DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM

POSITIVAS Y NEGATIVAS.POSITIVAS Y NEGATIVAS.

Dra. Norma Velázquez GuadarramaLaboratorio de Investigación en Bacteriología

Antibiótico

Toda sustancia de origen natural osintética con la capacidad de destruir osintética con la capacidad de destruir oimpedir el desarrollo de un organismovivo.

3) Alcanzar el sitio blanco 3) Alcanzar el sitio blanco para ejercer su efecto para ejercer su efecto

1) Concentrarse en el órgano, 1) Concentrarse en el órgano, tejido o células donde se tejido o células donde se encuentren las bacteriasencuentren las bacterias

2) Penetrar en el interior de la2) Penetrar en el interior de labacteria, concentrarse ybacteria, concentrarse ypermanecer activopermanecer activo

• antibióticos naturales: producidos pormicroorganismos (por ejemplo la penicilina)

• antibióticos semi-sintéticos: disponen de unesqueleto producido por microorganismos yesqueleto producido por microorganismos ymodificado químicamente (por ejemplo, laampicilina)

• quimioterápicos: son fármacos totalmente desíntesis creados en el laboratorio (por ejemplo,las sulfamidas)

Clasificación de los antibióticos

• Naturaleza Química

• Mecanismo de Acción

Naturaleza Química

• Beta-lactámicos– Penicilina– Cefalosporinas– Monobactámicos– Monobactámicos– Carbapenems– Inhibidores de Betalactamasas

• Polipéptidos• Aminoglucosidos• Anfenicoles• Tetraciclinas• Macrolidos• Glucopeptidos• Glucopeptidos• Lincosamidas• Sulfonamidas• Inhibidores de la folato redutasa• Quinolonas

En base a su mecanismo de acción

Acción de la Teicoplanina en la Síntesis de Pared Bacteriana

Resistencia Bacteriana

• Pérdida de la sensibilidad de unmicroorganismo a un antimicrobiano alque originalmente era susceptible.que originalmente era susceptible.

• Capacidad de las bacterias dedesarrollar mecanismos para evadirel efecto de los antibióticos a loscuales eran previamente susceptible

• Natural: Cuando todos losintegrantes de una determinadaespecie son resistentes.

• Adquirida: Cuando afecta a algunosintegrantes de una especie pero no ala totalidad.

Resistencia antimicrobiana

Bacteria Susceptible

Bacteria Resistente

Nueva Bacteria Resistente

Transferencia de Genesde Resistance

Centers for Disease Control and Prevention Campaign to Prevent Antimicrobial Resistance in Healthcare Settings

Resistencia adquirida• Cromosómica: se origina por mutaciones

• Extracromosómica

– Plasmidos– Plasmidos

– Trasposones

– Integrones

Mecanismos de transferencia genética

conjugación

Transformación

Transducción

Transformación

The Science Creative Quarterely Jan- March 2007

Disminución de la permeabilidad celular

BOMBAS DE EXPULSIÓN ACTIVA

RESISTENCIA A LA VANCOMICINA EN S. aureus

Identificación y Susceptibilidad

(CLSI) Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI/2007

Determinación del perfil de susceptibilidad antimicrobiana por la prueba de difusión

con disco

(CLSI) Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI/2007

Antibióticos activos in vitro sin eficacia clínica

(CLSI) Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI/2007

Prueba del Doble Disco para determinar Fenotipo “D”

SENSIBLEFENOTIPO cMLS

FENOTIPO iMLSFENOTIPO M

Detección de BLEEs por prueba de doble disco

Disco de la izquierda con 30 µg de CTX y disco central con 20mas 10µg de amoxicilina con ác. clavulánico y a la derechadisco con 30 µg de CAZ, muestran un fenotipo de resistenciaa ambas cefalosporinas

CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, Oct. 1995, p. 557–584

Determinación de la inducción de β-lactamasas AmpC

Cefotaxima

Cefoxitina

E-test para determinación de MBL

Walsh. CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, Apr. 2005, p. 306–325

E-test por un extremo imipenem (IP) y en el otro extremo imipenem más EDTA (IPI), reducción de 3 diluciones en la CIM en presencia de EDTA prueba positiva para metalo-ββββ-lactamasa (MBL), recomienda como S. malthophilia

ATCC13636 como control +

Concentración Inhibitoria Mínima

stock

MH

Antibióticos

Solidificar

Inhibición del crecimiento

Lectura e interpretación de Lectura e interpretación de

placasplacas

Oxa 0.25Oxa 0.25µµg/ml Oxa 0.5 g/ml Oxa 0.5 µµg/ml Oxa 1g/ml Oxa 1µµg/mlg/ml

Oxa 2Oxa 2µµg/ml Oxa 4g/ml Oxa 4µµg/mlg/ml

MÉTODOS

Verificaciónde cepas

Susceptibilidad

Método de difusión en disco

• Aislamiento en Gelosa Sangre

• Aislamiento en Gelosa Sal-Manitol

• Catalasa

• Prueba de la Coagulasa

Susceptibilidad Antimicrobiana

Concentración Mínima Inhibitoria (MIC)

Prueba del doble disco para determinar Fenotipo “D”

Extracción de DNAIdentificación del gen mecA y

tipificación del SCCmec por PCR-Multiplex

SAMR

Kit de extracción deDNA Genómico Wizard®

Identificación del gen mecA y tipificación del SCCmec por PCR-Múltiplex

Tamaño Amplicón

(pb)Especificidad

613 SCCmec I

398 SCCmec II

280 SCCmec III

776 SCC IVa

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tipo II Tipo V776 SCCmec IVa

493 SCCmec IVb

200 SCCmec IVc

881 SCCmec IVd

325 SCCmec V

147 mec A

Tipo IVaGel de agarosa 2%

Tipo II

Claritromicina

Claritromicina

� Mecanismo de acción:� Interfiere en la síntesis de

proteínas, se fija a lasubunidad 50S ribosomal.

� Mutación puntual en elgen 23S rRNA,gen 23S rRNA,principalmente en lasposiciones:

� 2142 (A2142 a G/C/T).� 2143 (A2143 a G/C).

Condiciones de Amplificación gen 23S

PCR

Desnaturalización 94ºC ----- 30s

Alineamiento 50ºC ----- 30s

Extensión 72ºC ----- 60s

30 ciclos

Condiciones de digestión Bsa I

Enzima Bsa I 5U

DNA Amplicon 5µg55ºC / 1 hora

Micromarker DNA

298

434

458

pb15001000

900800700600500

400

300

100 pb promega1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

80

102

174

298200

100

Tetraciclina

� Mecanismo de acción:� Inhibe la síntesis de

proteínas por la unión ala subunidad 30Sribosomal y bloqueandoel sitio de unión deltRNA-aminoacil.

Tetraciclina

tRNA-aminoacil.

� Mutaciones porsustitución y delecionesen el rRNA 16S,involucra lasposiciones:

� AGA 926-928 TTC

Identificación de mutaciones en el gen 16S del rRNA

GEN OLIGONUCLEÓTIDOS AMPLIFICADO

16S 16S-880fw 5-ATAGACGGGGACCCGCACAAG-3

16S-999rv5-TGGCAAGCCAGACACTCCA-3

120 pb.

Condiciones de PCR:

94ºC/ 15 min. preincubación

95ºC/ 10 seg. desnaturalización

56ºC/ 10 seg. alineamiento 30 ciclos

72ºC/ 10 min. extensión

Amplificados se mandaran asecuenciar para determinarlas mutaciones de losnucleótidos 926 a 928 delgen 16S del rRNA.

(Glocker E. et al, 2005)

frxA

Metronidazol

� Mecanismo de acción:� Produce pérdida de la

estructura helicoidal del DNA,inhibición de la síntesis deácidos nucleicos y muertecelular.

� Mutaciones sin sentido(deleciones o inserciones) en(deleciones o inserciones) enel gen rdxA y frxA quecodifican paranitrorreductasas.

� Dos tipos de cepasresistentes aquellas querequieren solo la inactivaciónde rdxA y aquellas querequieren de la inactivaciónde rdxA y frxA

Identificación de los genes rdxA y frxA

GEN OLIGONUCLEÓTIDOS AMPLIFICADO

rdxA

frxA

rdxA-F5-GCAGGAGCATCAGATAGTTCT-3

rdxA-R5-GGGATTTTATTGTATGCTACAA-3

frxA-F5-GGATATGGCAGCCGTTTATCATT -3

frxA-R

886 pb.

780 pb.frxA-R

5-GAATAGGCATCATTTAAGAGATTA-3

Condiciones de PCR:

94ºC/ 2 min. preincubación

95ºC/ 4 seg. desnaturalización

58ºC/ 40 seg. alineamiento 30 ciclos

72ºC/ 1 min. extensión

72ºC/ 10 min. extensión final

Jeong J.Y et al, 2000, Jeong J.Y et al, 2001

Mutación no habrá amplificación de los genes.

Sin mutación amplificación de los genes.

CONTROL DE CALIDAD DE LOS MÉTODOS A EMPLEAR

• E. faecalis ATCC 29212• GENTAMICINA 4-16 µg/mL• VANCOMICINA 1-4 µg/mL• OXACILINA 8-32 µg/mL• OXACILINA 8-32 µg/mL• HLRA sensible (gentamicina 500 µg/mL, HLRA estreptomicina 200 µg/mL)

• E. faecalis ATCC 59212• HLRA resistente • VancomicinaR 6 µg/mL en BHI

Oligonucleótidos para la amplificaciónpor PCR de Enterococcus resistentes aelevados niveles de Gentamicina yEstreptomicina

GEN SECUENCIAProducto

amplificado (pb)Referencia

GEN SECUENCIA amplificado (pb)Referencia

aac(6’)-Ie

aph(2’’)-Ia

(Gm)

5´-TGA TGA TTT TCC TTT GAT GT-3´

5´-CAA TCT TTA TAA GTC CTT TT-3´1,395

Suk-Kyung Lim,Koichi Tanimoto,

ant(6’) (Sm)5´-ACT GGC TTA ATC AAT TTG GG-3´

5´-GCC TTT CCG CCA CCT CAC CG-3´597

Udo, E. E., N. Al-Sweih,

Ciclo Temperatura Tiempo No. Ciclos

Desnaturalización 94° C 5 min. 1

Condiciones de la PCR para los genes

ant (6’)(Sm) y aac (6’)- aph (2’’) (Gm)

Desnaturalización inicial

94° C 5 min. 1

Desnaturalización 94° C 1min.

30Alineamiento 47° C 1min.

Extensión 72° C 1min.

Extensión final 72° C 5min. 1

**El almacenamiento es a 4°C

Electroferograma de los productos de la PCR para los genes ant (6’) y aac (6’)- aph

(2’’) de cepas HLRA

M C(-) C(+) C(-) C(+) 1 2 3 4 5 6(Sm) (Sm) (Gm) (Gm)

2000

3000

1395 pb1000

500

100

Fig 11. Ensayo de PCR para cepas HLRA. Línea M; MPM; línea C(-) ATCC 59212; línea C(+), ATCC 29212; lineas nones son cepas HRLA aac (6’)- aph (2’’) (+) ; líneas pares son cepas HLRA ant (6’) (+).

597 pb(Sm)

1395 pb(Gm)

• Obtención cepas (gram, catalasa, 6.5%NaCl)

• “over.night”

• Extracción de DNA total (kit Wizard® de Promega)

• Amplificación por PCR

Oligonucleótidos para la amplificación por PCR de los genesvanA y vanB de cepas de enterococos VancomicinaResistentes

GEN SECUENCIAProducto

amplificado (pb)Referencia

Van A5'- CAT GAA TAG AAT AAA AGT TGC AAT A - 3'5'- CCC CTT TAA CGC TAA TAC GAT CAA - 3'

1,030 Clark, N. C.,

Van B5’GTG ACA AAC CGG AGG CGA GGA 3’5’CCG CCA TCC TCC TGC AAA AAA 3’

433 Clark, N. C.,

Resistentes

PROGRAMACIÓN PARA GENES Van A.

Ciclo Temperatura Tiempo No. Ciclos

Desnaturalización inicial

94° C 5 min. 1

Condiciones de la PCR para el gen vanA y vanB

inicial

Desnaturalización 94° C 1min.

30Alineamiento 55° C 1min.

Extensión 72° C 1min.

Extensión final 72° C 5min. 1

**El almacenamiento es a 4°C

Electroferograma de los productos de la Electroferograma de los productos de la amplificación por PCR para los genes amplificación por PCR para los genes vanAvanA y y

vanBvanB

1000

500

200

100

3000

433 pb.

vanB

1 2 3 4 C(+) C(+) 7 8 M

Pie de figura

1,030 pb.

vanA

500

200

100

3000

400

Fig10. Ensayo de PCR para cepas EVR . Línea M; MPM; línea C(+), ATCC 29212; línea 3, capa EVR con vanB (+); lineas 4,7,8 cepas EVR con vanA (+); líneas restantes vanA y vanB (-)

Macrorestricción con enzima NotI empleando PFGE

Cepa microbiana

37°C/ 3 días

Cepa 1. Lavado con sol. salina EDTA,

(1min. 5000 rpm) y decantar

2. Agregar 1ml. de sol. PIV (TRIS-HCl 2M (pH 7.6) + NaCl 5M+ agua destilada estéril)

37°C/ 3 días

Bloques al 2%

Agarosa de bajo punto de

fusión

adicionar a los bloques

Agregar 1ml de sol. de lisis EC

Incubar/ 1 hr.

(Hosaka Y. et al, 2005)

Decantar la solución

agregar 1ml de sol. ES

Sol. ES: EDTA (pH 9-9.5)0.5M + Proteinasa K + sarcosil 20%

Incubar a 50°C/ 48hrs

Decantar la sol. ES

Agregar regulador TEconteniendo sol.fluorada defenilmetilsulfonil.

Incubar a temp. ambiente/ 4 hrs.

Hacer 3 lavados con TE por 10 min. c/u

Incubar a tem. ambiente/20 Decantar la sol.

Corte de los bloques de

agarosa

Sol. Tris-EDTA

ambiente/20 min.

PFGE

fragmentos de 40 a 20 kb a 9 V/cm a 14ºC /30 hrs/ 11 min.

fragmentos de 20 a 10 kb a 9 V/cm a 14ºC /26 hrs/ 3 min.

Buffer TBE 0.5 X

Decantar la sol.

Incubar con regulador de la enzima NotI/ 30 min.

Incubar a 37ºC/ 16 hrs. con 50U de NotI

Pseudomonas aeruginosa

multirresistentes

28H 116D 356H 379U 382D 452H 437H 438H 483H 498H 668H 672H 845H 925H

291

339.5388436.5

48.5

97

145.5

194

242.5

291

Foto gel de agarosa 1.2% de P.ae digeridas con enzima Spe I

Marcador

397U Liof

397U 4ºC

397U ºT amb

4U ºT amb

197UºT amb

4U 4ºC

4U Liof

197U 4ºC

197U Liof