Deteccion de Antigenos Virales

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Detección de antígenos virales RICARDO PEREZ ESPADA NICKY LOZANO

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la detecion de antigenos mediante la ifd y la ifi

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Deteccion de antigenos virales

Deteccin de antgenos virales

RICARDO PEREZ ESPADANICKY LOZANO

Tcnicas inmunolgicasInmunofluorescencia directa

Es una tcnica mas antigua y de uso mas difundido en el laboratorio clnico

La Muestras clnicas apropiadas son recolectadas y colocadas sobre portaobjetos donde se dejan secas y fijar

Luego se agregan AC especficos marcados con isotiacianato de fluorescena (FITC ) que difunde a travs de la membrana celular y se combinan con los antgenos vricos en el interior de las clulas La reaccin AG AC se visualiza con el microscopio de fluorescencia . por la aparicin de fluorescencia de color verde

Test de aglutinacinEl test de aglutinacin es un mtodo simple de un solo paso que a veces se usa para la deteccin de antgenos virales en muestras clnicas Los ensayos de aglutinacin ,dependen de la fijacin inicial de anticuerpo antivirales especficos sobre eritrocitos o partculas de ltex

Estas pruebas en general se complementan o se confirman por medios de otros ensayos debidos al elevado porcentaje de reacciones inespecficas . El test de aglutinacin ha sido usado para detectar antgenos de rabtorivus en heces y adenovirus

Radioinmunoensayo (RIA)Fue originalmente aplicado para identificar en antgeno de superficie de la hepatitis B Este ensayo tiene buena sensibilidad y especificidad

ENZIMOINMUNOANALISISLa EIA para la deteccin de antgeno se basa habitualmente en la captura del antgeno por anticuerpos especficos unidos a una fase solida

EL AG viral se detecta mediante la adicin de otro AC especifico conjugado a una enzima ELISAEnzyme-Liked Immunosorbent Assay Anlisis de inmunoabsorcin enzimtica: determinacin de un antgeno o anticuerpo, por medio de una molcula indicadora, la cual se encuentra unida de forma covalentemente a una enzima.11INTRODUCCIN:El mtodo ELISA, se basa en el uso de Ags o Acs marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica como enzimtica.

Al estar uno de los componentes (Ag o Ac) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte o pocillo (inmunoadsorbente) la reaccin Ag-Ac quedar inmovilizada y, por tanto, ser fcilmente revelada mediante la adicin de un substrato especifico que al actuar, la enzima producir un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotmetro o un colormetro.TIPOS:ELISA no competitivo:Consiste en enfrentar la muestra con el Ag o Ac que est en la fase slida. Si una muestra es positiva se formar el complejo Ag-Ac, y al agregar el conjugado reaccionar con el respectivo sustrato desarrollando color.Directo: Detectan AgIndirecto: Detectan AcELISA SandwichDoble (DAS)Heterlogo (HADAS)ELISA competitivo:El Ac de la muestra va a competir con el conjugado por un nmero limitado de sitios de unin del Ag. Habr ausencia de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrar a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el Ac presente en la muestra.

Pasos generalesTapizado del pocillo con el Ag o Ac.Adicin de la muestra problema con la mezcla de Ags o Acs.Unin del Ag o Ac especfico al Ag o Ac tapizado en el pocillo.Lavado del pocillo para eliminar el exceso de Ag o Ac no unido.Adicin del Ac secundario marcado con la enzima.Unin del Ac secundario al Ag o Ac.Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida.Adicin del sustrato.Unin del sustrato a la enzima.Coloracin.

El primero es el ELISA directo, seguido del indirectoELISA directoConsta de las siguientes etapas: Fijacin al soporte insoluble (tapizado) de Acs especficos.

Lavado con solucin salinaTween 20 como agente tensioactivo (ph-7,2) para eliminar los Acs fijados deficientemente o no fijados. Adicin de Ags marcados (conjugados) con una enzima; si los Acs reaccionan con los Ags, el complejo quedar solubilizado.

Lavado para eliminar los Ags marcados que no hayan reaccionado.

ELISA directoAdicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora.

Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.

Los lectores ELISA se llaman espectrofmetros!!

ELISA indirectoConsta de las siguientes etapas: Fijacin al soporte insoluble (tapizado) de Ags especficos.

Lavado con solucin salina Tween 20 como agente tensioactivo (ph-7,2) para eliminar los Ags fijados deficientemente o no fijados. Adicin de Acs marcados (conjugados) con una enzima; si los Acs reaccionan con los Ags, el complejo quedar solubilizado.

Lavado para eliminar los Acs marcados que no hayan reaccionado.

ELISA indirectoAdicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora.

Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.

ELISA indirecto

Por si no les ha quedado claro

LECTURA E INTERPRETACIN DE RESULTADOS:Una de las grandes ventajas de la tcnica ELISA es la posible automatizacin de la lectura y, por lo tanto, su objetividad. Dicha automatizacin se puede conseguir con un simple colormetro o espectrofotmetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automtica de microplacas.

Los resultados finales de la lectura colorimtrica se reflejan numricamente mediante valores de absorbancia o densidad ptica que se obtendrn a la longitud de onda ms adecuada para la coloracin final alcanzada.

APLICACIONES CLNICAS:Enfermedades producidas por parsitosToxoplasmosis, Triquinosis, TripanosomasEnfermedades producidas por Micoplasmas Enfermedades producidas por bacteriasMycobacterium tuberculosis, brucelas, Estreptococos, SalmonelasEnfermedades producidas por virusEnfermedad de Newcastle, Peste porcina, Rotavirus, artritis vrica, Leucemia felinaOtras aplicaciones Hormonas (GCH, Progesterona, Testosterona..)Cuantificacin de inmunoglobulinas (IgG, IgE, IgA)Inmunopatologa (Ac anti-DNA, Factor reumatoide, Inmunocomplejos circulantes)