DETECCIÓN DE UBIQUITINA EN MUESTRAS DE SEMEN Y SU …
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1 DETECCIÓN DE UBIQUITINA EN MUESTRAS DE SEMEN Y SU UTILIDAD EN EL DIAGNOSTICO DE INFERTILIDAD MASCULINA Ingrid Andrea Lozano Murillo Anny Paola Ríos Núñez TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar el titulo de BACTERIÓLOGAS PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE BACTERIOLOGÍA Bogotá Febrero 26 de 2002
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DETECCIÓN DE UBIQUITINA EN MUESTRAS DE SEMEN Y SU UTILIDAD EN EL
DIAGNOSTICO DE INFERTILIDAD MASCULINA
Ingrid Andrea Lozano Murillo Anny Paola Ríos Núñez
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
Para optar el titulo de
BACTERIÓLOGAS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BACTERIOLOGÍA Bogotá
Febrero 26 de 2002
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NOTA DE ADVERTENCIA
Articulo 23 de la Resolución N°13 de Julio de 1946: “La Universidad no se hace
responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus tesis de grado”.
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DETECCIÓN DE UBIQUITINA EN MUESTRAS DE SEMEN Y SU UTILIDAD EN EL
DIAGNOSTICO DE INFERTILIDAD MASCULINA
Ingrid Andrea Lozano Murillo
Anny Paola Rios Núñez
APROBADO: Directora: Co- Director: Luz Mabel Ávila Portillo Dr. José Ignacio Madero
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DETECCIÓN DE UBIQUITINA EN MUESTRAS DE SEMEN Y SU UTILIDAD EN EL
DIAGNOSTICO DE INFERTILIDAD MASCULINA
Ingrid Andrea Lozano Murillo
Anny Paola Rios Núñez
APROBADO: Jurados: ____________________________ ______________________________ Dra. Viviana Rodríguez Dra. Magally Escobar
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DETECCIÓN DE UBIQUITINA EN MUESTRAS DE SEMEN Y SU UTILIDAD EN EL
DIAGNOSTICO DE INFERTILIDAD MASCULINA
Ingrid Andrea Lozano Murillo
Anny Paola Rios Núñez
APROBADO:
Dra. Angela Umaña Dra. Aura Rosa Manascero Decana Académica Directora de la carrera de Bacteriología
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AGRADECIMIENTOS
• Agradecemos a la Doctora Luz Mabel Ávila Portillo del Centro de Referencia en
Autoinmunidad e Infertilidad (CERIA) por su dirección, asesoría y apoyo
incondicional en la elaboración de este trabajo.
• A los Doctores José Ignacio Madero y Jesús Alberto Ruiz de la Clínica de
Reproducción Asistida Medifértil por su apoyo financiero y por poner a nuestro
alcance las instalaciones de la clínica para la realización del estudio.
• A las Doctoras Claudia Lopez y Nubia Barrios del laboratorio de Andrología de la
misma institución por su amabilidad e invaluable colaboración en la selección de los
pacientes..
• Al Doctor Cristian Leiva representante de Becton Dickinson en Colombia por su
asesoría en la parte de citometría de flujo.
• A la Dra. Marcela Mercado, docente de la Pontificia Universidad Javeriana por su
excelente ayuda en la elaboración del análisis estadístico.
• Agradecemos enormemente a nuestros pacientes, quienes creyeron en nosotras e
hicieron posible la realización de este estudio.
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TABLA DE CONTENIDO
Pagina
• RESUMEN ............................................................................................. 1
• INTRODUCCION ........................................................................................... 1
• REVISION DE LITERATURA ................................................................... 5
1. UBIQUITINA ............................................................................................... 5
1.1 Generalidades ................................................................................. 5
1.2 Genes de la Ubiquitina ........................................................................ 6
1.3 Estructura ............................................................................................ 7
1.4 Síntesis de la Ubiquitina ..................................................................... 8
1.5 Funciones de la Ubiquitina ............................................................... 8
1.5.1 Ubiquitinacion de Proteínas ............................................................. 8
1.6 Señales en proteinas para Ubiquitinación y degradación ............... 12
1.7 Degradación de Conjugados de Ubiquitina ..................................... 13
1.7.1 Proteosoma 26S y 20S .................................................................... 13
1.8 Deubiquitinación ................................................................................. 17
1.9 Proteínas Celulares degradadas por el sistema de Ubiquitina ....... 19
1.9.1 Reguladores del ciclo celular. ............................................................. 20
1.9.2 Factores de Transcripción , Supresores Tumorales y
Oncoproteinas...................................................................................... 22
1.9.3 Proteínas liberadas del retículo endoplásmico.................................... 25
1.10 PAPEL DE LA UBIQUITINA EN DIFERENTES PROCESOS.............................. 25
2. ESPERMATOGÉNESIS ................................................................................. 28
2.1. Generalidades .......................................................................................... 28
8
2.2. Células Germinales .................................................................................. 29
2.2.1 Espermatogonias .................................................................................... 29
2.2.2 Espermatocitos ...................................................................................... 29
2.2.3 Espermatides ......................................................................................... 30
2.3. Fases de la Espermatogénesis .............................................................. 30
2.3.1 Fase proliferativa .................................................................................... 31
2.3.2 Fase Meiótica .......................................................................................... 33
2.3.2.1 Meiosis I .......................................................................................……. 33
2.3.2.2. Meiosis II ....................................................................................…….. 35
2.3.2.3. Síntesis de Ácidos Nucleicos y proteínas ....................................... 36
2.3.3. ESPERMIOGENESIS .............................................................................. 37
2.3.3.1. Reorganización nuclear ..................................................................... 38
2.3.3.2. Fase de Golgi ..................................................................................... 38
2.3.3.3. Fase Acrosomal y formación del flagelo .......................................... 38
2.3.3.4. Fase de Maduración ............................................................................ 39
3.0 REPRODUCCION ........................................................................................ 40
3.1. Ubiquitina y Reproducción ....................................................................... 40
3.1.1. Gametogenesis........................................................................................ 40
3.1.1.1 Espermatogénesis .............................................................................. 40
3.1.1.2 Ovogenesis .......................................................................................... 44
3.1.1.3 Deterioro de la espermatogénesis por inactivación de
Componentes del sistema de Ubiquitina. ..................................................... 44
3.1.2 Desarrollo placentario ......................................................................... 45
3.1.3. Modificaciones endometriales ............................................................. 46
3.2. MORFOLOGIA Y REPRODUCCION ......................................................... 47
vi.
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3.2.1. Morfología y Ubiquitina ......................................................................... 47
3.3. INFERTILIDAD .......................................................................................... 47
• FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN ........................... 49
• OBJETIVOS ............................................................................................. 51
• MATERIALES Y METODOS .................................................................. 52
• RESULTADOS ........................................................................................... 60
• DISCUSIÓN............................................................................................. . 67
• CONCLUSIONES....................................................................................... 71
• RECOMENDACIONES.............................................................................. 72
• ANEXOS..................................................................................................... 73
• BIBLIOGRAFIA.......................................................................................... 76
vii.
10
INDICE DE TABLAS.
Página
TABLA 1.0. Porcentaje de espermatozoides anormales en pacientes infértiles 60
TABLA 2.0. Porcentaje de espermatozoides anormales en controles fértiles 61
TABLA 3.0. Comparación del diagnóstico previo de infertilidad y el resultado
por el Test de Ubiquitina 66
viii.
11
INDICE DE FIGURAS
Página
• FIGURA 1. Estructura de la Ubiquitina................................................................ 7
• FIGURA 2. Proceso de Ubiquitinación ................................................................ 9
• FIGURA 3. Proteosoma 26S............................................................................... 13
• FIGURA 4. Degradación de proteínas por el sistema de Ubiquitina................... 19
• FIGURA 5. Espermatogénesis............................................................................. 28
• FIGURA 6. Primera División Meiótica................................................................... 33
• FIGURA 7. Segunda División Meiótica................................................................. 36
• FIGURA 8. Histograma control fértil....................................................................... 62
• FIGURA 9. Histogramas pacientes infértiles .......................................................... 63
• FIGURA 10. Sobreposición de histogramas de pacientes infértiles sobre el
Control Fértil .................................................................................... 63
ix.
12
RESUMEN
La Ubiquitina es un residuoproteico de 76 aminoácidos, cuya función es marcar proteínas,
células o substratos que van a ser degradados por el sistema proteosomal.
Teniendo en cuenta la función de esta molécula y su presencia en todas las células del
cuerpo humano se quiso dirigir este estudio sobre la relación de esta proteína con el
diagnostico de infertilidad masculina.
Para este fin, se evaluó la presencia de Ubiquitina, a través de citometría de flujo, en
muestras de semen de 15 pacientes infértiles y 8 controles fértiles (utilizados como muestras
Standart) y se obtuvo como resultado que los pacientes infértiles presentan una intensidad
de marcación mucho mayor que la de los controles fértiles y distribuciones histográficas
distintas. De los 15 pacientes infértiles, tratados en el estudio, 11 mostraron aumento en la
intensidad de fluorescencia en comparación con los controles, permitiendonos pensar que
en nuestros pacientes una elevada intensidad de fluorescencia está relacionada con la
infertilidad por factor masculino.
Al analizar las medianas de las muestras de los grupos en estudio se observaron diferencias
estadísticamente significativas (p=0.0001) siendo mayores los valores de las medianas de
los pacientes infértiles.
Con los datos proporcionados en este estudio se pretende aportar una base preliminar
importante dentro del campo de la investigación de la infertilidad masculina, sugiriendo la
detección de la Ubiquitina como un examen más objetivo, y de esta forma agilizar la toma
de decisiones en cuanto a diagnostico y tratamiento del paciente..
13
1. INTRODUCCION
A través de los años, diversos estudios han demostrado la íntima asociación existente entre
la morfología espermática y el éxito de la fecundación, convirtiéndose este parámetro y por
supuesto su alteración, en una de las posibles causas de la infertilidad de la pareja así
como un elemento de gran ayuda para la predicción de resultados en las diferentes técnicas
de reproducción asistida. (Kruger, T.F., et al., 1988).
Debido a esta importancia, múltiples autores han propuesto diferentes técnicas que permitan
evaluar las anormalidades morfológicas de los espermatozoides. Dentro de estos
procedimientos se pueden citar aquellos que permiten establecer la relación de la Ubiquitina
como marcador de malformaciones espermáticas, y el diagnóstico de infertilidad (Sutovsky,
P y cols, 2000; Sutovsky, P., y cols,2001)
La Ubiquitina es una proteína, conocida como un marcador proteolítico universal presente
en todas las células eucariotas, juega un rol importante en diversos eventos celulares, dentro
de los cuales se pueden mencionar el marcaje de detritos, células y diferentes proteínas
que van a ser sometidas a procesos proteolíticos o a apoptosis según el caso. Este marcaje
se realiza a través de un proceso conocido como ubiquitinación el cual se basa en
numerosas reacciones donde intervienen una enzima activadora específica llamada E1, una
enzima transportadora de Ubiquitina conocida como E2 y una enzima ligadora denominada
E3 logrando de esta forma el marcaje de la proteína blanco. Una vez marcado el substrato,
es transportado al complejo proteosomal y degradado a pequeños péptidos que luego serán
presentados por el Complejo Mayor de histocompatibilidad clase I (Bebington et al., 2001).
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Dentro de los substratos que son marcados por la Ubiquitina se encuentran
espermatozoides de morfología defectuosa, que al parecer son ubiquitinizados en su
transcurso por el conducto epididimal para su posterior fragmentación. (Hochstrasser,1996).
La Ubiquitina es secretada por el epitelio epididimal y se une selectivamente a la superficie
de los espermatozoides defectuosos, parte de los cuales son reabsorbidos por las células
epiteliales y otra parte por razones no conocidas pasa al eyaculado. El porcentaje de
espermatozoides ubiquitinizados en el eyaculado parece estar relacionado con la fertilidad
en toros, al igual que el grado de ubiquitinación epididimal es correlacionada con la
infertilidad en hombres, como se demostró por inmunofluorescencia y citometría de flujo en
muestras de semen de pacientes infértiles. (Sutovsky, P., 2000).
Como se mencionó anteriormente el sistema de la Ubiquitina está involucrado en numerosos
procesos celulares, regulando las cantidades y/o actividades de proteínas específicas a
través del apareamiento post-transduccional con la Ubiquitina o proteínas similares a esta.
Dentro de los procesos se puede citar la espermatogénesis, ya que diferentes fases de esta,
como las divisiones meióticas, requieren actividades especializadas del sistema de la
Ubiquitina. ( Baarends, W.M. y cols., 1988).
Datos bioquímicos indican que durante la espermatogénesis, la actividad del sistema de la
Ubiquitina es alta, lo cual se relaciona con el alto requerimiento de ruptura masiva de
proteínas nucleares y citoplasmáticas durante la última fase de este proceso que incluye la
distribución del DNA así como la condensación de la cromatina. ( Baarends, W.M. y
cols.,1988).
15
Otra de las funciones que tiene la Ubiquitina es el marcaje de la mitocondria espermática
dentro del citoplasma del ovocito para su posterior proteólisis durante el desarrollo
preimplantatorio. Esto brinda una fácil explicación para la herencia exclusiva del DNA
mitocondrial materno en mamíferos. La unión inicial de las moléculas de Ubiquitina a las
proteínas de la membrana mitocondrial del espermatozoide, ocurre durante la
espermatogénesis mientras la membrana mitocondrial del espermatozoide normal ya
marcada se enmascara por enlaces disulfuro en el epidídimo los espermatozoides
defectuosos son ubiquitinados en su superficie. (P. Sutovsky et al., 1999)
Por todo lo anterior, se evidencia la necesidad de profundizar en la investigación de técnicas
y estudios mejorados que permitan dilucidar con mayor certeza si existe alguna relación
entre la Ubiquitina y la infertilidad.
En este estudio se pretende determinar la presencia de Ubiquitina; en muestras de semen
de varones fértiles e infértiles mediante la técnica de citometría de flujo, ya que esta además
de ser una de las herramientas mas confiables existentes del momento, es una técnica
altamente especifica y potencialmente sensible que permitirá establecer una relación entre
la detección de esta proteína y la fertilidad.
Como la prueba fue realizada en varones fértiles e infértiles, se pudo comparar los diferentes
parámetros evaluados en el espermograma entre los dos grupos al igual que las diferencias
en la intensidad de fluorescencia con respecto a la presencia de Ubiquitina y se encontró
que los varones infértiles al contrario de los fértiles presentan mayor intensidad de
fluorescencia y parámetros seminales lejanos de los idóneos, lo que nos permitió deducir
que, si existe relación entre la presencia anormal de Ubiquitina y la infertilidad masculina.
16
Por último, se pretende con este estudio aportar una herramienta valiosa en el campo de la
investigación de la infertilidad masculina.
El trabajo fue realizado en la clínica de reproducción asistida MEDIFERTIL y el Centro de
Referencia en Infertilidad y Autoinmunidad (CERIA), bajo la dirección de la Dra. Luz Mabel
Ávila Portillo, el Dr. José Ignacio Madero y la Asesoría de la Dra. Diana Patiño docente de la
Pontificia Universidad Javeriana.
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2. REVISIÓN DE LITERATURA
1. UBIQUITINA
1.1 Generalidades
La Ubiquitina es un residuo proteico de 76 aminoácidos, conocido como un marcador
proteolítico universal presente en todas las células eucariotas, ya sea en su forma libre o
atada de manera covalente a las proteínas del núcleo, citosol o membrana plasmática. Esta
proteína fue descrita por primera vez en 1975, por Goldstein y Schlesinger, quienes
observaron que este péptido actúa en los linfocitos vía receptores β-adrenergicos y
activación de adenil-ciclasa (Goldstein et al., 1975; Schelsinger et al., 1975). Además justo
desde el comienzo hubo una indicación de que la Ubiquitina podía ser de interés para los
investigadores que trabajaban en la transducción de la señal. Sin embargo se aclaró que el
sistema de la Ubiquitina es altamente complejo, y que muchas de las extensas e importantes
funciones de la ubiquitinación de proteínas dependen de su rol en la degradación de
proteínas (Baarends, W.M., et al, 1999).
La Ubiquitina y sus enzimas representan uno de los sistemas más complejos y fascinantes
en biología. Es una de las proteínas más altamente conservada hasta ahora descubierta en
las células eucarióticas, exhibe profunda estabilidad a temperaturas extremas y degradación
proteolítica (Monia, B.P., 1990). Juega un papel importante en diversos eventos celulares,
dentro de los cuales se pueden mencionar el marcaje de proteínas que van a ser sometidas
a procesos proteolíticos, este marcaje se realiza a través de un proceso conocido como
ubiquitinación( Sutovsky. P, 2001).
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1.2 Genes de la Ubiquitina:
La Ubiquitina es codificada en el genoma eucariota por una familia multigénica (Bebington,
C., 2001), la cual está dividida en dos clases. La primera compuesta por poligenes
(poliubiquitina) en la cual las repeticiones directas de los 76 amino ácidos existen de manera
contigua. La repetición final del extremo 3’ de este poligen es usualmente seguido por un
codón codificando un aminoácido C-terminal no ubiquitinado que no es conservado entre las
diferentes especies.(Monia, B.P., 1990).Esta familia poligénica está presente en levaduras,
Tripanosoma, Drosophila, Xenopus, plantas, pollos, y humanos; hallándose variaciones en el
número de repeticiones encontradas en cada gen y en el número de loci de poliubiquitina en
cada genoma. Por ejemplo, las levaduras contienen en su genoma un gen poliubiquitina
único que codifica un pentámero de Ubiquitina mientras que el Dyctioselium contiene cinco
genes poliubiquitina; uno con nueve repeticiones directas de la unidad de Ubiquitina, dos con
cinco repeticiones y dos mas con tres repeticiones. El genoma humano contiene al menos
dos genes poliubiquitina uno de nueve repeticiones y otro de tres repeticiones. (Monia, B.P.,
1990)
La segunda clase de genes de Ubiquitina ha sido identificada en células eucarióticas en
donde una única unidad de Ubiquitina es fusionada en su C-terminal, con secuencias de
aminoácidos no relacionados. Se han identificado dos tipos de genes de esta familia, el
primero codifica Ubiquitina unida a PEC52 (Proteínas de Extensión de Carboxilo) de 52
Aminoácidos y el segundo codifica para una extensión de 76-80 Aminoácidos (CEP76-80)
dependiente de las especies. (Monia, B.P., 1990).
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Las CEPs son altamente conservadas a nivel de Aminoácidos en los diferentes organismos
como levaduras, ratón, Dyctioselium y humano. Son similares a gran variedad de proteínas
de unión a ácidos nucleicos. Todas contienen un motivo común estructural presente en
muchas proteínas reguladoras de unión conocidas como “proteínas de dedos de Zinc”. Este
motivo coordina el Zinc por sus residuos de Cisteína e histidina cuidadosamente alineados
resultando en la formación de una estructura similar a un dedo, que se une al DNA o RNA.
.(Monia, B.P., 1990)
En cuanto a la expresión de estos genes se ha observado regulación diferencial en
diferentes organismos durante el desarrollo, crecimiento celular y bajo condiciones de
estrés. Se ha demostrado que bajo condiciones de rápido crecimiento celular las reservas de
diferentes mRNA de Ubiquitina están compuestos predominantemente de transcriptos de
UbPEC(Proteínas de Extensión de Carboxilo de la Ubiquitina) mientras que bajo condiciones
de estrés los genes poliubiquitina están altamente inducidos y los genes UbCEP son
apagados simultáneamente. (Monia, B.P., 1990).
1.3 Estructura:
Figura 1. Estructura de la Ubiquitina
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Es un dominio único empaquetado, tiene una estructura globular compuesta de cinco hebras
de hoja β plegada y 3 giros y medio en α- hélice. Tiene una cubierta hidrofóbica densa así
como algunos parches hidrofóbicos en su superficie. La cubierta hidrofóbica y las moléculas
de hidrógeno extensivas unidas a la estructura secundaria explican probablemente la
profunda estabilidad de la Ubiquitina a la denaturación por temperatura. Los últimos cuatro
residuos de C-terminal (leu-arg-gli-gli) se extienden desde la estructura compacta para
formar una cola; este proceso es crítico para la función de la Ubiquitina porque es el residuo
terminal de glicina el que se une a la enzima activadora E1 y posteriormente a su proteína
blanco durante la formación de los conjugados Ubiquitina-proteína..(Monia, B.P., 1990).
1.4 Síntesis de la Ubiquitina.
La Ubiquitina no se produce en forma madura sino como un precursor, el cual está formado
por una proteína ribosomal fusionada con el C-terminal de la Ubiquitina y más copias de esta
generando poliubiquitina (Bebington, C., 2001). El procesamiento de los precursores de la
Ubiquitina es extremadamente rápido e incluso puede ocurrir de manera cotraduccional
.(Monia, B.P., 1990).
1.5 Funciones
1.5.1 Ubiquitinación de proteínas:
El principal y uno de los más importantes factores que determina la probabilidad de que una
proteína celular particular deba ser degradada por el proteosoma es la modificación por la
Ubiquitina ya sea en su forma monomérica o a manera de cadena.(Hochstrasser M.; 1996).
21
La unión de la Ubiquitina a la proteína requiere la acción esencial de 3 enzimas. La primera
de estas es la enzima activadora específica E1 que se encarga de activar el Carbono
Terminal del residuo de Glicina de la Ubiquitina de una manera ATP dependiente, este
suceso consiste en la formación de un adenilato de Ubiquitina intermediario, con la liberación
de Pirofosfato (PPi) y AMP. La unión de la Ubiquitina al residuo de Cisteina de la enzima E1
se realiza por medio de un enlace Tíoéster. Una vez activada la Ubiquitina es transferida a
un residuo de Cisteina, sitio activo de la proteína transportadora de Ubiquitina, segunda
enzima de este sistema, conocida como E2. El tercer paso de este proceso es catalizado por
una enzima ligadora llamada E3, donde la Ubiquitina es unida a través de su Carbono
Terminal en un enlace isopeptídico amido al grupo ε- amino del residuo de Lisina de la
proteína substrato (Hochstrasser M.; 1996).
Fig2 Proceso de Ubiquitinación
22
Usualmente hay una sola E1, pero hay muchas especies de E2s y múltiples familias de E3s;
de estas últimas algunas parecen ser responsables de la selectividad de la unión de la
Ubiquitina a sus proteínas blanco. En algunos casos la unión de la proteína substrato a
una E3 es indirecta, vía una proteína adaptadora. Diferentes tipos de E3s pueden llevar a
cabo la transferencia de la Ubiquitina a una proteína substrato por dos mecanismos
diferentes. En casos como el de la familia del dominio Hect de enzimas E3, la Ubiquitina es
primero transferida desde una E2 apropiada a un sitio activo de la enzima E3 formado por un
residuo de Cisteina. Este enlace Tíoéster Ub-E3 es el donador para la formación del enlace
amido con la proteína substrato (Figura 2B). Desde que las enzimas E3 estén unidas a un
grupo de enzimas E2s y a su vez estén unidas a su proteína substrato apropiada, la
Ubiquitina (Ub) puede ser transferida directamente desde una E2 a una proteína substrato
(Figura 2C). Después del enlace de la Ubiquitina a su proteína blanco una cadena de
poliubiquitina es usualmente formada, en la cual el C-terminal de cada unidad de Ubiquitina
es unido a un residuo especifico de Lisina ( usualmente Lisina 48) de la Ubiquitina previa.
(Hochstrasser M.; 1996).
Existen datos genéticos en levaduras indican que múltiples enzimas E2 pueden ser
necesarias para la degradación máxima de un substrato, análisis in Vitro de ubiquitinación
de proteínas han sugerido que diferentes enzimas E2 pueden tener algunas veces
funciones redundantes en la ubiquitación de un substrato particular; lo que lleva a pensar
que una sola E2 puede cumplir a cabalidad la función de marcaje de la proteína substrato.
(Hochstrasser M.; 1996). Sin embargo no es mucha la evidencia experimental que se tiene
para relacionar la unión directa de las E2s a la proteína substrato. (Kovalenko O.V. et al;
1996).
23
El componente del sistema de conjugación de la Ubiquitina que está mas directamente
involucrado en el reconocimiento del substrato es la enzima E3. Las ligasas Ubiquitina –
proteína tienen papeles importantes en la determinación de la selectividad de la degradación
de proteínas mediada por Ubiquitina ( Hochstrasser M.; 1996).
Existen cuatro tipos de proteínas ligadoras de Ubiquitina la principal es la E3 regla N –
terminal, de las cuales la mejor caracterizada hasta el momento es la E3α, proteína de
200kDA que une substratos proteicos formados en su extremo N-– terminal por residuos de
aminoácidos básicos o altamente hidrofóbicos. (Hochstrasser M.; 1996)..
Una segunda familia de enzimas E3 es la familia del dominio hect ( homologo a E6 – AP
carbono – terminal). El primer miembro de esta familia es E6 – AP (proteína asociada a E6)
una proteína celular de 100 kDa que a diferencia de E3α, E6 – AP no se une directamente a
la proteína sino que se une indirectamente vía E6 Huibregtse JM. Et al; 1991).
En el presente existe poca información acerca de las posibles funciones de algunas
proteínas hect. Algunos casos de síndrome de Angelman, una enfermedad humana
hereditaria caracterizada por retardo mental, es debida a mutaciones en el gen que codifica
para E6-AP Estas observaciones sugieren que la proteína E6-AP es requerida para el
desarrollo cerebral. (Ciechanover A 1994 ).
La tercera de esta clase de enzimas es el Ciclosoma o Complejo Promotor de Anafase
(APC) el cual tiene una actividad ligasa de Ubiquitina especifica para proteínas reguladoras
del ciclo celular que contienen un motivo degenerado de 9 aminoácidos llamado la caja de
destrucción (Hochstrasser M.; 1996).
24
La última clase a mencionar es el Complejo Fosfoprotein-Ubiquitin Ligasa (PULCs), que se
encarga de reconocer otras proteínas reguladoras del ciclo celular que se encuentran
fosforilados haciendose más susceptibles a la acción Ubiquitin-ligasa. (Hershko A y
Ciechanover; 1998).
1.6 SEÑALES EN PROTEÍNAS PARA UBIQUITINACIÓN Y DEGRADACIÓN.
Existen diferentes señales que permiten que una proteína sea reconocida para la marcación
por Ubiquitina:
• ELEMENTOS PEST: Son regiones enriquecidas en residuos de Prolina, Serina,
Glutámico y Treonina que contienen sitios de fosforilación necesarios para la
degradación. Fosforilaciones múltiples de estos elementos son requeridas para la
ubiquitinación y degradación de reguladores del ciclo celular tales como G1 y el
IkB(Inhibidor del Factor Nuclear kB).
• REGLA DEL EXTREMO AMINO: En este caso la ubiquitinación y degradación de la
proteína es determinada por la naturaleza del residuo aminoácido de su N-terminal.
(Hershko A y Ciechanover; 1998).
• CAJA DE DESTRUCCIÓN: Es una secuencia motivo de 9 aminoácidos usualmente
localizada en la región N-terminal de ciclinas mitóticas y es necesaria para su
ubiqutinación y degradación. (Hershko A y Ciechanover; 1998).
Una compilación de secuencias de la caja de destrucción de 40 ciclinas de tipo B y
de tipo A de varios organismos (Hochstrasser;1996) mostraron que tienen la
siguiente estructura general:
R (A/T) (A) L (G) x (I/V) (G/T) (N)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
25
Residuos de Aminoácidos o combinación de dos residuos, que aparecen en
paréntesis en la estructura mostrada arriba ocurren en mas del 50% de las
secuencias de destrucción conocidas. De este modo los únicos residuos invariables
son R y L en posiciones uno y cuatro respectivamente; el resto de la secuencia de la
caja de destrucción es completamente degenerada. (Hochstrasser;1996)
1.7 DEGRADACION DE CONJUGADOS DE UBIQUITINA – PROTEINA.
1.7.1 Proteosoma 20S y 26s.
Figura 3. Proteosoma 26S
La ruptura de proteínas de células eucarióticas ocurre en un complejo multicatalítico
denominado proteosoma el cual es el responsable de la degradación selectiva de proteínas
celulares y la producción de péptidos para la presentación antigénica.(Goldberg A, et
al;1992)
26
El proteosoma 26S es un complejo multicatalítico encontrado tanto en el citosol como en el
núcleo de una gran variedad de células y sus funciones incluyen la remoción de proteínas
anormalmente ensambladas, degradación de ciclinas involucradas en el control del ciclo
celular, el procesamiento y degradación de reguladores de trascripción, respuesta inmune
mediada por células y apoptosis.(Hershko, A.. y cols, 1998).
El proteosoma 26S esta compuesto por una proteinasa de superficie denominada
proteosoma 20S y un par de partículas reguladoras dispuestas simétricamente llamadas 19S
(Peters JM, et al; 1994).
El proteosoma 20S es una partícula de 700 kDa con un rol esencial en la vía Ubiquitina
dependiente de ATP y probablemente en otros procesos degradativos no lisosomales
Esta estructura contiene la mayor actividad proteolítica normal y es casi el 1 % de las
proteínas en células de mamíferos. ( Goldberg A, et al;1992).
Esta partícula contiene tres o cuatro actividades peptidasa diferentes, las cuales clivan
específicamente residuos ácidos, hidrofóbicos o básicos. Las subunidades responsables de
estas actividades son poco conocidas, sin embargo mutaciones en una simple subunidad en
levaduras puede inactivar la vía catalítica ( Goldberg A, et al;1992). Estas subunidades
están dispuestas dentro de un complejo con forma de barril de cuatro estratos los cuales
están sobre una sección cruzada con forma de anillos con un claro hoyo central de 10 a 20
Å, las cuales pueden ser un sitio de ingreso para proteínas. Presumiblemente el gran
numero de distintas subunidades y su hermética organización conceden el eficiente
rompimiento de las proteínas y la cuidadosa regulación de actividades proteolíticas in vivo
(Hershko A y Ciechanover; 1992). .
27
El proteosoma 20S posee dos unidades α7- β7 idénticas organizadas como α1-7β1-7β1-7 α1-7.
Sin embargo solo tres de las 7 subunidades β son activas. A partir del uso del modelo de
substratos e inhibidores así como de proteosomas mutantes se dedujo que estas
subunidades β activas de la proteasa multicatalítica son responsables de tres actividades
proteolíticas distintas de acuerdo a la posición 1 (P1) del residuo del substrato como
sigue(Uebel, S., Tampé, R., 1999).
• β5: Actividad similar a la quimotripsina (para residuos hidrofóbicos).
• β2: Actividad similar a la tripsina (residuos básicos en P1)
• β1: Actividad similar a peptidilglutamilpeptidasa (residuos ácidos en P1)
La estructura de cristal también ha mostrado que las cadenas α, a pesar de ser
cataliticamente inactivas, juegan una función esencial en la estabilización de la estructura de
las cadenas β. La estructura cristalina ha revelado una distancia de 28Å entre los sitios
activos de la treonina de la subunidad β activa adyacente (Hershko A y Ciechanover
A;1996). Esta distancia puede determinar la longitud de los péptidos generados durante el
proceso proteolítico ( mas o menos ocho residuos de aminoácidos) y puede explicar el
desempeño del proteosoma en la elaboración de péptidos antigénicos presentados a las
moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad clase Ι El residuo catalítico de
Treonina está en el N – terminal de una subunidad β y el grupo α amino libre parece que
sirve como la base general en el mecanismo catalítico. (Hershko A y Ciechanover A;1996).
A pesar de que el proteosoma 20S es esencial en la vía dependiente de Ubiquitina, por si
misma, esta partícula no puede digerir conjugados de Ubiquitina y requiere componentes
adicionales para este proceso. (Hershko A y Ciechanover A;1996).
28
Estudios por Rechsteiner Goldberg y sus colegas demostraron inicialmente que las proteínas
ubiquitinadas son degradadas a péptidos pequeños por una estructura muy larga la cual fue
llamada complejo proteasa 26S (Goldberg L;1992). Pero la estructura purificada no solo
degrada conjugados de Ubiquitina por un proceso ATP dependiente sino que también
algunas proteínas no ubiquitinadas y péptidos cortos. Sin embargo fue recientemente
propuesto el nombre simple de proteosoma 26S para enfatizar que esta es una partícula
proteolítica distinta pero relacionada a la partícula 20S. (Goldberg A.,1992).
Un hallazgo critico hecho por Hershko y colaboradores mostró que cuando los reticulocitos
eran privados de ATP, no podía ser encontrado el complejo 26S (Goldberg A;1992) . Pero
esta estructura podría ser formada in Vitro por una asociación dependiente de ATP de tres
grandes componentes llamados CF-1( 600kDa), CF-2 (250kDa) y CF-3(600kDa). Dos grupos
demostraron entonces que el proteosoma 20S corresponde al componente CF-3, y que en
presencia de ATP, esta partícula se asocia con los otros componentes para formar el largo
complejo que degrada las proteínas ubiquitinadas. (Goldberg A;1992).
De este modo, tanto la formación del complejo 26S como su función proteolítica requiere
hidrólisis de ATP. El complejo 26S contiene las múltiples actividades peptidasas del
proteosoma 20S y probablemente todas estas subunidades (21-31 kDa) (Goldberg A;1992).
Recientemente imágenes claras del complejo 26S purificado han sido obtenidas a través de
coloraciones negativas. Dos formas son evidenciadas, una como un “corcho de champaña”
compuesta en uno de los extremos en forma de barrera del proteosoma 20S pero con una
base romboédrica que contiene los componentes del reconocimiento de proteínas
ubiquitinadas (Goldberg A;1992)
29
CF-1 y CF-2 pueden proveer la capacidad para el reconocimiento de las proteínas
ubiquitinadas así como para la disociación de cadenas de Ubiquitina y liberación de
moléculas de Ubiquitina libre cuando la proteolisis es completada. (Goldberg A;1992)
1.8. DEUBIQUITINACION.
Evidentemente, un control especifico de proteínas de deubiquitinación toman parte en el
sistema de Ubiquitina. Muchos trabajos acerca de la regulación del recambio de proteínas
intracelulares se han centrado en las enzimas que unen la Ubiquitina a las proteínas,
olvidando el papel de las enzimas de deubiquitinación en los eventos reguladores. Las
cadenas de Ubiquitina ensambladas sobre varias proteínas son un sistema altamente
dinámico. La Ubiquitina es clivada de su substrato por enzimas conocidas como enzimas
deubiquitinantes (Hershko A y Ciechanover A;1996).
Las enzimas de deubiquitinación están divididas en dos familias: La primera conformada por
las ubiquitin-carboxil hidrolasas(UCHs) capaces de remover Ubiquitina solo de péptidos o
proteínas pequeñas y la otra familia está conformada por las proteasas procesadoras
especificas de Ubiquitina ( UBPs) que tienen una amplia especificidad y también hacen
deubiquitinación de proteínas intactas. Esta última familia de enzimas es extremadamente
divergente pero todos los miembros contienen numerosas secuencias consenso cortas que
ayudan a formar el sitio activo de la enzima ( Hochstrasser et al., 1996).
-
Una hidrolasa, llamada isopeptidasa T ( Iso T), actúa preferencialmente sobre cadenas de
poliubiquitina libres o no ancladas y estimula la ruptura de proteínas por el desensamblaje de
cada cadena que inhibe la acción del proteosoma 26S ( Hershko et al., 1992). Estudios in
30
Vitro sugieren que Iso T podría facilitar la degradación proteosomal, posiblemente evitando
la acumulación de cadenas de Ubiquitina generadas como intermediarios en la degradación
del substrato.(Hadari, T., et al., 1992).
Recientemente, Lam et al reportaron que el complejo regulador 19S del proteosoma 26S
contiene una Ubiquitina sensible aldehído de 37 kDa, Isopeptidasa ATP independiente que
remueve motivos simples de Ubiquitina. Los autores propusieron que esta Isopeptidasa
participa en la edición y en el bloqueo de la degradación de proteínas lentamente catalizadas
o pobremente ubiquitinadas. (Shaeffer JR. et al.,1997).
Otra función interesante de Isopeptidasas especificas es la regulación de la proliferación
celular. Esto fue observado debido a que en ensayos in vitro las citoquinas indujeron
enzimas deubiquitinantes especificas en células T, llamadas DUB-1 y DUB-2 DUB-1 es
inducida por estimulación de los receptores de citoquinas para interleuquina-3,IL-5 y GM-
CSF, sugiriendo una intervención de la subunidad β común de los receptores de la
interleuquina, en esta inducción. DUB-2 es inducida por la interleuquina 2 como un gen
inmediato temprano que está sobre regulado después de la iniciación de la estimulación.
(Jentsch S, et al., 1992).
Presumiblemente mas enzimas deubiquitinantes trabajarán como reguladores negativos del
sistema de Ubiquitina. Sin embargo, hay numerosas formas en las cuales las enzimas de
deubiquitinación pueden funcionar para aumentar la ubiquitinación y/o degradación de
proteínas. Primero, la Ubiquitina es siempre sintetizada en forma de precursora, lo cual
requiere la remoción de péptidos carbono terminal o aminoácidos, enzimas deubiquitinantes
son por consiguiente necesarias para generar monómeros de Ubiquitina. Segundo, la
Ubiquitina activada puede formar grupos con abundantes nucleofilos intracelulares, como
31
aminas o glutation. Se ha demostrado que estos aductos pueden consumir el pool de
Ubiquitina libre en menos de un minuto en las células de mamífero. Tercero, largas cadenas
de Ubiquitina son frecuentemente ensambladas a proteínas intracelulares, en algunos casos
quizás a proteínas marcadas inapropiadamente (Jentsch S, et al., 1992).
Finalmente, los proteosomas y ciertas enzimas del sistema de conjugación de la Ubiquitina,
como la E3 α parecen unir cadenas de Ubiquitina de manera ávida (Jentsch S, et al., 1992).
Estas cadenas, ya sea generadas de novo o en el curso de la proteolisis del sustrato
pueden necesitar ser rápidamente desensambladas para prevenir la unión extensiva y la
consiguiente inhibición del proteosoma o de otras enzimas del sistema de Ubiquitina.
Evidencias de diferentes enzimas de deubiquitinación indican que la función de ellas in Vivo
llevada a cabo para facilitar la degradación dependiente de Ubiquitina por el mecanismo
anteriormente descrito, es necesaria para prevenir la excesiva acumulación de oligomeros
inhibidores de Ubiquitina. (Jentsch S, et al., 1992).
1.9. PROTEÍNAS DEGRADADAS POR EL SISTEMA DE UBIQUITINA.
Figura 4. Degradación de proteínas
32
1.9.1 Reguladores del ciclo celular.
El progreso del ciclo celular en las células eucariotas es manejado por las oscilaciones en
las actividades de las enzimas quinasas dependientes de ciclinas denominadas Cdks, éstas
proteínas catalizan la transferencia de grupos fosfato desde el ATP a proteínas implicadas
en la síntesis de DNA y la mitosis estas quinasas son activadas enzimáticamente cuando
se unen a las ciclinas. (García, J., Bandrés, E., et al, 2001). La actividad Cdk es
controlada por una síntesis y degradación periódica de ciclinas, así como por fluctuaciones
en los niveles de inhibidores Cdk (Ckis) y por fosforilación reversible. La degradación
selectiva mediada por Ubiquitina de ciclinas, Ckis y otros reguladores del ciclo celular
parecen jugar un papel central importante en el control de este mecanismo.(Peralta, O.,
Baena, M., et al; 1997)
Inhibidores CDK
Las actividades de algunos Cdks son reguladas por fluctuaciones en el nivel de sus
proteínas reguladoras negativas denominadas Ckis. De este modo un complejo Ciclina/Cdk
no puede actuar hasta que el inhibidor sea removido por proteolisis selectiva. (Peralta, O.,
Baena, M., et al; 1997). Los inhibidores de Cdks (Ckis) se dividen en dos familias que
difieren en estructura, mecanismo de acción y especificidad. (Peralta, O., Baena, M., et al;
1997).
• Familia KIP/CIP: Está conformada por tres proteínas denominadas p21, p27 y p57,
siendo la más importante p21 ya que inhibe CDK2, CDK4 y el antígeno nuclear de
proliferación, el cual es una subunidad de la DNA polimerasa e inhibe de esta
manera la síntesis de DNA.
33
• Familia INK4: Formada por cinco proteínas: p14, p15, p16, p18 y p19 encargadas de
inhibir la formación de complejos de ciclina D/CDK4 y D/CDK6 (implicados en el
control de la fase G!) por competición con las ciclinas por las subunidades CdK.
Ciclinas mitóticas.
Se piensa que todas las ciclinas son degradas por un proceso mediado por Ubiquitina. Los
sistemas que llevan a cabo esta ligación a la Ubiquitina, y la manera por la cual estos
sistemas son conectados a la red de fosforilación reguladora del ciclo celular, son diferentes
para ciclinas mitóticas y ciclinas G1. Ciclinas mitóticas de tipo B y algunas ciclinas de la fase
S como la ciclina A (Jentsch S, et al., 1992), son ligadas a la Ubiquitina por el Ciclosoma,
mientras las ciclinas G1 son ubiquitinadas por enzimas E3 tipo complejo fosfoprotein-
ubiquitin-ligasa(PULC).
La ciclina B mitótica fue la primera ciclina descubierta. Está combinada con Cdk1 para
formar la mayor quinasa mitótica denominada MPF (factor promotor de fase M ). MPF causa
la entrada de las células a mitosis, y después de un retraso, activa el sistema que degrada
su subunidad Ciclina. La inactivación de MPF, causada por la degradación de la ciclina B es
requerida para la salida de la mitosis, como lo muestran las observaciones en las células
que expresan formas no degradables de ciclina B que se detienen en la anafase tardía
(Herhsko et al; 1991).
Ciclinas G1:
Las ciclinas G1 son proteínas altamente inestables presentes durante la fase G1 y en la
transición de G1 a S estas no contienen el motivo de caja de destrucción pero en cambio
34
son marcadas para la degradación por fosforilación. (Hershko y Ciechanover; 1998)
1.9.2 Factores de transcripcion, supresores tumorales y oncoproteínas.
La actividad de muchas proteínas de vida corta, como los factores de transcripción, los
supresores tumorales y diferentes clases de oncoproteínas es regulada a través del
complejo del sistema de Ubiquitina.
NF-κB e IκBα
El factor nuclear κB es un factor de transcripción involucrado en la expresión de una gran
variedad de genes críticos para la regulación de la apoptosis, replicación viral,
tumorogénesis, inflamación y varias enfermedades autoinmunes. En su forma inactiva el
factor de transcripción es retenido en el citoplasma de células no estimuladas por asociación
con moléculas inhibidoras llamadas inhibidores de NF-κB (IκBs). Cuando la célula es
expuesta a varios estímulos extracelures como citoquinas, productos virales, bacterias y
estrés se activa la fosforilación de IκBs siendo degradado rápidamente por el sistema de la
Ubiquitina. Una vez llevado a cabo este proceso hay una exposición de las señales de
localización nuclear de NF-kB para su posterior traslocación al núcleo, estando allí NF-kB se
une a una secuencia consenso de varios genes activando su transcripción. (García, J.,
Bandrés, E., et al., 2001).
Los inhibidores cumplen su funcion a traves de una via dual: por un lado impiden la señal de
localizacion nuclear de las proteínas NF-κB, debido a que retienen las proteínas en el citosol
y también inhiben su unión con el DNA y la capacidad de transactivación. La familia de
proteínas IκB contiene entre otras proteínas 4 inhibidores IκBβ, IκBα, IκBε y Cactus
(Baeuerle PA, et al; 1996; Whiteside ST, et al;1997). Muchos estímulos que inducen la
35
activación de NF- κB marcan los inhibidores para degradación.
Supresor Tumoral p53
p53 es un supresor tumoral que tiene la capacidad para regular la transcripción de genes
que participan en el control del ciclo celular. Esta molécula es sintetizada por la célula en
respuesta a la aparición de alteraciones del DNA. La elevación de niveles de p53 induce la
detención de las células al final de la fase G1 para que sean reparados los daños en el ADN
antes de continuar con su replicación en la fase S. Una vez reparado el DNA es necesario
degradar el p53 para dar continuidad al ciclo celular y esto se realiza a través del proceso de
ubiquitinación. (García, J., Bandrés, E., et al., 2001)
β - Catenina
La β - Catenina es una proteína multifuncional involucrada en el complejo de adhesión célula
– célula, la transducción de señales y la regulación de la trascripción, la proteína es
encontrada en la membrana citoplasmática, en el plasma y en el núcleo. Análisis genéticos y
bioquímicos mostraron que la β - Catenina tiene un mejor desempeño en la transducción
de señales y en la diferenciación en epitelio colorectal de mamíferos, y que aberraciones en
este proceso son importantes en el desarrollo de tumores colorectales. (Hershko y
Ciechanover;1998).
Factor E2F-1
La familia de factores de transcripción E2F tiene una función importante en la regulación de
la progresión del ciclo celular mas específicamente en la transición de fase G1 a S. Uno de
los miembros mejor estudiados de esta familia es el factor E2F1 una proteína de 437
aminoácidos que tiene una vida media de aproximadamente 2 a 3 horas. E2F-1 puede
36
actuar bajo diferentes circunstancias como un oncogen o como un inductor de apoptosis y es
controlado por múltiples mecanismos. E2F es degradado de una manera regulada por el
sistema de Ubiquitina (Hoffman F, et al; 1996 y Campanero MR, et al;1996).
1.9.3. Degradación de proteínas liberadas desde el retículo Endoplasmático.
El retículo endoplasmático es la puerta de muchas proteínas secretoras y de anclaje a
membrana. Es también el sitio de modificación de cadenas nacientes y ensamblaje de
complejos de multisubunidades, por esto debe tener un excelente control de calidad para
remover proteínas que no se ensamblaron u oligomerizaron de manera correcta. (Hershko y
Ciechanover;1998).
La degradación de subunidades de TCR en el retículo endoplásmico constituye un
importante mecanismo que asegura que solo los complejos receptores ensamblados
correctamente podrían llegar a la superficie. La subunidad δ del CD3 del TCR es degradada
en el retículo endoplásmico a través de la ubiquitinación ( Yang M, et al; 1998).
1.10 PAPEL DE LA UBIQUITINA EN:
Desarrollo:
Estudios genéticos han permitido detectar que mutaciones en ciertos genes tienen
implicaciones para el desarrollo de patologías a nivel de cerebro y del sistema nervioso
central. Este es el caso del Síndrome de Angelman caracterizado por retardo mental,
ataques y caminar anormal, ocasionado por la mutación en el gen E6-AR que codifica para
la enzima E3.(Kishino, T., et al,1997;Matsuura, T. Et al., 1997).
37
En cuanto al SNC se ha visto que mutaciones en el gen de E2 en Drosophila bendless
causa anormalidades en el sistema visual que involucran daños en la sinaptogénesis entre
células fotoreceptoras y otros elementos del sistema ( Oh, C.E., et al, 1994;Muralidhar, M.G.,
et al, 1993). También se sabe que el gen fat de Drosophila fat facets, es necesario para el
desarrollo del ojo y las moscas mutantes tienen mas de 8 fotoreceptores en cada una de las
unidades que componen el ojo (Huang, Y.,et al, 1995;1996).
De otra parte la mutación de HR6B un homólogo de E2 Rad6/Ubc2 en levaduras involucrado
en la distribución del DNA y marcaje de N-terminales en substratos ocasiona infertilidad
masculina. Esto es específico de los espermatozoides y no involucra el proceso general de
la meiosis. Se cree que HR6B está involucrado en la poliubiquitinación y degradación de
histonas, proceso crítico para la remodelación de cromatina que involucra el reemplazo de
histonas por proteínas de transición y posteriormente por protaminas (Roets et al., 1996).
Procesamiento antigénico:
Los epítopes peptídicos presentados a los linfocitos T citotóxicos por las moléculas del CMH
clase I son generados en el citosol por procesamiento limitado de proteínas antigénicas. Se
ha reportado que este proceso puede ser mediado por ubiquitilación (Cox, J.H., 1995; Dick,
L.R., 1994) o por mecanismos proteosoma independiente (Vinitsky, A.,1997). Parece que
muchos antígenos clase I son procesados por el sistema proteosoma-Ubiquitina
(Goettrup,M., et al., 1996; Coux, O., et al.,1996).
Las moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad clase I transportan fragmentos
peptídicos derivados de proteínas expresadas de manera endógena desde el retículo
endoplasmático hasta la superficie de células nucleadas para presentar al linfocito T
38
citotóxico. Antes de que ocurra la presentación los antígenos citoplasmáticos deben ser
clivados a fragmentos peptídicos para luego ser transportados al lumen del retículo(Martinez
y Mónaco., 1991)
Respuesta al estrés:
Los genes que codifican para poliubiquitina han mostrado contener elementos promotores
del shock térmico y además ser inducibles por el estrés(Ohmachi, T., et al., 1989; Bond, U.,
et al., 1985; Muller-Taubenberger, A., et al., 1988; Finley, D., et al .,1987).
Se ha mencionado que se requiere Ubiquitina para que la célula sobreviva a estados de
estrés y que actúa marcando proteínas anormales producidas durante este estado, para la
degradación. .(Monia, B.P., 1990).
Función de receptor:
Se han reportado tres receptores de superficie celular ubiquitinados. El receptor de “casa de
linfocitos”: proteína transmembranal de células endoteliales involucrada en el reconocimiento
y transporte de linfocitos (St. Jhon, T., et al., 1986; Siegelman, M., 1986).
Los estudios muestran que la Ubiquitina está localizada en el dominio extracelular de este
receptor y su conjugación es un evento temprano durante su biosíntesis ( van de Rjin, M., y
Weissman, J. L, comunicación personal) y los receptores para factor de crecimiento
derivado de las plaquetas y hormona del crecimiento sobre los que se conoce poco acerca
del estado y el sitio donde ocurre la ubiquitinación. El papel de la Ubiquitina en la función y/o
procesamiento de estos receptores es desconocido. Es posible que la ubiquitinación de
receptores pueda estar involucrada en la regulación del receptor y transducción de la señal
de una manera análoga a los receptores de fosforilación. .(Monia, B.P., 1990)
39
Enfermedades neuronales:
Debido a la importancia de la Ubiquitina y el proteosoma 26S dentro de eventos tales como
el ciclo celular, la degradación de proteínas y la presentación antigénica, es claro que la falla
en cualquiera de estos procesos puede causar daños graves en el individuo, siendo más
comunes los daños a nivel neurológico ya que el hallazgo de proteínas ubiquitiladas en
depósitos intraneuronales es uno de los marcadores de enfermedad neurológica crónica.
Esto es posiblemente una consecuencia de procesos patológicos en neuronas post-
mitóticas: ya que no hay alternativa para un problema de proteínas o una anormalidad en el
sistema nervioso que vaya en contra de la destrucción de proteínas. Estos intentos por lo
general fallan dejando una secuela neuropatológica (Mayer, R.J, et al.,2001).
Dentro de las enfermedades neurodegenerativas que cursan con acumulación de
inclusiones filamentosas intraneuronales que contienen proteínas ubiquitiladas se pueden
mencionar la Enfermedad de Alzheimer, Demencia con Cuerpos de Lewy, Enfermedad de
Parkinson y Enfermedad de neuronas motoras. (Lowe et al., 1988).
Estudios inmunocitoquímicos de la enfermedad de Alzheimer (Cole, G.M.,
1987;Dickson,D.W., 1990; Lennox, G., 1988; Love, S., 1988; Lowe, J., 1988; Manetto, V.,
1989; Manetto, V., 1988), y otras enfermedades neurodegenerativas ( Bancher, C., et al.,
1989; Dickson, D.W., et al., 1989; Galloway, P.G., et al., 1988; Lee, S., et al., 1989; Leigh,
P.N., et al., 1988; Lennox., et al., 1988; Love, S., et al., 1988; Lowe, J., et al, 1988; Manetto
V. Et al 1989; Manetto, V., et al., 1988) con anticuerpos anti-ubiquitina han demostrado que
la Ubiquitina está presente en neuritis de placas seniles y otras inclusiones citoplasmáticas
filamentosas como Cuerpos de Pick.
40
2 ESPERMATOGENESIS:
Figura 5. Espermatogénesis
2.1 Generalidades:
En los mamíferos, la espermatogénesis es un proceso de división y diferenciación celular
altamente complejo, por medio del cual las células germinales indiferenciadas se
transforman en espermatozoides. La producción de espermatozoides tiene lugar en los
testículos, dentro de los túbulos seminíferos, e implica proliferación celular por medio de
divisiones meióticas, duplicación de cromosomas, recombinación y división meiótica para
producir espermátides haploides y, finalmente, diferenciación de las espermátides en
espermatozoides. De esta manera, la espermatogénesis puede dividirse en tres fases:
proliferativa o mitótica, de reducción o meiótica y de diferenciación o espermiogénesis. Las
tres fases están asociadas con determinados tipos de células germinales: espermatogonias,
espermatocitos y espermátides respectivamente. (Núñez, R., 1999).
41
2.2 Células germinales:
2.2.1 Espermatogonias: Son células diploides, situadas cerca de la membrana basal de los
túbulos seminíferos y se multiplican mitóticamente, bien para producir más espermatogonias
o bien para entrar en diferenciación y producir espermatocitos primarios. Las
espermatogonias se dividen en tres tipos: A (AO, A1,A2, A3, A4), intermedias y B. Las
mitosis de las espermatogonias son al azar o sincronizadas en el ciclo de espermatogénesis.
Las espermatogonias tipo B son las que se desarrollan en espermatocitos. (Núñez, R.,
1999)
2.2.2 Espermatocitos: Se dividen por meiosis para producir espermátides haploides. Durante
estas divisiones, ocurren dos sucesos muy importantes que tienen consecuencias genéticas
considerables. El primero es la separación al azar de los cromosomas homólogos, y el
segundo es la recombinación del material genético. Estos dos eventos producen la
diversidad genética requerida para la supervivencia de la especie. (Núñez, R., 1999)
La profase de los espermatocitos es muy prolongada y se divide en los siguientes estadios:
leptotene, zigotene, paquitene, diplotene y diacinesis. Cuando los espermatocitos entran en
leptotene de la primera profase meiótica, pasan del compartimento basal al luminal. En la
fase zigotene (donde se unen los cromosomas homólogos) ya están separados de la
membrana basal por la barrera hemato-testicular. La fase de paquitene es la más larga de la
meiosis, y es el estadio donde los espermatocitos son más susceptibles al daño. Es, en este
momento, donde tiene lugar el sobrecruzamiento del material genético. (Núñez, R., 1999)
Cada espermatocito primario origina dos espermatocitos secundarios. Estos existen en una
42
fase muy corta y cada uno de ellos se divide para formar espermátides haploides. La
conducta de los cromosomas sexuales durante la meiosis es diferente de la de los otros
cromosomas, tanto en el momento de la replicación de ADN como en la condensación y
transcripción. (Núñez, R., 1999)
2.2.3. Espermátides: El desarrollo de las espermátides hasta espermatozoides se conoce
como espermiogénesis. Este es un proceso muy importante, durante el cual la célula sufre
cambios morfológicos, fisiológicos y bioquímicos complejos. Este proceso tiene una duración
aproximada de 22 días en humanos. El acontecimiento por el cual tiene lugar no es bien
conocido en su totalidad Una característica importante es que muchos de los cambios que
acontecen durante este tiempo son sucesos únicos que no ocurren en otras células.
(Hamilton y Waites;1990). El proceso está estrechamente sincronizado e integrado, por lo
que muy pequeñas desviaciones del mismo pueden ocasionar infertilidad, aunque no se
conoce la naturaleza de tales desviaciones (Hamilton y Waites;1990).
Cuando la espermatogénesis se completa, las extensiones citoplásmicas con las células de
Sertoli se rompen y los espermatozoides se liberan. En algunos casos, hasta el 70% de los
citoplasmas de las espermátides maduras pueden ser fagocitados por las células de Sertoli.
(Hamilton y Waites;1990).
2.3 Fases de la espermatogénesis:
Este proceso se ha dividido en tres fases funcionalmente distintas: Fase proliferativa,
durante la cual algunas espermatogonias se dividen para reponer la reserva de células en
reposo y otras sufren divisiones mitóticas para comenzar la diferenciación y producir
espermatocitos, fase meiótica en la cual los espermatocitos sufren divisiones meióticas para
43
originar las espermátides haploides. Y, por último, la espermiogénesis, durante la cual las
espermátides se diferencian en espermatozoides maduros capaces de moverse y fecundar
el óvulo..(Núñez, R., 1999)
2.3.1 Fase proliferativa:
Como ya se había mencionado, las espermatogonias se encuentran en el compartimento
basal del epitelio de los túbulos seminíferos y están separadas de otras células germinales
en desarrollo por las uniones estrechas entre las células de Sertoli. Proliferan por divisiones
mitóticas, y se multiplican repetidamente para continuar tapizando el epitelio germinal.
(Hamilton y Waites;1990). Las espermatogonias son capaces de autorenovarse y
producir, de esta manera, células detenidas que se sitúan en la base de los túbulos
seminíferos, así como otras células orientadas en dirección del tracto y que originarán los
espermatozoides (Kupker, Diedrich y Edwards, 1998).
Hay tres clases principales de espermatogonias caracterizadas por el distinto patrón de
tinción de la cromatina nuclear: Espermatogonias con cromatina oscura y densa, una
pequeña área central pálida y un citoplasma estrechamente unido a la porción basal de los
túbulos seminíferos (AO,A1,A2,A3,A4). Estas espermatogonias son células detenidas. Dado
su bajo grado de división mitótica, son relativamente resistentes a las agresiones externas o
a los agentes como radiaciones y quimioterapia que pudieran afectar la
espermatogénesis.(DeRooji, DG., et al., 1989)
Después de una agresión a los testículos, estas espermatogonias sufren divisiones mitóticas
para reponer la población afectada. La destrucción completa de estas células puede causar
una pérdida irreversible de la capacidad espermatogénica (Rowley, 1974).
44
Durante la fase proliferativa de la espermatogénesis, estas espermatogonias se dividen
mitóticamente para producir espermatogonias pálidas, las cuales presentan una cromatina
que se tiñe de forma pálida y uno o dos nucleolos unidos a la membrana nuclear (Células
Intermedias). Posteriormente, sufren ulteriores divisiones mitóticas y se diferencian en
espermatogonias B, con agrupaciones oscuras de cromatina a lo largo del borde de su
membrana nuclear. A lo largo de las divisiones mitóticas se mantiene, en la línea de
espermatogonias detenidas y de reserva, un complemento diploide de cromosomas (46
cromosomas). (Hamilton y Waites;1990).
Las espermatogonias tipo B sufren otra división mitótica para producir espermatocitos
primarios en preleptotene, los cuales inician la fase meiótica de la espermatogénesis que
dura 24 días en humanos. Las espermatogonias no se separan completamente durante la
división mitótica. Las mitosis a lo largo del proceso de proliferación se suceden
sincrónicamente para cada grupo de la progenie de la célula tipo A. No obstante, la división
del citoplasma(citocinesis) es incompleta durante la proliferación, resultando en un sincitio de
64 espermatocitos en preleptotene, conectados por puentes citoplásmicos. (Núñez., R.,
1999).
Las células germinales permanecen conectadas por los puentes citoplásmicos a lo largo de
la espermatogénesis hasta que se ha completado la formación de espermatozoides. Los
espermatocitos en preleptotene son bastante más pequeños que las espermatogonias tipo B
y tienen menos grumos de cromatina a lo largo de la membrana nuclear. La síntesis activa
de ADN tiene lugar en los espermatocitos en preleptotene, y el contenido de ADN de cada
cromosoma se duplica completamente. (Dym y Fawcett, 1971).
45
Como resultado, los espermatocitos en preleptotene contienen un juego diploide de
cromosomas(46 cromosomas), pero ya que cada cromosoma tiene un par de cromátidas
hermanas idénticas, el contenido total de ADN de estas células germinales es dos veces el
contenido diploide. Los espermatocitos en preleptotene son las últimas células germinales
que sufren síntesis de ADN durante la espermatogénesis. (Núñez., R., 1999)
2.3.2 Fase meiótica:
Figura 6. Primera división Meiotica
2.3.2.1 Meiosis I: Una vez completada la síntesis de ADN y la formación de cromátidas
hermanas, los espermatocitos en preleptotene entran en profase (profaseI) de la primera
división meiótica, la cual, como ya se mencionó anteriormente se caracteriza por su larga
duración. (Núñez, R., 1999).
Durante la profase, las células germinales en desarrollo y sus núcleos aumentan
progresivamente de tamaño. Cambios en la morfología nuclear reflejan cambio
cromosómicos y son la base para clasificar los espermatocitos primarios de acuerdo a los
sucesivos estados de la profase I. (Núñez, R., 1999).
46
En los espermatocitos en leptotene, los cromosomas se condensan pero no están
apareados, y aparecen como filamentos de cromatina en el núcleo. Los espermatocitos en
zigotene, ligeramente mayores, se caracterizan por tener largas hebras de cromatina donde
comienzan a aparearse los cromosomas homólogos. Frecuentemente muestran una
configuración arracimada, en la cual los cromosomas se acumulan en uno de los lados del
núcleo. (Núñez, R., 1999).
En paquitene, los cromosomas están totalmente apareados, y permanecen así durante dos
semanas aproximadamente. Cada cromosoma comprende un par de cromátidas hermanas
que se mantienen unidas por el centrómero, por eso, los pares de cromosomas homólogos
están compuestos de cuatro cromátidas cada uno, y se refieren como bivalentes o tétradas.
(Núñez., R., 1999)
Durante el apareamiento de los cromosomas, o sinapsis, tiene lugar el intercambio de
material genético entre cromosomas homólogos, que están unidos por el quiasma. La
recombinación genética origina células germinales que contienen una combinación de
material genético única. Los espermatocitos en paquitene se caracterizan por su núcleo
grande y ovoide, que contiene un grueso y corto material y nucleolos prominentes y
esféricos. Los espermatocitos en diplotene contienen los pares de cromosomas separados a
lo largo de su longitud, excepto en donde está localizado el quiasma. Son las células
germinales más grandes y tienen un gran núcleo, así como áreas más claras entre las
bandas de cromatina. (Núñez., R., 1999)
Durante la diacinesis I los cromosomas se acortan, alcanzando la máxima condensación y
se separan completamente de la membrana nuclear. Después de una prolongada profase I,
47
los siguientes estadios de la meiosis suceden velozmente. La diacinesis I es seguida
rápidamente por la metafase I. En este estadio. La membrana nuclear se invagina, aparece
el huso y los cromosomas apareados se alinean a lo largo del eje ecuatorial de la célula, con
los centrómeros orientados hacia los polos opuestos. Los pares de cromosomas homólogos
se separan entonces y los centrómeros, con las cromátidas hermanas unidas, se sitúan en
polos opuestos de la célula durante la anafase I. (Núñez, R., 1999).
En la telofase I los juegos haploides de cromosomas se empiezan a agrupar en los polos
opuestos de la célula. Después de este estadio, la célula se divide para formar dos
espermatocitos secundarios, los cuales contienen un juego haploide de cromosomas(23
cromosomas). Los espermatocitos secundarios son esféricos, y más pequeños que los
primarios, sus núcleos son redondos y contienen cromatina muy teñida y homogénea. Estos
espermatocitos son de corta vida: sólo están presentes durante ocho horas. Esto, junto con
su falta de características típicas, los hace muy difícil de distinguir histológicamente. (Núñez.,
R., 1999)
2.3.2.2 Meiosis II: Después de una breve interfase, los espermatocitos secundarios entran
en la segunda división meiótica, la cual es similar a la división mitótica, excepto que las
células que entran en meiosis II tienen un número haploide de cromosomas. Durante la
metafase II, los 23 cromosomas de los espermatocitos secundarios, cada uno con sus dos
cromátidas hermanas (2n), se empiezan a alinear en el eje ecuatorial de la célula. Durante la
anafase II, los centrómeros se dividen longitudinalmente y las cromátidas hermanas de cada
cromosoma comienzan a migrar hacia los polos opuestos de la célula. Las cromátidas
comienzan a agruparse en dichos polos durante la telofase II y la célula se divide en dos
espermátides, cada una de las cuales contiene un número haploide de cromosomas
heredando solo una de las cromátidas. (Núñez, R., 1999).
48
Figura 7. Segunda división Meiotica
2.3.2.2 Síntesis de ácidos nucleicos y proteínas; expresión genética haploide: La síntesis de
ARN y proteínas es máxima durante la meiosis, y desciende abruptamente durante las fases
iniciales de la espermatogénesis, hasta niveles indetectables. Durante la espermatogénesis
el núcleo cambia su estructura somática. Las histonas son sustituidas primero por proteínas
de transición que a su vez son reemplazadas por pequeñas proteínas básicas y ricas en
residuos de arginina llamadas protaminas, cambiando por completo, de esta forma el
aspecto del nucleosoma por el de nucleoprotamina. (Baarends, W., 1992)
El papel principal de las protaminas parece ser compactar el núcleo para producir
espermatozoides funcionales. El ADN espermático interacciona con las protaminas para
formar los filamentos de cromatina, mientras que en las células somáticas el ADN está
enrollado alrededor de las histonas. (Baarends, W., 1992)
El ADN de los espermatozoides de mamíferos es el más empaquetado de entre los
eucariotas, estando como mínimo seis veces más condensado que el ADN de los
cromosomas mitóticos, lo que permite al ADN poder compactarse en un pequeño volumen
(Ward y Coffey, 1991). Zhong y col (1999) han demostrado recientemente que un error en la
síntesis de protaminas origina una traducción retrasada de las proteínas, y en consecuencia
un fallo en la espermiación.
49
La expresión genética haploide es donde el genotipo único de un espermatozoide podría ser
revelado en su estructura o función. Es justo decir que la existencia de la expresión haploide,
a pesar de la reciente atención que se le ha prestado utilizando sofisticadas técnicas de
biología molecular, sigue en controversia. Se han identificado varios productos expresados
por posibles genes haploides que están siendo objeto de investigación (Johnson, 1991).
A pesar de la considerable investigación realizada al respecto, los mecanismos de esta
transmisión no Mendeliana y la relación con la expresión del genoma haploide, permanece
sin elucidar.Es interesante que espermátides genéticamente distintas, las cuales se
desarrollan en un sincitio, poseen puentes intercelulares que conectan las células entre sí,
asegurando el desarrollo sincrónico. Se sabe ahora que, en algunos casos, el ARNm
específico puede moverse desde una espermátide a otra a través de esos puentes; por eso
los productos de todos los genes postmeióticos pueden distribuirse por igual entre las
espermátides. Esto no significa que todos los productos pueden ser igualmente
transportados o compartidos, pero esta cuestión continúa en estudio. (Johnson, 1991).
2.3.3 Espermiogénesis:
Es el proceso mediante el cual las espermátides se transforman en espermatozoides
maduros capaces de fecundar. En muchos animales, las espermátides más jóvenes están
asociadas con una generación de espermátides más viejas formadas en un ciclo
anteriormente.Al principio, la espermátide es una célula bastante simple, pero tienen lugar
muchos cambios encaminados a formar el citoesqueleto de los espermatozoides. Este
proceso implica importantes cambios morfológicos y funcionales en divisiones posteriores.
(Hamilton DW., 1990)
50
Los principales cambios que ocurren durante este proceso son la formación del flagelo, que
permite la movilidad; el desarrollo del acrosoma que contiene enzimas proteolíticas
necesarias para que el espermatozoide pueda penetrar en las cubiertas del ovocito; la
condensación de los cromosomas y nucleoproteínas para formar la cabeza del
espermatozoide; la expulsión del citoplasma y, finalmente, la liberación del espermatozoide a
la luz del túbulo seminífero (espermiación). Existen seis fases o tipos de espermátides,
correspondiente a: Sa, Sb1, Sb2,Sc, Sd1, y Sd2.(Hamilton DW., 1990)
2.3.3.1 Reorganización nuclear: En la fase de elongación nuclear, el núcleo lateral y
polarizado, rota dirigiendo el polo acrosomal hacia la membrana basal del túbulo seminífero.
Cambios estructurales de la cromatina son concomitantes con las modificaciones de las
proteínas, y la cromatina nuclear comienza a condensarse.(Núñez, R., 1999)
2.3.3.2 Fase de Golgi: La cisterna del aparato de Golgi, que es más compleja que en otras
células, se une para formar el acrosoma, el cual migra al núcleo y se esparce por la
superficie nuclear, desarrollando el sistema acrosomal. La membrana interna de este
sistema se asocia en estrecho contacto con la membrana nuclear. Esta es una de las pocas
estructuras secretoras que están en íntima asociación con el núcleo. Los dos centriolos
migran al lado opuesto del acrosoma, uno asume una alineación radial y se desarrolla en el
axonema de la cola futura, mientras que el otro, que está localizado en ángulo recto, forma
la pieza conectiva que une la cola con el núcleo. La migración de los centriolos al núcleo en
las espermátides es única.(Hamilton DW., 1990)
Fase acrosomal y formación del flagelo: Durante esta fase, el núcleo se elonga y se
condensa formando paquetes de cromatina. Se mueve hacia el polo craneal a la misma vez
51
que el citoplasma se desplaza hacia el polo caudal de la espermátide. En el citoplasma, los
microtúbulos corren en paralelo al flagelo en desarrollo, formando una cubierta cilíndrica
denominada manchette. Durante este período, también ocurrirá el desarrollo del flagelo. Se
forma el cuello o pieza conectiva y se une con las fibras de la pieza media las cuales rodean
y van en paralelo con el axonema. Este se elonga, y su base comienza a unirse al annulus.
(Hamilton DW., 1990). Las mitocondrias se dividen aunque el mecanismo es desconocido, y
se asocian con otras fibras densas para formar la característica doble hélice, generando la
energía necesaria para la movilidad espermática. (Hamilton DW., 1990)
Fase de maduración: Durante la fase final de la espermiogénesis o maduración, los residuos
de citoplasma unidos a la espermátide comienzan a ser pellizcados y sumergidos por las
células de Sertoli. Se forman unos cuerpos residuales esféricos que se tiñen densamente y
que son retenidos por las células de Sertoli, en la luz de los túbulos seminíferos, cuando se
liberan los espermatozoides (espermiación). Una pequeña cantidad de citoplasma queda
retenida en la unión entre la cabeza y el flagelo; este se liberará durante las fases
posteriores de maduración de los espermatozoides en los diferentes conductos. (Hamilton
DW., 1990).
La espermiación es una fase clínicamente importante, porque es fácilmente alterada por un
medio hormonal inadecuado o por influencias externas, tales como exposición a calor o a
químicos, originando una caída en la producción espermática varias estructuras aparecen y
desaparecen durante la espermatogénesis, incluyendo el cuerpo cromatoide, el cual puede
estar asociado al almacenamiento de material genético. (Russell, 1993).
Cuando se transportan los espermatozoides en el tracto genital masculino, ocurren pocas
Transformaciones morfológicas, pero sí suceden importantes cambios funcionales,
52
especialmente en el epidídimo, donde se adquiere la capacidad de fecundar un ovocito. La
mayoría de los espermatozoides eyaculados poseen una cabeza oval compuesta por un
núcleo con cromosomas compactados y condensados, núcleo-proteínas y la cubierta
acrosomal que cubre aproximadamente las dos terceras partes de la cabeza. El flagelo es la
parte móvil del espermatozoide y está compuesto del complejo axonémico, con dos
microtúbulos centrales rodeados de nueve pares de microtúbulos periféricos. (Russell,
1993).
3. REPRODUCCIÓN.
3.1 Ubiquitina y reproducción.
3.1.1 Gametogénesis
3.1.1.1 Espermatogénesis:
Diferentes fases de la espermatogénesis, como lo son las divisiones meióticas requieren
actividades especializadas del sistema de la Ubiquitina. Datos bioquímicos indican que
durante la espermatogénesis, la actividad del sistema de la Ubiquitina es alta, lo cual se
relaciona con el alto requerimiento de ruptura masiva de proteínas nucleares y
citoplasmáticas durante la última fase de este proceso que incluye la distribución del DNA
así como la condensación de la cromatina. ( Baarends, W.M. y cols).
La elongación nuclear postmeiótica y los procesos de condensación nuclear en las
espermátides requieren el reemplazo de histonas nucleosomales por proteínas de transición
y luego por protaminas. ( Baarends, W.M. y cols).
53
A través de la asociación de protaminas con el DNA se forman hileras de cromatina lo cual
resulta en la construcción de un núcleo que contiene DNA altamente compactado, al menos
seis veces más condensado que el DNA de los cromosomas mitóticos. La ubiquitinación de
histonas resulta en la desestabilización del dímero H2A-H2B lo cual puede facilitar el
reemplazo por histonas recién sintetizadas y/o potenciar la transcripción de DNA( Li et al.,
1993).
La espermatogénesis requiere la remoción de histonas unidas al DNA para el posterior
empaquetamiento en la cabeza del esperma, un proceso en el cual está involucrado el
sistema de la ubiquitina, viéndose así, las enzimas E1 y E2 claramente implicadas en este
proceso. El cambio de proteínas nucleares durante la transición postmeiótica de histonas a
protaminas en células germinales masculinas requiere una ruptura masiva de histonas y
proteínas transitorias, lo cual indica una alta demanda de actividad de la maquinaria de
ubiquitinación y del proteosoma.La ubiquitinación de histonas también puede estar
involucrada en la remoción de histonas de la cromatina. Se han detectado histonas
ubiquitinadas en los estados tardíos de la espermatogénesis de pollos y truchas cuando los
nucleosomas son desensamblados Debido a la pronunciada reducción que debe sufrir el
citoplasma de las espermátides al final de la espermatogénesis se manifiesta que la
actividad del sistema en esta parte del proceso es bastante alta. (Agell N., et al.,1983; Nickel
B.E., et al., 1987).
Otra de las funciones que tiene la Ubiquitina es el marcaje de la mitocondria espermática
dentro del citoplasma del ovocito para su posterior proteólisis durante el desarrollo
preimplantatorio La ubiquitinación de la mitocondria espermática está involucrada en el
control de la herencia mitocondrial en mamíferos. (Sutovsky, P. et al., 1999).
54
La mitocondria de espermatozoides de embriones de ratas, bovinos y ratones, es destruida
antes o durante el tercer clivaje embrionario y la ubiquitinación de la mitocondria espermática
durante la espermatogénesis en estas especies probablemente marca esta mitocondria para
su posterior reconocimiento y destrucción selectiva por la maquinaria proteolítica del
citoplasma del ovocito (Sutovsky P., 2000).
Se plantea una teoría para la destrucción de la mitocondria denominada “Teoría del daño
oxidativo” que sugiere, que las mitocondrias son reconocidas por el citoplasma del ovocito
debido al daño oxidativo que sufren durante el pasaje a través del tracto genital femenino.
Aunque el mtDNA es claramente susceptible a mutagénesis por especies oxígeno reactivas
este daño oxidativo es mínimo durante técnicas de reproducción asistida como la
Fertilización In Vitro (FIV) por lo cual se esperaría que no hubiese eliminación de esta
estructura con este procedimiento, pero sí la hay, lo cual invalida esta teoría. (Sutovsky P.,
2000).
Estudios previos plantean que la mitocondria es previamente marcada con Ubiquitina en los
espermatocitos haploides, cierta parte de estas es reabsorbida por las células de Sertoli y
las mitocondrias remanentes forman la envoltura mitocondrial del esperma y retienen su
nacimiento talvez debido a mono o di-ubiquitinación en una o más proteínas membranales
mitocondriales. Este marcaje se vuelve indetectable debido la unión de enlaces disulfuro que
ocurre durante el tránsito a través del tracto reproductor masculino más específicamente en
el epidídimo. Después de la incorporación en el citoplasma del ovocito durante la
fecundación, quizá concordante con la reducción inducida por glutatión; de los enlaces
disulfuro espermáticos la ubiquitinación de la mitocondria es de nuevo detectable y parece
aumentar en intensidad. La mitocondria paterna puede entonces ser distinguida de la
materna por ubiquitinación (Peter Sutovsky y cols, 2000).
55
Estudios de cruces de ratón intraespecíficos e interespecíficos sugieren que un componente
proteínico nuclear codificado de la membrana mitocondrial del esperma, más que el DNAmt
por sí solo, es reconocido por los mecanismos de destrucción del citoplasma ovocito.
(Kaneda, H., et al., 1995).
Se sugiere que la prohibitina, una proteína integral de 30kDa, evolutivamente conservada,
de la membrana mitocondrial internaes el substrato posible para la ubiquitinación en la
mitocondria espermática durante la espermatogénesis y después de la fecundación.
(McClung, J.K., et al., 1995).
La isoforma de 30kDa de la prohibitina desaparece en las espermátides redondas en la rata
(Choongkittaworm, N.M., et al., 1993), quizás por la pérdida de reactividad cruzada causada
por modificaciones post-translacionales como la ubiquitinación. Se sabe que In vivo, la
reducción de enlaces disulfuro desestabiliza la envoltura mitocondrial espermática (Sutovsky,
P., et al., 1997) y causa el rearreglo de dominios de la membrana mitocondrial interna y
externa. In vitro, puede causar el rearreglo de las membranas mitocondriales espermáticas y
la exposición de la prohibitina marcada con Ubiquitina en el citoplasma del ovocito. ( Olson,
G.E., et al., 1992).Todo lo anterior nos brinda una fácil explicación para la herencia exclusiva
del DNA mitocondrial materno en mamíferos.(Sutovsky P., 2000).
Existen dos genes USP9Y para humanos y HR6B para ratones que codifican proteínas que
forman parte del sistema de la Ubiquitina, cuya mutación se ve expresada fenotípicamente
como infertilidad masculina. Estas son proteínas de función múltiple con actividad de
conjugado con Ubiquitina y esenciales en la reparación del DNA post-replicación. HR6B,
posiblemente unida a la enzima ligadora de Ubiquitina mRAD18SC, parece estar involucrada
56
en la reorganización de la cromatina durante las fases meióticas y post-meióticas de la
espermatogénesis.( Baarends, W.M., et al., 2000)
3.1.1.2 Ovogénesis:
Diferentes pasos de la gametogénesis requieren un alto recambio de un gran numero de
proteínas, la regulación de la primera y segunda división meíotica en ovocitos dependen de
unos componentes que también están presentes en células mitóticas lo cual es un factor
estabilizador de la degradación de proteínas mediada por Ubiquitina.
La detención de la metafase II en ovocitos de mamíferos depende de las actividades de
cMos una protein Kinasa especifica de meiosis componente del factor citostático(CSF) el
cual previene la degradación del factor promotor de maduración (MPF), este ultimo complejo
esta también presente en células mitóticas y consiste de una cdc2 kinasa y una ciclina B
(Baarends et al., 1999.) Inmediatamente después de la fertilización, la movilización de calcio
media la rápida degradación de la ciclina B y de cMos. ( Sagata, 1996; Herkimhemo y
Gibbons, 1998).
3.1.1.3 Deterioro de la gametogénesis por inactivación de componentes del sistema de
Ubiquitina
El papel del sistema de Ubiquitina en la gametogénesis esta dado por los fenotipos de
infertilidad de animales a los cuales se les han inducido mutaciones en genes que codifican
componentes de este sistema. (Ciechanover, A., 1996). El sistema de Ubiquitina es un
sistema jerárquico en donde una enzima activadora denominada E1 puede actuar con
57
numerosas enzimas encargadas de la conjugación llamadas E2 y una simple E2 puede
funcionar junto con diferentes enzimas ligadoras (E3s) o independiente de estas para lograr
el marcaje de proteínas y luego ser llevadas a proteólisis. (Chieanover, 1996)
Desde que el sistema de Ubiquitina esta involucrado en una gran variedad de procesos
celulares fundamentales, la inactivación de enzimas como la E1 y las E2 puede conducir a
un amplio espectro de fenotipos en donde la infertilidad es el más común sin embargo, esto
no se cumple para el gen del cromosoma Y ube1y en el ratón que codifica para una enzima
E1 por que este gen es expresado exclusivamente en el testículo. (Kay et al., 1991; Mtchell
et al., 1991).
En estudios descritos anteriormente en levaduras, la enzima E2 (Rad6) es requerida para
una gran variedad de funciones celulares incluyendo reparación de DNA, esporulación etc.
Dos homólogos de Rad6 han sido identificados en ratones y en hombres HR6A y HR6B.
El porcentaje de aminoácidos idénticos entre las proteínas de HR6A y HR6B es del 96%
ambos genes son expresados en muchos tejidos con niveles altos de expresión de mRNA
en cerebro corazón y testículos. (Koken et al., 1991; Roest et al., 1996)
3.1.2 Desarrollo Placentario
A pesar de que las células estromales endometriales contienen aparentemente bajas
concentraciones de Ubiquitina en úteros no embarazados, esta cantidad puede aumentar
durante el embarazo, con células estromales deciduales que contienen altas
concentraciones de Ubiquitina nuclear y citoplasmatica, la función de la Ubiquitina en estas
células no es clara. (Bebington, et al., 2001).
58
Tanto la Ubiquitina monomérica como la conjugada han sido detectadas en citotrofoblastos
pero parecen estar ausentes en los sincitiotrofoblastos. La importancia de la Ubiquitilacion
en el desarrollo placentario esta indicada por el desarrollo de múltiples anormalidades,
como el retardo del crecimiento intrauterino y la muerte perinatal (Harbers et al; 1996),
observadas en ratones que carecen del gen UbcM4 (que codifica para la enzima E2).
(Bebington, et al., 2001)
3.1.3 Modificaciones endometriales
Altas concentraciones de Ubiquitina y de proteínas unidas a ésta han sido encontradas en el
epitelio glandular endometrial durante el ciclo menstrual. (Bebington et al; 2000b). La
proteína aparece en locaciones citoplasmaticas y nucleares y la intensidad de la coloración
de la Ub nuclear a través del ciclo siendo más intensa en la fase secretoria tardía.
(Bebington, et al., 2001)La abundancia relativa de Ub nuclear y el receptor de prolactina en
el epitelio glandular endometrial parece estar inversamente correlacionada a través del ciclo
menstrual y en embarazo. (Bebington, et al., 2001)
De otra parte, el desarrollo Post-natal de testículos en ratas requiere una enzima
conjugadora de Ubiquitina llamada E2, UBC4 (Rajapurohitam et al; 1999). Las células de
Sertoli expresan la Hidrolasa carbono terminal de Ubiquitina PGP9.5(kon et al; 1999) y la
diferenciación germinal en testículos de ratones esta acompañada por el incremento en la
expresión de cadenas de multiUbiquitinas unidas a proteínas.mRNAs específicos de
testículo transcritos desde un gen de poliubiquitina en pollos, son producidos a través de un
splicing alternativo, sin embargo, el nivel de Ubiquitina como proteína es elevado en
testículos humanos, pero también altamente expresado en otros órganos incluyendo el
ovario. (.Baarends W.M et al; 2000).
59
3.2 Morfología y reproducción:
La relevancia de la morfología espermática como elemento determinante en la reproducción
ha sido de mucho interés. Este parámetro ha sido reportado como el más significante en la
predicción del resultado de un ciclo de FIV, teniendo mayor significado que la concentración
y la motilidad. ( Eilish, et al., 1998).
3.2.1 Morfología y ubiquitina.
La Ubiquitina es secretada en un contexto apocrino por el epitelio epididimal y se une de
manera selectiva a la superficie de espermatozoides defectuosos, parte de los cuales son
luego reabsorbidos por las células epiteliales. Las células epididimales cultivadas mantienen
su habilidad de producir Ubiquitina, e internalizar espermatozoides defectuosos. .(Sutovsky,
et al 2001).
La Ubiquitina parece ser un marcador universal de anormalidades seminales, reconoce, un
amplio rango de defectos de cabeza, cola y también detecta otros contaminantes del semen
de origen celular como espermátidas, leucocitos y detritos celulares presentes en el
eyaculado de algunos pacientes. .(Sutovsky,P., et al 2001)
3.3 Infertilidad.
Se hace la aclaración que la deficiencia de HR6B en el ratón se expresa como infertilidad
en el macho mientras que las hembras con esta deficiencia poseen una fertilidad normal. El
defecto en la espermatogénesis coincide con daños en el proceso postmeiótico que incluye
60
la remodelación de la cromatina y provee evidencia de la participación del sistema de la
ubiquitina en la dinámica de la cromatina. Se ha sugerido que mayores avances a este
respecto podrían permitir un mayor entendimiento de la infertilidad masculina en la raza
humana.(Roest, H.P., et al., 1996)
Roest, H.P; 1996 menciona las implicaciones dentro de la fertilidad de la enzima RAD6 de la
levadura encargada de la conjugación de ubiquitina la cual es homóloga a la hHR6A y
hHR6B humanas. Las mutaciones en este gen específicamente en cepas de S. cerevisiae
se desarrollan en la descendencia como defectos postreplicación, causando una alta
sensibilidad a los agentes dañinos de DNA y aumentando la frecuencia de mutaciones
espontáneas. También se menciona que los alelos nulos de rad6 muestran anormalidades
en el ciclo celular, crecimiento sensible a la temperatura, aumento de retrotransposones y
dificultades en la esporulación Igualmente se hace referencia al hallazgo realizado por
Jentsch et al, 1987 en donde se identifica a RAD6 como la primera enzima de conjugación
de ubiquitina, capaz de mono y poliubiquitinar las histonas 2A y 2B in vitro. (Lawrence,
1994).
El porcentaje de espermatozoides ubiquitinados en el eyaculado parece estar relacionado
con la fertilidad en toros, al igual que el grado de ubiquitinación epididimal es correlacionado
con la fertilidad en hombres, como se demostró por inmunofluorescencia y citometría de flujo
en muestras de semen de pacientes infértiles.( Sutovsky, P., 2000).
Después de todo lo anterior es claro que si la Ubiquitina está encargada de marcar todos los
elementos que deben ser destruidos, altas cantidades de esta proteína en las muestras de
semen indicarán la presencia de elementos indeseables en el eyaculado restándole a este,
capacidades que lo conviertan en óptimo para conseguir la fecundación.
61
3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
Muchas parejas en el mundo tienen problemas para concebir ya sea por causas de origen
femenino o masculino. Cualquiera que sea la razón esta situación debe ser manejada con
cuidado y ser objeto de atención debido a las repercusiones personales y sociales a que
esta conlleva.
Situándonos en el contexto de que la mayoría de las parejas desean tener hijos y el no
poderlos tener, los lleva a asistir a las clínicas de reproducción asistida en busca de una
solución a su problema. Es necesario avanzar en el campo de la investigación de la
infertilidad para acercarnos cada vez más al conocimiento de esta situación proporcionando
a las parejas mayor rapidez en el diagnóstico y de la misma forma soluciones en un período
de tiempo mucho mas corto.
Teniendo en cuenta que según datos estadísticos de los Estados Unidos el 40% de los
problemas para concebir son de origen masculino, se ve la necesidad de mejorar técnicas
que permitan evaluar la calidad del liquido seminal, de una manera más objetiva con el fin de
acelerar el proceso de toma de decisiones en cuanto al diagnóstico y tratamiento de la
infertilidad.(Sutovsky y cols, 2001)
El Doctor Peter Sutovsky y cols propusieron un ensayo denominado Sperm Ubiquitin Tag
Immunoassay (SUTI), como herramienta para el diagnóstico de infertilidad masculina. En
este estudio se estableció la relación de la Ubiquitina con la morfología espermática gracias
al uso de la inmunofluorescencia que permitió hacer una visualización simultánea de las
anormalidades espermáticas y la localización de la Ubiquitina en la superficie del
espermatozoide.
62
El propósito de este estudio es evaluar la presencia anormal de Ubiquitina en 15 muestras
de semen de pacientes infértiles y relacionarla con el diagnóstico de infertilidad masculina.
El análisis de las muestras fue realizado por medio de citometría de flujo. Técnica que
permite, debido a su sensibilidad y especificidad, obtener resultados confiables que
proporcionen peso a las afirmaciones planteadas en este trabajo. En caso de que se
evidencie la relación entre la Ubiquitina y la infertilidad masculina se dará un paso importante
para establecer la determinación de la Ubiquitina como un examen de rutina en las clínicas
de reproducción asistida.
Por otra parte, considerando que son pocos los estudios que se han centrado en la
investigación de este tema, a nivel mundial y ninguno a nivel nacional, este trabajo ofrece
convertirse en una herramienta muy útil dentro de las perspectivas de análisis del líquido
seminal así como en la toma de decisiones del tratamiento a seguir con las respectivas
parejas.
63
1. OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL.
Determinar por medio de Citometría de Flujo, la presencia de Ubiquitina como marcador de
infertilidad masculina en muestras de semen de varones infértiles.
OBJETIVOS ESPECIFICOS.
Estandarizar la técnica de citometría de flujo para la detección de Ubiquitina en muestras de
semen de varones fértiles e infértiles.
Analizar las medianas de espermatozoides marcados con Ubiquitina en muestras de semen
de varones infértiles y controles fértiles.
Evaluar el comportamiento de las muestras de pacientes infértiles y controles fértiles por
medio de los histogramas proporcionados por el citómetro.
Establecer la relación entre la presencia anormal de Ubiquitina y el diagnóstico de infertilidad
masculina.
64
5. MATERIALES Y METODOS.
a) Tipo de estudio:
El tipo de estudio de este trabajo es Observacional de carácter Descriptivo.
Se realizó una prueba de hipótesis para medianas.
La variable de estudio es de tipo cualitativa.
b) Hipótesis:
Existen diferencias entre las medianas de espermatozoides marcados con Ubiquitina entre
pacientes infértiles y controles fértiles.
c) Muestra:
La recolección de muestras para el estudio fue realizada en un período de cuatro meses
comprendido entre el mes de octubre de 2001 y el mes de enero de 2002.
Se obtuvieron por masturbación 15 Muestras de semen de varones asistentes a la Clínica
de Reproducción Asistida Medifértil con diagnóstico previo de infertilidad y 8 muestras de
Varones Fértiles utilizadas como muestras Standart, los cuales debieron cumplir con las
siguientes características para ser incluidos en el estudio:
Edad: no mayores de 41 años
Abstinencia: 3-8 días
No estar consumiendo ningún tipo de medicamento al momento de la toma de la muestra, no
consumir alcohol ni ningún otro tipo de droga.
65
En cuanto a las muestras se tuvieron en cuenta los siguientes criterios de definición de un
paciente fértil según la Organización Mundial de la Salud ( OMS ) que son:
VOLUMEN: 2-6mL
pH: 6- 8
CONCENTRACION: > 20 millones / mililitro
VITALIDAD: > 70%
MOVILIDAD: A + B = > 50%
MORFOLOGÍA: Normales > 30%
Teniendo en cuenta que los pacientes que no cumplan con estos requisitos (es decir se
excluyan de los rangos en el caso del volumen y el pH o presenten valores inferiores en los
otros parámetros) serán clasificados dentro del grupo de los infértiles y quienes cumplan con
las características definidas como normales dentro del espermograma y además tengan
paternidad comprobada serán clasificados dentro del grupo de los controles fértiles.
d) Equipos:
• Citómetro de flujo FACScan
• Centrífuga normal
• Centrífuga Refrigerada
• Microscopio de Fluorescencia
• Microscopio de contraste de fase
66
d) Materiales:
• Laminas portaobjetos
• Cámara de Makler.
• Papel indicador de pH
• Jeringas de 5 mL
• Micropipetas de 5-20µL y de 200-500µL.
• Puntas Amarillas
• Puntas Azules
• Laminillas
• Tubos para Citómetro
• Tubos falcon de 15 y 50 mL
• Pipetas pasteur plásticas
• Pipetas de vidrio de 5 y de 10mL
f) Reactivos:
• Formaldehído
• Coloración eosina- nigrosina
• Coloración para espermatozoides Spermac- Stain
• Anticuerpo anti-ubiquitina isotipo IgM
• Anticuerpo secundario marcado con isotiocianato de fluoresceína
• Suero normal de caballo.
• PBS
• Medio para congelar Sperm freeze
• Medio de lavado Washing
67
g) Métodos:
Las muestras fueron obtenidas por masturbación, el paciente debe tener mínimo tres
máximo siete días de abstinencia sexual y no estar consumiendo medicamentos, ser un
paciente en estudio de algún tipo de infertilidad y tener una historia clínica conocida, se
realizará un consentimiento que deberá ser firmado por el paciente aceptando su
participación en el estudio. (Anexo 1).
Las muestras de los controles Fértiles fueron obtenidas de la misma manera y bajo las
mismas condiciones y deben ser personas con paternidad comprobada.
ESPERMOGRAMA.
Volumen: Se midió con la utilización de una jeringa desechable.
pH: se realizó depositando una gota de semen en el papel indicador de pH.
Concentración, movilidad y aglutinación: Estos parámetros fueron analizados depositando
10ìl de semen en la cámara de Makler, y realizando el conteo respectivo teniendo presente
lo siguiente:
Concentración: Cantidad de espermatozoides(en millones) por mililitro.
Movilidad: Se realizó el recuento de espermatozoides en toda la cámara hasta completar el
cien por ciento(100%), diferenciando, los tipos de movilidad así:
Tipo A: Móviles progresivos rápidos.
Tipo B: Móviles progresivos lentos.
Tipo C: Oscilantes
Tipo D: Inmóviles.
68
Aglutinación: Se define como el hallazgo de grupos de espermatozoides pegados por sus
colas, e indica presencia de anticuerpos anti-espermatozoides.
Morfología: Se elaboraron extendidos de semen en láminas portaobjetos que se dejaron
secar para ser teñidas según la coloración spermac-stain que está compuesta por cuatro
elementos el A y el B que se deben dejar 5 minutos y el C y D que se dejan 1 minuto la
lámina debe ser lavada con agua de chorro entre cada uno de los colorantes;
posteriormente, la lámina se deja secar y se realiza la evaluación correspondiente. Para
esto se hizo un recuento de cien espermatozoides, diferenciando anormalidades de cabeza,
parte intermedia y cola.
Examen fresco: Se depositó una gota de semen entre lámina y laminilla y se evaluó la
presencia de cristales, bacterias, etc.
Vitalidad: Se evaluó siguiendo el protocolo de la coloración eosina- nigrosina;(10ìL de
semen + 2 gotas de eosina mezlar y agregar 3 gotas de nigrosina y mezclar bien.) la cual
nos permite observar los espermatozoides muertos de color naranja-rojizo, debido al daño
que sufren en la membrana, que permite la entrada del colorante. Los vivos se observan
transparentes. Se realizó un recuento de cien espermatozoides diferenciando entre vivos y
muertos.
Todo este análisis anteriormente descrito fué basado en los criterios, protocolos y valores de
referencia proporcionados por la Organización Mundial de la Salud (OMS).
CITOMETRÍA DE FLUJO:
Una vez realizado el espermograma pudimos escoger las muestras útiles para el estudio de
acuerdo a los parámetros de la OMS anteriormente descritos, para proceder con la
citometría de flujo para este fin se siguió el siguiente protocolo:
69
1. Lavado de muestras por centrifugación( 1500 revoluciones/minuto) durante 5
minutos en 10 mL de medio washing. (Todos los pasos fueron hechos tubos falcon
tapa azul).
2. Se remueve el sobrenadante con una chupa plástica y se resuspende el botón en 5
mL de formaldehído al 2% preparado de uno puro al 40% por dilución con PBS, se
deja la muestra en fijación por 40 minutos a temperatura ambiente.
3. Después de la fijación se debe obtener el botón por centrifugación, y posteriormente
lavar 3 veces con 10 mL de PBS, para remover todo el fijador y obtener de nuevo
botón.
4. Dividir el botón en dos partes iguales una para la unión con el anticuerpo
antiubiquitina y el anticuerpo secundario fluorescente y otra para el blanco ( solo
anticuerpo secundario).
5. Bloquear las reacciones no específicas por 30 minutos de incubación del botón en
Suero normal de caballo al 5% preparado en PBS. Mezclar bien. No lavar,
centrifugar y remover todo el PBS.
6. Los siguientes pasos excepto los 2 últimos fueron elaborados en PBS con 1% de
suero normal de caballo. Agregar al botón 200ìL de anticuerpo diluido KM -
691(Kamyia Biomedical Company, Seatle, WA; diluido 1/100) en PBS/1% SNC.
Mezclar bien e incubar por 1 hora a temperatura ambiente. Este paso debe ser
omitido para el blanco.
7. Lavar dos veces por resuspensión en 10 ml de PBS/SNC y centrifugar.
8. Incubar por 1 hora tanto el blanco como la muestra con 200ìl de IgM anti ratón
hecho en cabra conjugado con FITC( Zymed Labs, S. San Francisco)
9. Lavar dos veces con PBS puro y obtener botón.
10. Resuspender el botón en 500 ìl de FACS flow y agregar posteriormente 10 ìl de
fijador.
11. Correr citometría de flujo.
70
Para asegurar al máximo que la población contada por el citómetro fuesen espermatozoides
se procedió a seleccionar el gate o ventana de inclusión esto se logró ajustando algunos
parámetros del citómetro de flujo de la siguiente manera: (Sutovsky, P. et al., 2001)
• FSC (Forward Scatter) en high.
• SSC (Side Scatter) en high.
• Umbral de análisis en canal cero.
Este procedimiento permitió evitar al máximo la interferencia de detritos u otros elementos
que pudiesen interferir con los resultados del estudio.
71
DIAGRAMA DE FLUJO
Agregar 200 µLde PBS
BLANCO
Agregar 200 µLde KM 691
MUESTRA
Dividir el botón en dos partes igules
Bloquear con 1mL deSuero Normal de Caballo al 5%
por 30m
Lavar 3 veces con 10mL de PBS puro
Fijar por 40m enFormaldehído al 2%
Centrifugar obtener el botóny remover el sobrenadante
Lavar por resuspensión en10 mL de medio Washing
Espermograma
Recolección de la muestra
INCUBAR 1 HORA
Lavar 2 veces
Agregar 200 ìl de anticuerpo secundario
e incubar 1 hora
Lavar 2 veces con PBS puro y resuspender en 200ìl de
buffer FACS flow
Agregar 10ìl de fijador y realizar
Citometría
72
6. RESULTADOS
Los resultados obtenidos en el estudio y su análisis estadístico realizado a través del
programa Statistix 7.0 son los siguientes:
:
DESCRIPCIÓN DE LA POBLACIÓN:
EDAD:
El promedio de edad de los 15 pacientes infértiles del estudio es de 36.4 años con una edad
mínima de 24 años y una máxima de 41 y el de los 8 pacientes fértiles es de 26.75 con una
edad mínima de 23 años y una máxima de 32.
VALORES DEL ESPERMOGRAMA:
% DE ESPERMATOZOIDES ANORMALES EN PACIENTES INFÉRTILES.
PACIENTE
No
CONCENTRACION TOTAL DE
ESPERMATOZOIDES EN MILLONES
# DE ESPERMATOZOIDES ANORMALES EN
MILLONES %
1 100 74 74 2 3.6 2.808 78 3 3.1 2.418 78
4 28 21.28 76 5 14.3 12.298 86
6 28 20.72 74 7 61 56.12 92
8 7.3 6.57 90 9 6.6 5.808 88 10 28 25.76 92
11 5.7 5.244 92 12 3.6 3.024 84
13 66 55.44 84 14 6.3 4.725 75 15 44 41.36 94
Tabla 1.0.
73
El promedio de espermatozoides anormales en los pacientes infértiles de nuestro estudio
es de 22´505.000 con un número máximo de 74´000.000 y un número mínimo de 2´418.000
espermatozoides.
La media del porcentaje de espermatozoides anormales en los pacientes infértiles del
estudio es de 83.8% con un porcentaje máximo de 94% y un porcentaje mínimo de 74%.
% DE ESPERMATOZOIDES ANORMALES EN CONTROLES FÉRTILES.
PACIENTE No
CONCENTRACION TOTAL DE
ESPERMATOZOIDES # DE ESPERMATOZOIDES
ANORMALES %
1 70 47.6 68
2 100 70 70
3 26 17.68 68
4 133 91.77 69
5 83 55.61 67
6 66 46.2 70
7 120 82.8 69
8 70 47.6 68 Tabla 2.0
El promedio de espermatozoides anormales en los controles fértiles de nuestro estudio es
de 57´407.500 con un número máximo de 91´770.000 y un número mínimo de 17´680.000
espermatozoides.
La media del porcentaje de espermatozoides anormales en los controles fértiles del estudio
es de 68.25% con un porcentaje máximo de 70% y un porcentaje mínimo de 67%.
74
PRUEBA DE HIPÓTESIS PARA LA MEDIANA.
Se realizó la prueba de hipótesis para las medianas encontrándose diferencias
estadísticamente significativas entre las medianas de los grupos en estudio, siendo el
promedio de las medianas de los controles fértiles 3.7 y el de los pacientes infértiles 21.106.
Otros resultados obtenidos fueron las gráficas arrojadas por el citómetro donde se
observaron dos comportamientos diferentes: Los controles fértiles presentaron histogramas
con curvas en punta mientras que en pacientes infértiles las curvas fueron planas o con
picos dobles. La posición del pico de fluorescencia relativa en el eje X fue cercano a 101 en
controles fértiles y en los pacientes infértiles la posición del pico se desplazó hacia la
derecha acercándose a 102 en el eje X.
Al sobreponer la gráfica del paciente infértil sobre la del control fértil se observó que el pico
de fluorescencia relativa de los pacientes 1,2,4,5,7,8,9,11,13,14 y 15 se desplazó hacia la
derecha mostrando mayor intensidad de marcación de Ubiquitina. Los pacientes 3,6,10 y 12
no presentaron desplazamiento.
Figura 8. Histograma control fértil.
75
Fig. 9 Histogramas pacientes infértiles Fig.10 Sobreposición de histogramas
de Pacientes infértiles sobre control
fértil
Paciente No. 1
Paciente No. 2
Paciente No. 4
76
Paciente No. 5
Paciente No. 7
Paciente No. 8
77
Paciente No. 9
Paciente No. 13
Paciente No. 15
78
COMPARACIÓN DEL DIAGNOSTICO PREVIO
DE INFERTILIDAD Y EL SUGERIDO A TRAVES DEL TEST DE UBIQUITINA.
PACIENTE DIAGNOSTICO ORIGINAL
RESULTADO UBIQUITINA
1 Factor masculino
Factor masculino
2 Factor masculino
Factor masculino
3 Inexplicada Inexplicada 4 Inexplicada Factor
masculino 5 Factor
Masculino Factor
masculino 6 Inexplicada Inexplicada 7 Inexplicada Factor
masculino 8 Factor
masculino Factor
masculino 9 Factor
masculino Factor
masculino 10 Factor
masculino Inexplicada
11 Factor masculino
Factor masculino
12 Inexplicada Inexplicada 13 Inexplicada Factor
masculino 14 Factor
masculino Factor
masculino 15 Factor
masculino Factor
masculino Tabla 3.0
En 11 de los 15 pacientes infértiles se detectó la presencia de Ubiquitina, evidenciada por el
desplazamiento del histograma hacia la zona de mayor intensidad de marcación con el
fluorocromo, lo que se reflejó en el aumento de la mediana con respecto a los 8 controles
fértiles.
En 8 de los 11 pacientes (1,2,5,8,9,11,14 y 15) hubo concordancia al comparar el
diagnóstico previo de infertilidad por factor masculino con el Test de Ubiquitina.
79
Tres pacientes ( 4,7 y 13) con diagnóstico de infertilidad inexplicada tuvieron un
comportamiento similar al observado en los pacientes con Factor masculino.
En 4 de los 15 pacientes (3, 6, 12,y 10) no se logró evidenciar reconocimiento anormal de la
Ubiquitina. De estos 4 pacientes en tres (3,6 y 12) hubo concordancia del diagnostico previo
con el proporcionado por el Test y 1(10) con factor masculino previamente diagnosticado no
proporcionó el resultado esperado con el test de la Ubiquitina.
80
7. DISCUSIÓN
La Ubiquitinación es un mecanismo universal para el reciclaje de proteínas, por medio del
cual se marcan substratos que deben ser destruidos, este proceso se realiza a través de la
unión covalente de 1 o más moléculas de Ubiquitina (péptido de 8.5 Daltons) que toma esos
substratos para la proteólisis en el lisosoma o proteosoma.
Peter Sutovsky y colaboradores, (2000, 2001) demostraron en sus estudios que los
espermatozoides defectuosos en el semen de toros domésticos, búfalos, humanos y ratones
están fuertemente ubiquitinizados en su superficie.
La Ubiquitina es expresada por el epitelio epididimal y acumulada en su microvilli apical, sitio
conocido de secreción apocrina. Es por esto entendible que la ubiquitinación de la superficie
espermática sea el medio para la inmovilización y/o reabsorción de los espermatozoides
defectuosos durante el pasaje epididimal. Este paso de la maduración espermática ocurre en
el epidídimo, lo cual puede deducirse debido al abrupto incremento en el número de
espermatozoides ubiquitinizados entre la red de testis y la cabeza del epidídimo en toros.
Como el mecanismo propuesto permite que cierta porción de espermatozoides defectuosos
ubiquitinizados sean descargados durante la eyaculación, la ubiquitinación de la superficie
espermática podría ser un buen marcador de la calidad del semen en hombres y animales.
La citometría de flujo es la técnica de elección para analizar grandes cantidades de células o
eventos contenidos en una muestra determinada ya que es un método objetivo y
automatizado que permite sacar conclusiones y obtener datos confiables de manera rápida.
81
Teniendo presente que el citómetro analiza 5000 células por segundo y posee sensores para
el reconocimiento del fluorocromo sobre las diferentes células se elimina al máximo el
porcentaje de error y proporciona resultados útiles para el diagnóstico y/o tratamiento de los
pacientes en estudio.
En nuestra investigación, al analizar las gráficas de los controles fértiles proporcionadas por
el Citómetro de Flujo, se observan espermatozoides marcados en los cuales existe
baja intensidad de reconocimiento; debido a esto la mediana del pico fue 3,6, estos datos
concuerdan con los espermogramas de individuos normales fértiles en donde se pueden
encontrar hasta el 70% de formas anormales.
Biológicamente, esto es un fenómeno entendible debido a que en los espermatocitos, los
mecanismos de distribución del ADN, el sistema de la Ubiquitina y la regulación de la
estructura de la cromatina meiótica tienen una íntima relación, como se demuestra por la co-
localización de proteínas involucradas en estos procesos en los complejos de recombinación
meiótica. HR6B y su homólogo más cercano HR6A son proteínas de función múltiple, con
actividad de conjugadoras de Ubiquitina y roles esenciales en la distribución del ADN post-
replicación. Datos bioquímicos indican que, durante la espermiogénesis, la actividad general
del sistema de la Ubiquitina es alta, lo cual está relacionado con la ruptura masiva de
proteínas nucleares y citoplasmáticas durante esta última fase de la espermatogénesis.
(Baarends, W:M., 2000). Dadas las anteriores consideraciones la Ubiquitinación es un
proceso de regulación, durante la maduración de los espermatozoides con lo cual es
comprensible que en individuos fértiles se encuentren espermatozoides ubiquitinizados.
En nuestro estudio en 11 de los 15 pacientes infértiles se detectó la presencia de Ubiquitina,
82
evidenciada por el desplazamiento del histograma hacia la zona de mayor intensidad de
marcación con el fluorocromo, lo que se reflejó en el aumento de la mediana con respecto a
los 8 controles fértiles.
En 8 de los 11 pacientes (1,2,5,8,9,11,14 y 15) hubo concordancia al comparar el
diagnóstico previo de infertilidad por factor masculino con el Test de Ubiquitina. Tres
pacientes ( 4,7 y 13) con diagnóstico de infertilidad inexplicada tuvieron un comportamiento
similar al observado en los pacientes con Factor masculino.
En 4 de los 15 pacientes (3, 6, 12,y 10) no se logró evidenciar reconocimiento anormal de la
Ubiquitina. De estos 4 pacientes en tres (3,6 y 12) hubo concordancia del diagnostico previo
con el proporcionado por el Test y 1(10) con factor masculino previamente diagnosticado no
proporcionó el resultado esperado con el test de la Ubiquitina. Cabe aclarar que estos
pacientes poseen una concentración espermática bastante baja por lo cual las gráficas
producidas no fueron muy claras y no permitieron establecer un resultado definitivo.
Al ser analizados los datos de este trabajo por el test de medianas, se demostró claramente
que existe una diferencia estadísticamente significativa (p=0.0001) entre la intensidad de
marcación de los controles fértiles y los pacientes infértiles; siendo mayor la de estos
últimos. Lo anterior nos lleva a sugerir que la presencia de esta proteína puede ser
relacionada de alguna manera con el diagnóstico de infertilidad por factor masculino.
En conclusión, el Test de la Ubiquitina por FACS sobre la superficie espermática provee un
nuevo acercamiento bastante prometedor a la evaluación del semen en humanos. En
contraste a los métodos subjetivos ya existentes, este ensayo puede proveer un parámetro
medible, objetivo y confiable de la espermatogénesis anormal y la calidad poco óptima del
semen adquirida antes de la descarga espermática del tracto genitourinario.
83
8. CONCLUSIONES
• Existen diferencias estadísticamente significativas entre las medianas de los
pacientes infértiles y los controles fértiles
• Los pacientes infértiles muestran una intensidad de marcación mayor que los
controles fértiles.
• La citometría de flujo es una técnica útil y objetiva para la detección de Ubiquitina en
las muestras de varones fértiles e infértiles.
• Existe relación entre la presencia anormal de Ubiquitina y el diagnóstico de
infertilidad masculina en los pacientes infértiles de nuestro estudio
84
9. RECOMENDACIONES
• Para el futuro se recomienda ampliar el tamaño de muestra ya que de esta manera
se podrán hacer inferencias sobre la población permitiendo así sacar conclusiones y
características más concretas acerca del grupo infértil y la presencia o ausencia de
la Ubiquitina en las muestras de semen.
• Plantear estudios longitudinales en hombres jóvenes con alteraciones del
espermograma que puedan ser consecuencia de varicocele que permitan estudiar a
largo plazo la sensibilidad y especificidad del test y su asociación con la infertilidad.
• Para lograr establecer relación entre parámetros del espermograma tales como la
morfología y la presencia de Ubiquitina, se recomienda complementar la citometría
de flujo con otra técnica inmunológica como la inmunofluorescencia que a pesar de
ser algo subjetiva permite visualizar en que parte del espermatozoide(cabeza, parte
intermedia o cola) está localizada la Ubiquitina.
• Es importante también realizar un doble marcaje ( anticuerpo anti-espermatozoide y
anticuerpo antiubiquitina) para asegurar que los eventos reconocidos por el citómetro
sean exactamente las células estudiadas en el trabajo y no otros elementos que
puedan interferir en el recuento.
85
ANEXOS.
(1) Espermatozoide con cabeza grande (2) Area acrosomal pequeña y vacuolada (3) Cabeza amorfa. (4) Normal. (5) Area acrosomal anormal pequeña. (6) Cabeza amorfa y gota citoplasmatica (7) Normal. (8) Area acrosomal pequeña y vacuolas.
(F
(1) Espermatozoide con cabeza grande y pieza media delgada
(2) Normal (3) Normal (4) Cabeza amorfa y vacuolada, region
postacrosomal asimétrica. (5) Cabeza piriforme, area acrosomal
vacuolada. (6) Cabeza amorfa y pequeña. (7) Cabeza amorfa y una gran gota
citoplasmática. (8) Normal.
86
(1) Espermatozoide Normal (2) Anormal con cabeza piriforme (3) Normal. (4) Anormal con cabeza amorfa. (5) Area acrosomal pequeña, pieza media delgada y cola
angulada. (6) Anormal con cabeza amorfa y pieza media delgada.
87
Santa Fe de Bogotá D.C. Fecha:
CONSENTIMIENTO PARA OBTENCIÓN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
Yo___________________________ Mayor de edad identificado con la CC No.
______________ de _____________ por medio del presente me permito manifestar que
acepto voluntariamente donar mi muestra de semen para ser utilizada con fines
exclusivamente investigativos en el estudio denominado DETECCIÓN DE UBIQUITINA EN
MUESTRAS DE SEMEN Y SU UTILIDAD EN EL DIAGNOSTICO DE INFERTILIDAD
MASCULINA, el cual será realizado por estudiantes de Bacteriología de último semestre de
la Pontificia Universidad Javeriana, en convenio y bajo total supervisión de la Clínica de
Reproducción Asistida MEDIFERTIL.
Manifiesto de igual manera que conozco y fui informado plenamente de la utilidad, manejo y
procesamiento que se le dará a dicha muestra.
______________________________
Firma
CC.
88
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