Detección molecular y serológica del virus de la leucosis ...

Universidad de La Salle Universidad de La Salle

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Maestría en Ciencias Veterinarias Facultad de Ciencias Agropecuarias

1-1-2017

Detección molecular y serológica del virus de la leucosis bovina Detección molecular y serológica del virus de la leucosis bovina

enzoótica en una finca lechera del municipio de Sibaté, enzoótica en una finca lechera del municipio de Sibaté,

Cundinamarca Cundinamarca

Néstor Arturo Quintero Castro Universidad de La Salle, Bogotá

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Citación recomendada Citación recomendada Quintero Castro, N. A. (2017). Detección molecular y serológica del virus de la leucosis bovina enzoótica en una finca lechera del municipio de Sibaté, Cundinamarca. Retrieved from https://ciencia.lasalle.edu.co/maest_ciencias_veterinarias/74

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Universidad de La Salle

Facultad de Ciencias Agropecuarias

Maestría en Ciencias Veterinarias

DETECCIÓN MOLECULAR Y SEROLÓGICA DEL VIRUS DE LA LEUCOSIS BOVINA

ENZOÓTICA EN UNA FINCA LECHERA DEL MUNICIPIO DE SIBATÉ, CUNDINAMARCA

Preparado por

NÉSTOR ARTURO QUINTERO CASTRO

Código

76141215

Bogotá D.C., Noviembre

2017

ii

Universidad de La Salle

Facultad de Ciencias Agropecuarias

Maestría en Ciencias Agropecuarias

DETECCIÓN MOLECULAR Y SEROLÓGICA DEL VIRUS DE LA LEUCOSIS BOVINA

ENZOÓTICA EN UNA FINCA LECHERA DEL MUNICIPIO DE SIBATÉ, CUNDINAMARCA

Proyecto de investigación

Néstor Arturo Quintero Castro

76141215

Director

Clara Stefany Romero Hurtado, M.V., M.Sc.

Bogotá D.C., Noviembre

2017

iii

Resumen

La Leucosis Bovina Enzoótica (LBE) es una enfermedad producida por un vírus de la familia

retroviridae, que afecta los linfocitos B y tiene la capacidad de integrarse al genoma del hospedero. El

virus de la LBE tiene distribución mundial aunque los índices de prevalencia varían ampliamente entre

países y continentes, siendo una enfermedad de presentación esporádica en Asia, África y Oceanía,

contrario a lo que ocurre en América y Europa, donde la enfermedad es enzoótica y con particular

predilección por sistemas productivos lácteos intensivos.

El objetivo del presente estudio fue determinar la presencia de la LBE, mediante las técnicas

diagnósticas PCR y ELISA de bloqueo, y establecer su relación desde los resultados de ambas pruebas

con el conteo de linfocitos, y así determinar si existe diferencia entre cada una de las técnicas a la hora de

determinar los animales positivos y negativos. Se trabajó con 50 animales de edades entre los 3 y los 11

años en una finca lechera ubicada en el municipio de Sibaté Cundinamarca. La prueba ELISA de bloqueo

arrojó que 12 de los 50 animales muestreados presentaron anticuerpos elevados específicos contra LBE

que corresponde a un 24%, de otro lado 7 de los 50 animales muestreados fueron positivos mediante PCR

anidado lo que corresponde a 14% a través de esta prueba, y 8 de los 12 animales positivos a ELISA de

bloqueo tienen conteo de linfocitos aumentado en relación con los conteos normales para ese grupo etario.

Palabras clave: Leucosis bovina enzoótica, linfocitos, PCR, Elisa

iv

Abstract

Enzootic Bovine Leukosis (LBE) is a disease caused by a virus of the retroviridae family, which affects B

lymphocytes and has the ability to integrate into the host genome. The LBE virus has a global distribution,

although prevalence rates vary widely between countries and continents, being a sporadic disease in Asia,

Africa and Oceania, contrary to what happens in America and Europe, where the disease is enzootic and

particular preference for intensive dairy production systems.

The objective of the present study was to determine the presence of enzootic bovine leukosis by means of

various diagnostic techniques, such as PCR, blocking ELISA, and lymphocyte counts, thus determining if

there is a difference between each of the techniques in determining the positive and negative. We worked

with 50 animals aged between 3 and 11 years in a dairy farm located in the municipality of sibate

Cundinamarca. The ELISA blocking test showed that 12 out of the 50 animals sampled had elevated

specific antibodies against Bovine Enzootic Leukosis which corresponded to 24%; on the other hand 7 of

the 50 animals sampled were positive by nested PCR, and 8 of the 12 animals which are positive to block

ELISA have increased lymphocyte counts relative to normal counts for that age group.

Keywords: Bovine Enzootic Leukosis, lymphocytes, PCR, ELISA

v

TABLA DE CONTENIDO

1. Introducción….…………………………………….…………………….…………………… 1

2. Revisión de literatura………..………..…….……. ...….……………….……………………. 3

2.1 Reseña………………………………….…..………..………………….………………... 3

2.2 Etiología ….………..……………….…………..………………….………...................... 4

2.3 Transmisión.…………… ……………….…………..……………….……….................. 7

2.4 Etiopatogenia…………….……………….…………..…………………........................... 8

2.5 Manifestaciones clínicas……..………………………………….……………..…………. 10

2.6 Lesiones...…………………….……………………….………………….......................... 12

2.7 Diagnóstico…. ………………………………………………………..…………………... 13

2.8 Prevalencia ……………………………………………………………………………….. 15

2.9 Impacto Económico………………………………………………………………………... 17

3. Materiales y métodos ………………………………………………………………………...... 18

3.1 Población…………………………………………………………………………………… 18

3.2 Muestra ………………………………………………………………………………….. 18

3.3 Procedimientos realizados ………………………………………………………………. 20

3.3.1 Cuadro Hemático…………………………………………………………………..….... 20

3.3.2 Elisa de bloqueo ………………………………………………………………………. 20

3.3.3 PCR ……………………………………………………………………………………. 22

4. Resultados …………………………………………………………………………………… 24

5. Discusión ………………………………………………………………………………….. 28

6. Conclusiones y recomendaciones …………………………………………………………. 33

7. Bibliografía ………………………………………………………………………………. 34

vi

8. Anexos …………………………………………………………………………………… 42

vii

LISTA DE TABLAS

Tabla 1 Distribución de muestras procesadas y porcentaje de positividad a LBE, por

departamento y número de municipios que enviaron muestras. Colombia 2005-2009.……… 16

viii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estructura genética de los retrovirus …………………………………………........... 5

Figura 2. Estructura del virus de la Leucosis Bovina Enzoótica ………………………......... 6

Figura 3. Mecanismo de transmisión de la Leucosis Bovina Enzoótica …………….……..… 8

Figura 4. Seroprevalencia de la Leucosis Bovina Enzoótica en una finca en Sibaté ………….. 25

Figura 5. Conteo de linfocitos en animales seropositivos…………………………….…........... 25

Figura 6. Producto del PCR amplificado ……………………………………………………... 26

Figura 7. Prevalencia de PCR para Leucosis Bovina Enzoótica …………………………….... 27

Figura 8. Comparación resultados ELISA de bloqueo contra resultados PCR anidada …….. . 27

1

1. INTRODUCCIÓN

La Leucosis Bovina Enzoótica (LBE), es una enfermedad infecciosa crónica ocasionada por un

virus de la familia retroviridae, sub familia orthoretrovirinae dentro del género deltaretrovirus tipo

C (Felmer R, Zúñiga J, Recabal M 2006). La enfermedad se caracteriza por afectar principalmente

a las células linfocíticas tipo B, aunque también tiene la capacidad de afectar las células tipo T y los

monocitos. (Schwartz & Lévy, 1994).

La transmisión de la Leucosis Bovina Enzoótica se puede dar de forma horizontal como

vertical, siendo la forma horizontal la de mayor importancia en las producciones lecheras, lo que

frecuentemente ocurre por el uso inadecuado de instrumental veterinario, el uso de agujas

desechables en varios animales, por insectos hematófagos, entre otros. Por otro lado, la transmisión

vertical ocurre porque el virus se encuentra en la leche y calostro de animales infectados y puede ser

transmitido a las crías en cualquier periodo de la lactancia; la vía transplacentaría también

constituye un mecanismo de infección con un 5% en terneros vivos nacidos de madres portadoras

(González et al., 2001).

La enfermedad puede tener varias presentaciones, una de ellas se caracteriza por la ausencia

de signos clínicos y otra donde los animales desarrollan linfoma maligno, con la subsecuente

presentación de signos de acuerdo a la afección orgánica desarrollada y los órganos afectados,

dichos signos varían y pueden ser, por ejemplo: anorexia, pérdida progresiva de la condición

corporal, disminución de la producción en vacas lecheras, aumento de tamaño de algunos ganglios y

alteraciones en la temperatura corporal de acuerdo al desarrollo del proceso neoplásico (Cadavid,

2012).

La LBE es una patología que se presenta con mayor frecuencia en ganaderías lecheras en

relación con las ganaderías de carne, en Colombia se han realizado varios estudios donde las

prevalencias para ganaderías de leche son 24.9 % para la región andina, 15.3% para el pie de monte

llanero y 14.4% para la región caribe (Romero et al. 1999). Otros estudios realizados en

2

Cundinamarca demuestran una prevalencia mayor como el reportado por Villegas, (2015) donde

encontró una prevalencia del 64% en el municipio de Ubaté en vacas Holstein, así mismo Alfonso,

Almansa y Barrera (1998) encontraron una seroprevalencia del 45.28% en vacas de leche en la

Sabana de Bogotá, Valle de Ubaté y Chiquinquirá

Esta enfermedad es considerada de importancia económica a nivel mundial, si bien en

Colombia no han sido estimadas las pérdidas monetarias, en países como Estados Unidos, se señala

que las mismas se encuentran en el orden de los $ 86 millones de dólares para la industria láctea

(Mohammadabadi et al., 2011); así mismo el 89% de los hatos lecheros en este mismo país tiene

una pérdida económica anual de $525 millones de dólares por disminución de la producción de

leche (Florins et al., 2007; Kobayashi et al., 2010). Por otra parte la patología presenta bloqueos en

comercialización mundial de semen y otros productos que procedan de animales positivos, esto trae

como consecuencia la imposibilidad de exportación y adquisición desde mercados extranjeros (OIE,

2014).

Para el diagnóstico de la LBE, se utiliza con frecuencia la prueba de ELISA indirecta, la cual

detecta anticuerpos del virus (OIE, 2014); sin embargo no su presencia. En este proyecto de

investigación, además de realizar el diagnóstico mediante la técnica de Elisa indirecta se busca

obtener resultados a través de la técnica molecular de PCR, e identificar más allá de los anticuerpos

la presencia del virus en un sistema productivo del municipio de Sibaté, lo que representaría el

primer reporte del virus de la LBE en esta zona específica del departamento de Cundinamarca.

3

2. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1 Reseña

La Leucosis Bovina Enzoótica (LBE) es una enfermedad que afecta fuertemente la

línea linfocitaria, en la que es posible la presentación de procesos neoplásicos mortales, se

caracteriza por la aparición de acúmulos linfocitarios neoplásicos en casi cualquier órgano del

bovino, lo que genera una multiplicidad de signos clínicos; de esta manera las manifestaciones

dependerán del órgano u órganos que estén directamente involucrados, con frecuencia corresponden

a bazo, corazón, riñón y abomaso (Blood & Radostits 1992; Cadavid G. 2012). Se han descrito tres

formas desde el punto de vista clínico-patológico de la enfermedad:

Infección permanente con anticuerpos detectables los cuales son conocidos como

portadores asintomáticos.

Linfocitosis persistente (LP), que es un proceso linfoproliferativo (Blood & Radostits,

1992; Cadavid G. 2012), definido como “un incremento en el número absoluto de linfocitos

de tres o más desviaciones estándar sobre la media normal determinada para cada raza y

grupo etario Esta definición y concepto para tener validez debe ser aplicado al incremento

de linfocitos que persistan por más de tres meses realizando conteos seriados” (Chamizo,

2005).

Linfoma maligno (Blood & Radostits 1992).

La LBE fue advertida por primera vez en Alemania proveniente de un hato del oeste del rio Elba

y se remonta al año de 1861, se describe la aparición de nódulos con superficie lisa, color

amarillo y diferentes tamaños en un bovino adulto con afección principal del bazo (Cadavid

G. 2012; Villegas V, 2015). Para el año de 1906 en los Estados Unidos se reportarían dos

casos de linfosarcoma bovino los cuales presentaban conteos de linfocitos superiores a

50.000 células por mm3. La introducción del término “Leucosis” se da por primera vez

4

hacia el año de 1916 cuando Dobberstein realizó una descripción especializada de la

enfermedad, en este mismo año Knuth y Volkmann, asociaron el incremento en el número

de leucocitos sanguíneos a una forma tumoral de presentación de la enfermedad, y

determinan que se trataba de una enfermedad infecciosa, comprobando la presencia del

virus a través de microscopia electrónica, posteriormente hacia el año de 1954 la cantidad

de linfocitos circulantes toma gran importancia como método diagnóstico de la patología

(Cadavid G. 2012; Villegas V, 2015). La LBE llegó por primera vez a América en la

primera parte del siglo XX, y el primer reporte en Colombia se realizó en 1957. Desde ese

momento, el número de casos, de reportes y de prevalencias ha ido aumentando, con más

intensidad en las ganaderías especializadas en producción de leche (Alfonso, Almansa, &

Barrera, 1998; Galdino de Lima. 1999).

2.2. Etiología

La (LBE) es causada por un virus de la familia retroviridae, subfamilia orthoretrovirinae,

del género Delta retrovirus tipo- C. Se clasifica como tipo C dado que tiene una nucleocápside

central dentro de un virón maduro. Los retrovirus tienen la capacidad de producir una

transformación neoplásica a la célula hospedadora y posteriormente linfoma, leucemia o ambas

(Vélez, 2006). Como ocurre en otros virus de la misma familia, está constituido por proteínas

glicosiladas y no glicosiladas, Ácido ribonucleico (RNA) y una enzima conocida como polimerasa-

RNA dependiente o Trascriptasa Reversa (Leite et al., 2004; Varmus, 1998). El genoma viral

comprende una molécula de RNA de 9 kilo bases (kb) donde se incluyen los genes pol, env gag,

(Figura 1). El virus infecta principalmente linfocitos B, pero también tiene la capacidad de infectar

linfocitos T y monocitos (Vélez, 2006).

El genoma de los retrovirus contiene tres genes importantes gag, pol y env, junto a ellos se

deben tener en cuenta dos regiones reguladoras en los extremos 3' y 5'. El gen gag codifica tres

5

proteínas: de matriz (MA), de nucleocápside (NC) y de cápside (CA), siendo la cápside el

componente proteico más importante del virus codificando cuatro proteínas p10, p12, p15 y p24. El

gen pol codifica a su vez tres enzimas: la transcriptasa inversa (RT), ribonucleasa (PR) y la

integrasa (IN) y el gen env codifica una proteína de superficie gp51 por el gen env que interactúa

con la célula huésped y una proteína transmembrana gp30 (Forti et al., 2014).

Estrictamente en su orden, la estructura del virus está formada por dos moléculas de RNA

estabilizadas por las nucleoproteína p10 y p12 que a su vez forman la nucleocápside, la

nocleocapside y el RNA se encuentran rodeados por una cápside formada por la proteína p24, esta

cápside está constituida por la proteínas p24 y se encuentra rodeada por un envoltorio formado por

la proteína matriz p15, inmediatamente después de esta estructura (matriz) aparece una malla de

glicoproteínas transmembrana constituida por la gp30 que se unen estrechamente con la

glicoproteína de superficie gp51. De acuerdo con lo mencionado anteriormente podemos decir que

la estructura del virus desde el interior al exterior corresponde a, RNA genómico, p12

(nucleocápside), p24 (cápside), p15 (proteína matriz), membrana celular, gp30 (transmembrana) y

gp51 (glicoproteína de superficie) (Figura 2). La glicoproteína de superficie por ser la estructura

viral más externa, es la molécula censada por el sistema inmune para el desarrollo y la producción

de anticuerpos, de igual manera es la encargada del tropismo y adhesión a la membrana los

linfocitos B, quienes en su superficie expresan la Inmunoglobulina M (IgM) y establecen contacto

directo con la glicoproteína de superficie viral gp51 (Kerkhofs, Heremans, Burny, Kettmann, &

Willems, 1998).

Figura 1: Estructura genética de los Retrovirus.

(Andújar, 2004).

6

Las regiones reguladoras tienen un papel importante en el ciclo vital del virus puesto que

son responsables de la expresión génica del virus y son necesarias para la integración viral en el

genoma celular. Las regiones reguladoras se dividen en tres regiones: U3, R y U5. A la región U3

se unen una serie de cooperadores para ayudar a regular los niveles de expresión génica del

provirus. Los cooperadores de origen celular hacen que muchos retrovirus sean específicos para

diferentes especies. Entre 5' de la región reguladora y el codón de iniciación del gen gag hay una

secuencia líder donde se encuentran tres locus importantes como son, el lugar de unión del cebador

donde tiene lugar la unión de un ARNt que sirve de cebador para la transcriptasa inversa; el

segundo locus es env relacionado con los transcritos del gen env y el último locus es de secuencias

de empaquetamiento que permite al ARN viral ser reconocido por las proteínas gag y poder ser

incorporado al virión y ser expulsado de la célula.

Figura 2: Estructura del virus de la Leucosis Bovina Enzoótica.

(Andújar, 2004).

7

2.3. Transmisión.

La transmisión del virus puede ocurrir tanto en forma vertical como en forma horizontal. La

transmisión vertical (hasta un 15%), sucede por diferentes mecanismos como, el consumo de leche

y calostro o por el paso transplacentario de madres infectadas (Hopkins, DiGiacomo, 1997). La

transmisión horizontal es considerada la más importante y ocurre por diferentes factores

tales como, contacto con sangre contaminada, insectos hematófagos, agujas hipodérmicas,

guantes ginecológicos, instrumental quirúrgico, transfusiones sanguíneas de animales

contaminados (Figura 3) (Sota, 2004).

La enfermedad presenta mayor prevalencia e incidencia en los hatos manejados de forma

intensiva, lo que generalmente ocurre en hatos lecheros, debido a que se incrementa el contacto

estrecho entre las vacas, y la manipulación de los animales, lo que permite el paso de linfocitos

contaminados durante procedimientos donde se realiza mayor intervención humana (Johnson &

Kaneene, 1991). Algunos de los materiales que son posibles fuentes de transmisión y que han sido

estudiados se encuentran: la sangre, la saliva, el calostro, la leche, las secreciones nasales, los

lavados bronco-alveolares, la orina, las heces, el semen, los lavados intrauterinos y los embriones.

(Johnson & Kaneene, 1991). El virus no se encuentra en secreciones y excreciones del ganado

bovino infectado, sin embargo si dichas secreciones se ponen en contacto con sangre,

específicamente con linfocitos, o presentan una fracción celular, puede ser fuente de transmisión

(OIE, 2004).

Frecuentemente ocurren procesos de infección debido a la introducción de nuevos animales

infectados asintomáticos a las ganaderías lo que provoca un aumento considerable del virus en los

hatos tomando características enzoóticas (González, et al., 2001).

8

Figura 3. Mecanismo de transmisión de la Leucosis Bovina Enzoótica

(Cadavid G. 2012).

2.4.Etiopatogenia

En un hospedador, la presencia del Virus de LBE tiene afinidad por los linfocitos en especial

por los linfocitos B CD5+ (Aida, et al, 1989). En la primera fase el DNA codificado (provirus),

puede producir viriones verdaderos y escapar de las células hospedadoras para infectar otras que se

encuentras a su alrededor. Pasados 10 a 12 días de la infección existe una respuesta inmune tanto

celular como humoral que aumenta los anticuerpos contra las proteínas estructurales de la cápsula

viral, las cuales controlan la replicación del virus (Leite et al 2004). La respuesta inmune eliminaría

las células virales activas permitiendo solo la replicación mitótica de las células portadoras del

ADN viral. Si bien los mecanismos fisiopatológicos exactos no se han determinado, es posible

sugerir un mecanismo de la siguiente manera: el virus ingresa al nuevo hospedero a través de

algunas secreciones de individuos infectados (leche, semen, sangre). Se estima que 1 ml de fluidos

o secreciones de un animal infectado con un recuento leucocitario de 10.000 por mm3

puede tener

9

hasta 5.000 dosis infectantes. El tropismo inicial será especialmente por linfocitos B CD5+, pero

este virus también puede afectar a los linfocitos T y los monocitos, particularmente cuando el virus

migra o llega a placas de Peyer. En los linfocitos B se producen de 1 a 5 partículas provirales, esto

significa que el genoma del virus se ha integrado con el DNA del hospedero, en este caso al DNA

de la célula linfoide, y estas células serán las encargadas de infectar a otros linfocitos.

Posteriormente el genoma celular sufre modificaciones, que conducen a la proliferación de células

con carácter neoplásico (Baruta et al., 2011; Orjuela, Navarrete, Betancourt, 1991).

Desde la infección viral los bovinos pueden mantenerse asintomáticos (65% de animales

infectados) hasta los 2 a 5 años, e incluso esta fase asintomática se puede mantener de por vida

(Cockrell & Reyes, 2000; Willems et al. 2000 citado por Rama G 2011). De los animales

infectados, aproximadamente el 30% desarrolla linfocitosis persistente en un periodo de 2 a 3 años

post infección (Schwartz & Levy, 1994). El Comité Internacional de la Leucosis define la

linfocitosis persistente (LP) como “un incremento absoluto de linfocitos de tres o más desviaciones

estándar sobre la media normal determinada para cada raza y grupo etario” (Gatti 2007; Cadavid.,

2012).

Dentro de la evolución de la enfermedad algunos animales infectados desarrollan un proceso

neoplásico linfoma maligno que puede afectar principalmente ganglios linfáticos, corazón, bazo,

abomaso, intestino, hígado, riñón, pulmones y útero (Cadavid., 2012). Esto ocurre de 3 a 8 años

después de la infección y aproximadamente entre el 1 al 5% de los animales infectados (Kettman, et

al. 1994; Trono K, et al. 2001).

Las manifestaciones clínicas, cuando se presentan, suelen aparecer después de los dos años de

edad. Sin embargo, diferentes estudios reportan que el período de mayor frecuencia de presentación

es de 5 a 8 años de edad (Elpidio G, 2005). La signología varia en diferentes animales teniendo en

cuenta el lugar de presentación del agente tumoral y el grado de afectación que tenga el órgano,

para posteriormente llevar al animal a la muerte entre 1 y 6 meses después de la aparición de los

10

signos clínicos (Florins, et al 2007). Algunos de los signos que permiten identificar la enfermedad

con mayor probabilidad es el aumento bilateral más o menos simétrico de los ganglios linfáticos

explorables, la pérdida progresiva de peso y condición corporal (Johnson, R & Kaneene, J. 1992)

Así mismo el virus de la LBE tiene un periodo de incubación aproximado de cuatro a cinco

años, generando una Linfocitosis Persistente (LP) antes de las manifestaciones clínicas, y raramente

produciéndose antes de los dos años de edad. Muchas animales se encuentran en la fase preclínica

de la enfermedad durante la etapa productiva de su vida, incluso sin aparentes disminuciones en su

rendimiento o producción, y aunque los animales se pueden infectar a cualquier edad, la fase

clínica, los linfomas o tumores suelen aparecer después de los tres años de vida (Kahn, et al.,

2007).

Algunos autores proponen que dentro de la fase clínica de la enfermedad existen tres cursos en

cuanto al tiempo de presentación de los signos clínicos y la posterior muerte (Florins, et al., 2007).

Un curso híper-agudo donde los animales mueren súbitamente sin aparentes muestras previas de

enfermedad, proceso que sucede a un 5% al 10% de los animales; casos clínicos de curso subagudo

donde los animales presentan hemorragias internas de tamaño variable y se presenta hasta por siete

días, y casos crónicos donde los animales infectados presentan pérdida de peso progresiva con la

consecuente pérdida de la condición corporal, anorexia, palidez, baja considerable en la producción

y debilidad muscular (Cadavid L,. 2012). La temperatura puede ser normal y se ve afectada

únicamente cuando el desarrollo tumoral es acelerado. Luego de ser detectado el tumor y los

diferentes signos clínicos la muerte del animal se acelera y sucede dos a tres semanas después

(Blood & Radostis., 1992).

2.5 Manifestaciones clínicas

La LBE genera múltiples casos de linfomas multicéntricos en bovinos adultos, los cuales se pueden

desarrollar fácil y rápidamente en varios lugares del cuerpo y por tanto la variación en las

11

manifestaciones clínicas que se puedan presentar; esta forma de presentación de la enfermedad es la

más severa y se conoce como la forma tumoral de la patología. Otra de las formas de presentación

de la patología se da por la presencia de linfocitosis persistente, esta no cursa con signos clínicos y

generalmente aparece antes de las manifestaciones tumorales (cuando estas se dan), pero aparece

después de los dos años. Muchas vacas infectadas permanecen con linfocitosis persistente durante

gran parte de su vida, casi durante todo su periodo productivo, sin cambios aparentes en la salud ni

en la producción del animal y algunas de ellas nunca desarrollan la etapa tumoral; sin embargo

cuando la etapa tumoral se desarrolla se da en animales mayores de 3 años de edad. (Kahn, et al.,

2007). Con gran frecuencia la enfermedad se da en forma subclínica, aunque algunos estudios han

demostrado que la linfocitosis persistente se puede encontrar entre un 30 – 70% de los animales

infectados y la etapa tumoral se puede encontrar entre el 0.1 al 10% de los animales infectados.

Los signos son variables y pueden incluir: desórdenes digestivos, anorexia, pérdida progresiva

de peso y de condición corporal, debilidad general y tumefacción de ganglios a la palpación

superficial. Los órganos más afectados por la LBE son la aurícula derecha, omaso y abomaso,

pulmones, hígado, bazo, intestinos, útero, riñón (Chamizo., 2005). Casos clínicos de curso híper-

agudo se presentan entre un 5% a un 10% donde los animales infectados mueren súbitamente sin

manifestaciones previas de enfermedad. La ruptura de una úlcera abomasal, la afección de los

ganglios o el daño a nivel del bazo, adicional a una hemorragia interna son algunas causas

conocidas dentro del cuadro sub agudo que puede tardar hasta siete días, como también se deben

tener en cuenta en el cuadro crónico que puede demorar meses. Los animales afectados empiezan a

perder condición corporal inexplicablemente, anorexia, debilidad muscular, palidez y en vacas

lecheras la producción puede disminuir drásticamente. Una vez que los signos clínicos y el

desarrollo del tumor sean detectables la muerte del animal es inminente y puede suceder de dos a

tres semanas (Cadavid., 2012).

12

En el caso de evolucionar como linfoma, los ganglios linfáticos aumentan de tamaño en el 75-

90% de los casos siendo un aumento mayormente simétrico; esto es con frecuencia un hallazgo

clínico precoz (Hernández-Herrera et al 2011). La exoftalmia junto con el aumento de tamaño más

o menos simétrico de los ganglios linfáticos explorables constituye el signo más evidente de la

presentación de la enfermedad. Sin embargo, lesiones periféricas se pueden presentar así como

pueden estar completamente ausentes en muchos casos con afectación visceral avanzada. El

aumento de tamaño de nódulos linfáticos viscerales es frecuente, normalmente subclínico, se

pueden observar signos clínicos cuando el aumento de tamaño de estos nódulos compriman otros

órganos de importancia como los intestinos o nervios. Los ganglios que se ven comprometidos son

de consistencia dura y lisa; en las vacas lecheras, se observan con facilidad cuando estos se

presentan y normalmente se encuentran edematizados, en algunos casos toda la superficie corporal

está cubierta con masas subcutáneas de 5 -11 cm de diámetro. (Kahn, et al., 2007; Cadavid.,

2012).

2.6 Lesiones

Las lesiones más comunes son tumores en los ganglios linfáticos, los más frecuentemente

afectados son los iliacos (65 a 83%), mesentéricos (66%), intratorácicos (62 a 74%), y los

superficiales (pre escapulares, pre crurales y de la región cervical) (41 a 62%). Estos se muestran

casi siempre sin adherencias a tejidos circundantes, lisos o con nódulos, de consistencia blanda y

edematosa o firme, turgente y friable. En la superficie de corte los detalles de la estructura

anatómica del órgano se pierden por la invasión de tejido tumoral lardáceo, húmedo y de color

blanco grisáceo o blanco amarillento (Cadavid., 2012). Cuando la medula ósea es afectada, aparece

un tejido blanco-gris o blanco remplazando el color rojo que se observa en la médula hemopoyética

normal. La afección tumoral de la médula ósea implica la presencia de leucemia, o sea, la aparición

de células tumorales en la sangre (Cañibano, 2011).

13

2.7 Diagnóstico

El diagnóstico de LBE puede ser determinado por un lado teniendo en cuenta que

aproximadamente el 30% de animales infectados cursan con linfocitosis persistente, mientras que

tan solo entre el 1% y el 5% desarrollan linfoma; de este modo se puede realizar una aproximación

diagnóstica con base en la sintomatología clínica y los hallazgos de laboratorio. Los signos clínicos

pueden variar dependiendo del sistema u órgano afectado presentándose algunos desórdenes

circulatorios, digestivos, respiratorios, reproductivos y locomotores. En animales con mayor edad la

sintomatología cursa con un proceso caquéctico. Se realiza examen clínico para diagnosticar el

linfoma que puede ser confirmado por histopatología en biopsias de los tumores. La linfocitosis

persistente se diagnostica mediante exámenes hematológicos realizados en una forma periódica

(Giraudo, 2010).

El diagnóstico de animales con linfocitosis persistente y animales infectados sin signos

clínicos requieren de pruebas de laboratorio (Cañibano, 2011). Algunos de los estudios realizados

son: Inmunodifusión en gel de agar (IDGA), Radioinmunoensayo (RIA), Seroneutralización (SN),

Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), Western Blot (WB) y Reacción en Cadena

de Polimerasa (PCR); La PCR es una prueba útil para detectar DNA proviral en muestras de sangre,

siendo un método sensible que permite un diagnóstico rápido y temprano (González et al., 2001).

Diferentes estudios realizados para la enfermedad indican diagnósticos moleculares y

serológicos, donde se pueden identificar genes del virus como anticuerpos para el virus

respectivamente, algunos estudios recientes señalan que el diagnóstico preciso corresponde a la

detección de los genes del virus gp51-env, gag-p25 y pol por pruebas moleculares específicamente

por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en sus diferentes formas diagnosticas (PCR-RT,

nested PCR, PCR duplex, PCR-EIA y PCR-ISH) de células procedentes de muestras de sangre,

testículo, ganglios linfáticos, abomaso, corazón u otros órganos afectados. La Reacción en cadena

de la Polimerasa tiene algunas ventajas las cuales permiten detectar animales infectados antes de

que estos desarrollen una respuesta inmunológica, animales cursando un período prolongado de

14

latencia, así como la detección del virus en terneros infectados que pudieran ser falsos positivos con

otras pruebas debido al consumo reciente de calostro, detectar el provirus en animales

inmunotolerantes que son serológicamente negativos, y detectar el provirus en vacas seronegativas

en periodo de periparto debido a la inmunodepresión generada por la gestación como tal y a la

cantidad de inmunoglobulinas dispuestas para el calostro (Monti et al., 2005), estudios realizados

en hembras gestantes han demostrado que en el periparto (30 días antes y hasta 30 días después del

parto) la actividad del sistema inmune esta considerablemente disminuido, por lo cual algunos

animales pueden aparecer como falsos negativos con pruebas diagnósticas basadas en la detección

de anticuerpos, puesto que la capacidad de los linfocitos para responder y la producción de

anticuerpos están significativamente bajos. Igualmente existe una disminución significativa de la

IgG y la IgM en las 8 semanas previas al parto y hasta 4 semanas posteriores al parto (Meikle, et al.,

2012).

Además de la PCR y de las pruebas serológicas de ELISA es posible realizar diagnóstico

por inmunohistoquímica o inmunofluorescencia de tejidos donde se sospeche de la presencia de la

partícula viral. Sin embargo es importante tener en cuenta que tanto para las pruebas moleculares

como para la inmunohistoquimica e inmunofluorescencia la detección del virus resulta difícil

porque depende de la carga proviral que posee el animal, es decir del número de células infectadas y

depende igualmente de la eficiencia del método de extracción del RNA, (Ott, Johnson, & Wells,

2003 citado por Villegas 2015).

El recuento de linfocitos si bien no es una prueba diagnóstica contundente, puede ser

relacionado con pruebas diagnósticas más precisas o avaladas para el diagnóstico médico, puesto

que se ha demostrado que el 92% de animales con LBE seronegativos presentan valores normales

de estas células, mientras que el 66% de animales seropositivos presentan niveles de linfocitos

superiores de los reportados como normales para la especie que para el caso de bovinos está

estipulado como normal entre 2200 a 9000 cel/ul (Rama, 2011).

15

Teniendo en cuenta los diferentes métodos diagnósticos, las pruebas más comunes para el

diagnóstico de LBE son inmunodifusión en gel agar (AGID) y la prueba de ELISA (Enzyme-

Linked ImmunoSorbent), que arrojan resultados relacionados con la cantidad de anticuerpos

presente en el huésped, la prueba de ELISA reconoce anticuerpos séricos contra las proteínas

estructurales gp51 y p24 y estos persisten durante toda la vida, es por esto que la Organización

Mundial de la Salud Animal OIE, reconoce a la AGID y al ELISA como métodos diagnósticos para

la LBE y recomienda a los gobiernos el uso de la prueba de ELISA como método oficial de

diagnóstico de la enfermedad (Ferrer Piper, Abt, & Marshak, 1977; Agresti et al., 1993).

2.8 Prevalencia

La mayor prevalencia se presenta en ganaderías especializadas en la producción de leche

entre un 15% y un 49% en diferentes países (Martín et al., 2000; Morris et al., 2001) esto

concuerda con diferentes estudios realizado en la Florida en donde reportan una prevalencia de

48% en ganaderías lecheras (Chamiso., 2005).

En algunos países de américa los reportes son los siguientes: Costa Rica 18,4%, Chile

35,9%, Uruguay en 60 ganaderías de 3 departamentos mediante la técnica de ELISA encontraron

una seroprevalencia del 77%, 72% y 57%, en Brasil se encontraron prevalencias del 4% hasta unas

mayores al 70% en hatos, y en otros estudios en chiles en diferente estudios encontraron

prevalencias del 21% al 59% y en Estados Unidos de América 23%, (Galdino de lima, 1999; Grau

& Monti, 2010). Otros continentes reportan prevalencia similares en algunos países específicos

como: Nueva Zelanda 36%, Israel 25%, 30% en Australia,

En Colombia, los primeros estudios de prevalencia serológica para la enfermedad se

realizaron en la sabana de Bogotá en 1980 obteniendo una seroprevalencia de 36,4 (+/- 5,2%).

Posteriormente dos años después, (Parra et al., 1982) reportaron una cercana al 30% para la zona

Andina. En este sentido se encontraron prevalencias en ganado de leche de 24.9 % para la región

16

Andina, 14.4 % para la región Caribe y 15.3 % para el Piedemonte Llanero (Romero et al. 1999;

Cadavid G. 2012).

La Federación Colombiana de Ganaderos entre los años 2005 y 2009 realizó una

recopilación de todos los datos de LBE de todo el país, encontraron que los laboratorios del ICA y

otros de referencia reportan una prevalencia del 25% en un total de 20.910 muestras procesadas en

búsqueda de la enfermedad y su prevalencia en todo el país. En la tabla 1 se encuentran

relacionados los departamentos que enviaron muestras, así como el número de municipios por

departamento, cantidad de muestras enviadas por cada municipio y cantidad de muestras positivas

con su respectivo porcentaje de prevalencia para cada municipio.

La elevada incidencia de la LBE en los hatos lecheros se relaciona con las diferentes

exigencias que requieren estos sistemas de producción que se caracterizan por producción intensiva

o semi-intensiva donde el confinamiento de los animales es mayor, el contacto directo entre

animales es alto, lo que aumenta la facilidad de infección de un animal sano por parte de uno

infectado, la intervención del veterinario en diferentes procesos quirúrgicos y de sanidad en hatos

lecheros también es mayor en ganaderías lecheras que en ganaderías de carne las cuales en su

mayoría son producciones extensivas; por tanto la prevalencia en hatos lecheros es mayor que en

hatos especializados en carne, donde se alcanza una prevalencia apenas del 7 % (Cadavid., 2012).

Tabla 1: Distribución de muestras procesadas y porcentaje de positividad a Leucosis Viral Bovina,

por departamento y número de municipios que enviaron muestras. Colombia 2005 – 2009 (Cadavid

G. 2012).

DEPARTAMENTO LEUCOSIS MUNICIPIOS QUE

ENVIARON MUESTRAS % MUESTRAS POSITIVO

S %

Antioquia 46 37 2.122 591 28

Arauca 4 57 113 2 2

Atlántico 6 26 201 33 16

Bolivar 2 4 4 1 25

Boyacá 20 16 376 171 45

Caldas 14 52 618 224 36

Caquetá 11 69 189 15 8

Casanare 4 21 17 5 29

17

Cauca 8 20 78 46 59

Cesar 16 64 7.099 778 11

Córdoba 11 39 1.400 668 48

Cundinamarca 44 38 1.543 480 31

Guaviare 0 0 0 0 0

Huila 7 19 113 47 42

La Guajira 0 0 0 0 0

Magdalena 3 10 10 0 0

Meta 16 55 171 42 25

Nariño 6 9 111 35 32

Norte de santander 9 23 253 28 11

Putumayo 4 31 171 73 43

Quindio 10 83 1.249 397 32

Risaralda 9 64 494 125 25

Santander 26 30 1.052 342 33

Sucre 3 12 102 47 46

Tolima 12 26 112 35 31

Valle del Cauca 33 79 3.310 1.056 32

Vichada 1 25 2 0 0

TOTAL 325 31 20.910 5.241 25

(Cadavid G., 2012).

2.9 Impacto Económico

La LBE causa disminuciones en la producción, así lo demuestra un estudio realizado en

lecherías especializadas donde se presentaba la patología. En estas ganaderías se observó una

disminución en la producción del 2.5% al 3% en la totalidad del ordeño y un aumento en las

pérdidas selectivas, como también se logró demostrar que aumentaba la susceptibilidad a la

presentación de otras enfermedades del origen infeccioso tales como mastitis, neumonía y diarrea

(OIE., 2004).

Las pérdidas económicas ocasionadas por la LBE aumentan por la mortalidad causada por

la patología tumoral, la alteración del sistema inmune del ganado afectado y restricciones para la

exportación de semen, embriones y ganado en pie de animales que padecen la patología (Rama,

2009). Otras perdidas económicas de gran importancia en que se incurre por la presentación es la

inversión que requiere para realizar un correcto diagnóstico, y la pérdida de canales que llegan a

matadero (DiGiacomo., 1992).

18

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 Población

Corresponde a bovinos de raza Holstein. Se seleccionaron hembras de edades entre 3 a 11

años, completamente al azar; estas edades se determinaron teniendo en cuenta que es la edad

estimada como productiva para la raza y el rango etario con mayor presentación de LBE. Los

animales fueron seleccionados en una finca del municipio de Sibaté, dedicada a la producción

especializada en leche, donde según la literatura se encuentra mayor prevalencia de la enfermedad.

La finca seleccionada para este estudio, cuentan con producción de leche por animales de

raza Holstein de alta producción. La finca cuenta con ordeño mecánico, higiene adecuada dentro del

ordeño y buenas prácticas de ordeño; los animales se encuentran en pastoreo, en praderas con Ray

Grass Italiano y Pasto Kikuyo y a la hora del ordeño son suplementados con concentrado y papa

picada. En esta finca se realizan dos (2) ordeños al día, siendo realizados a las 3 A.M. y a las 3

P.M. Los animales seleccionados no poseían signos clínicos aparentes para la enfermedad en el

momento de la toma de las muestras.

3.2 Muestra

El cálculo de la muestra se realiza con base en la totalidad de la población presente en el

sistema productivo, la cual corresponde a 59 bovinos. De acuerdo con lo anterior se estimó el

número de ejemplares para estudio, según la fórmula matemática:

Dónde:

n = número de animales para construir la muestra representativa de estudio

k = constante dependiente del nivel de confianza (nivel de confianza del 90%) k = 1,65

19

p = proporción de individuos que tiene la característica en estudio (animales seropositivos y con

presencia del virus de LBE) 50% de la población (0.5)

q = proporción de individuos que no tiene la característica en estudio (animales seropositivos y con

presencia del virus de LBE) 50% de la población (0.5)

e = error muestral deseado del 5%

Así:

N = 61

K = 1,65

e = 5

p = 0,5

q = 0,5

En este sentido el número de animales para la obtención de resultados estadísticamente

significativos correspondió a 50. Estudios similares en la detección del virus de la leucosis estiman

una muestra similar a la del presente trabajo de investigación (Betancur & Rodas 2008; Hernández-

Herrera, Posso-Terranova, Benavides, et al., 2011; Úsuga-Monroy, Echeverri, & López-Herrera,

2015)

La muestra para detección de anticuerpos, virus y linfocitos fue de tipo biológica y

correspondió a sangre, la cual se obtuvo por punción de la vena coccígea, teniendo en cuenta el

procedimiento establecido por (Nava et al 2011). El procedimiento consistió en realizar una

limpieza antiséptica en la región ventral de las primeras vértebras coccígeas, para posteriormente

ingresar a la luz del vaso sanguíneo con un Vacutainer® calibre 21, estando en la luz del vaso se

procedió a recolectar las muestras en 2 tubos tapa lila para las muestras de hemograma y PCR, y en

un tubo tapa roja para el procedimiento de ELISA.

3.3 Procedimientos realizados

3.3.1 Cuadro hemático

20

Para llevar a cabo el cuadro hemático, se tomó una muestra de sangre en tubo tapa lila con

anticoagulante (EDTA), cada una de las muestras iba siendo depositada en la cava de transporte con

pilas de gel refrigerado a 4 grados centígrados para así el mismo día ser almacenadas en nevera a 4

grados centígrados. Al día siguiente a la toma de las muestras fueron llevadas al laboratorio donde

fueron procesadas y se obtuvieron los resultados correspondientes.

La importancia de realizar el cuadro hemático, radica en la posibilidad de establecer la

cantidad de leucocitos, y específicamente de linfocitos. Para relacionar estas células con la

enfermedad es necesario realizar el recuento celular que consiste en determinar la cantidad de

células linfoides en sangre por unidad de volumen microlitro (μL), milímetro cúbico (mm3) o litro

(L). Teniendo en cuenta lo anterior se obtienen resultados del conteo de leucocitos para cada

individuo, en valores de cantidad de leucocitos por microlitro de sangre (leu/μL), se utilizaron

valores de referencia para la especie y grupo etario de 4.000 a 12.000 leucocitos/microlitro; luego se

realiza el recuento diferencial o porcentual de cada línea leucocitaria y de esta manera la

determinación total de los linfocitos, con la siguiente ecuación:

Cantidad de leucocitos x % linfocitos / 100 = X

3.3.2 Elisa de bloqueo

Para el diagnóstico de LBE se tomaron muestras de sangre de vena coccígea según el

procedimiento en el numeral 3.2. Las muestras fueron recolectadas en tubos tapa roja; para obtener

suero sanguíneo con mayor facilidad, las muestras se refrigeraron a una temperatura de 4°C en una

cava para posteriormente llevarlas al laboratorio el mismo día del muestreo para realizar la prueba

de Elisa de bloqueo, donde se realizó la técnica de ELISA de bloqueo a cada una de las muestras y

se obtienen los resultados de Positivo o Negativo según corresponda para cada muestra.

21

La Elisa de bloqueo es una prueba serológica útil para el diagnóstico de diferentes

enfermedades mediante el uso de anticuerpo antígenos, la técnica de ELISA se basa en el uso de

anticuerpos o antígenos marcados con una enzima, así los conjugados resultantes tengan actividad

tanto inmunológica como enzimática. Marcado uno de los dos componentes antígeno o anticuerpo,

con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-

anticuerpo quedará inmovilizada, de esta forma será fácilmente revelada mediante la adición de un

substrato especifico que al actuar la enzima producirá un cambio color observable a simple vista o

cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.

La prueba consta de las siguientes etapas:

Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a detectar.

Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.

Adición de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma

que si está presente el agente patógeno de diagnóstico (antígeno), reaccionará

específicamente con los anticuerpos fijados al soporte.

Lavado para eliminar los antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no

fijados.

Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo diferente

de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima, los

cuales reaccionan con los antígenos añadidos con la muestra problema y que se encuentran

fijados a los anticuerpos.

Lavado para eliminar los anticuerpos marcados sin reacción.

Adición del substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede

detener la reacción en este punto si se desea.

Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

22

3.3.3 Reacción en cadena de la polimerasa PCR

PCR Anidada

Para la extracción de ARN se utilizó el kit de extracción comercial RNeasy Mini Kit® de

laboratorios Qiagen®; el ARN de la muestra fue recuperado a partir de 200 µl de sangre entera

siguiendo las indicaciones del fabricante y almacenado a -70 °C. Para la primera reacción se utilizó

un volumen final de 25 µl teniendo en cuenta el siguiente protocolo: 2.5 µl de primer externo con

oligonucleótidos (F-TCTGTGCCAAGTCTCCCAGATA y R-

AACAACAACCTCTGGGAAGGGT), 12.5 µl de Dream Taq Green PCR master mix (2x), 2 µl

DNAc y 8 µl de agua libre de DNAasas, la PCR se realizó en un termociclador Bio Rad C1000TM

Thermal Cycler ® utilizando el siguiente perfil térmico: 5 minutos a 94 °C, seguido de 35 ciclos de

30 segundos a 94 °C, 60 segundos a 59.3 °C y 60 segundos a 72°C seguido de 1 ciclo de 10 minutos

a 72°C.

En la segunda reacción se utilizó como DNA 2 μl del producto resultante de la PCR de la primera

amplificación, las mismas concentraciones de los demás reactivos y los oligonucleótidos (F-

CCCACAAGGGCGGCGCCGGTTT y R-GCGAGGCCGGGTCCAGAGCTGG). Posteriormente

se realiza el siguiente perfil térmico: 2 minutos a 95 °C, seguido de 36 ciclos de 30 segundos a 95

°C, 30 segundos a 56 °C y 30 segundos a 72°C seguido de 1 ciclo de 5 minutos a 72°C. Los

productos obtenidos se llevaron a realizar electroforesis en BIO-RAD PowerPac ® HV y el

resultado fue visualizado en gel de agarosa al 1,5 % en TBE y teñidos con SYBR Green.

23

3.4 Procedimiento estadístico

Con los resultados obtenidos para cuadro hemático, PCR y la prueba de Elisa se realizó

estadística descriptiva de modo que fue posible la obtención de media, moda y desviación estándar

para los datos igualmente se realizaron gráficas de acuerdo a las metodologías descritas por Villegas

(2015), así mismo se realizó la prueba t de student de acuerdo al procedimiento referenciado por

Martinez y Martinez (1997), para identificar la correlación de los resultados obtenidos para

linfocitos, y los positivos obtenidos por las pruebas de PCR y ELISA

24

4. RESULTADOS

A continuación se muestran los resultados obtenidos para las pruebas de Cuadro hemático,

ELISA de bloqueo y PCR, que permiten dar análisis y discusión de lo obtenido con relación a otros

resultados reportados en la literatura para la enfermedad.

Resultados del cuadro hemático: de la prueba de conteo celular es posible mencionar que el

promedio de conteo de glóbulos blancos para la muestra utilizada es de 13371,6 Leu/ µl, el

número promedio de linfocitos es de 7895,46 Linf/ µl. Los resultados de cuadro hemático también

nos arrojan valores a tener en cuenta como el promedio de Hematocrito para los 50 animales

muestreados que corresponde a 34,34 %, un promedio de hemoglobina de 10,53 g/dl, un recuento

de glóbulos rojos promedio de 7,25 x 106/µl y un recuento de plaquetas promedio de 185,25 x10

3/

µl, valores que concuerdan con los reportados por Villegas V (2015).

El conteo de linfocitos para cada animal según el coeficiente de correlación t de student, se

relaciona con el resultado de la prueba de Elisa de bloqueo, puesto que 11 de los 12 animales

positivos a ELISA (91,66 %) presentan valores por encima de los parámetros normales, mientras

que 1 de los 12 animales positivos, que corresponde a un 8,33% siendo seropositivo, presenta

conteo de linfocitos dentro de los valores normales para este grupo etario.

Resultados ELISA de bloqueo: Teniendo en cuenta los resultados obtenidos mediante la técnica

ELISA de bloqueo, podemos decir que la presencia de la enfermedad en la muestra del presente

estudio corresponde al 24% lo anterior de acuerdo con la fórmula utilizada por Villegas V. (2015)

que corresponde a prevelencia = número de casos existentes/número total de población * 100; de

esta manera de acuerdo a lo obtenido la prevalencia en el sistema productivo analizado es 24% en

tanto, prevalencia puntual = 12/50 * 100 = 24.

25

Figura 5: Seroprevalencia de la Leucosis Bovina Enzootica en una finca en Sibaté.

Figura 6: Conteo de linfocitos en animales seropositivos

De los animales seropositivos (12), 11 (91,66%) presentan conteo de linfocitos por encima

del rango normal teniendo en cuenta los parámetros establecidos por el laboratorio para esta zona y

grupo etario (4.000-12.000 leu/µl de los cuales los linfocitos deben ser 45-75%).

De los animales seropositivos, 1 (8,33 %) presentan conteo de los linfocitos establecidos

como normales para animales de este grupo etario.

En cuanto a los resultados para la prueba de PCR anidada que se realizó, se obtienen 7

animales positivos, que corresponde al 14 %, estos 7 animales encontrados positivos con PCR

también son positivos a la técnica de ELISA de bloqueo, por lo cual se confirma el diagnóstico para

estos animales.

24%

76%

SEROPOSITIVOS (elisa de bloqueo)

positivos

negativos

92%

8%

ANIMALES SEROPOSITIVOS (12)

Linfocitos por

encima del valor

de referencia

26

Figura 7: Producto del PCR amplificado. carril 1: Marcador de peso molecular 100 bp; carril 2:

animal negativo a la presencia del provirus; carril 3: animal positivo a la presencia del provirus;

carril 4: animal negativo a la presencia del provirus; carril 5: animal positivo a la presencia del

provirus; carril 6: animal negativo a la presencia del provirus; carril 7: animal positivo a la

presencia del provirus; carriles 8 y 9: animales negativos a la presencia del provirus; carriles 10 al

13: animales positivos a la presencia del provirus; carril 14: control negativo; carril 15: control

positivo.

Figura 8: Prevalencia de PCR para Leucosis Bovina Enzoótica

14%

86%

PCR ANIDADA

POSITIVOS NEGATIVOS

27

Figura 9: Comparación resultados ELISA de bloqueo contra resultados PCR anidada.

12 7

38 43

ELISA PCR

ELISA VS PCR

POSITIVOS NEGATIVOS

28

5. DISCUSION

El presente estudio evaluó el uso de un método de PCR anidado, el método de ELISA de

bloqueo y conteo de linfocitos como prueba indirecta para la detección del Virus de la Leucosis

Bovina Enzoótica en una finca lechera en el municipio de Sibaté Cundinamarca. De acuerdo a

nuestros resultados, la técnica de ELISA de bloqueo en suero detectó un mayor número de

animales positivos (10%) con respecto a la técnica de PCR anidada en sangre. Todas las muestras

negativas a ELISA de bloqueo en suero, fueron también negativas a PCR, Sin embargo, cinco (5)

muestras negativas a PCR fueron positivas a ELISA de bloqueo, situación que de acuerdo a Felmer

(2006) se podría explicar por la ausencia del provirus en linfocitos sanguíneos, una infección

restringida a órganos linfoides o algunas variaciones de la secuencia nucleotídica de algunos

aislados del virus, que podrían inducir a errores en la hibridación de los oligonucleótidos utilizados

como cebadores, disminuyendo consecuentemente la sensibilidad del PCR.

Este estudio detectó la presencia de anticuerpos específicos contra Leucosis Bovina

Enzoótica en 12 de los 50 animales objeto de estudio, lo que corresponde a un 24%, por la técnica

de ELISA de bloqueo, mientras que la técnica de PCR anidada arrojo que 7 de los 50 animales

objeto de estudio son positivos lo que corresponde a un 14 % de presencia del virus. El conteo total

de linfocitos realizado mediante el cuadro hemático para cada uno de los animales, esta aumentado

en 11 de los 12 animales positivos con la técnica de Elisa de bloqueo, que corresponde a un 91.66

%, situación concordante al estudio realizado por Gonzalo Rama en el 2011 donde indica que el

66% de los animales seropositivos por ELISA indirecta presentan niveles superiores de linfocitos a

los establecidos para la especie, pero que a su vez difiere con el estudio realizado por Villegas 2015

donde encontró que solo el 28% de los animales positivos a Elisa indirecta presentaban aumento en

el conteo de linfocitos para ese grupo etario, teniendo en cuenta que la OIE estima como linfocitosis

persistente al aumento en el número total de linfocitos de 3 o más desviaciones estándar para una

grupo etario especifico (Villegas, 2015).

29

De los animales negativos para la prueba de Elisa de Bloqueo (38), el 36,84 %

correspondiente a 14 animales, presenta un aumento en el conteo de leucocitos determinados como

normales por el laboratorio para este grupo etario, situación que se puede atribuir a la presencia de

otra enfermedad viral (Herr et al.,2011; Meikle et al.,2012). De igual manera el promedio arrojado

por la estadística descriptiva para el numero de linfocitos es de 7895,96 Linf/ µl situación que está

en el límite del máximo permitido como normal para esta raza y grupo etario, esto pudiéndose

atribuir a que algunos de los animales positivos a Elisa y a PCR anidada presentan un aumento del

conteo de linfocitos de hasta 23.454 Linf/ µl lo que aumenta el promedio general para el grupo

objeto de estudio.

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, este estudio concuerda con algunos autores tanto

nacionales como internacionales donde la presencia de LBE por las técnicas de ELISA es similar en

algunos países como por ejemplo: en Canadá y Turkía del 23%, Brasil del 28,7 al 52 %, Estados

Unidos de América 23% de los animales y 69,6% de los hatos, Costa Rica 18,4 de los animales y

51 % de los hatos, Israel 25 % (Cadavid G, 2012).

En la sabana de Bogotá, los primeros estudios epidemiológicos determinaron una prevalencia

serológica de 36,4 + o - 5,2% en 1980 (Cadavid G., 2012); posteriormente en 1982 (Parra et al.,

1982) reportaron una prevalencia de 25,9% para la zona Andina. Teniendo en cuenta estos estudios

se encontraron prevalencias en ganado de leche de 24.9 % para la región Andina, 14.4 % para la

región Caribe y 15.3 % para el Piedemonte Llanero (Romero et al. 1999), datos que concuerdan con

este estudio. Así mismo la Federación Colombiana de Ganaderos entre los años 2005 y 2009 realizó

una recopilación de todos los datos de LBE de todo el país, encontraron que los laboratorios del

ICA y otros de referencia reportan una prevalencia del 25% en un total de 20.910 muestras

procesadas en búsqueda de la enfermedad y su prevalencia en todo el país, situación que similar

con el 24% de seroprevalencia reportado en este estudio.

30

De otra parte estudios más recientes difieren un poco de éste puesto que presentaron resultados de

entre el 50 y hasta el 90 % de presencia de la enfermedad, ya sea por técnicas serológicas y/o

moleculares; de esta manera (Villegas , 2015) reporta una prevalencia del 64% en una finca lechera

del municipio de Ubaté Cundinamarca, estudio realizado con la técnica de Elisa indirecta y donde

para dicho estudio también se realiza conteo de linfocitos que según resultados reportados por el

autor no se relaciona la linfocitosis persistente con la seropositividad, circunstancia que también

difiere de este estudio; En otro estudio realizado en Santander para ganado lechero se reporta una

seroprevalencia del 73% con una población estudio de 360 animales (Carrero. R, Arévalo M,

Tarazona y Cepeda., 2008); en el año 2012 (Cadavid G. 2012) señala una prevalencia de 77,8%

utilizando la técnica de PCR anidada en 9 hatos de lechería especializada y con 194 animales en

estudio en el departamento de Córdoba; más recientemente en el año 2016 en una investigación

realizada por conglomerados con detección molecular (Meza B, Sanjuanelo C, Gallego M, 2016)

reportan una presencia del virus de 22,6%; identificando para la zona centro (Cundinamarca y

Boyacá) una presencia del virus de 50,7% donde los animales muestreados son de especialidad

lechera, mientras que para la zona sur en los departamentos del Huila y Tolima se reportó un 5,1%

de presencia del virus de animales de producción de carne. Teniendo en cuenta estos datos es

posible identificar una tendencia al aumento de la prevalencia y presencia del virus en

explotaciones ganaderas especializadas en leche, tanto de la zona de influencia de este estudio como

para el resto del país. Diferentes estudios revelan la alta presencia del virus en hatos destinados a la

producción de leche en comparación con los bajos porcentajes descritos para animales de afinidad

cárnica, situación que se atribuye en gran medida a las prácticas de manejo, puesto que en

ganaderías lecheras se facilita la transmisión entre animales clínicamente sanos, por diferentes

procesos tales como la alta y permanente manipulación por técnicos en el ordeño, incremento en los

procesos de diagnóstico necesarios dentro del hato tanto productivos como reproductivo y/o

clínicos, falta de higiene o precauciones al realizar inseminaciones, utilización de las mismas

agujas en varios bovinos, mal uso de guantes y demás elementos contaminados con sangre;

31

igualmente la producción intensiva en ganaderías lecheras y mayor contacto entre animales

favorece la propagación del virus por moscas e insectos hematófagos (Rama G, 2012; Cadavid G

2012; Villegas 2015). Cada una de estas acciones genera un efecto negativo en las ganaderías en

general, afectando no solo la producción de leche, sino también los índices reproductivos y el

favorecimiento de la presentación de enfermedades secundarias que conllevan a pérdidas

económicas y así la dificultad en el sostenimiento en las ganaderías especializadas (Murakami et

al., 2011; Betancur & Rodas, 2008; Visbal, 1997; Chamizo, 2005).

La baja presencia de LBE encontrada en este estudio (24% para Elisa y 14 % para PCR)

comparada con los resultados de otras investigaciones, donde se encuentran prevalencias de entre

el 50 al 80 % (Cadavid G, 2012; Villegas 2015; Meza B, Sanjuanelo C, Gallego M, 2016) dadas

para ganaderías especializadas en leche, se atribuye en gran medida a que la propietaria de la finca

es una Médica Veterinaria que conoce la enfermedad y entiende la importancia de poner en práctica

los métodos de prevención y control en su finca, como son un solo uso de las agujas desechables,

una manga de palpación por animal, la completa desinfección tanto de instalaciones como de

material de ordeño y quirúrgico, acompañando estos procesos con la capacitación a sus trabajadores

y operarios para de esta forma evitar la propagación descontrolada de la enfermedad, igualmente la

entrada de nuevos animales a la finca procedentes de otros hatos es controlada situación que

favorece el ingreso de animales portadores del virus.

Cabe mencionar que la dinámica de detección serológica de LBE puede ser alterada por diferente

procesos como lo son los periodos de gestación, específicamente el periparto (un mes antes y hasta

un mes después) este mecanismo se da porque durante las últimas semanas de gestación los

anticuerpos van con mayor proporción al calostro y puede existir una inmunodepresión en la

gestante, puesto que por un efecto depresor de la progesterona sobre la actividad linfocitaria dada

por la proteína inmunomoduladora conocida como PIBF o Factor Bloqueador Inducido por la

Progesterona, el cual es capaz de suprimir la diferenciación celular de linfocitos, de tal manera que

32

una prueba serológica de una animal positivo podría resultar negativa, así mismo las

concentraciones de células linfocitarias pueden estar disminuidas durante este mismo periodo; de

igual forma en terneros jóvenes menores de 6 meses, podemos encontrar animales serológicamente

positivos debido al calostro obtenido a través de la madre y que puede poseer lo anticuerpos para

generar un resultado falso positivo ( Cadavid G., 2012; Rama G., 2012; Villegas 2015; Meza B,

Sanjuanelo C, Gallego M, 2016).

33

6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

La presencia de Leucosis Bovina Enzoótica en una finca lechera del municipio de Sibaté

Cundinamarca es de 24% para la técnica de Elisa de Bloqueo y de 14 % para la técnica

molecular de PCR anidada.

El conteo de leucocitos y de linfocitos se puede relacionar directamente con la presentación de

la enfermedad puesto que, en este estudio, el 91,66% de los animales positivos presentaron

aumento en el conteo total de leucocitos y específicamente de linfocitos. Para comprobar esto,

se sugieren estudios que descarten otras causas de linfocitosis y/o se corrobore que es

persistente.

El resultado obtenido en este estudio de seropositividad 24% y 14 % para la técnica de PCR

anidada, determina una presencia baja de la infección, comparado con otros estudios en la zona

para ganaderías de leche, situación que puede estar determinada por el conocimiento de la

enfermedad por parte de la propietaria y de los operarios de la finca, de esta forma se evitan las

malas prácticas de manejo disminuyendo la transmisión de la enfermedad al interior de la

lechería. De acuerdo con los resultados obtenidos en este estudio, es necesario esclarecer, en

estudios posteriores, si se trata de falsos positivos por ELISA o de falsos negativos por PCR.

Es posible concluir que la técnica de Elisa resulta eficiente para el diagnóstico de LBE, la

técnicas moleculares como la PCR anidada al ser costosa puede resultar conveniente en ciertas

situaciones, donde la técnica de Elisa puede arrojar errores, como es el caso de terneros

menores de 6 meses puesto que con la técnica de Elisa pueden resultar falsos positivos debido

al consumo de calostro de una madre infectada, o el caso de vacas gestantes en el periodo de

periparto, que pueden resultar falsos negativos debido a la inmunodepresión que se genera. Por

esta razón, se recomienda este mismo tipo de estudios comparativos en vacas gestantes, para

establecer el porcentaje de posibles falsos negativos a ELISA en el periparto.

34

Se recomienda capacitar a los operarios de las fincas a cerca de la enfermedad para de esta

forma evitar las diferentes formas de transmisión y disminuir la presencia de la enfermedad en

las finca.

35

7. BIBLIOGRAFÍA

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43

8. ANEXOS

# ID ht Hb Leuco % Linf # linf

G. rojos x10"6/ul

Plaquet x10"3/ul S/N% ELISA PCR

1 525 34 10,2 9900 54 5346 6,86 260 3,8 POSITIVO NEGATIVO

2 462 32 9,6 12380 52 6438 7,82 160 86,9 NEGATIVO NEGATIVO

3 532 33 9,8 28640 75 21480 8,04 135 2 POSITIVO NEGATIVO

4 524 32 9,6 9920 49 4860 7,17 57 107 NEGATIVO NEGATIVO




8 1228 38 12 12080 74 8939 6,12 89 87,2 NEGATIVO NEGATIVO


10 395 34 10 8240 55 4532 6,43 181 94 NEGATIVO NEGATIVO













23 999 39 12 20700 59 12213 7,85 156 2 POSITIVO POSITIVO




27 490 38 12 11240 56 6294 6,82 268 90,4 NEGATIVO NEGATIVO

28 1255 37 11,1 21990 73 16052 8,18 119 4 POSITIVO POSITIVO



31 488 32 9,8 22340 54 12063 6,28 134 2,3 POSITIVO POSITIVO









44












ESTADISTICA REALIZADA

Statistix 8.0 datos leucosis, 30/10/2017,

8:13:53

Descriptive Statistics

Hematocri Hemoglobi globblan gr plaqueta

N 50 50 50 50 50

Mean 34.340 10.534 13372 7.2522 185.28

SD 2.6156 0.9138 5274.3 0.6572 68.216

Variance 6.8412 0.8349 2.782E+07 0.4320 4653.4

SE Mean 0.3699 0.1292 745.90 0.0929 9.6472

C.V. 7.6167 8.6743 39.444 9.0625 36.818

Minimum 28.000 9.2000 5930.0 6.1200 57.000

Maximum 40.000 12.700 30460 8.4400 431.00

porlin

N 50

Mean 57.420

SD 12.271

Variance 150.58

SE Mean 1.7354

C.V. 21.370

Minimum 27.000

Maximum 84.000


8:14:27

Descriptive Statistics for ELISA = NEGATIVO


N 38 38 38 38 38

Mean 34.421 10.587 11745 7.2961 188.26

SD 2.7864 0.9785 3426.9 0.6548 72.184

Variance 7.7639 0.9574 1.174E+07 0.4288 5210.5

45

SE Mean 0.4520 0.1587 555.92 0.1062 11.710

C.V. 8.0950 9.2423 29.178 8.9747 38.342

Minimum 28.000 9.2000 5930.0 6.1200 57.000

Maximum 40.000 12.700 21210 8.4400 431.00

porlin

N 38

Mean 53.263

SD 9.3076

Variance 86.632

SE Mean 1.5099

C.V. 17.475

Minimum 27.000

Maximum 74.000

Descriptive Statistics for ELISA = POSITIVO


N 12 12 12 12 12

Mean 34.083 10.367 18523 7.1133 175.83

SD 2.0652 0.6773 6806.0 0.6740 55.448

Variance 4.2652 0.4588 4.632E+07 0.4543 3074.5

SE Mean 0.5962 0.1955 1964.7 0.1946 16.007

C.V. 6.0593 6.5338 36.743 9.4754 31.535

Minimum 32.000 9.7000 9700.0 6.2400 96.000

Maximum 39.000 12.000 30460 8.1800 260.00

porlin

N 12

Mean 70.583

SD 11.429

Variance 130.63

SE Mean 3.2994

C.V. 16.193

Minimum 54.000

Maximum 84.000


8:15:21

Descriptive Statistics for PCR = NEGATIVO


N 43 43 43 43 43

Mean 34.279 10.523 12439 7.2560 187.19

SD 2.6577 0.9441 4381.3 0.6600 70.808

Variance 7.0631 0.8914 1.920E+07 0.4356 5013.8

SE Mean 0.4053 0.1440 668.14 0.1006 10.798

C.V. 7.7530 8.9717 35.223 9.0958 37.828

Minimum 28.000 9.2000 5930.0 6.1200 57.000

Maximum 40.000 12.700 28640 8.4400 431.00

porlin

N 43

Mean 55.535

46

SD 11.304

Variance 127.78

SE Mean 1.7238

C.V. 20.355

Minimum 27.000

Maximum 82.000

Descriptive Statistics for PCR = POSITIVO


N 7 7 7 7 7

Mean 34.714 10.600 19103 7.2286 173.57

SD 2.4976 0.7572 6946.5 0.6912 52.156

Variance 6.2381 0.5733 4.825E+07 0.4777 2720.3

SE Mean 0.9440 0.2862 2625.5 0.2612 19.713

C.V. 7.1948 7.1433 36.364 9.5620 30.049

Minimum 32.000 9.8000 9700.0 6.2800 119.00

Maximum 39.000 12.000 30460 8.1800 258.00

porlin

N 7

Mean 69.000

SD 12.383

Variance 153.33

SE Mean 4.6803

C.V. 17.946

Minimum 54.000

Maximum 84.000


8:16:46

Two-Sample T Tests for Hematocri by ELISA

ELISA Mean N SD SE

NEGATIVO 34.421 38 2.7864 0.4520

POSITIVO 34.083 12 2.0652 0.5962

Difference 0.3377

Null Hypothesis: difference = 0

Alternative Hyp: difference <> 0

95% CI for Difference

Assumption T DF P Lower Upper

Equal Variances 0.39 48 0.7008 -1.4190 2.0945

Unequal Variances 0.45 24.8 0.6556 -1.2036 1.8791

Test for Equality F DF P

of Variances 1.82 37,11 0.1439

Cases Included 50 Missing Cases 0

Two-Sample T Tests for Hemoglobi by ELISA

ELISA Mean N SD SE

47

NEGATIVO 10.587 38 0.9785 0.1587

POSITIVO 10.367 12 0.6773 0.1955

Difference 0.2202





Equal Variances 0.72 48 0.4725 -0.3912 0.8315



of Variances 2.09 37,11 0.0957


Two-Sample T Tests for globblan by ELISA

ELISA Mean N SD SE

NEGATIVO 11745 38 3426.9 555.92

POSITIVO 18523 12 6806.0 1964.7

Difference -6778.6





Equal Variances -4.62 48 0.0000 -9731.3 -3825.9

Unequal Variances -3.32 12.8 0.0056 -11197 -2360.7


of Variances 3.94 11,37 0.0008


Two-Sample T Tests for gr by ELISA

ELISA Mean N SD SE

NEGATIVO 7.2961 38 0.6548 0.1062

POSITIVO 7.1133 12 0.6740 0.1946

Difference 0.1827





Equal Variances 0.84 48 0.4067 -0.2562 0.6216



of Variances 1.06 11,37 0.4182


48

Two-Sample T Tests for numlif by ELISA

ELISA Mean N SD SE

NEGATIVO 6217.4 38 1961.4 318.19

POSITIVO 13209 12 5470.5 1579.2

Difference -6991.7





Equal Variances -6.74 48 0.0000 -9078.5 -4905.0



of Variances 7.78 11,37 0.0000


Two-Sample T Tests for plaqueta by ELISA

ELISA Mean N SD SE

NEGATIVO 188.26 38 72.184 11.710

POSITIVO 175.83 12 55.448 16.007

Difference 12.430





Equal Variances 0.55 48 0.5874 -33.316 58.176



of Variances 1.69 37,11 0.1755


Two-Sample T Tests for porlin by ELISA

ELISA Mean N SD SE

NEGATIVO 53.263 38 9.3076 1.5099

POSITIVO 70.583 12 11.429 3.2994

Difference -17.320





Equal Variances -5.32 48 0.0000 -23.868 -10.773

Unequal Variances -4.77 15.9 0.0002 -25.017 -9.6236


of Variances 1.51 11,37 0.1702

49



8:18:19

Two-Sample T Tests for Hematocri by PCR

PCR Mean N SD SE

NEGATIVO 34.279 43 2.6577 0.4053

POSITIVO 34.714 7 2.4976 0.9440

Difference -0.4352





Equal Variances -0.40 48 0.6875 -2.5971 1.7267

Unequal Variances -0.42 8.4 0.6825 -2.7859 1.9155


of Variances 1.13 42,6 0.4844


Two-Sample T Tests for Hemoglobi by PCR

PCR Mean N SD SE

NEGATIVO 10.523 43 0.9441 0.1440

POSITIVO 10.600 7 0.7572 0.2862

Difference -0.0767





Equal Variances -0.20 48 0.8392 -0.8330 0.6795

Unequal Variances -0.24 9.3 0.8159 -0.7975 0.6440


of Variances 1.55 42,6 0.3049


Two-Sample T Tests for globblan by PCR

PCR Mean N SD SE

NEGATIVO 12439 43 4381.3 668.14

POSITIVO 19103 7 6946.5 2625.5

Difference -6664.3





50

Equal Variances -3.42 48 0.0013 -10580 -2748.9



of Variances 2.51 6,42 0.0361


Two-Sample T Tests for gr by PCR

PCR Mean N SD SE

NEGATIVO 7.2560 43 0.6600 0.1006

POSITIVO 7.2286 7 0.6912 0.2612

Difference 0.0275





Equal Variances 0.10 48 0.9196 -0.5166 0.5716



of Variances 1.10 6,42 0.3803


Two-Sample T Tests for numlif by PCR

PCR Mean N SD SE

NEGATIVO 7025.8 43 3452.7 526.54

POSITIVO 13238 7 5543.1 2095.1

Difference -6211.9





Equal Variances -4.03 48 0.0002 -9307.8 -3116.1



of Variances 2.58 6,42 0.0323


Two-Sample T Tests for plaqueta by PCR

PCR Mean N SD SE

NEGATIVO 187.19 43 70.808 10.798

POSITIVO 173.57 7 52.156 19.713

Difference 13.615


51




Equal Variances 0.49 48 0.6293 -42.728 69.957



of Variances 1.84 42,6 0.2272


Two-Sample T Tests for porlin by PCR

PCR Mean N SD SE

NEGATIVO 55.535 43 11.304 1.7238

POSITIVO 69.000 7 12.383 4.6803

Difference -13.465





Equal Variances -2.89 48 0.0058 -22.843 -4.0868

Unequal Variances -2.70 7.7 0.0280 -25.040 -1.8901


of Variances 1.20 6,42 0.3252


PCR

Detección molecular y serológica del virus de la leucosis ...

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