Diseño químico y genético de biocatalizadores con

fines ambientales

Diseño químico y genético de biocatalizadores con

fines ambientales

Rafael Vazquez-DuhaltRafael Vazquez-Duhalt

Desarrollo Tecnológico

ENERGÍA

PROCESOSACTUALESPROCESOSACTUALES

PROCESOSFUTUROS

PROCESOSFUTUROS

AMBIENTE

El petróleo se nos va de las manosEl petróleo se nos va de las manos

Entre 2010 y 2020 será la máxima extracción de petróleo en el mundo, después la inexorable

disminución del recurso no renovable.

(Campbell and Laherrère, 1998, Nature Biotechnology 19: 314-315)

Entre 2010 y 2020 será la máxima extracción de petróleo en el mundo, después la inexorable

disminución del recurso no renovable.

(Campbell and Laherrère, 1998, Nature Biotechnology 19: 314-315)

World Resource Institute, 1996

1900 1950 2000 2050 2100

Disponibilidad de petróleo

Disponibilidad de petróleo

PoblaciónPoblación

45 años65 años

230 añosReservas mundiales a finales de 1995

Gas natural

Petróleo

Carbón

185019001920

1950

1970 1990

2100

2100 2100

2100

2100

0%

0%

0%20%

20%

40%

40% 60%

60%

60%

40%

80%

80%

80%

100%

100%100%

RENOVABLES / NUCLEARRENOVABLES / NUCLEAR

PE

TER

OLE

O / G

AS

PE

TER

OLE

O / G

ASC

ARBO

N

CAR

BON

Historia y Perspectivas del las Fuentes de EnergíaHistoria y Perspectivas del las Fuentes de Energía

A. Grübler (1999) Energy, the next fifty years. OCED.

Consumo energético de diferentes sectores industriales en Francia durante el año 2000.

Ton. eq .de petróleo por añoSector industrial por millón de dólares de v.a. Química mineral y fertilizantes 59.3Siderúrgica 46.2Ciclo del uranio 42.6Papelera 19.2Vidrio 16.9Cementero y materiales de construcción 15.8Química orgánica y farmacéutica 8.5Hulero y transformación de plásticos 5.4Fundición y metalmecánica 4.5Textil 3.8Transportes 2.6Eléctrica y electrónica 1.8Madedero, muebles 2.0  

Consumo energético de diferentes sectores industriales en Francia durante el año 2000.

Ton. eq .de petróleo por añoSector industrial por millón de dólares de v.a. Química mineral y fertilizantes 59.3Siderúrgica 46.2Ciclo del uranio 42.6Papelera 19.2Vidrio 16.9Cementero y materiales de construcción 15.8Química orgánica y farmacéutica 8.5Hulero y transformación de plásticos 5.4Fundición y metalmecánica 4.5Textil 3.8Transportes 2.6Eléctrica y electrónica 1.8Madedero, muebles 2.0  

Lerey P. Une industrie moins gourmande. Science et Vie. 2001 No. 214, 98-101.

EtilenoEtileno

Toda la industria(uso de energéticos fósiles)Toda la industria(uso de energéticos fósiles)

Mínimo termodinámico para la producción de etilenoMínimo termodinámico para la producción de etileno

19551955 19601960 19651965 19701970 19751975 19851985 1990199019801980

Energía, una fuerza de cambioEnergía, una fuerza de cambio

¿Industriaun riesgo ambiental?

¿Industriaun riesgo ambiental?

US Environmental Protection Agency, Toxic Release Inventory, 2000

Año

3500

3000

2500

2000

1500

1000

500

0

1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000

Emisones a la atmósfera

Dispersión en aguas superficiales

Infiltración en mantos freáticos

Dispersión en suelos

Transferencia en descargas

3500

3000

2500

2000

1500

1000

500

0

1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000

Mill

ones

de

libra

s po

r añ

o

Emisones a la atmósfera

Dispersión en aguas superficiales

Infiltración en mantos freáticos

Dispersión en suelos

Transferencia en descargas

Inventario de Sustancias Tóxicas dispersadas en el ambiente en Estados Unidos, 2000

Inventario de Sustancias Tóxicas dispersadas en el ambiente en Estados Unidos, 2000

Emsiones de químicos tóxicos en Estados Unidos durante 1990. Industria Toneladas/año Química 835,000Metalurgia 483,000Papelera 134,000Transportación 107,000Plásticos 98,000Mueblera 63,000Petrolera 57,000Eléctrica 55,000Metalmecánica 30,000Pinturas 26,000Madedera 21,000Textil 17,000 

Emsiones de químicos tóxicos en Estados Unidos durante 1990. Industria Toneladas/año Química 835,000Metalurgia 483,000Papelera 134,000Transportación 107,000Plásticos 98,000Mueblera 63,000Petrolera 57,000Eléctrica 55,000Metalmecánica 30,000Pinturas 26,000Madedera 21,000Textil 17,000 

US Environmental Protection Agency. Toxics Release Inventory (1990)

HOYAYER MAÑANA

Ambiente, una fuerza de cambioAmbiente, una fuerza de cambio

Tratamientoy

Remediación

Ecología IndustrialEcología Industrial

La Ecología industrial es el estudio por medio de sistemas de ingeniería basado en principios ambientales o ecológicos, que integre a la producción y al consumo aspectos de diseño, proceso, uso y terminado de productos, satisfactores o servicios de una manera en que se minimice el impacto ambiental y la utilización de recursos y energía

La Ecología industrial es el estudio por medio de sistemas de ingeniería basado en principios ambientales o ecológicos, que integre a la producción y al consumo aspectos de diseño, proceso, uso y terminado de productos, satisfactores o servicios de una manera en que se minimice el impacto ambiental y la utilización de recursos y energía

Los industriales deben dejar de ver los productos, efluentes y emisiones como flujos que salen de la

planta y verlos como parte integral y responsabilidad de la compañía.

Los industriales deben dejar de ver los productos, efluentes y emisiones como flujos que salen de la

planta y verlos como parte integral y responsabilidad de la compañía.

Diseño del producto y del procesoDiseño del producto y del proceso

Productos de menor impacto ambiental.Incrementar eficiencias de transformación.Selección de materia primas de menor impacto ambiental.Minimización del uso de recursos.Reciclaje.Integración de los efluentes y emisiones a otros procesos.Uso eficiente de la energía.

Productos de menor impacto ambiental.Incrementar eficiencias de transformación.Selección de materia primas de menor impacto ambiental.Minimización del uso de recursos.Reciclaje.Integración de los efluentes y emisiones a otros procesos.Uso eficiente de la energía.

RETOSRETOS

Responsabilidad Social de los Industriales+

Impuesto sobre Impacto Ambiental (IIA)

C

CH3

CH3

HO OH C

CH3

CH3

O--

O

C

CH3

CH3

-O O

-

Bu4N+Bu4N+

NaOH

H2O

Bu4N+X-

O

CClCl

C

CH3

CH3

OO C

O

x

Síntesis química tradicional de polycarbonatosSíntesis química tradicional de polycarbonatos

FosgenoFosgenoAltamente tóxicoLetalArma química

Altamente tóxicoLetalArma química

Subproductos tóxicosSubproductos tóxicos

+

OHC

CH3

CH3

HO

O

CO O CH3H3C C

CH3

CH3

C

O

O

LipasaLipasa

+x

Síntesis enzimática de ploycarbonatosSíntesis enzimática de ploycarbonatos

Reducción significativa de la toxicidad de las materias primas y productos.Mejor economía estequiométrica (menos subproductos).Proceso energéticamente menos costoso.

Precios de catalizadores industriales.

Enzima Dólares / kg Catalizador Dólares / kg

Deshidrogenasa láctica 100,000 BINAP 40,000Esterasa de hígado porcino 15,000 Platino 12,000Penicilina amidasa 10,000 ChiraPhos 10,000Aspartasa 10,000 Sharpless 10,000Tripsina 5,000 Pd(Diphos)2 5,000Lipasa 5,000 Rh(PPh3)3Cl 2,000Glucosa isomerasa 500 Jacobsen 1,000Proteasa de detergente 250 Chirald 500Glucoamilasa 100 Niquel Raney 30

Precios de catalizadores industriales.

Enzima Dólares / kg Catalizador Dólares / kg

Deshidrogenasa láctica 100,000 BINAP 40,000Esterasa de hígado porcino 15,000 Platino 12,000Penicilina amidasa 10,000 ChiraPhos 10,000Aspartasa 10,000 Sharpless 10,000Tripsina 5,000 Pd(Diphos)2 5,000Lipasa 5,000 Rh(PPh3)3Cl 2,000Glucosa isomerasa 500 Jacobsen 1,000Proteasa de detergente 250 Chirald 500Glucoamilasa 100 Niquel Raney 30

J.D. Rozzell (1999) Bioorg. Med. Chem. 7: 2253-2261. J.D. Rozzell (1999) Bioorg. Med. Chem. 7: 2253-2261.

Nuevas actividaescatalíticas

Nuevas actividaescatalíticas

Diseño racional de enzimas

Diseño racional de enzimas

BioprospecciónBioprospección

Evolución dirigidaEvolución dirigida

Bioprospección

La secuenciación masiva de muestras de ADN ambiental usando sondas universales ha abierto una ventana hacia la sorprendente biodiversidad bacteriana. Ahora sabemos que, aunque el número exacto varie de acuerdo a la fuente, probablemente más del 99% de los componentes bacterianos del suelo y de los oceános son desconocidos.

Bioprospección

La secuenciación masiva de muestras de ADN ambiental usando sondas universales ha abierto una ventana hacia la sorprendente biodiversidad bacteriana. Ahora sabemos que, aunque el número exacto varie de acuerdo a la fuente, probablemente más del 99% de los componentes bacterianos del suelo y de los oceános son desconocidos.

La estrategia consistió en la eficacia de la actividad de nitrilasa para la hidrólisis de cianohidrinas.

La estrategia consistió en la eficacia de la actividad de nitrilasa para la hidrólisis de cianohidrinas.

OH

R CN

OH

R CN

O

R H

HCN

(S)-1 (R)-1

OH

R COOH

(R)-2

De Santis et al. J. Am. Chem. Soc. 2002. 124:9024

Caso de éxito de bioprospeccion en la selección de biocatalizadores enantioselectivos

Caso de éxito de bioprospeccion en la selección de biocatalizadores enantioselectivos

Uno de los organonitrilos utilizados como sustratos fue el mandelonitrilo, precursor del ácido mandélico, compuesto muy utilizado en las industrias farmaceútica y cosmética. Solo 27 de 200 nitrilasas obtenidas en un primer ensayo resolvieron la mezcla de mandelonitrilos en mas de 90% ee. Solo una de ellas fue estudiada en mayor detalle y se lograron obtener eficiencias de >98% ee.

Uno de los organonitrilos utilizados como sustratos fue el mandelonitrilo, precursor del ácido mandélico, compuesto muy utilizado en las industrias farmaceútica y cosmética. Solo 27 de 200 nitrilasas obtenidas en un primer ensayo resolvieron la mezcla de mandelonitrilos en mas de 90% ee. Solo una de ellas fue estudiada en mayor detalle y se lograron obtener eficiencias de >98% ee.

OH

CN

OH

COOHCN

OH

Acido R-mandélico

Una biblioteca numerosa, usualmente en el rango entre 104 y 107, se prepara por mutagenesis al azar del gene entero, recombinacion in vitro o por mutagenesis de una sección subgenómica del gene. La clonación y expresión de la librería resulta en una colección de moléculas de la enzima potencialmente activas que deben ser seleccionadas en función de la actividad enzimática o propiedad determinada.

Una biblioteca numerosa, usualmente en el rango entre 104 y 107, se prepara por mutagenesis al azar del gene entero, recombinacion in vitro o por mutagenesis de una sección subgenómica del gene. La clonación y expresión de la librería resulta en una colección de moléculas de la enzima potencialmente activas que deben ser seleccionadas en función de la actividad enzimática o propiedad determinada.

Evolución dirigidaEvolución dirigida

Gene silvestreD

esem

peño

Dist. en el espacio de secuencia

Mutagenésis al azar

Rondas sucesivas de mutagénesis al azar, recombinación y selección

Selección

Des

empe

ño

Selección

Recombinación

Dist. en el espacio de secuencia

Recombinación

Rondas sucesivas de recombinación y selección

Selección

Des

empe

ño

Selección

Recombinación

Dist. en el espacio de secuencia

Gene silvestre Genes homólogos

Mutagenésis al azar

Rondas sucesivas de mutagénesis al azar y selección

Selección

Selección

Mutagenésis al azar

Caso exitoso de enantioselectividad por evolucion dirigidaCaso exitoso de enantioselectividad por evolucion dirigida

C8H17

NO2

CH3

O

O

C8H17

NO2

CH3

O

O

C8H17

CH3

O

OH

Lipasa de P. aeruginosa

H2O

+

p-nitrofenil 2-metildecanoato Acido S-2-metildecanoico

Resolucion hidrolitica del p-nitrofenil 2-metildecanoatoResolucion hidrolitica del p-nitrofenil 2-metildecanoato

La enzima silvestre cataliza la reaccion con una enantioselectividad hacia el enantiomero S del 2% ee a una tasa de conversión del 50%.La enzima silvestre cataliza la reaccion con una enantioselectividad hacia el enantiomero S del 2% ee a una tasa de conversión del 50%.

Despues de cuatro rondas de PCR mutagénico, se detectaron variantes con un incremento en enantioselectividad de ee = 81%. La clona mas activa se mejoró al mutagenizar a saturación aquellas posiciones seleccionadas en la primera etapa. Se obtuvieron variantes con valores de ee = 90-94% hacia el enantiomero S.

Despues de cuatro rondas de PCR mutagénico, se detectaron variantes con un incremento en enantioselectividad de ee = 81%. La clona mas activa se mejoró al mutagenizar a saturación aquellas posiciones seleccionadas en la primera etapa. Se obtuvieron variantes con valores de ee = 90-94% hacia el enantiomero S.

Liebeton, K. et al. Chem Biol. 2000. 7:709.Liebeton, K. et al. Chem Biol. 2000. 7:709.

Diseño racional de enzimasDiseño racional de enzimas

La estereoespecificidad de las enzimas responde al arreglo espacial de los residuos catalíticos en el sitio activo.

El rediseño racional de los sitios activos permitirá, en principio, modular la enantioselectividad de los mismos en aquellos casos donde los sustratos posean esta propiedad.

El diseño racional implica un conocimiento preciso no solo de la secuencia, sino de la estructura tridimensional. Esta necesidad esta dejando de ser limitante, ya que cuenta con la información estructural de alrededor de 2,000 enzimas diferentes, 80% de las cuáles cuenta con una determinación completa del sitio activo.

La estereoespecificidad de las enzimas responde al arreglo espacial de los residuos catalíticos en el sitio activo.

El rediseño racional de los sitios activos permitirá, en principio, modular la enantioselectividad de los mismos en aquellos casos donde los sustratos posean esta propiedad.

El diseño racional implica un conocimiento preciso no solo de la secuencia, sino de la estructura tridimensional. Esta necesidad esta dejando de ser limitante, ya que cuenta con la información estructural de alrededor de 2,000 enzimas diferentes, 80% de las cuáles cuenta con una determinación completa del sitio activo.

Caso exitoso en el diseño racional del cambio de enantioselectividad

Caso exitoso en el diseño racional del cambio de enantioselectividad

Van den Heuvel et al. PNAS, 2000. 97:9455.

La vanillil-alcohol oxidasa (VAO) convierte preferencialmente 4-etilfenoles y 4-propilfenoles a los correspondientes R-1-(4´-hidroxifenil)alcoholes. El reacomodo simétrico de las cadenas laterales Asp170 y Thr457 involucrados en la activaciòn de una molécula de agua involucrada en la conversión del sustrato permitieron un cambio en selectividad hacia la producción del enantiomero S en 80% ee.

La vanillil-alcohol oxidasa (VAO) convierte preferencialmente 4-etilfenoles y 4-propilfenoles a los correspondientes R-1-(4´-hidroxifenil)alcoholes. El reacomodo simétrico de las cadenas laterales Asp170 y Thr457 involucrados en la activaciòn de una molécula de agua involucrada en la conversión del sustrato permitieron un cambio en selectividad hacia la producción del enantiomero S en 80% ee.

Reducción enzimática del impacto ambiental de residuos industriales

Reducción enzimática del impacto ambiental de residuos industriales

Antraceno

Pireno

Fenantreno

Fluoranteno

Benzo(a)pireno Benzo(e)pireno

Benzo(ghi)perileno Nafto(2,3-a)pireno

O

HO

HO

+

OO

N

N

N

NNH

OHHO

HO

HOCH2O P O

O

O O O

N

N

N

NNH

OCH2 OHPO

O

O

Formación del diolepóxidoFormación del diolepóxido

Oxidación de un electrónOxidación de un electrón

Lignino peroxidasa

Manganeso peroxidasa

Lacasa

Citocromo P450

Veratril alcohol oxidasa

Hongos ligninolíticosHongos ligninolíticos

OCH3

OHHO

OLignin

O

OH

OCH3

OHO

HO

O

OH

OH

CH3O

O O

HO

OCH3

OHOH

O

CH3O

OH

OOH

CH3O

O

O

OCH3O

OHLignin

OCH3

O

OHHO

O

CH3O

OHHO

OCH3

O

CHO

HO

Products from oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbonsby lignin peroxidase from Phanerochaete chrysosporium in

vitro.________________________________________________________

PAH Products Ref._________________________________________________________

Anthracene 9,10-Anthraquinone 1Acenaphthene 1-Acenaphthenol 1

1-Acenaphthenone 11-Methylanthracene 1-Methyl-9,10-anthraquinone 12-Methylanthracene 2-Methyl-9,10-anthraquinone 19-Methylanthracene 9-Methyl-9,10-anthraquinone 1

9-Methyl-10-anthranone 19,10-Anthraquinone 1

Pyrene 1,8-Pyrenedione 1, 21,6-Pyrenedione 2

Benzo(a)pyrene 1,6-Benzo(a)pyrenedione 33,6-Benzo(a)pyrenedione 36,12-Benzo(a)pyrenedione 3

_________________________________________________________

Products from oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbonsby lignin peroxidase from Phanerochaete chrysosporium in

vitro.________________________________________________________

PAH Products Ref._________________________________________________________

Anthracene 9,10-Anthraquinone 1Acenaphthene 1-Acenaphthenol 1

1-Acenaphthenone 11-Methylanthracene 1-Methyl-9,10-anthraquinone 12-Methylanthracene 2-Methyl-9,10-anthraquinone 19-Methylanthracene 9-Methyl-9,10-anthraquinone 1

9-Methyl-10-anthranone 19,10-Anthraquinone 1

Pyrene 1,8-Pyrenedione 1, 21,6-Pyrenedione 2

Benzo(a)pyrene 1,6-Benzo(a)pyrenedione 33,6-Benzo(a)pyrenedione 36,12-Benzo(a)pyrenedione 3

_________________________________________________________

1. Vazquez-Duhalt et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 459-4662. Hammel et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 16984-169523. Haemmerli et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 6900-6903

1. Vazquez-Duhalt et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 459-4662. Hammel et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 16984-169523. Haemmerli et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 6900-6903

In vitro PAH oxidation with manganese peroxidase in lipid peroxidation reactions.

____________________________________________________

Aromatic compound Oxidation rate (nmol/h)____________________________________________________

Fluorene 3.10Benz(a)antrhracene 1.08Benzo(a)pyrene 0.96Anthracene 0.93Dibenz(a,c)anthracene 0.60Benzo(e)pyrene 0.31Diphenylmethane 0.30Benzo(c)phenanthrene 0.21Benzo(b)fluoranthene 0.19Fluoranthene 0.14Phenanthrene 0.06____________________________________________________

In vitro PAH oxidation with manganese peroxidase in lipid peroxidation reactions.

____________________________________________________

Aromatic compound Oxidation rate (nmol/h)____________________________________________________

Fluorene 3.10Benz(a)antrhracene 1.08Benzo(a)pyrene 0.96Anthracene 0.93Dibenz(a,c)anthracene 0.60Benzo(e)pyrene 0.31Diphenylmethane 0.30Benzo(c)phenanthrene 0.21Benzo(b)fluoranthene 0.19Fluoranthene 0.14Phenanthrene 0.06____________________________________________________

Bogan et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62: 2381-2386Bogan et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62: 2381-2386

Oxidation of aromatic compounds by MnLiP atOxidation of aromatic compounds by MnLiP at

pH 4.0 in the absence of Mn(II).pH 4.0 in the absence of Mn(II).

PAHPAHIonizationIonizationpotentialpotential

(eV)(eV) aa

SpecificSpecificactivityactivity(min(min -1-1))

9-Methylanthracene9-Methylanthracene 7.257.25 52 (52 ( ±± 2.7)2.7) b b1-Methylanthracene1-Methylanthracene NANA cc 22.422.4 ±± (1.7)(1.7)2-Methylanthracene2-Methylanthracene 7.377.37 12.4 (12.4 ( ±± 1.1)1.1)AnthraceneAnthracene 7.417.41 2.5 (2.5 ( ±± 0.01)0.01)Benzo(a)pyreneBenzo(a)pyrene 7.417.41 0.32 (0.32 ( ±± 0.04)0.04)PyrenePyrene 7.427.42 0.008 (0.008 ( ±± 0.01)0.01)Benzo(e)pyreneBenzo(e)pyrene 7.437.43 NRNR ddChryseneChrysene 7.607.60 NRNRCarbazolCarbazol 7.687.68 2.4 (2.4 ( ±± 0.05)0.05)1-Methylphenanthrene1-Methylphenanthrene 7.707.70 NRNRAcenaphtheneAcenaphthene 7.767.76 NRNRPhenanthrenePhenanthrene 7.917.91 NRNRDibenzothiopheneDibenzothiophene 7.937.93 NRNRFluorantheneFluoranthene 7.957.95 NRNRNaphthaleneNaphthalene 8.158.15 NRNR

Kinetic constants of purified cytochrome P448 from Saccharomyces cerevisiea for oxidation of

benzo(a)pyrene._____________________________________________

System kcat (min-1) KM (µM) _____________________________________________

Reconstituted with NADPH 0.017 33Cumene hydroperoxide 0.022 125Hydrogen peroxide in situ 0.034 200

_____________________________________________

Kinetic constants of purified cytochrome P448 from Saccharomyces cerevisiea for oxidation of

benzo(a)pyrene._____________________________________________

System kcat (min-1) KM (µM) _____________________________________________

Reconstituted with NADPH 0.017 33Cumene hydroperoxide 0.022 125Hydrogen peroxide in situ 0.034 200

_____________________________________________

King et al. (1984) Xenobiotica 14: 187-206Azari and Wiseman (1982) Enzyme Microb. Technol. 4: 401-404

Specific activity of yeast cytochrome c on aromatic compounds. _____________________________________________________

Aromatic Specific activitycompound Product (min-1)_____________________________________________________

Dibenzothiophene Dibenzothiophene sulfoxide 3.2 (±0.1)Anthracene 9,10-Anthraquinone 2.1 (±0.1)Pyrene 1,8-Pyrenodione 1.3 (±0.3)Benzothiophene Benzothiophene sulfoxide 1.0 (±0.2)Carbazole Unknown 0.9 (±0.1)Acenaphthene NRChrysene NRFluoranthrene NRFluorene NRPhenanthrene NRTriphenylene NR_____________________________________________________

NR, no reaction detected.

Specific activity of yeast cytochrome c on aromatic compounds. _____________________________________________________

Aromatic Specific activitycompound Product (min-1)_____________________________________________________

Dibenzothiophene Dibenzothiophene sulfoxide 3.2 (±0.1)Anthracene 9,10-Anthraquinone 2.1 (±0.1)Pyrene 1,8-Pyrenodione 1.3 (±0.3)Benzothiophene Benzothiophene sulfoxide 1.0 (±0.2)Carbazole Unknown 0.9 (±0.1)Acenaphthene NRChrysene NRFluoranthrene NRFluorene NRPhenanthrene NRTriphenylene NR_____________________________________________________

NR, no reaction detected.

Torres et al. (1995) Enzyme Microb. Technol. 17: 1014-1020Torres et al. (1995) Enzyme Microb. Technol. 17: 1014-1020

Biocatalytic oxidation of aromatic compounds by hemoglobin and hydrogen peroxide.

___________________________________________________ Reacted

Compound substrate (%) Product___________________________________________________

9-Hexylanthracene 100 9,10-AnthraquinoneAnthracene 91 (± 4) 9,10-AnthraquinoneCarbazole 84 (±28) UnknownPyrene 85 (±10) 1,8-PyrenodioneDibenzothiophene 74 (± 1) Dibenzothiophene

sulfoxideFluorene 49 (±30) 9-FluorenoneAcenaphthene NRChrysene NRDibenzofuran NRFluoranthene NRPhenanthrene NR___________________________________________________

Biocatalytic oxidation of aromatic compounds by hemoglobin and hydrogen peroxide.

___________________________________________________ Reacted

Compound substrate (%) Product___________________________________________________

9-Hexylanthracene 100 9,10-AnthraquinoneAnthracene 91 (± 4) 9,10-AnthraquinoneCarbazole 84 (±28) UnknownPyrene 85 (±10) 1,8-PyrenodioneDibenzothiophene 74 (± 1) Dibenzothiophene

sulfoxideFluorene 49 (±30) 9-FluorenoneAcenaphthene NRChrysene NRDibenzofuran NRFluoranthene NRPhenanthrene NR___________________________________________________

Ortiz-Leon et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Comm. 215: 968-973Ortiz-Leon et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Comm. 215: 968-973

Benzo(a)pirenodiona

282.1

254.1

226.1

224.1113.1

0

20

40

60

80

100

120

20 67 108 152 193 233 274

m/z

Abu

ndan

cia

rela

tiva O

O

1,8-Pirenodiona

88.1

150.1

176.1

204.1

232.1

0

20

40

60

80

100

120

26 63 94 125 155 183 213 245 284

m/z

Ab

un

dan

cia

rela

tiva

O O

O

O

OO

O

O

Lignino peroxidasaManganeso peroxidasaHemoglobinaCitocromo c

Lignino peroxidasaManganeso peroxidasaHemoglobinaCitocromo c

H2O2H2O2

Oxidación biocatalítica de hidrocarburos aromáticos policiclicos

por hemoproteínas

Oxidación biocatalítica de hidrocarburos aromáticos policiclicos

por hemoproteínas

Minimum mutagenic concentration of polycyclic aromatic hydrocarbons and their respective quinones.

Compound MMC (ng/ml)

Cyclopenta(cd)pyrene 1.8Cyclopenta(cd)pyrenedione 2600

Phenanthrene -Phenanthrenedione -

Benzo(a)anthracene 570Benzo(a)anthraquinone -

Chrysene 750Chrysene quinone -

Benzo(a)pyrene 141,6- Benzo(a)pyrenedione -3,6- Benzo(a)pyrenedione -4,5- Benzo(a)pyrenedione -

Minimum mutagenic concentration of polycyclic aromatic hydrocarbons and their respective quinones.

Compound MMC (ng/ml)

Cyclopenta(cd)pyrene 1.8Cyclopenta(cd)pyrenedione 2600

Phenanthrene -Phenanthrenedione -

Benzo(a)anthracene 570Benzo(a)anthraquinone -

Chrysene 750Chrysene quinone -

Benzo(a)pyrene 141,6- Benzo(a)pyrenedione -3,6- Benzo(a)pyrenedione -4,5- Benzo(a)pyrenedione -

Durant et al. 1996 Mutation Res. 371:123-157Durant et al. 1996 Mutation Res. 371:123-157

Horse heart cytochrome c

Modificación química

Herraminta para mejorar el rango de sustratos y la termoestabilidad

Modificación química

Herraminta para mejorar el rango de sustratos y la termoestabilidad

PEG

PEGPEG

PEG

PEG

PEG

PEG PEG

PEGPEG

Specific activity on polycyclic aromatic hydrocarbon oxidation with modified and unmodified cytochrome c.

__________________________________________________________________________

Specific activity (min-1) ___________________________________________________________

Aromaticcompound Cyt Cyt-Met PEG-Cyt PEG-Cyt-Met Cyt-TMS PEG-Cyt-TMS__________________________________________________________________________

Pyrene 0.51 0.26 2.78 0.97 0.69 1.21Anthrecene 0.33 0.35 6.62 3.09 0.72 4.47Benzo(a)pyrene 0.22 0.09 5.15 0.39 1.40 0.26Fluoranthene NR NR ND 0.65 ND 1.16Fluorene NR NR NR 0.22 NR NRPhenanthrene NR NR NR 0.17 NR NR__________________________________________________________________________

ND. Not determinedNR. No reaction detected

Tinoco and Vazquez-Duhalt (1998) Enzyme Microb. Technol. 22: 8-12

Oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbon by unmodified- and methylated poly(ethylene)glycol-modified-cytochrome c.

_______________________________________________________________

Specific activity (min-1) ________________________________________

Aromatic compound Unmodified PEG-Cyt-Met_______________________________________________________________

7,12-Dimethylbenzanthracene 24.59 (±1.52) 80.33 (±3.83)1,2:3,4-Dibenzanthracene NR 16.60 (±2.24)Azulene 2.26 (±0.29) 14.32 (±0.57)3-Methylcholanthrene 1.88 (±0.07) 10.96 (±0.54)7-Methylbenzo(a)pyrene NR 7.56 (±0.42)1,2:5,6-Dibenzanthracene NR 5.70 (±0.31)Triphenylene NR 5.27 (±1.05)Dibenzothiophene 0.67 (±0.06) 4.73 (±0.05)Anthracene 0.33 (±0.06) 3.09 (±0.32)Thianthrene 0.49 (±0.06) 1.41 (±0.08)Pyrene 0.51 (±0.05) 0.97 (±0.03)Fluoranthene NR 0.65 (±0.09)Acenaphthene NR 0.40 (±0.01)Benzo(a)pyrene 0.22 (±0.02) 0.39 (±0.06)Fluorene NR 0.22 (±0.01)Phenanthrene NR 0.17 (±0.02)Chrysene NR NR9,10-Dimethylanthracene NR NRNaphthalene NR NRBiphenyl NR NR_______________________________________________________________

NR. No reaction detected

Oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbon by unmodified- and methylated poly(ethylene)glycol-modified-cytochrome c.

_______________________________________________________________

Specific activity (min-1) ________________________________________

Aromatic compound Unmodified PEG-Cyt-Met_______________________________________________________________

7,12-Dimethylbenzanthracene 24.59 (±1.52) 80.33 (±3.83)1,2:3,4-Dibenzanthracene NR 16.60 (±2.24)Azulene 2.26 (±0.29) 14.32 (±0.57)3-Methylcholanthrene 1.88 (±0.07) 10.96 (±0.54)7-Methylbenzo(a)pyrene NR 7.56 (±0.42)1,2:5,6-Dibenzanthracene NR 5.70 (±0.31)Triphenylene NR 5.27 (±1.05)Dibenzothiophene 0.67 (±0.06) 4.73 (±0.05)Anthracene 0.33 (±0.06) 3.09 (±0.32)Thianthrene 0.49 (±0.06) 1.41 (±0.08)Pyrene 0.51 (±0.05) 0.97 (±0.03)Fluoranthene NR 0.65 (±0.09)Acenaphthene NR 0.40 (±0.01)Benzo(a)pyrene 0.22 (±0.02) 0.39 (±0.06)Fluorene NR 0.22 (±0.01)Phenanthrene NR 0.17 (±0.02)Chrysene NR NR9,10-Dimethylanthracene NR NRNaphthalene NR NRBiphenyl NR NR_______________________________________________________________

NR. No reaction detected

Tinoco and Vazquez-Duhalt (1998) Enzyme Microb. Technol. 22: 8-12

Native Cyt

PEG-Cyt-Met

Low spin spectrum(g = 3.05, 2.25, 1.25)Low spin spectrum(g = 3.05, 2.25, 1.25)

High spin species(g = 6.06, 2.00)

and low spin heme(g = 4.3)

High spin species(g = 6.06, 2.00)

and low spin heme(g = 4.3)

PEG-Cyt-Met

Cyt c

Methionine ligand is replaced by waterMethionine ligand is replaced by water

Busi et al. (2000) J. Mol. Cat. B: Enzymatic 9: 39-48

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7

Time (h)

Re

sid

ual

act

ivity

(%

) cyt-peg w/subst.

cyt-peg wo/subst.

cyt-wt w/subst.

cyt-wt wo/subst.

Thermal stability of horse heart cytochrome at 80ºCThermal stability of horse heart cytochrome at 80ºC

cyt-wt

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

200 250 300 350 400 450 500 550 600

Longitud de onda (nm)

Ab

sorb

anci

a

30°C, t=0

80°C, t=0

80°C, 7 hr

80°C, t=7hr, - 30°C

cyt-peg

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

200 250 300 350 400 450 500 550 600

Longitud de onda (nm)

Ab

sorb

anci

a

30°C,t=0

80°C,t=0

80°C,t=7 hr

80°C,t=7 hr -30°C

Active site thermostability of cytochrome cActive site thermostability of cytochrome c

Abs

orba

nce

Abs

orba

nce

Wavelength (nm)

Gracia-Arellano et al. 2002 Bioconjugate Chem. (In press)

Circular dichroism of unmodified and modified cytochrome c during incubation at 80ºC

Circular dichroism of unmodified and modified cytochrome c during incubation at 80ºC

-1.5E+04

-1.0E+04

-5.0E+03

0.0E+00

5.0E+03

1.0E+04

1.5E+04

2.0E+04

190 200 210 220 230 240 250 260

Longitud de onda (nm)

MR

W ((g

ra

do

s*c

m2 )

/dm

ol)

30ºC

80ºC

80ºC 7h

80ºC 24h

30ºC (80ºC 24h)

-1.5E+04

-1.0E+04

-5.0E+03

0.0E+00

5.0E+03

1.0E+04

1.5E+04

2.0E+04

190 200 210 220 230 240 250 260

Longitud de onda (nm)

MR

W ((g

ra

do

s*c

m2 )

/dm

ol)

30ºC

80ºC

80ºC 7h

80ºC 24h

30ºC (80ºC 24h)

Cyt-WtCyt-Wt Cyt-Peg(5000)Cyt-Peg(5000)

Gracia-Arellano et al. 2002 Bioconjugate Chem. (In press)

Plaguicidas, un problema ambientalPlaguicidas, un problema ambiental

2.5 millones de toneladas usadas anualmente en 19905 millones de intoxicados anuales45,000 muertes anualmente1% de los fallecimientos en los países desarrollados (80% del consumo)20% de los intoxicados mueren en los países subdesarrollados

Terbufos

Phosmet Azinphos methyl

ParathionDEF

N

NN

OC

NC

O

O

P

SCH3O

CH3O

CH2P

SCH3O

CH3O

S CH2

P

SCH3CH2O

CH3CH2OS CH2 S C(CH3)3

OP

SCH3O

CH3O

NO2P

S

S

OS

P

SCH3O

CH3OS C

COOCH2CH3

H

COOCH2CH3

Malathion

Plaguicidas organofosforadosPlaguicidas organofosforados

Fungi Metabolism (%)

B. adusta 4312 49.0 ± 4.2

B. adusta 7308 49.0 ± 5.5

B. adusta 8258 78.3 ± 3.6

G. applanatum 8168 ND

P. ostreatus 7964 44.5 ± 4.1

P. ostreatus 7980 44.5 ± 4.7

P. ostreatus 798 18.4 ± 4.0

P. ostreatus 7989 96.9 ± 2.9

P. ostreatus 7972 32.3 ± 3.1

P. ostreatus 7992 26.0 ± 2.5

P. ostreatus IE8 48.5 ± 2.3

P .chrysosporium FC-322 10.5 ± 3.0

P .chrysosporium 3641 55.0 ± 2.1

P. chrysosporium 3642 28.6 ± 2.5

P. chrysosporium ATCC 24725 30.0 ± 2.0

S. pulverulentem 4521 7.7 ± 3.2

C. gallica 8260 28.5 ± 2.5

Parathion degradation by 18 strains of white rot

fungi after 96 hrs culture Parathion degradation by 18 strains of white rot

fungi after 96 hrs culture

Specific depletion rates of five organophosphorus pesticides by three ligninolytic fungi strains

Specific depletion rates of five organophosphorus pesticides by three ligninolytic fungi strains

Depletion rate (mmol g dry wt-1 hr-1)

Fungi Parathion Azinphos-methyl Phosmet Terbufos Tribufos

B. adusta 8258 217 ± 10 223 ± 8 220 ± 2 23 ± 9 84 ±8

P. ostreatus 7989 169 ± 4 106 ± 6 103 ± 4 59 ± 5 25 ± 2

P. chrysosporium 3641 145 ± 6 203 ± 8 45 ± 3 17 ± 7 25 ± 2

Specific activity (mol min-1mg protein-1)

Fungi Enzyme Ligninolytic Non ligninolytic Medium a Medium b

B. adusta 8258 Laccase 7 Nd

Mn-peroxidase 35 12 Lignin peroxidase 112 23

P. ostreatus 7989 Laccase 250 6

Mn-peroxidase 100 Nd Lignin peroxidase Nd Nd

P. chrysosporium 3641 Laccase Nd Nd

Mn-peroxidase 30 3 Lignin peroxidase 4 Nd

Activities of ligninolytic enzyme in the extracellular concentratefrom liquid cultures of three different white rot fungi.

Activities of ligninolytic enzyme in the extracellular concentratefrom liquid cultures of three different white rot fungi.

Nd. Not detected

Phosmet

Product

Product

Product

Microsomal oxidation of Phosmet by succesive additions od NADPH

Microsomal oxidation of Phosmet by succesive additions od NADPH

Organophosphorus pesticide transformation with microsmal

perparation from Pleurotus ostreatus

Organophosphorus pesticide transformation with microsmal

perparation from Pleurotus ostreatus

Pesticide Specific rate (mmol mg prot-1 hr-1)

Phosmet 10.0 ± 2

Azinphos-methyl 2.2 ± 0.7

Terbufos 5.7 ± 0.95

Pesticide Specific rate (mmol mg prot-1 hr-1)

Phosmet 10.0 ± 2

Azinphos-methyl 2.2 ± 0.7

Terbufos 5.7 ± 0.95

0

20

40

60

80

100

0 0,1 1 5

Inhibitor concentration (mM)

Spe

cific

met

abol

ism

rat

e (µ

mol

/g d

ry w

t/h)

Miconazole

1-aminobenzotreazole

Metyrapone

Effect of cytochrome P450 inhibitors on the degradation of phosmet pesticide by microsomal fraction from P.

ostreatus 7989.

Effect of cytochrome P450 inhibitors on the degradation of phosmet pesticide by microsomal fraction from P.

ostreatus 7989.

3-M ethy len-4-ke tobenzotriazine

P

CH3O

CH3O

S

S

CH2 N

O

NN

P

CH3O

CH3O

S

O

CH2 N

O

NN

PCH3O

CH3O

S

S

CH2

N

O

NN

CH2

+

+

P

CH3O

CH3O

S

S

CH2 NC

O

C

O

P

S

S

CH3CH2O

CH3CH2O

CH2 S C(CH3)3

P

CH3O

CH3O

O

CH

OH

C Cl

Cl

Cl

NC

O

C

O

H

P

CH3O

CH3O

S

S C

COOCH2CH3

H

C

O

OH

+ PCH3O

CH3O

S

S

CH2

P

SCH3CH2O

CH3CH2O

SH + S C(CH3)3CH3

P

CH3O

CH3O

O

C

O

C

Cl

Cl

H

P hosm et

M ala th ion

T erbufos

T rich lorfon

N

O

NN

H

4-K etobenzotriazine

Az inphos-m e thyl oxon O ,O ,S - T rim ethyl d ithiophosphate

P htha lim ide

2,2-D ich loro-1-ke tone e thyl,

phosphoric ac id d im ethyl ester

B u tanedioic ac id ,

[(d im ethoxyphosphinoth ioyl)]-4-e thy l ester

O ,O ,S - Trim ethy l dithiophosphate

3,3-D im ethy l-2-th iabutaneD iethy l phosphorod ith io ic ac id

H

COOCH2CH3

COOCH2CH3

CS

S

CH3O

CH3O

P

A zinphos-m ethy l

Productos de la degradación enzimática de plaguicidas organofosforados con

citocromo P450 de Bjerkandera adusta

Productos de la degradación enzimática de plaguicidas organofosforados con

citocromo P450 de Bjerkandera adusta

Impacto Ambiental de los colorantes IndustrialesImpacto Ambiental de los colorantes Industriales

700,000 Toneladas por año son producidas en todo el mundo (Zollinger, 1987)

125 Toneladas por día son dispersadas en el ambiente por medio de las aguas residuales (Vaidya et al. 1982)

Los cuerpos de agua receptores se colorean aún con bajas concentraciones de colorante (Pagga et al. 1986)

Suelos y vegetación, incluyendo zonas agrícolas son afectados (Nelson et al., 1980)

700,000 Toneladas por año son producidas en todo el mundo (Zollinger, 1987)

125 Toneladas por día son dispersadas en el ambiente por medio de las aguas residuales (Vaidya et al. 1982)

Los cuerpos de agua receptores se colorean aún con bajas concentraciones de colorante (Pagga et al. 1986)

Suelos y vegetación, incluyendo zonas agrícolas son afectados (Nelson et al., 1980)

Clasificación de los colorantes.Clasificación de los colorantes.

NH 4

+

N

HN NH

NO

O

O

O -

O O

N

H H

Murexida. Polimetino del grupo de oxonoles.

HOOC

COOCH 3

Bixin. Derivado de - caroteno.

N

N

CN

O2NO C H3

NHCOCH3

N (C2H 5) 2

CN

Compuestos azo.Compuestos azo.

Polimetinos y polienos.Polimetinos y polienos.

Di- y triarilmetanos.Di- y triarilmetanos.+

N N (CH )

C

(H C )3 2 3 2

Verde de malaquita (C. I. Verde básico 4)

+

2( H 3C )2

N N (C H 3 )

C

N H2

Auramina O (C. I. Amarillo básico 2)

Heterocíclicos nitrados y azufrados.Heterocíclicos nitrados y azufrados.

NH NH NO 2

O2N

H O 2 S

Amarillo Amido E (C. I. Anaranjado ácido 3)

H O3SS

H 3CO N

N

NH O

CH 3

C6H 5

N

Anaranjado Brillante Dicolita 3G (C. I. Anaranjado azufre condensado 2)

Anulenos.Anulenos.

N N

NN

M

M = Zn , Cu , Fe

Estructura general de un tetra aza anuleno.

M = Z n, C u, Fe

N N

NN

N

N

N NM

Estructura general de un octa aza anuleno.

Antraquinonas.Antraquinonas.O

N

N

O

O

O

H

H

Primer colorante “a la cuba” basado en antraquinona

Indantrona.

N

H

O

N

H

O

Colorante natural.

Indigo.

C. gallica P. chrysosporium P. ostratus T. versicolor

C. gallica P. chrysosporium P. ostratus T. versicolor

t = 0

t = 1 semana

Metabolic de Metabolic decolorizationcolorization Enzymatic decolorization Enzymatic decolorization

DyeDyeP. chrysosporiumP. chrysosporium P. ostreatusP. ostreatus P. ostreatusP. ostreatus T. hispidaT. hispida

(ATCC-24725) (ATCC-24725) (IE8) (IE8) (IE8) (IE8) (8260) (8260)

BASFBASFAcid black 194Acid black 194 ++ ++ ++ ++Acid blue 185Acid blue 185 -- ++ ++ ++Direct black 22Direct black 22 NANA NANA -- ++Disperse blue 56Disperse blue 56 ++ ++ -- ++Disperse blue 79Disperse blue 79 NANA NANA -- ++Disperse orange 30Disperse orange 30 -- -- -- --Disperse yellow 54Disperse yellow 54 -- ++ -- --Disperse red 161Disperse red 161 -- -- -- --Reactive blue 19Reactive blue 19 -- ++ -- ++Reactive blue 198Reactive blue 198 -- ++ ++ ++Reactive red 141Reactive red 141 -- -- -- --Reactive red 180Reactive red 180 -- -- -- --Reactive yellow 84Reactive yellow 84 -- -- -- --Sulfur black 1Sulfur black 1 ++ ++ -- ++Vat blue 6Vat blue 6 ++ ++ -- --Vat red 10Vat red 10 -- ++ -- --Vat yellow 46Vat yellow 46 -- ++ -- --

COLORFANCOLORFANOrisol black 2VOrisol black 2V NANAaa NANA -- ++Orisol blue BHOrisol blue BH ++ ++ ++ ++Orisol orange SOrisol orange S -- -- -- --Orisol scarlet 4BSOrisol scarlet 4BS -- -- -- --Orisol turquoise JLOrisol turquoise JL -- ++ ++ ++Orisol yellow 4JLZOrisol yellow 4JLZ -- -- -- --

aa Not assayed Not assayed

Reyes et al. 1999 Current Microbiol. 38: 27-32Reyes et al. 1999 Current Microbiol. 38: 27-32

Dye decolorization in vivo by fungal cultures on agar medium and in vitro by crude extracts from fungal cultures grown on oat grains

Dye decolorization in vivo by fungal cultures on agar medium and in vitro by crude extracts from fungal cultures grown on oat grains

Enzymatic activities of crude extracts from solid cultures of different fungi grown on oat grains.

__________________________________________________________________________

Volumetric activity (U/l) a

__________________________________________________________________

Strains Laccase Mn-peroxidase VAO __________________________________________________________________________

B. adusta (4312) b nd c nd 54 - 160B. adusta (7308) 5 - 7 66 - 70 ndB. adusta (8258) 6 - 18 126 - 22 ndP.ostreatus (7964) 83 - 181 59 - 75 ndP.ostreatus (7972) 151 - 223 21 - 81 ndP.ostreatus (7980) 109 - 421 47 - 61 24 - 97P.ostreatus (7988) 235 - 588 77 - 157 ndP.ostreatus (7989) 287 - 427 97 - 108 41 - 42P. ostreatus (7992) 134 - 215 78 - 253 ndP. ostreatus (IE8) 403 - 1272 49 - 67 ndP. chrysosporium (3541) nd nd ndP. chrysosporium (3642) nd nd ndP. chrysosporium (ATCC-24725) nd nd ndS. pulverulentem (4521) nd nd ndT. hispida (8260) 1184 - 1766 78 - 99 ndT. versicolor (8272) 86 - 1042 39 - 96 nd_________________________________________________________________________

Enzymatic activities of crude extracts from solid cultures of different fungi grown on oat grains.

__________________________________________________________________________

Volumetric activity (U/l) a

__________________________________________________________________

Strains Laccase Mn-peroxidase VAO __________________________________________________________________________

B. adusta (4312) b nd c nd 54 - 160B. adusta (7308) 5 - 7 66 - 70 ndB. adusta (8258) 6 - 18 126 - 22 ndP.ostreatus (7964) 83 - 181 59 - 75 ndP.ostreatus (7972) 151 - 223 21 - 81 ndP.ostreatus (7980) 109 - 421 47 - 61 24 - 97P.ostreatus (7988) 235 - 588 77 - 157 ndP.ostreatus (7989) 287 - 427 97 - 108 41 - 42P. ostreatus (7992) 134 - 215 78 - 253 ndP. ostreatus (IE8) 403 - 1272 49 - 67 ndP. chrysosporium (3541) nd nd ndP. chrysosporium (3642) nd nd ndP. chrysosporium (ATCC-24725) nd nd ndS. pulverulentem (4521) nd nd ndT. hispida (8260) 1184 - 1766 78 - 99 ndT. versicolor (8272) 86 - 1042 39 - 96 nd_________________________________________________________________________

Reyes et al. 1999 Current Microbiol. 38: 27-32

Dye decolorization by crude extracts from solid cultures of differents fungi grown on oat grains._________________________________________________________________________________________

Decolorization activitya (A min-1 l-1)_____________________________________________________________

Strains Reactive Acid Acid Orisol Orisol blue 198 blue 185 black 194 blue turquoise

________________________________________________________________________________________

B. adusta (4312)b ndc nd nd nd ndB. adusta (7308) 940 - 1800 520 - 667 nd nd 133 - 180B. adusta (8258) nd nd nd nd ndP. ostreatus (7964) 1300 - 2220 440 - 580 nd nd 560 - 1040P. ostreatus (7972) 1040 - 3320 140 - 460 0 - 160 0 -180 400 - 480P. ostreatus (7980) 8080 - 8420 1440 0 - 100 0 - 400 2040 - 3000P. ostreatus (7988) 4180 -10160 1580 - 3500 0 - 360 180 - 600 1800 - 6060P. ostreatus (7989) 3860 - 6660 880 - 1960 0 - 460 160 - 320 1060 - 2580P. ostreatus (7992) 1580 - 1820 60 - 600 0 - 40 0 - 260 0 - 780P. ostreatus (IE8) 1060 - 9500 1160 - 2500 130 - 500 650 - 900 1200 - 2300P. chrysosporium (3541) nd nd nd nd ndP. chrysosporium (3642) nd nd nd nd ndP. chrysosporium (ATCC-24725) nd nd nd nd ndS. pulverulentem (452 nd nd nd nd ndT. hispida (8260) 14020 - 21700 2640 - 12840 420 - 740 240 - 780 2840 - 3720T. versicolor (8272) 3480 - 14540 400 - 1220 0 - 840 360 - 840 480 - 900_________________________________________________________________________________________

Dye decolorization by crude extracts from solid cultures of differents fungi grown on oat grains._________________________________________________________________________________________

Decolorization activitya (A min-1 l-1)_____________________________________________________________

Strains Reactive Acid Acid Orisol Orisol blue 198 blue 185 black 194 blue turquoise

________________________________________________________________________________________

B. adusta (4312)b ndc nd nd nd ndB. adusta (7308) 940 - 1800 520 - 667 nd nd 133 - 180B. adusta (8258) nd nd nd nd ndP. ostreatus (7964) 1300 - 2220 440 - 580 nd nd 560 - 1040P. ostreatus (7972) 1040 - 3320 140 - 460 0 - 160 0 -180 400 - 480P. ostreatus (7980) 8080 - 8420 1440 0 - 100 0 - 400 2040 - 3000P. ostreatus (7988) 4180 -10160 1580 - 3500 0 - 360 180 - 600 1800 - 6060P. ostreatus (7989) 3860 - 6660 880 - 1960 0 - 460 160 - 320 1060 - 2580P. ostreatus (7992) 1580 - 1820 60 - 600 0 - 40 0 - 260 0 - 780P. ostreatus (IE8) 1060 - 9500 1160 - 2500 130 - 500 650 - 900 1200 - 2300P. chrysosporium (3541) nd nd nd nd ndP. chrysosporium (3642) nd nd nd nd ndP. chrysosporium (ATCC-24725) nd nd nd nd ndS. pulverulentem (452 nd nd nd nd ndT. hispida (8260) 14020 - 21700 2640 - 12840 420 - 740 240 - 780 2840 - 3720T. versicolor (8272) 3480 - 14540 400 - 1220 0 - 840 360 - 840 480 - 900_________________________________________________________________________________________

Reyes et al. 1999 Current Microbiol. 38: 27-32

0

40

80

120

160

200

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Actividad laccasa (U/mg)

A

min

-1 mg-1

)

Actividad decolorativa Azul E-3R vs. actividad laccasa.Actividad decolorativa Azul E-3R vs. actividad laccasa.

Laccase I and laccase II separation from a strong anion exchanger column

Laccase I and laccase II separation from a strong anion exchanger column

Purificación laccasa de T. hispida (SDS-PAGE 10%).

E. 2a. cromatografía en DEAE-celulosa.

C. 1a. cromatografía de DEAE-celulosa.

D. Permeación en gel. Sephadex G-100.

A. Extracto crudo.

B. Extracto crudo concentrado.

F. Marcadores de peso molecular.

A B C D E F

Laccasa

116 00097 00084 00068 00055 000

45 000

36 000

29 000

24 000

20 000

PM (Da)

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

350 400 450 500 550 600 650 700 750 800

(nm)

Ab

sorb

an

ce

0 min

2 min

4 min

Decolorization of Reactive blue 198 by purified laccase from C. gallica

Decolorization of Reactive blue 198 by purified laccase from C. gallica

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

350 450 550 650 750

(nm)

Ab

sorb

an

ce

Without laccaseUnder N2

Air

Decolorization of Reactive blue 198 by laccase in the presence and in tha absence of oxygen

Decolorization of Reactive blue 198 by laccase in the presence and in tha absence of oxygen

(nm)

Ab

sorb

an

cia

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

350 450 550 650 750

0 min

5 min

Decoloración del azul recativo 19 con lacasa de C. gallica

Decoloración del azul recativo 19 con lacasa de C. gallica

0

20

40

60

80

100

0 200 400 600 800 1000

Tiempo (min)

Lacasa

control

% c

olo

r

Decoloración del azul reactivo 198 en una columna con lacasa

inmovilizada

Decoloración del azul reactivo 198 en una columna con lacasa

inmovilizada

Reyes et al. 1999 Biotechnol. Lett. 21: 875-880

0

20

40

60

80

100

120

0 200 400 600 800 1000 1200

Time (min)

Laccase

Control

% c

olo

r

Reyes et al. 1999 Biotechnol. Lett. 21: 875-880

Decolorization of a real industrial effluent by immobilized laccase

Decolorization of a real industrial effluent by immobilized laccase

N

S

N

CH2CH3

HO3S S

N

N

CH2CH3

SO3H

N

N

N

OH

ABTS HBT

O2

H2O

Laccase (Cu+)

Laccase (Cu++)

Mediator(Ox)

Mediator(Red)

Substrate

Product

Free Radical MediatorsFree Radical Mediators

Bourbonnais and Paice (1992) Appl. Environ. Biotechnol. 36: 823-827

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10

1 mM HBT

1 mM ABTS

1 mM ABTS + 1 mM HBT

Pickard et al. (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65: 3805-3809

Anthracene oxidation by purified laccase

from Coriolopsis gallica

Anthracene oxidation by purified laccase

from Coriolopsis gallica

Time (h)

Ant

hrac

ene

(% r

emai

ning

)

“Hasta hoy, el hombre se ha enfrentado con la naturaleza;

a partir de ahora lo hará contra su propia naturaleza”.

“Hasta hoy, el hombre se ha enfrentado con la naturaleza;

a partir de ahora lo hará contra su propia naturaleza”.

Dennis Gabor, fisico húngaro (1900-1979)

Premio Nobel 1971 por su investigación y desarrollo de la holografía.

Dennis Gabor, fisico húngaro (1900-1979)

Premio Nobel 1971 por su investigación y desarrollo de la holografía.