Diagnostico Virologico Julio Ruiz

INMUNOLOGA Y VIROLOGA

UNMSM

FACULTAD DE FARMACIA Y

BIOQUMICA

DIAGNSTICO DE LABORATORIO DE LAS

ENFERMEDADES VIRICAS

JULIO REYNALDO RUIZ QUIROZ PROFESOR AUXILIAR DPTO. MICROBIOLOGIA

GENERALIDADES

Las pruebas vricas de laboratorio pretenden:

1) Confirmar el diagnstico identificando el agente vrico de la infeccin

2) Seleccionar un tratamiento antivrico adecuado

3) Definir el cuadro patolgico

4) Hacer un seguimiento epidemiolgico de la enfermedad, y

5) Educar a mdicos y pacientes.

GENERALIDADES

Mtodos de laboratorio para diagnosticar infecciones vricas

Examen citolgico

Microscopia electrnica

Aislamiento y cultivo del virus

Deteccin de protenas vricas (antgenos y enzimas)

Deteccin de material gentico vrico

Serologa

GENERALIDADES Muestras para diagnstico vrico

Virus patgenos habituales Muestras para cultivo Comentarios

Tracto respiratorio

Adenovirus; virus de la gripe;

enterovirus

(picornavirus); rinovirus;

paramixovirus;

virus de la rubola; VHS

Lavado nasal, hisopo de

garganta, hisopo nasal,

esputo

Los enterovirus tambin se eliminan por

las heces

Tubo digestivo

Reovirus; rotavirus; adenovirus;

virus Norwalk;

calicivirus

Heces, hisopo rectal Las muestras se analizan por microscopa

electrnica y deteccin de antgeno

(ELISA); los virus no se cultivan

Exantema maculopapular

Adenovirus; enterovirus

(picornavirus)

Hisopo de garganta,

hisopo rectal

Virus de la rubola; virus del

sarampin Orina

Exantema vesicular

Virus Coxsackie; echovirus; VHS;

VVZ

Lquido de vesculas,

raspado o hisopo,

enterovirus en heces

El diagnstico inicial del VHS y VVZ se

puede obtener con un raspado vesicular

(frotis de Tzanck)

CMV, citomegalovirus; ELISA, anlisis de inmunoabsorcion unida a enzimas; PCR, reaccin en cadena de la

polimerasa; PCR-TI, PCR con transcriptasa inversa; VHS, virus herpes simple; VIH, virus de inmunodeficiencia

humana; VVZ, virus varicela zster.

Muestras para diagnstico vrico

Virus patgenos habituales Muestras para cultivo Comentarios

Sistema nervioso central (meningitis asptica, encefalitis)

Enterovirus (picornavirus) Heces PCR

Arbovirus (p. ej., togavirus,

bunyavirus)

Raramente se cultiva Diagnstico mediante anlisis serolgicos

Virus de la rabia Tejido, saliva, biopsia

cerebral

Diagnstico mediante anlisis de

inmunofluorescencia

del antgeno

VHS; CMV; virus del sarampin, virus

de la parotiditis

Lquido

cefalorraqudeo

PCR, se intenta el aislamiento del virus y del

antgeno

Aparato urinario

Adenovirus; CMV Orina El CMV se puede eliminar sin enfermedad

aparente

Sangre

VIH; virus de la leucemia de linfocitos

T humana;

virus de la hepatitis B, C y D

Sangre Se hace una deteccin del antgeno o

anticuerpo en

suero (ELISA), PCR y PCR-TI

CMV, citomegalovirus; ELISA, anlisis de inmunoabsorcion unida a enzimas; PCR, reaccin en cadena de la

polimerasa; PCR-TI, PCR con transcriptasa inversa; VHS, virus herpes simple; VIH, virus de inmunodeficiencia

humana; VVZ, virus varicela zster.

GENERALIDADES

CITOLOGIA

El examen citolgico de las muestras permite

elaborar un diagnstico inicial rpido de las

infecciones vricas que producen unos Efectos

Citopatolgicos (ECP) caractersticos.

Entre estos ECP observados habitualmente en las

muestras tisulares o los cultivos celulares figuran:

Modificaciones de la morfologa celular Lisis celular Formacin de vacuolas Sincitios Cuerpos de inclusin.

Formacin de sincitios provocada por el virus del sarampin. Clulas gigantes multinucleadas (flecha) visibles en un corte histolgco de una biopsia pulmonar de una neumona de clulas gigantes, producida por un virus del sarampin en un nio inmunodeprimido.

CITOLOGIA

Los sincitios son clulas gigantes multinucleadas formadas

como consecuencia de la fusin vrica de clulas individuales.

SINCITIOS

cuerpos nucleares de inclusin en ojo de buho presentes en las clulas de tejidos infectados por citomegalovirus

CITOLOGIA CUERPOS DE INCLUSIN

Los cuerpos de inclusin constituyen cambios histolgicos de las clulas

provocados por componentes vricos o bien alteraciones de las estructuras

celulares inducidas por los virus.


ECP inducido por VHS. Una muestra de biopsia de un hgado infectado por VHS muestra un cuerpo de inclusin eosinoflico de Cowdry de tipo A (A) rodeado de un halo y un anillo de cromatina marginal en la membrana nuclear.

Una clula infectada (B) presenta un ncleo condensado ms pequeo (picntico).

ECP: efecto citopatolgico VHS: virus del herpes simple.

A. Un corte de cerebro de un paciente con rabia presenta cuerpos de Negri (flecha).


Cuerpos de Negri producidos por el virus de la rabia.

B. Imagen con aumento de otra muestra de biopsia.


Cuerpos de Negri

producidos por el

virus de la rabia. Cuerpos

de Negri

Cuerpos

de Negri

Neurona

MICROSCOPIA ELECTRNICA La microscopa electrnica no es una tcnica de laboratorio

estndar en la clnica, si bien se puede utilizar para detectar e

identificar algunos virus cuando existe un nmero suficiente de

partculas vricas.

La adicin de un anticuerpo especfico del virus a una muestra

puede hacer que las partculas vricas se agrupen, facilitando as

la deteccin e identificacin simultneas del virus

(inmunomicroscopia electrnica).

Este mtodo es til para la deteccin de los virus entricos,

como los rotavirus, que se producen en abundancia y que tienen

una morfologa caracterstica.

Tambin se puede examinar si un tejido adecuadamente

procesado, procedente de una biopsia o una muestra clnica,

contiene estructuras vricas.

AISLAMIENTO Y PROLIFERACIN DE VIRUS

Formas de transmisin de virus

Personas

Animales: vacas (p. ej., vacuna de la viruela de Jenner), pollos, ratones, ratas, ratones lactantes

Huevos embrionarios

Cultivos de rganos

Cultivos tisulares:

Primarias

Lneas celulares dipliodes

Lneas celulares tumorales o inmortalizadas

AISLAMIENTO Y PROLIFERACIN DE VIRUS Crecimiento de virus en huevos embrionados

El periodo optimo de inoculacin: 5 14 das despus de la fertilizacin. Este mtodo es actualmente usado para la propagacin del virus de la influenza

AISLAMIENTO Y PROLIFERACIN DE VIRUS Crecimiento de virus en huevos embrionados

Utiliza tipos especficos de clulas de cultivo tisular.

Los cultivos de clulas primarias se obtienen por tratamiento de algn

rgano animal especfico con tripsina o colagenasa.

Las clulas obtenidas con este mtodo se cultivan en monocapa

(fibroblastos o clulas epiteliales) o en suspensin (linfocitos) en medios

artificiales complementados con suero bovino u otra fuente de factores de

crecimiento.

Las clulas primarias se pueden separar con tripsina, se diluyen y crecen

en nuevas monocapas (subcultivos) para convertirse en cultivos celulares

secundarios.

Las lneas de clulas diploides son cultivos de un nico tipo de clula con

los que se puede hacer un gran nmero de pases, aunque finito, antes de

presentar signos de senescencia o experimentar cambios significativos

en sus caractersticas.

CULTIVO CELULAR


Cultivos de clulas primarias

CULTIVO CELULAR


+ enzimas

tiempo

Subcultivos

CULTIVO CELULAR


enzimas

tiempo

CULTIVO CELULAR


Primaria Heterogneo - muchos tipos de clulas Ms cercanos a los animales Problemas tcnicos Cepa de clulas diploides Relativamente homognea - menos tipos de clulas Adems de los animales Tcnicamente, menos problemas La lnea celular continua Immortal Ms homognea Genticamente raro - ms alejados de los animales Sin complicaciones Suspensin o monocapa

Las lneas celulares tumorales y las lneas celulares inmortalizadas,

iniciadas a partir de tumores de pacientes o por efecto de virus o

compuestos qumicos respectivamente, se componen de clulas de un

solo tipo que pueden ser sometidas a pases continuos sin envejecer.

CULTIVO CELULAR


Lnea continua de clulas

epiteliales humanas (HeLa)

CULTIVO CELULAR

Las clulas primarias de rion de mono son muy adecuadas para

llevar a cabo el aislamiento del virus de la gripe, paramixovirus,

muchos enterovirus y algunos adenovirus.

Las clulas diploides fetales humanas, que generalmente son

fibroblastos, permiten el crecimiento de un amplio abanico de

virus (p. ej., VHS, VVZ, CMV, adenovirus, picornavirus).

Las clulas HEp-2, una lnea continua de clulas epiteliales

derivada de un cncer humano, son excelentes para aislar el virus

respiratorio sincitial, los adenovirus y los VHS.

Muchos virus con importancia clnica se pueden aislar, al menos,

con alguno de estos cultivos celulares.


DETECCIN VRICA

Un virus se puede detectar e identificar inicialmente mediante la

observacin de los ECP por l inducidos en la monocapa celular

o bien mediante tcnicas de inmunofluorescencia o de anlisis

genmico del cultivo celular infectado.

Por ejemplo, un nico virus infecta, se disemina, y destruye las

clulas circundantes (placa).

El tipo de cultivo celular, las caractersticas de los ECP y la

rapidez del crecimiento vrico se pueden utilizar para identificar

inicialmente muchos virus clnicamente importantes.

Este planteamiento de la identificacin de los virus es parecido

al que se utiliza en la identificacin de bacterias, que se basa en

la proliferacin y la morfologa de las colonias en medios

diferenciales selectivos.



DETECCIN VRICA

Efectos Citopatolgicos de los virus

AISLAMIENTO Y PROLIFERACIN DE VIRUS DETECCIN VRICA

ECP de una infeccin

por VHS.

A. Cultivo de clulas

Vero (estirpe celular de

rion de mono verde

africano) no infectadas.

B. Imagen de clulas Vero

infectadas por VHS-1 en la que se

aprecian clulas redondeadas,

clulas multinucleadas y

desaparicin de la monocapa.

DETECCIN VRICA EN QU CASOS NO SE PUEDE USAR LA CITOLOGA?

Virus que Crecen lentamente No crecen en absoluto No provocan ningn ECP en las lneas celulares Suponen un riesgo para el personal de laboratorio.

Las propiedades vricas caractersticas se pueden utilizar

para identificar virus:

Interferencia heterloga Hemadsorcin Hemaglutinacin. Inhibicin de la hemaglutinacin (IH).

PARA ESTOS USAR

Serologa

Deteccin de genomas o antgenos vricos

Virus de la rubola impide la multiplicacin

de los picornavirus


DETECCIN VRICA

Algunos virus poseen HEMAGLUTININA (glucoprotena

vrica) que aglutina los hemates de determinadas

especies animales en la superficie de la clula infectada,

a este fenmeno se conoce como HEMADSORCIN

virus de la gripe, virus paragripal, virus de la parotiditis y togavirus


DETECCIN VRICA HEMADSORCIN


Adicionar hematies

DETECCIN VRICA

Cuando estos virus se liberan en el medio de cultivo celular, se

pueden detectar gracias a la aglutinacin de los hemates, un

proceso denominado HEMAGLUTINACIN.

La cepa de virus se puede identificar por medio de anticuerpos

especficos que bloquean la hemaglutinacin, a esto se le conoce

como INHIBICIN DE LA HEMAGLUTINACIN (IH).

Un mtodo innovador de deteccin del virus del herpes simple

emplea clulas de cultivo tisular modificadas genticamente que

expresan el gen de la -galactosidasa y adquieren una coloracin azulada al ser infectadas por el VHS (sistema ligado a enzimas

inducible por virus).


DETECCIN VRICA HEMAGLUTINACIN


GR

DETECCIN VRICA

HEMAGLUTINACIN: Mtodo


Ttulo = 32 HA unidades/ml

1:8

1:2 1:2 1:2 1:2 1:2

8 16 32 64 128 256

virus

Dilucin serial

Mezclar con

glbulos rojos

vista lateral

vista

superior

DETECCIN VRICA HEMAGLUTINACIN: virus influenza


DILUCIN

VIR

US

T

TU

LO

DETECCIN VRICA

Los virus se pueden cuantificar mediante la determinacin

de la dilucin mayor que conserva las siguientes

propiedades (ttulo):

1. Dosis de cultivo tisular (DTCS0): ttulo de virus que

provoca efectos citopatolgicos en la mitad de las clulas de

cultivo celular.

2. Dosis letal (DL50): ttulo de virus que destruye el 50% de

un conjunto de animales incluidos en la prueba.

3. Dosis infecciosa (DI50): ttulo de virus que provoca un

sntoma identificable, la formacin de anticuerpos u otra

respuesta en el 50% de un conjunto de animales

participantes en la prueba.

Recuento de las placas producidas por diluciones de la muestra a la

dcima parte (unidades formadoras de placas).


INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS DE LOS CULTIVOS

La deteccin de cualquier virus en los tejidos, LCR, sangre o lquido

vesicular del organismo hallazgo altamente significativo.

La diseminacin vrica tambin puede estar inducida por cualquier

trastorno subyacente (p. ej., otra infeccin, inmunosupresin,

estrs) no guarde relacin con los sntomas de la enfermedad.

Otros virus pueden eliminarse de forma intermitente ...asintomticos

- unas semanas (enterovirus en las heces)

- meses o aos

- VHS o CMV en la bucofaringe y la vagina

- Adenovirus en la bucofaringe y en el tubo digestivo.

Por qu no se podra aislar un virus a partir de una muestra?

Mala manipulacin Contenga anticuerpos neutralizantes Se haya obtenido con anterioridad al comienzo de la diseminacin de las partculas vricas.


DETECCIN DE PROTENAS VRICAS

Durante la multiplicacin vrica se sintetizan enzimas y otras

protenas . las que se detectan por: Mtodos bioqumicos Mtodos inmunolgicos Mtodos de biologa molecular

ANLISIS DE PROTENAS

Patrones protenicos (electroforesis)

Actividades enzimticas (p. ej. Transcriptasa inversa)

Hemaglutinacin y hemadsorcin

Deteccin de antgenos (fluorescencia directa e indirecta, ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas, transferencia Western)


ANTICUERPOS

Los anticuerpos instrumentos sensibles y especficos para detectar, identificar y cuantificar virus y

antgenos vricos en muestras clnicas o cultivos

celulares (inmunohistoqumica).

Los anticuerpos monoclonales son tiles para distinguir entre cepas vricas y mutaciones.

Los antgenos vricos de la superficie celular o el interior

de la clula se pueden detectar mediante:

Tcnicas de inmunofluorescencia Enzimoinmunoanlisis (EIA)


Tcnicas de inmunofluorescencia


Tcnicas de inmunofluorescencia

Localizacin por inmunofluorescencia de clulas nerviosas

infectadas por virus del herpes simple (VHS) en una seccin cerebral

de un paciente con encefalitis por herpes.


Tcnicas de

inmunofluorescencia

Clulas de cultivo de tejidos se cultivan

en portaobjetos en la parte inferior de un

shell vial

Deteccin del Virus del Herpes

Simple 1 usando la tcnica del shell vial e inmunofluorescencia


Enzimoinmunoanlisis (EIA)


Enzimoinmunoanlisls para

cuantificacin de anticuerpos

Anticuerpos no fijados se eliminan

por lavado

Cromforo Precipitado

Luz


EIA: para

antigenos

Anticuerpos no fijados se eliminan

por lavado

Cromforo Precipitado

Luz


El virus o el antgeno desprendido de las clulas

infectadas se puede detectar mediante:

Anlisis de inmunoabsorcin ligada a enzimoinmunoanlisis (ELISA)

Radioinmunoanlisis (RA) Aglutinacin con ltex (LA)

Se han comercializado algunas pruebas de deteccin

de patgenos vricos especficos.

ELISA

ELISA

ELISA: HIV

DETECCIN DE MATERIAL GENTICO VRICO La estructura del genoma y la secuencia gentica son

caractersticas diferenciales de la familia, tipo y cepa de virus

ANLISIS DE MATERIAL GENTICO VRICO

Patrones de digestin con endonucleasa de restriccin

Tamao del ARN segmentado de origen vrico (electroforesis)

Hibridacin del ADN del genoma in situ (citoqumica)

Transferencia de Southern y Northern

PCR (ADN)

RT-PCR

PCR a tiempo real

Cadena ramificada de ADN y otras pruebas relacionadas (ADN, ARN)

PCR: Reaccin en cadena de la polimerasa

DETECCIN DE MATERIAL GENTICO VRICO

Los patrones electroforticos del cido ribonucleico (ARN)

(virus de la gripe, reovirus) o las longitudes de los fragmentos

de restriccin resultantes de la digestin del ADN del genoma

vrico por una endonucleasa son semejantes a las huellas

dactilares genticas de estos virus.

Las distintas cepas de VHS-1 y VHS-2 se pueden distinguir

mediante el polimorfismo de la longitud de los fragmentos de

restriccin.

Los nuevos mtodos de deteccin de genomas vricos emplean

sondas genticas especficas de secuencias y mtodos de

amplificacin del ADN semejantes a la tcnica de PCR


SONDAS DE ADN

Las sondas de ADN con secuencias complementarias a regiones

especficas del genoma vrico se pueden utilizar como herramientas

sensibles y especficas para detectar un virus, igual que los

anticuerpos.

Estas sondas son capaces de detectar el virus incluso en ausencia

de multiplicacin vrica.

til para detectar:

Virus de replicacin lenta o no productivos (como el CMV y papilomavirus humano)

Cuando no se puede detectar el antgeno vrico por medio de pruebas inmunolgicas.

DETECCIN DE MATERIAL GENTICO VRICO SONDAS DE ADN


Localizacin in situ de una infeccin por citomegalovirus

(CMV) utilizando una sonda gentica. La infeccin por CMV de los tbulos renales de un

rion se localiza con una sonda ADN especfica para CMV marcada con biotina y se

visualiza por medio de la conversin del sustrato con avidina conjugada con peroxidasa de

rbano picante de manera similar al enzimoinmunoanlisis.

HIBRIDACIN IN-SITU

HIBRIDACIN IN SITU: Permite detectar secuencias genticas

vricas especficas en muestras de biopsia de tejido fijadas y

permeabilizadas


TRANSFERENCIA PUNTUAL O DE SOUTHERN

El genoma vrico o los fragmentos del genoma digeridos por una

endonucleasa de restriccin y separados electroforticamente se

aplican sobre filtros de nitrocelulosa y posteriormente se detectan

mediante sondas de ADN que se hibridan con ellos.

TRANSFERENCIA NORTHERN: HIBRIDACIN DE SONDA ARN:ADN

El ARN vrico separado por electroforesis y aplicado sobre un filtro

de nitrocelulosa se puede detectar de forma similar.

Las sondas de ADN se detectan mediante mtodos de

autorradiografa, fluorescencia o EIA.

En la actualidad se ha comercializado un amplio abanico de sondas

vricas y equipos de reactivos para la deteccin de virus.


REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA

(Polymerase Chain Reaction: PCR)

La deteccin de genomas vricos mediante PCR, PCR con

transcriptasa inversa (PCR-TI) y otras pruebas relacionadas se

usan para deteccin e identificacin de diversos virus.

El uso de cebadores adecuados para PCR puede facilitar la

amplificacin de hasta un milln de veces de la secuencia diana

en pocas horas.

CUNDO USARLA?

Para detectar secuencias latentes e integradas de virus secuencias de virus presentes a bajas concentraciones y los virus cuyo aislamiento resulta complejo o peligroso a partir

de cultivos celulares.

La PCR-TI utiliza una transcriptasa inversa de origen retrovrico

para convertir el ARN vrico en ADN y permite la amplificacin por

PCR de las secuencias de cido nucleco vrico.

retrovirus, virus del herpes, papilomavirus y

papovavirus

DETECCIN DE MATERIAL GENTICO VRICO REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura

Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias

Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR

Desnaturalizacin

95C

Hibridizacin

50-60C

Extensin de

La cadena

75C

Primer Ciclo

2do Ciclo

95C

50 - 60C

75C

Mltiples ciclos darn un incremento exponencial en

el nmero de copias

DETECCIN DE MATERIAL GENTICO VRICO REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA


La cuantificacin de la cantidad de VIH de un paciente (carga vrica)

se lleva a cabo a travs de la PCR en tiempo real.

La concentracin de genoma de este virus en una muestra srica es

proporcional a la tasa de amplificacin por PCR del ADN genmico.

La amplificacin basada en la transcripcin emplea una transcriptasa

inversa y cebadores especficos para secuencias vricas con el

propsito de sintetizar ADN complementario (ADNc), el cual contiene

tambin una secuencia reconocida por la polimerasa de ARN

dependiente de ADN del bacterifago T7.

Una RNAsa H digiere el ARN, y la polimerasa de ARN T7 transcribe el

ADN en ARN. A continuacin, las nuevas secuencias de ARN

participan de nuevo en la reaccin para amplificar la secuencia

relevante.

DETECCIN DE MATERIAL GENTICO VRICO Otras tcnicas son semejantes al mtodo de ELISA.

Estos abordajes emplean secuencias inmovilizadas de ADN que son

complementarias para una secuencia genmica vrica relevante y

permiten capturar el genoma vrico.

Posteriormente se unen a otra secuencia complementaria que

contiene un sistema de deteccin.

La secuencia de ADNc se puede unir a una cadena muy ramificada

de ADN, que amplifican la seal hasta hacerla detectable

Otra variacin de esta tcnica utiliza un anticuerpo capaz de

reconocer complejos ADN-ARN con el fin de capturar hbridos

formados por una sonda de ARN con el ADN vrico en un pocillo de

la placa.

A continuacin se efectan pruebas con anticuerpos marcados con

enzimas y de ELISA con el propsito de detectar la presencia del

genoma vrico.


Tcnica de amplificacin de seal basada en bDNA (branched DNA)


TCNICA PROPSITO EJEMPLOS CLNICOS

PLFR Comparacin de ADN Epidemiologa molecular, cepas de VHS-1

Electroforesis de ADN Comparacin de ADN Diferencias en cepas de virus (hasta 20,000 b)

Hibridacin in situ Deteccin y localizacin de secuencias de ADN en tejidos

Deteccin de virus de ADN que no se estn replicando (CMV, papilomavirus)

Transferencia puntual Deteccin de secuencias de ADN en sol. Deteccin de ADN vrico

Transferencia Southern Deteccin y caracterizacin de secuencias de ADN por su tamao

Identificacin de cepas vricas especficas

Transferencia Northern Deteccin y caracterizacin de secuencias de ARN por su tamao

Identificacin de cepas vricas especficas

PCR Amplific. de muestras muy diludas de ADN Deteccin de virus ADN

PCR-TI Amplific. de muestras muy diludas de ARN Deteccin de virus ADN

PCR a tiempo real Cuantificacin de muestras muy diludas de ADN y ARN

Cuantificacin del genoma de VIH; carga vrica

ADN de cadena ramificada

Amplificacin de muestras muy diludas de ADN o de ARN

Cuantificacin de virus ADN y ARN

DSS-GEPA Separacin de prot. por su peso molecular Epidemiologa molecular del VHS

TCNICAS MOLECULARES PARA VIROLOGA

DSS-GEPA, electroforesis con dodecil sulfato sdico en gel de poliacrilamida; PCR, reaccin en cadena de la polimerasa;

PCR-TI, reaccin en cadena de la polimerasa por transcriptasa inversa; PLFR, polimorfismo de longitud de fragmentos de

restriccin; VHS, virus del herpes simple.

SEROLOGA VRICA

La respuesta inmunitaria humoral contiene los antecedentes de

cuadros infecciosos del paciente.

CUNDO USARLA?

Identificar los virus difciles de aislar y cultivar en cultivos celulares

Virus que provocan enfermedades de larga duracin

PARA QU?

Para identificar un virus y su cepa o serotipo. Determinar si se trata de una enfermedad aguda o crnica. Definir si la infeccin es de tipo primario o reinfeccin.

Los datos serolgicos sobre una infeccin vrica los proporcionan el

tipo y el ttulo de anticuerpos y la naturaleza de las dianas

antignicas.

SEROLOGA VRICA VIRUS DIAGNOSTICADOS POR SEROLOGA*

SEROLOGA VRICA La seroconversin est indicada por un incremento de por lo menos

el cudruple entre el ttulo de anticuerpos del suero obtenido durante

la fase aguda de la enfermedad y el obtenido por lo menos dos o tres

semanas despus durante la fase de convalecencia.

Por ejemplo, las muestras con 512 unidades y 1023 unidades de anticuerpos generaran una seal en una dilucin de 1:512, pero no en una de 1:1024, y en

ambas el ttulo se considerara 512. Por otro lado, las muestras con 1020 y

1030 unidades no son significativamente diferentes, pero se identificaran

como ttulos de 512 y 1024, respectivamente.

El curso crnico de la infeccin tambin puede determinarse a partir

de un perfil serolgico.

til para el diagnstico de las enfermedades vricas de evolucin

lenta (p. ej., hepatitis B, mononucleosis infecciosa producida por el

virus de Epstein- Barr).

Primera etapa: anticuerpos contra

los antgenos ms accesibles:

virin o superficie

Segunda etapa: anticuerpos contra

protenas y enzimas vrica intracelulares

SEROLOGA VRICA

IgM: Primera exposicin IgG: Segunda exposcin

SEROLOGA VRICA MTODOS DE ANLISIS SEROLGICO

Los anlisis serolgicos utilizados en virologa son:

Inmunofluorescencia (virus de la rabia, virus del herpes simple)

Enzimoinmunoanlisis (similar que la inmunofluorescencia)

ELISA (antgeno vrico:rotavirus; anticuerpo vrico: anti-VIH)

Transferencia de Western (confirmacin seropositividad anti-VIH)

Radioinmunoanlisis (similar a ELISA)

Fijacin de complemento (anticuerpos vricos)

Inhibicin de la hemaglutinacin (serocorversin e identif. gripe)


Los anlisis de neutralizacin e IH estudian los anticuerpos

basndose en el reconocimiento y la unin a los virus.

Los anticuerpos que recubren el virus inhiben su unin a las

clulas indicadoras.

La neutralizacin implica que el anticuerpo inhibe la infeccin y los

efectos citopatolgicos del virus en las clulas del cultivo tisular.

La respuesta de neutralizacin del anticuerpo es especfica del

virus y de la cepa.

La IH se emplea para identificacin de virus que pueden aglutinar

de manera selectiva los hemates de distintas especies animales

(p. ej., pollo, cobaya, humanos).

Los anticuerpos del suero impiden que una cantidad estandarizada

de virus se una y aglutine los hemates.

SEROLOGA VRICA

El ttulo del anticuerpo en el

suero era de 100.

ufp, unidades formadoras de

placa.

ANLISIS DE

NEUTRALIZACIN,

HEMADSORCIN E INH.

HEMAGLUTINACIN

MTODOS DE ANLISIS

SEROLGICO


El anlisis de fluorescencia indirecta de anticuerpos y los

inmunoanlisis en fase slida como LA, ELISA y RA se utilizan

habitualmente para detectar y cuantificar el antgeno vrico y el

anticuerpo antivrico.

La prueba de ELISA se utiliza para cribar las donaciones de sangre

(excluir a las personas seropositivas para los virus de la hepatitis

B, la hepatitis C y el VIH).

El anlisis de la transferencia de Western es muy importante para

confirmar la seroconversin y, por tanto, la infeccin por VIH.

La capacidad de los anticuerpos del paciente de identificar ciertas

protenas vricas separadas mediante electroforesis, transferidas

(depositadas) a un papel de filtro (p. ej., nitrocelulosa, naylon) y

visualizadas por medio de un anticuerpo antihumano conjugado con

una enzima.

Anlisis de transferencia de Western

las protenas se separan por electroforesis con dodecil sulfato sdico

en gel de poliacrilamida (DSS-GEPA), se transfieren a un filtro de

nitrocelulosa (NC) y se incuban con antisuero especfico del antgeno o

el paciente (1. Ab) y posteriormente con suero antihumano conjugado con enzimas (2. Ab). La conversin enzimtica del sustrato identifica el antgeno.



(c) (b)

Anlisis de transferencia de Western de antgenos y anticuerpos del VIH.

Estos datos ponen de manifiesto la seroconversin de un sujeto infectado por el VIH con suero

obtenido los das 0 (D0) a 30 (D30) en comparacin con un control positivo (CP) y un control

negativo (CN).


La presencia de un anticuerpo antivrico indica una infeccin

previa, pero no basta para indicar cundo se produjo la misma.

Infeccin reciente:

IgM especfica del virus El incremento del ttulo de anticuerpos al cudruple entre el

suero de la fase aguda y la fase convaleciente, o

perfiles de anticuerpos especficos

Asimismo, en los anlisis se producen resultados falsos positivos

o falsos negativos que tambin pueden confundir el diagnstico.

La formacin de inmunocomplejos impide la deteccin de

anticuerpos por ej. en los pacientes con hepatitis B

SEROLOGA VRICA LIMITACIONES DE LA SEROLGIA

Las reacciones serolgicas cruzadas entre los distintos virus tambin

pueden generar confusin con respecto a la identidad del agente

infectante

Ejemplo: los virus paragripal y del sarampin expresan antgenos

similares

El anticuerpo utilizado en el anlisis puede ser excesivamente

especfico (como sucede en el caso de un gran nmero de

anticuerpos monoclonales) y es posible que no reconozca otros virus

de la misma familia y d lugar a un resultado falso negativo (p. ej.,

rinovirus).

SEROLOGA VRICA LIMITACIONES DE LA SEROLGIA

Una buena comprensin de la sintomatologa clnica y el

conocimiento de las limitaciones y las posibles dificultades de los

anlisis serolgicos facilitar el proceso de elaboracin del

diagnstico.

[email protected]

Diagnostico Virologico Julio Ruiz

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