Determinación de bioplaguicidas microencapsulados: aceites ... · eugenol en el caso de la canela...

Alberto Moral Ruiz

María Trinidad Cedrón Fernández y Susana Cabredo Pinillos

Facultad de Ciencia y Tecnología

Grado en Química

2015-2016

Título

Director/es

Facultad

Titulación

Departamento

TRABAJO FIN DE GRADO

Curso Académico

Determinación de bioplaguicidas microencapsulados: aceites de canela y menta

Autor/es

© El autor© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2016

publicaciones.unirioja.esE-mail: [email protected]

Determinación de bioplaguicidas microencapsulados: aceites de canela ymenta, trabajo fin de grado

de Alberto Moral Ruiz, dirigido por María Trinidad Cedrón Fernández y Susana CabredoPinillos (publicado por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una Licencia

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Trabajo de Fin de Grado

(Grado en Química)

Determinación de bioplaguicidas

microencapsulados: aceites de

canela y menta

Alberto Moral Ruiz

Tutoras: Mª Trinidad Cedrón Fernández

Susana Cabredo Pinillos

Logroño, junio de 2016


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Agradezco a mis tutoras oficiales Susana Cabredo y Trinidad Cedrón, y a mis tutores no oficiales Félix Gallarta y Cecilia Sáenz, por su ayuda y apoyo durante estos meses de trabajo en el laboratorio.

A Jorge Barriobero y el Centro Tecnológico de la Industria Cárnica-Centro de Innovación y Tecnología Alimentaria, por su colaboración en la preparación de las microcápsulas y la ayuda recibida.

A Andrea Rubio por ser mi acompañante en esas interminables mañanas de laboratorio y echar siempre una mano que era posible.

A mis padres y hermana por la ayuda y la paciencia que siempre me han brindado.

A María Celsa Peña por ayudarme con mi lamentable inglés y ser mi apoyo en todo momento.


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Índice.

Resumen.................................................................................................................................. 4

Abstract. ................................................................................................................................... 4

1. Introducción. ........................................................................................................................... 5

2. Objetivos................................................................................................................................ 12

3. Material e instrumentación. ................................................................................................ 13

3.1. Material empleado. ....................................................................................................... 13

3.2. Instrumentación. ........................................................................................................... 13

4. Resultados. ........................................................................................................................... 15

4.1. Estudios previos. ........................................................................................................... 15

4.1.1. Cromatografía de gases-masas. ......................................................................... 15

4.1.2. Cromatografía de gases-FID. .............................................................................. 22

4.1.3. Patrón interno......................................................................................................... 24

4.2. Desarrollo y validación del método analítico. ........................................................... 26

4.2.1. Intervalo lineal. ....................................................................................................... 26

4.2.2. Rectas de calibrado y sensibilidad. .................................................................... 28

4.2.3. Límite de detección (LOD) y límite de cuantificación (LOQ). ......................... 31

4.2.4. Precisión: Repetibilidad y precisión intermedia. ............................................... 33

4.2.5. Cuantificación de los aceites esenciales. .......................................................... 35

4.2.6. Factor de recuperación. ........................................................................................ 36

4.2.7. Resumen de la puesta a punto del método....................................................... 37

4.3. Análisis de las microcápsulas ..................................................................................... 38

4.3.1. Rendimiento del proceso de encapsulado. ....................................................... 39

4.3.2. Eficacia de encapsulación. .................................................................................. 40

4.3.3. Evolución de las microcápsulas con el tiempo. ................................................ 40

5. Conclusiones. ................................................................................................................... 43

6. Bibliografía. ....................................................................................................................... 44


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Resumen.

Una alternativa al uso de plaguicidas clásicos ha sido el empleo de bioplaguicidas basados en aceites esenciales, que acaban con los agentes nocivos de las cosechas causando menos problemas medioambientales, aunque con menor efectividad.

En este estudio se puso a punto un método para determinar los componentes mayoritarios de aceites esenciales de canela y menta en microcápsulas, que es un modo en que estos aceites se emplean como bioplaguicidas.

Se analizaron en primer lugar los aceites esenciales por medio de cromatografía de gases-masas para conocer los componentes mayoritarios de cada aceite, siendo eugenol en el caso de la canela y mentol en el caso de la menta.

Una vez conocidos, se puso a punto el método de determinación los compuestos mayoritarios por medio de cromatografía de gases-FID y se obtuvieron las rectas de calibrado, el intervalo lineal, la sensibilidad, la precisión y el factor de recuperación.

Finalmente se analizaron las microcápsulas para calcular la eficacia y el rendimiento de encapsulado y cómo difunden los aceites desde la microcápsula.

Abstract.

Employing biopesticides that are based on essential oils is one of the best alternatives to the classical pesticides. Biopesticides are able to finish up with the harmful agents, bringing about less environmental problems, but having less effectiveness.

Microcapsules is the way essential oils are used as biopesticides, and the tuning up of the method for the determination of cinnamon and peppermint essential oils in those microcapsules was the final objective in our study.

First of all, the essential oils were analysed through gas chromatography-mass, in order to know the main components of each oil. On one side, the main component of cinnamon oil is eugenol, meanwhile on the other side, the main component of peppermint oil is menthol.

Once known the main components of each oil, the method for the determination of those main components through gas chromatography-FID was tuned up, obtaining the calibration lines, the linear range, the sensibility, the accuracy and the recovery factor.

At last, microcapsules were analysed in order to appraise the microencapsulation yield and its efficacy, and how the essential oils spread out from the microcapsule.

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1. Introducción.

Los aceites esenciales son productos de composición generalmente muy compleja que contienen los principios volátiles que se encuentran en los vegetales más o menos modificados durante su preparación (Farmacopea Francesa, 1965).[1] Estos productos tienen un aroma intenso, otorgando así el olor característico de cada planta. En general son menos densos que el agua, aunque existen excepciones, como es el caso del clavo. Son solubles en disolventes orgánicos, como el hexano o el diclorometano, pero sin embargo son insolubles en agua.

Son característicos de los siguientes órdenes: Magnoliales, Laurales, Austrobaileyales y Piperales, además de algunas familias no pertenecientes a estos órdenes como son Verbenaceae o Lamiaceae. Dentro de la planta se pueden encontrar en las flores (rosa), en todo el árbol (eucalipto), en las hojas (citronela), en la madera (sándalo), en la raíz (vetiver), en la resina (incienso) o en la cáscara de sus frutos (limón). [2]

El método más común para obtenerlos es la destilación por vapor, donde se introduce en un alambique la parte de la planta que se quiere destilar junto con agua. Al calentarse, el vapor arrastra las moléculas volátiles que llegan a otro recipiente. Al enfriarse, la diferencia de densidad hace que el aceite quede depositado encima del agua. Otros métodos para su obtención son la extracción por presión en frío, la maceración o la extracción con disolventes volátiles.[3]

Existen diversos factores que pueden modificar la actividad de los aceites esenciales, y, por lo tanto, restringir su uso. Estos factores pueden resumirse en tres puntos importantes:

La influencia del ciclo vegetativo: la proporción de los diferentes constituyentes de un aceite esencial puede variar a lo largo de su desarrollo.

La influencia de factores extrínsecos, del entorno y de las prácticas de cultivo. La influencia del proceso de obtención de los propios aceites esenciales: la

labilidad de los constituyentes de los aceites esenciales explica que la composición del producto obtenido por hidrodestilación sea, generalmente, diferente de la mezcla de los constituyentes inicialmente presentes en los órganos secretores del vegetal.

De la mayoría de los aceites esenciales se pueden obtener distintas propiedades o acciones farmacológicas y toxicidad:

- Propiedades farmacológicas:[1][4]

Poder antiséptico frente a diversas bacterias patógenas, incluso cepas habitualmente resistentes a los antibióticos.

Propiedades espasmolíticas y sedantes. Numerosas drogas, entendiendo droga como material que contiene los principios activos con actividad farmacológica necesarios para su uso directo o para la elaboración de medicamentos, con aceites esenciales son reputadas como eficaces para disminuir o suprimir los espasmos gastrointestinales.


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Actividad tóxica:[5]

Toxicidad dérmica: los aceites esenciales pueden producir irritación en la piel por contacto con ésta, como el aceite esencial de naranja (Citrus × sinensis) o de eucalipto (Eucaliptus globulus).

Carcinogénesis: algunos aceites esenciales poseen compuestos que son potencialmente cancerígenos como es el caso del aceite de estragón (Artemisia dracunculus) o el anís verde (Pimpinella anisum).

Hepatotoxicidad: algunos aceites esenciales son dañinos para las células del hígado como el aceite esencial de nuez moscada (Myristica fragrans).

Nefrotoxicidad: algunos aceites esenciales presentan efectos perjudiciales sobre las células de los riñones como el aceite de sabina (Juniperus sabina).

Los aceites esenciales se emplean en perfumería, siendo este su mercado principal; en farmacia, mediante la preparación de infusiones, siendo además el soporte de una práctica de cuidados especial, denominada aromaterapia; en industrias agroalimentarias o químicas, como bioplaguicidas, en los cuáles se aprovechan tanto las actividades farmacológicas como la actividad antimicrobiana de algunos aceites esenciales.

Los plaguicidas son sustancias destinadas a matar, repeler, atraer, regular o interrumpir el crecimiento de algunos seres vivos considerados como plaga. Los plaguicidas no son necesariamente venenos, pero pueden ser tóxico para los animales u otros seres vivos que no son los seres considerados como plaga.[6]

El control de plagas en la agricultura ha dependido en gran medida del empleo de productos químicos sintéticos que aniquilen rápidamente el insecto. Este método consigue mantener las poblaciones de plaga a niveles tolerables, lo que ha supuesto una gran ayuda en el desarrollo de la agricultura. Sin embargo, su uso indiscriminado ha desembocado en la contaminación de suelos y mantos freáticos, efectos tóxicos en animales y seres humanos, genotipos resistentes y muerte de enemigos naturales de las plagas.

Estos problemas obligan a buscar alternativas en el control de plagas, como podrían ser los bioplaguicidas. Los bioplaguicidas, debido a su rápida degradación pueden ser más selectivos con insectos plaga y menos agresivos con otras especies. Los insectos y otros parásitos tienden a desarrollar menor resistencia a productos naturales que a productos sintéticos clásicos. Los bioplaguicidas, al ser menos tóxicos y al degradarse rápidamente disminuyen el riesgo de residuos en los alimentos. Por contra, estos productos necesitan mayor número de aplicaciones para tener una efectividad alta, su producción no es tan sencilla como la de los insecticidas químicos y son más sensibles a factores ambientales.[7]

Los agentes empleados como plaguicidas biológicos se pueden dividir en tres grupos:

Microorganismos: bacterias, hongos, oomicetos, virus y protozoos. Productos bioquímicos como aceites esenciales. Semiquímicos (feromonas de insectos).


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Dentro del segundo grupo se encuentran los aceites esenciales, que tienen acción antiséptica y bactericida. Los más activos son los aceites ricos en fenoles como el de tomillo (timol y carvacrol) o canela (eugenol); y las esencias con alcoholes y cetonas como la menta (mentol y mentona) o el árbol del té (terpin-1-en-ol).

La determinación de aceites esenciales se puede llevar a cabo con diferentes métodos, como la cromatografía de gases acoplada a un detector de masas (CG-EM) o a un detector FID que son los empleados en este estudio (CG-FID).

Otros métodos empleados son la cromatografía de líquidos de alta resolución acoplada a un espectrofotómetro UV-visible (HPLC-UV-Vis) o la cromatografía de gases acoplada a un espectrofotómetro infrarrojo (CG-FTIR).

Un ejemplo del empleo de CG-EM es el llevado a cabo por Çetin et al [8] donde se analizaron los aceites esenciales de dos plantas de especias: Cymbocarpum

erythraem y Echinophora tenuifolia. Además de determinar los componentes de estos aceites, se analizó su actividad antimicrobiana frente a microorganismos que crecen en los alimentos.[9]

El aceite de Cymbocarpum erythraem resultó ser rico en (E)-2-decenal, (E)-2-decen-1-ol y (E)-2-dodecenal. Se analizó su actividad antimicrobiana frente a 24 bacterias, 3 hongos y 3 levaduras, dando resultados buenos.

El aceite de Echinophora tenuifolia tenía como componentes principales metileugenol, p-cimeno y α-felandreno. El estudio frente a los mismos agentes microbianos que el otro aceite también dio buenos resultados.

La actividad antimicrobiana de estos aceites fue bastante alta , en particular, frente a bacterias psicrófilas, bacterias que son capaz de vivir a temperaturas por debajo de 5 ºC. Esta familia de bacterias es uno de los problemas más importantes de los alimentos almacenados en frío.

Por otra parte, Hajimehdipoor et al [10] validaron un método para la determinación de timol y carvacrol en tomillo (Thymus vulgaris), por medio de HPLC-UV-Vis y CG-FID. Desarrollaron el método de determinación de éstos compuestos ya que ambos tienen alto poder antiséptico [11]. El método más habitual para analizar componentes volátiles derivados de las plantas es la cromatografía de gases[12], sin embargo no es posible determinar timol y carvacrol en muestras farmacéuticas de un modo directo. Por ello, se emplea HPLC, una de las técnicas más precisas para determinar compuestos derivados de las plantas, tanto volátiles como no volátiles.[13]

En este estudio se empleó una mezcla de agua y acetonitrilo 50:50. Los resultados obtenidos fueron bastante buenos, pudiendo ser ésta una buena alternativa a la cromatografía de gases.

Li et al [14] realizaron un estudio acerca del aceite esencial de la corteza de 3 especies de árbol de canela por medio de CG-EM y CG-FTIR.


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En el estudio realizado se utilizaron dos aceites esenciales, obtenidos de la menta y de la canela:

Menta (Mentha sp. L.) [15]

Se usan diferentes especies del género Mentha, perteneciente a la familia Laminaceae. La que está recogida en la Farmacopea es la menta piperita (Mentha piperita), la dulce (Mentha viridis) y la poleo (Mentha pullegium).

Se emplean las hojas, pero muchas veces para la obtención del aceite esencial se emplean las sumidades floridas. En todos los casos son plantas herbáceas, que se distinguen muy bien porque su tallo es cuadrangular. Las hojas son opuestas y de margen dentado. La coloración de las flores es variada.

En la figura 1 se observa una planta de mentha piperita.

Figura 1: Planta de mentha piperita

La Mentha piperita se considera una especie, aunque su origen es un híbrido que viene de 2-3 especies distintas de menta (acuatica x viridis, acuatica x spicata, acuatica x rotundifolia).

Es una planta que se cultiva ampliamente en climas templados; necesita terrenos ricos en materia orgánica, sueltos, frescos, ricos en humus. Requiere muchos cuidados y se multiplica de manera vegetativa. Hay muchas variedades y en el cultivo se intenta seleccionar y cultivar las variedades que sean más resistentes a parásitos y ricas en aceite esencial.

El contenido en aceite esencial y la composición del aceite van a variar mucho en función de factores ambientales, del cultivo, del ciclo vegetativo (primero mentona y luego mentol). Se suelen recolectar antes de la floración, habiendo 2-3 cortes anuales.

Acciones y usos

Propiedades carminativas que le dan acciones para tratar los trastornos digestivos (dispepsia, cólicos y flatulencia). Por su propiedad


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descongestionante se usa en resfriado y por la antiséptica como desinfectante. Parece que también tiene propiedades analgésicas y se puede usar por vía tópica como antirreumático.

Canela (Cinnamomum zeylanicum, Cinnamomum verum J.Presi) [16]

La canela se obtiene del árbol de la canela, árbol de hoja perenne que crece aproximadamente hasta unos 10 o 15 metros de altura, perteneciente e la familia Lauraceae. Su origen se encuentra en Sri Lanka, aunque también se cultiva en la India, y en otros lugares del mundo, así como en todo el continente asiático.

Para su crecimiento requiere un clima cálido y húmedo, con una temperatura media anual de entre 24 y 30 ºC, y una precipitación de entre 2.000 y 4.000 mm anuales, si bien, distribuidos durante todo el año. Estas condiciones se dan únicamente entre los 0 y los 600 metros sobre el nivel del mar.

El árbol, como ya se ha dicho, es de hoja perenne, creciendo más de 10 m de altura, cuyo tallo es de consistencia leñosa y sus hojas son ovaladas y puntiagudas. Sus flores son hermafroditas, blancas o amarillo verdosas,

Principalmente se aprovecha como especia la corteza interna, liberada de la parte externa, de color marrón grisáceo, que se extrae pelando y frotando sus ramas.

En la figura 2 se muestra un árbol de canela:

Figura 2: Árbol de canela

Acciones y usos

En la España rural ha sido siempre utilizada como inductor del sueño, gracias a su propiedad relajante. Tiene además propiedades cicatrizantes y efectos beneficiosos contra la diabetes y la hipercolesterolemia, ayudando a reducir las


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cifras de azúcar en sangre en las personas diabéticas y a disminuir los niveles de colesterol y triglicéridos.

Se puede utilizar como forma de condimento, y se emplea en resfriados, gripe y bronquitis, por su fuerte efecto como estimulante calorífico.

También es usada como tónico estomacal, favoreciendo la expulsión de gases, combatiendo náuseas, vómitos y diarreas.

Los aceites, en la mayoría de los casos, se emplean microencapsulados cuando son usados como bioplaguicidas. El microencapsulado consiste en cubrir el aceite de una pared para poder protegerlo del ambiente, de la reacción con otros compuestos o de la oxidación producida por la luz o el oxígeno ambiental. Se trata de proteger sustancias sólidas o líquidas divididas en partículas, recubriéndolas con una película de carbohidratos o material polimérico. [17][18][19]

Algunos ejemplos de estos materiales que se emplean como pared son:

Materiales inorgánicos como el silicato de sodio, siendo un poderoso encapsulante para materiales peligrosos.[20] Este tipo de encapsulante convierte materiales solubles en insolubles y los cubre de silicato, reduciendo su potencial contaminante.

Lípidos como ceras, parafinas, aceites o grasas. Los más efectivos son los aceites hidrogenados de palma, algodón y soja[21].

Proteínas como gluten, caseína, albúmina o gelatina[22]. Debido a su alta capacidad emulsionante, forman microcáspulas de pequeño tamaño. Sin embargo son poco solubles en agua a baja temperatura, tieneden a reaccionar con grupos carbonilo y su coste es alto[23].

Gomas como alginato de sodio o goma arábiga. Son hidrocoloides extraídos de las algas. Se utilizan preferentemente como componentes de la membrana que reaccionan con iones para inducir la formación de geles estables[24].

Polímeros cuya ventaja es su bajo coste y su fácil adquisición. Pueden ser polímeros de origen natural como resinas vinílicas o acrílicas[25], presentan distinta permeabilidad en función del pH, controlando la liberación del material encapsulado[26]. Por otra parte se pueden emplear polímeros sintéticos como povidona o poliurea[27].

Carbohidratos son muy utilizados gracias a su alta solubilidad acuosa, su carácter no higroscópico, su vida media a temperatura ambiente y su bajo coste [28]. Entre ellos se encuentran la sacarosa, el almidón o las ciclodextrinas.


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Es una ventaja que los aceites se encuentren microencapsulados cuando se emplean como bioplaguicidas porque los principios activos del aceite se van liberando poco a poco. Esto permite que el plaguicida se libere bastantes días después de haberlo vertido en la cosecha, haciendo que su actividad antimicrobiana se desarrolle en un amplio período de tiempo.


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2. Objetivos.

Los objetivos propuestos para este estudio fueron:

Conocer los componentes de los aceites esenciales de canela y menta, así como determinar cuáles eran sus componentes mayoritarios.

Desarrollar y validar un método analítico para determinar los compuestos mayoritarios de los aceites esenciales en microcápsulas empleadas como bioplaguicidas.

Analizar los aceites microencapsulados Obtener la eficacia y el rendimiento de encapsulado de las aceites esenciales. Estudiar la liberación de los aceites desde la microcápsula.


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3. Material e instrumentación.

3.1. Material empleado.

Aceites esenciales de menta (CAS: 8006-90-4) y canela tipo ceylon (CAS: 8015-91-6) suministrados por Sigma-Aldrich.

Patrones de los compuestos seleccionados: mentol (CAS. 2216-51-5) y de 3-octanol suministrados por Sigma-Aldrich; y eugenol (CAS: 97-53-0) suministrado por Acros Organics.

Hexano suministrado por Carlo Erba y diclorometano suministrado por Panreac.

Microcápsulas de los aceites esenciales elaboradas en el CTIC-CITA (Centro Tecnológico de la Industria Cárnica-Centro de Innovación y Tecnología Alimentaria) de Alesón, La Rioja. Las microcápsulas se prepararon por el método de secado por aspersión elaboradas con:

- Maltodextrina.

- Goma arábiga.

Ambas suministradas por Sosa Ingredients S.L.

Vórtex : Heidolph tipo REAX top Agitador: modelo ABT - 4 horizontal (Afora)

3.2. Instrumentación.

Cromatógrafo de gases-masas (CG-MS): el análisis se llevó a cabo con un cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas HP-G1800B GCD System Agilent Technologies 5975C equipado con un puerto de inyección Split/Splitless (relación 1:150), un inyector manual Agilent 7863 y un software HP Chem Station. La columna empleada fue una columna capilar no polar: Teknokroma columna TRB-5MS con una fase estacionaria de (95%) Dimetil-(5%) difenilsiloxano de dimensiones (30m x 0.25mm x 0.25µm). El horno se programó a 50 ºC durante 2 minutos y se aumentó hasta 310 ºC con una rampa de 6 ºC/min donde se mantuvo 2 minutos. El inyector se mantuvo a 230 ºC mientras que la temperatura del detector fue 250 ºC. Como gas portador se empleó helio a una velocidad de flujo de 1 mL/min. Los espectros de masas y corriente iónica reconstruidas se obtuvieron por medio de barrido automático de frecuencia frecuencia (full scan), a 4.75 scan s-1, en el rango de masas m/z 30-450.

Cromatógrafía de gases-FID: el cromatógrafo empleado fue un HP 5890 serie I con inyector automático Agilent, detector de ionización de llama (FID) y software Chemstation A.05.02. La columna usada fue una HP5 Crosslinked 5% PM ME Siloxano (30 m x 0.32 mm x 0.25 µm), siendo una columna ligeramente apolar. Es la columna más


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utilizada en el análisis de aceites esenciales. En todos los programas con este cromatógrafo se mantuvieron las temperaturas del inyector y del detector a 220 ºC.

Büchi mini Spray Dryer B-290: El equipo de secado por nebulización se muestra en la figura 3 y se compone, esencialmente, de un sistema de alimentación del líquido (1), un dispositivo de nebulización (2), una cámara de secado (3) y un sistema colector del producto seco (4).

Figura 3: Instrumento Spray dryer.

2

4

3

1


15

4. Resultados.

Los resultados se dividen en tres apartados distintos, en el primero se realizaron una serie de ensayos previos con los aceites esenciales; en el segundo apartado se desarrolló y validó el método de determinación de los principios activos y finalmente, en el tercero, se procedió a la aplicación, analizando las microcápsulas.

4.1. Estudios previos.

Se realizaron una serie de estudios antes de realizar el desarrollo del método analítico y la aplicación en la determinación de principio activo en microcápsulas. El objetivo era analizar los componentes de cada aceite, comprobar si se podía emplear el cromatógrafo de gases-FID para el análisis y el patrón interno, tanto el compuesto como su concentración.

4.1.1. Cromatografía de gases-masas.

En primer lugar se realizó el análisis de los dos aceites esenciales por medio de cromatografía de gases-masas (CG-EM) para conocer cuáles eran los componentes mayoritarios. Para ello se prepararon dos disoluciones con 10 gotas de los aceites en 5 ml de diclorometano y en hexano.

Con el aceite de canela se obtuvieron los resultados que se muestran en las figuras 4, 5 y 6.

Figura 4: Cromatograma de CG-MS del aceite de canela en hexano.


16

Figura 5: Cromatograma de CG-MS del aceite de canela en diclorometano.

Figura 6: Fragmentación del pico que aparece a 15.71 minutos con la fragmentación del eugenol.


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Los dos compuestos que aparecieron fueron el eugenol y el cariofileno, tal y como se observa en la tabla 1.

Tabla 1: Compuestos del aceite de canela y tiempos de retención.

Tiempo de retención(min) Compuesto

15.71 Eugenol

17.33 Cariofileno

El componente mayoritario de este aceite es el eugenol.

Con el aceite de menta se obtuvieron los siguientes resultados que se muestran en las figuras 7, 8, 9, 10 y 11.

Figura 7: Cromatograma de CG-MS del aceite de menta en hexano.

Figura 8: Cromatograma de CG-MS del aceite de menta en diclorometano.


18

Figura 9: Fragmentación del pico que aparece a 11.03 minutos con la fragmentación de la mentona.


19

Figura 10: Fragmentación del pico que aparece a 11.03 minutos con la fragmentación del mentol.


20

Figura 11: Fragmentación del pico que aparece a 11.03 minutos con la fragmentación del mentilacetato.

Los tiempos de retención de los tres compuestos se recogen la siguiente tabla 2:

Tabla 2: Compuestos del aceite de menta y tiempos de retención.

Tiempo de

retención (min) Compuesto

11.03 Mentona

11.64 Mentol

14.44 Mentilacetato

El componente mayoritario de este aceite es el mentol.


21

Se obtienen 5 compuestos en total de los dos aceites, las propiedades de éstos, así como sus nombres IUPAC y sus estructuras se recogieron en la tabla 3:

Tabla 3: Propiedades de los componentes mayoritarios de los aceites esenciales.

Compuesto Nombre IUPAC Masa

molecular (g/mol)

Densidad (g/ml)

Punto de ebullición

(ºC) Estructura

Eugenol 2-metoxi-4-(2-propenil)fenol 164.20 1.06 -19

Cariofileno

4,11,11-trimetil-8-metilen-

biciclo[7.2.0] undec-4-eno

204.36 0.905 130

Mentol (1R,2S,5R)-2-

Isopropil-5-metilciclohexanol

156.27 0.890 212

Mentona

(2S,5R)-2-Isopropil-5-

metilciclohexano-na

154.25 0.895 207


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Mentilacetato

Acetato de [(1R,2S,5R)-2-

isopropil-5-metilciclohexilo]

198.30 0.92 229-230

Por lo tanto, el compuesto que se empleó para determinar el aceite de menta fue el mentol mientras que el que se empleó para cuantificar el aceite de canela fue el eugenol.

4.1.2. Cromatografía de gases-FID.

Tras obtener los cromatogramas de CG-MS se pasó a analizar los aceites con el cromatógrafo de gases-FID que se empleó durante el resto del trabajo en el laboratorio.

Se cogieron 49.0 µL de aceite de canela y se llevaron a dos matraces de 50.0 mL, enrasando con hexano y con diclorometano. Se procedió del mismo modo con 56.0 µL de aceite de menta.

A partir de la dilución de hexano se realizó otra dilución 2:10, mientras que con el diclorometano se realizó una dilución 4:10. Estas diluciones se analizaron en el cromatógrafo.

El programa empleado para este análisis comenzaba a 50 ºC durante 1 minuto, aumentaba la temperatura hasta 150 ºC a 6 ºC/min, manteniendo esta temperatura 20 minutos para aumentar hasta 200 ºC a 10 ºC/min y finalmente mantener esta temperatura 10 minutos.

Los cromatogramas obtenidos fueron los siguientes, representados en las figuras 12, 13, 14 y 15.


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Figura 12: Cromatograma de CG-FID del aceite de canela en hexano.

Figura 13 Cromatograma de CG-FID del aceite de menta en hexano.

Figura 14: Cromatograma de CG-FID del aceite de canela en diclorometano.

min0 10 20 30 40 50

counts

3500

4000

4500

5000

5500

6000

6500

7000

FID1 A, (C:\DOCUME~1\ADMINLAB\ESCRIT~1\ANDREA~1\ACEITE~1\CANELA~1.D)

1.7

07 1

.728

1.8

22 1

.919

15.

964

min0 10 20 30 40 50

counts

3500

4000

4500

5000

5500

6000

FID1 A, (C:\DOCUME~1\ADMINLAB\ESCRIT~1\ANDREA~1\ACEITE~1\MENTAH~2.D)

1.6

27 1

.654

1.7

06 1

.825

1.8

94 1

.920

11.

039

11.

307

11.

504

14.

481

min0 10 20 30 40

counts

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

FID1 A, (C:\DOCUME~1\ADMINLAB\ESCRIT~1\ANDREA~1\ACEITE~1\CANELA~2.D)

1.5

44 1

.612

16.

001


24

Figura 15: Cromatograma de CG-FID del aceite de menta en diclorometano.

Se observó cómo los compuestos relacionados con los aceites esenciales en ambos cromatogramas aparecían antes de los 20 minutos, por tanto no era necesario emplear programas que duraran tanto tiempo. Por ello, en los experimentos posteriores se emplearon programas de temperatura de menor tiempo. Se decidió emplear dos programas, uno para cada aceite:

Para las disoluciones de aceite de menta: 2 minutos a 50 ºC, una rampa de 6 ºC/min hasta los 120 ºC y mantener esta temperatura 2 minutos.

Para las disoluciones de aceite de canela: 2 minutos a 50 ºC, rampa de 6 ºC/min hasta los 130 ºC y mantener esta temperatura 4 minutos.

Se observó también cómo en el análisis de menta en diclorometano no se obtuvieron los resultados esperados, en la cromatografía de gases-masas los picos eran mucho menores que con el hexano mientras que en la cromatografía de gases-FID se obtuvo un cromatograma en el que no se veía ningún pico como corresponde. Por estos motivos se concluyó que el disolvente que se emplearía para este estudio sería el hexano.

4.1.3. Patrón interno.

Se pensó en emplear como patrón interno 3-octanol, un compuesto que había sido empleado en otros estudios relacionados similares llevados a cabo por el grupo de investigación donde se realizaba la misma labor con otros aceites esenciales.

Para realizar este estudio se analizaron 3 disoluciones de patrón interno con diferentes concentraciones: 12.50, 25.00 y 50.00 ppm, para observar con qué tiempo de retención aparecía y cuál sería la concentración más apropiada.

El programa de temperaturas empleado fue el correspondiente a la menta. En la figura 16 se muestra el cromatograma de la disolución de 50.00 ppm del 3-octanol:

min0 10 20 30 40

counts

3700

3800

3900

4000

4100

FID1 A, (C:\DOCUME~1\ADMINLAB\ESCRIT~1\ANDREA~1\ACEITE~1\MENTAD~1.D)

1.7

58 1

.838

1.9

79 2

.036

2.1

84

5.9

62 6

.815

6.8

90 7

.193

8.0

82 8

.151

8.8

08

13.

995

26.

100

26.

360

28.

444

28.

597

28.

733

28.

902


25

Figura 16: Cromatograma de la disolución de 3-octanol con una concentración de 50.00 ppm.

Se observó que el 3-octanol aparecía con un tiempo de retención de 7.73 minutos, por tanto se consideró un compuesto correcto para emplear como patrón, ya que el componente de los aceites que aparecía a un tiempo más cercano era la mentona, a 11.03 minutos. También se decidió que la concentración de patrón interno empleada fuera de 50 ppm ya que esta concentración es la que da un área más próxima a la de los picos de los compuestos activos.

min0 2 4 6 8 10 12 14

counts

3500

4000

4500

5000

5500

6000

6500

FID2 A, (PINTERNO\29021610.D)

1.3

49 1

.446

1.4

79 1

.583

7.7

31


26

4.2. Desarrollo y validación del método analítico.

Tras los estudios previos se comenzó el desarrollo del método analítico. El disolvente empleado fue hexano, el patrón interno fue 3-octanol con una concentración de 50 ppm.

Como los picos del eugenol y del mentol aparecían a tiempos de retención lo suficientemente separados, se prepararon disoluciones conteniendo simultáneamente eugenol y mentol, así como 3-octanol, ahorrando tiempo y disolvente.

El programa empleado fue el que se había usado para las disoluciones de aceite de canela: 2 minutos a 50 ºC, rampa de 6 ºC/min hasta los 130 ºC y mantener esta temperatura 4 minutos.

4.2.1. Intervalo lineal.

A partir de los patrones de eugenol y mentol se prepararon rectas con concentraciones entre 10 y 300 ppm con el objetivo de encontrar el lugar donde se pierde la linealidad en cada compuesto. El objetivo era medir disoluciones por triplicado con concentraciones próximas a 10, 60, 120, 180, 240 y 300 ppm.

En el caso del eugenol se partió de una disolución de 1001 ppm. En la tabla 4, se presentan la concentración obtenida y el promedio del cociente entre la señal del eugenol y la del 3-octanol de las tres medidas de cada disolución.

Tabla 4: Disoluciones y señal para la recta inicial de eugenol.

Concentración (ppm) y/y'

10.01 0.2006

60.08 1.0971

120.2 1.9077

180.2 2.5744

240.3 3.3805

300.4 4.3145


27

Al representar estos datos se obtuvo la gráfica que se muestra en la figura 17.

Figura 17: Representación inicial de las disoluciones de eugenol.

Se vio cómo en la gráfica se mantiene la linealidad hasta los 300 ppm. Por lo tanto, el intervalo lineal será desde el límite de cuantificación, que se calculará posteriormente, hasta 300 ppm.

En el caso del mentol se partió de una disolución de 1321 ppm, actuando del mismo modo que con el eugenol, las disoluciones y sus señales se presentan en la tabla 5:

Tabla 5: Disoluciones y señal para la recta inicial de mentol.

Concentración(ppm) y/y'

10.04 0.2039

60.77 0.8447

118.9 1.5577

179.7 2.2313

240.4 3.4159

301.2 3.1160

y/y'= 0,0137[Eugenol] + 0,1705 R² = 0,996

0

1

2

3

4

5

0 50 100 150 200 250 300 350

y/y'

[Eugenol] (ppm)

Recta inicial de eugenol


28

Al representar estos datos en una gráfica se obtiene la figura 18:

Figura 18: Representación inicial de las disoluciones de mentol.

Se observó que la linealidad se mantiene hasta la disolución de unos 180 ppm. Por lo tanto, el intervalo lineal será desde el límite de cuantificación, que se calculará posteriormente, hasta 179.7 ppm.

4.2.2. Rectas de calibrado y sensibilidad.

Aunque la linealidad se mantenía hasta concentraciones superiores, se decidió que las rectas de calibrado para este método fueran en el intervalo de 0.5 a 100 ppm para el mentol y de 4 a 120 ppm para el eugenol. Esto se debe a que 0.5 ppm y 4 ppm eran las concentraciones menores que había señal detectable. El límite superior en 100 y 120 ppm se debe a que las muestras que se pretendían analizar no iban a tener concentraciones mayores que estos valores.

Se prepararon 8 disoluciones en matraces de 5 ml. Para el mentol las concentraciones elegidas fueron 0.5, 3, 7, 10, 30, 50, 75 y 100 ppm; mientras que en el caso del eugenol fueron 4, 7, 10, 30, 50, 75, 100 y 120 ppm.

Las disoluciones de mentol y eugenol superiores a 30 ppm se prepararon a partir de disoluciones de 1321 y 1001 ppm, respectivamente, mientras que las disoluciones de menor concentración se prepararon a partir de disoluciones cercanas a 50 ppm. Cada disolución se analizaba por triplicado.

y/y' = 0.012 [Mentol] + 0.1039 R² = 0.9991

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

0 50 100 150 200 250 300 350

y/y'

[Mentol] (ppm)

Recta inicial de mentol


29

Para el mentol se obtuvieron los siguientes resultados, representados en la tabla 6:

Tabla 6: Disoluciones preparadas para la recta de calibrado de mentol y sus respectivas señales.


0.5021 0.0096

3.012 0.0604

7.028 0.1422

10.04 0.2470

29.06 0.4786

50.20 0.9054

73.98 1.3754

100.4 1.8333

Se desechó el valor de 29.06 ppm ya que no se ajustaba al resto de puntos.

Representando los puntos y ajustándolos se obtuvo la gráfica mostrada en la figura 19:

Figura 19: Recta de calibrado de mentol.

Se obtuvo la siguiente recta:

y /y'= 0.0181[Mentol] + 0.0188; R2 = 0.999 (1)

y /y'= 0,0181[Mentol] + 0,0188 R² = 0,999

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

0 20 40 60 80 100 120

y/y'

[Mentol] (ppm)

Recta de calibrado de mentol


30

En el caso del eugenol los resultados obtenidos fueron los que se observan en la tabla 7:

Tabla 7: Disoluciones preparadas para la recta de calibrado de eugenol y sus respectivas señales.


4.005 0.05206

7.009 0.1212

10.01 0.1626

30.04 0.5182

50.06 0,9709

74.10 1.570

100.1 1.910

120.2 2.326

En esta ocasión también había un punto que no se ajustaba al comportamiento del resto, tratándose del correspondiente a 74.10 ppm.

Representando el resto de puntos se obtuvieron los valores de la pendiente y de la ordenada en el origen, tal y como se muestra en la figura 20.

Figura 20: Recta de calibrado de eugenol.

La recta obtenida fue la siguiente:

y/y' = 0.0195[Eugenol] - 0.0308 ; R² = 0.9995 (2)

y/y' = 0,0195[Eugenol] - 0,0308 R² = 0,9995

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 20 40 60 80 100 120 140

y/y'

[Eugenol] (ppm)

Recta de calibrado de Eugenol


31

En ambos casos el coeficiente de determinación es mayor que 0.999, pudiendo considerar ambos métodos como lineales[29].

La sensibilidad es la capacidad para discriminar entre pequeñas diferencias de concentración del analito y viene dada por la pendiente de la recta de calibrado.

Los valores de sensibilidad se muestran en la tabla 8:

Tabla 8: Sensibilidad de cada analito.

Analito Sensibilidad (ppm-1)

Eugenol 0.0195 Mentol 0.0181

4.2.3. Límite de detección (LOD) y límite de cuantificación (LOQ).

El límite de detección es la menor concentración de analito que produce una señal significativamente distinta de cero. Se expresa como el triple de la desviación estándar del blanco divido por la pendiente.

El límite de cuantificación es la mínima concentración de analito que puede ser medida para predecir una concentración con cierto nivel de precisión y exactitud. Se obtiene multiplicando por 10 la desviación estándar del blanco y dividiendo entre la pendiente.

Para obtener la desviación estándar del blanco se prepararon 5 disoluciones con concentraciones más diluidas que las empleadas para las rectas calculadas en el apartado anterior, éstas se analizaron 10 veces obteniendo 10 rectas. Asumiendo la ordenada en el origen como la señal del blanco, se pudo calcular la desviación estándar de sus señales.

Las disoluciones, preparadas a partir de una disolución madre de 50 ppm, se muestran en la tabla 9:

Tabla 9: Concentraciones en ppm de las disoluciones empleadas para calcular el LOD y el LOQ.

Eugenol / ppm

3.00 4.01 5.01 6.01 7.01

Mentol / ppm

0.50 1.00 2.00 3.00 5.00


32

Los valores de las rectas obtenidas para el eugenol se presentan en la tabla 10:

Tabla 10: Rectas diluidas de eugenol.

Ordenadas en el origen Pendientes

-0,0563 0,0453 -0,0547 0,0390 -0,0458 0,0445 -0,0330 0,0424 -0,0374 0,0423 -0,0489 0,0410 -0,0492 0,0378 -0,0458 0,0436 -0,0463 0,0435 -0,0464 0,0417

Mientras que las obtenidas para el mentol se observan en la tabla 11:

Tabla 11: Rectas diluidas de mentol.

Ordenadas en el origen Pendientes

-0,0026 0,0360 -0,0021 0,0353 -0,0026 0,0355 -0,0027 0,0353 -0,0018 0,0353 -0,0025 0,0349 -0,0024 0,0352 -0,0022 0,0351 -0,0019 0,0348 -0,0023 0,0350

Se obtienen mayores pendientes que en las rectas de calibrado mostradas en el apartado 4.2.2, esto se debe a que hay comportamientos distintos a concentraciones bajas y a concentraciones más altas, debiendo emplear rectas diferentes a las de dicho apartado si se quisieran analizar muestras con bajo contenido en principio activo.

En la tabla 12 se recogen las medias de las pendientes de las rectas y la desviación estándar de las ordenadas en el origen, el límite de detección y el límite de cuantificación para cada compuesto:

Tabla 12: Resultados del cálculo de LOD y LOQ. Eugenol Mentol

m (ppm -1) 0.0421 0.0352 sb 0.0070 0.00031

LOD (ppm) 0.499 0.0261

LOQ (ppm) 1.67 0.0871


33

4.2.4. Precisión: Repetibilidad y precisión intermedia.

La repetibilidad es la dispersión de resultados de ensayos mutuamente independientes, utilizando el mismo método aplicado a alícuotas de la misma muestra, en el mismo laboratorio, por el mismo operador, usando el mismo equipamiento en un intervalo corto de tiempo.

Para obtener la repetibilidad se prepararon 10 disoluciones de 50.00 ppm de cada patrón y se analizaron con el cromatógrafo.

La repetibilidad se calculó como la desviación estándar relativa porcentual de los resultados obtenidos:

Los resultados obtenidos se encuentran en la tabla 13:

Tabla 13: Resultados obtenidos del cálculo de la repetibilidad.

Eugenol Mentol

sr 0.0113 0.0017 Media 0.9236 0.6695

sr% 1.22 % 0.25 % La precisión intermedia consiste en la desviación estándar inter-días en un estudio de la repetibilidad en diferentes días.

Para ello se midió una disolución de 50.00 ppm por triplicado de ambos principios activos 4 días diferentes a lo largo de un mes y medio. Los días elegidos fueron: el 11 de abril, el 29 de abril, el 16 de mayo y el 1 de junio.

El análisis se llevó a cabo por medio de ANOVA de un factor.

En primer lugar, se comprobó por medio del test de Levene si las varianzas eran homogéneas, los resultados se muestran en la tabla 14:


34

Tabla 14: Resultado del Test de Levene

N Media Desviación típica Error típico

Mentol

11/04 3 ,660144341333 ,0071847835236 ,0041481367015

29/04 3 ,677374953000 ,0013291507246 ,0007673855287

16/05 3 ,684717374333 ,0014462776524 ,0008350087920

1/06 3 ,688661574000 ,0005913501673 ,0003414161783

Total 12 ,677724560667 ,0118504716550 ,0034209365001

Eugenol

11/04 3 ,935984701000 ,0163293440194 ,0094277511653

29/04 3 ,940919886000 ,0378741289089 ,0218666385209

16/05 3 ,919600240333 ,0179549229471 ,0103662795968

1/06 3 ,933860651333 ,0145299173126 ,0083888516718

Total 12 ,932591369667 ,0217902562487 ,0062903051555

Estadístico de

Levene

gl1 gl2 Sig.

Terpineol 4,020 3 7 ,059

Eugenol 2,329 3 8 ,151

Para que las varianzas fueran homogéneas, para un nivel de confianza del 95%, la significación tenía que ser mayor que 0.05, en ambos casos, esto ocurre, por lo tanto se puede realizar el test de ANOVA, ya que las varianzas son homogéneas.

En la tabla 15 se recoge el resultado del test de ANOVA:

Tabla 15: Resultados de ANOVA para eugenol y mentol.

Suma de cuadrados gl Media cuadrática F Sig.

Mentol

Inter-grupos , 0,001433 3 , 0,000478 34,226 ,000

Intra-grupos , 0,000112 8 , 0,000014

Total , 0,001545 11

Eugenol

Inter-grupos , 0,000754 3 , 0,000251 ,450 ,724

Intra-grupos , 0,004469 8 , 0,000559

Total , 0,005223 11


35

A partir de la varianza inter-grupos y la gran media, usando la ecuación 5 se obtiene el valor de la precisión intermedia, que se encuentra en la tabla 16:

Tabla 16: Precisión intermedia para eugenol y mentol.

Analito Precisión intermedia %

Eugenol 4.06 Mentol 4.05

La medida de la precisión intermedia da valores mayores que la repetibilidad, ya que al realizar los análisis en días diferentes las diferencias son mayores que realizando varios análisis en un día.

4.2.5. Cuantificación de los aceites esenciales.

Se analizaron los aceites de canela y de menta para cuantificar la cantidad de eugenol y mentol que poseían, para ello se añadieron 49.0 µL de aceite de canela y se llevaron a dos matraces de 50.0 mL, enrasando con hexano y con diclorometano. Se procedió del mismo modo con 56.0 µL de aceite de menta..

A partir de éstas diluciones, se prepararon dos diluciones más, la primera 1:2 y la segunda 1:10, con el objetivo de que al menos una de ellas tuviera una concentración de principio activo que se encontrara dentro de los límites de las rectas de calibrado.

Estas diluciones se analizaron con los programas de temperatura mencionados en el apartado 4.1.2.

A partir de los resultados obtenidos y las rectas calculadas en el apartado 4.2.2, se calculó la concentración de eugenol y mentol en las disoluciones.

Para las diluciones 1:2, los resultados se encuentran en la tabla 17:

Tabla 17: Resultados para las diluciones de los aceites de 1:2.

Medida Eugenol (ppm) Mentol (ppm)

1 31.47 16.74 2 31.65 16.63 3 31.03 16.36

Mientras que para las diluciones de 1:10, la concentración de los compuestos se recoge en la tabla 18:

Tabla 18: Resultados para las diluciones de los aceites de 1:10 ppm.

Medida Eugenol (ppm) Mentol (ppm)

1 64.64 33.49 2 64.43 33.56 3 65.00 33.80


36

Como en ambos casos, las concentraciones obtenidas de los principios activos estaban dentro de los límites de las rectas de calibrado, se deshicieron las diluciones y se calculó la concentración promediada de las 6 muestras de eugenol y mentol en los aceites originales, valores que se encuentran en la tabla 19.

Tabla 19: Concentración de los principios activos en los aceites.

Eugenol (g/L) Mentol (g/L)

650±9 304±5

4.2.6. Factor de recuperación.

El factor de recuperación consistió en un estudio sobre la exactitud del método, analizando el comportamiento al añadir una concentración conocida de patrón (eugenol o mentol) a una disolución con concentración conocida de aceite.

Se analizó el factor de recuperación de los aceites añadiendo una cuarta parte aproximadamente del patrón presente en ellos. En el caso del aceite esencial de menta se añadieron 7.00 ppm de mentol sobre una disolución de 100 ppm del aceite (que contiene en torno a 33 ppm de mentol). Para el aceite de canela, se añadieron 11.00 ppm a una disolución con una concentración de 50 ppm del aceite esencial (que contiene en torno a 32 ppm de eugenol). Las disoluciones se midieron por triplicado.

Se calcula el factor de recuperación como la concentración adicional obtenida dividido entre la concentración añadida por 100.

Los resultados obtenidos fueron los presentados en la tabla 20:

Tabla 20: Resultados en el cálculo del factor de recuperación.

Eugenol Mentol

Concentración adicional obtenida (ppm)

10.86 5.641

Concentración añadida (ppm)

11.00 7.000

Factor de recuperación % 98.8 80.6


37

4.2.7. Resumen de la puesta a punto del método

En la tabla 21 se recogen todos los resultados obtenidos en este apartado:

Tabla 21: Resumen de los resultados de la puesta a punto del método.

Eugenol Mentol

Recta de calibrado y/y' = 0.0195 [Eugenol] -

0.0308 (R = 0.9995) y /y'= 0.0181 [Mentol] +

0.0188 (R=0.9991)

Sensibilidad (ppm-1) 0.0195 0.0181

LOD (ppm) 1.039 0.060

LOQ (ppm) 3.462 0.200

Intervalo lineal (ppm) 3.462 - 300.4 0.200 - 179.7

Repetibilidad (sr%) 1.22 % 0.25 %

Precisión intermedia 4.06 % 4.05 %

Concentración del aceite (g/L)

663±16 304±5

Factor de recuperación 101 80.6


38

4.3. Análisis de las microcápsulas

Tras haber desarrollado el método de cuantificación de eugenol y mentol se pasó a probar su efectividad analizando microcápsulas de aceites de canela y de menta. Las microcápsulas fueron elaboradas en el CTIC-CITA (Centro Tecnológico de la Industria Cárnica-Centro de Innovación y Tecnología Alimentaria) de Alesón, La Rioja.

Las microcápsulas se obtuvieron por secado por atomización, este proceso consiste en nebulizar un material en estado líquido, ya sea una disolución o una dispersión, en forma de gotas pequeñas sobre una corriente de aire calentado. Estas pequeñas gotas, al ponerse en contacto con el gas producen una rápida evaporación del disolvente, formándose una fina película del material de recubrimiento que se encuentra disuelto en él.[30].

Para efectuar la microencapsulación, el material de recubrimiento, en nuestro caso una mezcla de maltodextrina:goma arábiga 1:2, se disuelve en un disolvente apropiado, en nuestro caso agua. A esta disolución se le añade el material activo, en nuestro caso el aceite de menta o el aceite de canela.

Las cantidades empleadas se encuentran en la tabla 22:

Tabla 22: Masas empleadas para la elaboración de las microcápsulas.

Aceite Core

(aceite) / g

Goma Arábiga /

g

Maltodextrina / g

Agua / g Peso final

microcápsulas/ g

Canela 4.40 7.33 14.67 73.60 12.20 Menta 4.40 7.33 14.67 73.60 12.20

Las microcápsulas dentro del sistema colector del producto seco se pueden observar en la figura 21:

Figura 21: Microcápsulas.


39

Una vez elaboradas las microcápsulas en el laboratorio se procedió a analizar el rendimiento y la eficacia de encapsulación. Para ello, se necesitaba conocer la cantidad de aceite que había dentro de las microcápsulas. Este dato se calculaba, por diferencia, a partir de la cantidad de aceite que quedaba fuera de las microcápsulas y la cantidad total de aceite.

Para obtener la cantidad de aceite fuera de las microcápsulas se pesaban 0.3000 gramos de microcápsulas y a esta masa se le añadían 10 ml de hexano. Esta suspensión se agitaba durante 15 minutos en un agitador y se filtraba con papel de filtro. Las aguas de filtrado se añadían en un matraz de 5 ml en el que había patrón interno y se analizaba con el cromatógrafo.

La cantidad total de aceite se obtenía pesando 0.1500 gramos de microcápsulas, esta masa se disolvía en 1.5 ml de agua a 60 ºC y se agitaba en un vórtex hasta total disolución. A esta disolución se le añadían 10 ml de hexano y se agitaba durante 30 minutos. Una vez pasado el tiempo, se recogía la fase orgánica y se cogían 0.5 ml para llevarlos a un matraz de 5 ml y se analizaba en el cromatógrafo.

4.3.1. Rendimiento del proceso de encapsulado.

En este apartado se calculó el rendimiento de encapsulación, el porcentaje de aceite que entró en las microcápsulas durante el proceso de microencapsulado. Para ello, se empleó la concentración de los compuestos mayoritarios calculada en el apartado 4.2.5 y se comparó con la cantidad de eugenol y mentol que se encontró dentro de las microcápsulas.

Para obtener la cantidad de aceite esencial en la microcápsula se obtuvo la concentración de aceite total en las microcápsulas, para después multiplicar por la cantidad de microcápsulas obtenidas. Mientras que la cantidad de aceite añadido eran 4.40 gramos y se multiplicó por la concentración de los aceites calculada en el apartado 4.2.5.

El rendimiento se calcula como los gramos de principio activo totales en la microcápsula entre los gramos de principio activo total añadidos multiplicado por 100, tal y como se observa en la tabla 23.

Tabla 23: Rendimiento del proceso de encapsulado.

Eugenol Mentol

Gramos de aceite añadido

4.40 4.40

Concentración del aceite 650.3 304.5

Gramos de principio activo añadidos

2.863 1.492


40

Gramos de microcápsula obtenidos

12.20 12.20

Gramos de principio activo total de las

microcápsulas 0.5133 0.2119

Rendimiento % 17.9 14.2

El rendimiento es bastante bajo ya que durante el proceso de microencapsulación se calienta el aceite esencial y sus principios activos al ser volátiles se evaporan, quedando una porción bastante baja en las microcápsulas.

4.3.2. Eficacia de encapsulación.

Se calculó la cantidad de aceite que quedó dentro de las microcápsulas respecto la cantidad de aceite que quedó en total en las microcápsulas (dentro y fuera). Para ello se emplearon los datos del apartado anterior.

La eficacia se obtiene dividiendo la cantidad de aceite encapsulada por la cantidad total de aceite presente en las microcápsulas multiplicado por 100. Los resultados se recogen en la tabla 24:

Tabla 24: Eficacia de encapsulación.

Eugenol Mentol

Concentración dentro de las microcápsulas (g/L)

41.84 17.04

Concentración total (g/L) 42.07 17.37

Eficacia 99.5 98.1

4.3.3. Evolución de las microcápsulas con el tiempo.

Tras estudiar el rendimiento y la eficacia de encapsulación se estudió como difundían los aceites desde las microcápsulas. Para ello se dejaron las microcápsulas en placas Petri al aire y se midió la concentración dentro de las microcápsulas de los aceites a los 13, 30 y 44 días.

En el caso del eugenol hubo un error craso de los 13 días, de modo que solo se obtuvieron datos de los 44 y los 56 días.

En las tablas 25 y 26 se muestra la disminución del contenido en aceite esencial de las microcápsulas a medida que pasan los días:


41

Tabla 25: Evolución del contenido en eugenol de las microcápsulas con el paso del tiempo.

Eugenol Día 1 Día 30 Día 42

Concentración(g/L) 41.54 37.90 5.289

% de aceite liberado 0 8.8 82.7

Tabla 26: Evolución del contenido en mentol de las microcápsulas con el paso del tiempo.

Mentol Día 1 Día 13 Día 30 Día 42

Concentración(g/L) 17.04 16.73 7.762 1.053

% de aceite liberado

0 1.8 54.4 93.8

Se puede concluir que entre el día 30 y el día 42 difunde la máxima cantidad de aceite de canela, mientras que para el aceite de menta difunde la máxima cantidad entre el día 13 y el día 30.

Prácticamente la totalidad del aceite encapsulado ha se libera a los 42 días.

El porcentaje de pérdidas de cada aceite se muestra en las figuras 22 y 23.

Figura 22: Evolución del porcentaje de aceite liberado respecto los días para el aceite de canela.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1 30 42

% d

e a

ceit

e li

be

rad

o

Días

Evolución de la liberación para el aceite de menta.


42

Figura 23: Evolución del porcentaje de aceite liberado respecto los días para el aceite de menta.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 13 30 42

% d

e a

ceit

e li

be

rad

o

Días

Evolución de la liberación para el aceite de canela


43

5. Conclusiones.

1. Los principales compuestos detectados en el aceite de menta son la mentona, el mentol y el mentilacetato, siendo el mentol el mayoritario.

2. Los principales compuestos en el aceite de canela son el eugenol y el cariofileno, siendo el eugenol el mayoritario.

3. En la siguiente tabla se recogen todas las propiedades analíticas obtenidas en este estudio.

Eugenol Mentol

Recta de calibrado y/y' = 0.0195 [Eugenol] -

0.0464 (R = 0.9995) y /y'= 0.0181 [Mentol] +

0.0188 (R= 0.9991)

Sensibilidad (ppm-1) 0.0195 0.0181

LOD (ppm) 1.039 0.060

LOQ (ppm) 3.462 0.200

Intervalo lineal 3.462 - 300.4 0.200 - 179.7

Repetibilidad (sr%) 1.22 % 0.25 %

Precisión intermedia 4.06 % 4.05 %

Concentración del aceite

(g/L) 663±16 304±5

Factor de recuperación 101.14 80.59

4. Los rendimientos del proceso de encapsulado son bastante bajos, menores que el 20%. Esto se debe a que se calienta la mezcla de material pared, agua y aceite esencial, provocando que se evaporen los principios activos. Sin embargo, prácticamente todo el principio activo que consigue entrar en el Spray Dryer forma microcápsulas, ya que el rendimiento de encapsulación es muy alto, mayor que el 98%.

5. Al cabo de 42 días se libera prácticamente todo el contenido de las microcápsulas en ambos casos.


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