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Determinación de la actividad acaricida de extractos vegetales y otros compuestos sobre Schizotetranychus hindustanicus en cultivo de Lima Tahití (Citrus ×latifolia Tanaka ex Q. Jiménez). CARLOS ENRIQUE OSORIO ALVARADO Fredy Alejandro Ortiz Meneses Director Beatriz Helena Guerra Sierra Codirectora TRABAJO DE GRADO UNIVERSIDAD DE SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES Y AGROPECUARIAS PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BUCARAMANGA 2019
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Determinación de la actividad acaricida de extractos vegetales y otros compuestos sobre
Schizotetranychus hindustanicus en cultivo de Lima Tahití (Citrus ×latifolia Tanaka ex Q.
Jiménez).
CARLOS ENRIQUE OSORIO ALVARADO
Fredy Alejandro Ortiz Meneses
Director
Beatriz Helena Guerra Sierra
Codirectora
TRABAJO DE GRADO
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES Y AGROPECUARIAS
PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BUCARAMANGA
2019
Determinación de la actividad acaricida de extractos vegetales y otros compuestos sobre
Schizotetranychus hindustanicus en cultivo de Lima Tahití (Citrus ×latifolia Tanaka ex Q.
Jiménez).
Presentado por:
Carlos Enrique Osorio Alvarado
Fredy Alejandro Ortiz Meneses
Director
Beatriz Helena Guerra Sierra
Codirectora
UNIVERSIDAD DE SANTANDER UDES
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES FISICAS Y AGROPECUARIAS
PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
BUCARAMANGA
2019
TABLA DE CONTENIDO
TABLA DE CONTENIDO ......................................................................................................................... 4
LISTA DE TABLAS .................................................................................................................................. 6
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................................. 7
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................ 10
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .......................................................................................... 12
3. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................................................. 13
4. HIPÓTESIS ...................................................................................................................................... 14
4.1. Hipótesis nula: ............................................................................................................................... 14
4.2. Hipótesis alternativa:...................................................................................................................... 14
5. MARCO TEÓRICO.......................................................................................................................... 15
5.1 Generalidades del cultivo del limón Tahití...................................................................................... 15
5.2. Efectos de los ácaros fitófagos en limón (Citrus ×latifolia Tanaka ex Q. Jiménez) ......................... 15
5.3. Schizotetranychus hindustanicus Hirst (1924) y sus efectos en la producción de cítricos .............. 16
5.3. Utilización de extractos vegetales en el control de ácaros .............................................................. 20
5.4. Implementación de Azufre micronizado en el control de ácaros .................................................... 21
5.5 Utilización de la Abamectina como control de ácaros fitófagos ..................................................... 22
6. OBJETIVOS ..................................................................................................................................... 23
6.1. Objetivo General: ........................................................................................................................... 23
6.2. Objetivos Específicos:.................................................................................................................... 23
7. METODOLOGÍA ................................................................................................................................. 24
7.1. Verificación morfológica de los adultos de Schizotetranychus hindustanicus ................................ 24
7.2. Establecimiento de la cría in vitro e in vivo de los ácaros fitófagos. .............................................. 24
7.3. Aplicación de los extractos sobre adultos de Schizotetranychus hindustanicus ............................. 25
7.4. Evaluación in vitro e in vivo de Azadirachta indica y otros compuestos acaricidas sobre
Schizotetranychus hindustanicus........................................................................................................... 29
7.5. Determinación de la DL 50 del extracto crudo de Azadirachta Indica. .......................................... 30
7.6. Observación de Schizotetranychus hindustanicus muertos en los tratamientos del Neen
Emulsificado, Kumulus y Abamectina. ................................................................................................. 31
8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................................................... 32
8.1. Establecimiento de la cría in vitro e in vivo de los ácaros fitófagos ............................................... 32
8.2. Caracterización morfológica de los adultos de Schizotetranychus hindustanicus........................... 33
8.3. Evaluación in vitro e in vivo de los extractos vegetales y otros compuestos sobre Schizotetranychus
hindustanicus. ....................................................................................................................................... 35
8.4. Determinación de la Dosis Letal 50 del extracto crudo de Azadirachta Indica. ............................. 39
7.6. Observación de Schizotetranychus hindustanicus muertos en los tratamientos del Neem
Emulsificado, Kumulus y Abamectina. ................................................................................................. 40
9. CONCLUSIONES ................................................................................................................................ 42
10. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................................ 43
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Duración (días) de los estados de desarrollo de hembras y machos de S. hindustanicus
en limón persa. Fuente: (Nienstaedt y Marcano, 2009). ................................... 18
Tabla 2. Compuestos y dosis evaluadas de cada tratamiento y su presentación comercial.
............................................................................................................................ 28
Tabla 3. Rangos de Medidas generales en µm, correspondientes al ácaro S. hindustanicus para
hembras y machos. ............................................................................................. 35
Tabla 4. Matriz de registro de mortalidad de los ácaros in vitro con los tratamientos en los
diversos tiempos evaluados................................................................................ 36
Tabla 5. Evaluación de los compuestos in vivo en plantas de vivero................ 38
Tabla 6. % de mortalidad de diferentes dosis de Neem Emulsificado sobre S. hindustanicus ,
cálculo de DL 50 ................................................................................................ 40
Tabla 7. Valores de modelo para el cálculo de DL 50 ...................................... 40
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Edeago Schizotetranychus hindustanicus. Fuentes:(a) Ilustración de Jeppson et al., 1975 y (b)
Microfotografía de Navia y Marsaro (2010). .......................................................................................................... 17 Figura 2. Esquema del dorso de Schizotetranychus hindustanicus. Fuente NAPPO (2014) ..................... 17 Figura 3. El ácaro hindú de los cítricos, Schizotetranychus hindustanicus: micrografías bajo microscopía
de contraste de fase. (a) dorso de la hembra; (b) dorso del macho. Fuente: Navia y Marsaro (2010) ...... 18 Figura 4. Manchas blanquecinas circulares sobre frutos y hojas de limón, causadas por S. hindustanicus.
Fuente: Delgado, 2012. ....................................................................................................................................... 19 Figura 5. Estructura química de la Azadiractina; compuesto activo de los extractos de Azadirachta indica.
............................................................................................................................................................................... 20 Figura 6. Técnica implementada de infestación de plantas de vivero con hojas afectadas por
Schizotetranychus hindustanicus. ...................................................................................................................... 25 Figura 7. Aplicación de los tratamientos por aspersión sobre papel toalla. .................................................. 26 Figura 8. Montaje de los ensayos con los tratamientos in vitro ..................................................................... 29 Figura 9. Ensayo in vivo de los tratamientos sobre plantas de Limón Tahití en el umbráculo de la UDES.
............................................................................................................................................................................... 30 Figura 10. Técnica de infestación de las plantas de vivero con las hojas con población de
Schizotetranychus hindustanicus. ...................................................................................................................... 32 Figura 11. Schizotetranychus hindustanicus bajo microscopia electrónica con un aumento de 200X. (a)
Hembra del ácaro hindú. (b) Macho del ácaro hindú. ...................................................................................... 33 Figura 12. Estructura del edeago de Schizotetranychus hindustanicus, en 100X ....................................... 34
Figura 13. % de Mortalidad de S. hindustanicus con los tratamientos aplicados en el ensayo in
vitro. Evaluaciones realizadas en tres tiempos...........................................................................37
RESUMEN
Título: “Determinación de la actividad acaricida de extractos vegetales y otros compuestos sobre
Schizotetranychus hindustanicus en cultivo de Lima Tahití (Citrus ×latifolia Tanaka ex Q.
Jiménez).”
Autores: Osorio Alvarado Carlos Enrique, Ortiz Meneses Fredy Alejandro, Guerra Sierra
Beatriz Helena.
Palabras Clave: Schizotetranychus hindustanicus, Extracto de Neen, Kumulus, Limón Tahití,
Descripción
Los cultivos de limón Tahití (Citrus ×latifolia Tanaka ex Q. Jiménez) abarcan una gran extensión
geográfica en Colombia, ya que los múltiples usos de su fruto generan diversos beneficios y su
exportación presenta un alto grado de actividad económica en el país. Por estas razones el vigilar
estos cultivos de cualquier agente que lo afecte se convierte en uno de los principales retos para
los agricultores. Schizotetranychus hindustanicus es una de las plagas que afecta los árboles de los
cítricos causando unas manchas blanquecinas circulares en hojas y frutos, y en Colombia se ha
reportado su presencia en diversos departamentos, por ende los agricultores optan por emplear
técnicas con base al uso de sustancias consideradas como los precursores de los plaguicidas cuando
dichas plagas aparecen.
Debido a esto, en el presente estudio se pretendió realizar estrategias de control con base a
extractos orgánicos derivados de la planta Azadirachta indica (Neem), ya que sus propiedades de
insecticida se han demostrado a través de diversos estudios, al igual que el Kumulus que ha sido
ampliamente utilizado pero que no se han evaluado en Schizotetranychus hindustanicus en cultivos
de Limón Tahití. Previamente se realizó la identificación del ácaro a través del carácter de
identificación, que corresponde al edeago en los machos. Se evaluaron 2 dosis de compuestos a
base de Azadiractina, comercial y Emulsificado in vitro; La mayor mortalidad la presentó el Neem
Emulsificado y el Kumulus con valores del 93.30 y 97.22% respectivamente a las 72 horas.
Estos tratamientos fueron evaluados in vivo. Posteriormente se determinó la DL50 del Neem
Emulsificado el cual se evidenció que a una concentración de 1,07% se presenta la mortalidad de
la mitad de la población a las 24 horas. Finalmente se logró identificar a Schizotetranychus
hindustanicus como la especie de interés, el cual fue inhibido por 2 de los compuestos orgánicos
evaluados.
ABSTRACT
Title: "Determination of acaricidal activity of plant extracts and other compounds on
Schizotetranychus hindustanicus in cultivation of Tahiti Lima (Citrus × latifolia Tanaka ex Q.
Jiménez)"
Authors: Osorio Alvarado Carlos Enrique, Ortiz Meneses Fredy Alejandro, Guerra Sierra Beatriz
Helena.
Keywords: Schizotetranychus hindustanicus, Neen Extract, Kumulus, Tahiti Lemon
Description
Lemon Tahiti (Citrus × latifolia Tanaka ex Q. Jiménez) crops cover a large geographical area in
Colombia, since the multiple uses of its fruit generate various benefits and its export presents a
high degree of economic activity in the country. For these reasons, monitoring these crops of any
agent that affects them becomes one of the main challenges for farmers. Schizotetranychus
hindustanicus is one of the pests that affects citrus trees causing circular whitish spots on leaves
and fruits, and in Colombia its presence has been reported in various departments, therefore
farmers choose to use techniques based on substance use considered as the precursors of pesticides
when these pests appear.
Due to this, in the present study it was tried to carry out control strategies based on organic extracts
derived from the Azadirachta indica (Neem) plant, since its insecticide properties have been
demonstrated through various studies, as well as the Kumulus that It has been widely used but has
not been evaluated in Schizotetranychus hindustanicus in Tahiti Lemon crops. Previously, the mite
was identified through the identification character, which corresponds to the edeago in males. Two
doses of Azadiractin-based, commercial and Emulsified compounds were evaluated in vitro; The
highest mortality was presented by Emulsified Neem and Kumulus with values of 93.30 and
97.22% respectively at 72 hours.
These treatments were evaluated in vivo. Subsequently, the LD50 of the Emulsified Neem was
determined, which showed that at a concentration of 1.07%, the mortality of half the population at
24 hours is presented. Finally, Schizotetranychus hindustanicus was identified as the species of
interest, which was inhibited by 2 of the organic compounds evaluated.
1. INTRODUCCIÓN
Los cítricos a nivel general presentan beneficios económicos, efectos sociales, propiedades
alimentarias y organolépticas empleadas en diversos sectores de la industria, por lo cual es uno de
los cultivos más estudiados, de interés (Cambra y Moreno 2000). El limón Tahití en Colombia y
principalmente Santander ha tenido un aumento en su producción en los últimos 2 años, pues así
lo indica ProColombia (2017) en donde Santander se escalona hasta el 80,3% de la producción
nacional, seguido de Antioquia con un 10,90%.
Los ataques de las plagas a los cultivos inciden en la producción y en el rendimiento de las
cosechas, debido a esto, los agricultores optan por emplear técnicas con base al uso de sustancias
consideradas como los precursores de los plaguicidas para evitar la pérdida de sus cultivos (Prieto,
2018). El uso indiscriminado y extensivo de estas sustancias, ha ocasionado contaminación del
suelo, del agua, efectos tóxicos sobre organismos benéficos, al hombre y a otros vertebrados,
además la resistencia que han desarrollado los insectos a estos compuestos sintéticos los cuales se
pretendía controlar (Brumheroto y Vendramin, 2001).
El daño causado por ácaros fitófagos; es uno de los problemas fitosanitarios que limitan la
comercialización y exportación debido a que estos afectan directamente el fruto y disminuyen el
potencial productivo de la planta (García, 2014). El ácaro Hindú Schizotetranychus hindustanicus
afecta árboles de los cítricos causando unas manchas blanquecinas circulares en hojas y frutos, y
en Colombia se ha reportado su presencia en diversos departamentos (ICA, 2013).
En Colombia, y en el mundo la investigaciones realizadas por Soto et al. (2011), León et al. (2019),
Aceves et al. (2016), Carrillo et al. (2011), Rivera et al. (2015), Gavilanes (2017), entre otros
muchos autores han evidenciado la potencialidad que tienen los extractos botánicos para el control
de plagas y enfermedades que se presentan en diferentes cultivos y los patógenos e insectos que
los ocasionan, una aplicación distinta a la de los agroquímicos. Esta característica se le atribuye a
los metabolitos secundarios, que son sintetizados por el vegetal para su propia defensa y cuya
concentración varía según el estado fenológico, época de cosecha, condiciones en las que se
encuentra el vegetal (Marcano y Hasewaga, 2002). El Neem, Azadirachta indica A. Juss, cuyo
principal ingrdiente activo es la Azadiractina, presenta elevada acción insecticida y acaricida, baja
toxicidad al hombre y a animales domésticos (Castagnoli et al. 2000; El –Gengaihi et al. 2000) El
producto se ha mostrado bastante promisorio en el manejo integrado de ácaro fitófagos, causando
mortalidad, reducción de la fecundidad, deterrencia, inviabilidad formas inmaduras y repelencia
(Dimetry et al. 1993; Brito et al. 2006; Soto et al. 2010). Además los extractos de la planta no solo
posee Azadiractina, a la vez se compone de tritoterpenoides como la solanina, la azadiradiona, lo
que con lleva a la dificultad de generar resistencia por parte de los organismos blanco (Viegas,
2003).
Por ello, en este estudio se pretende evaluar la actividad acaricida de compuestos derivados de la
planta Azadirachta indica conocida generalmente como Neem y otros compuestos acaricidas sobre
Schizotetranychus hindustanicus para reducir la aplicación de los plaguicidas sintéticos por parte
de los citricultores a nivel regional.
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Los cítricos son cultivos permanentes y en general tienen alta adaptabilidad a diversas condiciones
climáticas, facilitando su cultivo en un gran número de países (Szita et al., 2012). El cultivo de
limón o lima Tahití (Citrus ×latifolia Tanaka ex Q. Jiménez) está dirigido principalmente al
consumo fresco como al de procesados; zumo concentrado, aceite esencial destilado, terpenos,
pectinas, ácido cítrico y cáscara deshidratada.
En la industria citrícola uno de los grandes problemas para la comercialización y exportación, es
el daño causado por ácaros fitófagos; debido a que estos afectan directamente el fruto y disminuyen
el potencial productivo de la planta (García, 2014).
León (2012) menciona que los ácaros logran afectar los cultivos atacando todos los órganos de las
plantas como raíces, troncos, ramas hojas y frutos, con lo cual causan disminución de la producción
y afectan la calidad de la fruta.
El ácaro Schizotetranychus hindustanicus Hirst (1924) conocido como ácaro hindú o ácaro de
nido; afecta árboles de los cítricos causando unas manchas blanquecinas circulares en hojas y
frutos, su sintomatología es generalizada en la copa de la planta, esto demerita la apariencia de los
frutos respecto a la calidad para su comercialización y consumo en fresco; no obstante la capacidad
fotosintética de las hojas puede ser afectada por el daño que se presenta en ellas ya que disminuye
hasta un 30% su clorofila y por la tanto causa pérdidas en la producción, retraso en la floración y
su calidad cosmética y organoléptica disminuye (como sabor, grados brix, consistencia entre
otros); en Colombia se ha reportado su presencia hasta el 2012 en departamentos como La Guajira
y Magdalena (ICA, 2012)
Debido a la importancia económica de esta plaga, diferentes técnicas de control para organismos
que afectan variedad de cultivos han sido evaluadas, en las que se han implementado en gran parte
los insecticidas sintéticos (Novo et al., 2001). El uso de extractos vegetales como Azadirachta
indica y compuestos con actividad acaricida para el control de Schizotetranychus hindustanicus
en cultivos de limón Tahití aún no se han registrado en la región, por lo que se desconoce la
potencialidad que ha reflejado en otros estudios con arácnidos aplicados a otros tipos de cultivo.
3. JUSTIFICACIÓN
El nuevo reto en agricultura para el control de plagas y enfermedades es utilizar productos
naturales que sean amigables con el nicho ecológico. Un ejemplo de estas aplicaciones de
productos orgánicos lo evidenciaron Bravo y colaboradores (2015) mediante la determinación del
efecto del extracto etanólico y de aceites esenciales procedentes de diferentes especies de plantas
como orégano silvestre (Lippia origanoides) y matarratón (Gliricidia sepium) sobre la mortalidad
y eficiencia reproductiva en una garrapata común del bovino, que mediante ciertas concentraciones
de los productos vegetales lograron inhibir la ovoposición y eclosión de huevos de la garrapata; en
el que ambos productos lograron presentar una alternativa saludable para el control de estos
parásitos en algunos rumiantes. Por su parte Sivira et al., (2011) evaluaron estas mismas especies
de plantas (Lippia origanoides y Gliricidia sepium) a diferentes concentraciones sobre
Tetranychus cinnabarinus, un ácaro que causa pérdidas económicas importantes en más de 130
especies de plantas incluidas vegetales, árboles frutales y ornamentales; los autores observaron
que la ovoposición decreció en gran porcentaje y la mortalidad a su vez aumentó, calificándose a
estos extractos como promisorios para el control del ácaro. Fernández et al. (2016) evaluaron
diferentes dosis del extracto etanólico de Cymbopogon citratus en la mortalidad y ovoposición de
Raoiella indica, un ácaro que afecta las palmeras de coco, esta evaluación la realizaron bajo
condiciones de laboratorio y el extracto etanólico al 7,5% produjo la mayor mortalidad (92,5%) y
una reducción de la ovoposición (100%). Diversos trabajos realizados con Neem (Azadirachta
indica) la especie de planta más estudiada como insecticida han mostrado que gran parte de sus
derivados afectan la reproducción de Tetranychus urticae; la fecundidad de las hembras fue
significativamente reducida por los extractos orgánicos de semillas de Neem (Dimetry et al.,
1993); a la vez Sundaram y Sloane (1995) determinaron repelencia, toxicidad y la inactividad para
la ovoposición en Tetranychus urticae de la Azadiractina pura y de cuatro formulaciones de Neem.
Además no sólo se ha evidenciado
En base a estos estudios previamente realizados por diversos autores en donde implementan
técnicas de control de plagas con compuestos derivados de plantas, se decide implementar estas
técnicas con objeto de minimizar el uso de agroquímicos en fincas productoras de limón Tahití y
que son afectadas por ácaros de interés económico en la industria agrícola.
4. HIPÓTESIS
4.1. Hipótesis nula:
Los extractos vegetales y otros compuestos acaricidas no tienen efecto sobre el control de
Schizotetranychus hindustanicus en Citrus × latifolia Tanaka ex Q. Jiménez
4.2. Hipótesis alternativa:
Los extractos vegetales y otros compuestos acaricidas tienen efecto sobre el control de
Schizotetranychus hindustanicus en Citrus × latifolia Tanaka ex Q. Jiménez
5. MARCO TEÓRICO
5.1 Generalidades del cultivo del limón Tahití
Los cítricos ocupan un lugar único en el reino vegetal, su anatomía presenta características únicas
y ocupan una posición privilegiada en la dieta humana (Domínguez y Ordoñez, 2018), estos a la
vez son el principal cultivo de frutas en el mundo y el segundo producto frutícola de importancia
socioeconómica; en Colombia se ubica después del banano, siendo este el primero. La importancia
de los productos cítricos radica en su alto contenido de antioxidantes, (sustancias capaces de
bloquear el daño de los radicales libres) evitar el envejecimiento prematuro del organismo y
prevenir enfermedades crónicas y degenerativas como el cáncer, de la misma forma se destacan
por su aporte de vitamina C. (Gómez 2008)
Los cultivos de Limón Tahití se encuentran en un aumento de su producción a nivel nacional, pues
precisamente para el año 2017 las cosechas alcanzaron hasta las 86.297 toneladas, presentando un
aumento con respecto al año 2016 del 6,6%. Las exportaciones también han aumentado y se han
ido agregando más destinos para su importación. A nivel nacional Santander concentra más del
80% de la producción. Estos frutos han sido exportados a más de 21 países, siendo el principal
Estados Unidos con un 17,7% de la exportación total.
La lima Tahití (Citrus x latifolia Tanaka ex Q. Jiménez) presenta una buena demanda en el
mercado internacional y buenos precios en el mercado interno, mientras que el limón pajarito posee
demanda solo en los mercados regionales debido a su rápido deterioro en postcosecha (Orduz y
Mateus; 2012; Grayum et al., 2012). Para la exportación, la principal característica, y la de mayor
interés es el color verde intenso del fruto, la ausencia de áreas con «golpe de sombra» y las
cualidades de la corteza; ya que la demanda principal de este fruto es en la coctelería,
especialmente en los mercados europeos. El municipio de Lebrija y Girón (Santander) han sido
de las regiones principales en la exportación de limón, ya que los frutos logran una buena calidad
debido a las condiciones ambientales de la zona y a las prácticas de manejo empleadas por los
agricultores como el raleo de frutos y podas, lo cual permite una mayor exposición de los frutos a
la luz solar, alcanzando el color verde intenso deseado en el exterior por los consumidores o
clientes (Hernández, D. R., et al., 2014). No obstante la base social Alcázar, menciona que en
Rionegro se tienen sembradas 450 hectáreas con Lima Tahití, con una media de 20 toneladas, lo
que representa un potencial de 9000 tonelada al año.
5.2. Efectos de los ácaros fitófagos en limón (Citrus ×latifolia Tanaka ex Q. Jiménez)
Los cultivos de limón por ser un tipo de cultivo que se mantiene en constante cosecha, es normal
que se encuentre un elevado número de organismos perjudiciales como plagas (Vanegas, 2002).
Debido a la gran cantidad de insectos dañinos que se presentan en el cultivo, estos pueden atacar
todos los órganos de la planta como raíces, tronco, ramas, hojas y frutos, para ello generalmente
los agricultores aplican prácticas de control de plagas mediante el uso de insecticidas de amplio
rango de acción en sus cultivos, esto tiende a influir en la viabilidad económica de las
explotaciones citrícolas comerciales; anteriormente los cultivadores tendían a aplicar insecticidas
con amplio rango de acción, pero debido a la necesidad de disminuir los costos de producción y a
la exigencia por parte de los consumidores de disminuir los residuos de plaguicidas presentes en
las frutas, se han debido buscar nuevas estrategias para el manejo de las plagas en los cítricos
(León, 2001).
Los ácaros son artrópodos que pertenecen al Phylum Arthropoda, Supphylum Chelicerata, Clase
Arachnida y subclase Acari y es particular debido a que su cuerpo se divide en 2 partes: (i) una
región anterior conocida como gnatosoma, en la cual se encuentran los apéndices bucales, contiene
los palpos y los quelíceros cuyo rango de variación refleja en gran parte la diversidad de estilos de
vida y hábitos de alimentación, y (ii) una posterior o idiosoma en la que se ubican internamente
los órganos y en su exterior 4 pares de patas en adultos y ninfas, y 3 pares en larvas, los apéndices
ambulacrales, las aberturas anal, genital y las estructuras sensoriales denominadas seta, La región
posterior al último par de patas es denominada Opistosoma (De Moraes y Flectmann, 2008; Krantz
y Walter, 2009) todas estas estructuras funcionan como características típicas de cada especie, las
cuales confieren una funcionalidad de clasificación de los grupos taxonómicos (Evans, 1992).
Por los hábitos alimenticios de estos organismos es posible encontrar especies exclusivamente
fitófagas , en donde ocasionan daños directos a los tejidos o actúan como vectores de diversas
enfermedades virales como leprosis, la cual es una enfermedad de importancia económica que ha
tendido a incrementarse durante los últimos años en diversos países de centro y Suramérica (Freitas
et al. 2005), y es transmitida por los diferentes estadios de Brevipalpus phoenicis
(Acari:Tenuipalpidae) conocido como el ácaro rojo plano (Leon, et al., 2006).
5.3. Schizotetranychus hindustanicus Hirst (1924) y sus efectos en la producción de cítricos
El género Schizotetranychus es uno de los de mayor número de especies de la familia
Tetranychidae (Migeon y Dorkeld, 2013). La identificación de las especies en este género se ha
basado principalmente en los caracteres del edeago (o aedeagus) del macho, este con la parte distal
curvada hacia la espalda y más pronunciado y agudo en forma de S distalmente, con la última
curva delgada, y puede parecer que tiene una forma ligera de gancho en la punta (figura 1)
(Jeppson et al., 1975; de Navia y Marsaro 2010).
La NAPPO (2014) describió a Schizotetranychus hindustanicus como un ácaro que tiene las setas
dorsales relativamente cortas, como la c1 - c2 y d1 - d2, alcanzando una distancia de 0,5 - 0,7 х
entre sus alvéolos; la seta dorsal f1 bien separada, con una distancia de f1 - f1 de 2,0 - 2,5 (figura
2).
Gupta y Gupta (1994) y Migeon y Dorkeld (2013) mencionan que se han identificado 5 plantas
hospederas; Cocos nuciferas (Arecaceae), Acacia sp. (Fabaceae), Azadirachta indica, Melia
azedirachta (Meliaceae), Sorghum vulgare (Poaceae) y Citrus sp. (Rutaceae).
Navia y Marsaro (2010) reportaron la presencia del ácaro S. hindustanicus en cultivos citrícolas
en Brasil, capturaron imágenes microscópicas del ácaro, tanto de hembras y machos bajo
microscopia de contraste de fase (Figura 3), e identificaron la especie principalmente mediante el
edeago.
Figura 2. Esquema del dorso de
Schizotetranychus
hindustanicus. Fuente NAPPO
a b
Figura 1. Edeago Schizotetranychus hindustanicus. Fuentes:(a) Ilustración
de Jeppson et al., 1975 y (b) Microfotografía de Navia y Marsaro (2010).
Este arácnido tiene la capacidad de adaptarse a diferentes tipos de cítricos y sus ciclos de vida en
los diferentes sustratos utilizados como alimentos no difieren en su duración, ya que Nienstaedt y
Marcano (2009) lo evidenciaron en su estudio, y observaron que las hembras presentan periodos
de vida más largos con respecto al de los machos; su ciclo de vida compuesto por cinco etapas que
inicia desde el huevo hasta el adulto, tiene un promedio en limón persa de 33,8 y 29,86 días en
hembras y machos respectivamente. Dichos estadios que conforman el ciclo de vida para estos
organismos se registran en la tabla 1, con su respectiva duración para cada sexo.
Tabla 1. Duración (días) de los estados de desarrollo de hembras y machos de
S. hindustanicus en limón persa. Fuente: (Nienstaedt y Marcano, 2009).
Estados de desarrollo Hembra Machos
Huevo 7,62 7,41
Larva 2,8 2,17
Protoninfa 2,08 1,79
Deutoninfa 2,15 2,14
Adulto 15,8 13,2
Ciclo de vida 33,8 29,86
Jerusalén y la India fueron los primeros países en identificar a Schizotetranychus hindustanicus y
fue reportada como una plaga potencial para los cítricos (Bolland et al. 1998 y Uri, 2003). Quirós
y Dorado (2004) resaltan que cerca al año 2000 en Venezuela se reportaron graves daños sobre
hojas y frutos de cítricos, afectando principalmente a los árboles de limón, evidenciándose este
daño en forma de círculos blanquecinos cloróticos sobre el haz de la hoja y en las depresiones de
la corteza de los frutos. En el 2011 fue reportado oficialmente en Colombia por el ICA en el
Figura 3. El ácaro hindú de los cítricos, Schizotetranychus hindustanicus:
micrografías bajo microscopía de contraste de fase. (a) dorso de la
hembra; (b) dorso del macho. Fuente: Navia y Marsaro (2010)
departamento de Magdalena, este se observó en plantas de naranja Valencia en sus hojas y frutos
(LNDF, 2012). En Colombia, al igual que en Venezuela su sintomatología se observa con las
manchas blanquecinas circulares con un diámetro que oscila entre 1 y 3 mm en hojas y frutos
(Figura 4) (Delgado, 2012).
En Brasil también Navia y Marsaro (2010) observaron manchas en el haz de las hojas y frutos de
árboles de limón Tahití galenguinho.
Quirós y Geraud (2002) reportaron en su estudio que los síntomas primarios aparecen sobre la cara
adaxial de las hojas a lo largo de la nervadura central, luego estos se extienden sobre todo el área
foliar y a la vez los frutos toman una coloración plateada y consistencia dura. Estos autores también
mencionan acerca de las telarañas que forman las hembras en las hendiduras de la superficie de
los frutos, en la cual construyen una red circular donde ovipositan sus huevos, estos crecen a
medida que la población aumenta. Bajo estos nidos es común encontrar ácaros en diferentes
estadios, como larvas, ninfas y huevos, los adultos tienden a ubicarse fuera de los nidos. Estas
manchas causadas por los nidos que producen las hembras tienden a desmejorar la apariencia de
los frutos, por lo que afecta económicamente su valor y limitando su exportación. Cuando la
infestación es extensa las frutas se vuelven plateadas y duras (Navia y Marsaro; 2010)
Para el control o manejo de los ácaros que afectan los cultivos de interés industrial se ha utilizado
intensamente los plaguicidas, no obstante, estos han causado diversos problemas como la
resistencia que generan los ácaros a estos productos, intoxicación de mamíferos y destrucción de
organismos benéficos (Venzon et al., 2008); la presencia de residuos tóxicos en los alimentos, en
el medio ambiente, fitotoxicidad, entre otros (Soto et al., 2012)
Figura 4. Manchas blanquecinas circulares sobre
frutos y hojas de limón, causadas por S.
hindustanicus. Fuente: Delgado, 2012.
5.3. Utilización de extractos vegetales en el control de ácaros
Diversas alternativas se han empleado para contrarrestar los daños causados por el uso indebido
de plaguicidas, como estrategias integradas mediante el uso de sustancias de origen vegetal con
una actividad acaricida (Castiglioni, et al., 2002) Estos estudios de la actividad insecticida de los
extractos vegetales y fitoquímicos ha ido aumentando debido a la demanda de alimentos orgánicos
(De Souza et al., 2009), y a la defensa de los alimentos por parte de organizaciones fitosanitarias
(Regnault et al., 2004).
El neem (Azadirachta indica A. Juus), representa este tipo de plantas con potencial para controlar
diferentes familias de insectos a través de las propiedades fisiológicas del ingrediente activo de
sus extractos, conocido como Azadiractina (Pavela et al., 2009), este árbol perteneciente a la
familia Meliaceae (caoba) y conocido comúnmente como margosa o lila india es atractivo debido
a sus hojas amplias y a sus ramas que pueden cubrir hasta diez metros alrededor, en los axilares
nacen las flores y frutos y sus semillas son conchas que contienen 1-3 granos los cuales poseen la
Azadiractina; esta molécula es biosintetizada por Azadirachta indica a partir de triterpenoides, el
cual su precursor es un esteroide que puede ser azadirone o azadiradione; la figura 5 muestra la
estructura química de este compuesto de interés en la agricultura, el cual en comparación con otros
compuestos menos complejos han demostrado tener una actividad altamente antialimentaria y
tóxica contra larvas de diversas especies de lepidópteros (Aerts y Mordue (Luntz) 1997).
También logra bloquear en algunos organismos la metamorfosis de las larvas o ninfas, destruyen
el apareamiento y comunicación sexual esterilizando adultos, impidiendo su alimentación
bloqueando la habilidad para tragar (reduciendo la movilidad intestinal) (Servalesa, 2001).
Figura 5. Estructura química de la
Azadiractina; compuesto activo de los
extractos de Azadirachta indica.
Este compuesto también se ha mostrado altamente promisorio en el manejo y control de ácaros
fitófagos causando mortalidad, reducción de la fecundidad, generando inactividad en sus procesos
de infección, inviabilidad en diferentes estadios de su ciclo de vida (Soto et al. 2012). Soto y
colaboradores (2011) evaluaron los efectos letales de extractos de Neen sobre el ácaro Tetranychus
urticae, el cual es considerado como uno de las principales plagas que afectan los cultivos de fresa,
a su vez generando pérdidas hasta del 80% del total de la producción, estos autores observaron que
la aplicación de diversos compuestos a base de Neen evidencian una estrategia de control viable
del ácaro fitófago T. urticae. En regiones africanas productoras de tomate, sus cultivos tienden a
ser perjudicados por plagas como Tetranychus evansi, este ácaro de importancia económica
alcanza a reducir la cosecha hasta un 90% de la productividad, por tal motivo Soto et al., (2012)
evaluaron formulaciones comerciales de Neem para su control, y observaron que las
concentraciones adecuadas de los extractos evaluados representan una alternativa viable para el
control del ácaro fitófago, y que los resultados obtenidos pueden ser utilizados para involucrarlos
en el manejo integrado de esta plaga.
5.4. Implementación de Azufre micronizado en el control de ácaros
El azufre ha sido un elemento significativo como alternativa para el control de diversos insectos
plagas de cultivos de importancia economica, tales como frijol, algodón entre otros, en los que han
utilizado compuestos a base de azufre para el combate de ácaros que perjudican estos tipos de
cultivos (Scwartz y Gálvez, 1980). El azufre, por sus propiedades como acaricida, es uno de los
productos más empleados, pudiendo aplicarse de diferentes formas: a) en espolvoreos (azufre en
polvo); b) foliar (azufre mojable o líquido); y c) sublimado (azufre en polvo) (Garrido et al. 2010).
Este por tiempos se ha venido utilizando debido a sus bajo costo, su fácil preparación y al permiso
de aplicación por parte de la mayoria de certificadoras de productos organicos (Mc Callan, 1967).
El azufre ha sido implemntado de forma industrializada y en diferentes presentaciones debido al
control que tiene en varios insectos, ácaros, trips y entre otros organismos plaga (Simas, 2012)
Varios autores han demostrado a traves de sus ensayos la eficiencia del producto sulfocalcio para
combatir los ácaros que afectan los cultivos, tales como el de pimentón (Capsicum annum) en
donde este compuesto redujo la población de los ácaros hasta un 83% por hoja (Rodriguez, 2004);
Soto (2011) a su vez resalta que la aplicación del caldo sulfocalcio a diferentes concentraciones,
las cuales fueron evaluadas, disminuyó los individuos del ácaro rojo (Oligonychus ílicis) en
cultivos de café hasta en un 95.5% de la población total. Junchaya (2016) recomienda que para el
control de ácaros tales como Polyphagotarsonemus latus y Tetranychus urticae y Pannonynchus
citri la implementación de Azufre en polvo 24 a 48 kg de i.a./ha; Azufre micronizado en aspersión
de 3,2 a 3,7 kg de i.a./ha permite la reducción de la población.
5.5 Utilización de la Abamectina como control de ácaros fitófagos
La abamectina es conocida como un compuesto de actividad acaricida, el cual su ingrediente activo
es la avermectina, estas pertenecen a un grupo de lactonas macrociclicas con efecto insecticida,
acaricida (Campos et al., 1996), esta es una molécula que es sintetizada por la bacteria
Streptomyces avermitilis de acción traslaminar y sistemia localizada, de un amplio espectro y en
la cual su acción como acaricida está enfocada en los adultos. Esta tiene dos modos acción, por
contacto y por ingestión, aunque esta última es más eficiente ya que el ácaro queda inmovilizado
después de haberla ingerido, y deja de alimentarse y muere. Esto es causado debido a que impide
la transmisión de señales en las conexiones neuromusculares por el mecanismo de amplificación
de la acción del ácido α-aminobutirico, a través de un aumento de la permeabilidad de la membrana
de calcio. (Rotam y Syngenta, 2014).
6. OBJETIVOS
6.1. Objetivo General:
● Evaluar la actividad acaricidas in vitro e in vivo de extractos vegetales y otros compuestos
acaricidas sobre ácaros que afectan los cultivos de limón Tahití (Citrus ×latifolia Tanaka
ex Q. Jiménez)
6.2. Objetivos Específicos:
● Verificar morfológicamente la especie de Schizotetranychus hindustanicus.
● Establecer la cría in vitro e in vivo de Schizotetranychus hindustanicus.
● Evaluar la mortalidad de Schizotetranychus hindustanicus mediante el uso de extractos de
Azadirachta Indica y otros compuestos acaricidas in vitro e in vivo
7. METODOLOGÍA
7.1. Verificación morfológica de los adultos de Schizotetranychus hindustanicus
Para la caracterización e identificación de los ácaros recuperados a partir de las muestras de las
fincas afectadas, se colocaron los ácaros en tubos ependorf con lactofenol durante 5 días, posterior
a este proceso se llevaron a cámara de Neubabuer y se observaron a través del microscopio óptico
Nikon Eclipse Ni, utilizando en software NIS-Elements (Ver.4.0) enfocando las muestras con un
aumento de 200X. Siguiendo el manual/guía de identificación de ácaros titulado Mites injurious
to economic plants, se estableció e identificó el ácaro con respecto a sus características
morfológicas. Para confirmar la especie del Schizotetranychus hindustanicus se fotografiaron más
individuos machos, los cuales permitieran una observación de su órgano reproductor, que
corresponde al edeago, pues este corresponde al carácter de identificación de especies en diferentes
arácnidos (Jeppson et al. 1975)
A través del software de procesamiento de imagen ImageJ 1.50i se midieron las diversas partes
que conforman el cuerpo del ácaro Schizotetranychus hindustanicus; esto se realizó con las
hembras y machos de las muestras vistas bajo el microscopio óptico.
7.2. Establecimiento de la cría in vitro e in vivo de los ácaros fitófagos.
Para el establecimiento de la cría se colectaron las muestras biológicas en el municipio de Girón,
Santander, en la finca Jaime Mantilla ubicada a 7°01'14.4"N y 73°16'20.8" O, con temperatura
promedio de 28,5°C; La Finca del Señor ubicada a 7°01'16.6"N y 73°16'86.1“O, con temperatura
promedio de 26°C, Finca El Diamante ubicada a 7°01'16.8"N y 73°18'27.1"O, con temperatura
promedio de 29,3°C y por ultimo finca Los Almendros ubicada a 7°02‘44.8"N y 73°09'09.2"O,
con temperatura aproximada de 28°C; estas granjas las cuales los árboles de limón Tahití (Citrus
×latifolia Tanaka ex Q. Jiménez) estaban afectados y presentaban el daño causado por el ácaro, se
tomaron muestras de hojas y frutos afectados, en los cuales por su hendidura en la superficie se
suelen almacenar los ácaros, estos fueron transportados al Laboratorio de investigación e
innovación en biotecnología agroambiental (LIIBAM) en donde se observaron bajo el
estereoscopio con el propósito de verificar la presencia del ácaro. En las hojas en las cuales estaba
presente el ácaro, sin tener en cuenta la población total por hoja, se colocaron con el peciolo
sumergido en un vaso plástico de 50 cm3 con agua hasta aproximadamente ¼ del vaso, con el fin
mantener la turgencia de la hoja; esta con la cara adaxial hacia arriba, fueron expuestos en un
estante con fluorescentes con un fotoperiodo automatizado de 12 horas luz y 12 horas oscuridad,
una temperatura de 27°C ± 1 y una humedad relativa de 47 ± 10%. Estas condiciones se
establecieron con el fin de obtener una reproducción de los ácaros, de una forma aislada; ya que
así lo sugieren Rivero y Vásquez (2009) mediante su publicación.
Para la obtención de una mayor población y poder infectar las plantas de vivero para el posterior
tratamiento in vivo, se buscaron hojas de las muestras obtenidas de las fincas que estuvieran
infestadas y con sintomatología del ácaro y que este estuviera en diferentes estadios de su ciclo de
vida, estas se pegaron con pedazos pequeños de cinta de enmascarar, de tal manera que el haz de
ambas hojas quedaran en contacto, por lo que la hoja infestada cubría a la hoja sana de la planta,
la cual se pretendía infestar; la figura 6 evidencia de cómo se trabajó este proceso de infección de
las plantas de vivero. Esta técnica fue necesaria incluirla debido a que la población no se reprodujo
cuando estos se pasaba de hojas a infestadas a hojas sanas con un pincel, y además fue la
metodología implementada por Villar (2016) donde el autor asegura que su población de ácaros
aumento al poner en contacto la cara adaxial de las hojas, estas en condiciones de invernadero a
una temperatura aproximada de 25°C, con una humedad del 75%
7.3. Aplicación de los extractos sobre adultos de Schizotetranychus hindustanicus
Después de que la población estaba aumentando debido a la cantidad de individuos observados,
se realizó el conteo por hoja en las que se tomaron como unidad experimental las hojas con una
población mayor o igual a 8 ácaros en estado adulto. Se llevó a cabo el experimento a nivel
umbráculo (Casa de cultivo UDES)
Figura 6. Técnica implementada de
infestación de plantas de vivero con hojas
afectadas por Schizotetranychus
hindustanicus.
Se evaluaron cuatro tratamientos en los que se incluyó Neem Emulsificado, Neem comercial,
Kumulus y ceniza y se implementaron 2 controles o testigos. Se efectuaron 3 repeticiones por
tratamiento, cada repetición o unidad experimental estaba constituida por un vaso de 50 cm³ el
cual contenía una hoja previamente identificada con el número poblacional de ácaros. El extracto
de Neen comercial fue adquirido en el portal para el suministro de insumos agropecuarios
Agroactivo, ubicado en la ciudad de Medellín, el cual contenía en su etiqueta la dosis comercial
para el tipo de plaga que se desea controlar, la concentración aplicada en el tratamiento según lo
indicado fue de 1mL del extracto en 100mL de agua.
El extracto oleaginoso de Semillas de Neen el cual fue donado por el investigador cubano Jesús
Estrada Ortiz en abril del 2017 y contenía 4,3g de Aza/kg de semilla, la fracción está compuesta
por una mezcla compleja de tetranortriterpenoides, entre los que se encuentran: Azadiractina,
salanina y Neenbina como principios activos. La dosis implementada fue de 1mL del extracto
oleaginoso en 100mL de agua; debido a que era la concentración indicada en la etiqueta comercial.
Este antes de ser aplicado se agitó fuertemente con el fin de liberar y romper las emulsiones para
que de esta manera el compuesto activo estuviera libre.
El Kumulus fue aplicado a una dosis de 0,5 g del compuesto en 100mL de agua
La ceniza fue obtenida de una hoguera, en el campo en donde implementaron leña para su
encendido, esta fue filtrada mediante un tamiz para separar los trozos de carbón, luego en 200 mL
de agua se puso a cocción 30 g de la ceniza ya tamizada hasta alcanzar una temperatura de
ebullición, esta se homogenizó y finalmente se tomaron los 100 mL que se embazaron en el
aspersor, para su aplicación con una concentración final de 15g de ceniza en 100mL agua.
La Abamectina comercial, la cual fue utilizada para el tratamiento del control positivo se
implementó a una concentración de 0,2 mL del compuesto en 100mL de agua.
Figura 7. Aplicación de los tratamientos
por aspersión sobre papel toalla.
Como control negativo se utilizó el agua, los tratamientos se aplicaron mediante la aspersión de 3
toques del embace, las hojas fueron puestas sobre un mesón en un papel toalla para la aplicación
de los compuestos y el agua (Figura 7).
En la tabla 2 se registran los compuestos y sus concentraciones evaluadas en cada uno de los
tratamientos a la vez se muestra el registro fotográfico de la presentación comercial, o particular
de los compuestos evaluados.
Tabla 2. Compuestos y dosis evaluadas de cada tratamiento y su presentación
comercial.
#Tratamiento
Compuesto
Concentración
Presentación
comercial
1 Neen
Emulsificado 1mL/100mL
2
Neen Comercial
1mL/100mL
3
Kumulus
0,5g /100mL
4 Avamectina 0,2mL/100mL
5 Ceniza 15g/100mL
6 Agua 100mL
Los resultados obtenidos en el ensayo in vitro fueron registrados en la matriz diseñada en un
archivo tipo Excel, para posteriormente ser analizada mediante los programas estadísticos de
Statistix V 8.0.
7.4. Evaluación in vitro e in vivo de Azadirachta indica y otros compuestos acaricidas sobre
Schizotetranychus hindustanicus.
Después de aplicados los cuatro tratamientos con los dos controles fueron puestas las hojas en los
vasos de 50 mL con agua hasta la cuarta parte del vaso, se dejaron en el mueble con las condiciones
previamente mencionadas, tales como fotoperiodo, temperatura y humedad. La figura 8 muestra
el montaje de las unidades experimentales con el tratamiento.
Luego de trascurridas las primeras 24 horas se realizó el primer recuento de mortalidad de ácaros,
este procedimiento se realizó mediante el uso de un pincel fino, de tal manera que al tocar los
ácaros se realizara de una manera suave y sin perjudicarlo, esto con objeto de causar un tipo de
estimulación y que el ácaro generara algún movimiento si este estaba vivo, esto se realizó durante
los 3 periodos de observación (24, 48 y 72h). De esta manera se realizaba el conteo y se registraban
los ácaros que no presentaban ningún movimiento, por lo que se consideraba como un ácaro
muerto. Se utilizó un diseño completamente aleatorizado de 4 tratamientos y 4 repeticiones, con
un arreglo de mediciones repetidas en el tiempo, seguido de una prueba de Anova y las pruebas de
medias por Tukey (α= 0,05) con el software Statistix 8 (2003).
Después de finalizado el tiempo de evaluación de mortalidad causada por los compuestos
aplicados, se analizaron los resultados obtenidos y fueron procesados por Statistix, con el fin de
tener una descripción e interpretación superior de los mismos mediante un diagrama de barras y
se observaron los tratamientos que presentaron mayor actividad acaricida, para que estos
nuevamente fueran aplicados en las plantas para el ensayo in vivo, Para este experimento se
utilizaron las plantas de vivero que tuvieran entre 15 a 20 hojas, (mayor a 3 meses de edad) y que
Figura 8. Montaje de los ensayos con los
tratamientos in vitro
cada una tuviera una población de ácaros (10 mínimo). Para este experimento se aplicaron 4
tratamientos, el cual correspondía a los 2 controles, al Neen Emulsificado y al Kumulus, cada uno
evaluado a las concentraciones que implementadas en el ensayo in vitro resultaron con mayor
actividad acaricida y en el menor tiempo. La figura 9 muestra el montaje del experimento in vivo
de las plantas de vivero expuestas a los tratamientos, estos separados con una distancia mínima de
25 cm entre cada uno, con el fin de no tener cruces entre las crías de las plantas.
Estas plantas fueron expuestas a los tratamientos por 10 días en donde fueron regadas con agua
del grifo, día por medio. Finalizado dicho tiempo las hojas fueron observadas al estereoscopio con
el fin de determinar la vitalidad de los ácaros.
Para el análisis estadístico, se utilizó un diseño completamente aleatorizado de 4 tratamientos y 4
repeticiones. Los datos de mortalidad se analizaron como mediciones repetidas en tiempo seguido
de una Anova y las pruebas de medias por Tukey (α= 0,05) con el software Statistix 8 (2003).
7.5. Determinación de la DL 50 del extracto crudo de Azadirachta Indica.
Para determinar la dosis letal 50 (DL50), se observó en la matriz cuál de los compuestos presentó
mayor mortalidad, y se evidenció que el extracto de Neen Emulsificado donado por el investigador
cubano Jesús Estrada Ortiz fue el que causó mayor mortalidad de los extractos naturales evaluados
sobre Schizotetranychus hindustanicus; por lo que se procedió hacer la evaluación de la
concentración míNeena de inhibición del ácaro en las hojas. Se evaluaron 4 tratamientos más los
2 controles que correspondían al agua y a la abamectina (0,2%). Para la determinación de la DL50
Figura 9. Ensayo in vivo de los tratamientos
sobre plantas de Limón Tahití en el umbráculo
de la UDES.
fue necesario realizar el ensayo 2 veces, con el fin de obtener resultados más o menos
satisfactorios.
Inicialmente el ensayo se realizó con concentraciones desde 0,25; 0,5; 0,75 y 1,0% del Neen
Emulsificado en 100 mL de agua, la mayor concentración correspondía a la concentración
evaluada en el primer experimento y la cual fue aplicada en el tratamiento in vivo, la lectura se
realizó únicamente a las 24 h después de aplicado el tratamiento, pero debido a los resultados
obtenidos y comparados con el control positivo, se decidió aplicar nuevamente el ensayo en nuevas
hojas con concentraciones superiores, en las que se evaluaron 1,25; 1,5; 1,75 y 2% en agua.
Mediante el uso de Excel (2018) se procedió a calcular los Probits de los índices de mortalidad de
cada uno de los tratamientos, a través de la fórmula = (5 + INV.NORM.ESTAND (índice de
mortalidad)) de cada una de las concentraciones evaluadas. Se realizó un análisis de regresión del
modelo y un ANOVA para calcular los valores de a, b, valor test, lc y finalmente la DL50.
7.6. Observación de Schizotetranychus hindustanicus muertos en los tratamientos del Neen
Emulsificado, Kumulus y Abamectina.
Muestras de ácaros muertos fueron colectadas a partir de las hojas de los tratamientos in vitro del
Neen Emulsificado, Kumulus y Abamectina, estos se almacenaron en lactofenol para un posterior
montaje en lámina y observación en el microscopio óptico Nikon Eclipse Ni, utilizando en software
NIS-Elements (Ver.4.0)
8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
8.1. Establecimiento de la cría in vitro e in vivo de los ácaros fitófagos
A través de la técnica de cubrimiento de las hojas de las plantas de vivero con las hojas infestadas
se logró obtener y una mayor población de los ácaros hasta evidenciar las manchas blancas
características del daño de S. hindustanicus, en un tiempo aproximado de 20 días, La Figura 10
muestra resultados de la aplicación de la técnica.
Villar (2016) quien recuperó individuos Tetranychus urticae mediante esta técnica, no mencionan
el tiempo que tardó en aumentar la cría, en infestar la planta o en presentar la sintomatología de la
infección, en nuestro estudio, esto se logró en un tiempo entre 25 – 30 días después de colocadas
las hojas sobre las plantas.
Figura 10. Técnica de infestación de las plantas de
vivero con las hojas con población de
Schizotetranychus hindustanicus.
8.2. Caracterización morfológica de los adultos de Schizotetranychus hindustanicus.
Bajo el estereoscopio estos ácaros tenían una apariencia amarillenta, traslucida, con puntos
internos negros y rojos en el idiosoma, muchos de estos se encontraron bajo una telaraña en la que
se encontraban igualmente los huevos, estos se identificaban como estructuras circulares,
aplanadas que tienen una hendidura en la mitad, Navia y Marsaro (2010) mencionan que debajo
de las telarañas o redes se encuentran las larvas y ninfas; y los adultos en ocasiones pueden estar
debajo también o en las áreas circundantes. Con estas descripciones dadas por los autores podemos
evidenciar las características similares que se presentan en lo observado en el estereoscopio con
respecto a lo que ellos reportan, por lo que puede ser una de las herramientas utilizadas para la
identificación del ácaro S. hindustanicus (Figura 11).
En las figura 11 se observa Schizotetranychus hindustanicus lo que corresponde al cuerpo de una
hembra (fig.11 a.) y un macho (fig.11 b.); el macho en su apariencia se caracteriza por tener sus
patas más largas con respecto a las de la hembra, además la parte final del idiosoma termina en
forma alargada tendiendo a ser puntuda, en comparación con la hembra en la que su cuerpo tiene
una terminación ovalar en su idiosoma. Estas imágenes fueron comparadas con las publicadas por
Navia y Marsaro (2010) (Fig. 3) en su estudio acerca del primer reporte del Schizotetranychus
hindustanicus en Brasil.
En contraste con las imágenes capturadas durante el proceso de identificación y las publicadas por
Navia y Marsaro (2010) se observan características morfológicas muy similares en los cuerpos de
los individuos utilizados (hembras y machos), los cuales sirven de clave taxonómica para la
identificación del género del arácnido que se estaba estudiando. La distancia entre las setas d1 –
d2 hasta c1 – c2 presentaron un promedio de 69,07µm y la distancia entre Las setas f1 – f1
demuestra una distancia promedio de 82,35µm, Según Hirst (1924) las setas dorsales relativamente
cortas, alcanzan una distancia entre sus bases de 0.5–0.7 x y las setas dorsales bien separadas,
tienen una distancia de 2.0–2.5 x, los autores (Jeppson et al. 1975) no reportan las unidades de
b
.
a
.
Figura 11. Schizotetranychus hindustanicus bajo microscopia electrónica
con un aumento de 200X. (a) Hembra del ácaro hindú. (b) Macho del ácaro
hindú.
medida, pero estos valores reportados respecto a las distancias determinadas entre las setas d1 –
d2 y c1 - c2 son menores tanto con los valores obtenidos, como los valores citados, en relación
con los valores de distancia entre las setas f1 – f1.
Jeppson y colaboradores (1975) mencionan que el macho es necesario para determinar la especie,
pues el edeago es el carácter de mayor clave para la identificación de la especie y además describe
el edeago S. hindustanicus, con la parte distal curvada hacia la espalda y más pronunciado y agudo
en forma de S distalmente, con la última curva delgada y redonda y puede parecer que tiene una
forma ligera de gancho en la punta. Con esta descripción y con la imagen publicada en su manual,
en la que se observa la silueta del edeago, se logró comparar con lo obtenido en la microfotografía
(figura 12), en donde se puede observar la morfología del edeago y con las características análogas
a las descritas por Jeppson et al., (1975) se confirma la especie del género como Schizotetranychus
hindustanicus, del cual se tenía cierta certeza debido a la sintomatología presentada en hojas y
frutos, y a las características macroscópicas del arácnido.
En la tabla 3 fueron registrados estos datos. Varios individuos fueron medidos y se obtuvieron
diversos datos de los cuales se sacó el intervalo de medidas para todas las estructuras arácnidas,
estos valores fueron hallados en micrómetros (µm).
Figura 12. Estructura del edeago de
Schizotetranychus hindustanicus, en 100X
Hirst (1924) y Gupta y Gupta (1994) mediante montajes en laminillas realizaron mediciones desde
el estilóforo, que corresponde a las bases de los quelíceros, hasta la punta del abdomen y los de
especímenes que fueron montados tenían medidas de aproximadamente 372 µm de largo y 250
µm de ancho; estas medidas muestran diferencias con respecto a las medidas del largo del cuerpo
que se hallaron en el laboratorio, debido a que no fueron tomadas en la totalidad del largor del
ácaro; no obstante las diferencias en relación al ancho del cuerpo son mininas a las halladas en
hembras con valores de 62,3 y 10µm de largo y ancho respectivamente; y en machos es mayor,
con valores diferenciales entre 109,1 y 33,2µm. Posiblemente estas medidas fueron realizadas en
hembras, aunque los autores no lo mencionan.
8.3. Evaluación in vitro e in vivo de los extractos vegetales y otros compuestos sobre
Schizotetranychus hindustanicus.
Lo resultados de mortalidad se registraron en la matriz de Excel y analizados mediante el programa
de Microsoft Excel, se observan en la tabla 4.
Tabla 3. Rangos de Medidas generales en µm, correspondientes al ácaro S.
hindustanicus para hembras y machos.
Órgano Schizotetranychus
hindustanicus Hembra Macho
Largo del cuerpo 434,3 -435,6 481,1- 488,0
Ancho del cuerpo 240,0 -241,9 216,8- 219,2
Primer par de patas 235,5- 244,4 467,9- 542,1
Segundo par de patas 148,8 - 171,3 301,8- 311,1
Tercer para de patas 131,0 - 141,9 268,3- 283,1
Cuarto par de Patas 123,1- 140,1 341,8- 353,9
Largo de los palpos 107,3 - 119,7 128,0- 135,4
Apertura de la vulva (ancho) 41,1- 42,9 n/a
Apertura de la vulva (largo) 51,0- 53,7 n/a
En la figura 13 se observan los datos que fueron procesados por Statistix.
En los resultados obtenidos se muestra que los tratamientos con mayor eficiencia de mortalidad de
los ácaros a las diferentes horas evaluadas fueron el Neen Emulsificado, el Kumulus y la
Abamectina, con porcentajes generales de 78,65; 91,11; y 96,44% respectivamente, dado que en
cada recuento o tiempo evaluado mostraron ser los más eficaces para causar la inhibición de los
ácaros.
Con respecto a la Abamectina se esperaba obtener un resultado similar al resultado hallado en los
ensayos in vivo e in vitro, por lo que este fue utilizado como control positivo, ya que se le confiere
actividad acaricida, debido a que ensayos realizados en laboratorio y en campo ha mostrado inhibir
la población de ácaros hasta más del 80% a una concentración de 3,2 ppm en 72 horas. (Vásquez
y Ceballos; 2009); en invernadero fue evaluada por De Evert y colaboradores (2016) para
disminuir la población del ácaro blanco (Polyphagotarsonemus latus Bank.) en cultivos de
pimentón, la abamectina fue el compuesto que presentó poblaciones más bajas de ácaros en
comparación con los demás compuestos evaluados.
Tabla 4. Matriz de registro de mortalidad de los ácaros in vitro con los
tratamientos en los diversos tiempos evaluados
Tratamientos 24h 48 h 72 h Total
general
T1:Neem Emulsificado
1,25%
59.66 82.98 93.30 78.65
T2:Neem Comercial 16.87 28.27 31.05 25.40
T3:Kumulus 84.68 91.41 97.22 91.11
T4:Abamectina 0,2% 91.88 97.44 100.00 96.44
T5: Ceniza 15% 37.87 36.05 39.08 37.67
T6:Agua 3.33 17.20 21.36 13.96
Total general 49.05 58.89 63.67 57.20
La abamectina también cumple un tipo de sinergismo al combinarse con otros compuestos como
spirodiclofen, ya que a una concentración de 0,6 L/Ha es el tratamiento que muestra una menor
población de ácaros de Tetranychus urticae móviles durante los 14 días de evaluación en cultivos
de rosas (López; 2015) Con estos estudios evidencian la acción que tuvo la abamectina en la
investigación, debido a que fue el tratamiento empleado como testigo y el que presentó mayor
mortalidad de S. hindustanicus.
El Kumulus, conocido también como azufre micronizado, es ampliamente utilizado en el control
de diferentes organismos plagas, entre estos los ácaros se han mostrado altamente sensibles a este
compuesto, pues así lo demuestran Meca et al., (2008) mediante su aplicación en cultivos de
calabacín, en donde evaluaban diferentes compuestos para ver la respuesta productiva y a su vez
el manejo de plagas y enfermedades, lo autores observaron la inhibición de arácnidos, tales como
Phytoseiulus persimilis, Amblyseius californicus y Amblyseius andersoni, y a sus vez recomiendan
el uso del azufre micronizado (98,5%) a dosis de 2Kg como materia activa para el control de
enfermedades causadas por ácaros fitófagos en general. Además Soto (2011) evaluó 3
concentraciones de caldo sulfocalcio para el manejo del ácaro rojo (Oligonychus ílicis) en cultivos
de café y observó que a concentraciones de 0,5% disminuyó los individuos hasta en un 95.5% de
la población total. Este autor señala que debe ser priorizado el uso de concentraciones bajas debido
a su baja selectividad, ya que es posible utilizar dosis del producto que sean eficientes en el manejo
de la plaga y selectivos a los enemigos naurales (Venzon et al., 2007; Soto et al., 2011). Con estos
estudios previamente mencionados se puede corroborar los resultados obtenidos durante esta
investigación, pues el azufre micronizado (Kumulus) presentó una mortalidad durante todo el
tratamiento del 91,11% de totalidad de los ácaros de S. hindustanicus en el tratamiento in vitro y
Figura 13: % de Mortalidad de S. hindustanicus con los tratamientos
aplicados en el ensayo in vitro. Evaluaciones realizadas en tres tiempos.
Nim_Em
ul Nim_Com
er Kumulu
s Abamecti
na Ceniz
a Agu
a
0
2
5
5
0
7
5
10
0 %
de
Mo
rtal
idad
in v
itro
Tratamientos
TIEMPO
24
h 48
h 72
h
a ab b
c cd
d
un 94,41% en el ensayo in vivo; esto se debe posiblemente al tiempo de evaluación de los
compuestos, o muy posiblemente a la finalización del ciclo de vida de los individuos.
Por otro lado Azadirachtina, el compuesto activo del Extracto de Neen, ha presentado una elevada
acción insecticida y acaricida, y es lo que se ha demostrado en este estudio, a través de la aplicación
del extracto Emulsificado, que a nivel general presentó una mortalidad del 78,65 y 86% en los
ensayos in vitro e in vivo respectivamente. Estos resultados se pueden soportar con lo citado por
Venzon y colaboradores (2005) donde observaron que en dosis superiores a 0,065 g/L de
azadirachtina, causó disminución de la tasa de crecimiento poblacional de Oligonychus ilicis en
experimento de laboratorio; esta investigación no difiere de los resultados obtenidos por
Castiglioni y colaboradores (2002) pues ellos evaluaron el efecto acaricida de extractos derivados
de meliáceas sobre Tetranychus urticae, entre estos tratamientos evaluaron semillas Neen
(Azadirachta indica) a una concentración de 5%p/v, aceite de Neen en las dosis de 0.5, 1 y 2% v/v
y la formulación comercial Neenkol-L en las concentraciones 0.5, 1 y 2% del ingrediente activo
v/v; los autores confirmaron el efecto tóxico de los extractos de Neen a los 5 días, causando una
mortalidad cerca del 90% de la especie plaga, generando reconocimiento valioso sobre el uso de
estos compuesto para el control de organismos fitopatógenos, aunque la formulación comercial
no tuvo efecto significativo sobre la mortalidad del ácaro en la concentraciones evaluadas, un
resultado muy similar al obtenido en el ensayo, pues la dosis comercial evaluada del Neen presentó
una leve mortalidad correspondiente al 25,40% durante los tiempos evaluados, quizás estos
compuestos necesiten mayor tiempo, pues así lo indican Castiglioni y colaboradores (2002), por
lo que en la mayoría de extractos vegetales podría esperarse mayores índices de mortalidad en
periodos de tiempo más prolongados. No obstante estos extractos orgánicos tiene una bajísima
toxicidad al hombre y animales domésticos, por lo que se muestra también selectivo para enemigos
naturales, y no genera efectos adversos en el ambiente (Castagnoli et al., 2000; El-Gengaihi et al.,
2000; Mourão et al., 2004).
En la tabla 5 se registran los datos obtenidos del experimento in vivo, después de terminados los
10 días de evaluación y se observa la mortalidad causada, la G muestra lo registrado en la tabla 4.
Tabla 5. Evaluación de los compuestos in vivo en plantas de vivero
Tratamientos Promedio de mortalidad en 10
días
Kumulus 0,5% 94,41
Neen Emulsificado 1,25% 86,00
Agua 0,04
Abamectina 0,2% 97,85
Total general 71,17
En la Figura 14 se evidencia la mortalidad de los ácaros causada por los tratamientos aplicados;
con estos resultados se logra observar que presentaron un comportamiento muy similar a lo
obtenido en el ensayo in vitro. Y se corrobora su eficiencia presentada en dicho ensayo, junto con
lo referente a la literatura, ya que el Extracto de Neem generó más del 80% de mortalidad y el 90%
lo presentó el Kumulus.
8.4. Determinación de la Dosis Letal 50 del extracto crudo de Azadirachta Indica.
En la siguiente tabla (6) se observa el porcentaje de mortalidad de S. hindustanicus a las 24 horas,
y se evidencia que la menor concentración que inhibió en gran proporción la población de los
ácaros fue la de 1,25% del Neen, a partir de esta se observa en algunos tratamientos hasta el 100%
de la mortalidad. Estos resultados muestran una particularidad respecto al estudio de Castiglioni
et al., (2002) pues los autores a una concentración del 1% lograron inhibir los ácaros de
Tetranychus urticae hasta en un 80%, en este estudio está mortalidad sólo se presentó en
concentraciones mayores al 1%, pues en 1,25% la mortalidad fue del 97,22% y al 1% del Neen
Emulsificado la muerte de los ácaros no superó al 5%, lo que indica que a mayor concentración
mayor mortalidad de los individuos.
Figura 14: Mortalidad (%) de S. hindustanicus con los tratamiento aplicados en el
ensayo in vitro
b
a a
a
Finalmente se determinó mediante el programa estadístico la DL50, (tabla 7) el cual nos indica
que equivale a 1,07% de concentración del Neem Emulsificado en agua.
7.6. Observación de Schizotetranychus hindustanicus muertos en los tratamientos del Neem
Emulsificado, Kumulus y Abamectina.
La figura 15 muestra ácaros de S. hindustanicus muertos con los tratamientos del Neem
Emulsificado, Kumulus y Abamectina, estos varían interna y se observa en las pigmentaciones
internas del ácaro y externamente los cuerpos de los ácaros muertos por los tratamientos tienen
irregularidades en su forma. La imagen del ácaro con el tratamiento del Kumulus se observa en la
técnica con UV.
Lo observado en la figura 15 (a) muestra que la Abamectina tiende a generar una descolorización
en la parte interna de S. hindustanicus, por lo que a luz blanca en el microscopio se observa
traslucido, lo contario pasa con el ácaro expuesto al tratamiento del Neen Emulsificado, este tiende
generar círculos internos oscuros, y una tonalidad verdosa en todo el cuerpo. Por el contrario el
Kumulus genera manchas color beige en gran parte del cuerpo; por esto fue necesario implementar
la U.V. pues no se notaban las diferencias con respecto a la luz blanca, hasta el momento no se
Tabla 6. % de mortalidad de diferentes dosis de Neem Emulsificado
sobre S. hindustanicus , cálculo de DL 50
Tratamientos % de mortalidad
0,25 % 0,00
0,5 % 2,78
0,75 % 1,96
1,0 % 2,00
1,25 % 97,22
1,5 % 90,00
1,75 % 100,00
2,0% 91,88
Total general 47,98
Tabla 7. Valores de modelo para el cálculo de DL 50
a 4,855
b 4,953
valor test 5,0
lc 0,02931
DL50 1,07
han reportado estudios sobre los cambios morfológicos de Schizotetranychus hindustanicus
muerto en por tratamiento acaricidas, sin embargo se resalta la característica interna respecto a la
coloración obtenida por cada tratamiento en este estudio.
a
.
b
.
¿
b
.
Figura 15. Schizotetranychus hindustanicus muertos con los tratamientos
(a) Abamectina (b) Nim Emulsificado (c) Kumulus
a. b.
c.
9. CONCLUSIONES
• Se verificó la morfología del ácaro Schizotetranychus hindustanicus que afecta las hojas
y frutos de Lima Tahit .
• Se logró establecer la cría in vitro e in vivo del Schizotetranychus hindustanicus, mediante
técnicas citadas en la literatura, la cual nos permitió aumentar la población para la
realización de los ensayos de los diferentes compuestos a evaluar, esto se evidenció
después de los 20 días de aplicada la técnica, por lo que se observó la sintomatología de la
enfermedad.
• La aplicación de extractos de Neen Emulsificado en el control de Schizotetranychus
hindustanicus puede ser implementado para reducir su población en cultivos de Limón
Tahití, comparado en igualdad de condiciones frente al azufre micronizado y la
abamectina, con valores de mortalidad del 82,98 al 93,30%
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11. ANEXOS
Statistix 8.0 KIKE_in vitro, 23/11/19, 20:44:34
Analysis of Variance Table for MORTAL
Source DF SS MS F P
TRAT 5 57696.3 11539.3 151.25 0.0000
Error TRAT*REP 12 915.5 76.3
TIME 2 2000.6 1000.3 24.49 0.0000
TRAT*TIME 10 1009.3 100.9 2.47 0.0338
Error TRAT*REP*TIME 24 980.3 40.8
Total 53 62602.1
Grand Mean 57.204
CV(TRAT*REP) 15.27
CV(TRAT*REP*TIME) 11.17
Statistix 8.0 KIKE_in vitro, 23/11/19, 20:45:53
LSD All-Pairwise Comparisons Test of MORTAL for TIME
TIME Mean Homogeneous Groups
72h 63.670 A
48h 58.892 B
24h 49.050 C
Alpha 0.05 Standard Error for Comparison 2.1304
Critical T Value 2.064 Critical Value for Comparison 4.3969
Error term used: TRAT*REP*TIME, 24 DF
All 3 means are significantly different from one another.
LSD All-Pairwise Comparisons Test of MORTAL for TRAT
TRAT Mean Homogeneous Groups
Avamectina 96.434 A
Kumulus 91.101 A
Neem_Emul 78.651 B
Ceniza 37.677 C
Neem_Comer 25.397 D
H2O 13.964 E
Alpha 0.05 Standard Error for Comparison 4.1176
Critical T Value 2.179 Critical Value for Comparison 8.9714
Error term used: TRAT*REP, 12 DF
There are 5 groups (A, B, etc.) in which the means
are not significantly different from one another.
Tukey
Statistix 8.0 KIKE_in vitro, 23/11/19, 20:46:15
Tukey HSD All-Pairwise Comparisons Test of MORTAL for TIME
TIME Mean Homogeneous Groups
72h 63.670 A
48h 58.892 A
24h 49.050 B
Alpha 0.05 Standard Error for Comparison 2.1304
Critical Q Value 3.533 Critical Value for Comparison 5.3214
Error term used: TRAT*REP*TIME, 24 DF
There are 2 groups (A and B) in which the means
are not significantly different from one another.
Tukey HSD All-Pairwise Comparisons Test of MORTAL for TRAT
TRAT Mean Homogeneous Groups
Avamectina 96.434 A
Kumulus 91.101 AB
Neem_Emul 78.651 B
Ceniza 37.677 C
Neem_Comer 25.397 CD
H2O 13.964 D
Alpha 0.05 Standard Error for Comparison 4.1176
Critical Q Value 4.751 Critical Value for Comparison 13.832
Error term used: TRAT*REP, 12 DF
There are 4 groups (A, B, etc.) in which the means
are not significantly different from one another.
.
EXPERIMENTO IN VIVO
Statistix 8.0 27/11/19, 19:57:25
Tukey HSD All-Pairwise Comparisons Test of MORTALIDA by TRATAMIEN
TRATAMIEN Mean Homogeneous Groups
ABAMECTINA 97.833 A
KUMULOS 94.433 A
NEEN EMULSI 86.000 A
AGUA 6.4667 B
Alpha 0.05 Standard Error for Comparison 4.2188
Critical Q Value 4.527 Critical Value for Comparison 13.505
There are 2 groups (A and B) in which the means
are not significantly different from one another.
