DETERMINACIÓN DE LA TOXICIDAD AGUDA (CL50) DEL ...
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DETERMINACIÓN DE LA TOXICIDAD AGUDA (CL 50 ) DEL EXTRACTO DE POLVILLO DE CARBÓN FRENTE A LARVAS DE Artemia franciscana. JESÚS DAVID PACHECO GÓMEZ UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA EN CONVENIO CON LA UNIVERSIDAD DE CARTAGENA DEPARTAMENTO DE MEDICINA MAESTRÍA EN TOXICOLOGÍA CARTAGENA 2011
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DETERMINACIÓN DE LA TOXICIDAD AGUDA (CL50) DEL EXTRACTO DE
POLVILLO DE CARBÓN FRENTE A LARVAS DE Artemia franciscana.
JESÚS DAVID PACHECO GÓMEZ
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
EN CONVENIO CON LA UNIVERSIDAD DE CARTAGENA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA
MAESTRÍA EN TOXICOLOGÍA
CARTAGENA
2011
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DETERMINACIÓN DE LA TOXICIDAD AGUDA (CL50) DEL EXTRACTO DE
POLVILLO DE CARBÓN FRENTE A LARVAS DE Artemia franciscana.
JESÚS DAVID PACHECO GÓMEZ
CÓDIGO: 598923
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de:
Magíster en Toxicología
DIRECTOR:
JESÚS OLIVERO VERBEL, PhD
Línea de Investigación:
Ecotoxicología
Grupo de Investigación:
Química ambiental y computacional
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
EN CONVENIO CON LA UNIVERSIDAD DE CARTAGENA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA
MAESTRÍA EN TOXICOLOGÍA
CARTAGENA
2011
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Nota de aprobación:
El trabajo titulado “Determinación de la Toxicidad Aguda (Cl50) del Extracto de
Polvillo de Carbón Frente a Larvas de Artemia Franciscana”, presentado por el
estudiante Jesús David Pacheco Gómez, como requisito parcial para optar al título
de Magíster en Toxicología, fue evaluado y calificado por los evaluadores:
Firma del director del trabajo
Firma del jurado
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RESUMEN
El carbón es una de las fuentes de energía más utilizada, su uso es globalizado y
está muy ligado con el desarrollo industrial, sin embargo, es considerado como el
contaminante de fuente de energía fósil más importante del mundo y su
explotación está relacionada con la aparición de efectos tóxicos en diferentes
organismos. El presente estudio tuvo por objetivo determinar la concentración letal
media (CL50) del extracto metanólico de polvillo de carbón frente a larvas de
Artemia franciscana; logrado mediante la exposición de las mismas a diferentes
concentraciones del extracto (1.25 mg/L, 2.5 mg/L, 5 mg/L, 10 mg/L, 20 mg/L),
utilizándose como blanco dimetil sulfóxido (DMSO) a una concentración de 20
mg/L. Los resultados fueron procesados con el método Probit, obteniéndose
valores de CL50 de 8.89 mg/L y 4.20 mg/L tras exposiciones de 24 y 48 horas
respectivamente. De acuerdo con los resultados obtenidos, pudo concluirse que el
polvillo de carbón es una sustancia potencialmente citotóxica al mostrar una CL50
menor a 10 mg/L, indicando el grado de peligrosidad de dicho material,
especialmente para los ecosistemas marinos y/o estuarinos (hábitat de A.
franciscana).
Palabras claves: Polvillo de carbón, concentración letal media, Artemia
franciscana.
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ABSTRACT
Coal is a widely used source of energy, its use is global and is closely linked with
industrial development; however, it is considered worldwide as the most notorious
polluting fossil energy source and its use is associated with toxic effects in different
organisms. This study was focused into determine the median lethal concentration
(LC50) of methanolic coal dust extract in larvae of Artemia franciscana by exposing
the larvae to different concentrations of methanolic coal dust extract (1.25 mg/L,
2.5 mg/L, 5 mg/L, 10 mg/L, 20 mg/L) targeting with dimethyl sulfoxide (DMSO) at a
concentration of 20 mg/L. Results were processed by Probit’s method. LC50 equal
to 8.89 mg/L and 4.20 mg/L at 24 and 48 hours respectively were measured.
According to the results, it could be concluded that coal dust is a potentially
cytotoxic substance showing a LC50 less than 10 mg/L, indicating high level of
danger, especially for marine and / or estuarine biomes (habitat of A. franciscana).
Keywords: coal dust, median lethal concentration, Artemia franciscana.
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AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer a mi director el profesor Jesús Olivero Verbel por haberme
permitido el honor de trabajar con él y de abrirme las puertas en su prestigioso
grupo de investigación y porque a través de su accionar como ser humano, me ha
inspirado el deseo de seguir luchando por alcanzar mis sueños y de esforzarme
cada día por hacer las cosas mejor. De igual manera quiero darle gracias al
personal del Grupo de Investigación de Química Ambiental y Computacional De La
Universidad De Cartagena por la colaboración brindada, en especial a la QF Nadia
Coronado, quien fue de gran apoyo para la consecución de los implementos del
laboratorio. De igual manera me gustaría reconocer la labor de mis profesores de
la maestría, el esfuerzo de mis padres al apoyarme en esta lucha y sobre todo
quiero darle gracias a Dios que nunca me abandonó cuando más lo necesitaba.
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CONTENIDO
Pág.
1. INTRODUCCIÓN 14
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 17
3. JUSTIFICACIÓN 19
4 OBJETIVOS 21
4.1 GENERAL 21
4.2 ESPECÍFICOS 21
5. MARCO TEÓRICO 21
5.1 EL CARBÓN 22
5.1.1 El Carbón en Colombia 24
5.1.2 Efectos ambientales del polvillo de carbón 27
5.1.3 Efectos tóxicos del polvillo de carbón 33
5.2 CARACTERÍSTICAS DE LA ESPECIE UTILIZADA
(Artemia franciscana) 35
5.2.1 Parámetros para la eclosión y el mantenimiento
de Artemia franciscana en el laboratorio 37
5.2.2 Bioensayos de toxicidad aguda en Artemia franciscana 38
6. METODOLOGÍA 40
6.1 OBTENCIÓN DEL POLVILLO DE CARBÓN, DEL AGUA
DE MAR, Y DE LAS LARVAS DE Artemia franciscana 40
6. 2 TRATAMIENTO DEL AGUA DE MAR EN EL LABORATORIO 41
6. 3 PREPARACIÓN DEL EXTRACTO DE CARBÓN 42
6.4 ENSAYOS DE TOXICIDAD CON A. franciscana 43
6.4.1 Exposiciones preliminares 43
6.4.2 Exposición final 44
6.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 45
7.RESULTADOS Y DISCUSIÓN 47
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7.1 EVALUACIÓN CLÍNICA DE LA EXPOSICIÓN DE LA Artemia
franciscana AL EXTRACTO METANÓLICO DE POLVILLO DE CARBÓN 47
7.2 CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA DEL EXTRACTO METANÓLICO
DE POLVILLO DE CARBÓN 50
7.3 ANÁLISIS GRÁFICO DE LA EXPOSICIÓN DE LA Artemia franciscana
AL EXTRACTO METANÓLICO DE POLVILLO DE CARBÓN 53
7.4 IMPLICACIONES AMBIENTALES DEL POLVILLO DE CARBÓN Y
UTILIDAD DE LOS BIOENSAYOS PARA DETERMINAR SU
PELIGROSIDAD 56
8. CONCLUSIONES 61
9. RECOMENDACIONES 62
BIBLIOGRAFÍA 63
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Tabla 1. Tipos de carbón y sus características Tabla 2. Normatividades relacionadas con la minería de carbón en Colombia Tabla 3. Características toxicológicas y ambientales de algunos de los materiales que constituyen el polvillo de carbón. Tabla 4. Algunos parámetros propuestos por la FAO para la eclosión y mantenimiento de la Artemia franciscana. Tabla 5. Concentración letal media, índice de vulnerabilidad ycoeficiente de variación del extracto de carbón sobre larvas de Artemia franciscana a diferentes períodos de exposición. Tabla 6. CL50 para diferentes sustancias
LISTA DE TABLAS
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30
38
50
60
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Figura 1.Vista en estereomicroscopio (3X) de diferentes estadíos del ciclo de vida de la Artemia franciscana. A huevos, B rotura de la membrana, C estadío de gota (membrana de eclosión unida al corion), Dnauplio, Emetanauplio 24-h, Fmetanauplio 48-h. Figura 2. Exposicion por triplicado de las larvas de artemia franciscana a diferentes concentraciones de extracto metanólico de polvillo de carbón Figura 3. Fórmula de Abbot.
Figura 4.A. Larva de Artemia franciscana del control B. Larvas de Artemia franciscana agonizando luego de ser expuesta a una solución de 200 mg/L de extracto metanólico de polvillo de carbón Figura 5. Diferencias en el abdomen de A animal no expuesto y B animal expuesto al extracto metanólico de polvillo de carbón Figura 6. Efectos de la concentración de polvillo de carbón sobre la mortalidad de metanauplios de Artemia franciscana. Figura 7. Concentración letal media del extracto de carbón a diferentes tiempos de exposición.
LISTA DE FIGURAS
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48
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1. INTRODUCCIÓN
Colombia es un país privilegiado al contar con las mayores reservas de carbón de
América Latina y ocupar el quinto lugar entre los países que más carbón térmico
exportan en el mundo [47], siendo la zona minera de la Región Caribe
(conformada por los departamentos de Guajira, Cesar y Córdoba) donde es
producido el 90% del carbón térmico de todo el país [77]. Sin embargo, pese a los
múltiples beneficios que otorga la comercialización del carbón, su producción
genera un gran desconcierto, debido a que en todas las etapas que involucran la
explotación carbonífera, son liberadas algunas partículas conocidas como polvillo
de carbón, las cuales pueden ocasionar efectos tóxicos en los organismos [3],
[14], [15], [47], [50] y perjuicios en el medioambiente [25], [68], [82].
El carbón es una de las fuentes de energía más utilizada en la actualidad, su uso
es globalizado y está muy ligado con el desarrollo industrial, no obstante, ha sido
catalogado como el contaminante de fuente de energía fósil más importante del
mundo al contener algunos compuestos como el dióxido de azufre y sus derivados
[82], materiales constitutivos de gran toxicidad como los hidrocarburos aromáticos
policíclicos (HAP), considerados como agentes mutagénicos y/o carcinogénicos
[19], [33] y altas concentraciones de diversos metales pesados que incluyen:
Cobre (Cu), Plomo (Pb), Cadmio (Cd), Níquel (Ni), Vanadio (V) y Zinc (Zn) [44],
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[58], sin dejar de lado, que las enfermedades pulmonares de origen ocupacional
más diagnosticadas en el mundo, han sido las provocadas por la inhalación de
polvos minerales como el polvillo de carbón [39].
Hasta hace pocos años no existían muchos estudios que manifestaran
alteraciones en el pulmón por acción del polvillo de carbón, debido a que la
mayoría de investigaciones relacionadas con el tema, estaban centradas en
demostrar efectos tóxicos por la deposición de partículas industriales como el
asbesto y sílice [9]. Sin embargo, la preocupación generada a partir de las
consecuencias observadas en aparente correspondencia con la minería del
carbón, conllevó al desarrollo de diferentes investigaciones, reportándose en
algunas de ellas que la exposición al polvillo de carbón puede conducir a diversas
enfermedades en humanos como la neumoconiosis, bronquitis, enfisema, fibrosis,
cáncer y otros eventos patológicos relacionados [15] y afectar la salud de
diferentes organismos como: bacterias [55], anélidos [51], peces [73], plantas [34]
y roedores [40].
El estudio de los efectos tóxicos del polvillo de carbón, no puede pasar
desapercibido en Colombia, menos cuando este recurso es explotado sin llegarse
a observar una verdadera voluntad por parte de los gobiernos de controlar de una
manera más rigurosa los impactos generados por la minería de carbón. De este
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modo, algunos investigadores colombianos han mostrado interés en contrarrestar
esta situación mediante la realización de estudios como el desarrollado por [47]
quien reporta algunas alteraciones en el ADN de roedores provenientes de zonas
mineras en el departamento de Córdoba, al igual que las investigaciones que
sobre este aspecto viene desarrollando el Grupo de Investigación de Química
Ambiental y Computacional de la Universidad de Cartagena.
Con el fin de seguir avanzando en el desarrollo del conocimiento sobre la toxicidad
del carbón y explanar algunos vacíos de información sobre este tema, fue
desarrollado un bioensayo para determinar la concentración letal media del
extracto metanólico de polvillo de carbón sobre la especie Artemia franciscana, la
cual cuenta con ciertas condiciones fisiológicas, adaptativas y de desarrollo que
favorecen su uso en el laboratorio [10] y representa un importante eslabón en la
cadena trófica de los ecosistemas marinos y estuarinos.
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2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
A pesar de que algunas de las enfermedades pulmonares ocupacionales de mayor
prevalencia en el mundo son las provocadas por la inhalación de polvos minerales
como el asbesto, sílice y polvillo de carbón [39], aún existen muchas dudas sobre
el mecanismo de acción del polvillo de carbón y su potencial para causar daños a
los diferentes organismos, razón por la cual, muchos investigadores centran sus
esfuerzos en el esclarecimiento de estas dudas, con el fin de brindar una
información veraz, copiosa y oportuna que oriente a los entes de control en la
toma de decisiones.
Al realizarse una búsqueda bibliográfica en la base de datos NLM Gateway
utilizando los términos coal AND toxic* pudo obtenerse un total de 3237 recursos,
de los cuales 1517 correspondieron a MEDLINE/PubMed, mientras que 1161 a
TOXLINE Subset. De estos, solamente 4 trabajos fueron realizados en Colombia,
representando apenas el 0.12% de la información disponible conforme a los
términos de búsqueda señalados, lo que es muy poco, teniendo en cuenta que
Colombia es el quinto país que más carbón térmico exporta en el mundo.
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Ante esta situación, el Grupo de Investigación de Química Ambiental y
Computacional de la Universidad de Cartagena, viene adelantando una serie de
investigaciones que buscan dar respuestas a las diferentes interrogantes que
persisten sobre los posibles efectos tóxicos y ambientales que puede acarrear la
minería del carbón, entre ellas, el hecho de no encontrarse en la literatura
consultada, estudios que indiquen la concentración letal media del polvillo de
carbón. Por tal motivo y con el fin de seguir avanzando en el desarrollo de la
toxicología en nuestro país, es necesario subsanar este vacío de información,
mediante la resolución de la siguiente pregunta: ¿Cuál es la concentración letal
media del polvillo de carbón sobre larvas de Artemia franciscana expuestas
durante 24-h y 48-h?
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3. JUSTIFICACIÓN
A pesar de que Colombia es un país minero y que cuenta con el privilegio de
poseer las mayores reservas naturales de carbón de América Latina y ser el quinto
exportador de carbón térmico en el mundo, son pocas las personas que tienen
conocimiento sobre los efectos tóxicos y ambientales del polvillo de carbón. Esto
puede ser atribuido a que la información que la nación genera sobre esta
problemática es muy limitada, teniéndose que recurrir a experiencias desarrolladas
en otros países, donde las condiciones bióticas, abióticas y “humanas” son muy
diferentes de las nuestras.
La minería del carbón no solo trae consigo impactos locales, sino que de manera
silenciosa puede afectar zonas alejadas de la mina, mediante la facultad que tiene
el polvillo de carbón de ser arrastrado por el aire y las escorrentías, observándose
grandes cantidades de este material depositado en la superficie de los árboles que
bordean las vías férreas de los trenes transportadores de carbón, al igual que
sobre la arena de las playas de sitios cercanos a puertos carboníferos, generando
seguramente preocupación en las comunidades vecinas y un impacto negativo
sobre la pesca, el turismo y en general en los aspectos socio-culturales de los
habitantes de la región.
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Por lo anterior y al no encontrarse reportes que indiquen la CL50 del polvillo de
carbón, fue necesario desarrollar un bioensayo de letalidad del extracto metanólico
de polvillo del carbón sobre la especie Artemia franciscana, con el fin de demostrar
de una manera clara, los efectos del mismo sobre el medioambiente y la salud de
un organismo indicador de gran importancia ecológica, al hacer parte del
zooplancton de los sistemas marinos y por ende un recurso importante en la
cadena trófica, el cual permitirá contribuir en la explanación de este vacío de
información y captar la atención de los científicos del país y entidades
ambientales, para que tomen interés en profundizar sobre esta problemática,
generando beneficios académicos y sociales.
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4. OBJETIVOS
4.1 GENERAL
Determinar la toxicidad aguda (Cl50) del extracto de polvillo de carbón frente larvas
de Artemia franciscana.
4.2 ESPECÍFICOS
Diferenciar los efectos clínicos observados en los individuos expuestos a
diferentes concentraciones de polvillo de carbón.
Calcular la concentración letal media del extracto de polvillo de carbón a
diferentes tiempos de exposición.
Evaluar la toxicidad del polvillo de carbón para Artemia franciscana de
acuerdo con su concentración letal media y sus implicaciones en el medio
ambiente.
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5. MARCO TEÓRICO
5.1 EL CARBÓN
El carbón es un combustible natural, sólido, formado a partir de plantas
prehistóricas, presentándose las condiciones favorables para su formación natural
hace aproximadamente entre 40 y 60 millones de años en la Era Terciaria
“formación de carbón blando” y hace más de 250 millones de años en la Era
Carbonífera “formación de carbón bituminoso” [72].
En términos generales el carbón consta de dos componentes, los macerales y las
cenizas. Los macerales son restos vegetales que conforman la parte orgánica del
carbón, mientras que las cenizas están conformadas por componentes inorgánicos
no combustibles. Este último puede proceder tanto de los tejidos vegetales, como
de material agregado posterior a la diagénesis [67].
Debido a la variedad de procesos y a las condiciones del terreno que
acompañaron la génesis del carbón, este presenta notables diferencias en su
composición. En la Tabla 1 son descritos los diferentes tipos de carbón y su uso
en diferentes industrias, razón por la cual, el impacto que puede generar en el
ambiente es variado.
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Tabla 1. Tipos de carbón y sus características
TIPOS DE CARBÓN DESCRIPCIÓN
Antracita
También denominado carbón duro, con alto contenido de carbono
(86% al 98%), bajo contenido de materia volátil y poder calorífico
superior a 32.6 MJ/Kg (14.000 BTU/lb). Usado como combustible
en generación de calor o vapor en la industria térmica, siderúrgica,
en la fabricación de goma sintética, colorantes y purificación de
agua para consumo humano (filtros).
Hulla Bituminosa
Este tipo de carbón posee un menor contenido de carbono y menor
poder calorífico que los carbones antracíticos. Por su forma de uso
son conocidos como carbones coquizables. Son empleados en
procesos de obtención del acero y en la producción de vapor para
generaciónde energía.
Hulla Sub-bituminosa
Con menor poder calorífico que los carbones bituminosos, su
composición en carbono está entre 35% y 45%, tiene un elevado
contenido de material volátil, algunos con poder coquizable. Es
empleado en la generación de energía eléctrica y en procesos
industriales.
Lignito y Turba
Son carbones con alta humedad y alto contenido de ceniza y de
material volátil, lo cual hace que posean un bajo poder calorífico. Es
empleado para calefacción, energía eléctrica, para algunos
procesos industriales que requieren generar vapor y como briquetas
para quemarlas en hornos.
Fuente: [76].
El carbón puede ser usado para muchos propósitos debido a que está conformado
por componentes orgánicos y minerales. Los componentes orgánicos son
fundamentales para definir la naturaleza del carbón (Por ejemplo, rango y tipo) y
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establecer su valor en los diferentes procesos donde es utilizado al proveer todos
los beneficios derivados del carbón (producción de energía en la combustión,
absorción de metano “In situ”, su papel en metalúrgica y su potencial como fuente
alternativa de hidrocarburos). Mientras, que la fracción inorgánica generalmente
contribuye poco y está relacionada con la mayoría de los problemas asociados al
carbón [81].
Cuando el carbón es sometido a efectos mecánicos, puede generar partículas
conocidas como polvillo de carbón. Este material es producido principalmente en
las operaciones de voladura, perforación, tallado y acarreo del mineral [7]; sus
características dependen de la fuente y el rango del mismo [4], [56] y está
constituido de algunos materiales como el carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno,
minerales inorgánicos, cuarzo, trazas de metales como el Cadmio, Hierro, Boro,
Cobre, Níquel, Antimonio, Zinc, Plomo y algunos otros contaminantes como el
Sodio, Calcita, Titanio, Mica, Pirita, Azufre y Magnesio [46].
5.1.1 El Carbón en Colombia. Colombia posee una gran variedad de minerales,
constituyéndose en un país donde la minería es una de las principales bases de la
economía. De igual forma, cuenta con importantes zonas de reservas naturales y
yacimientos de agua, que muchas veces son afectados por las actividades de la
minería formal e informal.
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Alberga las mayores reservas de carbón de América Latina y ocupar el quinto
lugar entre los países que más exportan carbón térmico en el mundo [47]. Cuenta
con reservas de carbón en prácticamente todas las regiones del territorio nacional,
destacándose la Región Caribe, donde es producido el 90% del carbón térmico de
todo el país [77]. Otras zonas de explotación minera la constituyen: Antioquia y
Antiguo Caldas, Valle del Cauca y Cauca, Huila y Tolima, Cundinamarca, Boyacá,
Santander, Norte de Santander, borde llanero y llanura amazónica [18].
Encontrándose en la Cordillera Oriental los mejores carbones bituminosos del país
[76].
En la Costa Atlántica predomina la minería a cielo abierto, tecnificada y a gran
escala, esta requiere de altos niveles de inversión que garantizan una
infraestructura tecnológica adecuada para desarrollar eficientemente las labores
de exploración, explotación, transporte y embarque; mientras que en el interior del
país prevalecen las explotaciones poco tecnificadas y bajo tierra [76].
Colombia abastece principalmente los mercados de EE. UU y Europa y ha venido
posicionándose en países como República Dominicana, Puerto Rico, Guatemala y
Jamaica e incrementando las exportaciones por el litoral pacífico hacia Chile, Perú
y Ecuador. No obstante, la visión generalizada frente a los problemas ambientales
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asociados a la combustión de carbón es negativa, dificultando su utilización en el
país [76].
Normatividad del carbón en Colombia. La legislación, reglamentación,
regulación y normatividad colombiana, en general, es caracterizada por ser muy
dinámicas y estar en constante cambio y evolución con el objeto de ser mejoradas
y actualizadas [18]. La información suministrada a continuación corresponde a los
datos más actuales de dicha información, de este modo, en la Tabla 2, pueden
observarse las principales normatividades relacionadas con la problemática
ambiental del polvillo de carbón.
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Tabla 2. Normatividades relacionadas con la minería de carbón en Colombia
TIPO DE NORMA NÚMERO Y AÑO CONTENIDO
Decreto ley 2811 de 1974 Código de los Recursos Naturales. Ley
9 de 1979
Código Sanitario Nacional.
Ley 99 de 1993 Crea el Ministerio del Medio Ambiente y organiza el Sistema Nacional Ambiental (SINA).
Decreto 948 de 1995 En relación con la prevención y control de la contaminación atmosférica y protección de la calidad del aire.
Resolución 1351 de 1995 Adopta la declaración denominada Informe de Estado de Emisiones.
Ley 491 de 1999 Define el Seguro Ecológico y delitos contra los recursos naturales y el ambiente y modifica el Código Penal.
Ley 685 de 2001 Expide el Código de Minas y dicta otras disposiciones.
Resolución 180861 de 2002 Establecen las guías minero-ambientales de exploración, explotación, beneficio y transformación.
Decreto 1180 de 2003 Reglamenta el título VIII de la Ley 99 de 1993 sobre Licencias Ambientales y deroga el Decreto 1728 de 2002.
Fuente: [18]
5.1.2 Efectos ambientales del polvillo de carbón. La minería del carbón
requiere la degradación extensiva del entorno natural, ocasionando consecuencias
difícilmente reparables para el paisaje y posibles efectos negativos en la
supervivencia de los organismos que pudieran resultar expuestos durante estas
actividades, además de promover el deterioro de la salud del ambiente y por ende
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de los organismos. Entre los impactos generados por la minería del carbón, puede
destacarse la producción de residuos, los cuales pueden ser muy peligrosos y
problemáticos para el medioambiente, al provocar alteraciones considerables en
las condiciones de los cuerpos agua, del suelo y de la atmósfera. Uno de estos
residuos es el polvillo de carbón, el cual resulta del fraccionamiento de rocas de
carbón, por lo que consta de los mismos componentes de la roca madre y puede
ser arrastrado por el aire o por el agua, generando conflictos en los ecosistemas
donde es depositado.
El carbón ha sido catalogado como uno de los combustibles más sucios del
mundo, al contener compuestos como el dióxido de azufre y sus derivados [82],
algunos minerales inorgánicos como el cuarzo, trazas de metales como el Cadmio,
Hierro, Boro, Cobre, Níquel, Antimonio, Zinc, Plomo y algunos otros contaminantes
como el Sodio, Calcita, Titanio, Mica, Pirita, Magnesio [46]. Representando estos
componentes un riesgo para los trabajadores de las minas, para el ambiente y
para la salud de la población en general, debido a la posibilidad de que dichos
compuestos penetren las fuentes de agua o puedan distribuirse en la atmósfera en
cantidades significativas [68].
Un ejemplo de lo anterior, lo podemos ver reflejado en algunos informes del Banco
de Datos del Sistema Único de Salud en Brasil (DATASUS), donde es manifestado
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que en la ciudad de Lauro Müller-Brasil, ubicada en una zona cuya principal
actividad económica es la minería de carbón y la dirección del viento favorece a
una exposición casi continua de polvillo de carbón durante gran parte del año, el
30% de los procedimientos médicos son causados por enfermedades en las vías
respiratorias, y el 4%, relacionado con diferentes tipos de cáncer [15]. Cabe anotar
que muchos de los oligoelementos contenidos en el carbón son contaminantes
problemáticos para la salud y el medioambiente [78], algunos de ellos reconocidos
por causar cáncer, otros por afectar la reproducción y el desarrollo normal de los
niños, y otros por generar daños en los sistemas nervioso e inmune, sin contar los
muchos efectos que pueden ocasionar sobre las vías respiratorias [36].
Ante esta situación, es preocupante la gran cantidad de partículas de carbón
(entre otros residuos) liberado de las actividades mineras y durante los procesos
de transporte y almacenamiento del mismo, lo cual puede ser observado en la
gran cantidad de carbón que es depositado en la superficie de los árboles
ubicados a lo largo de las vías férreas que recorren los trenes carboníferos de la
costa Caribe colombiana y en ciudades turísticas como Santa Marta (Colombia)
donde el carbón de los terminales marítimos puede distribuirse sobre las playas y
zonas de bajamar generando una notable alteración del paisaje y una afectación a
las comunidades bentónicas al promoverse condiciones de anoxia por el
cubrimiento del suelo marino [25].
Tabla 3. Características toxicológicas y ambientales de algunos de los materiales que constituyen el polvillo de carbón.
COMPONENTE EFECTOS AGUDOS EFECTOS CRÓNICOS EFECTOS AMBIENTALES
CUARZO Neumoconiosis y probablemente cáncer en
seres humanos.
CADMIO Por vía respiratoria causa lesión pulmonar,
por vía digestiva irritación grave del
estómago produciendo vómitos y diarrea.
Acumulación en los riñones y posiblemente
enfermedad renal. Otros efectos de la
exposición prolongada consisten en daño
del pulmón y fragilidad de los huesos.
No es degradado en el ambiente, pero sí cambia de
forma. Las partículas de cadmio en el aire pueden
movilizarse largas distancias antes de depositarse en la
tierra o el agua, puede adherirse fuertemente a
partículas del suelo y algunas formas de cadmio son
solubles en agua. Las plantas, los peces y otros
animales incorporan cadmio del ambiente.
BORO Irritación de la nariz, la garganta y los ojos,
la cual generalmente desaparece al
abandonar el área de exposición. Puede
afectar el estómago, los intestinos, el
hígado, el riñón el cerebro y sistema
reproductivo en machos. Eventualmente
puede causar la muerte.
Puede afectar el sistema reproductivo de los
machos, especialmente los testículos.
El boro no puede ser destruido en el ambiente,
solamente puede cambiar de forma o adherirse o
separarse de partículas en el suelo, el sedimento y el
agua.
COBRE Por vía aérea genera Irritación de la nariz y
la garganta. La ingestión produce náuseas,
vómitos y diarrea. Cantidades muy altas
pueden dañar el hígado, los riñones y
causar la muerte.
Todo el mundo debe absorber pequeñas
cantidades de cobre diariamente debido a
que el cobre es esencial para la salud.
El cobre liberado al ambiente generalmente es adherido
a partículas de materia orgánica, arcilla, tierra o arena.
No es degradado en el medio ambiente.
fuente: http://www.atsdr.cdc.gov/
28
Continuación de la Tabla 3. Características toxicológicas y ambientales de algunos de los materiales que constituyen el
polvillo de carbón.
COMPONENTE EFECTOS AGUDOS EFECTOS CRÓNICOS EFECTOS AMBIENTALES
NÍQUEL El efecto adverso más común en seres
humanos es una reacción alérgica.
Por exposición aérea puede ocasionar
bronquitis crónica y alteraciones del pulmón.
Mientras que por vía digestiva causa
dolores de estómago y efectos adversos en
la sangre y los riñones.
En el aire, es adherido a pequeñas partículas de polvo
que son depositadas en el suelo o son removidas del
aire en la lluvia o la nieve. El níquel no parece
acumularse en peces o en otros animales usados como
alimentos.
ANTIMONIO La principal vía de exposición es la aérea,
puede ocasionar irritación en los ojos, los
pulmones, trastornos del corazón, de los
pulmones, de los riñones, dolor de
estómago, diarrea, vómitos y úlceras
estomacales.
Irritación de los ojos, caída del pelo, daño
pulmonar y trastornos del corazón.
Puede permanecer en el aire adherido a partículas muy
pequeñas por muchos días. La mayoría del antimonio
en el aire es depositado en el suelo, en donde es
adherido firmemente a partículas que contienen hierro,
manganeso o aluminio.
PLOMO Daño cerebral y de los riñones en niños y
adultos, es embriotóxico y puede alterar la
producción de espermatozoides. Puede
causar la muerte
Deteriora las funciones del sistema
nervioso, puede producir debilidad en los
dedos, las muñecas o los tobillos. Produce
un pequeño aumento de la presión
sanguínea, especialmente en personas de
mediana edad y de edad avanzada, y puede
causar anemia
El plomo no es degradado en el ambiente, pero los
compuestos de plomo son transformados por la luz
natural, el aire y el agua. Cuando es liberado al aire,
puede movilizarse largas distancias antes de
depositarse en el suelo, donde puede adherirse a
partículas. La movilización del plomo desde el suelo al
agua subterránea dependerá del tipo de compuesto de
plomo y de las características del suelo.
fuente: http://www.atsdr.cdc.gov/
29
5.1.3 Efectos tóxicos del polvillo de carbón. El polvillo de carbón es
generado a partir del carbón mineral durante los procesos de extracción,
transporte, o por medios mecánicos durante su manipulación; por tal motivo,
de no tomarse las medidas preventivas necesarias, puede ser inhalado, ya
que la principal vía de ingreso es la respiratoria, encontrándose en estudios
post mortem realizados en mineros de carbón, que hasta 30 g de polvo total
puede depositarse en los pulmones, con tasas de acumulación anual de 0.4 -
1.7 g [31], [61].
El polvillo de carbón una vez depositado en los pulmones, llega
principalmente a dos células diana: los macrófagos y células epiteliales del
pulmón [23], encontrándose en algunos estudios realizados tanto en
personas como en animales expuestos crónicamente, un aumento en el
número de macrófagos alveolares, los cuales contenían las partículas de
carbón ingeridas [21], [37]. Sin embargo, otras células, al igual que los
componentes intersticiales, pueden verse afectados por la presencia de las
partículas de carbón [23].
La inhalación de polvos como el de carbón, puede desencadenar la
liberación de sustancias que incluyen: los eicosanoides, citocinas, especies
reactivas de oxígeno (ROS), factores de crecimiento celular y el factor
30
activador de plaquetas, entre otros, que de no ser controlados podrían
desencadenar un efecto patógeno [43], manifestándose que el mecanismo
esencial por el cual el polvo de carbón puede inducir a una lesión pulmonar,
consiste en la activación de macrófagos y el reclutamiento de células
polimorfonucleares, incidiendo en la liberación de mediadores inflamatorios,
como los ROS [41], que de producirse excesivamente o de no
contrarrestarse su acción, conducen a un estado de estrés oxidativo, que
puede inducir daño molecular y/o muerte celular [9], [29], [48].
Cabe destacar que la exposición de humanos al polvillo de carbón, puede
conducir a diversas enfermedades, tales como la neumoconiosis, bronquitis,
enfisema, fibrosis, cáncer y otros eventos patológicos relacionados [15] y
aunque no hay pruebas suficientes sobre su carcinogenicidad en el hombre
[13], diversos estudios realizados en ratas han manifestado un incremento en
la proliferación de células epiteliales y cáncer de pulmón después de la
exposición a dichas partículas [3], [14].
Algunos investigadores han propuesto mecanismos de toxicidad del polvillo
de carbón que involucran diversos modelos biológicos, encontrándose
efectos sobre la actividad citotóxica y mutagénica en mamíferos [71], [63], en
sistemas bacterianos [5], [22], puede aumentar la expresión hepática de L5 y
31
CYPlAl (genes que codifican proteínas que desempeñan un papel crucial en
el metabolismo celular), en salmones juveniles [26], reduce significativamente
la actividad fotosintética de la especie de mangle Avicennia marina [34],
puede obstruir los estomas de algunas plantas [57], restringe la luz que
incide sobre las hojas [50], merma la absorción de CO2 [34] y limita el
crecimiento de las plantas [50].
5.2 CARACTERÍSTICAS DE LA ESPECIE UTILIZADA (Artemia
franciscana).
La Artemia franciscana es una especie primitiva de crustáceo perteneciente
al orden anostraca, distribuida en los lagos de agua salada y mares de todo
el mundo y está adaptada a sobrevivir en cuerpos de agua que sufren
grandes variaciones de sal que van desde 5 a 150 ups [24]. Esta especie es
capaz de depositar huevos que constan de un quiste integrado por
aproximadamente 4000 células, las cuales le confieren gran resistencia en
condiciones extraordinarias de estrés fisiológico [6]. Mientras los huevos
permanezcan bajo condiciones de estrés, estarán metabólicamente inactivos
(letargo); una vez dadas las condiciones ambientales específicas, los huevos
reanudan su metabolismo y desarrollo, hasta finalmente emerger en forma
de nauplios [65]. El desarrollo del embrión hasta la eclosión dura
aproximadamente 24 horas en condiciones adecuadas, llegando a su fase
32
adulta en 20-30 días de vida libre, favoreciendo su uso en estudios de
toxicidad aguda [10].
En general las especies pertenecientes al orden anostraca poseen un cuerpo
dividido en cabeza, tórax y abdomen, con apéndices torácicos no
especializados y semejantes entre sí, mientras que el abdomen carece de los
mismos. Los dos segmentos posteriores del tórax corresponden a la zona
genital, mientras que el abdomen corresponde a seis segmentos posteriores
a esta y concluye con el telson, el cual a su vez lleva un par de furcas
caudales en su fin. En la cabeza de los adultos pueden observarse un par de
ojos compuestos y uno simple, los nauplios por su parte, constan de un ojo
medial hacia el final anterior denominado ojo naupliar. El apéndice del primer
segmento de la cabeza es el primer par de antenas, las cuales no son
articuladas y presentan quimio-sensores. Seguidamente pueden observarse
un segundo par de antenas de mayor tamaño que las primeras, estas
presentan dimorfismo sexual en adultos y actúan como aparato de
locomoción en los primeros estadios larvarios [17].
33
Figura 1. Vista en estereomicroscopio (3X) de diferentes estadíos del ciclo
de vida de la Artemia franciscana. A huevos, B rotura de la membrana, C
estadío de gota (membrana de eclosión unida al corion), D nauplio, E
metanauplio 24-h, F metanauplio 48-h.
5.2.1 Parámetros para la eclosión y el mantenimiento de Artemia
franciscana en el laboratorio. Debido a la gran demanda de Artemia
franciscana que existe en el mercado de la acuicultura, es relativamente fácil
la consecución de los huevos por medios comerciales. De igual forma existen
algunos laboratorios con cultivos de los mismos e incluso pueden obtenerse
directamente del medio natural, siempre y cuando provengan de aguas con
buena calidad y retiradas de la orilla.
34
La FAO (Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la
Alimentación) en su “manual para el cultivo y uso de Artemia en acuicultura”
cuyo autor es [64] propone ciertos parámetros críticos para una eclosión
óptima y mantenimiento de la especie (Tabla 4), los cuales han sido basados
en la experiencia recogida a través de una extensa revisión bibliográfica [75].
35
Tabla 4. Algunos parámetros propuestos por la FAO para la eclosión y
mantenimiento de la Artemia franciscana.
PARÁMETROS CRITERIO
Temperatura
La temperatura deberá mantenerse en el intervalo de 25–30°C. A temperatura por debajo de 25°C la eclosión es más lenta y por encima de 30°C los quistes detienen su metabolismo irreversiblemente.
Salinidad y pH
Por razones de conveniencia práctica, usado mayormente el agua de mar para la eclosión de los quistes. Sin embargo, a una salinidad de 5% aumenta la tasa de eclosión. Es esencial incrementar las cantidades de tampón cuando eclosionan grandes densidades de quistes (= gran producción de CO2), con el fin de mantener los niveles de pH por debajo de 8.0.
Oxígeno
A fin de lograr una eclosión máxima (tanto en tasa como en eficiencia), es recomendable mantener unos niveles de oxígeno por encima de 2 mg/L.
Densidad de quistes Es recomendable no sobrepasar densidades de 5 gramos de quistes por litro.
Iluminación
La iluminación de los quistes, al menos durante las primeras horas tras su hidratación es esencial para lograr una eclosión máxima. Es aconsejable para obtener unos resultados óptimos, mantener una iluminación de aproximadamente unos 2000 lux en la superficie del agua.
Fuente: [64]
5.2.2 Bioensayos de toxicidad aguda en Artemia franciscana. La
realización de bioensayos de toxicidad aguda, tiene por objeto clasificar las
sustancias de acuerdo con su peligrosidad [74]. En este sentido, pese al
36
avance en los conocimientos toxicológicos y la mayor frecuencia de
intoxicaciones crónicas, es considerada la DL50 (en nuestro caso la CL50),
como un indicativo clave en ciertas legislaciones, para determinar la
capacidad tóxica de muchas sustancias [74] razón por la cual, es necesario
garantizar la reproducibilidad y confiabilidad de dichos estudios, por lo tanto,
la elección del organismo indicador es de mucha importancia, razón por la
cual, para este ensayo fue empleada la especie Artemia franciscana, que
gracias a sus condiciones fisiológicas y de desarrollo, favorece su uso en
estudios de toxicidad aguda [10].
Aunque inicialmente la Artemia franciscana era utilizada en ensayos de
toxicidad que involucraban compuestos bioactivos de extractos de plantas
[49], [69], hoy en día podemos ver extendido su uso a otros ensayos que
buscan detectar la toxicidad nuevos productos naturales [2], [35], [59],
metabolitos tóxicos producidos por hongos [52], complejos metálicos [10],
pesticidas [20], [66], [70], hidrocarburos [27] e incluso, sobre algunos
materiales de restauración dental [1].
37
6. METODOLOGÍA
Esta investigación corresponde a un estudio de carácter experimental. La
cual, fue realizada mediante bioensayos de letalidad de la especie Artemia
franciscana al ser sometida a diferentes concentraciones de extracto
metanólico de polvillo de carbón durante diferentes períodos de tiempo.
6.1 OBTENCIÓN DEL POLVILLO DE CARBÓN, DEL AGUA DE MAR, Y
DE LAS LARVAS DE Artemia franciscana.
Para la realización del experimento fue empleada una muestra de polvillo de
carbón térmico donada al Grupo de Investigación de Química Ambiental y
Computacional de la Universidad de Cartagena por la Empresa
DRUMMOND. LTDA. Esta provino de una mina a cielo abierto ubicada en el
municipio de la Loma (Cesar), recolectada a una profundidad de 150 metros,
en el manto 35 según especificaciones de la misma empresa.
El agua de mar, fue tomada en horas de la mañana a 30 metros de
profundidad con la ayuda de una bomba tipo Niskin, en inmediaciones del
Parque Nacional Natural Corales del Rosario y San Bernardo, donde las
aguas presentan un bajo nivel de intervención humana, lo que permite
38
reducir los riesgos de conflictos en la investigación por la presencia de algún
agente xenobiótico desconocido. Una vez recolectada el agua, fue
depositada en botellones de plástico de 20 Litros previamente lavados con
agua de mar, los cuales son empleados en el comercio para la venta de
agua.
Por su parte, los huevos de Artemia fueron tomados de la colección existente
en el Laboratorio de Toxicología Ambiental de la Universidad de Cartagena.
Estos fueron colocados en cajas de Petri que contenían agua de mar filtrada,
procurando que consiguieran depositarse en el fondo. Luego con la ayuda de
una servilleta fueron retirados los huevos de la superficie debido a que son
considerados como no viables, los restantes fueron incubados durante 24
horas a una temperatura de 28° C, y en ausencia de luz, pero ventilados.
Cumplidas las 24 horas, algunos de ellos alcanzaron a eclosionar en forma
de nauplios libres. Dichos nauplios fueron separados del resto del material
con la ayuda de una pipeta Pasteur de vidrio y mantenidos bajo condiciones
similares a la de los quistes. Luego de 24 horas, dichas larvas alcanzaron el
estadio de metanauplios, iniciándose los tratamientos correspondientes en
esta etapa larval.
39
6. 2 TRATAMIENTO DEL AGUA DE MAR EN EL LABORATORIO
Una vez recolectada e inmediatamente transportada al Laboratorio de
Toxicología de la Universidad de Cartagena, el agua de mar fue sometida a
filtraciones con papel Whatman número 40, con el fin de retener la mayor
cantidad de sólidos. Realizándose de manera consecutiva otras dos
filtraciones con membranas de 0.45 µm, las cuales permiten la captación de
partículas y microorganismos. Por último, fueron determinados el pH y la
salinidad del agua, la cual fue mantenida bajo refrigeración durante el tiempo
correspondiente a la investigación.
6. 3 PREPARACIÓN DEL EXTRACTO DE CARBÓN
La trituración de la muestra de carbón, fue realizada en un mortero,
tamizándose el triturado en una malla (40/200) hasta obtenerse polvillo de
carbón con un tamaño de partícula aproximado de 75 µm.
Para la preparación de cada extracto fueron pesados con la ayuda de una
balanza analítica 25 g de polvillo de carbón, colocándolos posteriormente en
cartuchos elaborados con tres capas de papel filtro, con el fin de evitar que el
polvillo traspasara hacia el extracto. Los cartuchos fueron colocados en un
equipo soxhlet, evitando que las puntas de los mismos obstruyeran la salida
25
40
de reflujo del equipo. Seguidamente fueron adicionados desde el
condensador 150 mL de metanol grado cromatográfico logrando humedecer
todo el cartucho; con posterior encendido del calentador por un espacio de
12 horas continuas a temperatura media. Una vez obtenido el extracto, fue
llevado al rotaevaporador para concentrar y eliminar la mayor cantidad de
solvente, guardándose subsiguientemente en el desecador hasta completa
sequedad.
En total fueron realizadas 20 extracciones, llegándose a obtener 10 gramos
de extracto, estos, luego de homogenizase, fueron sometidos a liofilización
durante 2 horas, con posterior almacenamiento y refrigeración. El extracto
completamente seco, fue disuelto en DMSO, llevándose al sonicador por 18
horas, sin realizarse algún tipo de agitación manual previa. Por último, el
extracto fue filtrado por repetidas ocasiones con papel Watman Nº 40,
eliminado la mayor cantidad posible del contenido sólido
6.4 ENSAYOS DE TOXICIDAD CON A. franciscana
6.4.1 Exposiciones preliminares. Los ensayos de toxicidad previos, fueron
realizados con el fin de determinar los valores de concentración letal mínima
(CLmin) y concentración letal máxima (CLmax). Estos valores fueron obtenidos
mediante la exposición de los individuos a concentraciones decrecientes del
41
extracto, tomando como control una solución libre del extracto de polvillo de
carbón pero con una concentración de DMSO (solvente utilizado en la
preparación de los extractos) igual a la mayor concentración de extracto
empleado en cada prueba. Estos valores fueron calculados para cada uno de
los tiempos de exposición (24 y 48 horas), correspondiendo CLmin a la
máxima concentración ensayada incapaz de provocar efecto letal a la
totalidad de los individuos, mientras que CLmax a la menor concentración
ensayada capaz de provocar efecto letal a todos los individuos.
6.4.2 Exposición final. El ensayo de toxicidad fue realizado de acuerdo
con lo reportado por varios autores [11], [30], [45], [53], entre otros. Esta
prueba consistió en la preparación de 5 soluciones con diferentes
concentraciones de extracto metanolico de polvillo de carbón y una solución
control. Dichas concentraciones fueron establecidas con valores dentro de
los rangos correspondientes a CLmin y CLmax. Las concentraciones de
extracto de polvillo de carbón empleadas para cada tratamiento fueron de
1.25 mg/L, 2.5 mg/L, 5 mg/L, 10 mg/L y 20 mg/L, mientras que la
concentración de MDSO en el control fue de 20 mg/L. Estas pruebas fueron
realizadas por triplicado (Figura 2), mientras que el experimento fue repetido
5 veces, con el fin de aumentar la confiabilidad del estudio. En cada una de
las soluciones preparadas incluyendo el control, fue medido el pH para
descartar su participación en los efectos letales.
42
Una vez preparadas las soluciones, fueron servidas en viales con capacidad
para 10 mL hasta lograr la mitad del volumen, luego, con la ayuda de pipetas
Pasteur de vidrio, fueron introducidos 10 metanauplios en cada uno de ellos,
para obtenerse un total de 30 larvas por tratamiento. Seguidamente fue
completado el volumen de cada vial con la solución correspondiente y
transcurridas 24 horas, fueron contadas en los mismos viales el número de
larvas muertas (larvas que no registraban ningún movimiento) para cada
tratamiento, repitiéndose dicho conteo después de 48 horas de exposición.
Figura 2. Exposicion por triplicado de las larvas de artemia franciscana a
diferentes concentraciones de extracto metanólico de polvillo de carbón
43
6.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Con los datos obtenidos al determinar la mortalidad de las larvas luego de los
diferentes tratamientos, fue construida una base de datos en Microsoft Excel
2010 para el análisis estadístico, calculándose el promedio de mortalidades
para cada concentración y el porcentaje de mortalidad respectivo. Como
hubo mortalidad en el control sin llegarse a superar el 10% de muertos en
ninguno de los casos, fue aplicada la fórmula de Abbott (figura 3) con el fin
de corregir dicha mortalidad. Con los datos de porcentaje de mortalidad fue
efectuada una gráfica de dispersión, tomando en eje de las abscisas el
logaritmo de las concentraciones, y en el eje de las ordenadas los
porcentajes de mortalidad en términos Probit. Luego fue graficada una línea
de tendencia para los puntos, señalando la ecuación de las, rectas el valor
R2. Finalmente fue calculada la CL50 de acuerdo con la información
suministrada en la recta y el coeficiente de variación del método (teniendo en
cuenta que el experimento se repitió 5 veces), con el fin de observar la
variabilidad de los valores en cada ensayo. Otros análisis complementarios
que fueron realizados correspondieron al test de normalidad de kolmogorov-
smirnov y posteriormente correlacionando los datos de mortalidad vs
concentración utilizándose el coeficiente de Pearson.
44
Figura 3. Fórmula de Abbot.
me - mb Donde:
M =
1 - mb M: mortalidad
me: mortalidad de los animales expuestos
mb: mortalidad en el blanco
45
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7.1 EVALUACIÓN CLÍNICA DE LA EXPOSICIÓN DE LA Artemia
franciscana AL EXTRACTO METANÓLICO DE POLVILLO DE CARBÓN.
La evaluación clínica de las artemias fue realizada mediante la observación
del comportamiento de los animales expuestos y no expuestos, con posterior
revisión a través del microscopio óptico de los individuos muertos y
agonizantes. Para la evaluación clínica de los animales fueron tenidos en
cuenta los siguientes factores: nado errático, nado superficial (barbeo),
letargia, debilidad y perdida del reflejo de huida, color del animal,
deformidades, flexión del músculo abdominal (calambre), edemas,
laceraciones y manchas [38].
En la Figura 4 pueden observarse dos larvas de Artemia franciscana, una de
las cuales fue sometida a una alta concentración de extracto metanólico de
polvillo de carbón y agonizaba por efecto del mismo al momento de tomarse
la fotografía (A), mientras que la otra larva fue tomada del grupo control (B).
Ambos animales presentaron similitudes en el color, ausencia de
laceraciones, manchas o deformidades, descartando que la sustancia
empleada sea corrosiva o genere necrosis bajo las condiciones de
46
exposición empleadas. Sin embargo, los individuos moribundos que fueron
expuestos al carbón, mostraron algunos indicios de flexión abdominal,
acompañada de movimientos intestinales muy intensos (Figura 5).
Figura 4. A. Larva de Artemia franciscana del control B. Larvas de Artemia
franciscana agonizando luego de ser expuesta a una solución de 200 mg/L
de extracto metanólico de polvillo de carbón
Figura 5. Diferencias en el abdomen de A animal no expuesto y B animal
expuesto al extracto metanólico de polvillo de carbón.
47
Una de las principales características presentadas en los individuos
expuestos al extracto fue una notable disminución de la velocidad de
desplazamiento en el nado y poca respuesta a los estímulos de luz.
Notándose que a concentraciones entre 50 mg/L y 200 mg/L este fenómeno
fue observado casi inmediatamente después de realizarse las exposiciones.
Transcurridas de 2 a 4 horas bajo las mismas concentraciones, los
movimientos de la mayoría de los individuos presentes en cada vial lucían
lentos y cortos (letárgia progresiva) hasta luego caer en el fondo del frasco
de donde intentaban despegar sin éxito, presentándose posteriormente la
muerte de los individuos (quietud total) luego de aproximadamente 1 hora. A
concentraciones por debajo de 20 mg/L fueron observados los mismos
efectos pero luego de exposiciones mas prolongadas (> 16 –h),
encontrándose efectos letales a concentraciones de 0.62 mg/L luego de 48
horas de exposición.
No es de extrañarse que la Artemia haya manifestado efectos abdominales y
en el tubo digestivo, debido a que posiblemente el polvillo de carbón esté
constituido por algunos metales como el cadmio, boro, cobre, antimonio y
plomo, los cuales según la Agencia para Sustancias Tóxicas y el Registro de
Enfermedades (ATSDR) son capaces de generar alteraciones en el aparato
digestivo. No obstante, debido a que en este estudio no fueron determinados
los componentes del extracto, resultaría atrevido atribuir este efecto a
48
determinado(s) compuesto(s) o elemento(s). De igual forma, muchos factores
pudieron incidir sobre la diminución de la velocidad de desplazamiento de los
nauplios, tales como dolor, los calambres abdominales, efectos nerviosos o
una disminución en la respiración.
7.2 CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA DEL EXTRACTO METANÓLICO
DE POLVILLO DE CARBÓN.
Los datos correspondientes a la concentración letal media del extracto
metanólico de polvillo de carbón sobre metanauplios de Artemia franciscana
expuestos durante 24 y 48 horas respectivamente, son presentados en la
Tabla 5. En ella también pueden observarse los límites de confianza superior
e inferior para cada caso, el índice de vulnerabilidad de la A. franciscana
frente al extracto de carbón y el coeficiente de variación (CV). Cabe destacar
que el pH de las diferentes soluciones preparadas, incluyendo el blanco, no
tuvo una variación que pudiera incidir sobre los resultados del estudio (pH
con valores entre 7.53 y 7.82), teniendo en cuenta que la Artemia franciscana
puede desarrollarse perfectamente a un pH entre 7.5 y 8.
49
Tabla 5. Concentración letal media, índice de vulnerabilidad y coeficiente de
variación del extracto de carbón sobre larvas de Artemia franciscana a
diferentes períodos de exposición.
LC50 (95% C.I.)
Sustancia (Código) 24-h 48-h 24-h LC50/48-h LC50
Extracto de 8.89 mg/L 4.20 mg/L
polvillo de carbón (6.19 – 12,78) (2.88 – 6.12) 1.452
CV= 30.23% CV= 29.49%
El estudio mostró un CV para ambos tiempos de exposición con valores
cercanos al 30% (con valores de 30.23% y 29.49% para 24-h y 48-h
respectivamente), resultado aceptable teniendo en cuenta que los estudios
de este tipo generalmente manifiestan valores de CV que pueden ser muy
grandes (>45%), lo que indica que la metodología empleada proporciona
datos que pueden ser repetibles [10]. Puede observarse (ver tabla 5) que el
extracto metanólico de polvillo de carbón posee una alta toxicidad para
Artemia franciscana con una CL50 igual a 8,89 mg/L para 24 horas de
exposición y de 4.20 mg/L para 48 horas, siendo las mortalidades para
ambas exposiciones menores que 10 mg/L, indicando que la sustancia
estudiada es potencialmente citotóxica [53]. Por su parte, el índice de
vulnerabilidad (relación de la CL50 estimada: 24 h- CL50/48 h-CL50) posee un
valor menor que 3, lo que refleja relativamente pocos efectos sobre la
susceptibilidad de las larvas con relación al tiempo de desarrollo [54]. Es
50
decir, un aumento en el tiempo de exposición de 24 a 48 horas no conduce a
un aumento notable de la toxicidad [53].
En concordancia a lo descrito en el presente estudio, [71] y [63] reportaron
que el extracto nitrosado de polvillo de carbón, puede ocasionar efectos
citotoxicos al describir un aumento en la frecuencia de intercambio de
cromatides hermanas y aberraciones cromosómicas en diferentes tipos de
células, mientras que [22] y [5], indicaron la facultad que tiene esta sustancia
para generar mutaciones en células de mamíferos. Si bien los resultados
reportados por estos autores no conllevan a eventos letales para las células,
revelan una manifestación citológica al observarse alteraciones en el ADN.
Por otra parte, resultaría difícil entender de una manera exacta la alta
toxicidad del polvillo de carbón, debido a la gran variedad de componentes
orgánicos y minerales que lo conforman, los cuales a su vez dependen del
rango, tipo de carbón y lugar de extracción [81]. Sin embargo, podría
sugerirse que los efectos citotóxicos son debidos a la presencia de metales,
teniendo en cuenta que muchos de ellos han demostrado generar efectos
tóxicos a nivel celular.
51
Entre los metales que contiene el polvillo de carbón podemos encontrar el
cadmio [46], [44], [58], el cual puede unirse a la metalotioneina o bien a
proteínas similares acumulándose en el hepatopáncreas de crustáceos como
la Artemia franciscana en forma de complejos metalotioneina-cadmio [28]
que resultan muy tóxicos para el sistema renal. No obstante, el cadmio por sí
solo no tiene la capacidad de generar un efecto agudo tan marcado sobre
Artemia franciscana como el observado en la presente investigación, debido
a que la especie en estudios como otras del mismo género demuestran una
gran resistencia hacia este metal, mostrando CL50 con valores que superan
los 90 mg/L luego de 96-h de exposición [42]. No obstante, es posible que la
acción combinada de varios de los metales presentes en el extracto
metanólico de polvillo de carbón puedan generar un efecto sinérgico que
aumente la toxicidad del extracto de polvillo de carbón [8].
Tanto el zinc como el níquel han demostrado ser tóxicos para Artemia
franciscana, afectando los mecanismos de osmorregulación, la actividad de
la Na/K ATPasa, el flujo de agua e iones [32] y deprimen significativamente la
respiración [24] lo que podría estar relacionado con el deterioro estructural de
la superficie de las branquias y la inhibición de las enzimas involucradas en
la cadena respiratoria a causa de los metales pesados [63], Spicer y Weber,
1991). Sumado a esto, el níquel altera el metabolismo de carbohidratos y
proteínas en diversas especies, deteriora las señales celulares y disminuye
52
las reservas de glutatión en las células [62], aumentando el riesgo de
afectarse el hepatopáncreas por la presencia de un tóxico como el boro o el
cobre, ambos contenidos en el polvillo de carbón [46].
En general las enzimas suelen ser muy sensibles a la presencia de iones
metálicos [74], por lo que es posible que muchas de ellas resulten
inactivadas luego de la exposición al extracto. Sin embargo la muerte en los
camarones pude deberse principalmente a la acción directa sobre diferentes
sistemas incluidos el repiratorio [63]; Spicer y Weber, 1991), digestivo [46], y
excretor [28].
7.3 ANÁLISIS GRÁFICO DE LA EXPOSICIÓN DE LA Artemia franciscana
AL EXTRACTO METANÓLICO DE POLVILLO DE CARBÓN.
Los efectos tóxicos observados luego de la exposición al extracto metanólico
de polvillo de carbón, son generados en proporción a la concentración
(Figura 6), con una correlación (r) de 0.92 para 24-h y de 0.90 para 48-h.
Figura 6. Efectos de la concentración de polvillo de carbón sobre la
mortalidad de metanauplios de Artemia franciscana.
53
Puede observarse (Figura 6) que ambas gráficas muestran una gran
variabilidad entre los resultados observados en cada tratamiento y en menor
proporción en el control. Esto indica claramente que la mortalidad observada
obedece a la acción del carbón y no a un agente externo a la investigación.
Igualmente, a medida que aumenta la exposición, disminuye la dispersión de
los datos, lo que seguramente es motivado por la menor capacidad de
respuesta que tienen los individuos en general para sobrevivir a los efectos
del carbón.
54
Figura 7. Concentración letal media del extracto de carbón a diferentes
tiempos de exposición.
Del mismo modo, en la figura 7 pueden observarse las líneas de tendencia
correspondientes a las mortalidades de los metanauplios para cada tiempo
de exposición (expresados en términos Probit) sobre el Logaritmo de las
diferentes concentraciones de extracto de carbón, el valor de R2 y la
ecuación de la recta, la cual corresponde a una ecuación lineal (y = mx + b)
Donde:
x, y: son variables en el plano.
m: pendiente de la recta.
b: es el punto de intersección de los ejes.
y = 1.59x + 3.49 R² = 0,98
y = 1.53x + 4.05 R² = 0,97
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
6,5
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
24 horas
48 horas
Loq [X]
Pro
bit
55
En este sentido, pueden observárse dos líneas paralelas con pendientes (m)
similares (m para 24 horas = 1,59; m para 48 horas = 1,53), lo que indica que
los factores de respuesta para ambos tiempos son semejantes entre sí,
mientras que los valores de R2 en ambos casos son cercanos a 1, indicando
la linealidad de las funciones, es decir, los valores obtenidos durante la
experimentación mantienen una tendencia tal que es posible determinar la
mortalidad con relación a la concentración, basándonos en la información de
las rectas.
7.4 IMPLICACIONES AMBIENTALES DEL POLVILLO DE CARBÓN Y
UTILIDAD DE LOS BIOENSAYOS PARA DETERMINAR SU
PELIGROSIDAD
Tanto el polvillo de carbón como sus componentes pueden llegar a los
ecosistemas marinos y estuarinos mediante procesos de lixiviación, a través
de las escorrentías o por la liberación de partículas hacia la atmosfera [68].
De este modo, el carbón almacenado en los puertos carboníferos puede ser
liberado hacia el océano y distribuirse por grandes extensiones de playa y
zonas de bajamar gracias a la acción de las corrientes marinas; mientras que
el carbón transportado en trenes puede desprenderse y depositarse sobre
casi cualquier superficie, generando en ambos casos un riesgo potencial
56
para el ambiente y la salud humana [68].
Aunque grandes cantidades de polvillo de carbón son depositadas en
diferentes ambientes, difícilmente pueda encontrarse en la naturaleza altas
concentraciones de los componentes que lo conforman. Sin embargo, la
indiferencia con que comúnmente es tratado este material debe alertar a las
autoridades competentes a que tomen decisiones que permitan mitigar los
impactos generados y reducir el riesgo de un proceso contaminante más
acentuado, debido a que los resultados encontrados en el presente trabajo
sugieren que el material estudiado posee una alta peligrosidad para los
distintos componentes del ambiente.
El polvillo de carbón es una sustancia de cuidado, por lo tanto no puede ser
tratada como un material inocuo. Es capaz (el extracto metanólico) de
producir la muerte de nauplios de Artemia franciscana en proporciones
cercanas al 4% luego de 48 horas de exposición a una concentración de 0.62
mg/L (según datos hallados en el presente estudio). Por tal motivo no puede
descartarse que el polvillo de carbón genere efectos tóxicos por debajo de
esta concentración.
57
La alta toxicidad del polvillo de carbón podría suponerse teniendo en cuenta
que está constituido de una gran cantidad de materiales peligrosos [44], [46],
[58], [81], [82], no obstante, esta información no es suficiente para determinar
su comportamiento en el medio ambiente. Por tal motivo, los bioensayos
además de permitir clasificar las sustancias de acuerdo a su peligrosidad
[74], brindan un panorama sobre lo que podría ocurrir en un determinado
ecosistema de encontrarse la sustancia estudiada bajo las condiciones
adecuadas. Ofrecen grandes ventajas al poseer propiedades como alta
simplicidad de manejo, rapidez, bajo costo [18], mientras que otros métodos
generalmente requieren más tiempo y recursos. Aunque los bioensayos han
sido utilizados durante décadas, algunos autores sugieren restringir su uso
[74], por lo tanto es necesario que dichos bioensayos sean confiables y
fácilmente replicables en cualquier laboratorio, ya que las investigaciones en
ecotoxicología deben realizarse de tal manera que permitan determinar
efectos puntuales de una sustancia sobre el ecosistema. De igual modo, la
escogencia de la especie indicadora debe hacerse de una manera cuidadosa
que pueda garantizar la utilidad de los resultados. La Artemia franciscana
cumple con ciertas características como: buena resistencia a las condiciones
de laboratorio, tener una amplia distribución geográfica, ser fácilmente
identificables en el laboratorio, provenir de áreas libres de contaminación
[79], además de tratarse de un elemento fundamental en el conjunto del
zooplancton y una especie importante dentro de la cadena trófica, ofreciendo
una vista general sobre los efectos que podrían ocurrir en los ambientes
58
marinos y/o estuarinos, debido a que un efecto negativo sobre su población
haría peligrar la viabilidad de otras especies superiores [16]. Sin embargo,
cabe resaltar que es necesario ser muy cuidadosos con la interpretación de
los resultados obtenidos de los bioensayos, ya que no pueden generalizarse
a otros modelos animales incluyendo el hombre y no representan los efectos
sub-letales y crónicos que pueden generar los contaminantes [74].
La Artemia franciascana es utilizada en ensayos que involucran sustancias
de diferente naturaleza, como extractos de plantas [49], [69], metabolitos
fúngicos, complejos metálicos [10], entre otros. Mostrando diferentes
resultados que manifiestan la versatilidad del organismo. En la Tabla 6
pueden observarse diferentes CL50 calculados para diversas sustancias,
observándose hay muchas variables que pueden incidir sobre la CL50 de un
determinado producto, como por ejemplo, la especie escogida, ya que dos
especies pertenecientes a un mismo género pueden responder de manera
diferente a una misma sustancia (A. persimilis mostró una mayor resistencia
al cadmio que A. franciscana) [42]. De igual modo, podemos apreciar que la
CL50 varía de acuerdo a la sustancia empleada, en este caso la CL50 del
extracto de polvillo de carbón es más baja que algunos tóxicos como el
dicromato de potasio [12], el biocida monopersulfato de potasio [16] y que los
metales Cadmio y Zinc [24], [42], evidenciando al polvillo de carbón como
una sustancia altamente toxica.
59
Tabla 6. CL50 para diferentes sustancias
CL50 mg/L
Sustancia (código)
Organismo
indicador 24-h 48-h Referencia
Piper eriopodon A. franciscana 4.43 2.54 [54]
Lippia alba A. franciscana 34.9 13.66 [54]
AE.Lippia alba (VEmtT01E) A. franciscana 4.53 1.17 [53]
AE. Croton malambo A. franciscana 119.710 83.862 [60]
Dicromato de potasio A. franciscana 12.5
[12]
Dispersante de petróleo BP 1100
WD Tetraselmis sp. 2.08 [80]
Sulfato de tetrakis hidroximetil
fosfonio A. franciscana 0.25
[16]
Bromuro de dodecil etil amonio A. franciscana 0.48 [16]
Monopersulfato de potasio A. franciscana 11.58
[16]
2-bromo-2 nitro – 1,3 propanediol A. franciscana 167.61
[16]
Cadmio (Cd) A. franciscana 93.3
[42]
Cadmio (Cd) A. persimilis 284
[42]
Zinc (Zn) A. franciscana 44.8 (96-h) [24]
Niquel (Ni) A. franciscana 5.5 (96-h) [24]
AE. Aceites esenciales, *Extracto acuoso, ** Extractos metanólicos
60
8. CONCLUSIONES
De acuerdo a los resultados obtenidos en el presente estudio puede
concluirse que:
El extracto de polvillo de carbón posee una CL50 igual a 8,89mg/L para
A. franciscana tras 24-h de exposición, y de 4,20 mg/L tras 48-h, lo
que sugiere que es un compuesto potencialmente citotóxico e indica el
grado de peligrosidad de los materiales que lo constituyen.
Los síntomas más frecuentes encontrados en Artemia franciscana
luego de ser expuesta al extracto fueron: letargia, poca reacción a la
luz, debilidad y perdida del reflejo de huida y flexión del músculo
abdominal (calambre). Los cuales son atribuidos principalmente a la
presencia de metales.
Los efectos tóxicos observados luego de la exposición al extracto
metanólico de polvillo de carbón, son generados en proporción a la
concentración, mientras que fueron observados pocos efectos sobre la
susceptibilidad de las larvas con relación al tiempo de desarrollo.
61
9. RECOMENDACIONES
Es recomendable profundizar en los efectos fisiológicos causados por la
exposición al material en estudio, mediante la examinación histopatológicas
de órganos como el hepatopáncreas, las branquias y la hemolinfa de la
artemia, con el fin de reconocer de una manera más concreta el mecanismo
de acción toxica del polvillo de carbón. De igual manera es recomendable
realizar estos estudios utilizándose otros modelos biológicos, que permitan
tener una idea más amplia sobre los efectos en el ecosistema.
De igual modo, es importante desarrollar esta tipo de investigaciones
acompañados de la información correspondiente a la composición del
material estudiado, ya que los materiales que conforman el polvillo de carbón
van a depender del rango, tipo y lugar de extracción.
Por ultimo cabe recordar, que debido a la gran toxicidad que demostró el
extracto metanólico de polvillo de carbón, es necesario que tanto los entes
de control, como las empresas explotadoras de este recurso y la comunidad
en general, tomen medidas para mitigar el impacto generado por el polvillo
de carbón y así reducir los riesgos para la salud y el medio ambiente.
62
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