DETERMINACIÓN DE FLORA AMBIENTAL, MORFOLOGÍA BACTERIANA, TINCIÓN SIMPLE, TINCIÓN DIFERENCIAL Y

SELECTIVA

Montes Alfredo; Palmeth Carlos; Quintana Adriana.alfredolaroa@gmail.comamqc26@gmail.com

carlospalmeth@hotmail.com

Universidad De CartagenaFacultad De Ciencias Exactas y Naturales

Programa de BiologíaMicrobiología

RESUMEN

Este trabajo de laboratorio se basó en la realización de pruebas de extendidos o frotis a partir de un cultivo de microorganismos, las cuales se sometieron a diferentes tipos de tinción como fue la tinción de diferencial, la tinción de Ziehl Neelsen y la tinción de Gram; además se hizo la clasificación de bacterias por medio de tinción de Gram las cuales se clasificaron en Gram positivas (+) o Gram Negativas (-).

Palabras clave: Tinción diferencial, Bacterias Gram positivas, Bacterias Gran negativas, Frotis, extendidos.

ABSTRACT

This work of laboratory was based on the accomplishment of tests of extended or smear from a culture of microorganisms, which surrendered to different types of tint since it was the tint of differential, Ziehl Neelsen's tint and Gram's tint; the classification of bacteria was done to others by means of Gram's tint which qualified in positive Gram (+) or Gram Negativas (-).

Keywords: Differential tint, Bacteria positive Gram, Bacteria Great denials, Smear, extended.

INTRODUCCIÓN

La morfología bacteriana debe considerarse desde dos puntos de vista:

como células individuales observables sólo al microscopio y

como colonias bacterianas apreciables a simple vista después de desarrollarse en la

superficie de medios de cultivo sólidos.

Las diferencias en el tamaño, forma y ciertos detalles estructurales son características de los principales grupos de bacterias, y proporcionan las bases fundamentales para su estudio sistemático e identificación. De la misma forma, las colonias bacterianas, compuestas por masas de células individuales, tienen características de tamaño, consistencia, textura y color que poseen un valor sistemático, pero no tienen la importancia fundamental de la morfología celular.

Por otra parte el tamaño de las células bacterianas se mide habitualmente en micrómetros, oscilando entre los 1 x 10 µm de los bacilos grandes como Bacillus anthracis, y los 0,2 x 0,7 µm de Francisella tularensis. Existen ligeras variaciones de tamaño de las células bacterianas dentro de algunas especies, siendo mayores las fluctuaciones entre las formas bacilares que entre las formas esféricas. Los límites de tamaño entre las células bacterianas y los virus no tienen una frontera bien definida, pues curiosamente existen virus más grandes que ciertas bacterias.

Desde el punto de vista microscópico, la diferencia más importante entre las bacterias es su forma, existiendo tres tipos morfológicos claramente distinguibles:

Formas esféricas o cocos.

Formas alargadas o bacilos.

Formas curvadas, comas o espirilos

Cocos: Las bacterias esféricas son las más homogéneas con respecto al tamaño, presentando un diámetro medio de 0,6 a 1,0 µm. La forma no siempre es exactamente esférica, observándose como más comunes las siguientes variaciones:

Formas lanceoladas.

Formas en grano de café.

Formas cocobacilares (achatadas)

Las diferencias entre los subtipos de cocos se basan en los agrupamientos celulares. Estos aparecen como consecuencia de dos factores: el plano o planos de división celular y la tendencia de las células hijas a permanecer unidas entre sí, una vez que se completa la división. Los cocos que se separan completamente después de la división aparecen individualmente, esta forma se le llama coco. Cuando hay una ligera tendencia a que las células hijas permanezcan unidas y la división celular ocurre en un solo plano, los cocos se agrupan predominantemente en pares, llamados diplococos. Si la unión es más marcada, se ven largas cadenas de cuatro cocos o más; estos agrupamientos se conocen como estreptococos. Cuando los cocos se dividen en varios planos, y hay una

elevada tendencia a que permanezcan unidos, aparecen racimos irregulares de cocos, semejantes a racimos de uvas; estos agrupamientos se denominan estafilococos. Sin embargo, la separación de subtipos morfológicos no es absolutamente nítida, y en una misma colonia pueden observarse cadenas o racimos junto con formas aisladas o en parejas. A pesar de todo esto, los grupos morfológicos tienen mucho valor práctico en la identificación y clasificación de cocos.

Bacilos: Las formas alargadas o bacilares agrupan una gran cantidad de subtipos morfológicos. Las diferencias en anchura, longitud y forma de los extremos de la célula proporcionan una considerable heterogeneidad a la forma bacilar. En función de la tendencia de las células hijas a permanecer unidas, los bacilos presentan también agrupaciones celulares características, los agrupamientos de células bacilares no tienen la misma importancia morfológica que el agrupamiento de cocos.

Espirilos: El tercer tipo morfológico es la forma espirilar, que puede considerarse como un bacilo que se ha torcido adoptando la forma de hélice. Aunque la curvatura se observa ocasionalmente en muchas formas bacilares, en el género Vibrio es suficientemente constante como para tener importancia diferencial. Los vidrios pueden presentar una

forma espirilar si las células permanecen unidas por sus extremos. Las verdaderas bacterias espirilares pueden ser de dos tipos: con espira rígida o con espira flexible. Al conjunto de las formas espirilares flexibles se le conoce como espiroquetas. La clasificación y diferenciación de las espiroquetas patógenas se basa en criterios morfológicos tales como la longitud de vuelta, el ángulo en los extremos de la célula, la presencia de una envuelta externa y la composición del filamento axial. (Gustavo A. 2010)

METODOLOGÍA

Marzo 18: En una caja de Petri se agregó agar nutrido y se expuso al medio para que bacterias en el aire se pudieran adherir al agar. Esto fue echo en una zona de mucha concurrencia de personas, una zona comercial. Luego se rotulo la caja de Petri y se dejo durante 24 horas en una incubadora a 37⁰C.

Marzo 19: A las 24 horas de incubación se revisó la caja de Petri, luego se tomó una nueva caja de Petri y con un asa esterilizada, se dividió el agar y se realizó una siembra de las cepas que habían crecido en la caja de Petri expuesta al medio a las cuales se les llamó cepa 1, 2, 3. Luego en cada una de las secciones de agar de la nueva caja de Petri. Esta se llevó a la incubadora nuevamente a 37⁰C.

Marzo 21: Se hizo crecimiento por siembra masiva de las Cepas 1, 2, 3 incubadas el día 19 de marzo.

Marzo 25: Se hizo replique de las cepas 1, 2, 3 bacterianas, para luego hacer crecimiento por agotamiento debido a que las bacterias ya habían pasado la fase de meseta e iban en disminución, esto debido a que se habían agotado los nutrientes disponibles en ese agar.

Marzo 26:sSe aplicó tinción de Gram a tres tipos de bacterias y se procedió a mirar en el microscopio en el objetivo de 100X.

Por otro lado se tomó una muestra de frotis bucal y se le aplicó una tinción selectiva.

RESULTADOS

Pasada 24 horas después de exponer el agar al medio, se pudo observar el crecimiento de diferentes tipos de bacterias, esto se determinó juzgando las características de crecimiento macroscópico de la colonia y la textura de esta misma. Una era mocosa y todas crecían en círculos (figura 1).

Posterior a esto el día 21 de marzo, al realizar la nueva siembra se observó el crecimiento de las cepas 1, 2, 3 por separado (figura 2 y 3).

Figura 1. Crecimiento luego de 24 horas de varios tipos de bacterias luego de exponer el agar al medio.

Figura 2. Crecimiento de cepas mucosa.

Figura 3. Crecimiento de cepas diferentes.

El 26 de marzo al terminar la tinción pudimos obtener como resultados de la tinción de la primera cepa cocos gram negativos (figura 4), de la segunda cepa bacilos gram negativos (figura 5) y finalmente de la tercera cepa se obtuvo bacilococos gram negativos (figura 6). En la tinción selectiva no se obtuvo resultado alguno debido a que no se dejó suficiente tiempo con el colorante safranina.

Figura 4. Cepa 1, cocos Gram negativos.

Figura 5. Cepa 2, bacilos Gram negativos.

Figura 6. Cepa 3, bacilococos Gram negativos.

DISCUSIÓN

Los ambientes exteriores o interiores se encuentran un gran número de partículas de diferente origen, forma y tamaño, teniendo en cuenta el origen (biológico, orgánico, inorgánico), la localización (marina, continental, rural, industrial, urbana) y el efecto que pueden causar sobre las superficies en que se depositan (químicos, tóxicos, patogénicos, degradatvo) (Mandrioli, 2002).

La determinación de la microbiota ambiental de un lugar altamente concurrido y en el cual el periodo de exposición de la caja de Petri fue aproximadamente 15 minutos, nos fue posible gran crecimiento de bacterias, teniendo en cuenta que las características macroscópicas de estas colonias eran diversas unas respecto a otras.

Al comparar los resultados obtenidos en los cultivos de las diferentes cepas

obtenidas con los expuestos por Borrego et al.; podemos determinar que en los medios exteriores y en el aire normalmente podemos encontrar gran diversidad de bacterias las cuales pueden ser indispensables en procesos naturales como pueden encontrarse cepas patógenas. Sin embargo que en gran proporción podemos encontrar diversos tipos de bacilos, cocos gram negativos en ambos casos, dentro de lo cual debemos se sabe que las cepas de bacterias Gram negativas pueden ser productoras de endotoxinas que están compuests por lipopolisacáridos relacionados con la membrana bacteriana y al inhalase desencadenan irritación de las muscosas del sistema respiratorio causando diversas enfermedades de tipo respitario (Yang, 2003).

CONCLUSIÓN

Se aprendieron las técnicas de coloración mediante las cuales se clasifican la mayoría de las bacterias, además se llevo a cabo el reconocimiento de bacterias Gram positivas la cuales dieron un color violeta y las Gram negativas dieron un color rosado usando la tinción de Gram. Cabe resaltar que se adquirieron conocimiento de cómo elaborar extendidos o frotis a partir de cultivos de microorganismos

BIBLIOGRAFÍA

Borrego, S. Perdomo, I. De la Paz, J. Gómez de Saravia, S. Guiamet, P.

2011. Relevamiento microbiológico del aire y de materiales almacenados en el Archivo Histórico del Museo de La Plata, Argentina y en el Archivo Nacional de la República de Cuba. UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA. Sección Botánica, 18 (119): 1-18. La Plata, Argentina.

Díaz Martín, G. Centro de Formación Profesional Instituto Villaverde Curso 2009-2010 Pigmentación: Fundamentos y técnicas de análisis microbiológicos Morfología y estructura bacteriana - 9 Laboratorio de Diagnóstico Clínico. 2º curso U.T. 12 - 1 Bloque temático III.

Mandrioli, P. 2002. Bioaerosol and Biodeterioration. Science and Technology for Sustainable Protection of Cultural Heritage. Technical Notes for Session 78. UCL Center for Sustainable Heritage London, UK.

Yang, C.S. 2004. Endotoxins. Aerotech P & K (Aerotech Laboratorios, Inc. and P & K Microbiology Services, Inc.) Version 2003-1.

PREGUNTAS

1. ¿Qué es un frotis y para que se utiliza?R/ Es una prueba que consiste en tomar muestras de las células de un tejido corporal, membrana o líquido el cual se utiliza para la determinación de organismos microscópicos, la muestra se extiende en un

portaobjetos la muestra lo que facilita la observación de los microorganismos en el momento de la tinción.

2. ¿Qué es una tinción?R/ Una tinción es una técnica auxiliar utilizada en microbiología para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas utilizadas son sustancias que se utilizan para resaltar estructuras en tejidos biológicos que van a ser observados con la ayuda de diferentes tipos de microscopios.

3. ¿Qué estructura permite la coloración de las bacterias?R/ la pared bacteriana, la cual presenta en bacterias Gram positivas cuya pared está formada por varias capas superpuestas de peptidoglicano y en la cara externa se encuentran polisacáridos y otras moléculas de ácidos teicoicos los cuales adquieren color violeta oscuro de la tinción de Gram; y en bacterias Gram negativas la pared está formada por una sola capa de peptidoglicano, sobre la que se encuentra una bicapa lipídica y proteica conocida como membrana externa, donde adquieren color rojo o fucsia de la tinción de Gram

4. ¿Cuáles géneros no pueden ser coloreados por la tinción de Gram? ¿Cuál es la razón de ello?R/ Los géneros de bacterias los cuales no pueden ser teñidos por la

tinción de Gram son los siguientes: Mycobacterium y Nocardia.

Esto se da debido a una propiedad física de algunas bacterias a la resistencia de la coloración de la fucsina la cual penetra a la bacteria por acción del fenol, a lo cual se le llama Acido-alcohol resistencia.

5. ¿Qué reacción de Gram darán resultados los cultivos de levaduras? ¿estos resultados tendrán la misma importancia que para las bacterias? ¿por qué?R/

6. ¿Qué es un mordiente? Mencione ejemplos.R/ Es una sustancia que se utiliza en una coloración para hacer más sólida la unión entre el colorante y el sustrato a teñir. El uso de los reactivos mordientes es imprescindible en aquellos casos en que la materia orgánica se muestra refractaria a los colorantes.

Ejemplos: IODO, ácido tánico

7. De ejemplos de 3 bacterias Gram positivas y 3 bacterias Gram negativas. R/ Gram Positivas: Staphylococcus Aureus, Streptococcus Phogenes, streptococcus Agalactiae.

Gram Negativas: Bacillus Antracis, Escherichia Coli, Salmonella Typhy.