http://www.msal.gov.ar/

Detección diagnóstica de

Cianotoxinas

y Cianobacterias Toxígenas

Graciela L. Salerno

FUNDACIÓN PARA INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS APLICADAS

Centro de Investigaciones Biológicas- Mar del Plata - ARGENTINA

FIBA

FIBA-Mar del PlataBuenos Aires, 25/11/2011

Las Floracioneso “BLOOMS”

Las cianobacterias como

organismos “peligrosos”

Diversidad de cianobacterias

Toxinas cianobacterianas(Metabolitos secundarios)

HEPATOTOXINAS (microcistina, nodularina,

péptidos cíclicos) Anabaena spp., Anabenopsis, Microcystis,

Nostoc, Oscillatoria, Planktothrix, Nodularia)

HEPATOTOXINAS (Cilindrospermopsina, alcaloide)Aphanizomenon, Cylindrospermopsis

NEUROTOXINAS (Anatoxina a, saxitoxina, alcaloides)

Anabaena, Aphanizomenon, Cylindrospermum,

A. circinalis, Aphazinomenon flos-aquae, Lyngbya wolleii)

Dermototoxinas (Aplisiatoxina, Lyngbiatoxina,

alcaloides) Lyngbia

Compuestos volátiles (olor a gamexane, debido a la producción de

geosmina y 2-metil isoborneol, o de gas sulfhídrico), por

cianobacterias o hongos asociados.

“BLOOMS”

Microcystis sp.

Microcystis aeruginosa

Caracterización morfológica de M. aeruginosa

(CAAT 2005-3) (Light microscopy 100x) y tinción negativa

Detección de

especies productoras de toxinas

Monitoreos ambientales

-- Análisis microscópicos

-- Detección molecular

Moffit MC et al. 2004

Operones de cianotoxinas8

8

8

8

mcyE

mcyG

mcyD

mcyJ

mcyF

mcyD

mcyE

mcyE

mcyG

mcyD

mcyG

mcyA

mcyA

mcyH

mcyB

mcyB

mcyBmcyA

mcyC

mcyC

mcyC mcyJ

mcyH I F

mcyJ I H

mcyT

ndaI H G ndaF ndaE ndaD ndaC ndaA ndaB

Anabaena

Nodularia

Microcystis

NRPS PKS Enzimas complementares Transportador ABC

Planktothrix

16

16

16

16

24

24

24

24

32

32

32

32

40

40

40

40

48

48

48

48

kb

kb

kb

kb

Anabaena

Nodularia

Microcystis

Planktothrix

mcy G mcy D mcy Emcy

J

A PC

P

KS AT CM KR ACP KSKS

AT

ACPACP

KRKR

AT

DH

DH

CM A

PC

P

CM

AMT C CAT

ACPKS

S

O

S

OH

OS

O

OH

OS

OH

NH2

OS

O

SO

NHO

O

H

NH2

O

O

mcy G mcy D mcy Emcy

J

A PC

P

KS AT CM KR ACP KSKS

AT

ACPACP

KRKR

AT

DH

DH

CM A

PC

P

CM

AMT C CAT

ACPKS

S

O

S

OH

OS

O

OH

OS

OH

NH2

OS

O

SO

NHO

O

H

NH2

O

O

+Phenylacetate+ATP

+Malonyl-CoA

+NADPH + H+2 x SAM

+

+Malonyl-CoA

+NADPH + HSAM-H O

+

2+Malonyl-CoA

+NADPH + H-H O

+

2+Malonyl-CoA+Glutamate?+SAM

+L-Glu

+ATP

Microcystis aeruginosa PCC7806

Microcistina LR

Genes para identificar cianotoxinas

Microcistina

Nodularina

Cilindrospermopsina

Saxitoxina

mcyB

mcyA

mcyD

mcyE

mcyG

nda

cyr

sax

PCR Multiplex: mcy

mcyD

mcyC

mcyG

-- Real Time PCR

-- Detección de chips de DNA

Metodologías más novedosas

qPCR o PCR en tiempo real

Identificación de 10 a 10.000.000 de moléculas “blanco” por muestra

CIANOTOXINAS

Microcistina

> 80 formas

Detección de toxinas

Cilindrospermopsina

Nodularina

Microcystis, Oscilatoria, Anabena, Nostoc

MC-LR

Detección de toxinas

-- ELISA (inmunodetección en placa)

-- Métodos cromatográficos HPLC/Masa

-- Kits de inhibición de fosfatasa PP2A

Análisis de Microcistinas (MCs)

• Grandes esfuerzos en desarrollar técnicas para

analizar MCs en cyano y agua

• Un desafío: detectar y cuantificarlas

en tejidos animales

Análisis de Microcistinas (MCs)

Limitaciones:

-- Están en MUY BAJAS concentraciones

-- Los tejidos tienen altas cantidades de proteínas

y otras macromoléculas (interferencias y

subestimación).

-- Unión covalente de las toxinas con proteínas

El estado del arte

y

recientes reportes

Identificación de microcistinas

en suero

Primera identificación en una población

humana expuesta crónicamente

Chen et al. (2009) TOXICOLOGICAL SCIENCES 108(1), 81–89

MCs en el suero de pescadores

chinos

Resultados de la Cromatografía líquida /MS/MS del suero de 35

pescadores seleccionados al azar que viven en el Lake Chaohu.

MC-RR

MC-YR

MC-LR

Evidencia estadística que indica

que una exposición prolongada a

MC-LR (a bajas dosis) influencia

los niveles séricos ALT, AST, LDH

y ALP.

Índces Bioquímicos en el suero de los pescadores

(n = 35)

Comparación con niveles de MCs en

pacientes de Caruarú

En este estudio:

MCs totales (-LR, -YR, -LR):

entre 0,045 y 1,832 ng/ml

En promedio, en sueros de muestras de

los pacientes hemodializados de

Caruarú, que sufrieron exposición letal

fue estimada en 2,2 ng/ml eq.MC-LRpor el método de ELISA (17 muestras de 12 víctimas)

Efecto de exposición crónica a MCs

en niños

• A Cross-Sectional Investigation of Chronic

Exposure to Microcystin in Relationship to

Childhood Liver Damage in the Three Gorges

Reservoir Region, China

Li et al. Environmental Health Perspectives • vol.119 | number 10 | October 2011

Los participantes fueron seleccionados al azar de 5 escuelas (Fuling Borough, Chongqing)

• Se detectó MCs en el agua de bebida, en la comida y en el suero de los niños en estudio.

• La exposición a MCs estuvo asociada con el incremento de niveles de enzimas en el sueroy daño hepático entre los niños en estudio.

• Este estudio puede ayudar al gobierno a hacer

una política sobre prohibir acuacultura en lagos que suministran agua de bebida

• Son necesarios métodos de detección de MC más sensibles y biomarcadores más apropiados en las poblaciones expuestas!!!

Conclusiones

Contar con datos ambientales de presencia de cianobacterias toxígenas y niveles de toxinas.

Generar datos para implementar políticas.

Contar con métodos para dosaje de MCs en los laboratorios.

Plantearse iniciativas a nivel nacional para desarrollar métodos de diagnósticoen tejidos.

FUNDACIÓN PARA INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS APLICADAS

Centro de Investigaciones Biológicas- Mar del Plata- ARGENTINA

FUNDACIÓN PARA INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS APLICADAS

Centro de Investigaciones Biológicas- Mar del Plata- ARGENTINA

V Taller

Cianobacterias Toxígenas

Mar del Plata 2012

FUNDACIÓN PARA INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS APLICADAS

Centro de Investigaciones Biológicas- Mar del Plata - ARGENTINA

FIBA

¡¡Muchas gracias !!