Diagnóstico Molecular en Enfermedades Infecciosas:

Una Mirada desde la Clínica

Dra. Natalia Conca M

Pediatra Infectolgo

Noviembre 2016

Conflictos de Interés

Remuneraciones por parte de laboratorios Roche y GSK

Asistencia a cursos y congresos invitada por otros laboratorios

Objetivos:

1. Conocer ventajas y desventajas de las técnicas de biología

molecular frente a técnicas convencionales

2. Comprender las posibles fallas de los test moleculares en cuanto a

la realización e interpretación

3. Conocer algunas situaciones reales donde la biología molecular

esta siendo de utilidad clínica (meningitis, virus respiratorios y

sepsis)

4. Comprender la relevancia clínica de las nuevas plataformas de

biología molecular

Generalidades

• Dg etiológico decisión clínica adecuada

uso racional antimicrobiano

• Avance tecnológico Persistencia de infecciones

• Infecciones emergentes

• Resistencia a antimicrobianos

Métodos Clásicos de Diagnóstico

Ampliamente usados y conocidos

Diversidad de medios y condiciones

Sensibilidad a antimicrobianos

Automatización

Limitaciones Métodos Clásicos

Bacterias y virus de difícil cultivo

No crecen al usar ATB o muestra escasa

Detección Ag (sensibilidad y especificidad variable)

Serología: inmunosuprimido, latencia

Microscopía: Baja sensibilidad y especificidad, operadordependiente

Dogma CentralBiología Molecular

DNA RNA Proteína

Transcriptasa Reversa cDNA

PCRRT-PCR

Replicación ADN

Denaturación ADN:

Enzimas

RNA polimerasa sintetizapequeño oligonucleótido en

sitio de inicio replicación

DNA polimerasa sintetiza hebracomplementaria

PCR

Denaturación ADN:

Altas temperaturas (94°)

Secuencias sintéticas (primers):

Se usan 2 primers paradelimitar amplificación

DNA polimerasa:

Taq polimerasa

British Medical Bulletin 2002; 61: 97-114

Diagnóstico molecular vs convencional

Cultivo IFI/IFD ELISA Sondas PCR

Rapidez + +++ +++ ++ ++/+++

Sensibilidad ++ / +++ ++ ++ ++ ++++

Especificidad +++ ++ ++ +++ ++++

Facilidad + + +++ + ++

Ventajas Diagnóstico Molecular

Resultados más rápidos

Técnicas estandarizadas, automatizadas

Microorganismos de difícil crecimiento

Mayor sensibilidad y especificidad

Investigación

Limitaciones Diagnóstico Molecular

Falsos (+): Contaminación

Falsos (-): Extracción ADN, inhibidores, partidores

Mayor costo (relativo)

Debe sospechar agente infeccioso

No informa sensibilidad antimicrobianos

¿Cuando elegir un método molecular?

1. Necesidad rápida de identificación

2. Identificación de microorganismos fastidiosos

3. Necesidad rápida de determinación de genes de resistencia

4. Identificación de agentes no cultivables

5. Virus en general

¿Dónde se hace una Reacción de Polimerasa en Cadena?

¿Qué tipos de RPC existen?

PCR

Cualitativa

Cuantitativa

Caso Clínico 1

• Embarazo normal , RNT, femenino, buen peso • Embarazo fisiológico, • Streptococcus agalactiae (+) en el tercer trimestre del embarazo.• 25 días de vida: movimientos mioclónicos del hemicuerpo izquierdo

estando en vigilia; somnolienta y disminución de la demanda por alimentos.

• SU: febril, en relativas buenas condiciones generales, sin movimientos anormales, fontanela con tensión normal, ausencia de lesiones en la piel y mucosas y su examen segmentario era normal.

• Evolución: respiración irregular, piel reticulada y movimientos mioclónicosen el hemicuerpo derecho que no cedían a la contención.

• RNM al 10 día con lesiones cerebrales compatibles con encefalitis

Manejo: tratamiento antimicrobiano empírico

Primera RPC para herpes simplex 1 y 2(-)

Persiste sintomática Se adiciona aciclovir2 muestra RPC para herpes simplex 1 y 2 (-)

Se toma 3era muestra LCR

Que salió mal?

• Mala muestra? – 1 causa – Tipo de muestra

• Presencia de inhibidores?• Inadecuado almacenamiento y refrigeración ?• Proceso de la muestra tardío ? • Bajo numero de copias bajo umbral de

detección?– Sensibilidad RPC en LCR para herpes 1 y 2 100%– Especificidad 97%

Métodos de laboratorios usados en infección SNC

Que busca el clínico en examen de biología molecular

• Definir infecciones que amenacen la vida (MBA-HSV)

• Confirmar o excluir infecciones tratables

• Iniciar tratameinto atbadecuado

Conca y cols al, Rev Chil Pediatr. 2016; 87(1): 24-30

Sensibilidad de PCR pacientes diagnosticados clínicamente 93% vs 55% de cultivoCon uso de ATB: s pcr 89,4% vs 10,5%

Aporte:Mejor diagnosticoTerapia adecuada Duración de tratamiento adecuada

Ramers y cols, JAMA may 24/31,2000 vol 283,N°20

Clinical Infectious Diseases 2013;57(8):1114–28

BacteriasEscherichia coli K1Haemophilus influenzaeListeria monocytogenesNeisseria meningitidisStreptococcus agalactiaeStreptococcus pneumoniae

VirusCytomegalovirus (CMV)EnterovirusHerpes virus simplex 1 (HSV-1)Herpes virus simplex 2 (HSV-2)Herpes virus simplex 3 (HSV-3)Parechovirus HumanoVirusVaricella zóster (VZV)

LevadurasCryptococcusneoformans/gattii

Aprobado por FDA 2012

Caso clínico

• Niño de 1 año 4 meses con cuadro de 2 días de tos, luego fiebre y evoluciona con dificultad respiratoria leve a moderada, polipnea y signología obstructiva. Saturación de O2 de 89%.

Rev Chil Infect 2003; 20 (Supl 1): S59 - S62

Infecciones Respiratorias en niños

SÍNDROME AGENTE ETIOLÓGICO

Bronquiolitis VRS, MPVh, VPI, ADV, Influenza, Rinovirus

Asma / Wheezing VRS, Rinovirus, MPVh

Croup Parainfluenza, Influenza

Neumonia Influenza, S pneumoniae, VRS, VPI, ADV, S pyogenes, Rinovirus

Clinical Infectious Diseases 2011; 52:S284-S289

IDSA recomienda fuertemente el desarrollo e implementación de técnicas de diagnostico molecular

para detección de virus respiratorios”

Inmunofluorescencia

Ventajas Desventajas

Bajo costo Operador entrenado

Procesa varias muestras a la vez

Controles adecuados

Simple de realizar Microscopia de fluorescencia

Técnicas por BM• Examen ideal :• Disponible 24/7, en pocas

horas • Idealmente realizado en el

lugar de atención• Precio razonable • Que reduzca el riesgo de

bacterias resistentes • Que sea capaz de diferenciar

entre colonización e infección (cuantitativo o semicuantitativo

CID 2011:53 (supl 4)

PACIENTE ONCOLOGICO CON NEUTROPENIA FEBRIL, SINTOMAS

RESPIRATORIOSCATEGORIZADO EN ALTO RIESGO

PACIENTE A ESQUEMA TRIASOCIADO Y

HEMOCULTIVOS + PVR

PACIENTE BESQUEMA TRIASOCIADO

HEMOCULTIVOS Y BM PARA VIRUS RESPIRATORIOS

BUENA EVOLUCION CLINICA

BUENA EVOLUCION CLINICA

SIGUE CON ATB HASTA AUMENTO DE RAN

CON HEMOCULTIVOS (-)SIN EVIDENCIA DE OTRO

AGENTE CAUSAL

INFLUENZA A (+) HC (-)SIN EVIDENCIA DE OTROS

PATOGENOS RESPIRATORIOSSE DEJA OSELTAMIVIR ORAL

SUSPENDE ATBALTA

Torres JP. Pediatr Infect Dis J 2012

Film Array RVP

(*): Aprobado por FDA 2012

Comparación de film array con tecnicas de IF+PCR para HRV

Comparación de las técnicas de Pneumovir/PCR en tiempo real y BiofireFilmArray para la detección de patógenos respiratorios virales y bacterianos

Torres JP, Farfán M y cols. Sochinf 2014

Laboratorio Biología Molecular Clínica Las Condes. Gentileza Dr. M. Farfán

Laboratorio Biología Molecular Clínica Las Condes

Antimicrobial prescription after multiplex PCR (+)Children study (n=1707; retrospective, inpatients with ARI)

• 50% received ATB

• 47% RVP was performed 87% (+)

• Children tested received more often ATB (54 vs 46%)

• RVP (+): OR 0.53 (CI 0.34-0.81)

• RVP (+) for influenza : oseltamivir use OR 27.38 (CI 14-42)

McCulloh et al. J Ped Infect Dis Soc 2014;3:146-53

Variable RVP (+) n=703 RVP (-) n=106

Received ATB * 51 % 67 %

Stopped ATB 6 % 0

Started ATB afterresult *

11 % 100 %* p < 0.05

PCR sens esp

SGA 98,3% 94,2%

Influenza A 100% 96.8%

Influenza B 100% 94,1%

VRS

Cobas Liat PCR

Point of careRápido (20 min)No requiere operador expertoNo requiere extraccion de DNAFácil de usar Seguro para el operador

“Aumento del diagnóstico etiológico en lactantes

< 3 meses que se hospitalizan por síndrome

febril sin foco al incorporar detección molecular

para enterovirus y virus respiratorios”

Cecilia Piñera , Alejandra Vergara, Romina Valenzuela, Bernardita Coublé, Macarena Moya, Thelma Suau, Anita Fritis, Carolina Roa,

Maria Elena Santolaya, Juan Pablo Torres

Fondo de investigación Saval- Facultad de Medicina de Universidad de Chile

• Síndrome febril sin foco (SFSF):

Fiebre en ausencia de un foco aparente luego de una anamnesis y examen físico completo– 19 a 30% consultas ambulatorias

• Causas en < 3 meses:– Infecciones bacterianas: 10-27%

– Infecciones virales: %??

– Otros

Rol de la biología molecular en diagnóstico infecciones virales

Baraff LJ, Pediatr Ann. 2008 Oct;37(10):673-9.

Aumentar el diagnóstico etiológico de SFSF en niños < 3 meses al incorporar técnicas de detección

molecular para

• enterovirus (EV) en sangre y LCR

• virus respiratorios en hisopado nasofríngeo (HNF)

por sobre el diagnóstico microbiológico convencional

Objetivos del estudio

Confirmación etiológica de los diagnósticos de egreso con microbiología convencional

Diagnóstico clínico infecciones bacterianas: 38/101 niños

Confirmado microbiología

convencional: 31/38 82%– Hemocultivos (+) 7

• E coli: 3

• SBHGA: 2

• SBHGB: 2

– Urocultivo (+) 23• E coli: 20 / Klebsiella: 1 /

Enterococcus: 1/ Enterobactercloacae: 1

Diagnóstico clínico infecciónviral: 25/101 niños

Confirmado microbiología

convencional: 3/25 12%– Rotavirus: 3

Diagnósticos etiológicos confirmados

Infecciones Bacterianas

30%

21%

Infecciones virales

3%

32%

Coinfección Virus-Bacteria

1%

11%

Etiología (-)

66%

36%

Diagnóstico Microbiológico Convencional

Diagnóstico Microbiológico Convencional + Biología Molecular

Globalmente se aumentó diagnóstico etiológico de un 34 a 63% (p 0,0001)

Diagnósticos etiológicos confirmados

Infecciones Bacterianas

31%

21%

Infecciones virales

2%

32%

Coinfección Virus-Bacteria

1%

11%

Etiología (-)

66%

36%

Diagnóstico Microbiológico Convencional

Diagnóstico Microbiológico Convencional + Biología Molecular

Globalmente se aumentó diagnóstico etiológico de un 34 a 63% (p 0,0001)

Genómica yProteómicaHUMANA

INFECTOMA

Genómica yProteómicaPATÓGENO

FARMACOMA

Efecto DROGASGenómica yProteómicaHUMANA

Efecto DROGASGenómica yProteómicaPATÓGENO

HOSPEDERO MICROORGANISMO

Microarrays

• Pequeño vidrio o chip de 1-2 cm2

• Muestras de DNA ordenadas en el vidrio

• Detectan miles de secuencias de DNA o RNA

3357 transcritos diferentes entre los niños con infección bacteriana vs los controles

No supervisado

97%

BIOFIRMA de niños con y sin infección bacteriana

2486 genes

Agrupo correctamente 76% (72/95)

Conclusiones

• Nuevas técnicas diagnósticas acortan tiempo de respuesta, disminuyen complejidad, realizan test múltiples y optimizarían variables clínicas

• Incorporación en pacientes hospitalizados / inmunocomprometidos

• Datos apoyan la costo-efectividad del diagnóstico molecular de virus respiratorios en meningitis y en sepsis

• Importante considerar realidad nacional/local

• Falta conocer aún más el impacto en variables clínicas

Lo mas importante !!!!!