PRÁCTICA 6

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA TOTAL

Determinación del Nitrógeno según Kjeldahl

Desde hace más de 100 años se está utilizando el método Kjeldahl para la determinación

del nitrógeno en una amplia gama de muestras. La determinación del nitrógeno Kjeldahl

se realiza en alimentos y bebidas, carne, piensos, cereales y forrajes para el cálculo del

contenido en proteína. También se utiliza el método Kjeldahl para la determinación de

nitrógeno en aguas residuales, suelos y otras muestras.

El método Kjeldahl sirve para determinar el contenido en nitrógeno en muestras

orgánicas e inorgánicas. Se basa en la digestión de la muestra en ácido sulfúrico

concentrado a ebullición, con la adición de un catalizador. La muestra se digiere hasta

disolución y oxidación de la muestra. El nitrógeno contenido en la muestra se convierte

en Amonio Sulfato.

Añadiendo un exceso de solución de sodio hidróxido, el ion amonio es liberado en

forma de amoniaco, destilado y recogido sobre una solución de ácido bórico o sobre una

solución valorada de ácido sulfúrico. El amoniaco recogido es determinado con una

solución valorada de ácido o se valora por retroceso con solución de sodio hidróxido de

concentración conocida, si se recogió sobre ácido sulfúrico.

De todas las moléculas de

importancia biológica, las proteínas son de

las que más se estudian por ser las más

versátiles. Muchas proteínas tienen actividad

biológica, como por ejemplo las enzimas y

las inmunoglobulinas. Otras son proteínas de

transporte que facilitan o controlan el

movimiento de sustancias a través de las

membranas en las células. Otras actúan como

hormonas (ej: insulina) y otras como parte

estructural de las células (ej: microtúbulos y

microfilamentos del citoesqueleto). El

Biólogo molecular puede obtener proteínas a

partir de fraccionamiento celular. Una vez se

separa la célula en sus componentes se

procede a aislar las proteínas para su estudio.

Lo más importante a seguir en la purificación es la recuperacion de la

proteína que nos interesa. Esto puede hacerse por ensayos enzimáticos si es una

enzima, bioactividad si es no-enzimática o algún otro método que sea conveniente,

como electroforesis o cromatografía de columna.

Lo segundo es conocer la cantidad de proteína presente en la muestra.

Existen varios métodos de análisis cuantitativo. El que se use dependerá de la

cantidad de proteína esperada, si la muestra analizada debe ser recuperada o si no

importa que la muestra sea destruída.

Hidalgo Nicho, Eduardo Alejandro

Universidad Ricardo Palma Facultad de Ciencias Biológicas-Escuela de Biología

Curso: Nutrición

Ciclo 2008-I

Los resultados se pueden expresar en % N, % NH3

o proteína (%N x factor).

PROCEDIMIENTO:

Se pesó 0.5 gr. de K2SO4 y 0.5 gr. de CuSO4,

luego ambas sustancias fueron introducidas en un

tubo con el pico largo y angosto cuya finalidad es

evitar que los gases se escapen en el proceso de la

digestión.

La cáscara de piña deshidratada o con un peso

neto (de 3.3 gr.), también fue introducida con el

objetivo de obtener la proteína total. Luego se

echó 3 ml. de H2SO4

a) Digestión de la muestra

En la primera etapa, el hidrógeno y el oxígeno proteico, son oxidados hasta dióxido de

carbono y agua, mientras que el nitrógeno es convertido en sulfato de amonio, por la

acción de un agente oxidante en medio ácido y con la ayuda de un catalizador. Se han

desarrollado diferentes variantes en las cuales cambia el catalizador ó el agente oxidante,

pero en todos los casos, el objetivo final de la etapa de digestión es el de convertir el

nitrógeno proteico en sulfato de amonio. Ocurren dos reacciones:

Mat. Org. +H2SO4 ------------ CO2 + 2SO2+ 2H2O 2NH3 + H2SO4 ---------- SO4(NH4)2

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b) Destilación

En la etapa siguiente, se utilizó

NaOH, que es una base fuerte

y su función es liberar el

amoniaco de la sal de amonio.

Se agregó 10 ml. de hidróxido

de sodio en el tubo grande y

luego se añadió la piña

digerida.

En el erlenmeyer se coloca

ácido bórico (de color rosado)

que, al actuar con el hidróxido

de amonio (resultante del

calentamiento de la mezcla del NaOH y la piña digerida) se transforma en borato de

amonio, fácilmente reconocible por el cambio de coloración (a verde). Se espera que

haya 50 ml. de borato de amonio en el erlenmeyer y se apaga la estufa retirando antes el

erlenmeyer para evitar que todo el líquido contenido en este retorne al tubo grande que

está siendo calentado.

Se puede apreciar como gracias al hidróxido de amonio el ácido bórico

reacciona con este para convertirse en borato de amonio. La reacción es

fácilmente identificada por el cambio de coloración.

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c) Titulación

Al final, se hace la titulación con ácido sulfúrico 0.0025 N (aunque también puede

utilizarse ácido clorhídrico a 0.05N). Se echa H2SO4 hasta que la solución vuelva a

adquirir un color rosado, luego se anota el volumen gastado de la titulación y se hacen

los cálculos respectivos.

CALCULOS:

→

%N = 0. 583

RESULTADOS:

a. Porcentaje de nitrógeno en la muestra: 0.583 %

b. Porcentaje de proteína bruta en la muestra: 0.583 x 6.25 = 3.644 %

Erlenmeyer con la solución titulada

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CUESTIONARIO:

a. ¿Cómo se obtiene el factor 6.25? Explique

El factor 6.25 se deriva del hecho de que la mayoría de las proteínas contiene 16 %

de Nitrógeno. De este modo, 100 entre 16 dará como resultado 6.25.

b. ¿Qué se entiende por proteína bruta o total?

Se entiende por proteína bruta o total al nitrógeno total de la muestra expresada

como proteína. El método empleado no es apto para aquellas sustancias que

contienen enlaces N-N, NO u NO2

c. ¿Qué críticas se le pueden hacer al método utilizado?

Existen otros tipos de mezclas catalíticas (siendo las más empleadas hechas a base de

selenio o mercurio). Estas mezclas catalíticas tienen como objetivo acelerar el proceso

de digestión, que se puede prolongar durante varias horas. En síntesis, aunque el método

utilizado es seguro, podemos utilizar otras mezclas catalíticas para acelerar la digestión.

Claro que debe tenerse en consideración, que la mayoría de estas mezclas catalíticas son

tóxicas y es necesario el uso de la campana extractora para evitar ser contaminados.

APLICACIÓN:

Se tomó dos muestras de pasto y se determinó la cantidad de proteína por el método de

Kjeldahl

MUESTRA 1

Gasto de HCl : 4.6 ml

Normalidad de HCl : 0.0544 N

Peso de la muestra : 0.300 gr.

Meq. Nitrógeno : 0.014

MUESTRA 2

Gasto de HCl : 4.4 ml

Normalidad de HCl : 0.0505 N

Peso de la muestra : 0.300 gr.

Meq. Nitrógeno : 0.014

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Entonces:

Hallando la proteína total en Muestra 1:

% N =

% N = 1.17

% de proteína bruta: 6.31

Hallando la proteína total en Muestra 2:

% N =

% N = 1.03

% de proteína bruta: 6.44

BIBLIOGRAFÍA

http://www.biorom.uma.es/contenido/av_biomo/FigT4/tema4.pdf

http://www.uprm.edu/biology/profs/velez/laboratorio2.htm

http://www.panreac.com/new/esp/productos/docs/re_esp.pdf

http://64.233.169.104/search?q=cache:ujNsG1vU784J:www.monografias.com/trabajos1

0/acig/acig.shtml+factor+6.25&hl=es&ct=clnk&cd=1&gl=pe

http://xtec.es/~ffernan5/castellano/05001.htm

0.300

4.6 x 0.0544 x 0.014 x 100

0.300

4.4 x 0.0505 x 0.014 x 100

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