DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE PATOLOGÍAS VIRALES Y

BACTERIANAS

PROF. DR. MARCELO BUSTAMANTE, Ph. D.FACULTAD DE MEDICINA, UCSC.

mbustamante@ucsc.cl

Desarrollo de la Ingeniería Genética- 1953 James Watson y Francis Crick, doble hélice DNA

- 1982 Insulina humana recombinante

- 1985 Kary Mullis, creador de la técnica de PCR

1993 Nobel de Química

- 1985 Alec Jeffreys (U. de Leicester, UK) huella génica

- 1990 Inicio proyecto Genoma Humano

Proyecto genoma patógenos humanos, animales y plantas

- 1997 Secuencia completa bacteria E. coli

Ian Wilmut-oveja Dolly

- 2000 Primer borrador Genoma Humano (85%)

Bancos de Datos-Internet-Acceso libre

-2003 Mapa completado en un 99% con 99% de precisión-Costo: US$ 2700 Mi-Intituciones participantes (18): USA, UK, Francia, Alemania, Japón y China.

ReverseTranscription

Código Genético

PROYECTO

GENOMA

Diagnóstico Molecular

• Diagnóstico basado en información molecular

• Información genética de los individuos (virus, procariontes y eucariontes)

• ADN

• ARN

Detección de Virus

• Indicado para:– Detección de virus ADN– Detección de virus ARN (retrovirus)– Epidemiología: Identificación de cepas– Taxonomía: Identificación de especies

• Ejemplos:– Herpes (Subtipos) Papiloma (Subtipos)– Citomegalovirus VIH (Carga Viral)– SARS Hepatitis A, B, C– Enterovirus Influenza aviar– Virus Sincicial Rotavirus

Detección de Bacterias• Indicado para:

– Detección de bacterias de difícil cultivo: Chlamidia, Mycoplasma

– Detección de bacterias de crecimiento lento: MTB– Detección de resistencias: -lactamasas, Rifampicina– Epidemiología: Identificación de cepas – Taxonomía: Identificación de especies

• Ejemplos:– M. tuberculosis complex M. Avium (Subesp. ParaTBC)– Treponema palidum Chlamidia – Mycoplasma pneumoniae Legionella pneumophila– Helicobacter pylori Leptospira sp– Bordetella pertussis

Detección de Parásitos• Indicado para:

– Detección de parásitos de difícil cultivo– Detección de parásitos de crecimiento lento– Detección de resistencias a antiparasitarios– Epidemiología: Identificación de cepas – Taxonomía: Identificación de especies

• Ejemplos:– Protozoos: Entamoeba sp– Helmintos: Nematelmintos (Enterobius, Trichinella)

»Platelmintos: Céstodes: Hymenoleptis, Tenias»Tremátodes: Distoma

Parásitos sánguíneos: Tripanosoma

Mutación del Gen de la protrombinaMutación del Factor V de Leyden

Optimización del PCR• Oligonucleótidos iniciadores

– Secuencia: Tm, especificidad– Tamaño: Tm– Gen que se detecta: nº de copias iniciales

• Temperatura de hibridación– Mayor temperatura = mayor especificidad = menor rendimiento

• Condiciones de reacción– Concentración de Mg++

– Concentración de Taq polimerasa• Extracción del DNA• Elección del método de detección y análisis

Proceso de análisis

Toma de MuestraToma de Muestra Extracción ADNExtracción ADN

Amplificación ADNAmplificación ADN Detección amplificadoDetección amplificado

SYBR GREEN I

Micrografía de Célula infectada por virus Herpes

Micrografía de fase final de infección por virus Herpes

Virus Herpes Simplex

Subtipos de Virus Herpes

Mapa genético de Virus Herpes 1

•Técnica: LightCycler® - HSV 1/2 Detection Kit

•Flexible: Permite la detección de 2 subtipos de virus Herpes simultáneamente

•Sensibilidad: 10 copias/muestra

•Rapidez: 3 horas para entrega de resultados

•Seguridad: Control interno para minimizar la posibilidad de falsos negativos y Control positivo para verificar efectividad del PCR

Método de Detección de Virus Herpes 1 y 2

Herpes 1 (53,9°C)

Herpes 2 (67,1°C)

Peaks de Melting para la diferenciación de Virus Herpes 1 y 2

Mycoplasma pneumoniae

•Técnica: LightMix® for the Detection of Mycoplasma pneumoniae

•Flexible: Permite la detección de Mycoplasma pneumoniae específicamente (fragmento de PCR de 342 bp)

•Sensibilidad: 10 copias/muestra (Detección linear entre 10 y 107 copias)

•Rapidez: 3 horas para entrega de resultados

•Seguridad: Control interno para minimizar la posibilidad de falsos negativos y Control positivo para verificar efectividad del PCR

Método de Detección de Mycoplasma pneumoniae

Resultados del PCR Light Cycler para Mycoplasma pneumoniae

Bordetella pertussis

Mecanismo de patogenicidad de B. pertussis

•Técnica: LightMix® for the Detection of Bordetella pertussis

•Flexible: Permite la detección de Bordetella pertussis específicamente (fragmento de PCR de 181 bp correspondiente a IS 481)

•Sensibilidad: 1-10 copias/muestra (Detección linear entre 10 y 107 copias)

•Rapidez: 3 horas para entrega de resultados

•Seguridad: Control interno para minimizar la posibilidad de falsos negativos y Control positivo para verificar efectividad del PCR

Método de Detección de Bordetella pertussis

Gram (-) Gram (+)Escherichia coli Staphylococcus aureusKlebsiella (pneumoniae/oxytoca) SCoN1Serratia marcescens Streptococcus pneumoniaeEnterobacter (cloacae/aerogenes) Streptococcus spp.Proteus mirabilis Enterococcus faeciumPseudomonas aeruginosa Enterococcus faecalisAcinetobacter baumannii 3Stenotrophomonas maltophilia

HongosCandida albicans

Candida tropicalisCandida parapsilosis

Candida glabrataCandida krusei

Aspergillus fumigatus

Tabla 1: Lista maestra de SeptiFast (SML)

Ilustración 1: RC G-, CH 610

Gráfico 1 Gráfico 2

Gráfico 3 Gráfico 4

Termociclador Labnet (PCR convencional)

PCR de tiempo real (Light CyclerTM)

Laboratorio de Diagnóstico MolecularUniversidad Católica de la Santísima ConcepciónLista de Prestaciones-Mayo 2007

Identificación genómica de patógenos Método

Mycobacterium spp. Real-Time PCR (LC)

Mycobacterium tuberculosis complex Real-Time PCR (LC)

Helicobacter pylori Real-Time PCR (LC)

Virus Hepatitis C (HCV) Real-Time PCR (LC-Roche)

Virus Hepatitis B (HBV) Real-Time PCR (LC-Roche)

Virus hepatitis A (HAV) Real-Time PCR (LC-Roche)

Papilloma Virus Humano (PVH) Real-Time PCR (LC-Roche)

Genotipificación PVH oncogénicos Real-Time PCR (LC-Roche)

Virus Herpes Simplex tipo 1 y 2 (HSV-1 y HSV-2) Real-Time PCR (LC-Roche)

Mycoplasma pneumoniae Real-Time PCR (LC-Roche)

Virus Varizella-Zoster (VZV) Real-Time PCR (LC-Roche)

Citomegalovirus Humano (HCMV) Real-Time PCR (LC-Roche)

Virus Epstein-Barr (EBV) Real-Time PCR (LC-Roche)

Herpes virus Humano tipo 6 (HHV6) NESTED - PCR

Bordetella pertussis Real-Time PCR (LC-Roche)

Septifast Real-Time PCR (LC-Roche)

Enterovirus Real-Time PCR (LC-Roche)

Determinación de Carga Viral

Virus de la Hepatitis B (HBV) PCR-ELISA (Amplicor-Roche)

Virus de la Hepatitis C (HCV) PCR-ELISA (Amplicor-Roche)

Virus Inmunodeficiencia Humana ( VIH) NASBA BIOMERIEUX

Detección de Mutaciones Genéticas Humanas

Gen Factor V de Leiden (G A) posición 1691 Real-Time PCR (LC-Roche)

Gen Protrombina (G A) posición 20210 Real-Time PCR (LC-Roche)

Prestaciones varias área Biología Molecular

Inmunotipificación subpoblaciones leucocitarias CD3/CD4/CD8

Citometría de Flujo-FACS Scan

Inmunotipificación subpoblaciones linfocitariasCD3/CD4/CD8/CD14

Citometría de Flujo-FACS Scan

Inmunotipificación subpoblaciones linfocitariasCD3/CD4/CD8/CD14/CD56/CD19

Citometría de Flujo-FACS Scan

MUCHAS GRACIAS