DETECCIÓN DE LEPTOSPIRA PATÓGENA EN...
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I DETECCIÓN DE LEPTOSPIRA PATÓGENA EN ORINA DE PACIENTES CRÓNICOS Y PERROS MEDIANTE PCR EN EL VALLE DEL CAUCA. ELIANA SÁNCHEZ ARTURO UNIVERSIDAD DEL VALLE FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS PROGRAMA ACADEMICO DE BIOLOGÍA SANTIAGO DE CALI 2011
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DETECCIÓN DE LEPTOSPIRA PATÓGENA EN ORINA DE PACIENTES CRÓNICOS Y PERROS MEDIANTE PCR EN EL VALLE DEL CAUCA.
ELIANA SÁNCHEZ ARTURO
UNIVERSIDAD DEL VALLE FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS
PROGRAMA ACADEMICO DE BIOLOGÍA SANTIAGO DE CALI
2011
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DETECCIÓN DE LEPTOSPIRA PATÓGENA EN ORINA DE PACIENTES CRÓNICOS Y PERROS MEDIANTE PCR EN EL VALLE DEL CAUCA.
ELIANA SÁNCHEZ ARTURO
Trabajo de Grado presentado como
requisito Parcial para optar el título de Bióloga
Directora MYRIAN ASTUDILLO H.
Bacterióloga, MSc.
Co-Directora LUZ ANGELA MORENO L.
Bióloga
UNIVERSIDAD DEL VALLE FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS
PROGRAMA ACADEMICO DE BIOLOGÍA SANTIAGO DE CALI
2011
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UNIVERSIDAD DEL VALLE FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS
PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGÍA
AUTOR: ELIANA SÁNCHEZ ARTURO, 1979
TITULO: DETECCIÓN DE LEPTOSPIRA PATÓGENA EN ORINA DE PACIENTES CRÓNICOS Y PERROS MEDIANTE PCR EN EL VALLE DEL CAUCA.
TEMAS: Leptospira sp, PCR, diagnóstico
SANTIAGO DE CALI 2011
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DEDICATORIA
A mis Padres Lyda y Belisario, y a mi hermano Luis Fernando, Por todo su amor y apoyo.
A mi hijo, quien próximamente estará conmigo.
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AGRADECIMIENTOS A Dios, por ser el principal motor de mi vida, y mi mayor inspiración. A mis padres Lyda Esther y Belisario, por todo su amor, comprensión y confianza que depositaron en mí, y por acompañarme durante los momentos difíciles. A mi hermano Luis Fernando Sánchez, por todo su cariño y apoyo. A la Universidad del Valle, a sus profesores, y demás colaboradores de la institución. A la profesora Myriam Astudillo, por la gran oportunidad de realizar mi trabajo de grado en las instalaciones del laboratorio de Microbiología y por la confianza que me brindo para su culminación. A mi co-directora Luz Ángela Moreno, por compartir conmigo todos sus conocimientos, y por la gran asesoría y acompañamiento durante la fase experimental de mi trabajo de grado. A Leonor, Graciela, Luz Helena y Dorayne, por su colaboración. A mis amigos, Cesar y Ángela, por brindarme su amistad sincera durante la carrera y que hasta hoy ha perdurado.
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TABLA DE CONTENIDO
1. RESÚMEN……………….. ............................................................................... 1
2. INTRODUCCIÓN ............................................................................................ 2
3. MARCO TEÓRICO ......................................................................................... 5
3.1. TAXONOMÍA Y CLASIFICACIÓN ....................................................................... 5 3.2. CARACTERÍSTICAS GENERALES ................................................................... 5
3.3. ASPECTOS HISTÓRICOS ............................................................................... 6 3.4. EPIDEMIOLOGÍA DE LA INFECCIÓN ............................................................... 12 3.5. CUADRO CLÍNICO ....................................................................................... 13
3.5.1. Manifestaciones clínicas. .............................................................. 14 3.5.1.1. Forma ictérica. ........................................................................ 14
3.5.1.2. Forma anictérica. .................................................................... 15 3.6. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA Y PREVALENCIA .............................................. 16
3.7. PREVALENCIA ........................................................................................... 17 3.8. FACTORES DE VIRULENCIA ......................................................................... 19
3.8.1. Producción de toxinas. ................................................................. 19
3.8.2. Adherencia. .................................................................................... 21 3.8.3. Proteínas de superficie. ................................................................ 21
3.8.4. Mecanismos inmunes. ................................................................... 22 3.9. DIAGNÓSTICO ........................................................................................... 23
3.9.1. Métodos de detección directos. ................................................... 23
3.9.2. Las que ponen en evidencia los anticuerpos producidos. ........ 23 3.9.3. Métodos Moleculares .................................................................... 26
4. OBJETIVOS……….. ......................................................................................28
4.1. GENERAL.................................................................................................. 28
4.2. ESPECÍFICOS ............................................................................................ 28
5. HIPÓTESIS………… ......................................................................................29
6. MATERIALES Y MÉTODOS .........................................................................30
6.1. UBICACIÓN ............................................................................................... 30 6.2. CARACTERIZACIÓN DE LA MUESTRA ............................................................ 30
6.3. CULTIVO DE MUESTRAS .............................................................................. 32 6.4. TINCIÓN DE LEPTOSPIRA: ........................................................................... 33 6.5. LÍMITE DE DETECCIÓN DE ADN DE LEPTOSPIRA .......................................... 33
6.5.1. Cuantificación de copias iniciales de ADN específico ............... 34 6.6. EXTRACCIÓN DE ADN ............................................................................... 34
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6.7. CUANTIFICACIÓN DEL ADN OBTENIDO ........................................................ 35
6.8. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Y ESPECIFICIDAD ............. 36 6.9. ELECTROFORESIS DE LOS PRODUCTOS DE PCR .......................................... 36
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................37
7.1. CULTIVO DE MUESTRAS .............................................................................. 37 7.1.1. Visualización directa de orina por campo oscuro ...................... 37
7.1.2. Urocultivos ..................................................................................... 38 7.1.3. Comparación entre los dos métodos: .......................................... 40
7.2. TINCIÓN DE LEPTOSPIRAS: ......................................................................... 42 7.2.1. Cuantificación de copias iniciales de ADN de Leptospira sp .... 43
7.3. EXTRACCIÓN DE ADN ............................................................................... 45 7.4. ESTANDARIZACIÓN DEL PCR ..................................................................... 47
7.4.1. Concentración de iniciadores ....................................................... 47 7.4.2. Concentración de Cloruro de Magnesio (MgCl2) ........................ 48
7.4.3. Concentración de enzima.............................................................. 48 7.4.4. Temperatura de hibridación .......................................................... 49 7.4.5. Amplificación de ADN ................................................................... 49
7.4.6. Especificidad .................................................................................. 50
7.5. RESULTADOS DE EVALUACIÓN DE PACIENTES POR PCR ............................... 51
8. CONCLUSIONES ..........................................................................................56
9. RECOMENDACIONES: .................................................................................58
10. LITERATURA CITADA: .................................................................................59
11. ABREVIATURAS ...........................................................................................66
12. ANEXOS…………….. ....................................................................................68
IX
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Micrografía electrónica de L. interrogans serovar icterohemorragie ........ 6
Figura 2: Observación de leptospiras en urocultivo de persona. Objetivo 40X ..... 39
Figura 3: Tinción de leptospiras con el colorante Giemsa ........................................ 42
Figura 4: Electroforesis en geles de agarosa al 2,5% teñido con bromuro de etidio de los productos de amplificación de las diluciones de L. cynopteri, empleando los iniciadores específicos Lepto F y Lepto R en muestras de orina. Carriles: 1) 100 bp ADN Ladder. 2) Control positivo (ADN extraído de cultivo puro de L. serovar cynopteri). 3) Control negativo (ADN extraído de cultivo de L. serovar patoc). 4) Blanco. 5 - 10) diluciones desde 10-1 hasta 10-6. ........................................................ 45
Figura 5: Corrido electroforético de la calidad de ADN de 12 muestras analizadas, extraídas con QIAamp DNA Mini Kit. ............................................................................ 47
Figura 6: Electroforesis en geles de agarosa al 2,5% teñido con bromuro de etidio de los productos de amplificación de Leptospira patógena. Carriles: 1) 100 bp ADN Ladder. 2) Control positivo. 3) Control negativo. 4) L. autumnalis. 5) L. bataviae. 6) L. bratislava. 7) L. canicola. 8) L. cynopteri. 9) L. copenhageni. 10) L. grippotyphosa. 11) L. mini. 12) L. shermani ................................................................. 51
Figura 7: Electroforesis en geles de agarosa al 2,5% teñido con bromuro de etidio de los productos de amplificación de 6 muestras positivas de Leptospira patógena en muestras de orina. Carriles: 1) 100 bp ADN Ladder. 2) Control positivo (L. interrogans serovar cynopteri). 3) Control negativo (L. biflexa serovar patoc). 4-9) Muestras positivas de personas y perros). 10) Blanco............................................... 53
X
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Especies y serovares de Leptospira utilizadas como controles positivos y negativos para los ensayos. ............................................................................................ 31
Tabla 2. Comparación de muestras positivas y negativas de los métodos de Visualización directa de orina por campo oscuro y Urocultivo .................................. 40
Tabla 3. Cálculo de la concentración del ADN utilizado en cada dilución y el Número de copias iniciales del genoma por dilución .................................................. 44
Tabla 4. Cuantificación de ADN extraído de 9 serovares de L. interrogas y 7 cepas utilizadas como controles negativos. ............................................................................. 46
Tabla 5: Resultados positivos y negativos por PCR de las muestras analizadas de personas y perros. ............................................................................................................ 52
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1. RESÚMEN
La leptospirosis es una enfermedad de distribución mundial. En Colombia,
diversos autores han reportado prevalencias de diferentes serovares de Leptospira
sp patógena tanto en humanos como en animales domésticos. El diagnóstico de
esta enfermedad se realiza por pruebas serológicas (MAT). La técnica molecular
mediante PCR ha sido desarrollada para la detección de microorganismos
patógenos de importancia clínica, tal como es el caso de la Leptospira sp,
ofreciendo diagnósticos más acertados dadas sus condiciones de sensibilidad y
especificidad. Por esta razón, se estandarizó la metodología de PCR para la
detección de Leptospira sp patógena utilizando 40 muestras de orina de personas
con leptospirosis confirmada por medio del MAT entre dos años y dos meses
antes del estudio, y de 25 muestras de orina provenientes de perros con o sin
sospecha de Leptospirosis. Inicialmente, se realizó una visualización directa de las
muestras de orina en microscopia de campo oscuro, sin obtener resultados
positivos. Se obtuvieron urocultivos, de las muestras de orina inoculadas en medio
EMJH y Stuart modificado, logrando detectar Leptospira sp solamente en 2
urocultivos de personas. En contraste, con la metodología por PCR, se logró
detectar el 12,5% (5/40) muestras positivas y 4% (1/25) de muestras de orina de
perros. También se observó una especificidad del 100% al obtener bandas de
amplificación de 9 serovares de L. interrogas (Leptospira sp patógena). Se
concluyó que la metodología por PCR logró la diferenciación entre Leptospira sp
patógena y no patógena y la detección de leptospirosis en personas considerados
como crónicos y en perros con o sin sospecha de Leptospirosis.
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2. INTRODUCCIÓN
La leptospirosis es una enfermedad de distribución mundial causada por una
espiroqueta perteneciente al género Leptospira, capaz de infectar cualquier
mamífero doméstico o silvestre, en especial perros, gatos, cerdos, caballos, ratas
y humanos (Bharti & Nally 2003). Se estima que esta zoonosis puede afectar a
diez millones de humanos anualmente con un 5-25% de casos fatales (Cachay &
Vinetz 2005). Este microorganismo se difunde principalmente a través de la orina
de los animales infectados y la transmisión hacia otros animales y personas
ocurre por el contacto con el agua, suelo o vegetación contaminada con orina de
animales que son hospederos de Leptospira sp patógena. El mecanismo de
contagio es a través de las mucosas de la piel o por ingestión y se replica en
muchos tejidos tales como riñón, hígado, pulmón, ojos y el sistema nervioso
central (Levett 2001).
Un gran porcentaje de personas infectadas se relaciona con labores de
agricultura en zonas rurales debido al contacto directo con animales o agua
contaminada. Las regiones que presentan clima tropical, con regímenes lluviosos
en determinadas épocas del año, los diferentes fluviales naturales y artificiales
han favorecido la propagación de la enfermedad (Ganoza et al 2006).
La leptospirosis presenta un cuadro clínico asociado a fiebre alta y compromete el
normal funcionamiento de órganos; es así como puede confundirse con otras
enfermedades que presentan síntomas similares como fiebre amarilla, influenza,
paludismo, hepatitis, dengue, etc. De aquí la importancia de un correcto
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diagnóstico de manera temprana con el fin de brindar un tratamiento adecuado
(Agudelo 2005).
Para la detección de Leptospira sp se han diseñado diversas técnicas directas
(microscopio de campo oscuro, contraste de fases e inmunofluorescencia) las
cuales son poco sensibles, necesitan cargas altas de celulas/mL, y son
potencialmente peligrosas. Las técnicas indirectas como el ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), técnica de aglutinación de
microcápsula (MCAT) y microaglutinación (MAT) requieren de mucho tiempo,
pueden ser costosas y retrasan el diagnostico temprano de la enfermedad en su
fase aguda (Bajani et al 2003).
En la actualidad, el uso de herramientas moleculares como la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) se considera altamente sensible, específica y rápida. Por
lo anterior, es utilizada para la identificación y clasificación de microorganismos
mediante la amplificación de regiones conservadas de genes como los
ribosomales u otros especie-específicos.(Shukla 2003). En el caso de Leptospira
sp, tanto para patógenas como saprofitas, la amplificación de los genes 16S o
23S rRNA ha sido reportada en diversos estudios (Shukla op. cit., Kositanont et al
2006, Morey et al 2006), utilizando iniciadores diseñados para la detección de
algunas serovares de Leptospira sp, permitiendo la diferenciación entre las
especies, además de brindar una detección rápida de la bacteria en un estado
temprano de la infección y utilizando cantidades mínimas de DNA presente en
muestras de sangre, orina, humor acuoso o tejido de pacientes. Sin embargo, a
4
pesar de las múltiples ventajas de esta técnica, en Colombia aún es una práctica
poco rutinaria para el diagnostico de la Leptospirosis.
En este estudio se pretende estandarizar un método de PCR para detectar
Leptospira sp patógena empleando muestras de orina, para amplificar una región
específica del gen 16S.
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3. MARCO TEÓRICO
3.1. Taxonomía y clasificación
La Leptospira pertenece a familia Leptospiraceae, familia del orden Spirochaetale.
Se reconoce como único género dentro de la familia Leptospireceae al género
Leptospira; dentro del cual se incluyen tres especies: Leptospira interrogans,
Leptospira biflexa y Leptospira illini, esta última considerada de “estado
taxonómico incierto” aislada de un buey en Illione, EE.UU. (Johnson & Faine
1984). A partir de 1.994 se reconoce como género independiente el Leptonema.
De esta forma, la familia Leptospireceae está formada por dos géneros, Leptospira
y Leptonema. En los últimos años y gracias a la utilización de nuevas
herramientas y métodos de clasificación, se han reconocido varias especies del
género Leptospira (Kositanont 2006).
3.2. Características Generales
La Leptospira sp son espiroquetas de forma enrollada, delgadas y flexibles de 5 a
10 µm de longitud con espirales muy finas de 0.1 a 0.2 µm de ancho. A menudo
uno de los extremos del microorganismo se dobla para formar un gancho. La
movilidad es lograda por un par de filamentos axiales, uno en cada extremo
(Figura 1). Estas bacterias solo son visibles al microscopio de campo oscuro o de
contraste de fases, pero no por microscopia de luz de campo brillante, y se
caracterizan por ser microorganismos aerobios obligados, de crecimiento lento y
requieren ácidos grasos o alcoholes de cadena larga como fuente de energía
6
primaria (Hoeprich 1980). No se tiñen con facilidad, pero se pueden impregnar
con plata (Fontana – Tribondeau, Levatidi, Rojo Congo, Tinta China), por
fluoresceína, peroxidaxa conjugada más reactivos coloreados o por hibridación
del ADN con reactivos coloreados biotina–avidit (DAB)( Winn, 1998).
Figura 1. Micrografía electrónica de L. interrogans serovar Icterohemorragie (Sobre membrana de filtro de 0.2 - µm)
3.3. Aspectos históricos
El espectro de enfermedades humanas causadas por Leptospira sp. es
extremadamente amplio, el rango va desde una infección subclínica a un síndrome
severo de infección multiorgánica con alta mortalidad. Este síndrome de
leptospirosis ictericia con falla renal fue informado hace mas de 100 años por Adolf
Weil en Heidelberg; sin embargo un síndrome aparentemente idéntico ocurrió en
personas que trabajaban en alcantarillas el cual fue descrito varios años atrás.
Anteriores descripciones de enfermedades que eran aparentemente leptospirosis
han sido revisadas recientemente. La Leptospirosis ha sido reconocida como un
peligro ocupacional en cosechadores de arroz en China antigua, y en Japón de ahí
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el nombre de Akiyami, o fiebre de autumn el cual persiste en la medicina moderna
(Landouzy, 1983).
Con excepción de la enfermedad de Weil, una identidad clínica bien definida
también se describió en 1886, la Leptospirosis muy a menudo fue diagnosticada
erróneamente como fiebre amarilla y paludismo hasta que se descubrió su agente
etiológico por cultivo en 1914. La confusión con la fiebre dengue, fiebre amarilla,
hepatitis, paludismo, influenza y otras causas de enfermedad febril aguda persiste
en la actualidad.
Los científicos Japoneses Inada & Ido fueron los primeros en describir el agente
causante de la enfermedad al comienzo del 1915 (Everard, 1996); aislado por vez
primera por estos mismos investigadores pero en 1916, siendo nombrado
Spiroqueta icterohaemorrhagiae, y luego renombrado Leptospira sp en 1917.
También en 1917, Noguchi aisló la bacteria de ratas en Nueva York, EE.UU. En
1917, se describe la infección en rata gris (Rattus norvegicus) por el mismo agente
y se postuló su posible papel como transmisora de esta enfermedad al hombre.
La confirmación de aparición de la Leptospirosis en toda la frontera occidental
europea fue obtenida rápidamente después de la publicación de los trabajos de
Inada.
Las primeras informaciones que sobre la enfermedad por Leptospira sp en los
animales procedían de la leptospirosis humana, datan del 1852 en que Hofer
describió una enfermedad de los perros antes desconocida que llamó Tyfus Seu
Febris Nervosa Canum. Keff en 1898 cambió el nombre de esta enfermedad por
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la enfermedad de los perros de Stuttgard (Stuttgarte Handesenchue). Sin
embargo, la etiología de esta enfermedad fue aclarada en 1922 por el
Checoslovaco Lukes, quien demostró que el agente era una espiroqueta. La
primera descripción de Leptospira sp como agentes productores de enfermedad
en los animales se realizó en 1933, cuando Klarenbeck y Schuffner demostraron
que la L. canicola era el agente etiológico de la enfermedad Stuttgart en los
perros (Van der Hoeden, 1958). Michin y Azinov (1935) fueron los primeros en
notificar la afectación de leptospirosis en los bovinos en la antigua USSR,
denominándola como “hemoglubinuria infecciosa aguda”, y del agente aislado L.
icterohaemorrhagiae bovina. Estudios posteriores apuntaron a L. grippotyphosa
como responsable de aquella enfermedad. Freund et al (1941) y Jungherr (1944)
notificaron en esta misma especie tanto en Israel como en los Estados Unidos de
América respectivamente, quedando este último como la primera notificación en
el continente Americano. Mientras el primer reporte en Gran Bretaña fue al cargo
de (Field & Wellers 1950). Smith & Perry (1952) divulgaron los primeros casos en
Canadá.
Los primeros diagnósticos hallados en el continente Africano datan casi a
mediados del siglo XX por Donatien y Gayot, (1950) en Argelia; Cordier (1952) en
Túnez y Farina y Sobrero (1960) en Somalia etc.
Una descripción de Leptospirosis en equinos fue en la antigua Unión Soviética por
Lubaschenko y Nowikowa, 1947 y desde entonces en Australia, Willington y Ferris,
1953; Yugoslavia, Zakarija, 1953; Hungría, Kasza y Kemenes, 1955; en los
EE.UU. Roberts, Cork y Robinson, 1955 y Francia, Rossi y Kolochine – Erber,
9
1955 (Hutyra et al 1968). Anteriormente se había informado sobre la primera
observación de Leptospira sp en el riñón de equino en 1934.
En Colombia, se ha considerado que la leptospirosis ha aparecido de manera
esporádica y rara, pero los estudios realizados por el Instituto Nacional de Salud,
Universidad del Valle, El Grupo Investigaciones en Enfermedades Tropicales de la
Universidad del Norte (Macías et al 2005) y la Dirección Seccional de Salud de
Antioquia, entre otros, muestran que la incidencia es alta y por eso se ha puesto a
la leptospirosis dentro de las zoonosis de reporte obligatorio al sistema nacional de
salud;
En Colombia es relevante plantear que históricamente existen reportes sobre
algunos brotes importantes en diversas regiones. En el primer estudio colombiano
de la enfermedad, Muñoz-Rivas en 1957 (citado por Bravo y Restrepo 1970),
estudiaron 3 lotes de sueros humanos por MAT, encontrando 4.28% de humanos
positivos para el serovar Icterohaemorrhagiae. Bravo et al (1970) reportaron el
primer aislamiento del serovar pomona en Colombia. Posteriormente en 1969,
presentaron el primer caso colombiano de leptospirosis por el serovar canícola, en
un joven con un cuadro de ictericia progresiva que afectó además riñones y
meninges
La única epidemia documentada en el país se inició en agosto de 1995 en el
departamento de Atlántico con un total de 47 casos confirmados y 284 casos
sospechosos. En los casos confirmados, provenientes de varios municipios de ese
departamento, la mortalidad fue del 17%. Pérez-García (1997) reportó los
hallazgos histopatológicos de casos de leptospirosis en necropsias, entre las que
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se cuentan hemorragias petequiales o equimóticas en músculos, riñones, hígado,
suprarrenales, estómago, bazo y pulmones.
En cuanto a grupos de riesgo ocupacional, Ochoa et al (2000), realizaron un
estudio para determinar la prevalencia de leptospirosis en una región antioqueña
de producción lechera donde el 22.4% de los operarios tenían títulos para
Leptospira sp. Orrego et al (2003), en trabajadores de explotaciones porcinas de
Manizales, encontraron prevalencias desde 3.9% hasta 14.3%. Nájera et al (2003)
determinaron una prevalencia para leptospirosis del 7% en un grupo de
trabajadores de carnicerías y arroceras en los departamentos de Córdoba y Sucre.
Sebek et al (1989), realizaron el único estudio seroepidemiológico en población
humana general del que se encuentra registro. Examinaron serológicamente 353
personas entre adolescentes y adultos sanos en 5 localidades colombianas
usando MAT, con 15 diferentes serogrupos encontrando una positividad general
de 18.4% principalmente por L. interrogans serovar icterohaemorrhagiae y
grippotyphosa.
Los anteriores datos para Colombia indican que la frecuencia de infección por
Leptospira spp es alta y que su espectro tanto de factores de riesgo como clínico
es amplio.
En Cali, Astudillo (2005) llevó a cabo un proyecto cuyo objetivo principal fue
establecer a partir de pacientes con sospecha de Leptospirosis la frecuencia de la
infección por Leptospira en el departamento del Valle del Cauca, y determinar la
circulación de diferentes Leptospiras en el departamento. Los estudios realizados
11
por el Laboratorio de Leptospira de la Universidad del Valle y la Secretaria de
salud del Valle, reportaron que los municipios con mayor frecuencia de casos
sospechosos fueron Cali (55%), Dagua (5.7%), Candelaria (5.7%) y Buga (4.4%);
de todos éstos, el 84% provenían de área urbana. También se encontró que los
serogrupos de L. interrogans que circulan en Valle del Cauca son: L. serovar
autumnalis, L. serovar australis, L. serovar bataviae, L. serovar canicola, L.
serovar cynopteri, L. serovar icterohaemorragiae, L. serovar mini y L serovar
shermani.
Hoyos et al (1998) informaron de un caso aislado de leptospirosis en un hombre
joven, admitido al Hospital Universitario del Valle (HUV), que evolucionó en forma
satisfactoria. En la presentación del cuadro clínico se destacó la insuficiencia
respiratoria severa y mialgias, hallazgos compatibles con otras enfermedades
infecciosas de alta incidencia en Cali como el dengue. Parra et al. realizaron en el
2002 un estudio para medir la frecuencia de la coinfección por virus dengue y
leptospira en casos con diagnóstico clínico presuntivo de fiebre por dengue o
leptospirosis en 419 personas provenientes de diferentes municipios del Valle del
Cauca.
Rodríguez et al (2004), realizaron un estudio en Cali a 197 sueros de perros
callejeros durante el 2001 y el 2003, utilizando la prueba MAT, encontrando
evidencia de infección en el 41.1% de los perros con, al menos, uno de los
serovares incluidos. La mayor reactividad fue a L. serovar icterohaemorrhagiae
con 55.6% del total de los seropositivos, sugiriendo así que el perro callejero es un
posible reservorio de Leptospira en Cali.
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Ferro et al (2006) realizó un estudio transversal en 259 habitantes de barrios
periféricos de Cali, con el fin de establecer la seroprevalencia de infección por
Leptospira en humanos, correspondiendo principalmente a estudiantes, amas de
casa y trabajadores en oficios varios, encontrando anticuerpos anti-leptospira en
23.3% de las personas siendo más frecuente en mayores de 57 años y
predominando los varones sobre las mujeres.
3.4. Epidemiología de la infección
La Leptospirosis es considerada la zooantroponosis de gran distribución mundial.
El estudio de la epidemiología es complejo debido al gran número de factores que
influyen en su presentación, lo cual dificulta la extrapolación entre las diferentes
regiones geográficas y obliga el conocimiento individualizado de cada continente,
país, región o zona. Las distintas cepas patógenas de Leptospira pueden afectar
potencialmente a los mamíferos, donde algunos actuarán como hospederos de
mantenimiento o accidental en función del serovar considerado (WHO 1999).
La mayoría de los casos en América Latina ocurren en hombres adultos (88% de
los enfermos), principalmente durante la cuarta o quinta década de la vida, en
poblaciones rurales y en los meses de lluvia. A pesar de la distribución mundial de
la leptospirosis, son las regiones tropicales las que sobrellevan el mayor impacto,
más aún en los lugares donde la población vive en contacto estrecho con
animales. (Sebek op. cit.)
Según el estudio realizado en el Valle del Cauca la prevalencia de Leptospirosis
en pacientes con sospecha de la enfermedad desde enero de 2004 hasta junio de
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2005, los cuales acudieron a alguna institución pública o privada fue de 11.8%.
Igualmente se encontró que las serovariedades más prevalentes en pacientes con
leptospirosis confirmada, fueron mini (2.4 %=11/417), bratislava (1,7% = 7/417),
gripothypos (1,4% = 6/417), y australis (1.4% = 6/417), cuyos reservorios son los
bovinos, porcinos, equinos y roedores (Astudillo op. cit)
3.5. Cuadro clínico
La leptospirosis presenta cuadros clínicos diversos, conforme al tropismo del
agente, intensidad de la infección y posiblemente de las condiciones inmunitarias
del hospedero. Entre los signos y síntomas, algunos son comunes a todas las
formas clínicas. La Leptospirosis es una típica enfermedad bifásica. Este
comportamiento bifásico se desarrolla en los dos tipos de presentaciones que
tiene esta enfermedad: la forma anictérica y la segunda, más grave, en la forma
ictérica. Sin embargo clínicamente el comportamiento bifásico puede no ser
definitivo (Elder et al 1986).
El período de incubación es de 7-12 días (máximo de 2 a 20 días). Esto se ha
podido estudiar después de exposición accidental o el tiempo transcurrido
después de una inmersión. Enseguida comienza la primera fase que es la
llamada fase séptica que dura alrededor de 4-7 días. Es la fase donde las
características principales pueden ser “gripales”. En esta fase se puede aislar a
las leptospiras de la sangre, el líquido cefaloraquídeo (LCR) y la mayoría de los
tejidos. Posteriormente aparece una etapa intercalar donde inclusive puede el
paciente presentarse afebril por uno o dos días; luego aparece la segunda fase
que es llamada de fase inmune, donde característicamente las leptospiras
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desaparecen de la sangre y LCR siendo posible hallarlas en el riñón, orina y
humor acuoso. Algunas veces puede aislarse a las leptospiras hasta 24 horas
después de aparecida la ictericia (en las formas ictéricas). En esta fase que dura
de 4 a 30 días se desarrollan los anticuerpos circulantes presentándose la
afectación renal, hepática, meningitis, uveítis (Van der Hoeden op. cit; Michna,
1970).
Entre los pacientes con leptospirosis el 90% presenta la forma anictérica que es
la más leve de la enfermedad mientras que entre 5-10% tiene la forma grave de la
leptospirosis, con ictericia. Esta última es la llamada enfermedad de Weil o
Síndrome de Weil. Se admite que el 60-70% de los pacientes presentan
manifestaciones diagnosticadas como gripe o resfriado y solo se identifican
mediante estudios serológicos. Se ha encontrado evidencia serológica de
infección en aproximadamente 15% de las personas que trabajan en mataderos y
en veterinarios (Heath et al 1965, Lee 1985).
3.5.1. Manifestaciones clínicas.
3.5.1.1. Forma ictérica.
Denominada síndrome de Weill, es la forma más severa; se caracteriza por
ictericia, alteraciones de la función hepática y renal, desarrollo de hemorragias,
colapso vascular, alteraciones hemodinámicas, cardíacas, pulmonares y de la
conciencia con una tasa de letalidad que varían del 5 al 15%. La ictericia, es una
manifestación constante, con niveles de bilirrubina sérica elevados a expensas de
15
la fracción directa. Con la instalación de la insuficiencia renal, puede desarrollarse
delirio y convulsiones junto con la aparición de manifestaciones hemorrágicas
diversas y acentuación de la ictericia. Hay hemorragias en forma de petequias,
equimosis o hemorragias pulmonares y gastrointestinales exteriorizadas por
hematemesis, melena o enterorragia. Puede haber esplenomegalia acompañada
de una hepatomegalia dolorosa. En la fase inmune, el paciente presenta
regresión progresiva de los síntomas y evoluciona hacia la mejoría entre 1 a 2
semanas (Ruiz 1995, Levett 1999)
3.5.1.2. Forma anictérica.
La enfermedad puede presentarse en forma discreta con: fiebre, cefalea, mialgias
o dolores musculares que involucran los músculos de las pantorrillas, muslos,
regiones paravertebrales y abdomen, resultando doloroso a la palpación, pudiendo
a veces simular un abdomen agudo quirúrgico. Puede ocurrir anorexia,
escalofríos, náuseas, vómito, tos, congestión ocular, artralgia, fotofobia, hiperemia
o hemorragia conjuntival. Hepatomegalía y esplenomegalia ocurren con menor
intensidad. Epistaxis, dolor torácico, tos seca con expectoración hemóptica, con
una duración de uno a varios días siendo frecuentemente rotulada como
"Sindrome gripal o virosis". En algunos casos pasa desapercibida (Machado et al
1998).
16
3.6. Distribución geográfica y prevalencia
La Leptospirosis es una enfermedad cosmopolita. Teóricamente, cualquier
mamífero puede infectarse por cualquier serovar; pero en realidad, solo algunos
serovares pueden ser considerados como endémicos y/o enzoóticos en una
región. A nivel internacional los países endémicos son: España, Barbados,
Holanda, Francia, Rusia, Perú, Argentina, Chile, Canadá, Eslovaquia, Escocia,
Pakistán, Tailandia, Nigeria, Costa Rica, Alemania, Dinamarca, Italia, Cuba,
Australia, Zaire, Yugoslavia, Irlanda del Norte, Bangla Desh, Gabón, Japón,
Venezuela (Sebek op.cit).
Los países epidémicos son: Brasil, China, India, Puerto Rico y casos aislados
Estados Unidos de las Américas. En este sentido, serovares como: L. pomona, L.
Icterohaemorrhagiae, L. canicola y L. grippotyphosa se consideran de distribución
mundial. La presencia de uno u otros serovares dependen de la existencia de
mamíferos silvestres en la región. Vander Hoeden (op. cit) declaró que tanto la
distribución como la incidencia de la enfermedad depende del tipo del suelo y su
pH, la temperatura y de la capacidad de las aguas naturales de mantener a los
microorganismos intactos.
En Colombia, entre 2000 y 2003 se conocen sólo dos estudios de prevalencia de
leptospirosis; uno en la ciudad de Cali en personas sintomáticas, y el otro en el
municipio de Don Matías (Antioquia) en trabajadores agrícolas, con tasas de
ataque de 6.4 y 22.8% respectivamente. En el departamento de Córdoba, región
ganadera con clima tropical propicio para el desarrollo de esta zoonosis, se cuenta
17
con estudios de prevalencia de leptospirosis en porcinos cuya elevada tasa de
infección oscila entre 30 y 50%.
3.7. Prevalencia
La prevalencia de la enfermedad en humanos varía notablemente entre los
distintos continentes, países e incluso, entre las diferentes regiones de un mismo
país así como entre las especies de animales y edades de éstas.
Algunos investigadores como Ellis & Michna (1977) y Pritchartd (1986) publicaron
la prevalencia de la enfermedad en humanos en un 49,1 % en el Reino Unido,
donde se considera como el país europeo de alta prevalencia; Francia se
considera como el país con baja prevalencia en Europa con 1,8% pero a diferencia
del 17,8% obtenido en un zona de Loira en este mismo país; Rocha (1998) obtuvo
15,3% en Portugal; Kingscote (1985) reveló 15,3% y en 1986, el estudio
realizado por Adler dio a conocer un 8,3%, mientras Millar et al (1991) reflejaron
una prevalencia de 49% después de realizar un trabajo que comprendió a 49
estados.
En el continente africano se han realizado varios estudios, Ndarathi et al (1991)
publicaron una prevalencia de 18,3% y 28,5% referente a Kenya. También existen
datos como: 79,2% por Sudáfrica (58); 1,9%, 58,3%, 72% y 74,6%
respectivamente (Wanyangu et al 1988, King 1991). De forma particular,
Paparamborda (2001) publicó una prevalencia de 24% en seres humanos, 61% en
bovinos y 40% en los cerdos.
18
En humanos también la tasa de incidencia tiene su variabilidad de acuerdo a los
elementos ya mencionados. En el continente americano, ha sido publicado la
prevalencia en algunos países como: México 18.9%; Argentina 26.8%; Brasil
22.3% Cuba 48.7%; Salvador 17,5% y Colombia 25% (WHO, 1982).
En Cuba, la mayor tasa de incidencia en la población humana fue en 1994
cuando este país obtuvo una tasa de 25,6 por cada 100.000 habitantes (Cruz de la
Paz 2004).
Las encuestas serológicas permiten explorar los factores de riesgo asociados con
la presentación endémica o epidémica de la enfermedad en animales y humanos.
Un estudio realizado en Nueva Zelanda investigó la presencia de Leptospira en
1.003 inspectores de carne y encontró una asociación entre la positividad y el
número de años de empleo. Otra investigación realizada en trabajadores de
alcantarillado de Canadá en 1995 registró una positividad de 12%, frente a 2% en
el grupo de control (P = 0,003) y resaltó la importancia de los roedores en la
transmisión de la enfermedad, haciendo énfasis en la necesidad del uso adecuado
de los elementos de protección personal. La infección por Leptospira en bovinos
es importante por las pérdidas económicas que generan los problemas de
infertilidad. En Venezuela, en 1980, se verificó que 40,8% de 1.526 abortos
bovinos eran atribuibles a la leptospirosis, y en Irlanda, en 1982, el serotipo hardjo
se asoció con 49,7% de 348 abortos bovinos. El aborto es una secuela crónica de
la infección que se produce semanas después de la leptospiremia.
19
3.8. Factores de virulencia
Dentro de los posibles factores de virulencia que podrían explicar las diferencias
entre las infecciones leves, autolimitadas y las infecciones más severas en los
seres humanos, se han identificado:
Produccion de toxinas
Adherencia
Proteinas de superficie
Mecanismos inmunes
3.8.1. Producción de toxinas.
La producción de toxinas por leptospiras patógenas in vivo fue estudiada por
Arean (2002). La actividad endotóxica ha sido reportada en varios serovares. En
algunos ensayos biológicos realizados, las preparaciones de lipopolisacaridos
(LPS) de leptospira exhiben la actividad de una endotoxina pero a muy bajo nivel.
El serovar L. pomona se ha caracterizado por la producción de una enfermedad
hemolítica en ganado; mientras que el serovar L. ballum la causa en hamsters
(Haake 2000).
Las hemolisinas de varios serovares L. ballum, L. hardjo, L. pomona y L. tarassovi;
son esfingomielinasas. Algunas variedades virulentas exhiben quimiotaxis con
respecto a la hemoglobina. Se ha encontrado que una hemolisina presente en el
20
serovar L. lai no presenta actividad de esfingomielinasa ni de fosfolipasa pero se
caracteriza por ser una proteína formadora de poros en células de mamíferos
principalmente en los eritrocitos.
En variedades como L. pomona y L. copenhageni elaboran una proteína
(citotoxina) detectándose actividad citotóxica en el plasma de animales infectados.
In vivo, a presencia de esta toxina, tiene un efecto histopatológico típico, con
infiltrado de macrófagos y células polimorfonucleares (Guerreiro, 2001).
La invasión en el líquido cefalorraquídeo y el humor acuoso del ojo puede estar
facilitada por la acción horadante del par de flagelos axiales y la liberación de
hialuronidasa. Algunos estudios realizados en ratones sugieren que el derrame
capilar y las hemorragias son el resultado de la ruptura endotelial de las
membranas celulares de los vasos de pequeño calibre por la intercalación de una
toxina glucoproteíca, que desplaza los ácidos grasos de la cadena larga del
hospedero requeridos para mantener la integridad de la pared de las células
vasculares. Sin tener en cuenta el mecanismo, las lesiones petequiales reflejan
una vasculitis sistémica, lo que permite la migración y proliferación de las
espiroquetas en casi todos los órganos y tejidos y son responsables de un amplio
espectro de enfermedades clínicas. Puede suceder una lesión vascular severa,
que causa, por ejemplo, hemorragia pulmonar, isquemia de la corteza renal que
conduce a una necrosis de las células epiteliales tubulares y destrucción de la
arquitectura hepática que produce ictericia y lesión hepática con necrosis o sin ella
(Guerreiro op. cit).
21
3.8.2. Adherencia.
Las leptospiras han mostrado una forma de ataque a las células epiteliales.
Leptospiras virulentas se adhieren al epitelio renal de células in Vitro, y su
adhesión es aumentada por concentraciones aglutinantes de anticuerpos
homólogos. Las bacterias son fagocitadas por macrófago en presencia de un
anticuerpo específico. La inhibición de la actividad de los macrófagos incrementa
la sensibilidad a la infección. Las leptospiras llegan a estar asociadas con los
neutrófilos pero no son eliminadas. La fagocitosis ocurre solo en presencia de
suero y del complemento, sugiriendo que en su membrana externa las leptospiras
poseen un componente antifagocítico (Haake op. cit).
3.8.3. Proteínas de superficie.
La membrana externa de las leptospiras contiene LPS y varias lipoproteínas o
proteínas de la membrana externa (outer membrane proteins OMPs). El
lipopolisacarido desencadena reacciones inmunológicas importantes y es
responsable de la especificidad del serovar. Se ha demostrado una relación
inversa entre la expresión de OMPs transmembrana y virulencia, lo cual fue
observado en el serovar grippotyphosa.
Mediante estudios realizados en hamsters, se ha demostrado que una lipoproteína
de la membrana externa la LipL36 tiene la propiedad de evadir la respuesta
22
inmune. Los componentes de la membrana externa pueden ser importantes en la
patogénesis de nefritis intersticial. Una fibronectina de unión a proteínas fue
identificada recientemente (Haake 1999).
3.8.4. Mecanismos inmunes.
El segundo estadio de leptospirosis aguda está relacionado con una fase inmune,
en la cual la desaparición de los microorganismos del torrente sanguíneo coincide
con la aparición de los anticuerpos. La severidad clínica de la enfermedad a
menudo aparece de manera proporcional junto con los hallazgos histopatológicos.
Esta reacción de tipo inmune de la enfermedad ha sido propuesta como un factor
que influencia la severidad de los síntomas (Thiermann 1984, Heath & Johnson
1994).
La respuesta inmune humoral de los seres humanos esta dirigida contra los
epitopes de la cadena lateral del LPS de la envoltura externa; los antígenos de
LPS desencadenan la producción de anticuerpos de tipo IgM e IgG los cuales se
unen de una manera específica con los ya mencionados epítopes, o reaccionan de
manera cruzada con el serovar o serovares, causando infección. Después de la
opzonización y la fagocitosis posterior en el pulmón y el hígado, las espiroquetas
se eliminan de la circulación por el sistema reticuloendotelial; la rapidez de la
depuración de las leptospiras es de importancia pronostica (Heath & Johnson op.
cit.).
23
Los antígenos de superficie pueden desempeñar algún papel, ya que ciertos
serovares se asocian con enfermedad leve (L. ballum, L. canicola, L. hebdomadis,
L. Hardjo, L. hyos, L. Grippotyphosa, L. pomona, y L. tarassovi), mientras que
otros serovares como los miembros del serogrupo L. Icterohaemorrhagie
(L. copenhageni, L. icterohaemorragie, L. Lai, L. australis, L. autumnales y
L. pyrogenes) se asocian con la enfermedad más severa. Factores físicos como
extremos curvos o en forma de gancho y la movilidad también puede desempeñar
un papel, ya que estas características se pierden de manera gradual después del
cultivo en el laboratorio, lo que da origen a microorganismos menos virulentos
(Heath & Johnson op. cit).
3.9. Diagnóstico
Las técnicas para el diagnóstico por el laboratorio de leptospirosis se pueden
dividir en dos grandes grupos:
3.9.1. Métodos de detección directos.
Los que evidencian al agente, tales como la observación al microscopio en campo
oscuro y contraste de fases, la inmunofluorescencia directa, las tinciones de plata
en tejidos fijados, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y el aislamiento.
3.9.2. Las que ponen en evidencia los anticuerpos producidos.
Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), técnica de aglutinación de
microcápsula (MCAT), la prueba de microaglutinación (MAT) y el Lepto-Dipstick.
24
Con respecto a las técnicas del primer grupo, el microscopio de campo oscuro
puede detectar estas bacterias tanto en tejidos como en líquidos corporales,
principalmente en orina y sangre y puede proporcionar un diagnóstico presuntivo
de leptospirosis en manos experimentadas. Sin embargo, es frecuente encontrar
exámenes falsos positivos y falsos negativos debido a la baja concentración de
microorganismos (incluso después de la centrifugación) y la presencia de fibrina y
otros productos celulares filamentosos encontrados en la mayoría de los cuerpos
líquidos, esto implica la confirmación de los resultados con el cultivo (Heinemann
et al 2000, Veloso et al 2000, Arias et al 2002).
La técnica de aislamiento ideal para cultivar estas bacterias es el empleo del
medio Ellinghausen, McCullough, Johnson y Harris (medio de EMJH). Los cultivos
deben examinarse microscópicamente a diferentes intervalos, hasta por varios
meses (Faine 1999).
Debido a que el examen directo no siempre es confiable, y a que los cultivos son
costosos, laboriosos, y toman mucho tiempo con una sensibilidad menor del 50%
y una especificidad del 48% al 55%, la serología es el método práctico para el
diagnóstico de esta enfermedad. En este grupo de técnicas, la prueba de
microaglutinación en campo oscuro (MAT) utiliza microorganismos vivos, y es la
técnica de referencia mundial. El MAT utiliza únicamente suero como muestra, y
su interpretación diagnóstica se basa en el aumento en los niveles de anticuerpos,
se recomienda utilizar muestras de suero pareadas.
A pesar de ser la prueba más recomendada y extendida, presenta una serie de
desventajas: la infección no puede ser detectada hasta el 5-7 días después de la
25
exposición a la infección, se requiere de una bateria de 18 a 25 antígenos vivos,
no distingue anticuerpos vacunales de los de infección (Ellis et al 1981); resulta
difícil su estandarización ya que su valoración es subjetiva (Faine 1982,
Thiermann op. cit, Heath & Johnson op. cit); requiere el mantenimiento de cultivos
de leptospiras, los antígenos deben ser subcultivados cada 7-10 días, con
controles periódicos con antisueros homólogo (Thiermann 1983); necesita de
personal capacitado, es muy laboriosa, implica riesgo de contaminación y no
siempre detecta a los animales infectados, en especial cuando el serovar
implicado es L. hardjo, que presenta como características ser poco antigénico
(Thiermann op. cit, Heath & Johnson op. cit). Presenta una sensibilidad baja, en
los estadios iniciales del 28% hasta el 48.7% necesitando muestras pareadas para
detectar un aumento de los títulos de anticuerpos; además la persistencia hasta
por meses de anticuerpos en una única muestra limita su uso, solamente se han
demostrado aumentos no significativos en la prueba cuando se utiliza como
referencia en la fase aguda la detección por MAT con IgM antileptospira.
(Thiermann op. cit)
En cuanto a las técnicas pertenecientes al segundo grupo como son ELISA la cual
se aprecian una sensibilidad baja del 15% y una excelente especificidad del 91%
al 96% tanto en la fase aguda como en la convaleciente de la enfermedad; y la
técnica de aglutinación de microcápsula (MCTA) entre otras, todas con la
capacidad de detectar diferentes clases de anticuerpos, pueden estar sujetos a
presentar reacciones de falsos positivos y requerir una posterior confirmación de
los resultados por el MAT (Ellis 1986).
26
3.9.3. Métodos Moleculares
En los últimos años, se han desarrollado métodos de PCR para la detección
rápida de ADN de Leptospira en muestras provenientes de seres humanos,
perros, roedores, bovinos y demás reservorios.
La reacción en cadena de polimerasa (PCR) detecta por amplificación, el ADN de
las espiroquetas en muestras de sangre, orina, humor acuoso y líquido
cefalorraquídeo (LCR). El PCR es una excelente opción para la detección
temprana de leptospirosis. Comparando la PCR con el MAT en una muestra de
200 pacientes, varios grupos de investigadores han encontrado que el PCR
detecta ADN de las leptospiras, en el suero o en la orina, entre los días 2 y 5 del
inicio de la enfermedad. Estos investigadores identificaron leptospiras por medio
del PCR en 13 de 71 pacientes que habían sido identificados como negativos por
el MAT. En otros estudios recientes se ha demostrado que la medición del PCR
en orina tuvo mayor éxito detectando el ADN que la de suero, y que los resultados
de las pruebas de PCR, fueron reportados en 24 horas, en contraste con la
medición de anticuerpos o los cultivos, cuyos resultados toman varias semanas
(Ooteman et al 2006, Merien et al 1995)
En los primeros estudios realizados en pacientes con leptospirosis, el PCR se
comparó con cultivos y pruebas serológicas, y resultó más sensible que los
cultivos en los pacientes con enfermedad confirmada por serología en ambos
estudios. Esto también se observa en un análisis comparativo entre cultivo y PCR
siendo positivo el 48% y el 62% de casos confirmados para leptospira
27
respectivamente (Levett 2001). El examen por PCR de sangre y LCR es muy útil
en los primeros 7 a 10 días de enfermedad cuando el DNA de las leptospiras
puede ser detectado antes del desarrollo de la respuesta inmune humoral. El
examen por PCR de orina y humor acuoso puede ser detectado positivo después
de varios meses de adquirida la enfermedad.
Las reacciones en cadena de la polimerasa (PCRs) han sido reportadas para la
rápida identificación de las regiones conservadas de genes ribosomales de ciertos
microbios. En el genoma de Leptospira, amplificaciones por PCR de segmentos
de DNA de los genes 16S rRNA y 23S rRNA han sido informadas para la
identificación específica de leptospiras patógenas y de 23S rRNA para otros
géneros de Leptospiras (Smythe op. cit).
Por todas estas razones la amplificación del ADN usando la técnica de reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) se ha convertido en una excelente técnica
diagnóstica, debido a la rapidez con que provee el resultado, y a su alta
sensibilidad.
28
4. OBJETIVOS
4.1. General
Detectar Leptospira patógena mediante la técnica de PCR en muestras de orina
4.2. Específicos
Estandarizar un método para detectar Leptospira patógena por PCR en
muestras de orina
Evaluar la sensibilidad y especificidad de la PCR
Detectar la presencia de Leptospira spp patógena en muestras de orina de
pacientes con leptospirosis confirmada entre dos meses y dos años antes
del presente estudio.
Diferenciar Leptospira patógena de no patógena.
29
5. HIPÓTESIS
Ho: la técnica de PCR permite detectar la presencia de Leptospira patógena en
muestras de orina de humanos y perros, sintomáticos y asitomáticos.
30
6. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1. Ubicación
El presente trabajo se llevo a cabo en el Departamento del Valle del Cauca, en
colaboración con los hospitales de los municipios de Tuluá, Buga, Palmira y
Versalles, de acuerdo con la información proveniente del Laboratorio de
Bacteriología de la Universidad del Valle, de pacientes confirmados de
Leptospirosis mediante prueba de MAT entre dos meses y dos años antes del
presente estudio. Los pacientes fueron contactados por medio del programa de
Promoción y Prevención de los hospitales a los cuales pertenecían dichos
pacientes.
La toma de muestras se realizó en cada hospital, siguiendo el protocolo para la
recolección de muestras de orina y posteriormente las muestras fueron
refrigeradas y transportadas al Laboratorio de Bacteriología de la facultad de salud
de la Universidad del Valle, Sede San Fernando, ciudad de Cali, para la fase de
procesamiento y análisis.
En este estudio también se incluyó a pacientes residentes en la Ciudad de Cali,
quienes acudieron al laboratorio de Bacteriología de la Universidad del Valle.
6.2. Caracterización de la muestra
40 muestras de orina (10 ml) de personas con leptospirosis confirmada por
medio del MAT entre dos años y dos meses antes del estudio.
31
25 muestras de orina (5 ml) provenientes de perros con o sin sospecha de
Leptospirosis.
9 cepas de leptospiras patógenas de la especie L. interrogans utilizadas
para la estandarización, pertenecientes a los serovares autumnalis,
bataviae, bratislava, canicola, cynopteri, copenhageni, grippotyphosa, mini y
shermani. (Tabla 1)
1 cepa de leptospira no patógena de la especie L. biflexa perteneciente al
serovar Patoc conservadas en medio EMJH a 30º C. (Tabla 1)
4 cepas bacterianas pertenecientes a las especies Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeurginosa, Bacillus cereus) y 1
aislado clínico de Bordetella pertussis como controles negativos para la
estandandarización.
Tabla 1. Especies y serovares de Leptospira utilizadas como controles positivos y negativos para los ensayos.
ESPECIE SEROGRUPO SEROVAR CARACTERÍSTICA
L. interrogans Autumnalis autumnalis PATÓGENA
Bataviae bataviae PATÓGENA
Australis bratislava PATÓGENA
Canicola canicola PATÓGENA
Cynopteri cynopteri PATÓGENA
Icterohaemorrhagiae copenhageni PATÓGENA
Grippotyphosa grippotyphosa PATÓGENA
Mini mini PATÓGENA
Shermani shermani PATÓGENA
L. biflexa Semaranga patoc NO PATÓGENA
32
6.3. Cultivo de muestras
Se utilizaron 5 µL de cada muestra de orina para examinarse por visualización
directa en campo oscuro. También se tomaron 5 mL del total de muestra de orina
de personas (previo consentimiento informado) y animales (perros) para ser
sembradas inmediatamente en los medios EMJH y Stuart modificado, y se
incubaron durante cuatro meses a 30ºC, para visualizar en microscopio de campo
oscuro una vez por semana hasta la observación de espiroquetas. La observación
se realizó en un microscopio de campo oscuro, realizando un extendido en un
portaobjeos adicionando 5 µL del urocultivo. Las muestras positivas fueron
resembradas en medio de cultivo EMJH, adicionando 500 µL del urocultivo, 500
µL de Suero fetal bovino y 1% de 5FU. Todas las muestras fueron descartadas
posteriores a su visualización.
Las muestras restantes fueron transportadas en refrigeración al laboratorio de
Bacteriología de la Universidad del Valle para proceder a extraer el ADN.
Las 9 cepas de Leptospira patógena de la especie L. interrogans y la cepa de
Leptospira no patógena (L. biflexa) fueron sembradas en medio EMJH e
incubadas a 30ºC y continuado con observaciones semanales durante cuatro
meses para confirmar la viabilidad del cultivo. Las cepas fueron repicadas hasta
finalizar de la fase experimental, en el Laboratorio de Microbiología de la
Universidad del Valle.
33
6.4. Tinción de Leptospira:
Se tomaron 10 μl del cultivo puro de L. cynoptery para examinar la pureza y
viabilidad de las muestras en campo oscuro (objetivo 4x). Luego, en 7 pozos de
una microplaca se adicionaron 50 µL de medio PBS. Se adicionó 50 µL del cultivo
en el primer pozo. Luego se tomó 50 µL del pozo 1 y se homogenizó con el pozo
siguiente, y así sucesivamente hasta realizar la dilución 10-6. Se procedió al
conteo de espiroquetas de cada una de las diluciones colocando 5 µL en una
lámina portaobjetos. Se observaron varios campos y se contó el número
aproximado de leptospiras en cada campo. De cada dilución se tomó 1 mL y se
inoculó con 5 mL de muestra de orina de una persona sana. Se centrifugó a 12000
rpm por 5 minutos y se realizaron extendidos en placa, se fijaron con metanol
durante 3 minutos y se dejaron secar. Se hizo una mezcla de
6 gotas del colorante giemsa con 3 mL de buffer giemsa. La placa se dejó secar
durante 20 minutos y se observaron al microscopio de campo oscuro.
6.5. Límite de Detección de ADN de Leptospira
El límite de detección de la técnica de PCR se define respecto a la cantidad
mínima en nanogramos de ADN específico que el equipo de PCR puede detectar.
Para determinar el límite de detección, se utilizaron las diluciones seriadas desde
10-1 hasta 10-6 del ADN total del cultivo de L. interrogans serovar cynopteri + orina
34
DN PM (g/mol)
l) (g/ (copias/mol) 10 6 l) (Copias / Cantidad
23
que fue cuantificado, para determinar la dilución máxima a la que debería
amplificar el género Leptospira.
6.5.1. Cuantificación de copias iniciales de ADN específico
El número de copias del genoma de Leptospira sp, presentes en el ADN fue
calculado con la ecuación reportada por Sambrook et al (op. cit.) que se explica a
continuación:
1 mol = Peso molecular (g)
1 mol = 6 x 1023 moléculas (= copias)
La Concentración Final de ADN utilizada por cada dilución, se calculó teniendo en
cuenta la concentración de ADN total obtenido del cultivo puro (141.4 ng/µl) y que
en cada muestra se adicionaron 5µl de la dilución:
[ADN de la dilución (ng/µl)] * 5µl = [ADN Final en la muestra (ng/µl)]
6.6. Extracción de ADN
La extracción de ADN bacteriano a partir de orina fue obtenido según
instrucciones del QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Australia): Se tomó 1mL de orina
y se deposito en un vial de 1.5mL; se centrifugó por 10 minutos a 7500 rpm en la
centrifuga refrigerada SIGMA 2K-15. Se descartó el sobrenadante y se
35
resuspendió el pellet en 180μl de buffer ATL. Se mezcló por inversión y se
adicionó 20μl de Proteinasa K. Se mezcló suavemente con el vortex VWR y se
incubó a 56 ºC durante tres horas. Se adicionó 200 μl de buffer AL y 200μl de
etanol al 70% y se mezcló con vortex. Se transfirió con micropipeta el contenido
del tubo a una mini columna con tubo colector. Se centrifugó por 1 minuto a 8000
rpm. Se descartó el tubo colector y la mini columna se transfirió a un nuevo tubo
colector. Se adicionó 500μl de buffer AW1 y se centrifugó por 1 minuto a 8000
rpm. Nuevamente se descartó el tubo colector y la mini columna fue transferida a
un nuevo tubo colector, donde se adicionó 500μl de buffer AW2 y se centrifugó
durante 3 minutos a 14000 rpm. La mini columna se transfirió a un vial de 1.5 mL y
se adicionó 100μl de buffer AE directamente sobre la membrana. Se incubó a
temperatura ambiente durante 1 minuto y finalmente se centrifugó a 8000 rpm por
espacio de 1 minuto. El ADN resultante se almacenó a -20ºC. La calidad del ADN
fue verificada en geles de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio a 10 mg/ml.
6.7. Cuantificación del ADN obtenido
Para determinar la concentración de ADN obtenido, se utilizó un espectrofotómetro
(UV 1601PC (Shimadzu) a partir de la densidad óptica a 260 nm. Para la lectura
se utilizaron 495 de agua desionizada y se mezcló con 5 µl de ADN. Una vez
determinada la concentración de cada muestra, se prepararon diluciones a 5 ng/ul
para realizar los análisis moleculares.
36
6.8. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y Especificidad
Se optimizaron todos los parámetros del PCR como iniciadores, cloruro de
magnesio, dNTP`s, Taq Polimerasa, Buffer y ADN. Para los estudios de
especificidad de la prueba de PCR se evaluó utilizando como control negativo el
ADN L. biflexa serovar patoc () y el ADN de las cepas patógenas Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeurginosa, Bacillus cereus y Bordetella
pertussis proporcionadas por el laboratorio de Bacteriología del Departamento de
Microbiología de la Universidad del Valle.
6.9. Electroforesis de los productos de PCR
Los productos de la amplificación se separaron en geles de agarosa al 2.5%
teñidos con bromuro de etidio a una concentración de 10 mg/ml. Las bandas se
visualizaron bajo luz ultravioleta y se empleó la cámara fotográfica Samsung
(referencia NV10) en el registro fotográfico. Todas las muestras se corrieron en
cámaras de electroforesis horizontal conteniendo como solución tampón Buffer
TBE 1X. Se empleó un marcador de 100 pb ADN Ladder para confirmar el tamaño
de los fragmentos producto de la amplificación.
37
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7.1. Cultivo de muestras
7.1.1. Visualización directa de orina por campo oscuro
La microscopía de campo oscuro es considerada como método útil para la
detección de leptospiras en fluidos, sin embargo con esta técnica se pueden
diagnosticar falsos positivos, ya que las leptospiras pueden ser confundidas con
proteínas séricas, hebras de fibrina u otros residuos celulares (Ellis op. cit).
En la visualización directa por campo oscuro de orina de las 40 personas y 25
perros (objetivo 40X), no se detectó la presencia de leptospiras en ninguna de las
muestras.
Esto fue debido a que la concentración de leptospiras en la orina humana es
frecuentemente baja como para ser detectables por este método (Culling 1963,
Romeis 1968), y las muestras deben tener un tratamiento adicional para
enriquecer al microorganismo y multiplicarlo. Aunque la microscopia de campo
oscuro es particularmente útil para observar las leptospiras en cultivo, el
diagnóstico frecuente de falsos positivos y falsos negativos obligan a que los
resultados de la microscopía de campo oscuro de material clínico sean siempre
confirmados por otras pruebas (OIE, 2004).
38
7.1.2. Urocultivos
Durante la fase de leptospiruria (excreción de leptospiras por vía urinaria),
caracterizada por un incremento en la concentración de anticuerpos, la orina es el
inoculo apropiado para el aislamiento de leptospiras en los humanos.
Después de la siembra de orina en cultivo EMJH, se observaron por campo oscuro
los 40 urocultivos provenientes de personas y se encontró sólo el 5% (2/40) de
cultivos positivos al inicio del experimento (figura 2). A medida que se repicaron
las dos muestras positivas en medio EMHJ, se observó una disminución o nulidad
en el número de espiroquetas. Las leptospiras tienen desarrollo lento en los
medios artificiales, son muy exigentes en sus requerimientos nutricionales y se
cultivan difícilmente, de ahí la escasa cantidad de aislamientos, sobre todo de
algunos serovares (preferentemente los patógenos) tienen gran dificultad de
adaptación a los medios de cultivo, (Ellinghausen 1973). La misma orina inoculada
en los medios de cultivo puede afectar el desarrollo in vitro de la espiroqueta por
enrarecimiento o reducción, creando la disminución de la aerobiosis y otros
posibles efectos tóxicos; también la inmovilidad y desaparición de la espiroqueta
está asociada con la contaminación bacteriana y el descenso del pH con un punto
crítico de alrededor de 6.0. (Zamora 1999).
Este resultado también pudo generarse ya que el medio de cultivo semisólido
EMJH contenía 5-fluorouracilo, el cual es un agente selectivo, cuya función es
inhibir el crecimiento de contaminantes bacterianos. Sin embargo, el uso de estos
agentes selectivos pueden reducir las posibilidades de aislamiento cuando hay
sólo un número pequeño de leptospiras viables, tal como las leptospiras
39
encontradas en la orina. La viabilidad de las leptospiras procedentes de orina
puede aumentarse al inocularse en el medio EMJH, 2 horas después de ser
excretada. También estas muestras antes de ser inoculadas pueden ser
neutralizadas con bicarbonato de sodio y el uso de una solución tamponada de
seroalbúmina bovina fosfato (BSA) (Ellinghausen op. cit).
Figura 2: Observación de leptospiras en urocultivo de persona. Objetivo 40X
Por otra parte, los perros domésticos en el estado de portadores pueden liberar
leptospiras intermitentemente por muchos años o incluso por toda la vida, durante
el cual las leptospiras pueden ser aisladas de su orina. Sin embargo, los
resultados indicaron que de los 25 urocultivos provenientes de perros, no se
encontró leptospiras en la observación microscópica por campo oscuro.
El cultivo de la orina de animales domésticos puede ser llevado a cabo, aunque es
difícil ya que la orina en medio de cultivo puede alcanzar una acidez de pH 5.6 o
bien incrementar su alcalinidad a pH 7.8 o más, contaminando fácilmente las
muestras de otras bacterias y generando que las leptospiras pierdan rápidamente
su motilidad y desaparezcan (Zamora 1999).
40
Para una mayor concentración de leptospiras en orina de animales, la muestra
debe ser procesada dentro de las dos horas siguientes a su recolección, ser
centrifugada y el sedimento inoculado en un medio de cultivo que inhiba el
crecimiento de bacterias contaminantes. La supervivencia de las leptospiras en la
orina ácida también puede incrementarse haciendo la orina neutra (Ellinghausen
op. cit).
7.1.3. Comparación entre los dos métodos:
Al comparar los dos métodos anteriores (Visualización directa de orina por campo
oscuro y Urocultivo), las leptospiras fueron detectadas en un porcentaje bajo por el
urocultivo, mientras que por la Visualización Directa la detección fue nula, tal como
se ilustra en la tabla 2.
Tabla 2. Comparación de muestras positivas y negativas de los métodos de Visualización directa de orina por campo oscuro y Urocultivo
Muestra
Visualización directa de
Orina por campo
oscuro
Urocultivo
positivas negativas Positivas Negativas
Personas 0 40 2 38
Perros 0 25 0 25
TOTAL 0 65 2 63
41
Este resultado se debe a que en los casos de infección crónica, el individuo
infectado no estaba excretando un número detectable de leptospiras, al momento
de la obtención de la orina (OIE, 2000), y además gran parte de las leptospiras se
eliminan como complejo inmune. El hecho que no se observen leptospiras por la
Visualización Directa, no elimina la posibilidad de que el individuo sea un portador
crónico, y que el aislamiento de la leptospira, es un método para demostrar su
presencia. No obstante, ni la Visualización Directa ni el cultivo de la orina son
procedimientos rutinarios para el diagnóstico de leptospirosis. La Visualización
Directa requiere de personal muy bien entrenado y expermentado.
En cuanto al aislamiento de los serovares de L. interrogans sembradas en medio
EMJH, se observó turbidez en los cultivos; En campo oscuro, se confirmó la
presencia de leptospiras de los 9 cultivos (100%), el cual fue corroborado más
adelante por PCR.
El tiempo que se requiere para la detección de un cultivo positivo varía con la
serovariedad de Leptospira y el número de organismos presentes en la muestra.
Las serovariedades menos exigentes (por ejemplo Grippotyphosa) pueden dar
resultados positivos como entre 7–10 días después de la inoculación; otras
serovariedades (Bratislava) pueden tardar mucho más tiempo (Ellis op. cit).
42
7.2. Tinción de Leptospiras:
La tinción de leptospiras con el colorante Giemsa del cultivo + orina de L.
interrogans serovar cynoptery en las diluciones 10-1 hasta 10-6 fueron detectadas
solamente en la primera dilución, observándose espiroquetas muy tenues,
agrupadas, de forma alargada y delgada (figura 3).
Estas técnicas de tinción son útiles para diagnosticar la infección en material
patológico que es inadecuado para la realización de cultivos o donde se requiere
un diagnóstico rápido. Puesto que el éxito de estas técnicas depende del número
de organismos presentes, son menos apropiadas para diagnosticar el estado de
portador crónico, donde el número de organismos puede ser muy bajo o
localizado. Las leptospiras no se tiñen bien con los colorantes de anilina, y las
técnicas de tinción argéntica carecen de sensibilidad y especificidad, aunque
constituyen un complemento útil para el diagnóstico histopatológico (Baskervillea
1986).
Figura 3: Tinción de leptospiras con el colorante Giemsa
En el ensayo de límite de detección por PCR, se midió la concentración en ng/mL
en un espectrofotómetro Uva 260 nm del cultivo puro de L interrogans serovar
43
DN PM (g/mol)
l) (g/ (copias/mol) 10 6 l) (Copias / Cantidad
23
3.054.061.560 (g/mol)
l) (g / (copias/mol) 10 6 l) (Copias / Cantidad
23
cynopteri, obteniéndose en la muestra una buena cantidad y pureza de ADN. La
calidad del ADN se observó mediante corrido electroforético, detallándose bandas
con buena definición.
7.2.1. Cuantificación de copias iniciales de ADN de Leptospira sp
Siguiendo la ecuación reportada por Sambrook et al (op. cit.) que se explica a
continuación:
1 mol = Peso molecular (g)
1 mol = 6 x 1023 moléculas (= copias)
El peso molecular (PM) del genoma se calculó con la siguiente fórmula:
PM para ADN de doble Cadena = # bases * (660 daltons/pb)
PM Genoma Leptospira = 4.627.366 pb (660 daltons/pb)
PM Genoma Leptospira = 3.054.061.560 daltons
El ADN total obtenido de del cultivo puro de L interrogans. serovar cynoptery fue
cuantificado obteniendo una concentración de 141.4 ng/µl. Entonces el número de
copias iniciales fue:
Cantidad = 27x106 (Copias / μ l)
44
La concentración final del ADN utilizada en cada dilución, se calculó teniendo en
cuenta que la concentración inicial de ADN total fue de 141.4 ng/µl, y que en cada
muestra se adicionaron 5 µl de la dilución (Tabla 3)
[ADN de la dilución (ng/µl)] * 5µl = [ADN Final en la muestra (ng/µl)]
[ADN dilución 10-1 (14.14 ng/µl)] * 5µl = [ADN Final en la muestra (70.7 ng/µl)]
Tabla 3. Cálculo de la concentración del ADN utilizado en cada dilución y el Número de copias iniciales del genoma por dilución
Dilución [ADN x
pozo]
Copias iniciales de
genoma (copias/µl)
10-1 (70.7 ng) 13.88 x106
10-2 (7.07ng) 138.8 x 104
10-3 (0.707 ng) 138.8 x 103
10-4 (0.0707 ng) 138.8 x 102
10-5 (0.00707
ng)
1388
10-6 (0.000707
ng)
138
Al evaluar la capacidad del ensayo para amplificar y obtener un patrón de bandas
definido, se observó que las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 mostraron una banda
específica con un tamaño de 87 pb, y que a mayor dilución la intensidad de la
45
banda fue disminuyendo. En el resto de diluciones no se visualizaron bandas de
amplificación, tal como se observa en la figura 4:
Figura 4 Electroforesis en geles de agarosa al 2,5% teñido con bromuro de etidio de los productos de amplificación de las diluciones de L. cynopteri, empleando los iniciadores específicos Lepto F y Lepto R en muestras de orina. Carriles: 1) 100 bp ADN Ladder. 2) Control positivo (ADN extraído de cultivo puro de L. serovar cynopteri. 3) Control negativo (ADN extraído de cultivo de L. serovar patoc). 4) Blanco. 5 - 10) diluciones desde 10-1 hasta 10-6.
Este resultado indicó que el límite de detección correcto fue hasta una dilución de
10-3, que equivale a 0.707 ng/ul; también sugirió que pequeñas cantidades de la
bacteria no son detectables por PCR en muestras de orina de pacientes crónicos.
7.3. Extracción de ADN
La cuantificación del ADN de los 9 serovares y las cepas utilizadas como control
negativo extraído mediante el kit QIAamp Mini Kit se consignó en la tabla no. 4,
46
siendo la mayor concentración 106.5 ng/ml y la relación más alta 260/280 fue de
2.274, lo que significa que las muestras no se encontraban contaminadas con
proteínas, fenol u otros ácidos nucléicos.
Tabla 4. Cuantificación de ADN extraído de 9 serovares de L. interrogas y 7 cepas utilizadas como controles negativos.
Serovar
Concentración
[ng/ml] Relación 260/280
autumnalis 85,5 1,887
bataviae 55,8 1,645
bratislava 40,6 1,518
canicola 70,5 1,912
cynopteri 106,5 1,854
copenhageni 82,7 2,175
grippotyphosa 96,8 1,923
mini 62,5 1,337
shermani 53,2 1,561
patoc 70,8 1,547
Escherichia coli, 75,7 1,996
Staphylococcus
aureus 93 2,274
Pseudomonas
aeurginosa 87,6 1,698
Bacillus cereus 72,8 2,181
Bordetella pertussis 69,8 1,834
47
El método de extracción de ADN con el kit QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen,
Australia) está basado en la lisis y extracción del un buffer que contiene proteinasa
K y la purificación es llevad a cabo en minicolumnas de silica. Con otros métodos
convencionales de extracción, el tiempo de inversión es bastante considerable en
comparación con el método del kit comercial, y su gran ventaja es que no requiere
mayor manipulación de las muestras, disminuyendo la probabilidad de
contaminación y error humano.
La cuantificación por densidad óptica demostró que la cantidad de ADN obtenida
fue significativa, y la calidad de la banda fue muy definida, sin rastro de
degradación. (Figura 5)
Figura 5: Corrido electroforético de la calidad de ADN de 12 muestras analizadas, extraídas con QIAamp DNA Mini Kit.
7.4. Estandarización del PCR
7.4.1. Concentración de iniciadores
Las concentraciones finales evaluadas de los iniciadores utilizados para la
reacción de PCR partieron desde 0.1 µM hasta 0.5 µM. La concentración óptima
fue de 0.2 µM, mientras que las concentraciones a 0.3, 0.4 y 0.5 µM mostraron
48
exceso de iniciadores lo cual fue observado mediante el corrido electroforético.
Una concentración menor a 0.2 µM mostró bandas de amplificación muy tenues.
7.4.2. Concentración de Cloruro de Magnesio (MgCl2)
En cuanto a la concentración final de iones de magnesio, se probaron rangos
desde 1.5 mM hasta 4 mM. La concentración que mostró un mejor patrón de
bandas fue a 1.5 mM. Las reacciones que se llevaron a cabo con mayor
concentración de cloruro de magnesio generaron bandas inespecíficas con
respecto al patrón generado a 1.5 Mm.
Las inespecificidades se pueden explicar debido a que a mayor dilución del ADN
los reactivos como Cloruro de Magnesio o la Enzima estarán en exceso, haciendo
que estos dos componentes se unan a lugares inespecíficos los cuales generan
amplicones que a posteriori en el tiempo competirán por la enzima y cofactor con
los amplicones de la secuencia blanco correcta generando una disminución de la
eficiencia en el PCR.
7.4.3. Concentración de enzima
Diferentes concentraciones de enzima fueron utilizadas para los ensayos de PCR.
Se probaron rangos entre 0.5 U, 1U, 1.2U, 1.4U, 1.6U, 1.8U y 2U Unidades de
enzima en reacciones de 50 µL de volumen de reacción. Se decidió utilizar la
enzima a 1.2U ya que esta concentración fue suficiente para observar bandas de
amplificación bien definidas y fue posible diferenciar las serovares patógenas de la
no patógena y de las cepas utilizadas como controles negativos.
49
7.4.4. Temperatura de hibridación
La temperatura de hibridación de los iniciadores es importante para una óptima
amplificación y obtención de un patrón de bandas definido. Se utilizaron
temperaturas entre los 40, 42, 44, 46, 48 y 50 ºC. La temperatura óptima fue de
42ºC, ya que con este parámetro no se obtuvieron bandas inespecíficas; mientras
que a temperaturas mayores, las bandas fueron muy tenues y poco definidas.
Finalmente, se estandarizaron las siguientes condiciones de reacción: 1X de PCR
Buffer (Qiagen), 1.5 mM de ClMg2+(Qiagen), 0.2 mM de dNTPs, 0.2 µM de
iniciador Lepto F, 0.2 µM de iniciador Lepto R, 1.2 U de Taq ADN polimerasa
(Qiagen) y 10 ng de ADN muestra, en un volumen final de 50 µl. La amplificación
se realizó en el termociclador MJ Researhc PTC-100, usando una denaturación
inicial de 94 ºC por 4 minutos; 35 ciclos de amplificación (90ºC por 1 min; 45ºC por
1 min; 72ºC por 1 min); 1 ciclo de amplificación a 45ºC por 1 min y una extensión
final de 72ºC por 10 min..
7.4.5. Amplificación de ADN
Para la amplificación del ADN de leptospira, se utilizaron los iniciadores reportados
por Smythe (2002), diseñados según la secuencia disponible para Leptospira sp a
partir de la región del gen 16S rDNA obtenida de la base de datos de nucleótidos
del GenBank, la cual es específica de las especies de Leptospira patógenas. Se
realizaron los alineamientos de los iniciadores utilizando el programa BLAST. Las
secuencias de iniciadores para la PCR Lepto F 5’-CCCGCGTCCGATTAG- 3’ y
50
Lepto R 5’-TCCATTGTGGCCGAACAC- 3’ fueron localizados entre las posiciones
171 y 258 del gen ya mencionado.
7.4.6. Especificidad
Los iniciadores utilizados para la estandarización del PCR en la detección de
leptospira patógena, amplificaron los 9 serovares pertenecientes a L. interrogans.
Estos serovares son comúnmente utilizados en el MAT. L. biflexa serovar patoc
utilizado como control de leptospira no patógena no mostró banda alguna (figura
6A). Igualmente, de las muestras de ADN de las otras 4 cepas patógenas
bacterianas: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeurginosa,
Bacillus cereus y el aislado clínico de Bordetella pertussis no se observó banda de
amplificación (Figura 6B).
51
Figura 6: A. Electroforesis en geles de agarosa al 2,5% teñido con bromuro de etidio de los productos de amplificación de Leptospira patógena. Carriles: 1) 100 bp ADN Ladder. 2) Control positivo. 3) L. biflexa (control negativo). 4) L. autumnalis. 5) L. bataviae. 6) L. bratislava. 7) L. canicola. 8) L. cynopteri. 9) L. copenhageni. 10) L. grippotyphosa. 11) L. mini. 12) L. shermani. B. Electroforesis de amplificacación de otras cepas patógenas bacterianas. Carriles: 1) 100 bp ADN Ladder. 2) Control positivo. 3) Escherichia coli. 4) Staphylococcus aureus. 5) Pseudomonas aeurginosa. 6) Bacillus cereus. 7) Bordetella pertussis.
Según estos resultados, para estos serovares patógenos utilizados contra las
cepas patógenas bacterianas se puede afirmar que la especificidad del método fue
del 100%, confirmando así que las leptospiras patógenas tienen un factor de
virulencia altamente conservado y no tiene genes ortólogos en especies saprofitas
u otros microorganismos patógenos.
7.5. Resultados de evaluación de pacientes por PCR
Los ensayos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se
emplean en la actualidad en algunos laboratorios de diagnóstico y en la mayoría
52
de los laboratorios de referencia para la detección de leptospiras en tejidos y
fluidos corporales (Smythe 2002).
De un total de 65 muestras analizadas por PCR, se detectó Leptospira patógena
en 12,5% (5/40) de las muestras de orina de personas, y 4% (1/25) de las
muestras de orina de perros, para un total de 6 muestras positivas (Tabla 5).
Tabla 5: Resultados positivos y negativos por PCR de las muestras analizadas de personas y perros.
Muestra PCR positivos PCR negativos Total
Personas 5 35 40
Perros 1 24 25
TOTAL 6 59 65
os datos obtenidos por urocultivo, ya que este último fue la utilizada como gold
standard como prueba de detección de Leptospirosis.
Con estos resultados, se calculó la sensibilidad de la prueba de PCR comparado
con la metodología de urocultivo descrita anteriormente, donde:
Sensibilidad = [PA /NP] * 100
Donde: PA = resultados positivos obtenidos por PCR
NP= número de muestras positivas por urocultivo.
Al reemplazar:
Sensibilidad del PCR= [6 / (6 + 2)]*100 = 75%
53
Todas las muestras positivas amplificaron con los iniciadores específicos
obteniendo una banda de amplificación de 87 pb, según Figura 7:
Figura 7: Electroforesis en geles de agarosa al 2,5% teñido con bromuro de etidio de los productos de amplificación de 6 muestras positivas de Leptospira patógena en muestras de orina. Carriles: 1) 100 bp ADN Ladder. 2) Control positivo (L. interrogans serovar cynopteri). 3) Control negativo (L. biflexa serovar patoc). 4-9) Muestras positivas de personas y perros). 10) Blanco.
Los resultados demostraron que la PCR fue sensible y específica, en base a los
iniciadores descritos por Smythe (op. cit), para la detección de leptospirosis en
muestras de orina en pacientes crónicos. Esta estandarización de PCR
desarrollado logró detectar el ADN de leptospiras patógenas y diferenciarlo de las
no patógenas, aunque no se puede diferenciar los serovares. Este inconveniente
podría ser una dificultad en estudios ambientales donde se requiera la
diferenciación entre los distintos serovares; sin embargo, no tiene importancia en
el aspecto clínico, pues no se aisla L. biflexa (no patógena) en muestras humanas.
54
El procesamiento de la muestra para PCR es decisivo y debe ser adecuado para
el tejido, el fluido y la especie que se esté analizando.
La PCR es una herramienta molecular útil para el diagnóstico de la leptospirosis
que sumada a las pruebas serológicas sirve para esclarecer casos de pacientes
crónicos en los que es necesario hacer diagnóstico diferencial. También es de
gran utilidad en la dilucidación de brotes y casos de fallecidos que permite
implementar medidas de control epidemiológico.
Se sugiere así, que para lograr un diagnóstico exitoso por PCR es necesario
colectar la muestra de orina para el examen durante la primera semana del
establecimiento de los síntomas y si es posible antes de la terapia con antibióticos
(Velasco-Castreon 2008).
En general, se considera que los sobrevivientes de leptospirosis aguda, en forma
espontánea o por tratamiento médico, se curan y se recuperan. Sin embargo,
aunque esto se piense así, no siempre ocurre de esta manera y, aparentemente,
un porcentaje alto evolucionan hacia la cronicidad, a pesar de haber sido
adecuadamente tratados. Algunos lo hacen con rapidez (semanas a meses) y
otros sufren aparentemente una fase indeterminada, similar a la que ocurre en la
enfermedad de Chagas, permaneciendo en ella toda su vida o tardando años en
evolucionar hacia la fase crónica. A pesar de que existen artículos o capítulos de
libros en que se hace mención a la leptospirosis evolutiva o persistente, esta fase,
común en los animales, (Shpilberg 1990) es poco conocida en el hombre. Sin
embargo, es frecuente que en la práctica diaria el médico atienda a este tipo de
enfermos sin sospechar siquiera la enfermedad que los aqueja, particularmente
55
cuando los títulos de anticuerpos a la microaglutinación en placa (MAT) son más
bajos que los requeridos por la norma técnica actual que exige titulaciones ≥a
1:100 en la mayor parte de los países del mundo. Por esta razón, los pacientes
con títulos por debajo de esa cifra se consideran negativos (Velasco-Castreon op.
cit) e incluso, a pesar de que mueran por leptospirosis, no serán considerados
como enfermos de leptospira, a menos que se les realicen biopsias u otros
estudios efectuados por expertos, como la impregnación argéntica y búsqueda de
leptospiras o sus productos mediante inmunofluorescencia indirecta para
búsqueda de antígeno, histopatología e inmunohistoquímica. También es
relevante hacer notar que es muy común que en la fase crónica se observen
recaídas y mejorías frecuentes del cuadro clínico. Por otro lado, la frecuencia de
leptospirosis humana crónica sugiere la existencia de un grave problema de salud
pública no reconocido y que por esta circunstancia es aún más grave. Al no ser
diagnosticada y sí confundida con otras enfermedades, los pacientes con
leptospirosis humana crónica van a permanecer enfermos por largas temporadas
e incluso por toda la vida, lo que repercute gravemente en la economía familiar y,
por su gran prevalencia, en la del país (Velasco-Castreon 2007).
La detección de leptospirosis mediante PCR promete ser el método diagnostico
molecular más sensible durante los primeros días en los que se presentan los
síntomas de la enfermedad, y así mismo poder contar con un acertado
tratamiento. Esto con el fin de generar un impacto económico y social al
convertirse en una estrategia de control integral sobre esta enfermedad que causa
una significativa morbi-mortalidad en la población humana y animal.
56
8. CONCLUSIONES
1. La observación directa por campo oscuro no es recomendada como
diagnóstico de Leptospira, ya que puede generar falsos positivos, al ser
confundidas las espiroquetas con otros artefactos presentes en fluidos
corporales, tales como fibrinas. Este método sólo se recomienda para la
observación de leptospiras aisladas de cultivo.
2. Aunque la metodología de aislamiento de Leptospira por urocultivo dio un
resultado mejor que la observación directa, esta técnica fue menos sensible
que la detección por PCR. Se puede concluir entonces, que el diagnóstico a
partir de orina de pacientes crónicos debe realizarse sólo por técnicas
moleculares, puesto que los cultivos necesitan altas concentraciones del
microorganismo para su crecimiento, y en la orina, la leptospira se
encuentra en muy bajas concentraciones, dada la labilidad de la bacteria
misma.
3. La extracción de ADN a partir de Orina utilizando la metodología
recomendada por QIAamp DNA Mini Kit resultó ser adecuada, ya que
proporcionó una buena calidad y cantidad de ADN. Sin embargo, el
tratamiento de la muestra de orina puede ser mejorada para obtener
mayores cantidades de ADN y menos inhibidores.
57
4. La estandarización del PCR para la detección de Leptospira, también fue
específica, al no generar producto amplificado en las muestras utilizadas
como controles negativos y tampoco generó bandas inespecíficas.
Entonces esta metodología podría ser utilizada en el futuro como método
de referencia para el diagnóstico de Leptospiroris, ya sea en fase aguda o
crónica de la enfermedad.
5. Los resultados obtenidos corroboran la necesidad de implementar el
diagnóstico de Leptospira mediante PCR, con el fin de proporcionar a los
pacientes un diagnóstico rápido y específico, evitando así que la
enfermedad trascienda a una fase crónica.
58
9. RECOMENDACIONES:
1. Se hace necesario estandarizar el diagnóstico por PCR de Leptospira
patógena, con el diseño de nuevos iniciadores que permitan la
diferenciación de las serovariedades conocidas con mayor prevalencia en el
Valle del Cauca, ya que esto podría aportar al control y manejo integral de
la Leptospirosis.
2. Para la metodología utilizada en la extracción de ADN de orina, se
recomienda la neutralización de la muestra con PBS inmediatamente
después de su recolección, así como el reposo de la muestra durante 2
horas, con el fin de reducir las probabilidades de inhibidores de la PCR.
3. Para un diagnóstico más preciso y exitoso de leptospirosis, se recomienda
la estandarización de la detección mediante PCR, para muestras de sangre
en la fase aguda de la enfermedad, además de la implementación de la
PCR en tiempo real, la cual brinda resultados más sensibles, confiables y
específicos.
59
10. LITERATURA CITADA:
ADLER, B. 1986. Development of and improve selective medium for isolation of leptopires from clinical material. Veterinary Microbiology 121: 377-381. AGUDELO P. 2005. Leptospirosis: Diagnóstico serológico. Revista CES Medicina 19(1):37-41 AREAN, D. H. & J. Matsunuga. 2002. Characterization of the Leptospiral Outer Membrane and Description of Three Novel Leptospiral Membrane Proteins. Infection and Inmunity 70(9): 4936 - 4945 ARIAS, R., OBREGÓN A. & C. FERNÁNDEZ. 2002. Taxonomía de las Leptospiras. en: XVIII Congreso Panamericano de Ciencias Veterinarias Habana, Cuba. ASTUDILLO, M. 2005. "Estudio seroepidemiológico de la leptospirosis humana en el departamento del Valle del Cauca, Colombia" . En: Cuba. Revista Cubana De Medicina Tropical 61(2):1 - 9 BAJANI, M.D., A.D. ASHTORD, S.L. BRAGG, C.W. WOODS, T. AYE & R.A. SPIEGEL. 2003. Evaluation of four commercially available rapid serologic test for Diagnosis of leptospirosis. Journal of Clinical Microbiology 41(2): 803 - 809 p. BASKERVILLE, A.1986. Histological aspects of diagnosis of Leptospirosis. In: W. A. Ellis & T.W.A. Little (Eds.) Present state of Leptospirosis diagnosis and control. Martinus Nijhoff Publishers, 33-43. BHARTI, A. R., J.E. NALLY, J.N. RICALDI, M.A. MATTHIAS, M. M DÍAZ & M. A. LOVETT. 2003 Leptospirosis: a zoonotic disease of global importance. Lancet Infectious Diseases 3(12):757 – 771.
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11. ABREVIATURAS
ELISA: ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas
MAT: Test de microaglutinación
MCAT: técnica de aglutinación de microcápsula
PCR: Polymerase Chain Reaction (Reacción en Cadena de la Polimerasa)
DNA: ácido dexosirribonucléico
µm: micrometro
DAB: biotina–avidit reactivos coloreados
HUV: Hospital Universitario del Valle
LCR: Líquido cefaloraquídeo
LPS: Lipopolisacaridos
OMPs: outer membrane proteins
IgG: Inmunoglobulina G
IgM: Inmunoglobulina M
EMJH: Medio Ellinghausen, McCullough, Johnson y Harris
RNA: ácido ribonucleico
mL: mililitro
µL: microlitro
5FU: 5-fluorouracil
PBS: Tampón fosfato salino
rpm: revoluciones por minuto
ng: nanogramos
µM: micromolar
mM: milimolar
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U: unidades
Pb: pares de bases
PM: peso molecular
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12. ANEXOS
ANEXO A. Protocolo de Extracción de ADN con el kit QIAamp DNA Mini Kit
(Qiagen, Australia)
1. Tomar 1mL de orina y se deposito en un vial de 1.5mL
2. Centrifugar a 7500 rpm por 10 minutos a temperatura ambiente
3. Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet en 180 uL de Buffer ATL.
4. Mezclar por inversión y adicionar 20 uL de Proteinasa K. Homogenizar con
vortex e incubar a 56ºC por tres horas.
5. Después de la incubación, adicionar a la mezcla 200 uL de buffer AL y 200
uL de etanol al 70%. Mezclar con vortex
6. Transferir con pipeta todo el contenido del vial a un tubo colector.
7. Adicionar 500 uL de buffer AW1.
8. Centrifugar a 8000 rpm por un minuto
9. Descartar tubo colector y transferir la minicolumna a un nuevo tubo colector.
10. Adicionar 500 uL de buffer AW2 y centrifugar a 14000 rpm por 3 minutos
11. Trasnsferir la minicolumna a un vial de 1.5 mL y adicionar 100 uL de buffer
AE directamente sobre la memebrana.
12. Incubar 1 minuto a temperatura ambiente.
13. Centrifugar a 8000 rpm por 1 minuto.
14. Descartar la minicolumna y almacenar el ADN a -20ºC.
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ANEXO B: REACTIVOS ELECTROFORESIS
TBE 5x
SOLUCIÓN STOCK CORRIDA ELECTROFORESIS
1. En un beaker de 1000 mL agregar 800 mL de Agua destilada.
2. Adicionar los siguientes reactivos:
.
3. Mezclar bien con magneto. Una vez disuelto, completar a 1000 mL con
agua destilada en una probeta.
4. Guardar la solución en un frasco de 1000 mL.
TBE 1X
SOLUCIÓN CORRIDA ELECTROFORESIS
1. Mezclar bien la solución TBE 5x
2. En una probeta de 1000 mL colocar 200 mL de TEB 5x
3. Llevar a 1000 mL con agua destilada.
BUFFER TEB 5X
1000 mL de solución
Cantidad [stock]
Trizma Base 54 g 445 mM
Ácido Bórico 27.5 445 mM
EDTA pH 8.0 20 mL 10 mM
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ANEXO C: PREPARACIÓN DE MEDIO LÍQUIDO DE EMJH (ELLINGHAUSEN
AND McCULLOUGH
Medio Base
1. Disolver 0.26 g de EMJH por cada 100 mL de H2O Destilada
2. Ajustar el pH a 7,4 con solución NaOH 0.2 N
3. Adicionar 0.15% de Agar Noble y esterilizar.
4. Adicionar 1 mL de Suero de Conejo (1%) cuando el medio base esté a
45ºC
5. Adicionar 1 mL de 5-fluorouracil (1%)
6. Adicionar suplemento de EMJH (50 mL por cada 450 mL)
7. Homogenizar la mezcla e incubar a 28ºC para luego distribuir en tubos.
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ANEXO D: PREPARACIÓN DE MEDIO STUART MODIFICADO
1. Pesar los siguientes reactivos
Reactivo Cantidad (g)
por 100 mL de
agua estéril
NaCl 0.193
NH4Cl 0.068
MgCl2.6H2O 0.034
L- aspargina 0.013
Na2HPO4 (anhydrous 0.067
KH2PO4 0.087
2. Homogenizar la mezclar y esterilizar
3. Adicionar 10 mL de Suero de Conejo.
4. Homogenizar la mezcla e incubar a 28ºC para luego distribuir en tubos.
