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© Ministerio de Salud

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Jr. Cápac Yupanqui 1400, Jesús María Telf. 471-3254 / Fax: 471-7443 Lima, Perú, 1997

Diseño e impresión : Art. Lautrec S.R.Ltda.

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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TECNICOS PARA EL DIAGNOSTICO SEROLOGICO

DE LA HIDATIDOSIS HUMANA

COMITÉ DE REDACCIÓN: Blgo. Elizabeth Luz Sánchez Romaní Dr. César Náquira Velarde Blga. Sonia Gutierrez Gonzáles Blgo. Eduardo Ayala Sulca Tec. Lab. Sonia Medina Alvarez COMITÉ EDITOR: Dr. Alfonso Zavaleta Martínez-Vargas Dr. César Cabezas Sánchez Dr. Carlos Carrillo Parodi Dr. Jaime Chang Neyra

MINISTERIO DE SALUD ALTA DIRECCIÓN Dr. Marino Costa Bauer Ministro Dr. Alejandro Aguinaga Recuenco Viceministro INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Dr. Carlos Carrillo Parodi Jefe CENTRO NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PUBLICA Dr. César Cabezas Sánchez Director General

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PERFIL DE LOS AUTORES Blga. M.Sc. Elizabeth Luz Sánchez Romaní Biólogo-Microbiológo, Maestro en Ciencias Jefe de División de Parasitología, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, INS, MINSA. Dr. César Náquira Velarde Médico, Doctor en Medicina Profesor Principal, Departamento de Microbiología Médica, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Miembro, Instituto de Medicina Tropical D.A. Carrión Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Jefe de Laboratorio de Zoonosis, División de Parasitología, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, INS, MINSA. Blga. Sonia Gutiérrez Gonzales Bióloga asistente, Laboratorio de Zoonosis, División de Parasitología, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, INS, MINSA. Blgo. Eduardo Ayala Sulca Biólogo asistente, Laboratorio de Zoonosis, División de Parasitología, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, INS, MINSA. Téc. Lab. Sonia Medina Alvarez Técnico de Laboratorio I, Laboratorio de Zoonosis, División de Parasitología, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, INS, MINSA. PERFIL DE LOS EDITORES Dr. Alfonso Zavaleta Martínez-Vargas Médico Cirujano, Doctor en Farmacología Director General, Centro Nacional de Control de Calidad, INS, MINSA Profesor Principal, Sección Farmacología, Departamento Académico de Ciencias Fisiológicas, Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia Miembro, Instituto de Medicina Tropical “Alexander von Humboldt”, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Dr. César Cabezas Sánchez Médico Cirujano, Master en Medicina, Especialista en Enfermedades Infecciosas y Tropicales Director General, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, INS, MINSA. Profesor invitado de Medicina Tropical, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Dr. Carlos Carrillo Parodi Médico Cirujano, Doctor en Medicina Profesor Principal, Departamento Académico de Microbiología, Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Jefe, Instituto Nacional de Salud Dr. Jaime Chang Neyra Médico Cirujano, Master of Science in Community Health in Developing Countries Director Ejecutivo de Garantía de la Calidad y Certificación, Centro Nacional de Control de Calidad, INS, MINSA Investigador, Instituto de Medicina Tropical “Alexander von Humboldt”, Universidad Peruana Cayetano Heredia. La edición de este Manual se efectuó en el marco del Convenio de Cooperación suscrito entre el Instituto Nacional de Salud y la Universidad Peruana Cayetano Heredia. El Comité Editor agradece al Dr. Jorge Barnaby Rodríguez, por la revisión y los comentarios efectuados a esta obra.

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INDICE

Presentación......................................................................................................................................................... 7 Resolución Jefatural............................................................................................................................................ 8 CAPITULO I Introducción......................................................................................................................................................... 9 CAPITULO II Métodos seroinmunológicos para el diagnóstico de la hidatidosis humana .............................................................................................................................................. 14 CAPITULO III Prueba de doble difusión arco 5 (DD5)................................................................................................................ 15 CAPITULO IV Prueba de inmunoblot...........................................................................................................................................19 CAPITULO V Obtención de muestra de suero.............................................................................................................................25 CAPITULO VI Conservación y envío de muestras de suero.........................................................................................................28 CAPITULO VII Bioseguridad.........................................................................................................................................................30 CAPITULO VIII Referencias Bibliográficas................................................................................................................................... 32 CAPITULO IX ANEXOS.............................................................................................................................................................. 34 Anexo 1 : Materiales, equipos, reactivos y soluciones para la prueba de DD5 .........................................................................................................................................35 Anexo 2 : Materiales, equipos, reactivos y soluciones para la prueba de inmunoblot ...............................................................................................................................39 Anexo 3 : Materiales para obtención de muestras de sangre venosa ...................................................................43 CAPITULO X Glosario.................................................................................................................................................................44

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PRESENTACIÓN

Las referencias históricas describen que el parásito Equinococcus granulosus fue introducido en la época de la Colonia, pero es en este siglo que la enfermedad es considerada como un problema emergente de Salud Pública. La relación epidemiológica hombre -perro- ganado (Bovino, Caprino, Ovino) no ha podido ser rota hasta la fecha en todo el territorio nacional. Se han intentado tratamientos a humanos y perros; se ha controlado los animales beneficiados; se ha capacitado a personal de Salud, escolares y comunidad; se ha evaluado el impacto económico negativo de por lo menos US$ 1'000,000 por año; se han ejecutado estudios, investigaciones e intervenciones integrales en áreas puntuales. Pese al desarrollo de diferentes métodos diagnósticos utilizados y fuentes de información (necropsias, hallazgos operatorios, radiología, serología) no existe aún un programa multisectorial, multidisciplinario y a nivel nacional que permita el abordaje exitoso de esta patología. “No basta con matar al perro”, es necesario que el personal de salud y de otras áreas técnicas trabaje en conjunto estrategias de mediano y largo plazo para limitar, eliminar o erradicar un problema endémico que a todas luces puede seguir avanzando en territorio y numero de personas y animales infestados.

El Instituto Nacional de Salud, dentro de la política sectorial presenta el Manual de Procedimientos Técnicos para el Diagnóstico Serológico de la Hidatidosis Humana, para su utilización en los laboratorios de diagnóstico y referencia a nivel nacional y como parte de las labores de difusión técnica de la Red Nacional de Laboratorios de Salud.

EL COMITE EDITOR

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CAPITULO I

INTRODUCCION La hidatidosis es una zoonosis parasitaria, que tiene como agentc etiológico la forma larvaria de helmintos de la Clase Cestoda, Género Echinococcus (Rudolphi, 1801). Cuatro especies del Género Echinococcus pueden infectar al hombre: E. granulosus, E. multilocularis, E. oligarthus y E. vogeli. De estas, la especie E. granulosus, es la de mayor importancia desde el punto de vista de la salud pública y de la producción animal. La hidatidosis causada por E. granulosus, es una de las zoonosis más difundidas y conocidas mundialmente, existiendo en tasas variables en todos los continentes. En América del Sur la infección incide, preferentemente, en los países ganaderos, sobre todo con crianza de ovinos, principalmente en las áreas rurales del Uruguay, Argentina, Chile, sur del Brasil, Bolivia y Perú. En el Perú, la hidatidosis está ampliamente difundida en ambientes rurales de la Sierra y también en zonas urbanas de Arequipa y Lima, debido a la presencia de perros infectados que son traídos de las zonas endémicas a las ciudades o al deficiente control veterinario de los camales. En la mayoría de los casos de infección humana, el desarrollo del quiste hidatídico es asintomático. La infección humana se produce por la ingesta de los huevos de E. granulosus, que generalmente se da en la infancia y la sintomatología irá a manifestarse tardíamente, esto es, en la edad adulta, cuando el quiste hidatídico haya alcanzado un tamaño mayor. Las manifestaciones clínicas de la hidatidosis se relacionan con el estado físico del quiste e integridad de sus membranas, así como con la localización y tamaño del quiste. Generalmente el crecimiento del quiste se manifiesta como masa que causa deformación de los órganos y alteraciones funcionales de los mismos. En casos de localización pulmonar, los signos y síntomas frecuentemente incluyen tos, dolor toráxico, hemoptisis y/o disnea. Cuando la localización es hepática o abdominal puede haber dolor, masas palpables, ictericia, hepatomegalia y/o esplenomegalia. Los casos de localización ósea producen destrucción de trabéculas, necrosis y fractura expontánea. El pronóstico se agrava cuando la localización es en órganos vitales como el sistema nervioso central, el corazón y los riñones. La hidatidosis es una de las pocas infecciones parasitarias humanas, cuyo diagnóstico de laboratorio es principalmente inmunoserológico. Sin embargo, cuando la sintomatología lo indica, son utilizados exámenes microscópicos dirigidos a la búsqueda de escólices en la orina, o escólices y/o fragmentos de membrana en la expectoración brónquica así como en líquidos pleurales y abdominales. Es importante señalar que está contraindicada la punción del quiste, por ser una conducta inductora de choque anafiláctico con riesgo de vida para el paciente y de causar diseminación hidatídica de consecuencias impredecibles. El inmunodiagnóstico de la hidatidosis humana es de gran importancia, pues complementa el diagnóstico clínico en pacientes que presentan manifestaciones o imágenes compatibles con el quiste hidatídico y consiste en la de-tección de anticuerpos circulantes, antígenos circulantes o células sensibilizadas contra los antígenos del quiste hidatídico. CARACTERISTICAS DEL AGENTE ETIOLOGICO EL VERME ADULTO de E. granulosus es el más pequeño de los céstodes conocidos, pues mide de 3 a 6 mm de longitud. Su cuerpo está dividido en tres partes principales: el escolex, que tiene forma globosa, con 4 ventosas y un rostelo armado de dos hileras de ganchos, el cuello o región proglotidogénica es delgado y corto; y la estróbila, formada por 3 ó 4 proglótides, de las cuales la última es grávida.

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LA HIDATIDE, es la larva propiamente dicha. Está formada por dos membranas denominadas laminar y germinativa y por el líquido hidatídico. a. La membrana laminar es la más externa y acelular, y está formada por un gran número de láminas

concéntricas. Su consistencia es frági1, rompiéndose fácilmente a la menor presión. b. La membrana germinativa es la responsable de la proliferación del parásito y de la regulación del

movimiento de macromoléculas del líquido hidatídico por la membrana laminar. A partir de esta membrana son formadas las vesículas prolígeras que generalmente presentan forma esférica y visibles, como granos de arena, miden de 250 a 500 μm.

A su vez, a partir de la membrana germinativa de las vesículas prolígeras se originan los Protoescólices, que vistos al microscopio son pequeñas cabezas invaginadas, de modo que el rostelo y los ganchos quedan protegidos, en las que la corona de ganchos y los dos pares de ventosas son claramente visibles.

c. El líquido hidatídico, elaborado por la membrana germinativa, es cristalino e incoloro, ocupa los espacios

intersticiales y baña las membrana germinativa.

Tiene composición química variable conteniendo sales y sustancias proteolíticas y glicolíticas. Es tóxico para el organismo parasitado siendo capaz de sensibilizarlo y consecuentemente provocar la formación de anticuerpos específicos.

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El E. granulosus es un parásito de ciclo de vida heteroxénico. La forma adulta se desarrolla y se torna sexualmente madura, en un hospedero definitivo (perro), la forma larvaria o quística tiene lugar en los hospederos intermediarios (ovinos, bovinos, equinos entre otros), incluyendo el hombre.

En el hospedero definitivo, el verme adulto se encuentra fijo a las vellosidades de la mucosa del intestino delgado. Las proglótides grávidas, conteniendo varias centenas de huevos, son eliminadas con las heces del animal a medida que se desprenden de la estróbila. Los huevos conteniendo la oncósfera (o embrión hexacanto), son ingeridos por los hospederos intermediarios a través de la vegetación, a partir del suelo contaminado. Cuando la oncósfera es liberada en el intestino delgado de este hospedero, atraviesa las paredes del intestino y penetra en los vasos sanguíneos y linfáticos, mediante los cuales es llevada a los tejidos del organismo. En el hígado o en los pulmones, órganos donde preferentemente se localizan los embriones, la gran mayoría es destruida por la respuesta inmune del hospedero. Aquellos que sobreviven evolucionan como una pequeña vesícula llena de líquido incoloro cercado por células mononucleares del hospedero. Esta vesícula es la que al

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enquistarse en los tejidos del hospedero intermediario, irá a representar el inicio de la fase larvaria del parásito y finalmente al quiste hidatídico, al formarse la membrana adventicia por la fibrosis alrededor de la hidátide o larva. Si las vísceras del hospedero intermediario, conteniendo quistes hidatídicos fueran devoradas por los perros, los escólisis se desarrollarán en su intestino dando origen a la forma adulta de E. granulosus. El hombre es un hospedero intermediario accidental y no cumple ningún papel en el ciclo evolutivo, sin embargo, es el principal responsable en perpetuar la infección, ya que alimenta a los perros por costumbre o por necesidad, con vísceras portadoras de quistes.

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CAPITULO II

METODOS INMUNOLOGICOS PARA EL DIAGNOSTICO DE LA HIDATIDOSIS HUMANA

Los métodos más utilizados para el diagnóstico de la hidatidosis humana son: Hemaglutinación indirecta (HAI), Aglutinación de Látex (AL), Doble difusión arco 5 (DD5), Inmunoelectroforesis (lEF) e Inmunoensayo (ELISA), (8, 13). Los métodos de DD5 e IEF son considerados de referencia en las áreas endémicas de los países de América del Sur, y están siendo utilizados en el Laboratorio de Zoonosis de la División de Parasitología del Centro Nacional de Laboratorios de Referencia. El empleo del método de ELISA presenta un amplio potencial para la detección de portadores asintomáticos en los que se confirmaría el diagnóstico inmunológico con la prueba de DD5 e Inmunoblot. Recientemente, está siendo utilizado el método de Inmunoblot o Western Blotting para el inmunodiagnóstico de la hidatidosis humana ofreciendo alta sensibilidad y especificidad con respecto a las anteriormente mencionadas (5). Los resultados de los estudios realizados hasta el momento en las diferentes áreas geográficas, empleando la técnica de Inmunoblot en el diagnóstico de la hidatidosis humana, muestran antígenos específicos para E. granulosus con masas relativas variadas (6, 11, 13). El patrón de reactividad positivo de los pacientes hidatídicos en áreas endémicas de nuestro país está condicionada al reconocimiento de bandas de Mr entre 21 y 31 kDa (12). Coincidentemente, estas bandas incluyen péptidos de los dos mayores componentes antigénicos del líquido de quiste hidatidico de E. granulosus: el antígeno “B” y el antígeno “5”. Este último es el mismo usado en la prueba de DD5, ampliamente conocida.

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CAPITULO III

PRUEBA DE DOBLE DIFUSION DEL ARCO 5 (DD5)

Es una reacción de precipitación antígeno-anticuerpo en un medio semisólido, que consiste en detectar, en el suero de un paciente, anticuerpos contra el antígeno del arco 5 (detectada por IEF), mediante la identidad inmunológica con un suero control positivo. 3.1 PROCEDIMIENTO:

3.1.1. Utilizar láminas portaobjeto de 2,5 x 7,5 cm sumergidas en alcohol, limpias y secas. 3.1.2. Rotular en un extremo de las láminas con lápiz punta de diamante, el número y fecha

correspondiente.

3.1.3. Sobre una superficie nivelada, colocar en la lámina con ayuda de una pipeta, 3,5 mL del gel (Anexo

I, 4.3) licuado en Baño María. (Foto 1).

3.1.4. Dejar solidificar el gel a temperatura ambiente durante 10 minutos. 3.1.5. Colocar la lámina en cámara húmeda y dejar enfriar por 15 minutos a 4°C. 3.1.6. Retirar la lámina de la cámara húmeda y colocarla sobre el diagrama de corte correspondiente

(Anexo I, Figuras 1 y 2).

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3.1.7. Cortar en el gel los orificios, utilizando los sacabocados con los diámetros correspondientes para los dos sueros problema (10 mm), el suero control.positivo (6 mm) y el antígeno (1 mm), según el diagrama (Figura 2). Retirar los geles cortados con una espátula fina procurando evitar dañar los bordes de los orificios. (Foto 2).

3.1.8. Colocar la lámina en cámara húmeda. 3.1.9. Llenar los orificios respectivos: suero problema (150 μL), suero control positivo (50 μL) y el

antígeno (3 μL), utilizando pipetas Pasteur. (Foto 3). No debe haber burbujas en su interior y el nivel superior debe ser convexo respecto a la superficie del agar (Anexo I, Figuras 3 y 4).

3.1.10. En el caso del orificio del antígeno, llenar con una pipeta Pasteur adaptado para el diámetro ( 1mm)

la que debe entrar holgadamente en el orificio (sin deformarlo ni agrandarlo). Introducir verticalmente en el orificio el extremo capilar hasta tocar la superficie del portaobjeto, dejar escurrir lentamente el antígeno, a medida que se retira la pipeta.

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3.1.11. Dejar difundir el antígeno y los anticuerpos en el agar de la lámina a temperatura ambiente durante 40 - 48 horas.

3.1.12. Finalizada la difusión, sumergir la lámina en Solución Salina Tamponada (SST), pH 7,4 (Anexo I,

4.1), a temperatura ambiente por 36 horas. Durante este período, se cambiará 5 veces la solución de lavado (SST). En los dos primeros lavados, eliminar de los orificios los posibles precipitados que pudiesen haber. Para lo cual con ayuda de una pizeta se rociará con SST a presión moderada.

3.1.13. Concluido el lavado, sumergir la lámina en agua destilada por 10 minutos. 3.1.14. Luego envolver la lámina en papel filtro Watman N° 1 previamente humedecido en agua destilada. 3.1.15. Dejarla secar en estufa a 37°C x 18 horas. 3.1.16. Retirar cuidadosamente el papel que envuelve a la lámina humedeciéndolo con agua destilada, en

caso necesario. 3.1.17. Sumergir en solución colorante (Anexo I, 4.4) durante 15-20 minutos, y observar si hay la banda de

precipitación entre antígeno y suero control; de no haberla, dejar la lámina más tiempo en la solución y continuar este paso.

3.1.18. Escurrir la lámina, enjuagar con agua de caño y volver a escurrir. 3.1.19. Sumergir en solución decolorante (Anexo I, 4.5) durante 20 - 30 minutos, hasta obtener una

decoloración satisfactoria en la lámina y apreciar claramente la banda entre el antígeno y el suero control.

3.2 LECTURA E INTERPRETACION

La lectura consiste en observar el número de bandas de precipitación entre los orificios del suero problema y el antígeno. Verificar si alguna de ellas presenta identidad con la banda formada entre el orificio del antígeno y el suero control positivo. (Foto 4). La prueba se considera válida cuando se observa la banda de precipitación entre el antígeno y el suero control positivo; en caso contrario, la prueba carece de valor y debe repetirse el ensayo.

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3.3 INFORME DE RESULTADOS

Informar la presencia (positivo) o ausencia (negativo) del Arco 5 y el número total de bandas observadas: a) Positivo. b) Negativo. Anotar la siguiente observación: “El resultado negativo no siempre indica ausencia de quiste hidatídico, pues esto puede ocurrir en caso de quiste íntegro (hialino) y calcificado”.

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CAPITULO IV

PRUEBA DE INMUNOBLOT FUNDAMENTO Este método permite observar la reacción de los anticuerpos presentes en el suero de un paciente frente a proteínas antigénicas del líquido hidatídico. Las proteínas son separadas por electroforesis y después transferidas a una membrana de nitrocelulosa. La membrana es entonces incubada con el suero problema y luego con Anti-IgG humano marcado con una enzima. Si el suero tiene anticuerpos, al agregar un substrato cromógeno adecuado, se origina un producto insoluble que precipita formando bandas en las zonas de proteínas antigénicas. 4.1 PROCEDIMIENTO 4.1.1. ETAPA I:

Separación de las proteínas del antígeno por electroforesis en gel de poliacrilamida conteniendo dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE). La separación de las proteínas, componentes antigénicos por SDS-PAGE es realizada siguiendo la metodología descrita por Tsang et al. (1983-1986), empleando un sistema discontinuo en el gel de se-paración y en el gel de empaquetamiento. Un sistema vertical (Mini-Protean II electroforesis Cel, BIO-RAD) resulta apropiado para realizar la separación de las proteínas. (Foto 5).

4.1.1.1 Antígeno

El antígeno total del líquido hidatídico de ovino (ATLH-O), liofilizado, es suspendido en un buffer Tris/HCl 0,05 M; pH 8,0 (Anexo II, 3.1) en concentración de 50 mg/mL y centrifugado a 3500 rpm por 30 minutos. El sobrenadante es conservado entre -40°C y-70°C hasta el momento de su uso.

4.1.1.2 Tratamiento del antígeno

El ATLH-O es diluido volumen a volumen, con una solución de tratamiento de muestra (Anexo II, 3.2). El antígeno es entonces sometido en Baño María a 100°C por 5 minutos. Luego se adiciona un colorante marcador de corrida (Anexo II, 3.3) a razón de 1 μL por cada 30 μL de muestra (Laemmli, 1970).

4.1.1.3 Preparación del gel de separación o de corrida para el modelo MiniProtean II, BIO-RAD.

- Usar 2 placas de vidrio de 73 mm de alto x 102 mm de ancho x 1 mm de espesor y 2 espaciadores de plástico de 0,75 mm de espesor.

- Limpiar las placas de vidrio con alcohol y secarlas. - Montar las placas, empleando los espaciadores untados con una capa fina de vaselina neutra para

unir las placas.

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- Preparar el gel en la concentración de 15% según la formula del Anexo II, 3.10 - Encajar las placas en un soporte. - Con auxilio de una jeringa colocar el gel en el espacio de las placas montadas hasta 65 mm de

altura e inmediatamente completar con agua destilada. - Dejar polimerizar a temperatura ambiente por 30 minutos.

4.1.1.4 Aplicación del gel de empaquetamiento

- Eliminar el agua destilada de la parte superior del gel, con ayuda de una jeringa. - Secar con papel filtro la superficie del gel de separación. - Preparar el gel de empaquetamiento como se indica (Anexo II, 3.10). - Colocar el gel de empaquetamiento preparado sobre el gel de separación e inmediatamente insertar

un peine preparativo de 0,75 mm de espesor, dejando un espacio entre el fondo del peine y el gel de separación. (Foto 6).

- Dejar polimerizar a temperatura ambiente por 30 minutos.

4.1.1.5 Preparación de la electroforesis

- Retirar el peine y lavar las cavidades que deja con Buffer Tris-Glicina-SDS o de corrida (Anexo II, 3.9).

- Aplicar en la cavidad del gel de empaquetamiento 40 μL de suspensión de antígeno en una concentración 4 μg/μL de proteínas.

- En las cavidades del extremo derecho de este gel, colocar 5 μL de proteínas de peso molecular patrón y 3 uL de peso molecular patrón preteñido.

- Adicionar aproximadamente 200 mL buffer de corrida en el recipiente superior y 300 mL del mismo buffer en el recipiente inferior de la cubeta, para iniciar la corrida electroforética. (Foto 7).

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4.1.1.6 Corrida electroforética

- Conectar los terminales eléctricos en la fuente de poder. La electroforesis se efectúa a 15 mA por gel.

- Prestar atención al colorante marcador de corrida. - Cuando los complejos SDS-proteínas entran uniformemente en el gel de separación o de corrida, la

corriente es aumentada a 30 mA por gel. - Desconectar el sistema cuando el colorante marcador de corrida alcanza la base del gel de

separación. 4.1.2 ETAPA II:

Transferencia de proteínas del gel de poliacrilamida a la membrana de nitrocelulosa. Las proteínas son transferidas electroforéticamente del gel para la membrana de nitrocelulosa con poros de 0,22 μm, empleando un recipiente de electroforesis. (Foto 9).

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4.1.2.1 Preparación de la transferencia

- En un recipiente conteniendo buffer de transferencia (Anexo II, 4.1) se coloca, el gel sobre una membrana de nitrocelulosa. Estos a su vez, se colocan entre dos hojas de papel filtro embebidas en el mismo buffer.

- El conjunto de gel, nitrocelulosa y papel de filtro se coloca entre dos esponjas de 3 mm de espesor y a su vez todo este conjunto queda empacado en una pieza plástica con perforaciones en ambos la-dos.

- Enseguida, este conjunto, se encaja en una cámara de transferencia, con el gel colocado hacia el cátodo y la membrana de nitrocelulosa hacia el ánodo.

4.1.2.2 Electrotransferencia

- La electrotransferencia se efectúa a una corriente, variando de 1,5 amperios a 10°C al inicio hasta 2,05 amperios a 35°C al final del proceso, manteniendo el voltaje constante de 55 voltios por una hora. (Foto 10).

- Finalizada la electrotransferencia, retirar la membrana de nitrocelulosa y lavar 5 veces por 5 minutos cada una, con buffer fosfato salino (PBS) 0,01M pH 7,2 (Anexo II, 4.2) conteniendo 0,3% de tween 20 (PBS-T) (Anexo II, 5.3) y 1 vez más con PBS sin tween.

- Cortar la tira de nitrocelulosa que contiene los patrones de peso molecular y colorear con solución al 1% de tinta China.

- A continuación cortar la membrana de nitrocelulosa conteniendo las proteínas del antígeno, en tiras de 3 mm de ancho y guardar a -20°C entre hojas de papel filtro humedecidos en PBS hasta el momento de su uso.

4.1.3 ETAPA III: Reacción inmunoenzimática

- Emplear placas de plástico divididas en compartimentos. - Colocar tiras de nitrocelulosa conteniendo el antígeno hidatídico en los compartimentos de las

placas. (Foto 11).

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- Incubar las tiras con PBS-T conteniendo 5% de leche descremada (PBS-TL) (Anexo) por 30

minutos a temperatura ambiente y agitando. - Descartar el PBS-TL y colocar los sueros problemas diluidos a 1:100 en PBS-TL e incubar por 1

hora. - Lavar las tiras 5 veces por 5 minutos cada una, con PBS-T. - Adicionar una solución de anti-IgG humano marcado con peroxidasa diluido a 1:1000 en PBS-TL e

incubar por 1 hora. - Lavar las tiras 5 veces por 5 minutos cada una con PBS-T y 1 vez más con PBS sólo. - Revelar la reacción adicionando una solución conteniendo 5 mg de Diamino bencidina (DAB)

10μL de H2O2 (30%) por cada 10 mL de PBS. - Luego de visualizar las bandas, lavar las tiras varias veces con agua deionizada. - Dejar secar las tiras a temperatura ambiente en la oscuridad.

4.2 Lectura e interpretación de resultados

Consiste en visualizar en las tiras de nitrocelulosa, la presencia o ausencia de bandas de precipitación. En caso de presencia de bandas anotar sus respectivas masas relalivas (Mr) expresados en unidades de kilodaltons (kDa). (Foto 12).

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4.3 Informe de resultados

El criterio de positividad para el diagnóstico de la hidatidosis humana, empleando antígeno hidatídico preparado en el INS, está condicionado al reconocimiento de uno o más péptidos antigénicos de Mr entre 21 y 31 kDa por anticuerpos presentes en el suero del paciente.

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CAPITULO V

OBTENCION DE LA MUESTRA DE SUERO SANGUINEO

El suero sanguíneo es el material que se solicita para el examen serológico de la hidatidosis humana, la cual se obtiene de sangre venosa siguiendo el procedimiento que a continuación se indica. 1. Colocar sobre la mesa de trabajo todo el material que se necesita para obtener la muestra (Anexo III). 2. Si el paciente se encuentra en el laboratorio, haga que se siente de manera que el brazo quede colocado,

paralelamente, a la mesa de trabajo donde se hará la extracción de sangre. Ponga el brazo del paciente sobre la mesa de trabajo apoyándolo en un pequeño cojín bajo el codo, con la palma de la mano vuelta hacia arriba.

3. Si el paciente se encuentra en cama extienda el brazo del paciente en una posición descansada. 4. El sitio más adecuado para la extracción de sangre es la vena que se encuentra en el pliegue anterior del

codo, en el punto donde es más gruesa y visible.

5. Coloque la ligadura alrededor del brazo y sujete firmemente los extremos.

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6. Con la mano izquierda, tire del extremo de la ligadura cruzándola y a continuación introduzca este extremo por debajo de la parte principal de la ligadura. De acuerdo a la Figura, la ligadura se deberá ajustar sólo lo suficiente para aminorar la corriente sanguínea y dilatar las venas, sin apretarlo tanto que reduzca el paso de sangre por las arterias.

7. Pedir al paciente que abra y cierre la mano varias veces, para favorecer la dilatación de las venas. 8. Con el dedo índice de la mano izquierda palpe la vena en que introducirá la aguja. 9. Desinfectar la zona de la piel donde se realizará la punción con un pedazo de algodón embebido en alcohol

yodado.

10. Usando guantes, tomar la jeringa con la mano derecha, colocando la yema del dedo índice sobre la base de

la aguja. 11. Colocar la aguja sobre la vena con el bisel hacia arriba; introduzca la aguja en el centro de la vena, sin

titubeos, 1-1,5 cm aproximadamente.

12. Con la mano izquierda tire hacia atrás el émbolo de la jeringa. muy lentamente. Deberá entrar la sangre en la

jeringa, hasta completar 5 mL; si no entra la sangre inténtelo nuevamente.

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13. Retirar la ligadura tirando del extremo doblado.

14. Aplicar un pedazo de algodón seco sobre la zona por donde se punzó la piel. Saque la aguja con un

movimiento rápido. 15. Pedir al paciente que presione, firmemente, el algodón durante tres minutos, con el brazo extendido. 16. Luego de extraída la sangre por punción venosa, retire la aguja de la jeringa y colóquela en un depósito de

metal (para autoclavar y eliminar); vierta, lentamente, la sangre en un tubo de prueba sin anticoagulante y tápelo. Deje reposar el tubo con la sangre en posición vertical, en una gradilla, por un lapso de 30 minutos a 2 horas, centrifugar la sangre de 2000 a 2500 rpm durante 5 minutos. Si no dispone de centrífuga, la sangre se puede dejar varias horas en la refrigeradora; el suero se separará del coágulo.

17. Destapar el tubo y aspirar el suero con una pipeta de Pasteur. 18. Depositar el suero en un tubo limpio y seco, así estará listo para realizar la prueba. 19. Si se remitiese la muestra a otro laboratorio, coloque el suero en viales de plástico con tapa o en frasco de

Weathon o de tipo penicilina, estéril, de 5 mL de capacidad, colocando inmediatamente la tapa y sellando con papel parafinado o cera.

20. Rotular y codificar el frasco de inmediato.

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CAPITULO VI

CONSERVACION Y ENVIO DE MUESTRAS DE SUERO

Las muestras contenidas en viales o frasquitos pueden conservarse en refrigeración (4°C) por período de tiempo cortos (hasta 1 día) y deben congelarse (freezer a 0°C) si se requiere conservarlas por mayor tiempo y si se cuenta con el equipo necesario a -20°C. Cuando las muestra no pueden ser procesadas en el mismo laboratorio o cuando se desea una confirmación del diagnóstico, éstas deben ser enviadas a otro laboratorio. Para efectuar el envío de las muestras de suero se deben seguir los siguientes pasos: - Colocar los frasquitos con las muestras de suero, rotulados apropiadamente, en una bolsa plástica y luego

acondicionarlas en un contenedor secundario (recipiente de plástico) rodeado de hielo seco o cubos de hielo. - El recipiente secundario debe ser colocado en una caja de tecnopor u otro material que conserve

temperaturas bajas. - Se debe adjuntar la ficha epidemiológica envuelta en una bolsa plástica o mica, cuidando que no se moje el

papel. - Cerrar y sellar herméticamente la caja térmica. - Rotular la caja térmica con los siguientes datos en caso de ser enviado al Laboratorio de Referencia

Nacional:

URGENTE INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL Jr. Cápac Yupanqui 1400 – Jesús María – Lima

Teléfono: 471-9920; Fax: 471-2529 contiene MATERIAL BIOLOGICO PERECIBLE

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CAPITULO VII

BIOSEGURIDAD Es un conjunto de medidas preventivas destinados a proteger la salud y la seguridad del personal, durante su trabajo, en los laboratorios donde se manipulan productos biológicos. El suero sanguíneo, y en ocasiones líquido cefalorraquídeo, son los productos biológicos principales que se procesan en las pruebas de diagnóstico inmunológico de la Hidatidosis humana. Los laboratorios donde se realizan las pruebas, deben ser de nivel de bioseguridad 2, esto implica las siguientes medidas: 1. DEL PERSONAL DE LABORATORIO

- Toda persona que manipula sangre o sus derivados, debe estar vacunada contra el virus de la Hepatitis B.

- Al momento de extraer la sangre debe vestir mandil, amarrarse el cabello largo o usar gorro y evitar tener brazaletes y collares.

- Usar guantes, jeringas y agujas descartables o vacutainers. Nunca utilizar sólo la aguja para la extracción de sangre, evitar pipetear fluidos.

1.1 Manipulación y eliminación de sangre y sus productos

- La extracción, centrifugación y separación de suero, deben hacerse usando guantes descartables. - Las agujas usadas, no deben devolverse al capuchón de plástico, sino colocarlas en lejía para luego

cremarlas juntamente con las jeringas usadas. Estas deben colocarse en un recipiente metálico o recipiente que resista la esterilización en autoclave, antes de eliminarlas.

- El operador es el responsable de desinfectar el área de trabajo antes y después de cada sesión de trabajo con fenol al 5%, cresol al 3% u otro desinfectante, dejándolos actuar durante 30 minutos. Durante este proceso no comer.

- El coágulo y suero innecesarios, deben eliminarse a un recipiente con desinfectante, lejía por ejemplo. - Los tubos de prueba, pipetas y láminas de microscopio pueden decontaminarse sumergiéndolas en

mezcla sulfocrómica o lejía antes de lavarlas. 2. DEL AMBIENTE DE LABORATORIO

- Las paredes y pisos deben ser lisos, de preferencia paredes enchapadas con mayólica y pisos de marmolina o cemento, que facilitan la limpieza con soluciones desinfectantes.

- Los pisos deben limpiarse todos los días con soluciones desinfectantes (pinosan, cresol, entre otros). No se debe barrer en seco ni encerar.

- Al sistema de desagüe, sólo se debe eliminar los agentes biológicos o químicos, previamente descontaminados, neutralizados o inactivados.

- El ambiente debe ser amplio, con suficiente iluminación, adecuadamente ventilación y que los servicios de agua, luz y gas funcionen satisfactoriamente.

- Las mesas de trabajo deben estar confeccionadas de material sólido, con superficies lisas, impermeables y resistentes a las sustancias corrosivas y de fácil limpieza.

3. ACCIDENTES 3.1 Inoculación accidental, cortes o abrasiones, quemaduras pequeñas

La persona accidentada debe lavarse las zonas afectadas y concurrir al servicio médico más cercano para el tratamiento adecuado del problema.

3.2 Ingestión de material posiblemente peligroso

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La persona acudirá inmediatamente al servicio médico más cercano para el tratamíento adecuado.

3.3 Contacto con material sospechoso de poder contener virus de la hepatitis B o virus de la inmunodeficiencia humana, dengue, fiebre amarilla, influenza etc.

- Se debe lavar la zona afectada con agua y jabón, favoreciendo el sangrado de la lesión, si es necesario, se cubre la herida con un apósito.

- Se concurrirá al servicio médico más cercano para determinar la gravedad y la posible contaminación con sangre.

- Se informará del accidente a las autoridades competentes. - Se tomará una muestra inicial de sangre del trabajador que será examinada serológicamente para

Hepatitis B, VIH, dengue y fiebre amarilla entre otros. - Se debe examinar, de la misma manera, una muestra del material con que se contaminó el personal. - Si la serología de VIH del trabajador es negativa, este examen debe repetirse mensualmente hasta el

sexto mes. La continuidad de la serología negativa indica que el trabajador no se ha contaminado.

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CAPITULO VIII

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. CENTRO PANAMERICANO DE ZOONOSIS. 1979. Prueba de doble difusión arco 5 para el diagnóstico

de la hidatidosis humana. (Nota Técnica N°22). Buenos Aires, Ramos Mejía. 2. COLTORTI E. & VARELA-DIAZ V. 1978. Inmunología e inmunodiagnóstico de la hidatidosis humana.

Med. Argent. 1a. Serie. (6):135-147. 3. GOMES DE MORAES RUY. 1971. Parasitología Médica. Rio de Janeiro, Atheneu. 219 p. 4. KAGAN I. 1968. A review of serological tests for the diagnosis of hydatid disease. Bull. WHO 39: 25-37. 5. LAEMMLI U. 1970. Cleavage of estructural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.

Nature 227: 680- 685. 6. MADDISON S., SLEMENDA S., SCHANTZ P., FRIED J., WILSON M. & TSANG V. 1989. A specific

diagnostic antigen of Echinococcus granulosus with an apparent molecular weight of 8 kDa. Am. J. Trop. Med. Hyg. 40 (4): 377-383.

7. NAQUIRA, C.; BULLON, F; BALVIN, G.; REYES, N. & SANCHEZ, E. 1989. Epidemiología de la

hidatidosis en el Perú. En: Anales del seminario nacional de zoonosis y enfermedades de alimentación alimentaria, Ministerio de Salud. 122-134.

8. NOBLE, E. & NOBLE, G. 1965. Parasitología: Biología de los Parásitos animales. 2ed. Mexico:

Interamericana. 258-262. 9. ORGANIZACION PANAMERICANA DE LA SALUD. 1986. Zoonosis y enfermedades transmisibles

comunes al hombre y a los animales. Washington, OPS. (Publicación Científica 503). 10. PEREZ FONTANA V. 1944. Tratado de la hidatidosis. En: Arch. Inter. Hidatid. Vol 1, Fasc. 1. Imprenta

Nacionales, Uruguay. 174 p. 11. PLANCHART S., BOTTO C., ALARCON DE NOYA B., BONIFACINO R., VIVAS L., SPENCER L. &

VIVAS S. 1994. Evaluation of the double diffusion, enzyme immunoassay and inmunoblotting techniques, for the diagnosis of human hydatid disease in tropical areas. Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo. 36 (3):205-210.

12. SANCHEZ E. 1995. Determinacao de antigenos relevantes da forma larvar do Echinococcus granulosus:

Padronizacao e aplicafao do “Immunoblot” no diagnostico da hidatidose humana. Instituto Oswaldo Cruz-FIOCRUZ. Rio de Janeiro. Tese de Mestría.

13. SHAMBESH M., GRAING P., GUSBI A., ECHTUISH E. & WEN H. 1995. Immunoblot evaluation of the

100 and 130 kDa antigens in camel hydatid cyst fluid for the serodignosis of human cyst echinococosis in Libya. Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 89: 276-279.

14. TSANG V., HANCOCK K., WILSON, M., PALMER, D., WHALEY S., McDOUGAL J. & KENNEDY S.

1986. Enzyme-linked inmunoelectrotransfer blot tecnique (western blot) for human T-Iymphotropic virus type III/lymphadenopathy- associated virus (HTLV-III/LAV) antibodies. Immunology series No.15 procedual guide. 1-25.

15. TSANG V., PERALTA M & SIMONS R. 1983. Enzyme-linked inmunoelectrotransfer blot tecniques

(EITB) for studying the specificities of antigens and antibodies separated by gel electrophoresis. Met. Enzymol. 92: 377-391.

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16. VARELA-DIAZ V. & COLTORTI E. 1974. Técnicas para el diagnóstico inmunológico de la hidatidosis humana. Centro Panamericano de Zoonosis, OPS/OMS (Monog. Cient. Tec. 7), Ramos Mejia, Provincia de Bs. As., Argentina.

17. VARELA-DIAZ, V., GUARNERA E. & COLTORTI E. 1986. Ventajas y limitaciones de los métodos

inmunológicos y de detección por imágenes para el diagnóstico de la hidatidosis. Bol. Of. Sanit. Panam. 100(4): 369-383.

18. VARELA-DIAZ, V., GUISANTES J., RICARDES, M., YARZABAL L. & COLTORTI E. 1975.

Evaluation of whole and purified hydatid fIuid antigens in the diagnosis of human hydatidosis by the immunoelectrophoresis test. Am. J. Trop. Med. Hyg. 24: 304-311.

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CAPITULO IX

ANEXOS

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ANEXO I

MATERIALES, EQUIPOS, REACTIVOS Y SOLUCIONES PARA DD5

1. MATERIALES Y EQUIPOS

- Láminas portaobjeto - Tubos de ensayo de 16 x 125 mm, tapa rosca - Pipetas Pasteur - Pipeta de 5 mL - Placas petri 100 x 15 mm. - Tubos de vidrio en “U” por 5 mm de diámetro - Beaker de 1 L. - Frasco Coplin - Frasco de vidrio de boca ancha con tapa de 100 x 80 mm aproximadamente - Lápiz con punta de diamante - Papel filtro (Whatman N° 1) - Pizeta de 500 mL - Guantes de látex - Bulbo para pipetas - Sacabocados para corte de 1, 6 y 10 mm de diámetro - Diagrama para corte (DD5) - Reloj de laboratorio - Refrigeradora - Estufa - Balanza - Potenciómetro

2. REACTIVOS Y SOLUCIONES

- Antígeno Hidatídico - Suero problema - Suero control positivo a antígeno del Arco 5 - Agar Noble (Difco) - Alcohol Etílico 95° - Merthiolate en polvo - Cloruro de Sodio - Fosfato dibásico de potasio - Fosfato monobásico de potasio - Colorante amido Schwarz (negro amido) - Acido acético glacial - Agua destilada - Lejía

3. PREPARACION DE ANTIGENO HIDATIDICO

El antígeno del arco 5 se encuentra en el líquido hidatídico. 3.1 Obtención del líquido Hidatídico:

El líquido extraído asépticamente (con jeringa) de quistes hidatídicos de animales, se deja decantar en probeta para permitir la sedimentación de arenilla hidatídica y posibles restos de membranas que hayan sido arrastrados en la aspiración. Una vez sedimentados los elementos más gruesos, el sobrenadante se transfiere a frascos para centrifugar a 2500 rpm durante 30 minutos. El líquido sobrenadante se congela

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inmediatamente.

3.2. Diálisis y Liofilización:

El líquido hidatídico descongelado, se transfiere a una bolsa de diálisis y se dializa a 4°C contra un volumen 25 veces mayor de agua destilada. Conviene dializar no menos de un litro de líquido hidatídico proveniente de varios quistes. El agua contra la cual se dializa dicho líquido se cambia cuatro veces, a intervalos de 24 horas. En consecuencia, la diálisis completa requiere cuatro días, y la relación entre el volumen de agua empleada y el volumen de líquido hidatídico dializado es de 100 a 1. Después de dializado, el líquido hidatídico presenta un aspecto opalescente debido a la precipitación de ciertas fracciones proteínicas. El contenido total de la bolsa de diálisis (incluido el precipitado) se trasvasa a frascos de tamaño adecuado para su liofilización (ejemplo frascos tipo penicilina). Es conveniente llenar los frascos solamente hasta un cuarto de su capacidad, para facilitar la congelación del líquido sobre las paredes lo que se consigue realizando la congelación mediante rotación del frasco en un baño de mezcla refrigerante (hielo seco- alcohol) o manteniéndolos a -80°C. Después de congelado el líquido hidatídico, se procede a su liofilización, tomando las precauciones necesarias para que durante este proceso la temperatura externa no exceda de los 20°C. El líquido hidatídico liofilizado que contiene el antígeno del arco 5, deberá guardarse en frascos perfectamente cerrados en un lugar seco y fresco hasta el momento de su empleo.

3.3 Control de Calidad del Antígeno Producido

El antígeno del líquido hidatídico obtenido según el procedimiento que se ha indicado, se controla mediante la prueba de inmunoelectroforesis para buscar la presencia del Arco 5; para ello, se comparan el antígeno producido y uno de referencia, frente a un suero positivo. El antígeno producido se considera satisfactorio cuando se verifica la formación de la banda del arco 5 y de no menos de otras cinco bandas. La banda de precipitación correspondiente al arco 5 debe ser bien definida y su morfología y ubicación debe estar una imagen en espejo de la morfología y ubicación del arco 5, resultante de la interacción del suero y antígeno de referencia. (Foto 13).

4. PREPARACION DE SOLUCIONES PARA DD5 4.1 Solución Salina Tamponada (Sst) 0,1M - pH 7,4

Solución Fisiológica (NaCl 0,85 gr%) ................................................ 900 mL Fosfato de potasio dibásico (K2HPO4) 0,1 M .................................... 100 mL Ajustar pH 7,4 con solución KH2PO4 0,1 M.

4.2 Preparación de Solución Antigénica

Pesar 50 μg de antígeno hidatídico liofilizado y disolver en 1 mL de SST 0,1 M, pH 7,4. Esta solución puede ser conservada en congelación a -20°C o a 4°C hasta 10 días.

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4.3 Preparación del Agar Noble

Pesar 1,2 gr. de Agar Noble (Difco o similar) y disolver en 100 mL de SST 0,1 M, pH 7,4 adicionada de un conservador (10 mg de merthiolate).

4.4 Solución Colorante

Amido Schwarz (Negro Amido) ................................................ 0,1 g Acido acético glacial ................................................................ 20,0 mL Agua destilada c.s.p. ............................................................. 1000,0 mL Conservar a temperatura ambiente en frasco color caramelo perfectamente cerrado.

4.5 Solución Decolorante

Alcohol etílico de 95° ............................................................ 400,0 mL Acido acético glacial .............................................................. 100,0 mL Agua destilada c.s.p .............................................................. 1000,0 mL Conservar a temperatura ambiente en frasco perfectamente cerrado.

DIAGRAMA PARA EL CORTE DEL AGAR EN LA PRUEBA DE DOBLE DIFUSION ARCO 5

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ANEXO II

MATERIALES, EQUIPOS, REACTIVOS Y SOLUCIONES PARA INMUNOBLOT

1. MATERIALES Y EQUIPOS

- 2 placas de vidrio de 73 mm de alto x 102 mm de ancho x 1 mm de espesor. - 2 espaciadores de plástico de 0,75 rnm de espesor. - Jeringas de 5 mL. - Peines separadores de especímenes. - Nitrocelulosa con poros de 0,22 μm. - Esponjas de 3 mm de espesor. - Papel filtro (Blotting paper). - Placas de plástico divididas en compartimentos (Mini-Incubation Trays). - Un sistema vertical Tipo Mini-Protean II electrophoretic cell, BIO-RAD. - Mini-Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cells Tipo “BIO-RAD”-USA.

2. REACTIVOS Y SOLUClONES

- Antígeno de líquido hidatídico de ovino (ATLH-O) liofilizado. - Suero problema. - Sueros control positivo. - Sueros control negativo. - Anti- IgG humano marcado con peroxidasa. - Tris o Trizma base. - 2-mercaptoetanol. - Azul de bromofenol. - Peso molecular estándar. - Acrilamida. - Bis-acrilamida. - Temed. - Dodecil sulfato de sodio (SDS). - Metanol. - Alcohol etílico. - Diamino-bencidina (DAB). - Peróxido de hidrógeno (30%). - Fosfato de sodio dibásico. - Fosfato de sodio monobásico. - Tween 20. - Leche descremada. - Coomassie blue R-250. - Solución decolorante.

3. PREPARACION BUFFER Y SOLUCIONES PARA SDS-PAGE 3.1 Buffer Tris/HCl 0,05M, pH 8,0

Tris .................................................................................................. 0,6 g NaCl ................................................................................................ 0,6 g Agua destilada q.s.p .................................................................... 100,0 mL Ajustar pH 8,0 con HCl concentrado.

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3.2 Solución de tratamiento de muestra

Tris/HCl 0,5 M pH 6,80 .................................................................... 95 mL 2 mercapto-etanol ........................................................................... 0,05 g SDS .................................................................................................. 0,02 g

3.3 Solución colorante marcador de corrida

Azul de bromofenol ....................................................................... 0,05 g Glicerol .......................................................................................... 8,00 mL Tris/HCl 0,5 M pH 8,0 ................................................................... 1,00 mL Agua deionizada .............................................................................. 1,00 mL Diluir la muestra 1:2 en el tampón de tratamiento, hervir por 10 minutos. Adicionar solución marcador de corrida 3 μL por cada 100 μL de la muestra.

3.4 Solución stock de poliacrilamida

Acrilamida ...................................................................................... 14,6 g N N’ bis-acrilamida .......................................................................... 0,4 g Agua deionizada q.s.p ..................................................................... 50,0 mL Pesar en tubo de plástico, disolverlos en agua caliente, esperar hasta que se enfríe y completar el volumen. Conservar a 4ºC.

3.5 Buffer de gel de empaquetamiento 0,5 M, pH 6,8

Tris 0,5 M ............................................................................................ 6,0 g Agua deionizada .............................................................................. 100,0 mL

3.6 Buffer de gel de separación o de corrida 1,5 M, pH 8

Tris 1,5 M .......................................................................................... 18,15 g Agua deionizada .............................................................................. 100,00 mL

3.7 Solución de persulfato de amonio (APS) a 10%

Persulfato de amonio ........................................................................ 10,0 g Agua deionizada .............................................................................. 100,0 mL Alícuotar y conservar a -20ºC.

3.8 Solución de Dodecil sulfato de sodio (SDS) a 10%

SDS (95%) ........................................................................................ 10,0 g Agua deionizada .............................................................................. 100,0 mL Conservar a 40ºC o a temperatura ambiente.

3.9 Buffer de corrida (superior/inferior) Tris 0,05M

Tris ó Trizma base ............................................................................... 30,0 g Glicina 0,192 M .................................................................................. 14,4 g SDS a 10% ........................................................................................... 10,0 mL Agua deionizada ............................................................................... 1000,0 mL

3.10 Fórmula de concentración de gel de empaquetamiento y de separación o de corrida al 12% y 15%

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4. PREPARACION DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA LA TRANSFERENCIA 4.1 Buffer de transferencia Tris 0,5 M

Tris ó Trizma base ............................................................................... 102,8 g Metanol ................................................................................................ 400,0 mL Agua deionizada ................................................................................ 2000,0 mL Ajustar pH 9,18 con HCl concentrado

4.2 Buffer fosfato salino 0,01 M, pH 7.2 (PBS)

Preparar 2 soluciones como sigue: A. NaH2PO4.H2O (fosfato monobásico de sodio) ............................... 1,37 g NaCl ................................................................................................... 8,76 g Agua deionizada q.s.p ................................................................. 1000,00 mL B. Na2PO4.7H2O .................................................................................. 2,68 g NaCl ................................................................................................... 8,76 g Agua deionizada .......................................................................... 1000,00 mL Mezclar las soluciones A y B (aproximadamente 5 partes de A para 6 partes de B). Ajustar el pH 7,2.

5. PREPARACION DE SOLUCIONES PARA REACCION INMUNOENZIMATICA 5.1 Conjugado anti-IgG humano diluido a 1:1000 en PBS-TL 5.2 Sueros controles negativo, positivo y suero problema diluidos a 1:100 en PBS-TL 5.3 PBS-T

PBS 0.01 M Ph 7,2 ............................................................................... 100,0 mL Tween ......................................................................................................... 3,0 mL

5.4 PBS-TL

PBS ........................................................................................................ 100,0 mL Leche descremada ...................................................................................... 5,0 g

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5.5 Solución reveladora

3,3’ diaminobenzidina tetracloridrato ...................................................... 5,0 mg PBS 0,01 M pH 7,2 .................................................................................. 10,0 mL H2O2 (30 volúmenes) ................................................................................ 10,0 μL

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ANEXO III

MATERIALES PARA OBTENCION DE MUESTRA DE SANGRE VENOSA

Según el procedimiento que emplee:

Tubos vacutainer estériles. Jeringa descartable de 5 mL.

- Agujas descartables 20 x 1G. - Ligaduras de 2,5 mm de diámetro. - Algodón. - Alcohol yodado. - Depósito de metal (tarros) para descartar las agujas. - Frasco de vidrio de boca ancha (para colocar jeringas en solución de lejía). - Lejía al 3-5%. - Gradillas. - Mascarillas (opcional). - Guantes. - Cuaderno de registro.

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CAPITULO X

GLOSARIO

Antígeno: Sustancia extraña al organismo que induce la respuesta del sistema inmune. Anticuerpo: Proteínas (inmunoglobulinas) producidas por el organismo, en respuesta al ingreso de una sustancia extraña (antígeno). Dilución: Mezcla de una sustancia con una o más partes de otra (diluyente) que no altere las características de la primera y que reduzca su concentración.. Enfermedad: Proceso mórbido con síntomas definidos que afecta a todo el organismo o parte del mismo. Enzima: Proteína que actúa como catalizador orgánico sobre un substrato específico. Embrión hexacanto: Embrión de tenia con seis ganchos (oncósfera). Estróbilo: Toda la cadena de proglótides de la tenia. Escólex: Cabeza de una tenia; puede adherirse a la pared intestinal mediante ventosas o ganchos. Helminto: Gusano que puede ser nemátodo, céstodo o tremátodo. Hospedero: Organismo en el cual vive un parásito. Hospedero intermediario: Ser que se requiere en el ciclo vital, en el cual debe verificarse el desarrollo larval esencial antes de que un parásito infecte a su hospedero definitivo o a hospederos intermediarios adicionales. Infección: Penetración y multiplicación de un microorganismo en un hospedero, independientemente de la presentación de síntomas y/o patología. Inmunoglobulinas: Proteína con actividad de anticuerpo específica, responsable de la inmunidad humoral; hay cinco clases distintas IgG, IgM, IgA, IgE, IgD. Proglótide: Segmento de la tenia que contiene los sistemas reproductores masculino y femenino; pueden ser inmaduros, maduros y grávidos. Quiste hidatídico: Estado larval de la tenia del género Echinococcus; consiste en una vesícula grande que posee 1) una membrana germinal interna desde la cual los escolises y los quiste hijos se desarrollan avanzan para proyectarse en la vesícula, 2) una membrana circular y 3) una membrana adventicia. Quiste multilocular: Quistes que contienen muchas vesículas. Quiste unilocular: Quiste que contiene sólo una vesícula. Título serológico: La cantidad de suero necesaria para producir una reacción biológica con otra sustancia, medida generalmente como la máxima dilución del suero testigo que aún mantiene dicha reactividad. Zoonosis: Enfermedad de animales transmisible a los seres humanos.

Esta publicación se terminó de imprimir en Diciembre de 1997 en los

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