Profesor Patrocinante Dr. Danilo González Nilo Centro de Bioinformática y Simulación Molecular Universidad de Talca. Profesor Co-Patrocinante Dr. Ricardo Ugarte Instituto de Química Facultad de Ciencias Universidad Austral de Chile, Valdivia.

DETERMINACIÓN DE LOS PERFILES DE ENERGÍA LIBRE DE UNIÓN DE LOS IONES POTASIO EN EL CANAL h Slo UTILIZANDO

SIMULACIONES DE DINÁMICA MOLECULAR DIRIGIDA

Tesis de grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y al Título Profesional de Bioquímico.

MARCO ANTONIO VIDAL JIMÉNEZ

VALDIVIA, CHILE

Agosto 2009

AGRADECIMIENTOS

Concretar el sueño de ser profesional para un joven con mi historia es difícil, me he

esforzado en hacerlo con alegría, optimismo y mucho sacrificio. He alcanzado una estrella

que quiero compartir con aquellos que me acompañaron en esta aventura del conocimiento

y crecimiento personal.

Quisiera agradecer a mi familia: a mi Madre y a mi Abuela por sembrar en mi la semilla

de la superación, a mis hermanas: Jasmin, Evelyn y Anais, por comprender mis deseos de

estudiar y viajar. Por el ánimo y la paciencia que me han brindado, por darme la dicha de

ser tío de esos tres angelitos: Bianca, Matías y Cristóbal.

Agradezco a esos innumerables (sin nombre para no caer en la desgracia de olvidar a uno)

amigas y amigos que, de una u otra manera me acompañaron en mi carrera compartiendo

sus bendiciones conmigo, muchos de ellos(as) me brindaron un hogar cuando fue necesario,

gracias a ellos, tengo la dicha de contar con muchas familias que me quieren como uno más

de su casa.

Agradezco al Dr. Danilo González, profesor patrocinante de ésta tesis, por exigirme,

enseñarme e integrarme al Centro de Bioinformática y Simulación Molecular de la

Universidad de Talca, en este caminar pude conocer a personas de excelente calidad

académica. Con muchos compartí conocimientos, amistad y ayuda para terminar esta

última etapa de estudiante: Ariela, Cristell, Mario, Héctor, Wendy y Julio.

Gracias a Gabriela Soto por su humor, por enseñarme cada día a ser mejor persona. Por

hacerme ver que, de lo cotidiano y sencillo podemos hacer algo increíblemente maravilloso.

Agradezco a los proyectos patrocinantes de mi tesis FONDECYT 1040254 (Fernando

González Nilo), FONDECYT 1030830 (Ramón Latorre) y PBCT ACT/24 (FGN).

i

INDICE DE CONTENIDOS

Pag.

1.- RESUMEN 1

1.- SUMMARY 2

2.- INTRODUCCIÓN 3

2.1.- Antedecentes generales 3

2.2.- Canal de potasio hSlo 4

2.3.- Modelamiento por homología del canal hSlo 6

2.4.- Aproximaciones de cálculos en canal de potasio 12

2.5 - Aproximaciones computacionales en el canal de potasio hSlo 15

HIPÓTESIS 16

OBJETIVOS 16

Objetivo general y especificos 16

3.- MATERIALES Y MÉTODOS 17

3.1.- Programas e Implementación computacional 17

A) Programas 17

B) Equipamiento computacional 18

3.2.- Dinámica molecular dirigida (Steered molecular dynamics, SMD) 19

3.3.- Simulación de SMD 21

3.4.- Cálculo del PMF desde trayectorias de SMD 22

3.5.- Cálculos de densidad iónica 25

ii

Pag.

4.- RESULTADOS 27

4.1 Análisis estructural del canal 27

4.2 Representación del modelo para los sistemas de estudio 30

4.3 Análisis de la simulación de la SMD 32

4.4 Trayectoria del átomo dirigido y cálculo de la fuerza aplicada en las 32

simulaciones de SMD para el canal silvestre y para las mutantes F380I

y E386N/E389N

4.5 Cálculo del trabajo aplicado y del perfil de energía libre a las simulaciones de 33

SMD para el canal silvestre y para las mutantes F380I y E386N/E389N

4.6 Cálculo de las moléculas de aguas que solvatan al ión K+ en la región 40

intracelular del canal con respecto a una coordenada de reacción en el

eje Z (en Å) para canal hSlo silvestre y la mutante F380I

4.7 Cálculo de densidad iónica en el canal hSlo para el canal silvestre y para la 44

doble mutante E386N/E389N sobre la coordenada de reacción en el eje Z

5.- DISCUSIÓN 46

6.- CONCLUSIÓN 58

7.- BIBLIOGRAFÍA 60

iii

INDICE DE FIGURAS

Pag.

Figura 1.- Estructura del canal hSlo 7

Figura 2.- Visualización de canales de potasio 8

Figura 3.- Modelo del poro del canal de potasio hSlo 10

Figura 4.- Representación de la construcción del sistema (caja) 11

Figura 5.- Cálculo de campo de fuerza 14

Figura 6.- Steered Molecular Dynamics (SMD) 20

Figura 7.- Visualización de la trayectoria del ión potasio en el canal silvestre hSlo 28

Figura 8.- Alineamiento múltiple de secuencia 29

Figura 9.- Representación del modelo obtenido para el poro de hSlo para el canal 31

silvestre y mutantes.

Figura 10.- Trayectoria del ión potasio y cálculo de la fuerza aplicada a las simulaciones 34

de SMD respecto a una coordenada de reacción en el eje Z para hSlo y F380I

Figura 11.- Trayectoria del ión potasio y cálculo de la fuerza aplicada a las simulaciones 35

de SMD respecto a una coordenada de reacción en el eje Z para hSlo

y E386N/E389N.

Figura 12.- Trayectoria del ión potasio y cálculo de la fuerza aplicada a las simulaciones de 36

SMD representadas con respecto al tiempo de cálculo (en ns) para hSlo y F380I

Figura 13.- Cálculo del trabajo y del perfil de energía libre con respecto a una coordenada 38

de reacción en el eje Z (en Å) para hSlo y F380I

iv

Pag.

Figura 14 Cálculo del trabajo y del perfil de energía libre con respecto a una 39

coordenada de reacción en el eje Z (en Å) para hSlo y E386N/E389N

Figura 15 Moléculas de aguas que solvatan al ión K+ en la región intracelular del 41

canal con respecto a una coordenada de reacción en el eje Z (en Å) para

canal hSlo silvestre y la mutante F380I

Figura 16 Visualización de la cantidad de moléculas de agua en la trayectoria del ión 42

potasio para el canal silvestre

Figura 17 Visualización de la cantidad de moléculas de agua en la trayectoria del ión 43

potasio para el canal mutante F380I

Figura 18 Densidad local de iones potasio respecto a una coordenada de reacción 45

en el eje Z para canal silvestre y para la doble mutante E386N/E389N

Figura 19 Cálculo del perfil de energía libre para el canal silvestre hSlo 49

Figura 20 Rol del residuo de fenilalanina en la conductancia del canal hSlo 53

Figura 21 Rol de los residuos de E386 y E389 en la conductancia del canal hSlo 57

v

SIMBOLOGÍA

Å: Armstrong

Ca++: Calcio

DM: Dinámica molecular

K+: Potasio

fs: femtosegundo

hSlo: canal de potasio humano dependiente de voltaje y de Ca++ intracelular, en donde la

subunidad α es codificada por un gen denominado slowpoke (Slo).

KCl: Cloruro de potasio

NAMD: programa Nanoescalable Molecular Dynamics

PMF: Potencial de fuerza media, es el perfil de energía libre en una coordenada de reacción

POPC: Bicapa palmitoiloleil-fosfatidilcolina

ps: picosegundo

pS: picoSiemens

S: Segmentos transmembranales

S: sitio de unión del ión potasio en el filtro selectividad del canal potasio

SMD: Steered Molecular Dynamics o Dinámica Molecular Dirigida

VMD: programa Visual Molecular Dynamics

1

1.- RESUMEN

hSlo es un canal de potasio humano dependiente de voltaje y de Ca++ intracelular que presenta

una alta conductancia de K+ (250 pS) y posee un motivo estructural (GYGD, filtro de

selectividad) que selecciona K+ por sobre otros cationes monovalentes. Se examinó la estructura

de hSlo buscando residuos claves en el vestíbulo intracelular del canal que explicaran esta alta

conductancia. Se determinó que un residuo de fenilalanina (F380), situado en el vestíbulo

intracelular, es clave en la conducción del ión. En base a los datos experimentales previos, se

propuso generar una mutante in silico para el residuo F380I y también para los residuos

E386N/E389N, estudiados por Brelidze y cols. (2003). Una vez generadas las mutantes in silico

en un modelo molecular de hSlo, se procedió a analizar la energía libre mediante simulaciones de

dinámica molecular (DM). Dentro de las simulaciones de DM escogimos la metodología de

Dinámica Molecular Dirigida, que aplica vectores de fuerzas externas dependientes del tiempo a

uno o más átomos en un sistema molecular, para estudiar las mutantes del vestíbulo intracelular

de hSlo. Las simulaciones con SMD, permiten obtener un perfil de energía libre a lo largo de una

coordenada de reacción (PMF).

Los resultados de dinámica molecular muestran que la ausencia de los glutámicos en la región

intracelular disminuye la concentración local de iones K+ en esta región y además se

desestabilizan los iones K+ presentes en el filtro de selectividad. El rol de los aminoácidos E386 y

E389 es esencial en la estabilización de los iones en el vestíbulo intracelular del canal hSlo. El

resultado del cálculo de PMF indica que el aminoácido F380 es esencial en el transito del K+

entre el filtro de selectividad y el vestíbulo intracelular porque facilita la desolvatación del ión

K+, contribuyendo este residuo en un pasaje más rápido para el ión K+.

2

1.1.- SUMMARY

hSlo is a human Ca++-voltage-activated potassium channels that have the largest single-channel

conductance of K+ (250 pS) and has a structural segment (GYGD, selectivity filter) that selects

K+ ions over other monovalent cations. The structure of hSlo was examined finding for residues

in the intracellular vestibule of the channel to explain this high conductance. It was determined

that a phenylalanine residue (F380) located at the intracellular vestibule has a key role in the

conduction of K+ ions. Based on previous experimental data, it was proposed to generate in silico

mutants: F380I and E386N/E389N previously studied by Brelidze and cols. (2003). The free

energy profile of the K+ ion movement through hSlo was determined by using Steered Molecular

Dynamics (SMD). SMD applies vectors of external forces dependent on the time to one or more

atoms in a molecular system. In this sense, these simulations are usually used to determine free

energy profiles along a coordinate of reaction (PMF).

The results of SMD show that the absence of glutamic acid in the intracelular region decreases

the local concentration of K+ ions in this region and further destabilize the K+ ions in the

selectivity filter. Residues E386 and E389 are essential in the stabilization of ions in the

intracellular vestibule of the hSlo channel. The resultant PMF indicates that the amino acid F380

is essential in the transit of K+ ion between the selectivity filter and intracellular vestibule.

Addittionally, it facilitates the desolvatación of K+ ions, and contributes to a faster passage for the

K+ ion.

3

2.- INTRODUCCIÓN

2.1.- Antecedentes generales

La membrana plasmática es una bicapa de lípidos que permite preservar la integridad de la célula.

Para cumplir esta función la membrana se asocia a diversas proteínas. Dentro de las proteínas de

membrana están los canales de iones que regulan el paso de cationes y aniones de manera

selectiva a través de la membrana celular.

En una clasificación general podemos distinguir dos grupos fundamentales: los canales iónicos

altamente selectivos y los canales iónicos poco selectivos. En el primer grupo encontramos a los

canales de K+, Na+, Ca+ y Cl-, en donde es importante destacar la gran selectividad de los canales

de K+, que son capaces de discriminar el ión K+ con una eficiencia 100 veces mayor sobre el ión

Na+ con igual carga y menor radio atómico. En el segundo grupo encontramos los canales de

acetilcolina y los canales activados por AMPC y CMPC, éstos son menos selectivos y conducen

indistintamente K+, Na+ y Ca+ (Hille, 2001).

El paso de iones produce una corriente que depende del voltaje de transmembrana que se

imponga. La razón corriente/voltaje se conoce como conductancia y es el inverso de la resistencia

(1/R); la conductancia es por tanto la corriente medida a determinado voltaje.

Los canales de iones pueden adoptar dos conformaciones: cerrados y abiertos. En condiciones

basales se encuentran cerrados y no hay conducción de iones. Una vez que el canal ha sido

activado, se produce la apertura del poro y la conducción de los iones se realiza a favor del

gradiente electroquímico. Algunos canales son activados por cambios en el potencial eléctrico a

través de la membrana, estos canales se definen como dependientes de voltaje (Hille, 2001).

4

En la familia de canales de iones se encuentran los canales de potasio (K+) dependientes de

voltaje (Kv), que se abren y cierran cuando hay cambios en el potencial de transmembrana. Los

canales de K+ son proteínas fundamentales en la transmisión de señales eléctricas en el sistema

nervioso.

La apertura de estos canales también puede ser regulada por otros estímulos, ya sean ligandos

químicos (neurotransmisores) o bien por cationes, por ejemplo Ca2+. Dentro de esta familia

existen miembros de activación mixta como el canal hSlo.

2.2.- Canal de potasio hSlo

El canal iónico humano hSlo (también llamado Maxi-KCa o BK), es un canal de K+ activado por

calcio intracelular y por cambios en el voltaje de transmembrana. El Ca2+ actúa disminuyendo la

diferencia de energía que separa el estado cerrado del abierto (Díaz y col., 1998; Haug y col.,

2004). Estos canales facilitan un amplio repertorio de funciones fisiológicas como la contracción

del músculo liso, regulación de la liberación de neurotransmisores y regulación de células

ciliadas en la cóclea (Toro y col., 1998; Haug y col., 2004). Comprender los principios

fundamentales de estas proteínas permitirá expandir el conocimiento de las bases moleculares de

muchas enfermedades neurodegenerativas.

El canal hSlo estructuralmente es un tetrámero, formados por 4 subunidades α y desde 1 a 4

subunidades β, en donde cada subunidad atraviesa la membrana celular (Hille, 2001). La

subunidad α forma el túnel acuoso o poro de conducción por donde los iones atraviesan la

membrana, la subunidad β es una proteína accesoria y tiene una función reguladora. La

subunidad α parece ser codificada por un solo gen denominado slowpoke (Slo).

5

La estructura primaria de hSlo es similar en aproximadamente un 97% con la secuencia de los

canales de potasio codificados por el gen slowpoke en otros organismos (mSlo (Mus musculus),

dSlo (Drosophila melanogaster), pSlo (Periplaneta americana), etc). El canal hSlo tiene una

baja identidad con el resto de los canales Kv, alrededor del 30%.

La subunidad α de todos los canales Kv contiene 6 segmentos transmembranales (S1-S6),

incluyendo un sensor de voltaje (S4) y una región P (S5-S6) que forma el poro o vía de

conducción (ver figura 1A). Dentro del poro encontramos el vestíbulo intracelular y la secuencia

TVGYGD conocida como el filtro de selectividad que es la responsable de la selectividad de

iones potasio por sobre otros cationes monovalentes. Esta secuencia (TVGYGD) es lo único que

se conserva idéntico entre los canales codificados por el gen slowpoke y el resto de los canales Kv

(ver figura 1B). El filtro de selectividad esta constituido por 4 cadenas de la secuencia TVGYGD

(una de cada monómero), con los oxígenos del carbonilo (de cada aminoácido) mirando hacia el

centro del poro, (ver figura 2). Esta configuración provee 5 sitios de unión al ión K+ (S0, S1, S2,

S3 y S4) ocupados por iones K+ o por moléculas de agua, por lo tanto, cada sitio de unión (S0-

S4) esta rodeado de 8 átomos de oxígenos (Bernèche y Roux, 2003; Zhou y MacKinnon, 2004;

Treptow y Tarek, 2006).

La diferencia principal entre hSlo y los otros canales de potasio es que en el primero se presenta

una conductancia elevada, de 100 a 250 pS y en los canales no codificados por el gen slowpoke la

conductancia no sobrepasa los 100 pS (Hille, 2001; Brelidze y col., 2003).

El canal de potasio hSlo permite una rápida (108 iones/segundo) y selectiva conducción de iones

K+ a través de la membrana (Khalili-Araghi y col., 2006).

En el canal hSlo existe además un séptimo dominio de transmembrana S0, presentándose el

extremo amino en el espacio extracelular a diferencia de los canales de potasio Kv que se

6

presenta en el espacio intracelular, lo que se traduce en que el segmento S0 de hSlo permita la

modulación del canal por subunidades accesorias β. El largo segmento carboxi terminal que

presenta el canal hSlo en la región intracelular comprende dos tercios de la proteína con 4

segmentos S7- S10 (Toro y col., 1998), (ver figura 1A). Entre los segmentos S9-S10, se

encuentra un segmento rico en residuos de aspartato que une los iones Ca2+ y se denomina

“calcium bowl” (Orio y col., 2002).

2.3.- Modelamiento por homología del canal hSlo

La obtención de modelos de buena calidad requiere de un refinado alineamiento múltiple de los

canales de K+, pero debido al bajo porcentaje de identidad de secuencia que existe entre los

miembros de esta familia, ha sido difícil lograr un alineamiento global satisfactorio de los

segmentos transmembranales S1 a S6, por lo cual se determinó enfocarse sólo en la región del

poro para realizar el alineamiento múltiple (S5 a S6). (ver figura 1B).

Se construyó un modelo por homología del canal hSlo en estado abierto, utilizando como

templado las estructuras cristalizadas de la base de datos Protein Data Bank (PDB) de los canales

de potasio MthK (PDB: 1LNQ) y KcsA (PDB: 1K4C). El uso de dos templados permitió generar

un modelo con mejor información de las cadenas laterales (Carvacho y col., 2008) (Figura 2).

Dicho modelo fue realizado usando ICM (Abagyan y col., 1994) y las cadenas laterales se

sometieron a una minimización de energía en CHARMm (Brooks y col., 1983). La resolución de

estructuras por difracción de rayos X de los canales de potasio KcsA y MthK, entregó datos

acerca de la relación estructura-función del filtro de selectividad y del poro (Doyle y col., 1998;

Zhou y col., 2001; Long y col., 2005).

7

Figura 1.- Estructura del canal hSlo. A) Topología de las subunidades α y β del canal hSlo.

Dentro de la subunidad α se encuentra el poro entre los segmentos S5 y S6, caracterizándose por

un diámetro de poro pequeño por donde los iones pasan en columna (modificado de Orio y col.,

2002). B) Alineamiento múltiple de secuencia. Segmento transmembranal S6, filtro y P-hélice de

los canales de K+ dependiente de voltaje, utilizando ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/).

Como referencia para los alineamientos se utilizó la secuencia conservada TVGYGD del filtro de

selectividad (en cuadrado azul). En la columna de la izquierda se muestra los valores de

conductancia de menor a mayor de los canales de potasio. (Modificado Carvacho y col., 2008).

8

Figura 2.- Visualización de canales de potasio: A) y B) son los canales cristalizados KcsA y

MthK respectivamente, C) el canal modelado de hSlo, indicando la posición de la coordenada de

reacción en el eje Z (en Å) y las zonas extracelular, filtro de selectividad e intracelular del canal.

El canal modelado fue construido utilizando como estructura de referencia KcsA y

posteriormente los segmentos S5 y S6 se movieron hasta lograr la conformación del esqueleto de

MthK para su estado abierto.

B A

A A

C A

Å

Filtro de selectividad

Extracelular

Intracelular

9

En el modelo del canal hSlo se insertaron en el filtro de selectividad 3 iones K+ (en los sitios S0,

S2 y S4) y 2 moléculas de agua (en S1 y S3) (ver figura 3). El modelo fue relajado por más de 5

ns bajo condiciones periódicas de borde, insertado en una bicapa de lípidos de palmitoiloleil-

fosfatidilcolina (POPC), en una solución con 110 mM de KCl y agua explicita (TIP3). Las

dimensiones del sistema (o de la caja) fueron de 102,7 Å, 101,0 Å y 92,2 Å. El tamaño del

sistema es de 78.132 átomos (figura 4).

La relajación del modelo, bajo condiciones periódicas de borde, se realiza con el programa de

NAMD2.6 (Kalé y col., 1999). Este programa fue desarrollado para realizar simulaciones de

dinámica molecular de sistemas biomoleculares, empleando la mejor tecnología disponible para

entregar la máxima resolución posible. Un tutorial acerca de este programa se encuentra en la red

(http://www.ks.uiuc.edu/Training/Tutorials/). NAMD se utiliza en computadoras en paralelo con

varios procesadores, como por ejemplo, el Servidor de cálculo ALTIX350 (SGI): 16

procesadores por 1,5 GHz y 16 Gb Memoria RAM compartida (ver Materiales).

10

Figura 3.- Modelo del poro del canal de potasio hSlo (en azul): sólo se muestran 2 de los 4

monómeros. Se indican el filtro de selectividad (en cyan), 3 iones potasio (en verde) en los sitios

de unión S0, S2 y S4 y dos moléculas de agua que se presentan en los sitios de unión S1 y S3. En

el aumento al filtro de selectividad, se indican los aminoácidos estructurales TVGYG (secuencia

conservada en todos los canales de potasio) que forman los sitios de unión desde S0-S4.

11

Figura 4.- Representación de la construcción del sistema (caja): En la parte superior se

muestra el sistema desde arriba del canal (desde el extracelular), en la parte inferior se muestra el

sistema transversal a la membrana. De izq. a der.) El canal hSlo (representado en cartoon y new

cartoon de color morado) con 3 iones K+ (esferas verdes), insertados en una membrana de lípidos

POPC (en color cyan), solvatados en agua (en rojo) y en una concentración de 110 mM de KCl

(representado en esferas amarillas).

12

2.4.- Aproximaciones de cálculos en canal de potasio

En todos los canales de potasio se presenta la misma secuencia aminoácidica (TVGYGD) en el

filtro de selectividad, tanto en los canales de alta o baja conductancia. Entonces, ¿como se podría

explicar la alta conductancia en el canal hSlo?

Datos experimentales y teóricos sugieren que los residuos cargados presentes en el vestíbulo

intracelular y en el poro pueden tener un rol clave en el control de la conductancia unitaria

mediante un mecanismo electrostático (Brelidze y col., 2003; Olcese y col., 2005). Se ha

observado que mutaciones de residuos cargados disminuyen la conductancia a potenciales

positivos (Guidoni y col., 1999).

Esta información junto con los avances metodológicos en simulaciones moleculares y el aumento

en el poder computacional, nos permitieron realizar estudios in silico de las características

energéticas del canal hSlo y relacionarlas con la disposición de sus aminoácidos cargados y a su

vez con la influencia de estos aminoácidos en la conductancia (Starace y Bezanilla, 2004; Lainé y

col., 2003; Bezanilla, 2000).

Las simulaciones de Dinámica Molecular (DM) basadas en modelos atómicos (McCammon y

col., 1977) desempeñan un papel fundamental en la comprensión desde el punto de vista

estructural del fenómeno de conductancia. En las técnicas de DM se obtiene una visión atómica

que permite simular el movimiento de los átomos durante un corto periodo de tiempo. Estos

cálculos son de alto costo computacional. Por ejemplo, la simulación de un canal de K+ inmerso

en una membrana (aprox. 100.000 átomos) por un periodo de 10 ns (10x10-9 segundos) toma

cerca de 4 años de cálculo continuo en un computador de escritorio. Para solucionar este

problema estos cálculos se realizan en computadores de alto rendimiento que distribuyen los

13

cálculos en varias CPUs de última generación disminuyendo el cálculo en 10 días de cómputo

(utilizando 16 procesadores).

En DM una molécula es descrita como una serie de esferas con carga (átomos) unidas por

resortes (enlaces), en el cual se calcula el comportamiento dependiente del tiempo de un sistema

molecular. En las simulaciones de DM los átomos se mueven según la ecuación clásica de

Newton:

donde mα es la masa del átomo α, řα es la posición, y Utotal es la energía potencial total que

depende de todas las posiciones atómicas. La energía potencial es lo mas importante en una

simulación ya que representa la interacción entre un átomo con su entorno, uno asume que cada

átomo experimenta una fuerza, especificada por un modelo de campo de fuerza, con el resto del

sistema. Este campo de fuerza es necesario para calcular el mínimo energético o la energía de

minimización del sistema.

La energía de minimización permite identificar las conformaciones más estables. Se consigue

después de uno o más ajustes (varias iteraciones). La eficiencia estará dada por el tiempo que se

necesita para evaluar la función y la cantidad de ajustes estructurales (iteraciones) para alcanzar

el mínimo. La energía de minimización se obtuvo mediante el campo de fuerza de CHARMM28

(MacKerell y col., 1998).

Para determinar la energía potencial total NAMD emplea funciones matemáticas que entregan las

contribuciones de las energías enlazantes y no enlazantes:, (ver figura 5)

14

Figura 5.- Cálculo de campo de fuerza: El campo de fuerza es descrito como una sumatoria de

ecuaciones y constantes que reproducen la geometría molecular y propiedades selectivas de las

estructuras. Describe la energía de enlace r (estirar), ángulo θ (entre dos enlaces covalentes de un

átomo), dihedro φ (pares de átomos separados por 3 enlaces covalentes con un enlace central

sujeto a torción), y las energías no enlazantes de van der Waals e interacciones electrostáticas

(Phillips y col., 2005).

15

2.5.- Aproximaciones computacionales en el canal de potasio hSlo

Las simulaciones de DM, junto con un número de técnicas computacionales específicas, proveen

una solución práctica de los mecanismos que gobiernan la conductancia del canal de K+,

ofreciendo una vía para interpretar y relacionar medidas funcionales con la estructura proteica del

canal.

Una alternativa es la técnica de Dinámica Molecular Dirigida o Steered Molecular Dynamics

(SMD) (Jensen y col., 2002) en el cual fuerzas externas dependiente del tiempo se aplican a un

sistema, y las respuestas del sistema se analizan.

Esta técnica es un acercamiento computacional de gran alcance que puede caracterizar

cuantitativamente la energía libre que gobierna la dinámica de sistemas moleculares complejos.

También es posible con SMD supervisar los movimientos dinámicos en la presencia de fuerzas

externas para reproducir un cierto aspecto del ambiente, tal como tensión superficial de la

membrana (Gullingsrud y Schulten, 2003), el gradiente de presión hidrostático (Zhu y col., 2004)

o voltaje de transmembrana (Tieleman y col., 2001).

En simulaciones de SMD, las fuerzas externas dependiente del tiempo se aplican, por ejemplo, a

un ligando para facilitar su desacoplamiento de una proteína. El análisis de las interacciones del

ligando, así como la trayectoria de fuerzas aplicadas (en función de tiempo) y de la posición del

ligando, entregan una información estructural importante sobre las relaciones de la función

estructural de los complejos ligando-receptor, y de los mecanismos subyacentes a la selectividad

enzimática.

16

HIPÓTESIS

En la cavidad intracelular del canal hSlo existen zonas esenciales que modulan las propiedades

energéticas, estructurales y dinámicas permitiendo un eficiente transporte de iones potasio a

través de esta región.

OBJETIVOS

Objetivo general

1. Analizar los perfiles de energía libre de unión del K+ en la cavidad del canal hSlo en la

región intracelular, comparando las propiedades energéticas, estructurales y dinámicas del canal

silvestre con mutaciones de residuos que afectan la conductancia en la región intracelular

(evidencias experimentales).

2. Estudiar la densidad de iones potasio en la misma cavidad.

Objetivos específicos

1. Determinar el rol de los aminoácidos en la cavidad intracelular del canal de potasio hSlo

sobre el perfil de energía libre de unión y en la densidad de iones potasio en esta región del canal.

2. Estudiar el efecto de la concentración de K+ en la cavidad del canal hSlo en la región

intracelular.

3. Implementar herramientas de Steered Molecular Dynamics para calcular el perfil de

energía libre de un ión de potasio en el modelo hSlo.

17

3.- MATERIALES Y MÉTODOS

3.1.- Programas e Implementación computacional

El desarrollo del trabajo de investigación fue realizado en el Centro de Bioinformática y

Simulación Molecular (CBSM), Universidad de Talca, Talca.

A) Programas

1. Para el desarrollo de las simulaciones de dinámica molecular y para realizar Steered

Molecular Dynamics se utilizó el programa Nanoescalable Molecular Dynamics,

NAMD2.6 (http://www.ks.uiuc.edu/research/namd/).

2. Para el análisis de las propiedades estructurales y dinámicas, y para la construcción de

modelos tridimensionales se utilizó el programa Visual Molecular Dynamics, VMD,

(http://www.ks.uiuc.edu/research/vmd/).

3. Para manipulación y modificación aminoácidica se utilizó VMD y los módulos Builder y

Biopolymer de Insight II.

4. Para análisis de lenguaje de programación de scripts, se utilizó Perl.

18

B) Equipamiento computacional

1. Servidores IRIX-SGI (modelos O2, Origin 200 y Origin 300).

2. Servidor de cálculo ALTIX350 (SGI): 16

procesadores por 1,5 GHz y 16 Gb Memoria

RAM compartida.

3. Servidor de cálculo ALTIX450 (SGI): 10

procesadores dual-core por 1,4 GHz y 40 Gb

memoria RAM compartida.

4. PC-Cluster, 28 nodos x 4 procesadores

XEON/HT, 3 GHz y 1 Gb RAM cada uno.

19

3.2.- Dinámica molecular dirigida (Steered molecular dynamics, SMD)

Los eventos biológicos importantes a menudo involucran transiciones desde un estado a otro,

dichos eventos deben ser dependientes del tiempo para que de esta manera, sea posible realizar

una Dinámica Molecular. Para poder guiar un sistema desde un estado a otro se podría aplicar

una fuerza externa a este sistema, y así acelerar el proceso que, de otra manera, sería muy lento

de modelar. Eso es precisamente lo que hace SMD (ver figura 6A).

Esta metodología se basa en la aplicación de una fuerza externa sobre una partícula en una

coordenada de reacción (por ejemplo un ión de K+, ver figura 6B). Para aplicar esta fuerza se une,

a través de un resorte virtual, el ión de K+ con un átomo fantasma, el cual se desplaza a una

velocidad constante. Como el átomo dirigido es movido a una velocidad constante por el átomo

fantasma, experimenta una fuerza que depende linealmente de las distancias del átomo dirigido

entre un tiempo t y el tiempo inicial o anterior, esta fuerza o potencial aplicado es:

( )[ ]2)0()(21

nrrvtkF trrr •−−=∆ Ecuación 3.1

donde F es la fuerza externa, řřřř (t) es la posición del átomo dirigido, řřřř 0 es su posición inicial, k

es la constante de resorte, v la velocidad de empuje, t el tiempo y ňňňň la dirección de empuje. El

resorte es un sistema armónico al cual se le asigna una constante de fuerza (constante κκκκ).

El trabajo externo fue calculado por integración de la fuerza sobre la distancia dirigida del ión K+

de las trayectorias de SMD.

∫=r

rr drFW0

´)()( ´ Ecuación 3.2

20

Figura 6.- Steered Molecular Dynamics (SMD). A) Esquema para SMD. Se representa en

verde un átomo el cual será dirigido o empujado, al cual lo denominaremos átomo dirigido (SMD

atom) y en café un átomo fantasma (dummy atom) que no tiene masa ni carga, y estará unido

virtualmente por un resorte al átomo dirigido. El átomo fantasma avanzará en una dirección con

respecto a una coordenada de reacción, a una velocidad constante y junto al resorte producirá que

también avance el átomo dirigido en la misma dirección. B) Esquema de SMD en hSlo. Se

representa el poro del canal hSlo (cartoon azul), resaltando los residuos del filtro de selectividad y

los residuos de fenilalanina y glutámicos en el interior de la cavidad. Se muestran dos iones K+ en

el filtro (en verdes), siendo el K+ inferior (en el sitio de unión S4) el átomo dirigido unido por un

resorte al átomo fantasma (esfera café). El átomo fantasma avanzará con respecto al eje Z (η), en

dirección desde S4 a la cavidad intracelular, a una velocidad constante (υ).

21

3.3.- Simulación de SMD

Se realizaron 1000 pasos de minimización al sistema, usando el campo de fuerza de

CHARMM28 (MacKerell y cols., 1998), fijando la cadena de la proteína (backbone o esqueleto)

con 1 kcal/mol/Å2 (en un archivo fix_atom.pdb), desde 0 °K hasta 310 °K y a presión constante.

NAMD provee simulaciones a presión constante usando el método modificado de Nosé-Hoover

(Feller y col., 1995; Martyna y col., 1994) en el cual Langevin dynamics es usado para controlar

las variaciones del barostato. Este método se puede combinar con el método de control de

temperatura, así se asume que las condiciones de la simulación son a temperatura y presión

constante (NPT) con Langevin dynamics.

Luego se equilibró el sistema a 100, 150, 200, 250 y 300 ps (picosegundos) para así obtener

diferentes trayectorias en cada simulación para realizar SMD, el time step (paso de tiempo) fue

de 1 fs (femtosegundo). Se aplicó una restricción sólo a los carbonos α de la proteína de 1

kcal/mol/Å2 (en un archivo restrain_ca.pdb), pero dejando libre el loop extracelular entre los

segmentos S5 y S6, todo el resto del sistema quedo libre en la simulación.

El átomo dirigido es seleccionado desde el archivo de coordenadas (smdfile.pdb) con un valor de

1 (en la columna B) y el resto de los átomos que no son seleccionados tienen un valor de 0 en la

misma columna. La constante de fuerza (resorte), la velocidad constante y la dirección de empuje

son especificadas en el archivo configuración (smd.namd).

La constante de fuerza utilizada fue de 169 pN/Å (2,5 kcal/mol/Å2), la dirección del átomo

fantasma fue 0, 0, ±1 (dependiendo sólo del eje Z), la velocidad utilizada fue de 3 Å/ns (0,000003

Å/fs). La velocidad se obtuvo mediante la relación entre el diámetro de la bicapa de lípidos (~ 30

Å) y el flujo de iones K+ a través del canal hSlo (108 iones/segundo o 1 ión/10ns).

22

3.4.- Cálculo del PMF desde trayectorias de SMD

El PMF o potencial de fuerza media es el perfil de energía libre en una coordenada de reacción.

En este trabajo la coordenada de reacción es el eje Z (Å), el cual atraviesa justo al medio del

canal.

Los cálculos de energía libre son extremadamente costosos para sistemas biomoleculares

complejos y un eficiente cálculo de energía libre es una de las tareas más desafiantes en

simulaciones de cálculo. Hay varios métodos basados en simulaciones en equilibrio o cuasi-

estáticas, como el umbrella sampling (Kumar y Kotekar, 1992). En cambio las simulaciones de

SMD describen un sistema de mecánica clásica que esta sujeto a una perturbación externa, debido

a que se aplica una constante de fuerza que es dependiente del tiempo, lo cual resulta en

significativas desviaciones del equilibrio. Esto trae como consecuencia, que los resultados

obtenidos de una dinámica con SMD tienen que ser analizados explícitamente desde un punto de

vista de no equilibrio.

Las propiedades de equilibrio de un sistema pueden ser deducidas a partir de simulaciones fuera

del equilibrio, como por ejemplo en simulaciones de SMD, utilizando la identidad de Jarzynski

(Jarzynski C., 1997). Considerando un proceso que cambia un parámetro λ de un sistema desde λo

en un tiempo cero a λt en un tiempo t. La segunda Ley de la termodinámica establece que el

promedio del trabajo realizado en un sistema no puede ser menor que las diferencias de energía

libre correspondientes al valor inicial y final de λ:

WGGG t ≤−=∆ )0(´)( Ecuación 3.3

23

La identidad de Jarzynski es una relación entre las diferencias de energía libre en equilibrio con

la distribución del trabajo de una serie de procesos fuera del equilibrio, como una integración

termodinámica. Permite obtener información del equilibrio así como las diferencias de energía

libre, desde el promedio de los procesos fuera del equilibrio. Para procesos a presión y

temperatura constante (NPT) la identidad Jarzynski es:

Ecuación 3.4

donde β = (KBT)-1. Donde KB es la constante de Boltzmann. Este método ha sido probado en

cálculo de simulaciones teóricas (Jarzynski 1997, 2) y experimentales (Liphardt y col., 2002).

El promedio exponencial del trabajo, en la ecuación de Jarzynski, tiene un gran aporte de las

trayectorias correspondientes a pequeños valores de trabajo W0→t . Por lo tanto, para estimar la

energía libre se requiere un mayor muestreo de tales trayectorias (Park y col., 2003).

La ecuación 3.4 puede ser expandida en términos acumulativos:

en donde, <W> es el promedio de los trabajos de una misma trayectoria. Los términos de menor

orden de la expansión están menos influenciados por el error estadístico, el error sistemático

( ) ( ) ...,23!3

121 3233222 ++−+++−=∆− WWWWWWWG ββββ

24

introducido por los términos de mayor orden puede ser considerado menor que el error

estadístico. Si la distribución del trabajo es gaussiana, los órdenes de magnitud mayor a 3 puede

aproximarse a cero, de manera que la expansión puede llevarse hasta el segundo término sin gran

error. Así la expresión para calcular la energía libre puede ser:

( )22

21

WWTK

WGB

−−=∆ Ecuación 3.5

La ecuación 3.5 no depende del promedio exponencial. En esta aproximación, tenemos dos

errores involucrados, para la ecuación 3.4 tenemos el error estadístico debido a un muestreo

insuficiente y para la ecuación 3.5 tenemos el error sistemático debido al truncamiento por la

aproximación de los términos de mayor orden. Para el error estadístico debemos realizar un

muestreo suficiente de la misma trayectoria para que este error sea mínimo y para el error

sistemático debemos obtener una distribución del trabajo gaussiana, a su vez para que la

distribución del trabajo sea gaussiana el proceso debe ser lento, para así obtener un mayor

muestreo en cada punto, de modo que las magnitudes de mayor orden de la expansión

acumulativa sean aproximadamente cero (Park y col., 2003).

Para que el proceso sea lento, la velocidad aplicada al sistema debe ser pequeña, lo que trae como

consecuencia el costo computacional que ello requiere. La velocidad utilizada en este trabajo fue

de 3 Å/ns que es mucho menor a las velocidades utilizadas en otras publicaciones para canales

como glicerol de 30 Å/ns (Jensen y col., 2003), receptores de acetilcolina nicotínico de 20 Å/ns

(Zhang y col., 2005), canal de gramicidina A de 10 Å/ns (Liu y col., 2006) y canal potasio KcsA

y Kv1.2 de 25 Å/ns (Treptow y Tarek, 2006).

25

3.5.- Cálculos de densidad iónica

Con el objetivo de determinar la concentración local de iones potasio en la cavidad intracelular

del canal hSlo utilizamos la medición de densidad iónica en la cual se cuenta la cantidad de iones

potasio en un determinado volumen, entregando como resultado una aproximación de las zonas

más favorables de encontrar iones potasio. Comparamos los resultados del canal silvestre con la

doble mutante E386N/E389N de la región intracelular estudiado por Brelidze y cols. (2003) en

donde sugiere que estos residuos cargados negativamente tienen un rol clave en la conducción del

canal.

Para los cálculos de densidad iónica se construyó un sistema con el modelo por homología del

canal hSlo en estado abierto (Carvacho y cols., 2008) de los segmentos S5-S6 que constituyen el

poro del canal, luego se insertó una bicapa de lípidos de palmitoiloleilfosfatidilcolina (POPC), en

una solución de 110 mM de KCl y agua explicita (TIP3). Al interior del filtro de selectividad se

insertaron 2 iones potasio en los sitios S1 y S3. Las dimensiones del sistema fueron de 94 Å, 94

Å y 88 Å. El tamaño del sistema es de 61.783 átomos.

En el sistema se aplicó una restricción de 5 kcal/mol/Å2 a los carbonos alpha de la proteína (Cα)

y a los 2 iones potasio de los sitios S1 y S3 para mantener el sistema estable y para mantener los

iones en el filtro de selectividad, el resto del sistema quedo libre en la simulación. La temperatura

y presión se mantuvieron constantes, como se señaló en la sección 3.3.

El sistema se minimizó durante 10.000 pasos y luego se equilibró con 1 ns de dinámica. La

simulación se realizó durante 5 ns de dinámica y posteriormente se analizaron los datos de

densidad iónica.

26

Para obtener los datos de densidad iónica se construyó un script (archivo de ordenes) en el cual se

ingresaron el eje a muestrear (eje Z), el espesor de las capas (1 Å), el radio de las capas (12 Å), el

límite superior (40 Å) e inferior (-40 Å) de la coordenada de reacción del eje Z y el volumen de la

caja.

27

4.- RESULTADOS

4.1.- Análisis estructural del canal

Una vez obtenido el modelo de hSlo, se estudió estructuralmente su composición aminoacídica

mediante el programa de visualización molecular, Visual Molecular Dynamics, VMD,

(Humphrey y col., 1996). Este programa permitió: 1) visualizar el modelo de hSlo, 2) generar el

sistema con membrana, agua e iones, 3) analizar la trayectoria del ión potasio, 4) visualizar los

residuos claves en la conducción del ión potasio.

En la figura 7 se observa la trayectoria del ión potasio desde el sitio S4 del filtro de selectividad

hacia la cavidad intracelular del canal hSlo silvestre. El análisis de esta figura muestra que el ión

potasio presenta una interacción prolongada con el residuo F380 localizado en el poro de hSlo, lo

cual sugiere que este residuo cumple un rol clave en la trayectoria del ión.

Estructuralmente el residuo F380 de hSlo se encuentra entre la cavidad intracelular y el sitio S4

del filtro de selectividad, formando un verdadero anillo que separa el filtro de selectividad y el

vestíbulo intracelular.

Puesto que se propone al residuo F380 como esencial para que ocurra el paso del ión potasio a

través del canal, se procedió a analizar su presencia en varios canales de potasio de alta

conductancia. En la figura 8 se observa el alineamiento múltiple del segmento S6 en donde el

residuo aromático F380 se presenta en todos los canales de potasio de alta conductancia, en

cambio en los canales de baja conductancia se encuentra reemplazado por un residuo de

Isoleucina (Ile).

28

Figura 7.- Visualización de la trayectoria del ión potasio en el canal silvestre hSlo: El ión

potasio ubicado en el sitio S4 del filtro de selectividad es dirigido hacia el vestíbulo intracelular

del canal hSlo en 5 ns de tiempo de simulación molecular y en cada cuadrante se visualiza la

trayectoria del ión potasio para 0, 2, 4 y 5 ns respectivamente. En los cuadrantes se observan los

residuos aminoacidicos que interactúan con el ión potasio a una distancia menor de 5 Å en su

trayectoria hacia la cavidad del canal. Se observa que el ión potasio interactúa desde el tiempo

inicial hasta 4 ns con el residuo de fenilalanina. A la izquierda de cada cuadrante se señalan los

sitios del filtro de selectividad.

29

Figura 8.- Alineamiento múltiple de secuencia: En la parte superior se señalan los segmentos

transmembranal S6, filtro y P-hélice de los canales de K+ dependiente de voltaje. Se indica el

residuo hidrófobo de Fenilalanina, en caja verde (F380 en hSlo) el cual sólo se presenta en los

canales de alta conductancia, en cambio el residuo de Isoleucina (en caja amarilla) se presenta en

los canales de baja conductancia. En caja roja, se muestran los residuos de Glutámicos de la

cavidad intracelular (E386/E389 en hSlo). En la columna de la izquierda se indican los valores de

la conductancia de los canales de K+ dependiente de voltaje (Modificado de Carvacho y col.,

2008).

30

Estas observaciones coinciden con lo publicado por Lippiat y colaboradores (Lippiat y cols.,

2006) en donde reportaron la disminución de la conductancia en la mutante F380 comparada con

el canal silvestre. Los autores señalan: “la presencia de un anillo aromático puede ser importante

en mantener la alta conductancia de este canal por la distribución de un ambiente electronegativo

en el vestíbulo intracelular”.

Con estas observaciones se propuso generar una nueva mutante F380I para realizar los estudios

de SMD y compararlos con el canal silvestre hSlo. De este modo el nuevo sistema con la mutante

F380I se unió a los dos sistemas ya creados inicialmente como son el canal silvestre y la doble

mutante E386N/E389N (descrita por Brelidze y cols., 2003) en donde se realizaron los cálculos

de SMD para obtener el perfil de energía libre de cada mutante comparándola con el canal

silvestre, ver figura 9.

4.2.- Representación del modelo para los sistemas de estudio

Las Figuras 9A, 9B y 9C representan el modelo del poro para el canal silvestre, la doble mutante

E386N/E389N y la mutante F380I respectivamente, para los cuales se efectuó el análisis de la

estabilidad de los iones potasio en la cavidad intracelular del canal silvestre y las mutantes. El

sistema posee el canal de potasio (silvestre o la mutante F380I o la doble mutante

E386N/E389N), insertado en una membrana de palmitoiloleilfosfatidilcolina (POPC), solvatado

en agua y en una concentración de 110 mM de KCl, además en el filtro selectividad del canal hay

tres iones potasio en los sitios S0, S2 y S4 y dos moléculas de agua en los sitios S1 y S3 (ver

figura 3 y 4).

31

Figura 9.- Representación del modelo obtenido para el poro de hSlo para el canal silvestre

y mutantes: A) En el canal silvestre se visualizan las cargas localizadas internamente E386 y

E389 y el residuo F380, indicando la posición de la coordenada de reacción en el eje Z (en Å) y

las zonas extracelular, filtro de selectividad e intracelular del canal. Se representan en B) la doble

mutante E386N/E389N y C) la mutante F380I, las cuales se encuentran en la cavidad intracelular

del canal.

A

B C

Å

FILTRO DE SELECTIVIDAD

EXTRACELULAR

INTRACELULAR

32

4.3.- Análisis de la simulación de la SMD

Para los cálculos de las trayectorias, fuerzas y trabajos aplicados, así como del cálculo de la

energía libre en el canal silvestre y en las mutantes F380I y E386N/E389N, se utilizaron en todas

las simulaciones de dinámica molecular dirigida los mismos parámetros, como se indicó en la

sección 3.4. Para representar las figuras de los cálculos se utilizó el programa OriginPro 7.5.

Los resultados se obtienen a partir del archivo de salida de la simulación llamado “smd.out”. Este

archivo entrega los datos en columnas, como los valores de la posición del átomo dirigido (ión de

potasio, en Å), la fuerza requerida para mover al ión (en pN) ordenados según el tiempo de la

simulación realizada (en fs). Tanto la posición del átomo dirigido como de la fuerza requerida se

entregan en sus coordenadas x y z. Luego estos valores son guardados en un archivo Excel en

donde se pueden ordenar los datos según el grafico a obtener (respecto a una coordenada de

reacción o con respecto al tiempo).

4.4.- Trayectoria del átomo dirigido y cálculo de la fuerza aplicada en las

simulaciones de SMD para el canal silvestre y para las mutantes F380I y E386N/E389N

Las figuras 10A y 11A exhiben el tiempo de la trayectoria del átomo dirigido bajo la coordenada

de reacción en el eje Z, para el canal silvestre comparado con la mutante F380I y para el canal

silvestre comparado con la doble mutante E386N/E389N respectivamente. La figura 12A muestra

la trayectoria del átomo dirigido bajo el tiempo de simulación para el canal silvestre comparado

con la mutante F380I. Con los valores de posición del átomo dirigido (ión K+) para cada tiempo

de simulación se puede obtener la trayectoria del ión.

33

Las figuras 10B y 11B presentan la fuerza aplicada al átomo dirigido bajo la coordenada de

reacción en el eje Z, para el canal silvestre comparado con la mutante F380I y para el canal

silvestre comparado con la doble mutante E386N/E389N respectivamente. La figura 12B muestra

la fuerza aplicada al átomo dirigido en el tiempo de simulación para el canal silvestre comparado

con la mutante F380I.

Con los valores de posición del átomo dirigido para cada tiempo de simulación, se puede obtener

la fuerza aplicada al ión potasio. Estos valores de fuerza lo entrega el archivo de salida smd.out,

en donde se selecciona la coordenada z de la fuerza según la posición del átomo dirigido y del

tiempo de simulación.

4.5.- Cálculo del trabajo aplicado y del perfil de Energía libre en las simulaciones de

SMD para el canal silvestre y para las mutantes F380I y E386N/E389N

Las figuras 13A y 14A presentan el trabajo aplicado para la simulación de SMD bajo la

coordenada de reacción en el eje Z, para el canal silvestre comparado con la mutante F380I y

para el canal silvestre comparado con la doble mutante E386N/E389N respectivamente.

Las figuras de fuerza del canal silvestre y de las mutantes (figuras 10B y 11B) se utilizaron para

integrar la fuerza bajo la coordenada de reacción (posición del átomo dirigido) según la ecuación

3.2, obteniendo como resultado los valores de trabajo (pN/Å) requerido para mover el ión de

potasio desde una posición inicial hasta una posición final según el tiempo de simulación.

34

Figura 10.- Trayectoria del ión potasio y cálculo de la fuerza aplicada a las simulaciones de

SMD respecto a una coordenada de reacción en el eje Z para hSlo y F380I: A) representa el

tiempo (en ns) de la trayectoria del ión y en B) indica la fuerza aplicada (en 100 * pN) ambas

bajo la coordenada de reacción del eje Z (en Å). El canal hSlo silvestre se representa en negro, la

mutante F380I se representa en azul. Las líneas punteadas indican la coordenada de reacción del

eje Z cada 1.5 Å.

35

Figura 11.- Trayectoria del ión potasio y cálculo de la fuerza aplicada a las simulaciones de

SMD respecto a una coordenada de reacción en el eje Z para hSlo y E386N/E389N: A)

representa el tiempo (en ns) de la trayectoria del ión y en B) indica la fuerza aplicada (en 100 *

pN) ambas bajo la coordenada de reacción del eje Z (en Å). El canal hSlo silvestre se representa

en negro, la doble mutante E386N/E389N se representa en rojo. Las líneas punteadas indican la

coordenada de reacción del eje Z cada 1.5 Å.

36

Figura 12.- Trayectoria del ión potasio y cálculo de la fuerza aplicada a las simulaciones de

SMD representadas con respecto al tiempo de cálculo (en ns) para hSlo y F380I: A)

representa la trayectoria del ión (en Å) y en B) indica la fuerza aplicada (en 100*pN) ambas con

respecto al tiempo de la simulación (en ns). El canal hSlo silvestre se representa en negro, la

mutante F380I se representa en azul. Las líneas punteadas indican el tiempo cada 500 ps (0.5 ns).

37

Sabiendo que 1 kcal/mol/Å = 67.479 pN/Å2, los valores de trabajo obtenidos se transformaron a

kcal/mol. Se guardaron en un archivo Excel y luego se promediaron los valores de los trabajos

cada 0,5 Å para cada una de las trayectorias obtenidas (repetidas 5 veces cada una según los

diferentes equilibrios realizados como se indicó en la sección 3.3 y 3.5), de manera de poder

disminuir la cantidad de puntos obtenidos y además representar la figura del trabajo mas

suavizada para cada trayectoria.

Las figuras 13B y 14B muestran el perfil de energía libre para la simulación de dinámica

molecular dirigida bajo la coordenada de reacción en el eje Z, para el canal silvestre comparado

con la mutante F380I y para el canal silvestre comparado con la doble mutante E386N/E389N

respectivamente.

Los valores de los trabajos (W en kcal/mol) obtenidos de la sección 3.6 de cada una de las

trayectorias para el canal silvestre y las mutantes F380I y E386N/E389N son utilizados para

calcular: i.- el promedio de los trabajos de las 5 trayectorias para cada sistema (<W>),

ii.- el cuadrado del promedio de los trabajos obtenido en i (<W>2),

iii.- el cuadrado de los trabajos de cada una de las trayectorias (W2) y

iv.- el promedio de los cuadrados de los trabajos obtenidos en iii (<W2>).

Con los valores de <W>, <W>2 y <W2>, según la ecuación 3.5, se obtiene el perfil de energía

libre requerido para mover el ión de potasio con respecto a la coordenada de reacción en el eje Z

(en Å).

38

Figura 13.- Cálculo del trabajo y del perfil de energía libre con respecto a una coordenada

de reacción en el eje Z (en Å) para hSlo y F380I: A) representa el trabajo (en kcal/mol) y en B)

indica el perfil de energía libre (en kcal/mol) ambas bajo la coordenada de reacción del eje Z (en

Å). El canal hSlo silvestre se representa en negro y cuadrado, la mutante F380I se representa en

azul y triangular. Las líneas punteadas indican la coordenada de reacción del eje Z cada 1.5 Å.

39

Figura 14.- Cálculo del trabajo y del perfil de energía libre con respecto a una coordenada

de reacción en el eje Z (en Å) para hSlo y E386N/E389N: A) representa el trabajo (en

kcal/mol) y en B) indica el perfil de energía libre (en kcal/mol) ambas bajo la coordenada de

reacción del eje Z (en Å). El canal hSlo silvestre se representa en negro y cuadrado, la doble

mutante E386N/E389N se representa en rojo y circular. Las líneas punteadas indican la

coordenada de reacción del eje Z cada 1.5 Å.

40

4.6.- Cálculo de las moléculas de agua que solvatan al ión K+ en la región

intracelular del canal con respecto a una coordenada de reacción en el eje Z (en Å) para

canal hSlo silvestre y la mutante F380I

En la figura 15 se presentan los resultados de la cantidad de moléculas de agua que solvatan

alrededor de 3,6 Å al ión potasio bajo la coordenada de reacción en el eje Z para el canal hSlo

silvestre comparado con la mutante F380I. Se utilizó un script en la consola de VMD para contar

la cantidad de moléculas de agua alrededor de 3,6 Å de radio del ión K+. La cuenta se realizó

cada 0,1 Å de la coordenada de reacción desde -1 Å hasta -11 Å en el eje Z.

En las figuras 16 y 17 se observa la cantidad de moléculas de agua en la trayectoria del ión

potasio para el canal silvestre y el canal mutado F380I respectivamente, desde el sitio S4 del

filtro de selectividad hasta la zona de -11 Å de la coordenada de reacción del eje Z. En los

cuadros se muestra un aumento de la zona entre 3 y -11 Å del eje Z, donde para el canal silvestre

se encuentra el residuo de fenilalanina y para el canal mutado F380I el residuo de isoleucina. En

ambas figuras se señala la distancia de separación entre los residuos de cada monómero del poro

del canal y la cantidad de moléculas de agua que solvatan alrededor de 3,6 Å del ión potasio.

41

Figura 15.- Moléculas de agua que solvatan al ión K+ en la región intracelular del canal con

respecto a una coordenada de reacción en el eje Z (en Å) para canal hSlo silvestre y la

mutante F380I: El canal hSlo silvestre se representa en negro y cuadrado, la mutante F380I se

representa en azul y triangular. Se señala el sitio S4 del ión K+ (en verde) del filtro de

selectividad (en morado), el vestíbulo intracelular (en damasco) y la zona de los anillos de

Fenilalaninas entre -4 Å y -8,5 Å bajo la coordenada de reacción en el eje Z.

42

Figura 16.- Visualización de la cantidad de moléculas de agua en la trayectoria del ión

potasio para el canal silvestre: En las figuras superiores se presenta la trayectoria del ión

potasio desde el sitio S4 del filtro de selectividad hasta -11 Å de la coordenada de reacción en el

eje Z. En la parte inferior se aumentó la zona donde se encuentra el anillo de fenilalanina en la

cual se observa la cantidad de moléculas de agua que solvatan al ión potasio señalando el

diámetro de la distancia de separación (en Å) entre las fenilalaninas de cada monómero del poro

del canal.

43

Figura 17.- Visualización de la cantidad de moléculas de agua en la trayectoria del ión

potasio para el canal mutante F380I: En las figuras superiores se presenta la trayectoria del ión

potasio desde el sitio S4 del filtro de selectividad hasta -11 Å de la coordenada de reacción en el

eje Z. En la parte inferior se aumentó la zona donde se encuentran los residuos de isoleucinas en

la cual se observa la cantidad de moléculas de agua que solvatan al ión potasio señalando el

diámetro de la distancia de separación (en Å) entre las isoleucinas de cada monómero del poro

del canal.

44

4.7.- Cálculo de densidad iónica en el canal hSlo para el canal silvestre y para la

doble mutante E386N/E389N sobre la coordenada de reacción en el eje Z.

En la figura 18 se observa la curva de la densidad local de iones potasio bajo la coordenada de

reacción en el eje Z, en donde los dos picos más altos corresponden a los iones potasio ubicados

en el filtro de selectividad en los sitios S1 y S3. Cada punto indica el cálculo realizado cada 1 Å

en la coordenada de reacción sobre el eje Z.

Se simuló un cilindro virtual de 12 Å de ancho y de 80 Å de largo (en la coordenada de reacción)

y que además presentaba divisiones cada 1 Å de alto bajo el eje Z. En este volumen de 1 Å de

alto se contaban la cantidad de iones potasio y se estableció una relación entre este volumen y el

volumen total del sistema (80 Å de alto).

45

Figura 18.- Densidad local de iones potasio respecto a una coordenada de reacción en el eje

Z para canal silvestre y para la doble mutante E386N/E389N: La medición se realizó desde

40 hasta -40 Å sobre el eje Z durante 5 ns de dinámica. El canal silvestre se presenta en línea

negra y cuadrada y la doble mutante E386N/E389N en línea roja y circular. Se señalan los sitios

del filtro de selectividad en verde y de fondo se observa el poro del canal hSlo.

46

5.- DISCUSIÓN

El canal de potasio humano hSlo dependiente de voltaje y calcio intracelular pertenece a la

familia de canales de potasio de activación mixta y es uno de los canales con más alta

conductancia de 250 pS, por esta razón es uno de los miembros de la familia más estudiados

desde el punto de vista cinético y estructural.

Los canales de potasio hSlo mantienen relajadas las arterias y además son regulados por los

estrógenos, de ahí que las mujeres estén más protegidas de las afecciones cardiacas que los

hombres (Toro y cols., 1994). Estos canales prevalecen en nuestros nervios, músculos, glándulas

secretoras y otros eucariotas y protozoo (Fernández-Fernández y cols., 2004).

Estructuralmente el canal hSlo es un tetrámero en cuya subunidad α encontramos la región que

contiene los segmentos S5 y S6 que forman el túnel acuoso o poro de conducción por donde los

iones atraviesan la membrana (Hille, 2001).

Los miembros de la familia de los canales de potasio presentan una muy baja identidad al

analizar su secuencia aminoacídica, por esta razón se seleccionó solamente la secuencia entre S5

y S6 para realizar el alineamiento como se indica en la Figura 8. Si es mayor la longitud de

secuencia menor será la identidad (Carvacho y cols., 2008). Al comparar distintos canales de

potasio de este alineamiento múltiple es posible rescatar que aunque todos tienen similar

composición aminoacídica en el poro, presentan conductancias de canal único distintas

permitiendo diferenciar canales de alta y baja conductancia a través de motivos particulares para

cada grupo.

47

En la figura 8 se puede observar que existe un conjunto de cargas negativas (E386 y E389) que

está presente sólo en los canales de potasio de alta conductancia, el cual fue descrito antes por

Magleby y colaboradores, indicando que estos residuos cargados ubicados en la región

intracelular afectan la conductancia del canal hSlo (Brelidze y cols., 2003).

En la misma figura 8 se observa que dentro de la secuencia del poro del canal hSlo encontramos

el filtro de selectividad, un segmento altamente conservado en todos los canales de potasio, el

cual esta constituido por 4 cadenas de la secuencia TVGYGD (una de cada monómero). Haug y

colaboradores describieron que el aspartato que se ubica en la entrada del filtro de selectividad,

región extracelular, forma un anillo de cargas negativas que regula la concentración local de

iones potasio en el vestíbulo exterior y en consecuencia también en la conductancia del canal

(Haug y cols., 2004).

Para estudiar la cavidad intracelular de hSlo se utilizó un modelo por homología para el canal en

su estado abierto (Carvacho y cols., 2008). Con este modelo se predijo anteriormente que las

cargas del vestíbulo intracelular se encuentran embebidas en la membrana lipídica y que el lazo

extracelular esta completamente embebido en el solvente.

Una vez construido el modelo de hSlo se comenzó a utilizar el programa VMD para construir

nuestro sistema. Luego el modelo de hSlo fue relajado en una bicapa de lípidos y solvatado en

agua.

En todas las simulaciones realizadas con SMD se observó que el ión potasio tardó

aproximadamente 1 ns en salir del sitio S4 del filtro de selectividad hacia la cavidad del canal,

aumentando la fuerza externa aplicada, mientras el átomo fantasma avanzaba a velocidad

constante (3 Å /ns). Luego del tiempo indicado, el ión potasio avanzó 5 Å aproximadamente, en

la misma dirección, en un tiempo muy corto (cerca de 10 fs), como si literalmente “saltara” del

48

filtro de selectividad a la cavidad intracelular, debido a la fuerza acumulada que lo tiraba, ver

figura 19A. A partir de los perfiles de fuerza se calcularon los trabajos con lo cual se pudieron

obtener los perfiles de energía libre sobre una coordenada de reacción en el eje Z. Estos

resultados para el canal silvestre hSlo se muestran en la figura 19B. Estos resultados indican que

entre el sitio S4 del filtro de selectividad (-0.5 Å del eje Z) hasta -5 Å sobre el eje se necesita un

trabajo significativo para mover el ión para luego tender a estabilizarse en esta nueva zona, ver

figura 19C.

En la figura 7 y 8 se observó además que el ión potasio en su trayectoria interactúa con

aminoácidos de la cavidad del canal, siendo el de mayor interés el residuo de fenilalanina que se

encuentra entre -5 y -8 Å sobre el eje Z del canal, F380 de la secuencia del canal de potasio hSlo.

Este residuo se presentó en todas las simulaciones interactuando con el ión potasio cerca de 4 ns

de la dinámica. El residuo de fenilalanina se ubica en el segmento S6 del poro del canal y la

observación más importante es que el residuo de fenilalanina sólo se encuentra en los canales de

potasio de alta conductancia, en cambio en los canales de baja conductancia se encuentra un

residuo de Isoleucina.

En el trabajo de Lippiat y colaboradores (Lippiat y cols. 2000) ellos reportaron cambios

dramáticos en la dependencia de voltaje y calcio intracelular para la mutante F380Y, mientras

que para la mutante F380I, no la pudieron registrar a todos los potenciales ni pudieron evaluar su

dependencia de calcio intracelular y voltaje debido a la poca cantidad de corriente obtenida. La

conductancia reportada para el canal silvestre es de 294 ± 5 pS, para la mutante F380Y es de 166

± 5 pS y para la mutante F380I fue de 92 ± 6 pS.

49

Figura 19.- Cálculo del perfil de energía libre para el canal silvestre hSlo: en A) se observa la

trayectoria del ión potasio (en negro) y la fuerza aplicada (en azul) obtenida con los datos de

posición del átomo dirigido (ión potasio) y el tiempo de simulación. En B) se indica el trabajo

realizado (línea negra) para mover el ión desde el sitio S4 del filtro de selectividad hacia la

cavidad intracelular del canal hSlo y con los resultados del trabajo obtenido se cálculo el perfil de

energía libre para el canal silvestre hSlo (en azul y cuadrado). En C) se señala la zona de interés

según los datos entregados en A) y B).

50

En la figura 10 se presentan los primeros resultados que comparan la mutante F380I con el canal

silvestre, en el cual se presentan la trayectoria del ión potasio y la fuerza aplicada para mover el

ión bajo la coordenada de reacción en el eje Z. Se observa que a la altura de -1 Å (sitio S4) el ión

“salta” hasta -6 Å en 1,5 ns de tiempo para el canal silvestre, en cambio para la mutante F380I

este “salto” ocurre en casi 1,7 ns de tiempo de dinámica. Si observamos la fuerza aplicada en esta

misma zona para el canal silvestre la fuerza fue de ~590 pN comparado con la fuerza en la

mutante F380I que fue de ~720 pN, es decir, para mover el ión potasio del sitio S4 a la zona de -

6Å en la mutante se requiere mayor tiempo de dinámica y por lo tanto es mayor la fuerza

aplicada comparado con el canal silvestre. Si ahora nos centramos en la zona de interés entre -5 y

-9 Å, donde se encuentra el residuo de fenilalanina para el canal hSlo observamos que el ión

potasio en el canal silvestre interactúa con mayor tiempo en esta zona comparado con el canal

mutado F380I. Esta interacción se refleja en la fuerza aplicada porque en esta zona el ión potasio

requiere cerca de 200 pN para mover el ión en el canal silvestre, comparado con la mutante F380I

que no requiere mas de 50 pN para avanzar el ión por la cavidad. En ambos casos la trayectoria

del ión potasio por la cavidad intracelular fue igual a la velocidad constante y la fuerza aplicada

no varió entre ellas con un valor de aproximadamente 0 pN.

La información anteriormente señalada también se refleja en la figura 12, en donde se calculó la

trayectoria y la fuerza aplicada con respecto al tiempo de cálculo (ps), en la cual se observa

claramente que el ión potasio “salta” desde -1 Å (sitio S4) hasta -5 Å mas lento en el canal

mutado F380I que en el canal silvestre y por lo tanto con una mayor fuerza para mover el ión en

el canal mutado que en el canal silvestre hSlo. En cambio en la zona entre -5 y -9 Å el ión potasio

avanza más rápido en el canal mutado F380I que en el canal silvestre y se observa que la fuerza

aplicada en esta zona del canal es mayor en el canal silvestre que en el canal mutado, indicando

51

que hay una mayor interacción del ión potasio con esta zona donde se encuentra el residuo de

fenilalanina.

Si ahora observamos la figura 13, sobre el cálculo del trabajo y el cálculo del perfil de energía

libre sobre la coordenada de reacción en el eje Z, se muestra que el trabajo necesario para mover

el ión potasio desde el sitio S4 del filtro de selectividad hacia la cavidad intracelular es mayor en

el canal mutado F380I que en el canal silvestre entre -2 y -9 Å; el promedio del trabajo en esta

zona es de 12 kcal/mol y de 7 kcal/mol para la mutante F380I y el canal silvestre

respectivamente. Se observa además en esta zona dos picos marcados en -4 y -7 Å para la

mutante F380I y en -2 y -7 Å para el canal silvestre. Con respecto al cálculo del perfil de energía

libre para el canal mutado F380I se presenta un pico de 2 kcal/mol en -5.8 Å sobre el eje Z que

no se presenta en el canal silvestre hSlo, por el contrario, se observa que el canal silvestre a la

altura de -5 Å del eje Z presenta una estabilización de -2.7 kcal/mol del ión potasio con el residuo

de fenilalanina que no se encuentra en el canal mutado.

En la figura 13 se indica claramente que el ión potasio tiende a estabilizarse en donde se

encuentra el residuo de fenilalanina (entre -4.5 y -8.5 Å sobre el eje Z), pero cuando se muta este

residuo se pierde la estabilidad del ión potasio en esta zona requiriendo de un mayor trabajo para

mover el ión potasio desde el sitio S4 del filtro de selectividad hacia la cavidad intracelular del

canal hSlo. Es por esta razón que se realizó un estudio más profundo en esta zona del canal para

poder visualizar la interacción del ión potasio con el residuo de fenilalanina especificando

primero la solvatación del ión potasio en esta zona y segundo la visualización e interacción del

ión potasio con el residuo de fenilalanina.

52

En la figura 15 se realizó la medición de la cantidad de moléculas de agua que rodean al ión

potasio en su trayectoria desde el sitio S4 del filtro hacia la cavidad del canal, es decir la

solvatación del ión potasio desde el sitio S4. Se observa que para el canal mutado F380I y para el

canal silvestre la solvatación del ión potasio es la misma en ambos sistemas desde el sitio S4

hasta -4 Å del eje Z, en cambio desde -4 Å hasta -8,5 Å de la coordenada Z se presenta la

diferencia mas importante y significativa porque en esta zona se encuentra el residuo de

fenilalanina en el canal silvestre ya que en la solvatación del ión potasio la mutante presenta una

molécula más de agua en esta zona comparado con el canal silvestre hSlo como se señalan en las

figuras 16 y 17. Pero si lo vemos desde el punto de vista de la desolvatación, es decir desde la

cavidad intracelular del canal hSlo hasta el filtro de selectividad, la mutante F380I como tiene

una molécula más de agua que el canal silvestre requiere más energía para sacar las aguas de la

primera esfera de solvente del ión potasio en su transito hacia el filtro de selectividad.

Según este análisis el rol de las fenilalaninas sería el de facilitar las desolvataciones de los iones

potasio, desestabilizando la primera esfera de solvente de los iones potasio en tránsito por la

cavidad disminuyendo la energía requerida para que el ión potasio avance desde el sitio S4 del

filtro de selectividad a la cavidad del canal y viceversa, ver figura 13. En la figura 20 A se

esquematiza como es el efecto de la mutación del residuo de fenilalanina en el canal silvestre en

el cual se observa que el residuo de fenilalanina contribuye en un pasaje más rápido para el ión

potasio y por lo tanto la conductancia será mayor en los canales donde se presente el residuo de

fenilalanina como se muestra en la figura 20 B.

53

Figura 20.- Rol del residuo de fenilalanina en la conductancia del canal hSlo: en A) se

muestra que el anillo de fenilalanina contribuye a una mayor eficiencia en el transporte de iones

potasio disminuyendo la energía requerida de los iones K+ en transito. En B) se presenta la

conductancia para el canal silvestre de 250 pS (en circulo) y para la mutante F380I de 92 pS (en

cuadrado), modificado de Lippiat y cols., 2006.

54

Con respecto a la doble mutante E386N/E389N, presente en el vestíbulo intracelular del canal en

-17 Å de la coordenada de reacción del eje Z, se obtuvo mediante SMD un estudio de las

características energéticas del canal que se relacionaron con la disposición de los aminoácidos

cargados y su influencia en la conductancia en el canal silvestre. Se ha reportado que los residuos

cargados E386 y E389 tienen un rol clave en el control de la conductancia unitaria mediante un

mecanismo electrostático (Brelidze y cols., 2003; Olcese y cols., 1999) y que las mutaciones de

los residuos cargados disminuyen la conductancia a potenciales positivos (Guidoni y cols., 1999).

Se compararon los resultados en el doble E386N/E389N con el canal silvestre sobre el perfil de

energía libre y en la densidad de iones potasio en el vestíbulo intracelular del canal.

En la figura 11 se presentan los resultados de la doble mutante E386N/E389N versus el canal

silvestre hSlo, en el cual se observan la trayectoria del ión potasio y la fuerza aplicada para mover

el ión potasio bajo la coordenada de reacción del eje Z. Se puede ver que el ión potasio desde -1

hasta -9.5 Å en su trayectoria hacia la cavidad demora más tiempo en avanzar en la doble

mutante, cerca de 3,4 ns, comparado con el canal silvestre, donde lo realiza en un tiempo de 2,6

ns. Por lo tanto hay una mayor fuerza aplicada en la doble mutante que en el canal silvestre entre

-1 y -9,5 Å del eje Z. Luego la trayectoria del ión potasio y la fuerza aplicada desde -9,5 hasta -18

Å de la coordenada de reacción del eje Z son cercanas entre la doble mutante y el canal silvestre.

Si ahora observamos la figura 14, sobre el trabajo necesario para mover el ión potasio y el cálculo

de la energía libre con respecto a la coordenada de reacción en el eje Z para la doble mutante

E386N/E389N y el canal silvestre, se indica que para sacar al ión potasio del sitio S4 hasta -8 Å

del eje Z en la doble mutante se requiere un mayor trabajo que en el canal silvestre. Con respecto

al cálculo de la energía libre se observa que en el canal silvestre el ión potasio en -5 Å sobre el

eje Z se estabiliza comparado con la doble mutante, ésto se traduce en un tránsito más rápido y

55

sin costo energético para el ión potasio en el canal silvestre que en la doble mutante

E386N/E389N. Entre -9 y -18 Å sobre el eje Z el trabajo y el cálculo de la energía libre fue

similar tanto para la doble mutante como para el canal silvestre.

A pesar de que la distribución de iones potasio que realiza la dinámica es aleatoria, existen

determinadas zonas en que hay una mayor densidad de iones potasio que en otras zonas. Para

determinar si la doble mutante E386N/E389N afecta la concentración local de iones potasio

(Brelidze y cols., 2003) se realizó la medición de la densidad iónica durante una dinámica

molecular de 5 ns en la cual se contabilizó la cantidad de iones potasio ubicados en un

determinado volumen. En la figura 18 se observa la densidad local de iones potasio para la doble

mutante E386N/E389N y el canal silvestre hSlo con respecto a la coordenada de reacción en el

eje Z, demostrando que en la zona de la entrada del vestíbulo intracelular (entre -15 y 21 Å)

existe una mayor presencia de iones potasio en el canal silvestre comparado con la doble mutante

en la cual no se presentan iones potasio en esta zona. Por lo tanto, la doble mutante

E386N/E389N disminuye la concentración local de iones potasio en esta misma zona y además

desestabiliza los iones potasio ubicados en el filtro de selectividad, lo cual indica una

contribución electrostática hasta el filtro de selectividad realizada por los residuos glutamicos

E386 y E389. Estos resultados coinciden con los anteriormente reportados por Brelidze y

colaboradores (Brelidze y cols., 2003). Ellos reportaron la disminución de la conductancia en la

doble mutante E386N/E389N comparada con el canal silvestre (ver figura 21A), lo cual coincide

con nuestros cálculos de densidad iónica que muestran una disminución en la concentración local

de iones potasio en la región intracelular del canal hSlo, como se resume en la figura 21B y 21C.

La presencia de los residuos negativos E386 y E389 en el vestíbulo intracelular es esencial para

provocar un potencial electrostático que permite concentrar los iones potasio en la cavidad

56

intracelular y así aumentar la conductancia del canal hSlo, por lo tanto, los residuos E386 y E389

modulan la concentración local de iones potasio y su conductancia en el vestíbulo intracelular del

canal hSlo.

57

Figura 21.- Rol de los residuos de E386 y E389 en la conductancia del canal hSlo: en A) se

observa la conductancia para el canal silvestre de 250 pS (círculos negros) y para la doble

mutante E386N/E389N de 122 pS (cuadrados blancos), modificado de Brelidze y cols., 2003. En

B) se indica la densidad iónica en la zona comprendida entre -1 y -40 Å de la coordenada de

reacción en el eje Z para canal silvestre (cuadrado negro) y para la doble mutante E386N/E389N

(círculos rojos). En C) se representa el efecto de la ausencia de las cargas negativas E386 y E389

en el transito de los iones potasio desde el vestíbulo intracelular hacia el filtro de selectividad.

58

6.- CONCLUSIÓN

Nuestros cálculos de dinámica molecular mostraron que los residuos negativos (Glu386 y

Glu389) en la región intracelular modulan la concentración local de iones potasio en el vestíbulo

intracelular del canal hSlo. La ausencia de los glutámicos E386 y E389 disminuye la

concentración local de iones potasio en la zona entre -15 y -21 Å de la coordenada de reacción

del eje Z (entrada del vestíbulo intracelular) y además desestabilizó los iones potasio presentes en

el filtro de selectividad indicando que los residuos glutámicos realizan una contribución

electrostática hasta en el filtro de selectividad.

La disminución de la concentración local de iones potasio en esta región aumenta la energía

requerida para que los iones potasio pasen de la región intracelular a la región extracelular. La

mutación de los glutámicos (negativo) a glutaminas (neutro) genera una caída de un 50 % de su

conductancia.

Otro residuo del canal estudiado fue la fenilalanina F380 cuya función es facilitar el tránsito de

un ión potasio entre el filtro de selectividad y la boca intracelular del canal, mejorando así la

eficiencia del transporte del ión potasio a través del canal silvestre hSlo. Este residuo es común en

los canales de alta conductancia. Se muestra claramente que para la mutante F380I hay una

molécula más de agua entre -4 y -8 Å, lugar donde se encuentra el residuo de fenilalanina en el

canal silvestre. La fenilalanina permite desolvatar al ión potasio, contribuyendo este residuo en

un pasaje más rápido para el ión y por lo tanto la conductancia será mayor en canales donde se

presente este residuo.

59

Concluimos que los canales de alta conductancia poseen a lo menos un sitio más de unión al ión

potasio (al que llamaremos S6), estabilizado por los residuos Glu386 y Glu389 y que además la

presencia de un anillo de residuos hidrófobos generado por las fenilalaninas Phe380, que se sitúa

entre el sitio S4 y S6, contribuye en una mayor eficiencia en el transporte de iones potasio a

través del canal silvestre hSlo. El residuo de fenilalanina de carácter hidrófobo desestabiliza la

primera esfera de solvente durante el tránsito del ión potasio, disminuyendo la energía requerida

para que el ión pase del sitio S4 al sitio S6 y viceversa.

SMD es un método que permite el cálculo del perfil de energía libre a través de un coordenada de

reacción, en nuestro caso la coordenada de reacción es el eje Z, el cual atraviesa exactamente por

el medio del canal. Se realizó un muestreo conformacional del ión potasio mientras cruza el canal

desde el filtro de selectividad hacia la región intracelular. SMD se podría aplicar a otros canales

iónicos así como también a otras proteínas y moléculas de interés científico y biotecnológico,

incluso a escalas tan pequeñas como en la nanotecnología, permitiendo visualizar una interacción

en un menor tiempo de estudio.

60

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