DETERMINACION DE CLOROFILAS A, B, C y CAROTENOIDES TOTALES POR ESPECTROFOTOMETRÍA

Cuando se necesita conocer la contribución de las clorofilas accesorias (b y c) y carotenoides totales, es posible usar métodos bi o tricromáticos. Sin embargo, estos se basan en que la absorbancia de los pigmentos activos es alta y que no existen pigmentos de degradación que interfieran con la lectura. Es apropiado su uso en cultivos algales, pero se obtienen resultados muy variables con comunidades naturales donde es preferible usar : método con corrección por acidificación para la determinación de la clorofila a, método isocrático de HPLC para las clorofilas y método heterocrático de HPLC para clorofilas y carotenoides(Jeffrey et al 1997). SOLVENTE : ACETONA 90% Nota : trabajar con luz tenue y conservando los tubos con las muestras y solvente en baño de agua y hielo. EXTRACCIÓN : 1- Colocar los filtros en tubos de centrífuga y agregar acetona 90% (3ml) 2- Lavar la sonda del sonicador con acetona. Sonicar la muestra 30 segundos (a 4 watts), detener (pausa de 10 segundos), repetir sonicación 30 segundos. El tubo debe estar en baño de agua y hielo. 3- Completar 5 ml de acetona 90%. Tapar herméticamente los tubos y colocarlos en heladera (4C). 4- Extracción en heladera : 20 horas 5- Clarificación del extracto : filtración por GF/C 6- Lectura en espectrofotómetro a las siguientes longitudes de onda (nm):

750, 664, 647, 630, 480 Notas : Path de la cubeta : 1 cm Todas las absorbancias se corrigen por 750 nm (Ax – A750) antes de ingresarlas a las fórmulas. FORMULA BICROMATICA PARA CALCULAR CLOROFILA A y B (Jeffrey & Humphrey 1975) CLO-A (µg/L) = (11.93*A664) – (1.93*A647)* vol extracto (en ml)/vol. filtrado (en L) CLO-B (µg/L)= (20.36*A647) – (5.50*A664) * vol extracto (en ml)/vol. filtrado (en L) FORMULA TRICROMATICA PARA CALCULAR CLOROFILA A, B y C (Jeffrey & Humphrey 1975) CLO-A (µg/L) = (11.85*A664)-(1.54*A647)-(0.08*A630) * vol extracto (en ml)/vol. filtrado (en L) CLO-B (µg/L) = (-5.43*A664)+(21.03*A647)-(2.66*A630) * vol extracto (en ml)/vol. filtrado (en L) CLO-C (µg/L) = (-1.67*A664)-(7.60*A647)+(24.52A630) * vol extracto (en ml)/vol. filtrado (en L)

Nota : clorofila c = clorofila c1+c2 FORMULA PARA CALCULAR CAROTENOIDES TOTALES (Strickland & Parsons 1972, Britton 1985) CAROTENOIDES TOTALES (g/L) = (A480 – A750) * vol. extracto (en ml) / ((100 * E1cm

1%)*(vol filtrado en L)) E1cm

1% = 2500 (100ml g-1 cm-1) coeficiente de extinción específico para los carotenoides totales a 480 nm en acetona 90%, según Britton (1985, tabla V). Nota : path de la cuveta 1cm Bibliografía Strickland, J.D.H. and Parsons, T.R. (1972) A practical handbook of seawaters analysis.

Bull. Fish. Res. Bd. Can. 167:1-20. (Ottawa, 170p.) Jeffrey , S. W. and Humphrey, G. F. (1975) New spectrophotometric equations for

determining chlorophylls a, b, c1 and c2 in higher plants, algae and natural phytoplankton. Biochem. Physiol. Pflanzen. 167: 191-194.

Britton, G. (1985) General carotenoid method. In: Methods in enzymology. Academic Press inc. Ed: J.H. Law and H.C. Rilling (1985), vol. 111: 113-149. (QU135C719)

Jeffrey S. W., Mantoura R. F. C. and Wright S. W. (1997) Phytoplankton pigments in oceanography. Unesco, Paris