dye”
• Cámara de electroforesis horizontal
Guía Práctica
37
Procedimiento
Condiciones para productos de PCR 1. Pesar la cantidad apropiada de agarosa y adicionar al tampón de corrido Tris/
Borato/EDTA (TBE) a 0.5X necesarios para preparar el gel correspondiente a las dimensiones de la cámara (24).
2. Calentar la solución en intervalos de 30 segundos y remover el recipiente hasta obtener una solución transparente y homogénea. Dejar enfriar, pero no solidificar.
3. Preparar la cuba y la cámara de electroforesis. Colocar los peines adecuados.
4. Servir la agarosa en el soporte del gel y esperar de 40 a 60 minutos hasta que gelifique, protegiéndolo de corrientes de aire directas con papel aluminio u otro material. Se debe evitar el uso de toallas de papel cerca de los geles de agarosa para evitar contaminarlo con fibras que exhiban fluorescencia ultravioleta.
5. Retirar los peines del gel cuidadosamente para evitar romper los pocillos.
6. Llenar la cámara de electroforesis hasta cubrir el gel con el tampón de corrido TBE a 1X.
7. Cargar el marcador de peso molecular en el primer pocillo de cada línea de peines. Colocar en los pocillos subsiguientes cada muestra previamente mezclada con el tampón así: en un papel parafinado mezclar por cada 10 µL de muestra, 2 µL de tampón de carga “5X Green GoTaq® Flexi Buffer”.
8. Cerrar la cámara y conectar los electrodos a la fuente de poder. Ajustar las condiciones de electroforesis a 90 voltios y 110 MA durante 50 minutos.
9. Apagar la fuente de poder una vez terminado el tiempo de corrido, retirar el gel de la cámara y sumergirlo por completo en una solución de bromuro de etidio a 0,5 µg/mL, durante 40 minutos.
10. Sumergir el gel en agua destilada durante 15 minutos para retirar el exceso de bromuro.
11. Visualizar el gel en un transiluminador UV (320 nm).
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Condiciones para cuantificación de ADN mediante electrofo- resis en geles de agarosa (método dots)
El método dots es una forma de verificar la cuantificación y pureza de las mediciones obtenidas mediante espectrofotometría.
1. Prepare el gel en la cámara de electroforesis horizontal teniendo en cuenta los pasos 1-6 del presente procedimiento.
2. Preparar concentraciones de ADN de diferentes microorganismos y diferentes concentraciones. La concentración de ADN en cada tubo se debe confirmar por espectrofotometría, como se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2. ADN de diferentes microorganismos y diferentes concentraciones.
Cepas Concentración –ADN
Proteus mirabilis 20,50 ng/µL
Klebsiella pneumoniae 12,90 ng/µL
Fuente: Autores del proyecto.
3. Adicionar en cada pozo del gel una alícuota de 15 µL de las concentraciones de ADN obtenidas en el paso anterior y mézclela con 4 µL de tampón de carga. Sembrar 10 µL del ADN muestra mezclado con 4 µL de tampón de carga.
4. Sembrar una escala patrón de ADN del fago λ en escalas de 2,5, 5, 10, 20 y 40 ng/µL, valores que corresponden a una región lineal en la curva.
5. Tapar la cámara de electroforesis, conectar a la fuente de poder.
6. Encender la fuente de poder y correr a 80 voltios durante una hora y 30 minutos.
7. Apagar la fuente de poder una vez terminado el tiempo de corrido, retirar el gel de la cámara y sumergirlo por completo en una solución de bromuro de etidio a 0,5 µg/mL, durante 40 minutos.
8. Sumergir el gel en agua destilada durante 15 minutos para retirar el exceso de bromuro.
9. Visualizar el gel en un transiluminador UV (320 nm).
10. Realizar una comparación visual de la intensidad de las bandas del fragmento problema y la solución patrón conocida. Estimar la concentración aproximada de ADN desconocido (ver figura 2).
Guía Práctica
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Recomendaciones A. Se recomienda correr los ensayos a una temperatura en el laboratorio cercanas/
menores a 22°C a fin de evitar la distorsión del frente de migración del ácido nucleico en el gel (ver figuras 3 y 4).
B. No se recomienda limpiar o secar la cama de electroforesis con toallas desechables de papel tipo Sanitas (o incluso emplearlas en los alrededores del área de electroforesis y fotodocumentador) debido a que liberan fibras fluorescentes bajo iluminación ultravioleta.
C. Los geles de agarosa son preparados usando una proporción w/v (% peso/ volumen) y su concentración depende del tamaño de los fragmentos de ADN que se desean separar (ver la tabla 3).
Tabla 3. Porcentajes de concentración de agarosa sugeridos para la visualización de moléculas de ADN.
Concentración de Agarosa (%) Rango de tamaño - DNA (bp)
0.2 5000-40000
0.4 5000-30000
0.6 3000-10000
0.8 1000-7000
1,0 500-5000
1.5 300-3000
2 200-1500
3 100-1000
Fuente: Barril y Nates, 2012 (25).
Los porcentajes de concentración anterior pueden estar sujetos a modificación, puesto que el corrido de los fragmentos también depende de: el tiempo de corrido, voltaje, miliamperios, tamaño de la cámara y tampón de corrido, entre otros.
D. Preparar la solución stock del tampón de corrido (TAE o TBE) al 5X y evitar preparar soluciones más concentradas que puedan precipitarse.
E. Es importante esperar el tiempo necesario hasta la completa solidificación de la agarosa, de lo contrario se vería afectada la migración del ADN durante el corrido. También evitar fuentes de vibración, corrientes de aire y movimiento que afecte la solidificación uniforme de la agarosa.
Detección de Helicobacter pylori por PCR Anidada en muestras no invasivas
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F. Preparar el marcador de peso “100bp DNA Ladder Promega” utilizando la siguiente proporción: 10 µL del marcador + 10 µL del colorante “Blue/Orange 6X Loading Dye” + 30 µL de H2O TI. Almacenar el volumen final en un tubo de 200 µL.
G. El bromuro de etidio es una sustancia altamente mutagénica e irritante para los ojos, piel y vías respiratorias. Por tanto, es obligatorio el uso de guantes desechables para su manipulación, señalizar las áreas de trabajo con bromuro y seguir las normas de bioseguridad pertinentes en relación con el descarte y desactivación del material y soluciones contaminadas. En la actualidad se encuentran disponibles tintes alternativos que no tiene efectos mutagénicos: Diamond™ Nucleic Acid Dye y SYBR Green, entre otros. Es necesario leer con precisión las pautas del inserto de cada reactivo.
H. Tener en cuenta que el tampón TBE es un mejor conductor y resulta menos propenso al sobrecalentamiento, lo cual hace que sea más adecuado para corridas largas. Por otro lado, favorece el despliegue de fragmentos <2kb. El TAE se recomienda para facilitar la separación de grandes fragmentos de ADN.
I. Utilizar una Uninterruptible Power Supply (UPS) para conectar los equipos. Esto reducirá el efecto de las variaciones del voltaje en la migración del ADN.
J. La interpretación de los corridos es más eficiente si se utilizan equipos de fotodocumentación, que incluyan cámaras de alta resolución y software de captura y análisis de las fotografías de los geles.
Guía Práctica
Interpretación de corridos electroforéticos
Figura 2. Cuantificación de ADN método de dots. Carril 1. Proteus mirabilis ADN; Carril 2. K. pneumoniae; Carril 3. ADN Helicobacter pylori Hp3; Carril 5. ADN CI; Carriles 6-10. ADN fago λ [2,5 ng/µL], [5.0 ng/µL], [10 ng/µL], [20 ng/µL], [40 ng/µL]. Por ejemplo: la concentración de ADN estimada por espectrofotometría para K. pneumonie (12.9 ng/µL), se ubicaría entre las bandas de los carriles 8 y 9, en la escala patrón.
Fuente: Aracely García, 2010 (26).
Figura 3. Efecto sonrisa, por lo general causado por variaciones del voltaje, temperatura o incorrecta solidificación de la agarosa. Carril 1. MP; Carriles 2. Amplificados de Cag A a partir de muestras de saliva.
Fuente: Datos del proyecto.
Figura 4. Corrido electroforético de ADN degradado. Carril 1. MP; Carriles 2, 3 y 8. Estelas de ADN degradado.
Fuente: Datos del proyecto.
Anahí María Barros Martínez, Aracely García Cuan.
Los geles de poliacrilamida también son utilizados para verificar la calidad y cantidad del material genético extraído debido a que tienen un poder de resolución mayor que la agarosa, permitiendo la separación de moléculas que difieren en un solo par de bases. Los geles de poliacrilamida, a pesar de que son más complicados en su preparación y manejo, su ventaja consiste en poder separar fragmentos entre 5-700 pares de bases.
Palabras clave: electroforesis en gel de poliacrilamida, polimerización, poliacri- lamida/bis-acrilamida.
Detección de Helicobacter pylori por PCR Anidada en muestras no invasivas
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Objetivo Describir las directrices y recomendaciones para el desarrollo de la técnica de electroforesis horizontal en geles de poliacrilamida para el análisis de muestras de ácido desoxirribonucleico (ADN).
Definiciones Gel de poliacrilamida: soporte empleado en electroforesis, formado por la polimerización vinílica del monómero acrilamida y del monómero entrecruzador N, N’-metilen-bis-acrilamida. Sus características son: químicamente inerte, de propiedades uniformes; además, es capaz de formar geles transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en agua, relativamente no iónicos y que permiten buena visualización de las bandas durante tiempo prolongado (27,28).
Materiales, insumos y equipos • Solución poliacrilamida/bis-acrilamida (29:1)5
• Tampón Tris/Borato/EDTA (TBE) de 5X6
• Solución de persulfato de amonio
• Tetrametiletiléndiamina (TEMED)
• Agua destilada
• Micropipetas
Descripción general 1. Montar la cámara de electroforesis horizontal.
2. Preparar el gel mezclando cada uno de los componentes con las cantidades descritas en la tabla 4, para un gel de 40 mL a 3,5% de acrilamida/bisacrilamida
5 Ver preparación en tabla 4.
6 Ver preparación en apéndice 4. Preparación de soluciones para procedimientos de biología molecular.
Guía Práctica
45
(30%). A excepción del persulfato de amonio, que se agrega en el momento antes de verter el gel.
Tabla 4. Reactivos para preparación del gel de poliacrilamida.
Reactivos Cantidad
TBE 10X 4 mL
Solución acrilamida/bisacrilamida (30%) 4,67mL
Fuente: Adaptado de Barril y Nates, 2012 (25).
3. Mezclar suavemente el tubo por 15 minutos para eliminar el aire que pueda inhibir la reacción de polimerización.
4. Agregar el persulfato de amonio a la mezcla, verter el gel y colocar el peine. Evitar que burbujas de aire queden atrapadas debajo de los dientes del peine; de ser necesario, utilizar el resto de la solución de gel de acrilamida para llenar completamente el molde de gel. Asegurarse que la solución de acrilamida no se derrame del molde del gel.
5. Tapar la cámara de inmediato, para evitar el contacto con el aire. Esperar entre 30 y 60 minutos hasta solidificación de la mezcla.
6. Quitar los peines y llenar la cámara con el tampón de corrido. Usar una pipeta Pasteur o una jeringa para enjuagar los pocillos una vez más con TBE 1x. En papel parafinado mezclar con una micropipeta 10 µL de muestra con 2 µL de tampón de carga.
7. Cargar las muestras en los pozos del gel. Evite expulsar burbujas de aire que vacíen la muestra del pozo. Sin embargo, es importante no tomar demasiado tiempo para completar la carga del gel; de lo contrario, las muestras se difundirán desde los pozos.
8. Correr las muestras a 80 voltios durante 80 minutos. Apagar la fuente de poder, retirar el gel de la cámara y sumergirlo por completo en una solución de bromuro de etidio a 0,5 µg/mL, durante 40 minutos.
9. Sumergir el gel en agua destilada durante 15 minutos para retirar el exceso de bromuro.
10. Visualizar el gel en un transiluminador UV (320 nm).
Detección de Helicobacter pylori por PCR Anidada en muestras no invasivas
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Recomendaciones A. Se recomienda utilizar esta técnica para obtener mejor resolución de moléculas
de ADN de 1-1.000 pb. En las condiciones adecuadas y ajustes de la técnica, las moléculas de ADN que difieren en tamaño por un solo par de bases pueden diferenciarse.
B. Preparar el gel en TBE a 5X o 1X, y bajo voltaje (1-8) V / cm largo de la cámara para evitar la desnaturalización de pequeños fragmentos de ADN por calentamiento. Es posible utilizar tampón TAE 1X; sin embargo, no es recomendable por ser menos resistente al calentamiento. Los geles de poliacrilamida no desnaturalizantes se usan por lo general a voltajes entre 1 V / cm y 8 V / cm. Si la electroforesis se lleva a cabo a un voltaje más alto, produce sobrecalentamiento y provoca el arqueamiento de las bandas de ADN o incluso fusión de hebras de pequeños fragmentos de ADN.
C. Utilizar guantes para manipular las placas de vidrio y los espaciadores de fondo, a fin de evitar la trasferencia de la grasa de las manos a las superficies de trabajo de las placas.
D. Agregar el TEMED para completar el gel antes de que la acrilamida se polimerice.
E. Enjuagar el material con agua desionizada y etanol y dejar secar.
F. Utilizar el tampón de electroforesis del mismo lote para el llenado de la cámara y preparación del gel. Pequeñas diferencias en la fuerza iónica o pH producen amortiguación de los frentes que pueden distorsionar en gran medida la migración del ADN.
G. Cuando se desea repetir la experiencia, el mismo gel se puede volver a usar para cargar nuevas muestras. Para ello, hacer un corrido electroforético hasta observar que el gel esté limpio del tampón de carga (y por tanto de ADN), retirar el tampón de corrido y lavar el gel por inmersión en agua destilada. Colocar el gel en la cámara con tampón de corrido nuevo.
H. El gel puede conservarse en una bolsa plástica y a 4°C, de 1 a 3 días.
I. Es obligatorio utilizar guantes durante todo el proceso y máscaras para pesar el reactivo en polvo, puesto que la acrilamida es una sustancia neurotóxica. Aun si la poliacrilamida no lo es, se debe manejar con precaución debido a la posible presencia de acrilamida libre.
CAPÍTULO 5
PREPARACIÓN DE UN CONTROL INTERNO PARA PCR ANIDADA
Aracely García Cuan, Andrés Felipe De la Hoz Pabola, Juan Felipe Lara Cobos.
Debido a la presencia de inhibidores en las muestras, para la amplificación del ADN se hace necesario incorporar al ensayo de PCR un sistema de amplificación con “control interno” que permita detectar posibles resultados falsos negativos cumpliendo con lo establecido por las Normas de la Organización de Estándares Internacionales (ISO), de tal manera que permita la amplificación de productos de los ácidos nucleicos con la calidad requerida.
Palabras clave: PCR, control interno, fago M13mp19, gen ureA.
Detección de Helicobacter pylori por PCR Anidada en muestras no invasivas
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Objetivo Describir las pautas para elaborar un control interno para su uso durante la amplificación del fragmento externo en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) anidada, a fin de evitar resultados falsos negativos debido a la presencia de inhibidores.
Definiciones Control interno (CI): corresponde a un fragmento de ácido desoxirribonucleico (ADN) híbrido que contiene una secuencia central del fago M13mp18, flanqueado de secuencias de H. pylori, el cual es adicionado a la reacción y es amplificado por los mismos cebadores que hibridan en el fragmento externo del gen ureA. Para sintetizar el CI, se amplifica en una primera ronda ADN del fago, usando un par de cebadores mixtos (ver secuencias en anexo 1, tabla 14) que contienen por una parte la secuencia de nucleótidos de los iniciadores del segmento externo (279 pb) del gen ureA y, del otro lado, la secuencia nucleotídica que amplifica al fago M13mp19. El producto se somete a una segunda reacción de PCR utilizando los cebadores externos de PCR anidado HpF1 y HpB25, buscando la producción de un fragmento homogéneo de ADN de 144 pb, que posee en sus extremos las secuencias del gen ureA contenidas en los cebadores externos del gen ureA y en el centro de la secuencia correspondiente al fago M13mp18. Una cantidad estimada de este fragmento se adicionará a los tubos de reacción que también contendrán el ADN de las muestras. Puesto que el CI también amplifica con los mismos cebadores del gen diana, su visualización en el corrido electroforético descarta un falso negativo debido a la presencia de inhibidores. La concentración de este control endógeno debe ser lo suficientemente baja para que sea sensible a la presencia de inhibidores, fallas en la preparación o en alguna fase del proceso. Utilizar un CI le otorga mayor validez a la técnica 7,8.
PCR anidada: variante de la PCR convencional que consiste en la realización de una segunda reacción de amplificación con dos cebadores nuevos que hibridan dentro del fragmento diana amplificado por el primer par. Debido al aumento en el número de ciclos utilizado en proceso (65 ciclos para el gen ureA de H. pylori), la sensibilidad aumenta8.
Materiales, insumos y equipos • Tubos de reacción de PCR de 200 µL • Puntas de micropipetas con filtro
Guía Práctica
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• Gradillas • Enzima Uracil ADN glicosilasa (UNG) 2.0 U/ µL • GoTaq® G2 Green Master Mix (Master mix) • Agua ultrapura tipo I (H
2O TI) • Cebadores Forward (CIHP F) y Reverse (CIHP R) para el fago M13mp19
(Invitrogen)7
• Cebadores Forward (HpF1) y Reverse (HpB25) para el fragmento externo del gen ureA (Invitrogen)7
• ADN del fago M13mp19 a 0.1 ng/ µL marca SIGMA REF: D4404 Lote 013H67348
• ADN muestra • Pipetas • Cabina de flujo laminar tipo II • Termociclador • Vórtex • Mini Centrífuga (Spin)
Procedimientos 1. Preparar la master mix utilizando los cebadores mixtos CIHP R y CIHP F
(ver secuencias en anexo 1, tabla 14), y siguiendo la tabla 5.
Tabla 5. Reactivos y concentraciones necesarios para preparar un tubo de reacción Control Interno del gen UreA para la PCR anidada (Primera amplificación).
Reactivos Concentración inicial Concentración final Cantidad por tomar
(µL)
Cebador Forward 10 pm 1,0 pm 2.5
Cebador Reverse 10 pm 1,0 pm 2.5
ADN 103 copias 102 copias 2.5
Agua - - 7.5
7 Ver secuencia en Anexo 1., Tabla 14.
8 Ver preparación de la solución trabajo en Apéndice 6. Cálculos para preparación de soluciones de ADN, 2. Preparación de solución del fago M13mp19.
Detección de Helicobacter pylori por PCR Anidada en muestras no invasivas
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2. Realizar una primera amplificación bajo las condiciones de la tabla 6. Ajustando el número de ciclos del equipo a 35, solo en las etapas de desnaturalización y extensión. Las etapas de desnaturalización inicial y extensión final se realizarán solo en el primer y último ciclo, respectivamente.
Tabla 6. Perfil de temperatura para la PCR Perfil de temperatura para PCR anidada del Control Interno del gen UreA (Primera amplificación).
Etapa Temperatura °C Tiempo
Desnaturalización 94 1 Hibridación 55 1 Extensión 7 1
Extensión final 72 10
Fuente: Tomado de García, A. 2010 (26).
3. Realizar la segunda amplificación con los cebadores Forward (HpF1) y Reverse (HpB25) que flanquean el segmento externo del gen ureA.
4. Cuantificar los ADN siguiendo las instrucciones del capítulo 2. Cuantificación de ADN por espectrofotometría.
5. Correr los productos en gel de agarosa al 3,5% (preparada en tampón TBE al 0,5X), tampón de corrido TBE al 1X, 90 voltios, 110 miliamperios y 50 minutos.
6. Visualizar con bromuro de etidio una vez finalizado el corrido (ver figura 5). Revisar capítulo 3. Electroforesis horizontal en gel de agarosa.
7. Lavar el producto utilizando el procedimiento para purificación de ADN (opcional), descrito en el capítulo 1.
8. Preparar alícuotas en varios viales para congelar a -20 oC, pues el producto es lábil.
Recomendaciones A. Descartar los guantes en uso una vez finalizado cualquier procedimiento en las
áreas de trabajo.
51
B. No utilizar las batas de laboratorio de biología molecular para otros procedimientos diferentes a los pertinentes.
C. Utilizar puntas de micropipetas con filtro para evitar contaminación de estas por formación de aerosoles.
D. Micropipetas, puntas para micropipetas, marcadores y todo lo que sea necesario para la realización de la técnica deben ser exclusivos y no intercambiables.
E. Preparar alícuotas de los reactivos stocks previamente, de modo que, en casos de contaminación, sólo se elimina la alícuota en uso.
F. Eliminar cualquier reactivo, tubo de agua a partir de la cual se detecta alguna contaminación.
G. Centrifugar por 5 segundos (spin) los tubos que contengan ácidos nucleicos y abrir cuidadosamente para evitar contaminar los guantes y las superficies.
H. Todos estos elementos deben estar rotulados según el área a la que pertenezcan y no deben ser trasladados a otro espacio del laboratorio.
I. Irradiar la superficie de trabajo dentro de la cabina con luz ultravioleta previo a su uso, de forma que las pirimidinas de cualquier traza de ácido nucleico presente en la cabina formen dímeros entre sí (cross-link) bloqueando el paso de la polimerasa en una futura reacción de PCR.
J. Se recomienda diluir el ADN a una concentración de trabajo de 102 y agregar el CI a una concentración de 100 copias de ADN hibridado, con el fin de evitar saturación de la reacción (pérdida de sensibilidad). Revisar el apéndice 6. Cálculos para preparación de diluciones de ADN. El ADN muy concentrado desplaza al control interno (en menor concentración) por competencia de la unión con la enzima polimerasa. En consecuencia, el fragmento más pequeño no amplifica (ver figuras 6 y 7).
K. Si la contaminación por amplicones es un problema frecuente, es recomendable adicionar al tubo de reacción la enzima UNG a una concentración final de 0,5 U/ µL para una máster mix de 25µL, y programar en el protocolo del termociclador 10 minutos adicionales de incubación a 20 °C. La enzima se debe dispensar en varias alícuotas y guardar a -20 °C. La UNG hidroliza los enlaces entre las bases, ribosa y residuos de uracilo, previniendo la replicación de la secuencia, al detenerse la actividad de la enzima cuando esta encuentra el sitio básico y así se elimina una de las fuentes más comunes de contaminación.
Nota: Las anteriores recomendaciones aplican para TODOS los procedimientos de
Detección de Helicobacter pylori por PCR Anidada en muestras no invasivas
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PCR que se describan en el presente manual.
Figura 5. Corrido electroforético de fragmento externo de muestras de saliva. Carril 1. MP, Carril 2. Fragmento externo de 279 pb y CI de 144 pb, Carril 3-4. Fragmento externo, Carril 5. ADN
degradado, Carril 6. CI.
Fuente: Datos del proyecto.
Figura 6. Corrido electroforético en gel de poliacrilamida de ADN genómico de Helicobacter pylori y CI a 100 copias. Carril 1. CN; Carril 2. CI 144 pb; Carril 3. Muestra Helicobacter pylori (Hp3) + sin diluir más CI a 100 copias; Carril 5. Marcador de peso molecular de 100 pb. Nota: Podemos observar en el carril 3 la inhibición de la banda del CI de 144 pb y sólo se aprecia la banda de
279 pb de Helicobacter pylori (Hp3).
Fuente: Aracely Garcia, 2010 (26).
Guía Práctica
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Figura 7. Corrido electroforético de fragmento externo de muestras de saliva. Carril 1. MP; Carriles 2-8. Muestras procesadas de saliva, se observa fragmento externo de 279 pb.
Fuente: Datos del proyecto.
DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS DE DESEMPEÑO DE LA PCR ANIDADA
PARA LA AMPLIFICACIÓN DEL PRODUCTO EXTERNO E INTERNO DEL GEN ureA EN Helicobacter pylori
Aracely García Cuan, Andrés Felipe De la Hoz Pabola, Juan Felipe Lara Cobos, Anahí María Barros Martínez.
Una prueba de PCR anidada, por ser una técnica muy sensible, requiere mayor cuidado para evitar la contaminación en su manejo que una PCR convencional, por lo que se debe ser riguroso en la medición de sus parámetros de desempeño o validación, como son: selectividad de los cebadores (especificidad), el límite de detección, precisión y reproducibilidad.
Palabras clave: PCR anidada, parámetros de desempeño, gen ureA, amplicones, inhibidores de PCR anidada.
Detección de Helicobacter pylori por PCR Anidada en muestras no invasivas
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Objetivo Describir las pautas para establecer los parámetros de desempeño de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) anidada para la amplificación del producto externo e interno del gen ureA en Helicobacter pylori.
Definiciones ureA: gen involucrado en la síntesis y actividad de la enzima ureasa, que regula la expresión de factores de virulencia (26).
Fragmento externo: segmento específico del gen ureA en el genoma de H. pylori, que se amplifica mediante el primer par de cebadores para obtener amplicones de 279 pb (11).
Fragmento interno: segmento de 120 pb, que se obtiene en la segunda ronda de amplificación, utilizando cebadores que hibridan dentro del fragmento externo obtenido en la primera amplificación (11).
Materiales, insumos y equipos • Tubos de reacción de PCR de 200 µL
• Puntas de micropipetas con filtro
• Gradillas
• Cultivo de Helicobacter pylori ATCC BAA-1606 cagA +
• Cultivo de Klebsiella sp
• Cultivo de Proteus sp
• Dimetil sulfóxido (DMSO)
• Cloruro de magnesio
• Tampón de PCR
• Cebadores Forward (F) (HpF1) y Reverse (R) (HpB25) para fragmento exter- no de gen ureA9
• Cebadores Forward (HpF2) y Reverse (HpB5) para fragmento interno de gen ureA9
• Muestra de Ácido desoxirribonucleico (ADN) • Solución de Control Interno (CI), preparado a 100 copias de ADN)10
• Marcador de peso (MP) • Control Negativo de Manipulador (CNM) • Control Negativo de Reactivo (CNR) • Pipetas • Cabina de flujo laminar tipo II • Termociclador • Vórtex
• Mini Centrífuga (Spin)
Procedimiento Se describen a continuación dos alternativas de preparación de la máster mix:
Protocolo usando preparación de GoTaq® G2 Green Máster Mix (Master mix) comercial.
Dispensar en un tubo de reacción de 200 µL o un tubo de centrífuga de1,5 mL el agua, la master mix y los cebadores para obtener una solución final 17,5 µL apro- ximadamente (ver tabla 7). Este paso se debe realizar dentro de la cabina de flujo. Luego, continuar con la incubación en el termociclador.
9 Ver secuencias en anexo 1, tabla 14.
10 Ver preparación en apéndice 6. Cálculos para preparación de soluciones de ADN, Obtención de solucio- nes de ADN a 100 copias.
Detección de Helicobacter pylori por PCR Anidada en muestras no invasivas
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Tabla 7. Reactivos y concentraciones necesarios para preparar un tubo de reacción Control Interno del gen UreA para la PCR anidada (Segunda amplificación, Máster Mix comercial).
Reactivos Concentración
Inicial Concentración
Cebador externo(Forward) 50 pm 1,0 pm 0,6
Cebador externo Reverse 50 pm 1,0 pm 0,6
ADN 103 copias 102 copias 3
Agua - 7,5 12,8
Volumen total - - 30
Fuente: Adaptado de Promega Corporation.
Protocolo usando preparación de máster mix no comercial Dispensar en un tubo de reacción de 200 µL o un tubo de centrífuga de 1,5 mL el agua, los reactivos descritos en la tabla 8. Este paso se debe realizar dentro de la cabina de flujo. Luego, continuar la incubación en el termociclador.
Tabla 8. Reactivos y concentraciones necesarias para preparar un tubo de reacción Segmento Externo del gen Urea A para la PCR anidada (Primera amplificación, Master Mix no comercial). 11
Reactivo Concentración inicial Volumen a tomar
(µL) Concentración final
DMSO 100% 1,25 5%
Primer F 60pmol/ µL 0,625 1,5 pmol
Primer R 60pmol/ µL 0,625 1,5 pmol
Cloruro de Mg 25mM 1,5 1,5 mM
Taq polimerasa 5 U/ µL 0,2 0,04 U/ µL
ADN CI 103 copias / µL 2,5 102 copias
ADN H.p. 103 copias / µL 2,5 102 copias
Agua tipo I - 10,40 -
Volumen final. - 25 µL
11 GoTaq® G2 Green Master Mix Protocol – Promega Corporation. En: https://worldwide.promega.com/
Guía Práctica
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1. Colocar los tubos en el termociclador y programar los ciclos, según tabla 9.
Tabla 9. Perfil de temperatura para PCR anidada del Segmento Externo del gen Urea A (Primera amplificación).
ETAPA TEMPERATURA °C TIEMPO CICLOS
Desnaturalización inicial 94 5
Fuente: Tomado de García, A. 2010 (26).
2. Correr los productos en gel de agarosa al 3,5% (preparada en tampón TBE al 0,5X), tampón de corrido TBE al 1X, 90 voltios, 110 miliamperios y 50 minutos.
3. Visualizar con bromuro de etidio una vez finalizado el corrido (ver figuras 5 y 7). Revisar capítulo 3. Electroforesis horizontal en gel de agarosa.
4. Tomar 3 µL del producto de la primera amplificación y realice una segunda empleando el segundo par de cebadores Forward (HpF2) y Reverse (HpB5) para fragmento interno de gen UreA teniendo en cuenta la tabla 10:
Tabla 10. Reactivos y concentraciones necesarios para preparar un tubo de reacción Segmento Interno del gen Urea A para la PCR anidada (Segunda amplificación).
Reactivos Concentración inicial Concentración Final Cantidad por tomar (µL)
Master mix 2X 0,8X 10
Cebador externo (Forward)
Cebador externo
ADN - - 3
Fuente: Autores del proyecto.
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5. Colocar los tubos en el termociclador y programar los ciclos (ver tabla 11):
Tabla 11. Perfil de temperatura para PCR anidada del Segmento Interno del gen Urea A (Segunda amplificación).
Etapa Temperatura°C Tiempo
Extensión final 72 10
Fuente: Tomado de García, A. 2010 (26).
6. Correr los productos en gel de agarosa al 3,5 % (preparada en tampón TBE al 0,5X), tampón de corrido TBE al 1X, 90 voltios, 110 miliamperios y 50 minutos.
7. Visualizar con bromuro de etidio una vez finalizado el corrido (ver figura 8). Revisar capítulo 3. Electroforesis horizontal en gel de agarosa.
Determinación de la selectividad de los cebadores 8. Amplificar diferentes productos de extracción de ADN genómico, pertenecientes
a microorganismos que compartan la actividad ureasa positiva. Ejemplo: Klebsiella pneumonie y Proteus mirabilis. Tener en cuenta las condiciones de PCR descritas en los puntos 1 y 2 del presente capítulo.
9. Correr los productos en gel de agarosa al 3,5 % (preparada en Tampón TBE al 0.5X), Tampón de corrido TBE al 1X, 90 voltios, 110 miliamperios y 50 minutos.
10. Visualizar con bromuro de etidio una vez finalizado el corrido (ver figura 9). Revisar capítulo 3. Electroforesis horizontal en gel de agarosa.
Determinación del límite de detección de la técnica 11. Cuantificar la cantidad de ADN inicial obtenida luego de realizar extracción de
ADN a partir de un cultivo de H. pylori ATCC (29).
12. Realizar diluciones a partir de la muestra anterior para obtener en otros tubos las siguientes concentraciones fentogramos por microlitros (fg/µL): 100 fg/µL, 10 fg/µL, 5 fg/µL, 2.5 fg/µL y 1 fg/µL (26).
Guía Práctica
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13. Amplificar las diluciones en el paso anterior teniendo en cuenta las condiciones de PCR descritas en los puntos 1 y 2 del presente capítulo.
14. Correr los productos en gel de agarosa al 3,5 % (preparada en tampón TBE al 0,5X), tampón de corrido TBE al 1X, 90 voltios, 110 miliamperios y 50 minutos.
15. Visualizar con bromuro de etidio una vez finalizado el corrido (ver figura 10). Revisar capítulo 3. Electroforesis horizontal en gel de agarosa
Determinación de la reproducibilidad de la técnica de PCR anidada
16. Evaluar la reproducibilidad de la prueba mediante la ejecución de los proce- dimientos de PCR por dos operarios ajenos a la estandarización de este (29). Procesar un CN deH2O TI, cepas de H. pylori ATCC 43526, 51652 y BAA-1606 (cagA +) y 2 controles negativos (ADN de Klebsiella spp, Proteus spp.)
17. Correr los productos en gel de agarosa al 3,5 % (preparada en tampón TBE al 0,5X), tampón de corrido TBE al 1X, 90 voltios, 110 miliamperios y 50 minutos.
18. Visualizar con bromuro de etidio una vez finalizado el corrido.
Recomendaciones A. Descontaminar las superficies utilizadas para preparar y dispensar la master mix
en los tubos de reacción de PCR, mediante radiación ultravioleta antes y después del procedimiento (15 a 30 minutos). Si hay sospechas de contaminación, limpiar las superficies con una solución de 0,5-1,0 % de hipoclorito de sodio y remover posteriormente con etanol al 70% una vez finalizado el trabajo.
B. Es recomendable incorporar los siguientes controles negativos para tener un mejor manejo de los contaminantes:
Control de extracción: agua estéril libre de nucleasas; procesarla como una muestra biológica más durante la extracción de ácidos nucleicos. Se trabaja siempre al final de las muestras.
Control Negativo de Reactivos (CNR): dispensar el reactivo en un tubo de reacción mantener el tubo cerrado durante el resto del proceso. Luego, incubarlo en el termociclador y realizar la electroforesis. Esto permite chequear los reactivos que se están utilizando para la preparación de las mezclas de PCR. Aplican para la master mix y el agua.
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Control Negativo del Manipulador (CNM): agregar agua en un microtubo en lugar del ácido nucleico, cada 3-4 muestras dispensadas, durante el proceso de carga de las muestras en la preparación de la PCR. Permite chequear la manipulación, por parte del operador, de las muestras con ácidos nucleicos.
Control de réplica: trabajar cada muestra utilizando réplicas (mínimo en triplicado) para descartar posibles falsos positivos, dada la alta sensibilidad de la técnica.
Por cada set de muestras que se procesa, se deben incluir en la misma tanda controles negativos y positivos. También se deben visualizar en el mismo corrido electroforético en el siguiente orden: Carril 1. MP; Carril 2. Control de master mix; Carril 3. Control de agua; Carril 4. CNM I; Carril 5. Línea de muestras, último carril. Control positivo. Los controles se deben montar en cada línea de muestras.
C. Si bien ambos métodos para preparar la master mix son válidos, se propone utilizar el producto comercial, puesto que ahorra tiempo en el pipeteado y se reduce el riesgo de contaminación por manipulación de los reactivos.
D. En la PCR anidada el segmento externo no es observado al usar 100 copias de ADN muestra. Se gana sensibilidad para detectar el segmento interno al hacer el segundo ciclo de amplificación de este segmento externo que no pudo ser observado en el primer ciclo de amplificación.
E. Se recomienda enviar a secuenciación los amplicones del gen ureA obtenido de las muestras para validar el método (Ver anexo 2. Figuras 13 y 14).
Figura 8. Corrido electroforético de fragmento interno de muestras de saliva. Carril 1. MP; Carril 2. CN; Carriles 3, 6-8. Fragmento interno de 120 pb muestras de saliva; Carril 4. Control negativo y master mix de agua; Carril 5. Control negativo bacteria; Carril 9. Control positivo de Helicobacter
pylori ATCC BAA-1606.
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Figura 9. Corrido electroforético de PCR realizada a partir de muestras de ADN de distintos orígenes. Carril 1. MP; Carriles 2. CNR de master mix y agua; Carriles 3 y 4. Helicobacter pylori
ATCC BAA-1606; Carriles 5 y 6. Helicobacter pylori ATCC 51652; Carriles 7 y 8. Helicobacter pylori ATCC 43526; Carriles 9, 14 y 15. Mezcla de ADN de las bacterias Helicobacter pylori ATCC 43526, 51652 y BAA-1606; Carriles 10 y 11. Klebsiella pneumonie, Carriles 12 y 13. Proteus mirabilis.
Fuente: Autores del proyecto.
Figura 10. Curva del límite de detección de la PCR anidada a partir de soluciones de ADN de cantidades conocidas. Carril 1. MP; Carril 2. CN; Carril 3. ADN 100 fg/ µL; Carril 4. 10 fg/µL; Carril
5. 5 fg/µL; Carril 6. 2.5 fg/µL; Carril 7. 1 fg/µL, concentración mínima detectable por la PCR.
Fuente: Autores del proyecto.
AMPLIFICACIÓN DEL GEN Cag A EN Helicobacter pylori MEDIANTE
PCR CONVENCIONAL Anahí María Barros Martínez, Aracely García Cuan.
El hallazgo del gen cagA ha permitido clasificar cepas de Helicobacter pylori en cagA+ y cagA-. Esta clasificación es importante porque las cepas cagA+ son más virulentas y están asociadas a patologías graves como el cáncer gástrico. El gen cagA se encuentra en un segmento de ADN de 40 kb que se conoce como isla de patogenicidad, por lo tanto, es un biomarcador de virulencia y de la presencia de esta isla de patogenicidad en la cepa de Helicobacter pylori.
Palabras clave: cagA, isla de patogenicidad, cáncer gástrico, Helicobacter pylori.
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Objetivo Describir las pautas para amplificar el gen Cag A, puesto que es un marcador de la patogenicidad de H. pylori.
Definiciones Cag A: gen con 3500 pb en asociado, asociado a citotoxina (cagA), está presente en el 50-70 % de las cepas de H. pylori. Es un marcador de la presencia de la isla genómica de patogenicidad (cag PAI) (30-32).
Materiales, insumos y equipos • Tubos de reacción de PCR de 200µL
• Puntas de micropipetas con filtro Gradillas
• GoTaq® G2 Green Master Mix (Master mix) agua ultrapura tipo I (H 2O TI).
• Cebadores Forward (D008 F Invitrogen) y Reverse (R008 R, Invitrogen)12
• Muestra de ácido desoxirribonucleico (ADN)
• Control de negativo del manipulador (CNM)
• Control negativo (CN)
• Control positivo (CP)
• Vórtex
• Mini Centrífuga (Spin)
Procedimientos 1. Dispensar en un tubo de reacción de 200 µL o tubo de centrífuga de 1,5 mL,
el agua, la y los cebadores Forward (D008 F) y Reverse (R008 R) para obtener una solución final 17,5 µL aproximadamente. Este paso se debe realizar dentro de la cabina de flujo; tener en cuenta la tabla 12:
12 Ver secuencias en anexo 1, tabla 14.
Guía Práctica
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Tabla 12. Reactivos y concentraciones necesarios para preparar un tubo de reación del gen Cag A para PCR convencional.
Reactivos Concentración inicial Concentración final Cantidad por tomar (µL)
Master mix 2X 0,8X 10
Cebador externo (Forward)
Cebador externo (Reverse)
ADN 103 102 2,5
Fuente: Autores del proyecto.
2. Dispensar la muestra de ADN (ver cantidad en la tabla 12) en el tubo de reacción. Este paso se debe realizar fuera de la cabina de flujo.
3. Colocar el tubo en el termociclador programado con los parámetros descritos en la tabla 13:
Tabla 13. Perfil de temperatura para PCR convencional del gen Cag A.
Etapa Temperatura °C Tiempo (minutos) Ciclos
Desnaturalización inicial
94 5
desnaturalización 35 ciclos
Fuente: Tomado de García, A. 2010 (26).
4. Correr los productos en gel de agarosa al 3,5% (preparada en tampón TBE al 0,5X), tampón de corrido TBE al 1X, 90 voltios, 110 miliamperios y 50 minutos.
5. Visualizar con bromuro de etidio una vez finalizado el corrido (ver figura 11). Revisar capítulo 3. Electroforesis horizontal en gel de agarosa.
Detección de Helicobacter pylori por PCR Anidada en muestras no invasivas
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Recomendaciones A. Revisar las recomendaciones de los procedimientos de PCR en los capítulos 4
y 5, pues para este capítulo también aplican.
Figura 11. Corrido electroforético de fragmento Cag A en muestras de saliva. Carril 1. MP; Carril 2. CNM; Carril 3. CNR de Master Mix; Carril 4. CNR deH2O TI; Carril 5. CN; Carriles 6, 8-14. Muestras negativas; Carril 7. Muestra positiva para Cag A 282pb; Carril 15. Control positivo de Helicobacter
pylori ATCC BAA-1606 cagA + (282 pb).
Fuente: Datos del proyecto.
CAPÍTULO 8
APLICACIÓN DE LA TÉCNICA DE PCR ANIDADA PARA DETECCIÓN DE Helicobacter pylori EN PLACAS
ARTERIOESCLERÓTICAS Franklin Enrique Torres Jiménez.
Agentes infecciosos como Chlamydia pneumoniae, Helicobacter pylori, Citomegalovirus, entre otros, pueden generar respuestas inflamatorias proateroscleróticas, en particular las infecciones latentes o persistentes. Por tal motivo, en el presente capítulo describiremo