DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD HIPOGLUCEMIANTE DE …
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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD HIPOGLUCEMIANTE DE Polygonum aviculare l Y ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA DE Cuphea aequipetala Cav., Taxodium mucronatum Y Gentiana spathacea Kunth. PROYECTO DE INVESTIGACION PARA OBTENER EL TÍTULO DE INGENIERO BIOTECNOLOGO PRESETADO POR: ARRIAGA ARANA EMMA LAURA MONTERO MATÍAS EVA DANIELA DIRECTORA: Dr. YOLANDA DE LAS MERCEDES GÓMEZ Y GÓMEZ ASESORAS: QFB. MARÍA ESTHER RAMÍREZ BAUTISTA PROF. MARÍA GUADALUPE GONZÁLEZ MORGADO México D.F. 2015
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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD
HIPOGLUCEMIANTE DE Polygonum aviculare l Y
ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA DE Cuphea
aequipetala Cav., Taxodium mucronatum Y Gentiana
spathacea Kunth.
PROYECTO DE INVESTIGACION PARA OBTENER EL TÍTULO DE INGENIERO
BIOTECNOLOGO PRESETADO POR:
ARRIAGA ARANA EMMA LAURA
MONTERO MATÍAS EVA DANIELA
DIRECTORA:
Dr. YOLANDA DE LAS MERCEDES GÓMEZ Y GÓMEZ
ASESORAS:
QFB. MARÍA ESTHER RAMÍREZ BAUTISTA
PROF. MARÍA GUADALUPE GONZÁLEZ MORGADO
México D.F. 2015
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AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a nuestros padres por brindarnos siempre su apoyo y amor incondicional, a
lo largo de esta travesía, motivándonos y dándonos palabras de aliento para seguir
siempre adelante, por enseñarnos a nunca darnos por vencidos en ninguna situación y
ser capaces de cumplir todas las metas que nos propongamos.
A nuestros hermanos que siempre estuvieron apoyándonos y alentándonos, en cada
momento, dándonos consejos, enseñándonos y motivándonos, para seguir adelante,
desvelándose en ocasiones con nosotras.
A nuestras amigas por siempre compartir esfuerzos y apoyarnos para lograr el final de
esta travesía, por ser siempre un apoyo incondicional en todo momento, por todos los
momentos que pasamos juntas y todas aquellas anécdotas que atesoraremos por el resto
de nuestras vidas.
A la Doc. Yolanda Gómez y Gómez, por darnos la oportunidad de realizar este proyecto,
bajo su orientación y por dedicar su tiempo y paciencia en enseñarnos. Por infundirnos
ánimos y depositar su confianza para la realización de ese proyecto.
A las profesoras Esther Ramírez Bautista y Guadalupe González Morgado por el tiempo
que nos dedicaron, por sus consejos y paciencia.
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Contenido
Introducción ....................................................................................................................................... 8
Capacidad antioxidante ............................................................................................................. 10
Métodos para la determinación de la actividad antioxidante ............................................... 13
Método DPPH ......................................................................................................................... 13
Método ABTS .......................................................................................................................... 14
Actividad antiinflamatoria .......................................................................................................... 14
Actividad hipoglucemiante ........................................................................................................ 16
Generalidades de las especies utilizadas .................................................................................. 17
Justificación ..................................................................................................................................... 21
Objetivos .......................................................................................................................................... 22
Principal ....................................................................................................................................... 22
Particulares .............................................................................................................................. 22
Metodología ..................................................................................................................................... 23
Recolecta de las muestras. ....................................................................................................... 23
Análisis fitoquímico ..................................................................................................................... 23
La capacidad antioxidante ........................................................................................................ 23
Cuantificación de metabolitos (Fenoles, Taninos y Flavonoides) ..................................... 24
Pruebas in vivo ........................................................................................................................... 24
Desarrollo experimental ............................................................................................................. 25
Resultados ....................................................................................................................................... 34
Análisis fitoquímico. ................................................................................................................... 34
Cuantificación de Fenoles ......................................................................................................... 37
Cuantificación de flavonoides. ...................................................................................................... 38
Cuantificación de Taninos ......................................................................................................... 39
Capacidad antioxidante ............................................................................................................. 40
Actividad Hipoglucemiante ........................................................................................................ 43
Capacidad Antiinflamatoria. ...................................................................................................... 50
Discusión ......................................................................................................................................... 53
Conclusiones ................................................................................................................................... 56
Referencias ..................................................................................................................................... 57
Anexos ............................................................................................................................................. 59
5
Anexo A. Cuantificación de compuestos fenólicos. .............................................................. 59
Anexo B. Determinación de la capacidad antioxidante ........................................................ 60
Anexo C. Cálculos para las pruebas in vivo. .......................................................................... 62
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Índice de Tablas
Tabla 1. Clasificación de los antioxidantes según el sitio donde ejerce su acción. ............. 13
Tabla 2. Productos naturales hipoglucemiantes. ..................................................................... 17
Tabla 3. Metabolitos secundarios presentes (+) y ausentes (-), de ahuehuete, hierba del
hielo, hierba del cáncer y flor y hoja se sanguinaria. ................................................................ 34
Tabla 4. Metabolitos presentes (+) en los extractos con metanol (fracción polar y no polar)
de ahuehuete, hierba del hiela, hierba del cáncer y flor y hoja de sanguinaria. .................. 36
Tabla 5. Concentración de fenoles, presentes en los extractos con acetona de ahuehuete,
hierba del hielo, hierba del cáncer y flor y hoja de sanguinaria. ........................................... 37
Tabla 6. Concentración de flavonoides presentes en los extractos con acetona de
sanguinaria, hierba del helo y ahuehuete. .................................................................................. 39
Tabla 7. Concentración de taninos presentes en los extractos con acetona de ahuehuete,
hierba hiela, hoja de hierba del cáncer y flor y hoja de sanguinaria. ..................................... 40
Tabla 8. Capacidad antioxidante por el método ABTS presente en los extractos con
acetona y metanólicos (fracción polar y no polar) de ahuehuete, hierba del hielo, hierba
del cáncer y sanguinaria, la absorbancia del radical fue de 0.7333. ..................................... 41
Tabla 9.Capacidad antioxidante por el método DPPH presente en los extractos con
acetona y metanólicos (fracción polar y no polar) de ahuehuete, hierba del hielo, hierba
del cáncer y sanguinaria, la absorbancia del radical fue de 0.5366 ....................................... 42
Tabla 10. Niveles de glucosa al tiempo inicial y después de 3 horas con la infusión del
extracto metanólico de la hoja de sanguinaria, así como el porcentaje de disminución de
disminución del nivel de glucosa. El promedio del nivel de glucosa presenta ± desviación
estándar, .......................................................................................................................................... 43
Tabla 11. Niveles de glucosa al tiempo inicial y después de 3 horas, ± desviación
estándar de los promedios de los niveles de glucosa, con la infusión del extracto con
acetona de la hoja de sanguinaria, así como el porcentaje de disminución del nivel de
glucosa. ............................................................................................................................................ 44
Tabla 12. Niveles de glucosa al tiempo inicial y después de 3 horas con la infusión del
extracto con hexano de la hoja de sanguinaria, así como el porcentaje de disminución del
nivel de glucosa y ± desviación estándar de los promedios. ................................................... 45
Tabla 13. Nivel de glucosa inicial y después de 3 h de haber suministrado la infusión con
extracto metanólico de flor de sanguinaria, ± desviación estándar de los promedios de los
niveles de glucosa y su porcentaje de disminución. ................................................................. 46
Tabla 14. Niveles de glucosa inicial y final de los ratones tratados con la infusión de flor de
sanguinaria, extracto obtenido con acetona. Los promedios de los niveles de glucosa
presentan ± desviación estándar. ................................................................................................ 47
Tabla 15. Niveles de la concentración de glucosa inicial y después de tres horas de haber
suministrado el extracto con hexanos de flor de sanguinaria, los promedios presentan ±
desviación estándar. ...................................................................................................................... 48
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Índice de Figuras
Figura 1. Planta Sanguinaria, con hoja y flor. ............................................................................ 17
Figura 2. Hoja y flor de la planta hierba del cáncer. ................................................................. 18
Figura 3. Hojas de ahuehuete ...................................................................................................... 19
Figura 4. Fotografía de hoja y flor de Gentiana spathacea Kunth. ......................................... 20
Figura 5. Curva tipo para la cuantificación de fenoles totales, utilizando acido gálico como
control. .............................................................................................................................................. 37
Figura 6. Curva tipo, para el cálculo de la concentración de flavonoides, utilizando como
control, Rutina. ................................................................................................................................ 38
Figura 7. Curva tipo para la determinación de taninos, usando como control acido tánico 39
Figura 8. Curva tipo para la determinación de la capacidad antioxidante por el método
ABTS utilizando Trolox como referencia. ................................................................................... 40
Figura 9. Curva tipo para la determinación de la actividad antioxidante por el método
DPPH utilizando Trolox como referencia .................................................................................... 42
Figura 10. Concentración de glucosa en sangre inicial y después de tres horas de haber
suministrado el extracto metanólico a los sujetos de prueba. ................................................. 44
Figura 11. Niveles de glucosa inicial y final, de los ratones tratados con la infusión con
acetona, de la hoja de sanguinaria. ............................................................................................. 44
Figura 12. Niveles de glucosa inicial y final, de los ratones tratados con la infusión con
hexano, de la hoja de sanguinaria. .............................................................................................. 45
Figura 13. Porcentaje de disminución de mg/dL de glucosa en sangre, por las infusiones,
con los extractos de metanol, acetona y hexanos de hoja de sanguinaria. .......................... 46
Figura 14. Disminución del nivel de glucosa en sangre de los ratones, dosificados con la
infusión del extracto metanólico. .................................................................................................. 47
Figura 15. Disminución del nivel de glucosa en sangre de los ratones, dosificados con la
infusión del extracto con acetona. ............................................................................................... 48
Figura 16.Nivel de glucosa inicial y después de suministrar la infusión de flor de
sanguinaria, extracto obtenido con hexanos .............................................................................. 49
Figura 17, Porcentajes des nivel de glucosa, con las infusiones de la flor de sanguinaria.49
Figura 18. % de inhibición de la hierba del cáncer con los extractos de hexanos, acetona y
metanol, y del fármaco, en la prueba antiinflamatoria. Los valores presentan ± desviación
estándar. .......................................................................................................................................... 50
Figura 19. % de inhibición de los extractos (con diferentes solventes, metanol, acetona y
hexanos) de la hierba del hielo, presentan ± desviación estándar 2n, comparado con el
fármaco. ........................................................................................................................................... 50
Figura 20. % de inflamación de la hierba del hielo, hierba del cáncer, control y fármaco .. 51
Figura 21. % de inhibición de la hierba del hielo, hierba del cáncer y fármaco. .................. 51
Figura 22. %de inflamación de la hierba del hielo, ahuehuete, fármaco y control ............... 52
Figura 23. % de inhibición de la hierba del hielo, ahuehuete y fármaco ............................... 52
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Introducción
La utilidad medicinal de las plantas tiene su origen desde el inicio de la historia del ser
humano sobre la tierra que, en íntimo contacto con la naturaleza, se fue desarrollando con
la imitación de las costumbres de otros animales y con la experiencia acumulada tras la
ingestión accidental o voluntaria de algunas especies. En el mundo se conoce la
existencia de herbarios desde la época de los asirios, los babilonios, los fenicios y los
sumerios.
El famoso papiro de Ebers, año 1700 a.C., cita aproximadamente 700 plantas utilizadas
con fines medicinales, entre ellas el ajo, que se daba a los esclavos que construían las
pirámides para preservarlos de las enfermedades; el sen, el comino y el tomillo para el
sistema digestivo; el ajenjo o incienso para los parásitos intestinales; la cebolla, el aloe, el
azafrán, la hierbabuena, la marihuana, la amapola o adormidera, etc.etc.
Unido al mejor conocimiento de las plantas medicinales y su mecanismo de acción, al
desarrollo de nuevas formas de preparación y uso de las plantas medicinales: en líquido,
capsulas, comprimidos, etc.; ha derivado en un aumento increíble del consumo de este
recurso terapéutico en las últimas décadas, por un consumidor cada vez mejor informado
y responsable sabedor de la eficacia y menores efectos secundarios de las plantas
medicinales frente a los medicamentos de síntesis química. (Cruz, 2007).
Metabolitos secundarios en las plantas
El metabolismo secundario se puede definir como la biosíntesis, la transformación y la
degradación de los compuestos endógenos mediante proteínas de especialización, las
cuales se han formado como resultado de los procesos de diferenciación y se clasifican
según su significado biológico y función en la célula productora (Valdés y Balbín, 2000).
Según la definición en el marco ecológico propuesta por Stransburger, Noll, Schenk y
Schimper (1994), estos compuestos son sustancias ecológicamente eficaces, frente a
compuestos primarios que serian sustancias fisiológicamente eficaces.
El término secundario implicaba, al principio de las investigaciones, que estas sustancias
tenían una menor importancia y muchas veces se les atribuyó la propiedad de productos
de desecho del metabolismo primario. Esta idea ha sido gradualmente cambiada, ya que
los compuestos secundarios desempeñan un papel protagónico en la fisiología de la
planta, la regulación de crecimiento, su desarrollo y la interacción con otros organismos
(Raskin, 1992), por lo que a partir de 1960 se han realizado investigaciones que han
hecho evidente la importante función ecológica de muchos de ellos (Valdés y Balbín,
2000).
Una de las principales diferencias que presentan los metabolitos secundarios con relación
a los primarios es su distribución limitada en el reino vegetal; mientras que los
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compuestos primarios se encuentran en todo el reino y las diferencias entre especies solo
son de índole cuantitativa (Ramos, Frutos, Giráldes y Mantecón, 1998).
Estos compuestos químicos se presentan típicamente en solo una especie o un grupo de
plantas taxonómicamente relacionadas (Grabiela-Anca, Dean y Wiley, 1997), por lo que
muchos de ellos se consideran marcadores taxonómicos de familias y géneros
(Garbaarino, 2003)
Principales metabolitos secundarios
Alcaloides
Los alcaloides son una gran familia de más de 15,000 metabolitos secundarios que tienen
en común tres características: son solubles en agua, contienen al menos un átomo de
nitrógeno en la molécula, y exhiben actividad biológica. En humanos, los alcaloides
generan respuestas fisiológicas y psicológicas, la mayoría de ellas por consecuencia de
su interacción con neurotransmisores. A dosis altas, casi todos los alcaloides son muy
tóxicos, sin embargo, a dosis bajas tienen un alto valor terapéutico como relajante
muscular, tranquilizante, antitusivos o analgésicos.
Compuestos fenólicos
Los compuestos fenólicos, también llamados fenoles o polifenoles vegetales, son
sustancias que poseen al menos un anillo aromático con un radical hidroxilo sustituyente
en su estructura química, el cual es llamado grupo fenólico. El fenol se encuentra como un
producto natural en el reino vegetal, pero es más común que los compuestos fenólicos
tengan dos o más grupos hidroxilo.
De todos los metabolitos secundarios los polifenoles son los más ampliamente
distribuidos dentro del reino vegetal (Harborne, 1973) y quizá los más diversos. La
diversidad de los fenoles vegetales se ve reflejada en la clasificación que de ellos hace
Harborne (1989).
Desde el punto de vista de la estructura química, son un grupo muy diverso que
comprende desde moléculas sencillas como los ácidos fenólicos hasta polímeros
complejos como los taninos y la lignina. En el grupo también se encuentran pigmentos
flavonoides.
Glicósidos
Su nombre hace referencia al enlace glicosídico que se forma cuando una molécula de
azúcar se condensa con otra que contiene un grupo hidroxilo. Existen tres grupos de
glicósidos de particular interés: saponinas, glicósidos cardiacos y glicósidos cianógenos.
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Las saponinas se encuentran como glicósidos esteroideos y se pueden presentar como
agliconas. La adición de un grupo hidrofilico a un terpenoide hidrofóbico da lugar a las
propiedades surfactantes o detergentes similares al jabón que presentan las saponinas.
Los glicósidos cardiacos también llamados cardenólidos, son semejantes a las saponinas
esteroideas, presentan propiedades detergentes, pero su estructura contiene una lactona.
Se encuentran de forma natural en forma de glicósidos o de agliconas, quizá el más
conocido sea la digitoxina aislada de Digitalis purpurea y utilizada como medicamento en
el tratamiento de la insuficiencia cardiaca congestiva.
Los glicósidos cianógenos son compuestos nitrogenados, que no son tóxicos por si
mismos pero se degradan cuando la planta es aplastada liberando sustancias volátiles
tóxicas como cianuro de hidrógeno (HCN). Un ejemplo es la amigdalina que se encuentra
en las semillas de almendra, albaricoque, cereza o melocotón.
Terpenos
Los terpenos o terpenoides, constituyen el grupo más numeroso de metabolitos
secundarios (más de 40000 moléculas diferentes). La ruta biosintética de estos
compuestos da lugar tanto a metabolitos primarios como secundarios, de gran
importancia para el crecimiento y supervivencia de las plantas, suelen ser insolubles y
derivan de la unión de unidades de isopreno (5 átomos de C).
El grupo de los terpenos, incluye hormonas (giberelinas y ácido abscísico), pigmentos
carotenoides β-carotenos y xantofilas), derivados de los esteroles (glicósidos cardiacos).
Muchos terpenoides son comercialmente interesantes por su uso; como aromas y
fragancias, o por su importancia en la calidad de productos agrícolas. Otros compuestos
tienen importancia medicinal por sus propiedades anticarcinógenas, antiulcerosas,
antimicrobianas, etc.
Capacidad antioxidante
Radicales libres
Los radicales libres son átomos o grupos de átomos que tienen un electrón desapareado
o libre, por lo que son muy reactivos ya que tienden a captar un electrón de moléculas
estables con el fin de alcanzar la estabilidad electroquímica. Una vez que el radical libre
ha conseguido sustraer un electrón que necesita, la molécula estable que se lo cede se
convierte a su vez en un radical libre por quedar con un electrón desapareado, iniciándose
a su vez una verdadera reacción en cadena que destruye nuestras células. La vida media
biológica de radical libre es de microsegundos, pero tiene la capacidad de reaccionar con
todo lo que esté a su alrededor provocando un gran daño a moléculas, membranas
celulares y tejidos. Los radicales libres no son intrínsecamente deletéreos; de hecho,
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nuestro propio cuerpo los produce en cantidades moderadas para luchar contra bacterias
y virus.
Los radicales libres de oxigeno causan daño oxidativo y este se ha visto implicado en la
etiología o patología de más de cien enfermedades diferentes, entre las que se
encuentran distintos tipos de cáncer, enfermedades cardiacas y vasculares, diabetes y
desórdenes neurodegenerativos.
Los radicales libres se producen continuamente en el organismo por medio de reacciones
bioquímicas de oxidación-reducción con oxigeno (REDOX), que tienen lugar por el
metabolismo normal de las células, por los fagocitos, en una reacción inflamatoria
controlada y también en ocasiones, como respuesta a la exposición de radiaciones
ionizantes, rayos ultravioletas, contaminación ambiental, humo de cigarrillos, hiperoxia y
exceso de ejercicio e isquemia.
Los radicales inestables atacan componentes celulares causando daño sobre los lípidos,
proteínas y ADN, los cuales pueden iniciar una cadena de eventos que dan como
resultado lesión celular. Estos procesos reductivos con acelerados por la presencia de
metales de transición como el Fe y el Cu y enzimas especificas como la monoxigenasas y
ciertas oxidasas.
Estrés oxidativo
Especies reactivas del oxigeno (ERO) es el termino que se aplica colectivamente a las
moléculas radicales y no radicales que son agentes oxidantes y/o son fácilmente
convertidos a radicales. En la última década se han acumulado evidencias que permiten
afirmar que los radicales libres y el conjunto de especies reactivas que se les asocia
juegan un papel central en nuestro equilibrio homeostático, que es el normal
funcionamiento de los mecanismos de regulación que conservan en estado normal
fisiológico de los organismos. En mamíferos son muchos los procesos fisiopatológicos
causados por estas especies tales como los mecanismos patogénicos asociados a virus,
bacterias, parásitos y células anormales, constituyendo un mecanismo de defensa del
organismo frente a estos agresores. Cuando el aumento del contenido intracelular de
ERO sobrepasa las defensas antioxidantes de la célula se produce estrés oxidativo a
través del cual se induce daño a moléculas biológicas como lípidos, proteínas y ácidos
nucléicos. El estrés oxidativo se presenta en diversos estados patológicos en los cuales
se altera la funcionalidad celular, contribuyendo o retroalimentando el desarrollo de
enfermedades degenerativas como la aterosclerosis, cardiomiopatías, enfermedades
neurológicas y cáncer (Gutteridge y Halliwell, 1999).
El daño o estrés oxidativo se ha definido como la exposición de la materia viva a diversas
fuentes que producen una ruptura del equilibrio que debe existir entre las sustancias o
factores prooxidantes y los mecanismos antioxidantes encargados de eliminar dichas
especies químicas, ya sea por un déficit de estas defensas o por un incremento
exagerado de la producción de ERO. Todo esto trae como consecuencia alteraciones de
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la relación estructura-función en cualquier órgano, sistema o grupo celular especializado;
por lo tanto se reconoce como mecanismo general de daño celular, asociado con la
fisiopatología primaria o la evolución de un número creciente de entidades y síndromes de
interés medico-social, involucrado en la génesis y en las consecuencias de dichos
eventos.
El daño oxidativo es un término usado con frecuencia para implicar daños al azar,
indiscriminados a una amplia gama de biomoléculas. Sin embargo, los objetivos a
menudo aparecen sorprendentemente específicos, por lo tanto en la enfermedad de
Parkinson, el daño en el incremento en el ADN oxidativo solo afecta a la guanina. En las
células sometidas al estrés oxidativo, técnicas proteómicas revelan que a menudo solo un
pequeño número de proteínas está dañado, aunque los mecanismos de esta selectividad
permanecen indeterminados en la mayoría de los casos.
Antioxidantes
El sistema de defensa antioxidante está constituido por un grupo de sustancias que al
estar presentes en concentraciones bajas con respecto al sustrato oxidable, retrasan o
previenen significativamente la oxidación de este. Como sustrato oxidable se puede
considerar casi todas las moléculas organizas o inorgánicas que se encuentran en las
células vivas, como proteínas, lípidos, hidratos de carbono y las moléculas de ADN. Los
antioxidantes impiden que otras moléculas se unan al oxigeno, al reaccionar-interactuar
más rápido con los radicales libres del oxigeno y las especies reactivas del oxigeno que
con el resto de las moléculas presentes, en un determinado microambiente-membrana
plasmática, citosol, núcleo o liquido extracelular. La acción de antioxidante es de sacrificio
de su propia integridad molecular para evitar alteraciones de moléculas-lípidos, proteínas,
ADN, etc.
La capacidad antioxidante celular está dada por mecanismos a través de los cuales la
célula anula la reactividad y/o inhibe la generación de radicales libres (Thornalley y Vasak,
1985; Greenwald, 1990; Palamanda y Kehrer, 1992). Estos mecanismos son adecuados a
la muy corta vida media de los radicales libres y comprenden moléculas pequeñas,
andógenas y exógenas con capacidad antioxidante. Los antioxidantes exógenos
provienen de la dieta, y dentro de este grupo se incluyen la vitamina E, la vitamina C y los
carotenoides. La vitamina C constituye el antioxidante hidrosoluble más abundante en la
sangre, mientras que la vitamina E es el antioxidante lipofilico mayoritario. Los
carotenoides son compuestos coloreados tales como los betacarotenos, presentes en
verduras y frutas amarillas y anaranjadas, y en verduras verdes oscuras, los alfacarotenos
en la zanahoria, los licopenos en el tomate, las luteínas y xantinas en verdura de hojas
verdes como el bbrócoli y las beta criptoxantinas en frutas cítricas.
Recientemente se han descubierto en algunos alimentos otros antioxidantes no
nutrientes, los compuestos fenolicos. Algunas fuentes con los frijoles (isoflavonas), cítricos
(flavonoides) y cebolla (quercetina). Tambien se ha encontrado algunos antioxidantes
fenolicos en el café, vino tinto y té. Por esta razón, la forma de suplir los antioxidantes
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para proteger al organismo del efecto oxidativo producido por los radicales libres es el
concumo de alimentos ricos en vitamina E, vitamina C, carotenoides y otras sustancias
que tienen función antioxidante, tales como compuestos fenólicos.
Tabla 1. Clasificación de los antioxidantes según el sitio donde ejerce su acción.
Intracelular Membrana Extracelular
Superóxido dismutasa Vitamina E Ceruloplasmina
Catalasa Betacarotenos Transferinas
Peroxidasa Ubiquinol-10 Lactoferinas
DT-deafarasa Albuminas
GSH Heptoglobinas
Proteinas que ligan metales Vitamina C
Sistemas proteolíticos Ácido úrico
Vitamina C Vitamina E
Métodos para la determinación de la actividad antioxidante
Alternativamente, diversos compuestos cromógenos (ABTS, DPPH, DMPD, DMPO y
FRAP) son utilizados para determinar la capacidad de los compuestos fenólicos para
captar los radicales libres generados, operando así en contra de los efectos perjudiciales
de los procesos de oxidación, que implican a especies reactivas de oxígeno (EROS)
(ARNOUS, A., et. al., 2002, ANTOLOVICH, M., 2002, Re. R, 1999 et. al.)
Los métodos más aplicados son ABTS y DPPH Ambos presentan una excelente
estabilidad en ciertas condiciones, aunque también muestran diferencias. Con el ABTS se
puede medir la actividad de compuestos de naturaleza hidrofílica y lipofílica, mientras que
el DPPH solo puede disolverse en medio orgánico. (ARNAO, M.B., 2000, ANTOLOVICH,
M., 2002).
Método DPPH
Para evaluar actividad antioxidante se recure a diferentes métodos, siendo uno de ellos el
método DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo), el cual determina actividades de captura de
material radicalario, en presencia de una sustancia antioxidante, midiendo el potencial de
inactivación de dicho radical en medio acuoso (Hseu y col., 2008).
La molécula 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH) es conocida como un radical libre estable
debido a la deslocalización de un electrón desapareado sobre la molécula completa, por
lo cual la molécula no se dimeriza, como es el caso de la mayoría de los radicales libres.
La deslocalización del electrón también intensifica el color violeta intenso típico del radical,
el cual absorbe en metanol a 517 nm. Cuando la solución de DPPH reacciona con el
sustrato antioxidante que puede donar un átomo de hidrógeno como se muestra en la
figura 8, el color violeta se desvanece. El cambio de color es monitoreado
espectrofotométricamente y es utilizado para la determinación de los parámetros para las
propiedades antioxidantes.
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Método ABTS
La generación del radical ABTS●+ constituye la base de uno de los métodos
espectrométricos que han sido aplicados para medir la actividad antioxidante total de
soluciones o sustancias puras y mezclas acuosas. El ensayo original de ABTS●+ estaba
basado en la activación de la metilmioglobina con peróxido de hidrógeno en presencia de
ABTS para producir un radical catión, en presencia o ausencia de antioxidantes. Este fue
criticado debido a que la reacción rápida de los antioxidantes, contribuye a la reducción
del radical ferrilmioglobina. Un formato más apropiado para el ensayo consiste en la
técnica de decoloración, en la cual el radical es generado directamente en una forma
estable antes de la reacción con los antioxidantes (Re et al., 1999).
La técnica mejorada para la generación del radical catión ABTS●+, implica la producción
directa del cromóforo ABTS●+ verde-azul a través de la reacción entre ABTS y el
persulfato de potasio (K2S2O8). Este presenta tres máximos de absorción a las
longitudes de onda de 645 nm, 734 nm y 815 nm. La adición de los antioxidantes al
radical pre-formado lo reduce a ABTS. De esta manera el grado de decoloración como
porcentaje de inhibición del radical catión ABTS●+ está determinado en función de la
estándar, bajo las mismas condiciones.
Actividad antiinflamatoria
La actividad antiinflamatoria ha despertado en los últimos años un gran interés científico
en el área farmacológica, principalmente en virtud de la capacidad potencias de ciertos
compuestos de interferís en la evolución de enfermedades que cursan con procesos
inflamatorios. La inflamación fue descrita por Celsus en el año 10 a.C. como
enrojecimiento e hinchazón con calor y dolos (rubor et tumor cum et dolore). El proceso
inflamatorio involucra una serie de eventos inespecíficos que pueden ser provocados por
numerosos estímulos o agresiones del medio (ej.: agentes biológicos, isquemia,
interacciones antígeno-anticuerpo, traumatismo, lesiones térmicas o fisicoquímicas de
otras índoles, etc.). Cada tipo de estimulo provoca una respuesta característica que
constituye una variante relativamente menor del mismo fenómeno. A nivel macroscópico,
la respuesta está usualmente acompañada por conocidos signos clínicos como
tumefacción (edema), rubor, calor, dolor espontáneo a la palpitación y desorden de la
función tisular. La respuesta inflamatoria ocurre en tres fases distintas, cada una mediada
aparentemente por diferentes mecanismos:
(1) Una fase transitoria aguda, caracterizada por vasodilatación local, hiperemia activa e
incremento en la permeabilidad capilar.
(2) Una fase subaguda tardía, visiblemente caracterizada por un periodo de hiperemia
pasiva, infiltración de leucocitos y fagocitos.
(3) una fase proliferativa crónica, en la cual ocurre degeneración de tejidos, lesión
endotelial y fibrosis (Fridovich, 1997).
La inflamación es un mecanismo fisiopatológico básico, la magnitud de la respuesta
inflamatoria es crucial pues una respuesta inflamatoria insuficiente resulta en
15
inmunodeficiencia, lo cual puede conducir desde una infección hasta cáncer. Por otro lado
una excesiva respuesta inflamatoria causa morbilidad y mortalidad en enfermedades tales
como, arteriosclerosis, tromboembolismo, enfermedad arterial coronaria, cerebral y
periférica, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), la enfermedad de
Crohn, colitis ulcerosa, peritonitis, esclerosis múltiple y artritis reumatoide, entre otras
(Nathan, 1987). En los últimos años ha sido creciente la cantidad de publicaciones e
investigaciones alrededor de la comprensión de los mecanismos y de las moléculas
involucradas en el proceso inflamatorio. El desarrollo de la biología molecular ha permitido
estudiar numerosas enzimas y mediadores involucrados en el Proceso, midiendo la
expresión o evaluando las señales bioquímicas y fisiológicas que se activan en respuesta
a un estímulo específico. En el proceso global intervienen muchos mecanismos, algunos
mediados por una variedad de moléculas de señalización, además de la activación de los
factores de complemento (Nathan, 2002).
Los mediadores pertenecen a diferentes clases químicas, tales como aminas biógenas
(histamina, serotonina), proteínas y péptidos (enzimas hidrolíticas, citoquinas, factores de
crecimiento, factores activadores de colonia, factores de complemento, anticuerpos,
quininas), especies reactivas de oxígeno (ROS, anión superóxido, hidroperóxido,
radicales hidroxilos), y lípidos (factores activadores de plaquetas, prostanoides,
leucotrienos). Estos mediadores inician, mantienen, agravan y modulan el curso de un
gran número de enfermedades humanas. Además de un enorme número de mediadores
proinflamatorios, la complejidad de tales procesos son incrementados adicionalmente por
la participación de mecanismos antiflogísticos e inmunomodulatorios (ej. la liberación de
esteroides antiinflamatorios e inmunosupresivos de la corteza adrenal) y por el hecho que
entre una clase de mediadores algunos miembros podrían actuar de forma
antiinflamatoria: ej. el ácido 15-Rhidroxieicosatetraenóico (15(R)-HETE) y lipoxinas de los
productos de la cascada del ácido araquidónico o la interleukina-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-4,
IL-10, IL-12 e IL-13 de la familia de citoquinas, las cuales ejercen acciones pro y
antiiflamatorias dependiendo de su participación en la respuesta inmunoespecífica
(Gilmore, 2006; Safayhi and Sailer, 1997).
La habilidad para desencadenar una reacción inflamatoria es esencial para la
supervivencia de los organismos, dado los innumerables agentes patógenos y lesivos
ambientales existentes, aunque en algunas situaciones y enfermedades tal reacción
puede llegar a ser exagerada y sin un aparente beneficio para el organismo (Goodman et
al., 2001; Smith et al., 1996). El entendimiento de cómo el proceso inflamatorio es
activado y como es contenido son elementos claves para desarrollar estrategias para
bloquear o reducir la respuesta inflamatoria. Ahora bien, dentro del contexto de los
productos naturales antiinflamatorios, la medicina tradicional se ha utilizado para tratar y
cuidar a pacientes con enfermedades que conllevan a procesos inflamatorios. En este
sentido, la medicina tradicional en la actualidad, es ampliamente usada en el mundo; por
ejemplo, en África su uso está por encima de 80%, Gómez et al Actividad Antiinflamatoria
de Productos Naturales Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y
Aromáticas/187 en China alrededor del 40%, mientras que en Asia y América Latina, las
poblaciones continúan usando la medicina tradicional, como resultado de circunstancias
16
históricas y creencias culturales, incluso muchos países desarrollados utilizan más que la
medicina tradicional, la medicina complementaria y alternativa así: 75% en Francia, 70%
en Canadá, 48% en Australia, 42% en USA y 38% en Bélgica (OMS, 2002).
Actividad hipoglucemiante
Cuando las células beta (en los islotes de Langerhans del páncreas) no producen insulina,
se origina la diabetes Mellitus insilodependiente (DMID) o tipo I; en tanto que si los
receptores de insulina de las células del cuerpo no funcionan, se genera la diabetes
mellitus no insulodependiente (DMNID) o tipo II. En cualquier caso, la glucosa no puede
penetrar en las células del cuerpo y utilizarse eficazmente; se produce entonces un
desbañance entre la elaboración de especies reactivas de oxigeno (EROS) y la capacidad
de defensa antioxidante del cuerpo; desbalance conocido como estrés oxidativo (Halliwell,
1992).
Esto ocasiona, a su vez, degeneración de las paredes celulares y de los vasos
sanguíneos, daños en la retina, deterioro renal, aterosclerosis, afecciones en el sistema
nervioso central e incluso multiples alteraciones repsoductivas (Gulcin, 2002).
Según la base de datos NAPRALERT se conocen aproximadamente 1200 especies
vegetales (incluyendo algas marinas y hongos), pertenecientes a 725 géneros y 183
familias, utilizadas popularmente en el tratamiento de la diabetes. De ellas casi la mitas se
emplea por sus propiedades hipoglucemiantes en la medicina tradicional y
aproximadamente un 50% de estos tratamientos naturales han sido sometidos a algún
tipo de estudio experimenta (Marles, 1995).
Para entender como los componentes de las plantas pueden ser hipoglucemiantes en
animales, vale la pena tener en cuenta las razones por las cuales se producen
compuestos con actividad hipoglucemiante en las plantas. En general, las discusiones de
los agentes medicinales de las plantas se centran en los metabolitos secundarios, es
decir, constituyentes no ubicuos con ningún papel esencial conocido en el metabolismo de
la planta (Marles, 1995).
La mayoría de los componentes hipoglucemiantes de las plantas como los alcaloides,
podrían encajar en esta categoría, pero hay otros componentes de las plantas para los
que esta explicación no es del todo satisfactoria. En los niveles celulares y moleculares,
las plantas y los animales no son muy diferentes en sus procesos metabólicos. La glucosa
es la fuente de energía metabólica y más importante precursor biosintético en las plantas,
por lo que la glucosa se somete a almacenamiento y movilización bajo control hormonal
en plantas como en animales. Reguladores de crecimiento en plantas tales como el ácido-
indol-3-acético y análogos naturales sintéticos tales como indol-3-butírico, ácido-indol-3-
propiónico, L-triptófano y ácido p-clorofenoxiacético inhiben insulinasa in vitro a in vivo son
hipoglucémicos en ratas (Mirsky et.al. 1956).
Hay más de 200 compuestos puros de origen vegetal reportados para mostrar actividad
hipoglucemiante. La tabla proporciona un resumen de las clases químicas de estos
compuestos, la amplia variedad de clases químicas indica que una variedad de
17
mecanismos deben estar involucrados en la disminución del nivel de glucosa en sangre.
Algunos de estos compuestos pueden tener un potencial terapéutico, mientras que otros
pueden producir hipoglucemia como un efecto secundario de su toxicidad, especialmente
hepatoxicidad.
Tabla 2. Productos naturales hipoglucemiantes.
Clase química Número activo Clase química Número activo
Alcaloides 38 Péptidos y aminas 15
Carbohidratos 66 Esteroides 7
Cumarinas 4 Terpenoides 17
Glucósidos cianógenos 1 Vitaminas 2
Flavonoides 7 Fenoles 4
Glicopéptidos 20 Fenolpropanoides 1
Sales inorgánicas 3 Compuestos de azufre 2
Lipidos 6 Estilbenos 1
Irinoides 4 Xantenos 1
Generalidades de las especies utilizadas
Sanguinaria (polygonum aviculare l)
ReinoVi: Plantae
Subreino: Traqueobionta (plantas
vasculares)
Superdivisión: Spermatophyta
(plantas con semilla)
División: Magnoliophyta (plantas
con flor)
Clase: Magnoliopsida
(dicotiledóneas)
Subclase: Caryophyllidae
Orden: Polygonales
Descripción técnica (Rzedowski y Rzedowski, 2001)
Hábito y forma de vida: Hierba anual, extendida ascendente. Planta sin pelos.
Tamaño: De 20 a 40 cm, pero a veces hasta de 1 m de largo.
Tallo: Delgado, con rayas longitudinales, rastrero o ascendente, con frecuencia
muy ramificado; ócreas membranosas, hialinas, partidas en forma irregular, unidas
a los cortos pecíolos que están unidos con las láminas.
Hojas: Con láminas lanceoladas o casi oblongas, de 1 a 4 cm de largo por 0.3 a 1
cm de ancho, generalmente agudas tanto en el ápice como en la base.
Figura 1. Planta Sanguinaria, con hoja y flor.
18
Inflorescencia: Flores axilares, solitarias o agrupadas en fascículos hasta de 6
flores cortamente pediceladas.
Flores: Brácteas en forma de embudo, bifurcadas o partidas en forma irregular en
la punta, perianto de 2 a 3 mm de largo, verde con los bordes blancos o rojizos, de
5 divisiones unidas en la base; estambres generalmente 8, no sobrepasan el
perianto.
Químicamente se ha demostrado que en las hojas de la sanguinaria se encuentran los
siguientes flavonoides: camferol, ramnósido de mircetin, quercetin y su ramnósido, así
como el componente fenílico ácido gálico. Además, se ha observado que en la planta
completa se detecta el flavonoide avicularin (Argueta et al. 1994).
Las características más comunes que presenta esta planta son: refrescante, astringente,
diurética, vulneraria, antihemorrágica, depurativa, hipotensora, hipoglucemiante y
antipérica. Se utiliza en afecciones renales y para lavar rozaduras; para la gastritis, la
colitis y para disminuir de peso; se usa en el reumatismo y enfermedades del aparato
respiratorio; y se ha demostrado que tiene actividad antineoplástica en animales con
cáncer experimental.
Se tienen registros de su producción en Baja California Norte, Chihuahua, Coahuila,
Distrito Federal, Durango, Hidalgo, Estado de México, Michoacán, Morelos, Nuevo León,
Puebla, Querétaro, Sinaloa, Sonora, Tlaxcala, Veracruz (Villaseñor y Espinosa, 1998).
Hierba del cáncer (Cuphea aequipetala Cav.)
Reino: Plantae
Subreino: Traqueobionta (plantas
vasculares)
Superdivision: Spermatophyta (plantas con
semillas)
División: Magnoliophyta (plantas con flor)
Clase: Magnoliopsida (dicotiledóneas)
Subclase: Rosidae
Orden: Myrtales.
Descripción técnica (Graham, 1988, 1991 y 1994; Rzedowski y Rzedowski, 2001 y 2004)
Hábito y forma de vida: Hierba grande, a veces algo leñosa hacia la base, a veces
con pelos rígidos combinados con otros largos y muy entrecruzados.
Figura 2. Hoja y flor de la planta hierba del cáncer.
19
Tamaño: De hasta 1m de largo, aunque generalmente más corta.
Tallo: Casi siempre ramificado, teniendo en el suelo pero con las puntas
ascendentes o bien erecto, color rojo oscuro o morado, generalmente provisto de
diferentes tipos de pelos color violeta o rojizo y con 2 hileras de diminutos pelos
blanquecinos a lo largo.
Hojas: Opuestas, sésiles o sobre pecíolos muy cortos, ovadas o angostas, de
hasta 3 cm de largo, a veces con pelos erectos.
Inflorescencia: Las flores solitarias sobre cortos pedicelos de hasta 6 mm de largo,
ubicadas entre el par de hojas opuestas. Dos diminutas bractéolas puntiagudas se
encuentran en la base de cada flor.
Flores: Tienen una estructura que se llama hipantio (estructura formada por la
fusión del cáliz y las partes interiores de la flor, es como un tubo por debajo de los
pétalos) de 13 a 17 mm de largo, a veces más angosto en su parte media, de base
redondeada, externamente es verde teñido de púrpura, con pelos color púrpura
algo erectos sobre las costillas, en la parte interna, por debajo de los estambres, la
superficie es rugosa con pequeñas vesículas, ápice con 6 lóbulos, uno más largo y
a veces cóncavo, entre los lóbulos se presentan unos apéndices engrosados que
tienen algunos pelos. Pétalos 6, color violeta intenso o rosa-púrpura, 2 de ellos de
color más oscuro y ligeramente más largos que los demás, de 3 a 8 mm de largo.
Estambres 11, desiguales, con pelos.
Frutos y semillas: El fruto es una cápsula. Semillas aproximadamente 8 a 14,
frecuentemente 5, casi globosas, de aproximadamente 2 mm de largo.
Raíz: Generalmente gruesa y leñosa.
La hierba del cáncer (C. aequipetala) es una planta medicinal originaria de México y de la
que se indican usos medicinales desde la época prehispánica. Desde entonces se
describe la aplicación en casos de ulceras de la boca y quemaduras.
Ahuehuete (Taxodium mucronatum)
Sinonimia popular:Sabino.
Sinonimia botánica: Taxodium montezumae
Decne.; Taxodium mexicanum Can.
Botánica y ecología.: Árbol de 20 a 30 m de
altura con la corteza de color rojiza oscuro,
follaje verde brillante, penduloso y laxo. Las
hojas son como hilos. Tienen frutos cónicos
esponjosos, de color verde azuloso, y que
al madurar tiran numerosas semillas.
Originario de México. Habita en climas cálido,
semicálido y templado, entre los 100 y los 1800msnm. Planta silvestre, asociada a bosque
tropical caducifolio, matorral xerófilo, pastizal; bosques de encino y de pino.
Figura 3. Hojas de ahuehuete
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Se recomienda usar esta planta cuando se padece diarrea; se toma el cocimiento
preparado con las hojas y el tallo, aunque también se recomienda, para el mismo fin,
ocupar la corteza, madera, frutos y alquitrán. Asimismo, se hace referencia de su uso en
el tratamiento de llagas con el cocimiento de la corteza, hojas, frutos y renuevos. Se
aconseja ingerir este cocimiento en ayunas por tres días consecutivos, suspendiéndolo
por otros tres días y así sucesivamente, cuando hay problemas circulatorios.
Otros padecimientos en los cuales se aplican sus usos medicinales son: hemorroides,
hidropesía, presión arterial, trastornos menstruales, várices, contra enfermedades de la
piel y afecciones cardiacas. Además se le utiliza como tónico. (Biblioteca Digital de la
Medicina Tradicional Mexicana, 2009).
Hierba del Hielo (Gentiana spathacea Kunth)
Sinonimia popular: Flor del cielo raso del monte.
Estado de México: juanilipili.
Morelos: yelhuetecapahtli.
Botánica y ecología.: Hierba erguida de 40cm a 1m de
altura. Las hojas son ovaladas y puntiagudas,
pegadas al tallo. Las flores son azules o azul morado,
de 2 a 2.5cm de largo y son como campanitas; con
frecuencia nacen solitarias o pueden estar agrupadas
en conjuntos terminales de las ramas. Los frutos son
cápsulas algo aplastadas y tienen muchas semillitas
con alas. Originaria de México. Presente en clima
templado a los 2000msnm. Asociada a terrenos de cultivo,
pastizal, bosques de encino y de pino.
Etnobotánica y antropología.: El principal uso medicinal que recibe esta planta es para
resolver problemas respiratorios. Contra la bronquitis, se emplea la raíz macerada con
alcohol, se pone sobre el pecho del niño las veces que sean necesarias, haciendo sólo
una aplicación por noche. Para la tos se utilizan las ramas hervidas junto con cáscara de
chirimoya china (Annona sp.), hierba de la víbora (Dalea minutifolia), flor
de bugambilia (sp. n/r), lechuguilla (Agave lecheguilla) y flor de trompetilla (Bouvardia
ternifolia); esta cocción se toma en ayunas. Para la alferecía (niños con síntomas de
amarillamiento de la piel y con sueño, parasitados y anémicos), así como para el hipo, se
hace una cocción de la raíz de la cual se toma una taza durante 5 días. También se indica
para el dolor de riñones (Biblioteca Digital de la Medicina Tradicional Mexicana, 2009).
Figura 4. Fotografía de hoja y flor de Gentiana spathacea
Kunth.
21
Justificación
El uso de plantas medicinales es parte de la historia de la humanidad y del acervo cultural
de cada pueblo. No obstante los problemas que se suscitaron por el empleo de las
mismas, ayudaron a obtener grandes conocimientos empíricos acerca de sus propiedades
terapéuticas, por lo que su utilización ha sido fundamental en el fomento de la salud
(Linares et al., 1990).
México tiene una gran herencia en el uso de hierbas aromáticas y medicinales para tratar
diferentes padecimientos, la cual inició varios siglos antes de la conquista. Se han
identificado hasta 5,000 especies con aplicaciones curativas, las cuales son comúnmente
utilizadas por los 60 grupos étnicos habitantes del país (González-Stuart y Rivera, 2009).
Muchos de los usos están restringidos por las autoridades de salud, sin embargo, en
regiones marginadas forman parte de la tradición y cultura popular (Rodríguez y Gómez,
1996). Debido a su actividad biológica, las Hierbas Aromáticas Medicinales (HAM) se han
utilizado en la medicina tradicional y actualmente sus principios activos se aprovechan
para elaborar medicamentos, colorantes, conservadores, cosméticos y nutracéuticos,
entre otros (Bourgaud et al., 2001).
Las plantas medicinales pueden convertirse en alternativa válida con el fin de mejorar la
calidad de vida de quienes padecen la más importante enfermedad relacionada con el
páncreas endocrino; resultando de particular interés aquellas que manifiesten tanto
propiedades hipoglicemiantes como antioxidantes. Un caso particular es el uso de
Sanguinaria (Polygonum aviculare l), como auxiliar el tratamiento de la diabetes, por la
población mexicana.
La inflamación es una señal de alerta al organismo sin embargo, la prolongación del
proceso inflamatorio puede provocar daño a células y tejidos. Dado que la mayoría de de
enfermedades, entre ellas crónico-degenerativas, como artritis reumatoide,
arteriosclerosis, cáncer, diabetes, etc. Entre la población existe el uso común de tres
plantas, Hierba del cáncer (Cuphea aequipetala Cav), Ahuehuete (Taxodium mucronatum)
y hierba del hielo (Gentiana spathacea Kunth), para la disminución de la inflamación que
producen dichas enfermedades. Por lo cual se suscitó la elaboración de este proyecto.
22
Objetivos
Principal
Determinar la actividad antiinflamatoria e hipoglucemiante de cuatro plantas
medicinales de México.
Particulares
Realizar el análisis fitoquímico de Polygonum aviculare l, Cuphea procumbens,
Taxodium mucronatum y Gentiana spathacea Kunth.
Evaluar la actividad antioxidante con tres solventes (metanol , éter de petróleo y
acetona) de Polygonum aviculare l, Cuphea procumbens, Taxodium mucronatum y
Gentiana spathacea Kunth.
Determinar la actividad hipoglucemiante de Polygonum aviculare l.
Determinar la actividad antiinflamatoria de Cuphea procumbens, Taxodium
mucronatum y Gentiana spathacea Kunth.
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Metodología
Recolecta de las muestras.
Las plantas utilizadas en este proyecto fueron obtenidas del “Mercado Sonora” de la
Ciudad de México, el cual se encuentra localizado sobre Av. Fray Servando Teresa de
Mier # 419 Col. Merced Balbuena, Delegación Venustiano Carranza, D.F.
Las muestras fueron divididas en hoja y flor, para Hierba del cáncer y Sanguinaria,
mientras que para el Ahuehuete y la hierba del hielo solo se deshojaron. El material
vegetal recolectado fue secado a temperatura ambiente, hojas y flores se pulverizaron en
molino de cuchillas.
Se realizo dos extractos, de cada planta, uno con acetona-éter de petróleo y otro con
metanol-éter de petróleo.
Análisis fitoquímico
Se realizaron pruebas para la identificación de los principales metabolitos secundarios
presentes en cada extracto: alcaloides con reactivo Dragendorff, para flavonides con
reacción de Shinoda e Hidróxido de sodio al 10%, la determinación de Glucósidos
Cianógenos con reactivo de Grignard, Azucares Reductores con reactivos de Fehling y
Benedict, la determinación de saponinas se realizo con la prueba de altura y estabilidad y
reacciones de Lieberman Bouchard y Rosenthaler, se utilizo la reacción de gelatina,
cloruro férrico y ferrocianuro de potasio para la determinación de Taninos.
Determinación de quinonas con reacción de hidróxido de amonio, ácido sulfúrico y
reacción de Börntraguer, mientras que para Cumarinas con reacción de Erlich y Reacción
con hidróxido de amonio, la determinación de Glicósidos cardiacos se llevo a cabo con la
reacción de legal y reacción de Baljet, la reacción hidroximato férrico se utilizo para
determinar Sesquiterpenlactonas, para fenoles se utilizo la reacción de cloruro férrico y la
prueba de Lieberman-Buchard para determinar esteroides.
La capacidad antioxidante
Se preparó una solución con el radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) 6*10-5M en
metanol. Para la prueba se añadió 2ml del radical DPPH y 50 μl de la muestra; se agitó y
a los 30 minutos se leyeron las muestras y el radical a una longitud de 517nm.
Se preparó el reactivo ABTS 7 mM con agua destilada y se mezcló 1:1 con una solución
de persulfato de potasio 2.45 mM; se dejó reposar 16 horas en la oscuridad.
Posteriormente se diluyó con alcohol hasta obtener una absorbancia de 0.72 ( 0.01) a
una longitud de 754nm. Se tomaron 1960μl del radical ABTS y 40 μl de la muestra y se
midió su absorbancia.
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Cuantificación de metabolitos (Fenoles, Taninos y Flavonoides)
Cuantificación de fenoles
Para la cuantificación de fenoles se realizo una curva tipo con acido gálico. Se prepararon
soluciones de 0.0156 mg/mL a 0.25 mg/mL de acido gálico, se le agrego reactivo Folin-
Ciocalteau 1 N, carbonato de sodio al 7.5 % y agua destilada, se dejo reposar por 30 min
en obscuridad y se leyeron a 765 nm. Para la muestra se agrego 100 μL de muestra y se
le adiciono el reactivo Folin-Ciocalteau 1 N, carbonato de sodio al 7.5 % y agua destilada,
se dejo reposar por 15 min en obscuridad y se leyeron a 765 nm.
Cuantificación de Taninos
La cuantificación de taninos se realizo una curva tipo con soluciones con concentraciones
de 2 μg/mL a 10 μg/mL de acido tánico, se le agrego reactivo Folin-Ciocalteau 1 N y
carbonato de sodio al 20 % se dejaron reposar por 40 min y se leyeron a 725 nm. Para la
muestra se agrego 100 μl de muestra y se le adiciono el reactivo Folin-Ciocalteau 1 N, y
carbonato de sodio al 20 %, se leyeron a 725 nm.
Cuantificación de flavonoides
La realización de la curva tipo, el estándar utilizado fue rutina, a las concentraciones de
20, 40, 60, 80 y 100 μg/ml, cada uno de los estándares se le adiciono agua destilada y
carbonato de sodio al 5% se dejó reaccionar 5 minutos. Se adicionaron cloruro de
aluminio al 10% y se dejó reaccionar 5 minutos. Se agregó hidróxido de sodio 1M y
finalmente fueron leídas al instante a una absorbancia de 510nm.
Pruebas in vivo
Actividad hipoglucemiante
Se evaluó la actividad hipoglucemiante de flor y hoja de sanguinaria (Polygonum aviculare
l), se realizo la extracción con los solvente hexano, metanol y acetona, dejando evaporar
el solvente durante 48 h. Se utilizaron 3 lotes de ratones, tres ratones macho por lote, se
resuspendieron los extractos en agua, y se administro 200 μL a cada ratón, se tomo la
glucosa antes y después de tres horas de haber suministrado el extracto.
Actividad antiinflamatoria
Infusión.
Se realizo la extracción de hierba de hielo (Gentiana spathacea Kunth) y hierba del cáncer
(Cuphea aequipetala Cav), con solvente hexano, metanol y acetona, se dejo evaporar por
48 h. Se utilizaron tres lotes de ratones, 3 ratones machos por lote. Se resuspendieron los
extractos en agua de beber, se administro 200 μL a cada ratón, después de una hora se
le aplico 50 μL de aceite de crotón al 5 % en el pabellón auricular derecho, después de 4
h de la aplicación del aceite, se sacrificaron a las ratones y se obtuvieron discos de 5 mm
de cada una de las orejas. El tamaño del edema fue determinado en relación al peso de la
oreja control (izquierda).
25
Gel
Se realizo la extracción de hierba de hielo (Gentiana spathacea Kunth) y ahuehuete
(Taxodium mucronatum), con metanol como solvente, se dejo evaporar por 48 h. Se
utilizaron tres lotes de ratones, 3 ratones machos por lote. Se agrego un gramo de gel por
cada 50 mg de extracto, se durmió a los ratones con éter etílico, y se les inyecto en la
oreja derecha 50 μL de aceite de crotón al 5 %, después de una hora se le aplico gel en
el pabellón auricular derecho, después de 4 h de la aplicación del gel, se sacrificaron a las
ratones y se obtuvieron discos de 5 mm de cada una de las orejas. El tamaño del edema
fue determinado en relación al peso de la oreja control (izquierda).
Desarrollo experimental
Extracto
Extracto metanólico
Se tomaron 4 g de muestra pulverizada de las plantas.
Se añadió 20 mL de la mezcla metanol-agua (9:1) y 20 ml de éter de petróleo,
Se realizo una filtración y se dejo reposar hasta la formación de dos capas.
Extracto con acetona
Se tomaron 4 g de muestra pulverizada de las plantas.
Se añadió 20 ml de la mezcla acetona-agua (9:1) y 20 mL de éter de petróleo.
Se realizo una filtración y se guardo en viales.
Análisis fitoquímico.
Determinación de Alcaloides
Se tomó 0.5ml de cada extracto (Acetona, fracción metanólica polar y no polar) y
se depositaron en tubos de ensaye.
Se adiciona 1ml de Ácido clorhídrico al 10%
Se calentaron a ebullición por 5 minutos y se dejaron enfriar a temperatura
ambiente.
Posteriormente se dividieron las soluciones resultantes en 2 tubos de ensaye, uno
de los cuales sirvió como testigo.
A un tubo se adicionó una gota del reactivo Dragendorff, la prueba se considera
positiva si se forma un precipitado naranja.
Determinación de Flavonoides
Se disolvió 0.5mL de cada extracto (Acetona, fracción metanólica polar y no polar)
en 2mL de etanol absoluto.
Se dividieron en tres tubos. El tercero fue el testigo.
o Reacción de Shinoda: Se adicionaron 2 gotas de ácido clorhídrico
concentrado, si se obtiene una coloración roja indica la presencia de
26
auronas o chalconas. En caso de haber cambio se coloca un trozo de
magnesio metálico, si se forma una coloración naranja a rojo, indica la
presencia de flavonas; si es rojo flavonoles y si es magenta flavononas.
o Reacción de Hidróxido de sodio al 10%: Se agregó 3 gotas de hidróxido de
sodio, si se forma una coloración de amarillo a rojo, indica la presencia de
xantonas y flavonas, de café a naranja de flavonoides, de púrpura a rojizo
de chalconas y azul de antocianinas.
Determinación de Glucósidos Cianógenos
Se agregó 0.5mL de cada extracto en un tubo de ensaye.
Se adicionó 1ml de ácido clorhídrico al 10% y 1 mL de cloroformo.
Calentar los tubos en Baño María en el cual se colocaron en la boca del tubo una
tira de papel filtro impregnado con reactivo de Grignard la formación de una
mancha rosa a rojo indica prueba positiva.
Determinación de Azúcares Reductores
Se tomaron 0.5ml de cada extracto y se depositaron en tubos de ensaye
Adicionar hidróxido de sodio al 10% hasta tener un pH de 11.
Se dividieron los extractos en dos tubos de ensaye para las pruebas.
o Reacción de Fehling: Se adicionaron 0.5mL de la solución Fehling A y
0.5ml de solución Fehling B y 1mL de agua destilada.
o Reacción de Benedict: Se adicionó 0.5mL del reactivo de Benedict y 1mL
de agua destilada.
Se prepara un blanco para cada tubo, sin el extracto.
Se colocaron los tubos en baño maría por 15 minutos. Si se forma un precipitado
naranja a rojo indica presencia de azúcares.
Determinación de Saponinas
Prueba de altura y estabilidad:
Colocar 1 mL de cada extracto en un tubo de ensaye.
Se agitó vigorosamente y se tomó la altura de la espuma. En caso de que se
presentará la prueba se considera positiva.
Reacción de Lieberman Bouchard:
Se colocó 0.5mL de cada extracto en un tubo de ensaye.
Se agregó 2 gotas de acético anhídrido y se estratifico con 2 gotas de ácido
sulfúrico concentrado. Al formarse una coloración azul o verde en la interfase, hay
presencia de saponinas esteroidales; si la coloración es rosa, rojo, magenta o
violeta habrá presencia de saponinas triterpenoides.
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Reacción de Rosenthaler:
Se tomó 0.5ml de cada extracto y se colocó en un tubo de ensaye.
Se adicionó 2 gotas del reactivo Rosenthaler y se estratificó con 2 gotas de ácido
sulfúrico concentrado. Si se forma una coloración violeta, se considera positiva.
Determinación de Taninos
Se tomó 1ml de cada extracto y se agregó 2ml de agua destilada y 3 gotas de
cloruro de sodio al 2%.
Se calentó a ebullición por un minuto y se dejó enfriar a temperatura ambiente.
Se dividieron las muestras en cuatro tubos, uno de los cuales fue el testigo.
o Reacción con gelatina: Se adicionó 2 gotas de reactivo de gelatina. La
formación de un precipitado blanco indica la presencia de taninos.
o Reacción de cloruro férrico: Se agregó una gota de cloruro férrico al 1%, la
formación de coloraciones azul a negro indica la presencia de derivados
del ácido gálico y coloraciones verdes de derivados del catecol.
o Reacción de ferrocianuro de potasio: Se agregó una gota de ferrocianuro
de potasio al 1%. La formación de una coloración azul, indica la presencia
de compuestos fenólicos.
Determinación de Quinonas
Reacción de hidróxido de amonio
Se agregó 0.5 mL de cada extracto en pocillos de cerámica y se concentran a
sequedad.
Se adicionó una gota de hidróxido de amonio concentrado a cada extracto. Se
considera positiva la prueba para antraquinonas al tener presencia de una
coloración roja (que aparece en los dos primeros minutos).
Reacción con ácido sulfúrico
Se agregó 0.5 mL de cada extracto en pocillos de cerámica y se concentran a
sequedad.
Se agregó una gota de ácido sulfúrico concentrado a otra porción de cada
extracto. La formación de una coloración roja indica la presencia antraquinonas.
Reacción de Börntraguer
Se colocó 1 mL de cada extracto en tubos de ensaye y se concentró a
sequedad.
Se diluyó cada extracto en 2 mL de agua destilada.
Se añadió 3 mL de hidróxido de potasio al 5%.
Se calentó a ebullición por 3 minutos, se dejó enfriar a temperatura ambiente y se
realizó una extracción con 3 mL de cloroformo.
28
Se eliminó la fase acuosa y a la fracción clorofórmica se le adicionó 2 mL de
hidróxido de potasio al 5%. Un color rojo indica la presencia de benzoquinonas; si
es amarillo verdoso, adicionar 1 gota de peróxido de hidrógeno al 6%. Si la
coloración cambia a roja, se considera positiva para derivados de antronas.
Determinación de Cumarinas
Reacción de Erlich
Se agregó 0.5mL de cada extracto en tubos de ensaye.
Se agregaron dos gotas de Reactivo Erlich y una gota de ácido clorhídrico
concentrado. La coloración naranja, indica presencia de cumarinas.
Reacción con hidróxido de amonio.
Se agregó 0.5ml de cada extracto en tubos de ensaye.
Se adicionó 0.5ml de etanol y dos gotas de hidróxido de amonio concentrado. Se
considera positiva la prueba si se presenta una fluorescencia azul-violeta.
Determinación de Glicosidos cardíacos.
Se agregó 2 mL de cada extracto en tubos de ensaye y se divide en tres tubos de
ensaye.
Reacción de legal
Se dejó evaporar el disolvente y se adicionó 2 gotas de piridina.
Se agregó una gota de nitroprusiato de sodio al 5% y 4 gotas de hidróxido de
potasio. Una coloración roja poco estable indica la presencia de glucósidos
cardíacos.
Reacción de Baljet
Se adicionó tres gotas del reactivo Baljet.
Una coloración de naranja a rojo obscuro indica presencia de glucósidos
cardiacos.
Determinación de Sesquiterpenlactonas
Reacción Hidroximato férrico:
Se agregó 0.5ml de cada extracto en tubos de ensaye.
Se adicionó dos gotas de clorhidrato de hidroxilamina 2N y una gota de hidróxido
de potasio 2 N en metanol.
Se calentó la mezcla a ebullición de 1 minuto, se enfrió y se llevó a pH de 1 con
ácido clorhídrico 0.5 N.
Se adicionó una gota de cloruro férrico al 1%. Las coloraciones roja, violeta o rosa
indican que la prueba es positiva. .
29
Determinación de fenoles
Se realizó series de cinco tubos de ensaye en los cuales se colocaron tres gotas
de la fracción polar y los extractos con acetona.
Se añadió tres gotas de agua destilada con lo que se logró un color amarillo.
Se dejó un testigo y se adicionó una gota de cloruro férrico en el segundo, dos en
la tercera, tres a la cuarta y cuatro al quinto tubo.
o Ninguna reacción (no cambia de color) = no hay presencia de fenoles o
taninos.
o Cambio en el color azul oscuro = fenoles o taninos pirogálicos
(hidrosolubles)
o Cambio de color a verde obscuro = fenoles o taninos de tipo catecol (
flavonoides o taninos concentrados)
Determinación de esteroides
Prueba de Lieberman-Buchard:
Se añadió 1 mL de la fracción no polar en un tubo de ensaye
Se dejó evaporar casi hasta la sequedad y se adicionaron de 3 gotas de
cloroformo.
Se adicionaron tres gotas de anhidro acético seguido por una gota de ácido
sulfúrico concentrado.
Cambios de color indican:
o Azul o verde = esteroides
o Rojo, rosado o violeta = triterpenos
o Amarillo pálido = esteroides o triterpenos saturados
Capacidad antioxidante
Determinación de actividad antioxidante con radical DPPH.
Preparación del radical DPPH
Se pesó 0.0118 g de DPPH y se aforo a 500mL de metanol, en un frasco ámbar
para evitar la entrada de la luz.
Se midió la absorbancia del radical una longitud de 517nm.
Realización de la curva tipo
Se realizó la curva tipo con Trolox con concentraciones de 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1 y
1.1 Mm.
Cuantificación
Se tomó 50 μl de los extractos y 2mL del radical preparado (DPPH).
Se agitó en el vortex y a los 30 minutos se leyó la absorbancia a una longitud de 517nm
30
Determinación de actividad antioxidante con radical ABTS.
Preparación del radical ABTS.
Se pesó 0.0192 g de ABTS y se aforo a en 5 mL de agua.
Se peso 0.0033 g de persulfato de potasio y se aforo a 5 mL de agua destilada.
Se mezclaron ambas soluciones y se dejo reposar por 16 horas en un frasco
ámbar.
Se tomo 1 mL de la solución y se diluyo con 39 mL de etanol puro, para obtener
una absorbancia de 0.72 (± 0.01), a una longitud de onda de 754 nm.
Realización de la curva tipo
Se realizó la curva tipo con Trolox a las concentraciones de 0.1, 0.24, 0.5, 0.75, 1 y
1.25 Mm.
Cuantificación
Se tomó 20 μL de los extractos diluidos 1:1000 y 980 μL del radical preparado
(ABTS).
Se agitó y se leyó la absorbancia a una longitud de 517nm al momento
Cuantificación de Metabolitos.
Determinación de fenoles
Curva tipo
Se prepararon soluciones de acido gálico de 0.0156, 0.0312, 0.0625, 0.125 y 0.25
mg/mL.
Se tomaron 1000 μL de cada solución y se agrego 100 μL de agua destilada
Se añadió 1000 μL de reactivo Folin-Ciocalteau 1 N y 800 μL de carbonato de
sodio al 7.5 %.
Se agito y se dejo reposar durante 30 min.
Se leyó a una absorbancia de 765 nm.
Preparación de muestra
Se realizo una dilución de 1:1000 de los extractos.
Se tomó 50 μL de las muestra diluidas y se añadió 200mL de agua, 1 ml de
carbonato de sodio al 7.5% y 50 μL de Folin-Ciocalteu.
Se mezcló y se agito durante 15 minutos.
Finalmente se determinó la absorbancia a 765 nm.
31
Determinación de flavonoides
Preparación de la curva tipo.
Se realizó una curva tipo con rutina como estándar a las concentraciones de 20, 40, 60, 80 y 100 μg/mL.
Se agregó 2mL de agua a las soluciones preparadas.
Se añadió 30 μL de nitrito de sodio al 5% y se dejó reaccionar por 5 minutos.
Posteriormente se agregó 20 μL de cloruro de aluminio al 10% y se dejó reaccionar por 5 minutos.
Se añadió 250 μL de carbonato de sodio al 1M.
Se determinó la absorbancia a 510 nm. Preparación de las muestras
Se realizo una dilución de 1:1000 de los extractos.
Se tomó 50 μL de las muestras diluidas y se añadió 2mL de agua.
Se añadió 30μL de nitrito de sodio al 5% y se dejó reaccionar por 5 minutos.
Se agregó 20μL de cloruro de aluminio al 10% y se dejó reaccionar por 5 minutos.
Se añadió 250 μL de carbonato de sodio al 1M.
Se determinó la absorbancia a 510 nm,
Determinación de taninos.
Curva tipo
Se realizaron concentraciones de 2, 4, 6, 8 y 10 mg/mL de acido tánico y se tomo
400, 800, 1200, 1600 y 2000 μL de las soluciones respectivamente.
Se agrego agua destilada hasta completar 2000 μL en cada solución.
Se agrego 250 μL de reactivo Foli-Ciocalteau y 1250 μL de carbonato de sodio al
20%.
Se dejaron reposar por 40 min y se leyó la absorbancia a 725 nm.
Preparación de la muestra
Se realizaron diluciones 1:1000 de los extractos.
Se tomó 50 μL de cada muestra diluida y se le adicionó 450mL de agua destilada.
Se añadió 1250 de carbonato de sodio al 20% y 250 μL de Folin-ciocalteu.
Se agitaron los tubos y se determinó a 725 nm la absorbancia.
32
Pruebas in vivo.
Actividad hipoglucemiante
Se tomo el peso inicial de tres frascos vacios.
Se peso 7 g de las muestras por solvente y se le agrego 30 mL del mismo.
Se sónico por 10 min y se filtro, poniendo la solución obtenida en los frascos antes
pesados.
Se realizo una segunda extracción de las muestras anteriores, agregando 20 mL
del solvente.
Se sónico por 10 min y se filtro, colocándolo en el mismo frasco,
Se dejo evaporar el solvente por 48 h.
Una vez evaporado se resuspendio en agua para beber y tween 80, para obtener
una solución 50:50, obteniendo una concentración de 50 mg del extracto por cada
200 μL de agua.
Se utilizaron 4 lotes de tres ratones con un rango de peso de 27 g a 31 g.
Se tomó la glucosa a los ratones en tiempo cero.
Se les suministró 200 μl del extracto a 3 lotes, al último se tomó como grupo
control y se les suministró 200 μl de agua.
Se tomó la glucosa a las 3 horas.
Actividad antiinflamatoria
Infusión
Se tomo el peso inicial de tres frascos vacios.
Se peso 7 g de las muestras por solvente y se le agrego 30 mL del mismo.
Se sónico por 10 min y se filtro, poniendo la solución obtenida en los frascos antes
pesados.
Se realizo una segunda extracción de las muestras anteriores, agregando 20 mL
del solvente.
Se sónico por 10 min y se filtro, colocándolo en el mismo frasco,
Se dejo evaporar el solvente por 48 h.
Una vez evaporado se resuspendio en agua para beber y tween 80, para obtener
una solución 50:50, obteniendo una concentración de 20 mg del extracto por cada
200 μL de agua.
Se preparo una solución de 2.5 mg/mL de Indometacina.
Se utilizaron 5 lotes de tres ratones con un rango de peso de 28 g a 32 g.
Se les suministró 200 μl del extracto a 3 lotes, al cuarto se les suministro 200 μL
del fármaco y al último se tomó como grupo control, por lo cual se les suministró
200 μl de agua.
Después de una hora se les administro 50 μL de aceite de crotón al 5 % en
acetona en la oreja derecha.
Se dejo transcurrir 4 horas.
Se sacrifico a los ratones por sobredosis de éter etílico y desnucamiento.
Se obtuvieron discos de 5 mm de cada oreja.
33
Gel
Preparación del Gel
Se peso 1.3 g de carbopol y se le añadió 1 mL de tiretanolamida.
Se disolvieron en 200 mL de agua desionizada, hasta la formación del gel.
Aplicación del gel
Se tomo el peso inicial del frasco vacio.
Se peso 7 g de las muestras y se le agrego 30 mL de metanol.
Se sónico por 10 min y se filtro, poniendo la solución obtenida en el frasco antes
pesado.
Se realizo una segunda extracción de la muestra anterior, agregando 20 mL del
solvente.
Se sónico por 10 min y se filtro, colocándolo en el mismo frasco,
Se dejo evaporar el solvente por 48 h.
Se agrego el gel para obtener una concentración de 50 mg de extracto por cada
gramo de gel.
Se utilizaron 4 lotes de tres ratones con un rango de peso de 28 g a 32 g.
Se aplico el gel con cada extracto a dos lotes, al tercer lote se le aplico el
ungüento driposone, utilizado como fármaco, al último lote se utilizo como el
control.
Después de trascurrida una hora se adormecieron los ratones con éter etílico, para
inyectarles 50 μL de aceite de crotón al 5 % en acetona en la oreja derecha.
Después de inyectado el irritante se dejo transcurrir 4 h.
Se sacrifico a los ratones por sobredosis de éter etílico y desnucamiento.
Se obtuvieron discos de 5 mm de cada oreja.
34
Resultados
Análisis fitoquímico.
El análisis fitoquímico tiene el objetivo de determinar metabolitos secundarios presentes
en los extractos vegetales a estudiar. En la tabla 3 se observan los resultados de los
metabolitos presentes en los extractos con acetona de Ahuehuete, hierba del hielo, hierba
del cáncer y flor y hoja de Sanguinaria, interpretándose (+) como la presencia del
metabolito y (–) la ausencia del metabolito.
Tabla 3. Metabolitos secundarios presentes (+) y ausentes (-), de ahuehuete, hierba del hielo,
hierba del cáncer y flor y hoja se sanguinaria.
Metabolitos Hierba hielo
Ahuehuete Hoja Hierba del cáncer
Hoja Sanguinaria
Flor Sanguinaria
ALCALOIDES
* Dragendorff + + + + +
FLAVONOIDES
*Reacción de Shinoda - - - - -
*Reacción con Hidróxido de Sodio al 10%
- - - - -
GLUCÓSIDOS CIANOGENOS
- - - - -
AZUCARES REDUCTORES
*Reacción de Fehling - + - - -
*Reacción de Benedict - + - - -
SAPONINAS
*Altura y estabilidad - + - - -
*Reacción de Liebarman-Buchard
+ + + + +
*Reacción de Rosenthaler - - - - +
TANINOS
*Ferrocianuro de Potasio 1% - - - - -
*Reacción con gelatina - + - - -
*Reacción de Cloruro Férrico
- + - - -
QUINONAS
*Reacción de Hidroxido de Amonio
- + - - -
*Reacción con Ácido Sulfúrico
- + - - +
*Reacción de Borntranger - - - - -
35
CUMARINAS
*Reacción de Erlich - - - - -
*Reacción con hidróxido de amonio
- - - - -
GLUCÓSIDOS CARDÍACOS
*Reacción de Legal - - - + +
*Reacción de Baljet - + + + +
SESQUITERPENLACTONAS
*Reacción con Hidroximato Férrico
- - - - -
FENOLES
*Esteroides + + + + +
*Prueba de Lieberman-Buchard
- - - - -
La evaluación de los metabolitos en el extracto con metanol, fueron determinados en las
dos fases formadas; fase polar (metanol-agua) y no polar (éter de petróleo). En la tabla 4
se muestran los resultados de los metabolitos presentes en las dos fases de los extractos
de ahuehuete, hierba del hielo, hierba del cáncer y flor y hoja de sanguinaria.
36
Tabla 4. Metabolitos presentes (+) en los extractos con metanol (fracción polar y no polar) de
ahuehuete, hierba del hiela, hierba del cáncer y flor y hoja de sanguinaria.
Metabolitos
Ah
ue
hu
ete
(M
eta
no
l-
fra
cc
ión
no
po
lar)
Ah
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hu
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no
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lar)
Flo
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gu
ina
ria
(M
eta
no
l-
fra
cc
ión
po
lar)
ALCALOIDES
* Dragendorff - + - + + + + + + + FLAVONOIDES
*Reacción de Shinoda - + - - - - - - - - *Reacción con Hidróxido de
Sodio al 10% - + - - - - - - - +
GLUCÓSIDOS CIANOGENOS - + - - - - + - - + AZUCARES REDUCTORES
*Reacción de Fehling - + - + + + - + - +
*Reacción de Benedict - + - + - + - + - + SAPONINAS
*Altura y estabilidad - + - + - + - - - - *Reacción de Liebarman-
Buchard - - + - + - + - + -
*Reacción de Rosenthaler - + - - - - - + - + TANINOS
*Ferrocianuro de Potasio 1% - - - - - - - - - -
*Reacción con gelatina - - - - - + - - - -
*Reacción de Cloruro Férrico - + - + - + - + - + QUINONAS
*Reacción de Hidróxido de Amonio
+ + - + + + - - + +
*Reacción con Ácido Sulfúrico + + - + + + - + - +
*Reacción de Borntranger - - - - - - - - - -
CUMARINAS
*Reacción de Erlich + + - - - - - + + - *Reaccion con hidróxido de
amonio - - - - - - - - - +
GLUCÓSIDOS CARDÍACOS
*Reacción de Legal - + - + - + - + - +
*Reacción de Baljet + + + + + - + + + + SESQUITERPENLACTONAS *Reacción con Hidroximato
Férrico - - - - - - - - - -
37
Cuantificación de Fenoles
Los compuestos fenólicos poseen una estructura química especialmente adecuada para
ejercer una acción antioxidante actuando como captores de radicales libres neutralizando
peligrosas especies reactivas de oxígeno e iones metálicos quelantes. Para la
cuantificación de fenoles totales se determinó por el método descrito por Singleton y
Rossi (1965), la fig. 5 muestra la curva tipo a diferentes concentraciones de acido gálico
para la cuantificación de los fenoles.
La cuantificación de los fenoles totales se realizo en los extractos con acetona, la tabla 5
muestra las concentraciones, habiendo interpolado con la ecuación obtenida de la fig. 5
Tabla 5. Concentración de fenoles, presentes en los extractos con acetona de ahuehuete, hierba del hielo, hierba del cáncer y flor y hoja de sanguinaria.
PLANTA Dilución
(mL) Absorbancia
Concentración (ácido gálico
mg/mL )
Concentración (mg eq. de ácido gálico/1
g de muestra)
Gentiana spathacea Kunth
1:2000 0.01768±2.68E-03 9.09±1.38 45.45±6.90
Taxodium mucronatum.
1:1000 0.01340±5.11E-04 3.45±0.13 17.23±0.66
Hoja de Cuphea procumbens
1:1000 0.01181±1.41E-05 3.04±0.004 15.19±0.02
Hoja Polygonum aviculare l
1:2000 0.02000±1.23E-04 10.29±0.063 51.43±0.32
Flor Polygonum aviculare l
1:1000 0.01072±2.04E-03 2.76±0.52 13.78±2.62
Nota: Los datos representan el promedio 2n ± desviación estándar.
FENOLES
*Esteroides + + + + + + +
*Prueba de Lieberman-Buchard + + + + +
y = 3.8889x - 0.0167 R² = 0.999
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3
Ab
so
rban
cia
[760 n
m]
Concentración de ácido gálico [mg/mL]
Figura 5. Curva tipo para la cuantificación de fenoles totales, utilizando acido gálico
como control.
38
Cuantificación de flavonoides.
Los flavonoides son pigmentos naturales presentes en los vegetales y que protegen al
organismo del daño producido por agentes oxidantes, como los rayos ultravioletas, la
polución ambiental, sustancias químicas presentes en los alimentos, etc. (Aherne, 2002).
Los flavonoides contienen en su estructura química un número variable de grupos
hidroxilo fenólicos y excelentes propiedades de quelación del hierro y otros metales de
transición, lo que les confiere una gran capacidad antioxidante (Havsteen, 1983). Por ello,
desempeñan un papel esencial en la protección frente a los fenómenos de daño oxidativo,
y tienen efectos terapéuticos en un elevado número de patologías, incluyendo la
cardiopatía isquémica, la aterosclerosis o el cáncer (Jang, 1997).
La concentración de flavonoides, se obtuvo de con ayuda de la curva tipo, utilizando como
control rutina,
Figura 6. Curva tipo, para el cálculo de la concentración de flavonoides, utilizando como control,
Rutina.
Dada la ecuación, obtenida por la linealización de la curva tipo de ruina, se obtuvo la
concentración de flavonoides, de los extractos de sanguinaria, hierba del hielo y
ahuehuete. La cuantificación de flavonoides de hierba del cáncer, no fue realizada, por
falta de extracto, ya que la época de producción de la planta es entre el periodo julio-
diciembre.
39
y = 0.0533x + 0.0103 R² = 0.9985
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0 2 4 6 8 10 12
Ab
sorb
anci
a [n
m]
concentración de ácido tánico [µg/mL]
Tabla 6. Concentración de flavonoides presentes en los extractos con acetona de sanguinaria,
hierba del helo y ahuehuete.
PLANTA Dilución
(mL) Absorbancia
Concentración (Rutina µg/mL
)
Concentración (mg eq. de Rutina/2g de
muestra)
Gentiana spathacea Kunth
1:50
0.04304±4.9E-04 206.43±5.84 10.32±0.29
Taxodium mucronatum.
1:100
0.02951±1.7E-04 90.79±4.04 4.54±0.20
Hoja Polygonum aviculare l
1:50 0.02433±3.1E-03 10.12±23.04 0.51±1.15
Flor Polygonum aviculare l
1:100
0.05017±7.8E-04 582.50±18.69 29.12±0.93
Nota: Los datos representan el promedio 2n ± desviación estándar.
Cuantificación de Taninos
Los taninos son compuestos polifenólicos que se encuentran en muchas plantas
dicotiledóneas. Son empleados por las plantas como mecanismo de defensa contra
herbívoros y patógenos y para la conservación del nitrógeno. La característica principal de
los taninos es su capacidad para formar complejos reversibles con las proteínas (Márquez
D, y Suárez A., 2008). Se hizo la cuantificación de taninos por el método de Folin-
Ciocalteau descrito por Makkar (2000)
Las concentraciones obtenidas fueron calculadas con la ecuación de la curva tipo de
ácido tánico (Figura 7), se utilizaron los extractos con acetona y se obtuvieron las
concentraciones de acido tánico por gramo de muestra, a la cual se le realizo la
extracción, (Tabla 7)
Figura 7. Curva tipo para la determinación de taninos, usando como control acido tánico
40
Tabla 7. Concentración de taninos presentes en los extractos con acetona de ahuehuete, hierba
hiela, hoja de hierba del cáncer y flor y hoja de sanguinaria.
PLANTA Dilución
(mL) Absorbancia
Concentración (ácido tánico
mg/mL)
Concentración (mg eq. de
ácido tánico/1 g de muestra)
Gentiana spathacea Kunth
1:2000 0.09313±9.56E-03 3.49±0.36 13.96±1.43
Taxodium mucronatum.
1:1000 0.06176±5.14E-03 1.16±0.10 4.63±0.39
Hoja de Cuphea procumbens
1:1000 0.06131±1.99E-03 1.15±0.037 4.60±0.15
Hoja Polygonum aviculare l
1:1000 0.06042±1.70E-03 1.13±0.032 4.53±0.13
Flor Polygonum aviculare l
1:1000 0.06446±4.25E-03 1.21±0.08 4.83±0.32
Nota: Los datos representan el promedio 2n ± desviación estándar.
Capacidad antioxidante
Los métodos de determinación de la actividad antioxidante se basan en distintos sistemas
generadores de radicales libres. Dichos radicales reaccionarían con la muestra y en virtud
de la capacidad antioxidante de esta se inhibiría la generación de los primeros. Así, lo que
se determina realmente es el efecto antioxidante ya que la actividad antioxidante no se
puede medir de forma directa. (Agudo L., 2010). Una forma de determinar esta actividad,
es por medio de métodos directos, DPPH y ABTS, donde el radical se emplea como un
factor de cuantificación (produciendo una señal analítica), La figura 8 muestra la curva tipo
utilizada, mientras que la tabla 8 muestra capacidad antioxidante que presentan los
extractos metanólicos y de acetona de las diferentes plantas tratadas por el método
ABTS.
Figura 8. Curva tipo para la determinación de la capacidad antioxidante por el método ABTS
utilizando Trolox como referencia.
41
Tabla 8. Capacidad antioxidante por el método ABTS presente en los extractos con acetona y metanólicos (fracción polar y no polar) de ahuehuete, hierba del hielo, hierba del cáncer y
sanguinaria, la absorbancia del radical fue de 0.7333.
PLANTA Absorbancia %inhibición Concentración
(Trolox mM)
Concentración (mM eq. De
Trolox /1 g de muestra)
Acetona
Gentiana spathacea Kunth
0.697±5.2E-04 495.80±7.194 7.160±0.1059 3.436±0.05
Taxodium mucronatum.
0.610±4.66E-03 1686.19±6.294 24.692±0.937 11.852±0.04
Hoja de Cuphea procumbens
0.376±1.32E-02 4143.82±8.617 58.388±0.324 29.227±0.94
Hoja Polygonum aviculare l
0.570±3.29E-01 1109.60±7.088 11.572±1.015 7.776±0.48
Flor Polygonum aviculare l
0.461±1.08E-01 2811.65±2.714 40.694±1.670 19.809±0.80
Metanol fracción polar
Gentiana spathacea Kunth
0.613±2.07E-03 1640.84±6.910 24.024±0.417 0.0755±0.200
Taxodium mucronatum.
0.712±4.88E-04 294±6.745 4.188±0.0.097 2.010±0.0.047
Hoja de Cuphea procumbens
0.277±1.15E-03 5674.36±6.192 83.432±0.265 11.532±0.127
Hoja Polygonum aviculare l
0.488±3.20E-02 2396.81±0. 35.159±7.134 40.047±0.873
Flor Polygonum aviculare l
0.330±1.04E-02 4846.83±8.990 71.383±0.648 16.876±1.193
Metanol fracción no polar
Gentiana spathacea Kunth
0.630±1.66E-03 1413.42±3.242 20.675±0.333 39.975±0.160
Taxodium mucronatum.
0.318±9.95E-03 5664.23±13.627 83.35±1.939 9.924±0.930
Hoja de Cuphea procumbens
0.576±5.76E-02 1028.78±1.189 15.010±0.675 7.204±6.345
Hoja Polygonum aviculare l
0.597±1.27E-02 693.69±0. 10.074±2.91 4.835±0.746
Flor Polygonum aviculare l
0.476±7.62E-03 2587.79±7.257 37.972±0.143 18.226±0.839
Nota: Los datos representan el promedio 2n ± desviación estándar.
A continuación la figura 9 muestra la curva tipo utilizada para el método DPPH y en la
tabla 9 se muestra la capacidad antioxidante que presentan los extractos metanólicos y de
acetona de las diferentes plantas tratadas.
42
Figura 9. Curva tipo para la determinación de la actividad antioxidante por el método DPPH
utilizando Trolox como referencia
Tabla 9.Capacidad antioxidante por el método DPPH presente en los extractos con acetona y metanólicos
(fracción polar y no polar) de ahuehuete, hierba del hielo, hierba del cáncer y sanguinaria, la absorbancia del radical fue de 0.5366
PLANTA Absorbancia %inhibición Concentración
(Trolox mM)
Concentración (mM eq. De
Trolox /1 g de muestra)
Acetona
Gentiana spathacea Kunth
0.2593±8.66E-05 51.679±0.0161 0.060±2.089E-04 0.364±1.253E-04
Taxodium mucronatum.
0.0944±2.20E-02 82.393±4.112 1.0044±0.05324 0.60266±0.03194
Hoja de Cuphea
procumbens 0.1056±1.45E-04 80.310±40.155 0.9774±3.50E-04 0.5864±2.10E-04
Hoja Polygonum aviculare l
0.2327±1.50E-04 38.332±0.0398 0.558±5.16E-04 0.3351±3.09E-04
Flor Polygonum
aviculare l 0.1224±2.03E-04 67.555±0.0537 0.9369±6.964E-4 0.5621±4.17E-4
Metanol fracción polar
Gentiana spathacea Kunth
0.613±2.07E-03 93.328±0.0451 1.146±5.85E-04 0.458±2.34E-04
Taxodium mucronatum.
0.712±4.88E-04 80.518±0.0139 0.980±1.81E-04 0.392±7.24E-05
Hoja de Cuphea
procumbens 0.277±1.15E-03 85.73±6.71E-03 1.047±8.69E-05 0.419±3.47E-05
Hoja Polygonum aviculare l
0.488±3.20E-02 84.404±0.01333 1.155±1.72E-04 0.462±6.90E-05
Flor Polygonum
aviculare l 0.330±1.04E-02 87.514±0.0161 1.195±2.08E-04 0.478±8.34E-05
Metanol fracción no polar
Gentiana spathacea Kunth
0.630±1.66E-03 22.2472±0.238 0.225±3.08E-03 0.108±1.47E-03
Taxodium mucronatum.
0.318±9.95E-03 92.40±4.68E-03 1.134±6.07E-05 0.544±2,91E-05
Hoja de Cuphea
procumbens 0.576±5.76E-02 79.395±0.0289 0.965±3.7E-03 0.386±1-49E-04
Hoja Polygonum aviculare l
0.597±1.27E-02 14.606±0.1233 0.251±1.59E-03 0.120±7.66E-04
Flor Polygonum
aviculare l 0.476±7.62E-03 8.2178±0.0395 0.168±5.12E-04 0.08±3.46E-04
Nota: Los datos representan el promedio 2n ± desviación estándar
43
Actividad Hipoglucemiante
Las plantas medicinales con actividad antidiabética pueden aportar una fuente útil de
nuevos compuestos orales hipoglicemiantes, ya sea como entidades farmacéuticas o
coadyuvantes de las terapias existentes (Sabu MC y Kuttan R., 2002). Se evalúo la
capacidad hipoglucemiante de la planta sanguinaria (polygonum aviculare l) tanto de
hoja como de flor utilizando 3 solventes orgánicos con diferente polaridad; acetona,
metanol y hexanos.
La toma de glucosa se realizo al inicio y después de tres horas de haber suministrado la
infusión metanólica de la hoja de sanguinaria a las individuos, dicha infusión mostro un
porcentaje de disminución de casi 14 %, todos los individuos muestran una concentración
de glucosa menor de 200 mg/dL, los cual nos indica que estos ratones no son diabéticos,
ya que los animales diabéticos presentan un nivel de glucosa sanguínea entre 200 y 600
mg/dL (Ramos H, 1994).
Tabla 10. Niveles de glucosa al tiempo inicial y después de 3 horas con la infusión del extracto metanólico de la hoja de sanguinaria, así como el porcentaje de disminución de disminución del
nivel de glucosa. El promedio del nivel de glucosa presenta ± desviación estándar,
Ratón Tiempo inicial Glucosa (mg/dL)
Tiempo final Glucosa (mg/dL)
1 105 72
2 82 84
3 99 90
Promedio 95.33±11.93 82±9.17
%disminución 13.99
Nota: Los datos representan el promedio 2n ± desviación estándar.
El nivel de glucosa inicial y después de la ingesta la infusión con el extracto metanólico
fue de 13.5 mg/dL aproximada mente.
44
Figura 10. Concentración de glucosa en sangre inicial y después de tres horas de haber
suministrado el extracto metanólico a los sujetos de prueba.
Los resultados obtenidos para acetona se muestran en la tabla 11, indicando la glucosa
inicial y final para cada uno de los 3 ratones así como el porcentaje de disminución.
Tabla 11. Niveles de glucosa al tiempo inicial y después de 3 horas, ± desviación estándar de los
promedios de los niveles de glucosa, con la infusión del extracto con acetona de la hoja de sanguinaria, así como el porcentaje de disminución del nivel de glucosa.
Ratón Tiempo inicial Glucosa (mg/dL)
Tiempo final Glucosa(mg/dL)
1 102 83
2 100 106
3 102 82
Promedio 101.33±1.15 90.33±13.58
%disminución 10.86
Nota: Los datos representan el promedio 2n ± desviación estándar.
La figura 11 muestra la disminución de la glucosa en sangre del lote de ratones a los
cuales se les suministro con la infusión del extracto con acetona, hubo una diferencia de
11 mg/dL, entre el nivel de glucosa inicial y el final.
Figura 11. Niveles de glucosa inicial y final, de los ratones tratados con la infusión con acetona, de
la hoja de sanguinaria.
95.33±11.93
82±9.17
75.00
80.00
85.00
90.00
95.00
100.00
Co
ncen
tracio
n d
e g
luco
sa
(mg
/dL
)
Glucosa inicial
Glucosa final
101.33±1.15
90.33±13.58
80.00
85.00
90.00
95.00
100.00
105.00
Co
ncen
tracio
n d
e
glu
co
sa (
mg
/dL
Glucosa inicial
Glucosa final
45
Los resultados obtenidos para hexanos muestran en la tabla 12, el nivel de glucosa al
tiempo inicial y al tiempo final para cada uno de los 3 ratones, así como, el % de
disminución del nivel de glucosa obtenido.
Tabla 12. Niveles de glucosa al tiempo inicial y después de 3 horas con la infusión del extracto con hexano de la hoja de sanguinaria, así como el porcentaje de disminución del nivel de glucosa
y ± desviación estándar de los promedios.
Ratón Tiempo inicial Glucosa (mg/dL)
Tiempo final Glucosa (mg/dL)
1 100 79
2 112 75
3 103 82
Promedio 105±6.24 78.67±3.51
%disminución 25.07
Nota: Los datos representan el promedio 2n ± desviación estándar.
La diferencia del nivel de glucosa inicial y después de haber suministrado la infusión del
extracto con hexano, fue de 26.33 mg/dL. Figura 12.
Figura 12. Niveles de glucosa inicial y final, de los ratones tratados con la infusión con hexano, de
la hoja de sanguinaria.
Todos los extractos mostraron un porcentaje de disminución mayor al 10 %, siendo mejor
el extracto con hexano como solvente, con un 25%, el doble de disminución en
comparación con metanol (13.99%) y acetona (10.86%).
105±6.24
78.67±3.51
0
20
40
60
80
100
120
Co
ncen
tracio
n d
e g
luco
sa
(mg
/dL
Glucosa inicial
Glucosa final
46
Figura 13. Porcentaje de disminución de mg/dL de glucosa en sangre, por las infusiones, con los
extractos de metanol, acetona y hexanos de hoja de sanguinaria.
La tabla 13 muestra el nivel de glucosa inicial y final del nivel de glucosa de los ratones
dosificados con la infusión de extracto metanólico de la flor de sanguinaria, la cual obtuvo
11.34 % de disminución del nivel de glucosa.
Tabla 13. Nivel de glucosa inicial y después de 3 h de haber suministrado la infusión con extracto
metanólico de flor de sanguinaria, ± desviación estándar de los promedios de los niveles de
glucosa y su porcentaje de disminución.
Ratón Tiempo inicial Glucosa (mg/dL)
Tiempo final Glucosa (mg/dL)
1 124 113
2 168 124
3 131 138
Promedio 141±23.64 125±12.53
%disminución 11.34
Nota: Los datos representan el promedio 2n ± desviación estándar.
Se disminuyo 11.34 mg/dL el nivel de glucosa, de los ratones, con la infusión de la flor de
sanguinaria, extracto obtenido con metanol como solvente. Figura 14.
13.99
10.86
25.08
%disminución % de disminución de glucosa
Metanol Acetona Hexanos
47
Figura 14. Disminución del nivel de glucosa en sangre de los ratones, dosificados con la infusión
del extracto metanólico.
La tabla 14 muestra los niveles de glucosa inicial y después de haber sido suministrado la
infusión del extracto con acetona de la flor de sanguinaria, el cual tuvo un porcentaje de
disminución del 16.33 %.
Tabla 14. Niveles de glucosa inicial y final de los ratones tratados con la infusión de flor de
sanguinaria, extracto obtenido con acetona. Los promedios de los niveles de glucosa presentan ±
desviación estándar.
Ratón Tiempo inicial
Glucosa (mg/dL) Tiempo final
Glucosa (mg/dL)
1 124 113
2 168 124
3 131 138
Promedio 118.33±18.01 102±7
% disminución 16.33
Nota: Los datos representan el promedio 2n ± desviación estándar.
El nivel de glucosa disminuyo aproximadamente 16 mg/dL, con la infusión de flor de
sanguinaria con el extracto de acetona. Figura 15.
141±23.64
125±12.53
115.00
120.00
125.00
130.00
135.00
140.00
145.00
Co
ncen
tracio
n d
e g
luco
sa
(mg
/dL
Glucosa inicial
Glucosa final
48
Figura 15. Disminución del nivel de glucosa en sangre de los ratones, dosificados con la infusión
del extracto con acetona.
Con la infusión del extracto obtenido con hexanos se obtuvo un porcentaje de
disminución del 21.30 %, La tabla 15 muestra las concentraciones de glucosa que
presentaron los ratones.
Tabla 15. Niveles de la concentración de glucosa inicial y después de tres horas de haber
suministrado el extracto con hexanos de flor de sanguinaria, los promedios presentan ±
desviación estándar.
Ratón Tiempo inicial
Glucosa (mg/dL) Tiempo final
Glucosa (mg/dL)
1 118 96
2 107 69
3 113 101
Promedio 112.66±5.51 88.67±17.21
% disminución 21.30
Nota: Los datos representan el promedio 2n ± desviación estándar.
La concentración de glucosa que disminuyo con el extracto obtenido con hexano de la flor
de sanguinaria, fue de 24 mg/dL, Figura 16.
118.33±18.01
102±7
90.00
95.00
100.00
105.00
110.00
115.00
120.00
Co
ncen
tracio
n d
e g
luco
sa (
mg
/dL
Glucosa inicial
Glucosa final
49
.
Figura 16.Nivel de glucosa inicial y después de suministrar la infusión de flor de sanguinaria,
extracto obtenido con hexanos
El extracto con hexano es el que muestra un porcentaje de disminución del 21.30 %
siendo el mejor comparado con los extracto de acetona y de metanol. Figura 17.
Figura 17, Porcentajes des nivel de glucosa, con las infusiones de la flor de sanguinaria.
112.66±5.51
88.67±17.21
0
20
40
60
80
100
120
Co
ncen
tracio
n d
e g
luco
sa (
mg
/dL
Glucosa inicial
Glucosa final
11.35
13.80
21.30
1 % de disminución de glucosa
Metanol Acetona Hexanos
50
Capacidad Antiinflamatoria.
La capacidad antiinflamatoria de hierba del hielo (Gentiana spathacea Kunth), hierba del
cáncer (Cuphea aequipetala Cav.) y ahuehuete (Taxodium mucronatum) fue evaluada
mediante 2 procedimientos, uno a través la ingesta de infusión de los extractos con
hexanos, acetona y metanol únicamente para la hierba del hielo y hierba del cáncer; y el
otro procedimiento requirió de la preparación de un gel con el extracto de metanol para la
hierba del hielo y el ahuehuete. Los resultados se muestran a continuación.
Resultados de la capacidad antiinflamatoria ingerida se muestran en las Fig. 18 y 19.
Figura 18. % de inhibición de la hierba del cáncer con los extractos de hexanos, acetona
y metanol, y del fármaco, en la prueba antiinflamatoria. Los valores presentan ±
desviación estándar.
Figura 19. % de inhibición de los extractos (con diferentes solventes, metanol, acetona y
hexanos) de la hierba del hielo, presentan ± desviación estándar 2n, comparado con el
fármaco.
23,02±0,0011
25,67±0,0035
12,98±2,05E-3
12,52±7E-4
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
% In
hib
ició
n
Labymetacyn
Metanol
Hexano
Acetona
23,02±0,0011
10,50±1,66E-3
7,55±6,1E-4
6,63±2,4E-3
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
%in
hib
ició
n
Labymetacyn
Metanol
Hexanos
Acetona
51
Para la capacidad antiinflamatoria ingerida, los resultados de ambas plantas con los
diferentes solventes se muestran en las figuras 20 y 21, en ambas figuran muestran ± la
desviación estándar. Siendo indometacina el nombre comercial del fármaco utilizado.
Figura 20. % de inflamación de la hierba del hielo, hierba del cáncer, control y fármaco
Figura 21. % de inhibición de la hierba del hielo, hierba del cáncer y fármaco.
77,11±6,43E-4
82,62±9,07E-4
111,40±3,54E-4
75,27±1,21E-3
102,5±8,19E-4
82,54±1,08E-3
94,25±1,74E-3
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
120.00
% d
e I
nfl
am
ació
n
Labymetacyn
Hierba del cáncer Metanol Control
Hierba del cáncer Acetona Hierba del hielo Metanol Hierba del hielo Hexanos Hierba del hielo Acetona Hierba del cáncer hexanos
111,40±3,54E-4
23,02±1,19E-3
25,67±3,51E-3
12,98±2,05E-3
12,52±7,02E-4
10,49±1,66E-3
7,55±6,11E-4
6,62±2,5E-3
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
% d
e I
nh
ibic
ión
Fármaco
Hierba del cáncer Metanol
Hierba del cáncer Hexano
Hierba del cáncer Acetona Hierba del hielo Metanol
Hierba de hielo Hexanos
Hierba del hielo Acetona
52
Resultados de la capacidad antiinflamatoria en gel se muestran en las figuras 22 y 23.
Utilizando diprosone como fármaco en crema. Los valores presentan ± desviación
estándar 2n.
Figura 22. %de inflamación de la hierba del hielo, ahuehuete, fármaco y control
Figura 23. % de inhibición de la hierba del hielo, ahuehuete y fármaco
89,19±2,20E-3
74,14±4,16E-4
102,84±3,79E-4
66,17±1,07E-3
0
20
40
60
80
100
120 %
de I
nfl
am
ació
n
Control
Betametasona
Hierba del hielo
Ahuehuete
34,25±3,48E-3
34,25±3,48E-3
34,25±3,48E-3
0
5
10
15
20
25
30
35
40
% d
e i
nh
ibic
ión
Betametasona
Hierba del hielo
Ahuehuete
53
Discusión
Los alcaloides son metabolitos secundarios que contienen nitrógeno en sus estructuras,
son consideradas defensas de las plantas, se encuentran aproximadamente en un 20 %
de las plantas vasculares, (Lincon y Zeiger, 2006), en todos los extractos se encontraron
alcaloides.
Las plantas sintetizan una gran variedad de productos secundarios que contienen un
grupo fenol, un anillo aromático con un grupo hidroxilo, por ejemplo cumarinas,
flavonoides y taninos (Álvados G., et. Al, 2009), en el total de las muestras fueron
localizados uno a más del grupo de estos metabolitos.
En las muestras de ahuehuete, flor de la hierba del cáncer y la flor de la sanguinaria, se
encontró la presencia de quinonas, estos compuestos están íntimamente relacionados
con la actividad de repelencia por las plantas a poblaciones de insectos (Álvarez V.
2010).Los metabolitos secundarios en las plantas se localizan disueltos en el citoplasma o
formando sales que se encuentran incrustadas en las células, después de triturar la
planta, el material vegetal se ponen en contacto con un solvente (acetona o metanol). Con
el metanol como solvente de obtienen 2 fases, la fase no polar y la fase polar; en la fase
polar se localizan los metabolitos secundarios, pues el solvente tiende a extraer del
vegetal los compuestos más polares. La acetona en cambio es un solvente intermedio
entre los muy polares y los no polares, por lo que sirve para extraer conjuntamente
sustancias polares y no polares. El utilizar diferentes solventes propicia el arrastre de
diferentes metabolitos secundarios y de esta forma poder purificarlos más fácilmente.
En cuanto a la capacidad antioxidante, mediante el método DPPH, la flor de sanguinaria
presenta una mayor actividad con respecto a la hoja, siendo que en extracto acetona tuvo
una capacidad de 0.562 TEAC y su extracto metanólico fracción polar fue 0.462 TEAC,
mientras que para la hoja de sanguinaria la mayor actividad se presento en la fracción
metanólica de 0.419 TEAC fracción en la cual se presentaron la mayor parte de
metabolitos secundarios y en extracto por acetona fue de 0.335 TEAC.
En el caso de la hierba del cáncer, la mayor actividad antioxidante, fue con el solvente
acetona, siendo su concentración de 0.586 TEAC.
La hierba de hielo presento una actividad antioxidante de 0.392 TEAC en el extracto
metanólico fracción polar, que fue el extracto que presento la mayoría de los metabolitos,
mientras que en extracto con acetona, fue de 0.364 TEAC.
El extracto de ahuehuete que presento la mayor actividad antioxidante fue el extracto con
acetona, de 0.602 TEAC, seguido del extracto metanólico fracción no polar con 0.544
TEAC.
54
Por otro lado, las concentraciones con ABTS fueron mayores para todas las plantas,
siendo el extracto metanólico polar de hoja de sanguinaria el mayor con 40.047 TEAC,
seguido por ahuehuete fracción no polar con 39.97 TEAC.
Mientras que los extractos con acetona de hierba del cáncer y sanguinaria flor, presentan
29.22 TEAC y 19.80 TEAC respectivamente.
Los extractos que presentaron a mayor actividad antioxidante (hierba de cáncer,
Ahuehuete, flor de sanguinaria y hierba del hielo), también presentaron metabolitos
pertenecientes a compuestos fenólicos. Los compuestos fenólicos se encuentran en
grandes cantidades en el reino vegetal, y se han demostrado tener múltiples funciones
biológicas, incluyendo la actividad antioxidante. (Kaplan M. y Aviram, 2004, Ricardo Da
Silva et. Al, 1991, Satom et. Al., 1996).
Posteriormente se determino la concentración de flavonoides, fenoles y taninos, estos
pertenecen a los compuestos fenólicos los cuales se encuentran ampliamente distribuidos
en la naturaleza y poseen una poderosa actividad antioxidante debido a su estructura
química ya que actúan como captores de radicales libres neutralizando a las especies
reactivas de oxígeno. Se observa que para la extracción con acetona la hierba del hielo
presenta más concentración de taninos (13.96 mg eq. Acido tánico/ g muestra), mientras
que el resto de las plantas presentaron una concentraciones cercanas a 4.5 mg eq. Acido
tánico/ g muestra. Para la determinación de fenoles, la hierba del hielo presenta 45.45 mg
eq. Acido galico/g muestra, mientras que la hoja de sanguinaria presento una
concentración mayor, 51.43 eq. Acido galico/g muestra. La flor de sanguinaria presento
una concentración de flavonoides de 29.12 mg Eq de rutina/2g de muestra, siendo la
mayor esta y contrastando con la menor concentración, perteneciente a la hoja de la
misma con 0. 51 mg Eq de rutina/2g de muestra.
Anteriormente se mencionó la importancia de la actividad antioxidante en problemas
relacionados con un alto nivel de glucosa en sangre y la capacidad que tienen algunos
compuestos para reducir estos niveles, por lo tanto determinar la capacidad
hipoglucemiante de distintos compuestos se ha convertido en un potencial para distintas
áreas de la salud. Dicha capacidad fue determinada en la hoja y flor de sanguinaria
utilizando 3 solventes orgánicos, y los resultados obtenidos indican que tanto hoja como
flor presentaron una mayor capacidad hipogucemiante (medida como % de disminución
de glucosa) cuando se trataron las muestras con hexanos siendo 25% de disminución
para hoja, y 21% de disminución para flor. Por lo tanto comparando ambos datos la hoja
de sanguinaria resulta ser más efectiva para disminuir los niveles de glucosa en sangre.
Si bien la cuantificación de compuestos fenólicos no se realizó con hexanos sino con
acetona, posiblemente los hexanos extraen de la planta mayor cantidad de los
compuestos fenólicos asociados a la capacidad hipoglucemiante.
En cuanto a la capacidad antiinflamatoria de la hierba del hielo, hierba del cáncer y
ahuehuete se realizaron dos procedimientos, el primero se trata de suministrar de manera
55
oral el extracto obtenido con los tres solventes, únicamente para hierba del hielo y hierba
del cáncer, mediante este procedimiento dichos extractos actúan como agentes
preventivos ante la inflamación sin embargo el segundo procedimiento realizado para
ahuehuete y nuevamente hierba del hielo, que se basa en la aplicación de un gel que
contiene el extracto, actúan una vez que ya se ha presentado la inflamación.
En cuanto al primer procedimiento se obtuvo un mayor porcentaje de inhibición por parte
de la hierba del cáncer (25%) cuando se utiliza metanol como solvente orgánico, El
segundo mejor porcentaje de inhibición pertenece al fármaco (23%), por otro lado para la
hierba del hielo se obtuvieron porcentajes muy bajos con los 3 solventes.
Por otro lado también se determinó el % de inflamación que presentan ambas plantas,
siendo la hierba del cáncer, tratada con hexanos, la que presenta un valor mayor, este de
111%.
Para el caso cuando se utiliza el extracto como gel se obtiene un alto porcentaje de
inhibición por parte del fármaco, 34%, seguido por la hierba del hielo, 21%, y por último el
ahuehuete, 17%. Si bien se esperaba que alguna de las plantas presentara mayor
efectividad en comparación con el fármaco esto se puede deber a que los extractos no se
encuentran puros ya que la extracción no sirve únicamente para compuestos fenólicos,
asi que el extracto contiene más metabolitos secundarios que pueden interferir; por otro
lado el fármaco se encuentra en estado puro por lo que le permite disminuir la inflamación
con mayor efectividad.
En cuanto al porcentaje de inflamación la hierba del hielo presenta 102% siendo este el
más alto en comparación con el ahuehuete (66%), el fármaco (74%) y el control (89%).
56
Conclusiones En base a los resultados obtenidos, se obtienen más metabolitos secundarios cuando se
extrae con metanol, estos pueden quedar solubles en la fase polar y en la no polar por lo
que se tiene más cantidad de ellos.
Por otro lado, la hierba de hielo presenta mayor cantidad de compuestos fenólicos debido
a que en la determinación de fenoles, flavonoides y taninos es esta planta la que tiene
mayor concentración comparada con las demás. Esto está relacionado con su capacidad
antioxidane y antiinflamatoria.
En cuanto a la capacidad antioxidante por el método ABTS, la hierba del hielo presentó
mayor capacidad a diferencia de las demás plantas. Además los resultados demostraron
que para este método se obtiene mayor capacidad cuando se utiliza metanol como
solvente, puesto que las capacidades más altas pertenecen a las plantas tratadas con
este solvente.
Para la capacidad antioxidante por el método DPPH el ahuehuete presenta una mayor
capacidad frente a las demás plantas, sin embargo al igual que para el método ABTS en
este se obtiene una capacidad más alta cuando se tratan las muestras con acetona, ya
que las capacidades más altas se obtuvieron utilizando este solvente.
Los resultados obtenidos para la capacidad hipoglucemiante demuestran que la
sanguinaria hoja es la más efectiva para disminuir la glucosa en la sangre cuando se
utiliza hexanos como solvente, en cuanto a la flor de sanguinaria su porcentaje de
disminución es mejor al utilizar metanol como solvente.
La actividad antiinflamatoria se puede determinar de dos maneras, como preventivo y
como correctivo, el primero se presenta cuando se quiere evitar la inflamación y el
segundo cuando ya existe la inflamación pero se quiere reducir; en el primer caso la
hierba del cáncer tratada con metanol presentó un mayor porcentaje de disminución, para
el segundo caso fue el fármaco quien actuó con mayor efectividad para reducir la
inflamación.
57
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59
Anexos
Anexo A. Cuantificación de compuestos fenólicos.
Fenoles
Para el cálculo de la concentración de fenoles se obtiene una absorbancia, la cual se
multiplica por el factor de dilución utilizado. Posteriormente se utiliza la ecuación obtenida
de la regresión de la curva tipo de ácido gálico que se muestra a continuación:
En donde la variable “y” pertenece a la absorbancia medida en nm y la incógnita “x”
pertenece a la concentración en mg/ml de ácido gálico de fenoles totales. Despejando “x”:
En donde:
FD=Factor de dilución utilizado
Posteriormente se utiliza la siguiente ecuación para determinar los mg equivalentes de
ácido gálico por g de muestra:
En donde:
C.ácido gálico= Concentración de la absorbancia obtenida (mg/ml)
V=Volumen del extracto obtenido (ml)
W=Peso de las hojas utilizadas para el extracto (g)
Flavonoides
Para el cálculo de la concentración de flavonoides se obtiene una absorbancia, la cual se
multiplica por el factor de dilución utilizado. Posteriormente se utiliza la ecuación obtenida
de la regresión de la curva tipo de rutina que se muestra a continuación:
En donde la variable “y” pertenece a la absprbancia medida en nm y la incógnita “x”
pertenece a la concentración en mg/ml de rutina de flavonoides. Despejando “x”:
Posteriormente se utiliza la siguiente ecuación para determinar los mg equivalentes de
rutina por 4g de muestra:
60
En donde:
Cácido gálico= Concentración de la absorbancia obtenida (mg/ml)
V=Volumen del extracto obtenido (ml)
W=Peso de las hojas utilizadas para el extracto (g)
Taninos
Para el cálculo de la concentración de taninos se obtiene una absorbancia, la cual se
multiplica por el factor de dilución utilizado. Posteriormente se utiliza la ecuación obtenida
de la regresión de la curva tipo de ácido tánico que se muestra a continuación:
En donde la variable “y” pertenece a la absprbancia medida en nm y la incógnita “x”
pertenece a la concentración en mg/ml de ácido tánico de taninos. Despejando “x”:
Posteriormente se utiliza la siguiente ecuación para determinar los mg equivalentes de
ácido tánico por 5g de muestra:
En donde:
Cácido gálico= Concentración de la absorbancia obtenida (mg/ml)
V=Volumen del extracto obtenido (ml)
W=Peso de las hojas utilizadas para el extracto (g)
Anexo B. Determinación de la capacidad antioxidante
a) Método DPPH
Para iniciar es necesario obtener el porcentaje de inhibición mediante la siguiente
ecuación:
Posteriormente para determinar la capacidad antioxidante en equivalente de Trolox
(TEAC) se utiliza la ecuación de la recta de la curva tipo:
En donde:
y=% inhibición
x= Concentración de Trolox (mM)
61
Se despeja “x” de la ecuación:
Finalmente para conocer los equivalentes de Trolox (TEAC) se utiliza la siguiente
ecuación:
En donde:
Ctrolox=Concentración de Trolox de la absorbancia obtenida (mM)
V=Volumen del extracto obtenido (ml)
W=Peso de las hojas utilizadas (g)
TEAC=Capacidad antioxidante en TEAC (mg eq. De Trolox /1g de muestra)
b) Método ABTS
Para iniciar es necesario obtener el porcentaje de inhibición mediante la siguiente
ecuación:
Posteriormente para determinar la capacidad antioxidante en equivalente de Trolox
(TEAC) se utiliza la ecuación de la recta de la curva tipo:
En donde:
y=% inhibición
x= Concentración de Trolox (mM)
Se despeja “x” de la ecuación:
Finalmente para conocer los equivalentes de Trolox (TEAC) se utiliza la siguiente
ecuación:
En donde:
Ctrolox=Concentración de Trolox de la absorbancia obtenida (mM)
V=Volumen del extracto obtenido (ml)
W=Peso de las hojas utilizadas (g)
TEAC=Capacidad antioxidante en TEAC (mg eq. De Trolox /1g de muestra)
62
Anexo C. Cálculos para las pruebas in vivo.
a) Capacidad hipoglucemiante
Para iniciar se deben obtener los promedios de los tiempos 0 y 3h, esto se obtiene
sumando la glucosa en mg/dl dividido entre el numero de ratones. Posteriormente para la
determinación del porcentaje de disminución se utiliza la siguiente fórmula:
En donde la glucosa final pertenece al promedio de glucosa después de 3h del inicio del
experimento y la glucosa inicial pertenece al promedio de glucosa al inicio del
experimento.
Dosis Suministradas
Las dosis suministradas a los ratones fueron de 50 mg de extracto/100 µL agua, a cada
ratón.
Los cálculos que se realizaron fueron:
Donde:
EO= extracto obtenido (mg)
P2= peso del frasco con el extracto (mg)
P1=peso del frasco vacio (mg)
Preparación de la infusión
Donde:
VA= volumen de agua para disolver el extracto (µL)
EO=extracto obtenido (mg)
VS=volumen de agua suministrado (µL)
PeS=peso del extracto suministrado (mg)
Ejemplo extracto metanólico de hoja de sanguinaria
A cada ratón se le suministro 100 µL de la infusión preparada.
63
b) Capacidad antiinflamatoria
Para el cálculo de la capacidad antiinflamatoria de debe conocer el porcentaje de
inflamación y el porcentaje de inhibición, las formulas para cada cálculo de muestran a
continuación:
Para determinar el porcentaje de inflamación se utiliza la siguiente fórmula:
Para determinar el porcentaje de inhibición se utiliza la siguiente fórmula:
A continuación se muestra la dosis suministrada a cada los ratones:
Prueba con extracto ingerido
Los cálculos que se realizaron fueron:
Donde:
EO= extracto obtenido (mg)
P2= peso del frasco con el extracto (mg)
P1=peso del frasco vacio (mg)
Preparación de la infusión
Donde:
VA= volumen de agua para disolver el extracto (µL)
EO=extracto obtenido (mg)
VS=volumen de agua suministrado (µL)
PeS=peso del extracto suministrado (mg)
Ejemplo extracto de hierba del hielo con acetona
A cada ratón se le suministro 50 mg de extracto/100 µL de agua.
64
Prueba con aplicación de gel.
Los cálculos que se realizaron fueron:
Donde:
EO= extracto obtenido (mg)
P2= peso del frasco con el extracto (mg)
P1=peso del frasco vacio (mg)
Preparación de gel
Donde:
Pgel= peso del gel preparado sin extracto (mg)
EO=peso del extracto obtenido.
Ejemplo de extracto de ahuehuete
La dosis suministrada a los ratones fue de 50 mg de extracto/1 g de gel.
