Diseño de un Medio de Cultivo Económico y Alternativo para ...

Diseño de un Medio de Cultivo Económico y Alternativo para la Producción de una Sustancia Tipo Bacteriocina Inhibitoria de Listeria monocytogenes. Fase II, Ajuste

de las Fuentes de Carbono y de Micronutrientes

Pamela Beatriz Antimán Avendaño

Valdivia – Chile 2008

Memoria presentada como parte de los requisitos para optar al Título de Ingeniero en Alimentos.

PROFESOR PATROCINANTE:

----------------------------------------------------- Sra. Marcia Costa Lobo

Ingeniero Civil Bioquímico Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos

Facultad de Ciencias Agrarias

PROFESORES INFORMANTES:

----------------------------------------------------- Sra. Renate Schöbitz Twele

Tecnólogo Médico, MSc Instituto de Ciencia y Tecnología de los

AlimentosFacultad de Ciencias Agrarias

----------------------------------------------------- Sra. Maria Adela Martínez Sanguinetti

Bioquímico, Master en Nutrición y Dietética Instituto de Farmacia Facultad de Ciencias

Esta tesis fue financiada y forma parte del proyecto FONDEF D04i-1153 titulado “Desarrollo de biocontroladores de Listeria monocytogenes para su incorporación al proceso industrial del salmón”. De acuerdo a lo informado por el honorable consejo universitario sobre los derechos de propiedad intelectual, los resultados de esta tesis están encriptados para no interferir y alterar procesos de obtención de patentes y otros derechos.

AGRADECIMIENTOS

En primer lugar quiero agradecer a mi familia en especial a mi mamita por tantos años de sacrificio para que pudiera estudiar y ser una profesional como tu, en este momento la meta está cumplida gracias por tu apoyo y cariño cuando lo he necesitado, gracias mamita!!!. Papá se que desde la distancia me deseas lo mejor, a veces no es necesario decir todo el tiempo las cosas se que me quieres y apoyas. A mis hermanas mis amigas y compañeras incondicionales……. Los quiero.

A mis amigas y compañeras: jesu, kuchis, angie, karla y toñiwui, gracias por cada consejo recibido, por todos los buenos momentos vividos, los carretes, y buenos por los innumerables trasnoches para intentar sacar buenas notas en las pruebas, gracias por la sincera amistad.

Gracias a todas las personas que pusieron un granito de arena en este trabajo, a mi gran amigo pancho gracias por acompañarme cuando lo necesite, obviamente no esperaba menos de ti, eres una gran amigo!!

No puedo dejar de agradecer a mi segunda familia a constanza y Alejandra y bueno a la familia entera, gracias por quererme, ayudarme en todo lo que necesité y por hacerme sentir parte de su familia, gracias por todos los momentos compartidos, los quiero mucho y los llevaré siempre en mi corazón.

Andres, gracias por el apoyo y comprensión y confianza, gracias por estar en los momentos buenos y malos. Te quiero mucho.

Y finalmente mis sinceros agradecimientos a mi profesora patrocinante Sra. Marcia Costa, gracias por todo el apoyo brindado y por la confianza que depositó en mi para el desarrollo de este trabajo. Muchas gracias

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INDICE DE MATERIAS

Capítulo Página 1 INTRODUCCIÓN 1 2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 3 2.1 Bacterias ácido lácticas 3 2.2 Bacterias ácido lácticas del genero Carnobacterium 4 2.3 Bacteriocinas de las BAL 5 2.3.1 Clasificación de bacteriocinas de BAL 6 2.3.2 Aplicación de bacteriocinas de las BAL en alimentos 6 2.4 Listeria monocytogenes 7 2.5 Sistemas de cultivo de microorganismos 7 2.5.1 Cultivo batch 8 2.5.2 Cultivo por lote alimentado 9 2.5.3 Cultivo continuo 9 2.6 Nutrición microbiana 10 2.6.1 Macronutrientes 10 2.6.2 Micronutrientes 10 2.6.3 Factores de crecimiento 10 2.6.4 Medio de cultivo 11 3 MATERIAL Y MÉTODOS 12 3.1 Cepas bacterianas 12 3.1.1 Carnobacterium piscicola L103 12 3.1.2 Listeria monocytogenes 4/00 12 3.2 Medio de cultivo 12 3.3 Agua de levadura 13 3.3.1 Materia prima 13 3.3.2 Preparación de la solución de agua de levadura 13 3.3.3 Proporciones a reemplazar en el medio de cultivo D-MRS 13 3.4 Carbohidratos 13 3.4.1 Materias primas 13 3.4.2 Proporciones a reemplazar en el medio de cultivo D-MRS 14 3.5 Proteínas 14 3.5.1 Proporciones a reemplazar en el medio de cultivo D-MRS 14 3.5.2 Preparación del extracto proteico 15

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3.6 Producción de la sustancia tipo bacteriocina (STB) 16 3.7 Determinación de la actividad de la bacteriocina 16 3.7.1 Obtención del sobrenadante con STB 16 3.7.2 Prueba de la actividad de la bacteriocina 16 3.7.3 Interpretación de placas resultantes 18 3.7.4 Análisis estadístico 18 3.8 Formulación del medio de cultivo modificado 18

3.9 Aplicación del medio de cultivo modificado a nivel de minifermentador 18

3.9.1 Consumo de NaOH 19 3.9.2 Determinación de la actividad de la STB 19 3.9.3 Determinación del contenido proteico 19 3.9.4 Determinación de concentración de glucosa 19 3.9.5 Crecimiento de las BAL 20 4 PRESENTACION DE RESULTADOS 21 4.1 Agua de levadura 21 4.2 Carbohidratos 24 4.3 Proteínas 27

4.4 Aplicación del medio de cultivo modificado a nivel de minifermentador 29

4.4.1 Consumo de NaOH 31 4.4.2 Actividad de la STB 32 4.4.3 Contenido proteico de los extractos 33 4.4.4 Contenido proteico del medio D-MRS modificado 34 4.4.5 Consumo de fuente de carbono 35 4.4.6 Crecimiento de BAL 36

4.4.7 Comparación de costos de los ingredientes del medio de cultivo alternativo al D-MRS 38

5 DISCUSIÓN DE RESULTADOS 40 6 CONCLUSIÓN 42 7 RESUMEN-SUMMARY 43 8 BIBLIOGRAFÍA 45 9 ANEXOS 48

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INDICE DE CUADROS

Cuadro Página 1 Composición medio de cultivo, D-MRS, utilizado para C.

piscicola 12

2 Formulaciones probadas en reemplazo del extracto de levadura, en el medio de cultivo D-MRS

13

3 Formulaciones probadas en reemplazo de sacarosa, en el medio de cultivo D-MRS

14

4 Formulaciones probadas en reemplazo del extracto de carne y proteosa peptona, en el medio de cultivo D-MRS

15

5 Composición final del medio de cultivo alternativo al D-MRS 30 6 Precios ($/ kg) de cada componente del medio de cultivo D-

MRS 38

7 Costo de preparación de 1 L de medio de cultivo D-MRS 38 8 Costo de preparación de 1 L de medio de cultivo D-MRS

modificado 39

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INDICE DE FIGURAS

Figura Página 1 Curva de crecimiento de un cultivo bacteriano 8 2 Diagrama de propagación de la cepa láctica C. piscicola 16 3 Diagrama de preparación del césped con la cepa indicadora. 17 4 Diagrama de la técnica de la gota sobre césped 17

5 Diagrama de propagación de la cepa láctica C. piscicola a nivel de minifermentador 18

6 Apariencia de los medios de cultivo para las distintas formulaciones probadas para reemplazar el extracto de levadura del medio de cultivo testigo caldo D-MRS

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7 Actividad de STB en cada tiempo de muestreo para las formulaciones propuestas en el ensayo de agua de levadura 22

8 Actividad de STB correspondiente a las 12 horas, para las distintas formulaciones probadas en el ensayo de agua de levadura

23

9 pH en cada tiempo de muestreo para las formulaciones propuestas en el ensayo de agua de levadura y caldo D-MRS 23

10

Apariencia de los medios de cultivo para las distintas formulaciones probadas para melaza y combinación melaza-sacarosa en reemplazo de sacarosa y medio de cultivo testigo caldo D-MRS

25

11 Actividad de STB en cada tiempo de muestreo para las formulaciones propuestas en el ensayo de carbohidratos y caldo D-MRS

25

12 Actividad de STB correspondiente a las 6 y 12 horas, para la formula probada en el ensayo de carbohidratos 26

13 pH en cada tiempo de muestreo para las formulaciones propuestas en el ensayo de carbohidratos y caldo D-MRS 26

14

Apariencia de los medios de cultivo para las distintas formulaciones probadas para harina de lupino-harina de pescado en reemplazo de proteosa peptona-extracto de carne respectivamente

28

15 Actividad de STB en cada tiempo de muestreo para las formulaciones propuestas en el ensayo de proteínas y caldo D-MRS

28

16 pH en cada tiempo de muestreo para las formulaciones propuestas en el ensayo de proteínas y caldo D-MRS 29

17 Sistema de Fermentación y sus componentes 31

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18 Consumo de NaOH durante el crecimiento de C. piscicola 32

19 Actividad de STB en cada tiempo de muestreo para la formulación final del medio de cultivo alternativo y Consumo de NaOH durante el crecimiento de C. piscicola

33

20 Contenido de proteína soluble de los extractos usados en la formulación del medio de cultivo alternativo y extractos originales en el medio de cultivo caldo D-MRS

34

21 Contenido de proteína soluble en cada tiempo de muestreo para la formulación final del medio de cultivo alternativo y Consumo de NaOH durante el crecimiento de C. piscicola

35

22 Concentración de glucosa remanente en cada tiempo de muestreo y consumo de NaOH durante el crecimiento de C. piscicola.

36

23 Recuento en placa mediante el método en superficie y consumo de NaOH durante el crecimiento de C. piscicola 37

24 Recuento en placa mediante el método en superficie y Actividad de STB durante el crecimiento de C. piscicola 37

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INDICE DE ANEXOS

Anexo Página

1 Determinación de proteínas de acuerdo al método de LOWRY et al., (1951) 49

2 Curva de calibración para determinación proteica de acuerdo a método propuesto por LOWRY et al., (1951) 50

3 Esquema de recuento en placa de C. piscicola por el método en superficie 52

4 Resultados de actividad de STB y pH para ensayo de agua de levadura y análisis estadístico: “Dócima de Friedman” 53

5 Resultados de actividad de STB y pH para ensayo de carbohidratos y análisis estadístico: “Dócima de Friedman” 54

6 Resultados de actividad de STB y pH para ensayo de proteínas y análisis estadístico: “Dócima de Friedman” 55

7 Aplicación del medio de cultivo modificado a nivel de fermentador: Resultados del consumo de NaOH 56

8 Aplicación del medio de cultivo modificado a nivel de fermentador: Resultados de la Actividad de STB 57

9 Curva de calibración usada en el método de Lowry 58

10 Aplicación del medio de cultivo modificado a nivel de fermentador: Resultado del contenido proteico de los extractos 59

11 Aplicación del medio de cultivo modificado a nivel de fermentador: Resultado del contenido proteico del medio de cultivo D-MRS modificado

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12 Aplicación del medio de cultivo modificado a nivel de fermentador: Resultado de la concentración de glucosa 61

13 Aplicación del medio de cultivo modificado a nivel de fermentador: Resultado del crecimiento de BAL 62

14 Precio de elaboración de agua de levadura 63 15 Precio de elaboración de extracto de harina de lupino 64 16 Precio de elaboración de extracto de harina de pescado 65

1. INTRODUCCION Las bacterias ácido lácticas por su origen alimentario son consideradas como GRAS1 y por lo tanto son ideales para su uso como biopreservantes o biocontroladores microbianos. Este grupo de bacterias en la etapa de desarrollo liberan al medio bacteriocinas, que poseen propiedades antimicrobianas. Las bacteriocinas de bacterias ácido lácticas son potencialmente aplicables en alimentos, pero se ven limitadas por sus propiedades individuales.

Entre las bacteriocinas estudiadas, se encuentra la producida por la cepa láctica, Carnobacterium piscicola, cuya bacteriocina inhibe el crecimiento de Listeria monocytogenes, considerada como un patógeno peligroso.

Para la producción de la bacteriocina a nivel de laboratorio, se cultiva C.piscicola en caldo D-MRS (DE MAN-ROGOSA-SHARPE modificado), detectándose altos niveles de actividad de bacteriocina lo que es indicativo de producción de dicha sustancia.

Para proyectar la producción industrial resulta de suma importancia formular un medio de cultivo complejo alternativo a D-MRS.

1.1 Hipótesis Si la cepa Carnobaterium piscicola produce una sustancia tipo bacteriocina en el medio de cultivo D-MRS, entonces también producirá una sustancia tipo bacteriocina en el medio de cultivo alternativo generado por el reemplazo de las fuente de carbono y micronutrientes en la composición original del medio D-MRS.

1.2 Objetivos Objetivo general. Diseñar un medio de cultivo económico y alternativo para la producción de la sustancia tipo bacteriocina de C.piscicola L103 (cepa BAL B), inhibitoria de Listeria monocytogenes. Objetivos específicos. Para el estudio se plantearon los siguientes objetivos específicos:

• Formular y reemplazar la proporción adecuada de agua de levadura, por el extracto de levadura, componente del medio de cultivo caldo D-MRS.

• Seleccionar la fuente de carbono (melaza, o combinación de melaza-sacarosa), para formular y reemplazar la fuente de carbono habitual (sacarosa) del medio de cultivo caldo D-MRS.

1 GRAS: Generally recognized as safe

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• Formular y reemplazar nuevas concentraciones de las fuentes proteicas de origen animal (harina de pescado) y origen vegetal (harina de lupino) escogidas en una investigación anterior, en reemplazo del extracto de carne y proteosa peptona respectivamente, componentes del medio de cultivo caldo D-MRS.

• Comprobar, el crecimiento de la cepa BAL B y la producción de bacteriocina, mediante, un cultivo a nivel de un minifermentador, usando las diversas fórmulas del medio de cultivo alternativo.

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2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1 Bacterias ácido lácticas Las bacterias acido lácticas (BAL), corresponden a un grupo filogenéticamente diverso, Gram-positivas, no esporuladas, cocos o bacilos, que representan en su ADN un porcentaje de G+C menor del 55%, y fermentan los hidratos de carbono obteniéndose como único producto el ácido láctico para el caso de las homofermentativas. Las heterofermentativas tiene como productos el acetato, etanol, dióxido de carbono y mayoritariamente ácido láctico (CINTAS et al., 2001).

En la actualidad, este grupo de bacterias está compuesto por 12 géneros, los cuales son: Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Lactosphaera, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus y Weissella. Al ser eliminados los enterococos y lactococos del género Streptococcus, el representante más importante de este género de importancia en los alimentos es S. thermophilus. S. diacetilactis ha sido reclasificado como una cepa de Lactococcus lactis subesp. Lactis que utiliza el citrato (JAY, 2000).

Otra característica de este tipo de bacterias es que forman parte de la microbiota inicial de muchos alimentos, y no existe ninguna indicación de que representen un riesgo para la salud del consumidor y son reconocidas generalmente como seguras (GRAS) por la Food and Drug Administración de EEUU (ZAMORA, 2003).

Además de su función tecnológica, las BAL también mejoran la calidad y seguridad higiénica de los alimentos y productos alimenticios por inhibición de la flora en competencia, que incluye muchas bacterias patógenas. Los principales efectos conservantes de las BAL se deben a la producción de ácidos orgánicos, principalmente ácido láctico, lo que conlleva a una significativa disminución de pH, además de la producción de una serie de compuestos antimicrobianos, que incluyen peróxido de hidrógeno, CO2, diacetilo, acetaldehído, D-isómeros de aminoácidos y bacteriocinas (CINTAS et al., 2001).

Como se indicó anteriormente, las bacterias ácido lácticas se dividen en dos grupos basados en los productos finales del metabolismo de la glucosa. Las que producen ácido láctico como producto principal o único en la fermentación de la glucosa se denominan homofermentativas u homolácticas y son capaces de extraer aproximadamente el doble de energía de una cantidad dada de glucosa que la que extraen las heterofermentativas o heterolácticas. El comportamiento homofermentativo se observa cuando la glucosa es metabolizada, pero no necesariamente cuando son metabolizadas las pentosas; así mismo el carácter homofermentativo de las bacterias homolácticas puede resultar desviado en algunas cepas modificando condiciones de crecimiento tales como la concentración de glucosa, el pH, y la limitación de nutrientes. Aquellas bacterias lácticas que producen cantidades equimolares de

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lactato, dióxido de carbono, y etanol de las hexosas son denominadas heterofermentativas (JAY, 2000).

En cuanto a las necesidades de crecimiento de las BAL, este se ve condicionado por aminoácidos preformados, vitaminas del grupo B, y bases purínicas y pirimidínicas, de aquí su uso para pruebas microbiológicas para detectar estos compuestos. Aunque son mesófilas, algunas pueden crecer en temperaturas inferiores a 5ºC y a otras temperaturas tan altas como 45ºC; en cuanto al pH de crecimiento, unos son capaces de crecer a valores de pH tan bajos como 3,2, y a otros valores tan altos como 9,6, casi todas las bacterias crecen en el intervalo de 4,0-4,5. Las bacterias ácido lácticas son solo ligeramente proteolíticas y lipolíticas (JAY, 2000).

2.2 Bacterias ácido lácticas del género Carnobacterium El género Carnobacterium corresponde a bacilos Gram-positivos, catalasa-negativo, fue formado para encuadrar algunos microorganismos clasificados anteriormente como lactobacilos. Filogenéticamente estos microorganismos están más próximos a los enterococos y a los vagococos que a los lactobacilos. Son homofermentativos, y la mayoría crece a 10 y no a 45º C. Algunas especies producen gas de la glucosa, y el contenido de G+C en moles del género es 33,0-37,2%. Se diferencian de los lactobacilos por ser incapaces de crecer en medio de acetato y en su síntesis de ácido oleico (JAY, 2000).

Según LEISNER., et al (2007), este género contiene nueve especies, de las cuales solo C. divergens y C. maltaromaticum (anteriormente C. piscicola) frecuentemente son aisladas del medio ambiente y de los alimentos, estas nueve especies están mencionadas a continuación:

• C. alterfunditum

• C. divergens

• C. funditum

• C. gallinarum

• C. inhibens

• C. maltaromaticum

• C. mobile

• C. pleistocenium

• C. viridans

Según lo citado por AXELSSON (1998), especies del género Carnobacterium originalmente fueron clasificados como lactobacilos del grupo III, en virtud de las designaciones Lb. Divergens, Lb. Carnis, y Lb. Piscicola (KANDLER y WEISS, 1986; COLLINS et al., 1987). Más tarde, los estudios mostraron que estas bacterias fueron separadas de los lactobacilos y por ende se autoriza como género separado (COLLINS et al., 1987), y donde el metabolismo de la glucosa fue homofermentativa. En general, Carnobacterium crece a pH relativamente alto, mientras que los lactobacilos no (SCHILLINGER y HOLZAPFEL, 1995). Carnobacterium se caracterizan

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por encontrarse en la carne y los productos cárnicos, en donde pueden proliferar incluso a bajas temperaturas (COLLINS et al., 1987).

Según lo citado por SCHÖBITZ et al., (1999), la especie Carnobacterium piscicola produce diferentes carnobacteriocinas (NETTLES y BAREFOOT 1993, QUADRI et al. 1994). Estos han sido identificados como resistentes al calor, estable a lo largo de un amplio rango de pH y con un modo de acción bactericida.

2.3 Bacteriocinas de las BAL Bacteriocinas son sustancias proteicas (que hace que sean inactivadas por las enzimas proteolíticas del tracto gastrointestinal) con características antimicrobianas producidas por bacterias. Además, corresponden a un grupo heterogéneo característico, seleccionado para la evaluación y el uso como antagonistas específicos contra bacterias problemáticas; sin embargo, su eficacia en alimentos puede ser limitada por muchas razones; por lo tanto, no sólo continúa la búsqueda de nuevas y eficaces bacteriocinas, sino que también la optimización de las existentes para tratar preocupaciones biológicas y pérdidas económicas. Estas sustancias proteicas son eficaces contra los patógenos Gram-positivos (CHEN y HOOVER, 2003).

A diferencia de los antibióticos, las bacteriocinas inhiben solamente especies y cepas bacterianas Gram-positivas emparentadas cercanamente. Constan de proteínas de tamaño pequeño, y la mayoría están mediadas por plásmidios. Algunas especies y cepas de todos los géneros de las BAL poseen la capacidad de producir bacteriocinas o compuestos parecidos a las bacteriocinas. Aunque los primeros estudios se centraron en las bacterias lácticas asociadas con productos lácticos, han sido aisladas especies y cepas productoras en la carne y en productos no lácteos fermentados (JAY, 2000).

Las bacteriocinas son de síntesis ribosomal, construidas por péptidos y son activas contra bacterias estrechamente relacionadas. La aplicación de la producción de bacteriocinas de BAL en alimentos tiene un potencial uso como parte de la tecnología de obstáculo, ya que diversas bacteriocinas han demostrado sinergismo con otros tratamientos y podrían utilizarse como obstáculos para mejorar la seguridad alimentaria (SCHÖBITZ et al., 2006).

Algunas bacteriocinas producidas por bacterias ácido lácticas, tal como la nisina, inhiben no sólo a bacterias genéticamente muy relacionadas, sino también a patógenos de alimentos como Listeria monocytogenes (causante de listeriosis que produce fiebre, diarrea, dolor de cabeza, dolor en el cuello, pérdida de equilibrio) o de bacterias que esporulan como Clostridium (BARBOZA et al., 2004).

Según CINTAS et al., (2001) la primera etapa que experimenta la bacteriocina es su purificación. Independientemente del procedimiento utilizado para la purificación, disminuyen los rendimientos de la bacteriocina en el proceso general, de modo que para optimizar la producción es aconsejable ajustar las condiciones experimentales óptimas, por ejemplo en un fermentador se debería ajustar el medio de composición, temperatura, tiempo, pH, aireación, agitación, tamaño del inóculo, etc.

En general, las bacteriocinas producidas por bacterias Gram positivas, tales como las BAL, a diferencia de aquellas producidas por las Gram negativas presentan un

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espectro antimicrobiano mucho más amplio, que afecta incluso a géneros taxonómicos no relacionados (TAGG et al., 1976; JACK et al., 1995). El extenso conocimiento sobre muchas de las bacteriocinas de las BAL, junto con el estatus GRAS de que gozan las bacterias productoras, son condiciones a favor de su empleo como conservantes biológicos para proteger los alimentos procesados (MUÑOZ, 2006).

Entre las bacteriocinas de BAL actualmente aisladas, la nisina es la más estudiada, la cual es producida por algunas cepas de Lactococcus lactis subs. Lactis, pertenece a un grupo pequeño que sintetiza ribosomalmente polipéptidos que contienen aminoácidos modificados como lanthionine, 3-methyllanthionine, y sus precursores, dehydroalanine y dehydrobutyrine (STOFFELS et al., 1992).

Según lo citado por OUWEHAND (1998), se ha observado que las moléculas de la bacteriocina se adsorben a la célula cerca de un pH 6,0 y la adsorción más baja se produce en un rango de pH de 1,5-2,0.

2.3.1 Clasificación de bacteriocinas de las BAL. Ha sido dado a conocer un sistema para clasificar las bacteriocinas que las sitúa en una de cuatro clases. El sistema de Klaenhammer se basa principalmente en la genética y en la bioquímica de estos compuestos. Las principales clases de bacteriocinas producidas por las BAL incluyen:

• Clase I: incluye los lantibióticos, son péptidos pequeños por ejemplo la nisina

• Clase II: péptidos de tamaño pequeño termoestable como la lactacina F

• Clase III: proteínas termoestables de gran tamaño como la helveticina J

• Clase IV: proteínas que forman complejos con otros factores.

La bacteriocina del C. piscicola L103 se ubicaría en la clase II de acuerdo con lo citado por BORQUEZ (2000), quien afirma que esta bacteriocina presenta un PM menor a 10.000 Da, siendo por lo tanto un péptido pequeño, termoestable.

La característica más común de la clase II de bacteriocinas es su fuerte acción bactericida en contra de cepas de Listeria, siendo hasta ahora de las más activas en contra de estas cepas, sin embargo, también presentan acción bactericida en contra de varias otras bacterias Gram positivas, como las bacterias ácido lácticas (Lactobacillus sake, Lactobacillus curvatus o Leuconostoc mesenteroides), presentándose inactivas en contra de bacterias Gram negativas, como Shewanella putrefaciens (ZUÑIGA, 2002).

Según lo citado por OUWEHAND (1998), se ha observado que las bacteriocinas de la clase III, pueden incluir las enzimas extracelulares bacteriolíticas, que puede simular actividades fisiológicas de las bacteriocinas (JACK et al., 1994).

2.3.2 Aplicación de bacteriocinas de las BAL en alimentos. Debido a que los consumidores han estado constantemente preocupados por los posibles efectos perjudiciales para la salud de la presencia de aditivos químicos en los alimentos, se ha incrementado el interés por la búsqueda de conservantes naturales y eficaces; las bacteriocinas se pueden considerar conservantes naturales o biopreservantes. Para la aplicación de bacteriocinas en la biopreservación de los alimentos (SCHILLINGER et al.,1996) se utilizan comúnmente las siguientes técnicas:

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• Inoculación de los alimentos con BAL productoras de bacteriocinas. La capacidad de las BAL para crecer y producir bacteriocinas es fundamental para el éxito de su uso.

• Adición de bacteriocina purificada o semi-purificada como conservante del alimento.

• El uso de un producto previamente fermentado con cepas de bacteriocina produciendo así una tensión como ingrediente en la transformación de los alimentos (CHEN y HOOVER, 2003).

2.4 Listeria monocytogenes Es una bacteria ampliamente difundida en la naturaleza. Su presencia en los alimentos está determinada por su extensa distribución en el ambiente-tierra, aguas servidas, materia fecal, vegetación, ensilados y entorno de la producción de alimentos, lo que confiere una importante oportunidad para contaminarlos.

El género Listeria agrupa bacilos de cadena corta Gram positivos, no esporulados, aerobios facultativos, psicrótrofos, catalasa positiva, oxidasa negativos.

El género Listeria concentra numerosas especies: Listeria innocua, L. welshimeri, L.seeligeri, L. ivanovii, L. grayi y L. monocytogenes; sólo esta última se ha mostrado patógena al hombre (MICHANIE, 2006).

L. monocytogenes es una bacteria capaz de crecer a temperaturas de refrigeración, aunque el crecimiento óptimo se produce entre los 30 y los 37ºC. La influencia de la temperatura sobre la supervivencia y el crecimiento de L. monocytogenes se refiere, con frecuencia en conjunto con otras variables ambientales. Algunos autores estudiaron las temperaturas y de sus interacciones con pH inicial, la atmósfera, el contenido de cloruro de sodio y el nitrito de sodio. Se encontró que la cinética de crecimiento era dependiente de la interacción de estas cinco variables (MARTIN y FISHER, 2000).

Las necesidades nutritivas son las típicas de otras especies de bacterias Gram-positivas, crecen bien en medios como caldo infusión de cerebro y corazón, caldo soya tripticasa y caldo triptosa. Respecto del rango de pH necesario para el crecimiento de estas especies, se ha observado que este fluctúa entre pH 6,0-8,0, sin embargo, pueden desarrollarse en un rango mucho mayor, entre 4,1 y 9,6. Respecto de la temperatura necesaria para el crecimiento ésta fluctúa entre 1 y 45º C, teniendo un rango óptimo entre 20 y 25º C y un desarrollo acelerado cerca de los 37º C (JAY, 2000).

En general L. monocytogenes es más sensible a los efectos del calor y de agentes antimicrobianos en la fase de crecimiento exponencial, lo que se puede explicar por los cambios en la estructura celular, como consecuencia de la activa división celular SCHÖBITZ (2003).

2.5 Sistemas de cultivos de microorganismos

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Se han desarrollado varias técnicas para el cultivo de microorganismos. El cultivo batch y el cultivo por lote alimentado han sido parte del arte de la fermentación desde la antigüedad y aún son usados en la mayoría de las fermentaciones industriales. Las técnicas de cultivo continuo son relativamente más nuevas y se ha demostrado ser de gran valor como herramienta para estudios de laboratorio (Brown, 1990, citado por BORQUEZ ,2000).

2.5.1 Cultivo batch. Según SCHLEGEL (1997), si durante un proceso no se adiciona ningún nutriente ni se elimina ningún producto metabólico se denomina a este crecimiento como un cultivo discontinuo o batch. Un cultivo discontinuo se comporta como un organismo pluricelular con un crecimiento genético limitado. El crecimiento de un cultivo bacteriano, se representa cuando se expresan los logaritmos del número de células viables frente al tiempo, representado en la FIGURA 1.

FIGURA 1 Curva de crecimiento de un cultivo bacteriano. FUENTE: SCHLEGEL, 1997.

Una curva de crecimiento tiene aspecto sigmoidal y permite diferenciar varias fases de crecimiento: fase de latencia (o lag), fase exponencial (logarítmica), fase estacionaria y fase de muerte.

La fase de latencia abarca el lapso de tiempo entre la inoculación y el momento en que se alcanza la tasa de división máxima. La duración de la fase lag depende sobre todo del cultivo previo, de la edad del inóculo, así como de lo apropiado que sea el medio de cultivo.

La fase de crecimiento exponencial se caracteriza por un tiempo de generación constante y mínimo. El de generación durante la fase logarítmica es un parámetro específico de cada especie bacteriana y dependiente del medio (SCHLEGEL, 1997). La mayoría de los microorganismos unicelulares crecen exponencialmente, pero las velocidades de crecimiento exponencial pueden variar esencialmente, esta velocidad es influenciada por condiciones ambientales, tales como: la temperatura y la composición del medio de cultivo, así como por las características genéticas del microorganismo en cuestión (BROCK, 1998).

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La fase estacionaria se instaura cuando la población bacteriana no crece. En esta fase la célula puede utilizar aún materiales de reserva, descomponerse parte de los ribosomas y sintetizarse enzimas. Sólo las células muy sensibles mueren rápidamente. Siempre que pueda obtenerse energía necesaria por respiración de materiales de reserva o proteínas las bacterias permanecen largo tiempo vivas (SCHLEGEL, 1997).

Por ultimo, la fase de muerte en algunos casos va acompañada de lisis celular y la muerte de las células. La fase de muerte de un ciclo de crecimiento es también una función exponencial; sin embargo en muchos casos, la velocidad de muerte celular es mucho más lenta que el crecimiento exponencial (BROCK, 1998).

El cultivo batch sigue siendo el más importante proceso de operación utilizado en la industria. Existen fundamentos técnicos y biológicos de la elección de esta estrategia, el fundamento es muy sencillo y se puede llevar a cabo fácilmente. El producto es de una calidad uniforme en el cultivo batch, donde algunos productos causan fuerte inhibición del crecimiento (por ejemplo, etanol) o lo son sólo a bajas tasas de crecimiento (por ejemplo, antibióticos). La ventaja de este tipo de operación (cultivo batch), es de una alta tasa de crecimiento en el inicio de la fermentación es seguido por la alta formación de productos al final (SAHM, 1993).

2.5.2 Cultivo por lote alimentado. La fermentación por lote alimentado es ampliamente utilizado en la obtención de bioproductos mediante el empleo de microorganismos. En este tipo de cultivo el medio se añade al biorreactor eliminándose simultáneamente un volumen proporcional del medio fermentado, con esto se logra que la etapa de formación de producto sea lo más larga posible. Las necesidades de mantener en parámetros específicos las propiedades físico – químicas dentro del ambiente del biorreactor (temperatura, pH, agitación, etc.), hacen que las estructuras de control propuestas sean de una alta complejidad al intentar su automatización (CABRERA et al., 2001). 2.5.3 Cultivo continuo. El cultivo continuo es un sistema abierto, que tiende a un “equilibrio dinámico” (SHLEGEL, 1997). Un cultivo continuo es esencialmente de volumen constante, al que se añade medio fresco y del que se retira medio usado con células. Una vez que se alcanza el equilibrio, el número de células y el estadío metabólico se mantienen constantes, se dice entonces que se alcanza el estado de equilibrio (BROCK, 1998). La base del proceso continuo, es tal cual como se realiza en el quimiostato o en el turbidostato. El quimiostato esta compuesto por un recipiente de cultivo al que ingresa un flujo constante de medio de cultivo estéril. Por aireación y agitación mecánica se consigue en el recipiente de cultivo un suministro óptimo de oxígeno y una distribución homogénea lo más rápida posible de los nutrientes contenidos en el medio de cultivo que va entrando. En la misma medida que entra cultivo en el recipiente de cultivo, va saliendo suspensión bacteriana (SCHLEGEL, 1997).

Si el volumen del recipiente del cultivo es V (litros) y el medio de cultivo ingresa con flujo f (l/h), la tasa de dilución es:

VfD = (1)

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Esta indica por lo tanto, el cambio de volumen o renovación por hora. Si en el momento de poner en marcha el quimiostato las bacterias que se encuentran en el recipiente de cultivo (x [g/l]) no creciesen, se irían eliminando del recipiente según una tasa de lavado (SCHLEGEL, 1997).

El crecimiento de las bacterias, en el recipiente de cultivo tiene lugar igualmente de forma exponencial, y si la tasa de crecimiento µ y la tasa de dilución D son iguales, la pérdida por lavado se iguala al crecimiento bacteriano, esto es, la modificación es nula y la densidad bacteriana x se mantiene constante, bajo estas condiciones el cultivo se encuentra en un equilibrio dinámico, llamado estado estacionario (SCHLEGEL, 1997).

2.6 Nutrición microbiana Las sustancias disueltas en el agua, a partir de las cuales los microorganismos forman su material celular y obtienen energía, son los nutrientes. Los requerimientos de los distintos microorganismos en cuanto a la composición del medio de cultivo y a las demás condiciones ambientales son muy variables; básicamente la condición mínima es que deben de estar presente todos los elementos implicados en la constitución del material celular y en forma de compuestos utilizables (SCHLEGEL, 1997).

2.6.1 Macronutrientes. Según BROCK (1998) carbono, oxígeno, hidrógeno y nitrógeno son los cuatro elementos que constituyen el esqueleto de las macromoléculas así como las moléculas orgánicas pequeñas. Macronutrientes, son aquellos requeridos en grandes cantidades, estando en mayor proporción carbono y nitrógeno. En peso seco, una célula típica consta de aproximadamente 50% de carbono y a su vez éste es el elemento mayoritario de las macromoléculas. Después del carbono el siguiente elemento más abundante es el nitrógeno, el cual corresponde a un 12% en peso seco de una célula típica y a su vez el nitrógeno es un componente mayoritario de proteínas, ácidos nucleicos y otros constituyentes celulares (BROCK, 1998).

Existen otros macronutrientes como el azufre, fósforo, calcio, potasio, sodio, magnesio y hierro, los cuales están contenidos en todos los microorganismos (SCHLEGEL, 1997).

2.6.2 Micronutrientes. Aunque los micronutrientes son requeridos en muy pequeñas cantidades son tan importantes como los macronutrientes para la función celular. Los micronutrientes son metales, muchos de los cuales forman parte de, enzimas. Debido a que el requerimiento de micronutrientes es muy pequeño, para el cultivo de microorganismo en el laboratorio se hace innecesaria su adición al medio. Sin embargo, si un medio contiene compuestos químicos altamente purificados y disueltos en agua destilada de alta pureza, puede ocurrir una deficiencia de elementos traza. En tales caso se añade una pequeña cantidad de estos metales (BROCK, 1998). Algunos de los microelementos más comunes se encuentra: manganeso, molibdeno, zinc, cobre, níquel, vanadio, boro, cloro, selenio, silicio, wolframio entre otros, que no los necesitan todos los organismos. La mayoría de los elementos se añaden al medio de cultivo en forma de sales (SCHLEGEL, 1997).

2.6.3 Factores de crecimiento. Los factores de crecimiento son compuestos orgánicos que, como los micronutrientes, son requeridos en muy pequeñas cantidades

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y sólo por algunas células. Los factores de crecimiento incluyen vitaminas, aminoácidos, purinas y pirimidinas. Aunque la mayoría de los microorganismos son capaces de sintetizar estos compuestos, otros requieren tomar uno o más preformados del medio ambiente. Las vitaminas son los factores de crecimiento más comúnmente necesitados y la mayor parte de éstas, funcionan como coenzimas. Muchos microorganismos son capaces de sintetizar todos los componentes de sus coenzimas, pero algunos son incapaces de hacerlo, debiendo ser suplementados con ciertas partes de estos coenzimas en forma de vitaminas (BROCK, 1998).

Según lo citado por GUERRA y PASTRANA, (2002), una alta concentración de glucosa en el medio de cultivo contrarresta el efecto positivo de las complejas fuentes de nitrógeno en la producción de bacteriocina, indicando así una posible inhibición.

2.6.4 Medios de cultivo. En microbiología se usan dos grandes grupos de medios de cultivo: los químicamente definidos y los indefinidos o complejos. Los medios químicamente definidos se preparan añadiendo al agua destilada cantidades precisas de compuestos orgánicos o inorgánicos altamente purificados. Los medios complejos emplean lisados de caseína (proteínas de leche), de carne, de soja, de levadura o cualquier otra sustancia altamente nutritiva (químicamente indefinida). Tales lisados están disponibles comercialmente en polvo y pueden ser pesados rápidamente y disueltos en agua destilada para dar lugar a un medio de cultivo. Sin embargo, cuando se utilizan medios complejos hay que tener en cuenta que no se conoce la composición exacta de los nutrientes (BROCK, 1998). Es necesario conocer las condiciones ideales de crecimiento de las cepas lácticas para la producción de bacteriocina, por lo que la composición de los medios de cultivo pueden tener efectos importantes sobre el rendimiento; la peptona es un componente fundamental de los medios de cultivo, ya que influye directamente en la producción de bacteriocina, otros componentes, sin embargo, no tienen efecto sobre la producción de este metabolito (SCHÖBITZ et al., 2006).

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3. MATERIAL Y MÉTODO

3.1 Cepas bacterianas 3.1.1 Carnobacterium piscicola (cepa BAL B). Aislada de carne envasada al vacío (ICYTAL) y descrita como productora de un compuesto antagónico (SCHÖBITZ, 1989)2, el medio de cultivo utilizado fue caldo D-MRS (SCHILLINGER et al., 1993), pH a 6,5 ajustado con NaOH 1N o HCl 1N. LA cepa BAL B corresponde a la cepa productora de una sustancia tipo bacteriocina, a la cual se diseñará un medio de cultivo alternativo.

3.1.2 Listeria monocytogenes 4/00. Aislada de Salmón (ICYTAL), el medio de cultivo utilizado fue caldo soya tripticasa (caldo ST)3. L. monocytogenes 4/00 corresponde a la cepa indicadora utilizada para la determinación de la actividad de la sustancia tipo bacteriocina.

3.2 Medio de cultivo El medio de cultivo testigo corresponde a D-MRS, al cual se le sustituyeron las fuentes de carbono, micronutrientes y se modificaron las proporciones de las fuentes proteicas, basado en un estudio anterior (GONZALEZ, 2008),

CUADRO 1 Composición medio de cultivo, D-MRS, utilizado para C. piscicola.

COMPONENTES g / L Proteosa peptona 10 Extracto de carne 10 Extracto de levadura 5 Tween 80 1 Citrato de amonio 2 Sulfato de magnesio 0,1 Sulfato de manganeso 0,05 Sacarosa 20 Fosfato de potasio 2 FUENTE: SCHILLINGER et al., 1993.

2 Shöbitz, R., 1989. Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos. Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Austral de Chile. 3 Caldo ST: Difco Laboratories, Detroit, MI, USA.

12

13

Debido a que el diluyente en el medio de cultivo es tampón fosfato pH 6,54, se omitió la adición de fosfato de potasio5.

3.3 Agua de levadura 3.3.1 Materia prima. La materia prima que se utilizó para la obtención de una solución de agua de levadura corresponde a crema de levadura (90% de humedad), la cual fue proporcionada por la industria de levaduras Collico, Valdivia.

3.3.2 Preparación de la solución de agua de levadura. La preparación de esta solución, se realiza mezclando 100 g de crema le levadura con 1 L de tampón fosfato pH 6,5, una vez que este bien mezclada se autoclava (121ºC, 15 min) y se deja decantar en frío, para luego extraer el sobrenadante mediante un sifón. 3.3.3 Proporciones a reemplazar en medio de cultivo D-MRS. Se prueban tres formulaciones para el agua de levadura en reemplazo del extracto de levadura6 en el medio de cultivo D-MRS, las cuales se presentan en el CUADRO 2.

CUADRO 2 Formulaciones probadas en reemplazo del extracto de levadura, en el medio de cultivo D-MRS.

Este ensayo requirió las siguientes condiciones y mediciones:

• Medio estéril

• El crecimiento de la cepa se desarrolla mediante un cultivo batch (a nivel de matraces)

• Incubación en shaker7 a una temperatura de 25ºC y 150rpm

• Se mide actividad en duplicado al tiempo 0, a las 6 y 12 horas

• El ensayo se compara con el medio de cultivo testigo (caldo D-MRS)

• Repetición del ensayo completo.

3.4 Carbohidratos 3.4.1 Materias primas. Entre las materias primas utilizadas se encuentran la sacarosa y melaza, esta última proporcionada por la industria de Levaduras Collico, Valdivia.

4 Tampón fosfato pH 6,5: 3,23 g/L de K2HPO4 y 9,54 g/L de KH2PO4 5 KH2PO4: Reactivo J.T.Baker.ACS. México. 6 Extracto de levadura: Difco Laboratories, Detroit, MI, USA. 7 Incubadora Shaker MA 411/CF. Marconi, Brasil.

FÓRMULAS Fórmula Nº1 Fórmula Nº2 Fórmula Nº3 100% agua de levadura 50% agua de levadura

50% tampón fosfato pH 6,5 10% agua de levadura 90% tampón fosfato pH 6,5

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3.4.2 Proporciones a reemplazar en el medio de cultivo D-MRS. Para determinar la fuente de carbohidratos a reemplazar del medio de cultivo original, se probaron tres formulaciones con distintas concentraciones de melaza y combinaciones de melaza-sacarosa. Estas formulaciones se presentan en el CUADRO 3.

CUADRO 3 Formulaciones probadas en reemplazo de sacarosa, en el medio de cultivo D-MRS.

Este ensayo requirió las siguientes condiciones y mediciones:

• Medio estéril


• Incubación en shaker a una temperatura de 25ºC y 150rpm

• Se midie actividad en duplicado al tiempo 0, a las 6 y 12 horas

• El ensayo se compara con el medio de cultivo testigo ( caldo D-MRS)


3.5 Proteínas 3.5.1 Proporciones a reemplazar en el medio de cultivo D-MRS. En un estudio que se realizó anteriormente (GONZÁLEZ, 2008) se seleccionó como fuentes proteicas las siguientes:

• De origen animal, harina de pescado a partir de una solución con una concentración al 7,5%

• De origen vegetal, harina de lupino a partir de una solución con una concentración al 1,25%

En la presente investigación, se probaron nuevas concentraciones tanto para las proteínas de origen animal, como la de origen vegetal en reemplazo del extracto de carne8 y la proteosa peptona9 respectivamente en el medio original. Estas nuevas concentraciones se presentan en el CUADRO 4. Este ensayo requirió las siguientes condiciones y mediciones:

• Medio estéril


8 Extracto de carne: Difco Laboratories, Detroit, MI, USA 9 Proteosa peptona: Difco Laboratories, Detroit, MI, USA

FÓRMULAS Fórmula Nº1 Fórmula Nº2 Fórmula Nº3 40 g/L de melaza 20 g/L de melaza

10 g/L de sacarosa 10 g/L de melaza 10 g/L de sacarosa

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• Incubación en shaker a una temperatura de 25ºC y 150 rpm

• Se mide actividad en duplicado al tiempo 0, a las 6 y 12 horas

• El ensayo se compara con el medio de cultivo testigo ( caldo D-MRS)


CUADRO 4 Formulaciones probadas en reemplazo del extracto de carne y proteosa peptona, en el medio de cultivo D-MRS.

3.5.2 Preparación del extracto proteico. Para la preparación del extracto proteico se siguieron los siguientes pasos:

• Preparación de la muestra: la muestra se preparó según la concentración requerida, por ejemplo, si se requiere preparar la muestra a una concentración del 2%, significa que se toman 2 g de harina y se mezcla con 100 mL de diluyente. En el caso de harina de lupino el diluyente corresponde a agua destilada y para el harina de pescado es tampón fosfato pH 6,5.

• Ajuste de pH: para el extracto de harina de lupino se ajusta el pH a 8 y para el extracto de harina de pescado el pH debió ajustarse a 6,5, en ambos casos el ajuste de pH se realizó con NaOH 1N o 0,1N.

• Agitación: Una vez ajustado el pH, la solución se agita por 30 minutos, en un agitador magnético10.

• Decantación: trascurrido los treinta minutos de agitación, que aseguran una solución homogénea, se retira del agitador magnético y se deja decantar por 15 minutos.

• Extracción: se extrae el sobrenadante con una jeringa, para no remover el precipitado.

• Centrifugación: el sobrenadante se centrífuga11 durante 5 minutos a 3000 rpm.

• Filtración: el sobrenadante centrifugado se hace pasar por un portafiltro, que contiene un papel filtro, con el fin de eliminar impurezas que hallan quedado.

10 Agitador magnético Thermolyne Nuova. 11 Centrifuga IEC Centra MP4.

FÓRMULAS Fórmula

Nº1 Fórmula

Nº2 Fórmula

Nº3 Fórmula

Nº4 Concentración de harina de pescado

12% 6% 3% 1,5%

Concentración de harina de lupino

2% 1% 0,5% 0,25%

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3.6 Producción de la sustancia tipo bacteriocina (STB) El crecimiento de la cepa Carnobacterium piscicola L103, a nivel de matraces, se desarrolla durante un período de 24 h, a 25°C, en agitador orbital a 150 rpm.

Una vez sembrados los medios a probar, se toman muestras del caldo inmediatamente inoculado, a las 6 h y 12 h, para determinar la actividad de la bacteriocina en duplicado, con la que se demuestra la eficiencia del medio de cultivo.

Para producir la STB, previamente se debió propagar la cepa láctica con el esquema que se muestra en la FIGURA 2.

FIGURA 2 Esquema de propagación de la cepa láctica C. piscicola. 3.7 Determinación de la actividad de la bacteriocina 3.7.1 Obtención del sobrenadante con la STB. El sobrenadante con la bacteriocina, se obtiene por medio de una centrifugación12 a una temperatura de 4ºC, 9000 rpm durante 15 minutos. Al sobrenadante obtenido se le ajusta el pH a 6,5, ya sea con NaOH 0,1N o 1N, se esteriliza con un filtro13 de 0,22 µm. 3.7.2 Prueba de la actividad de la bacteriocina. Para la determinación de la actividad de la bacteriocina producida por C. piscicola, se utiliza la técnica de la “Gota sobre césped”. Esta técnica consiste en la preparación de un césped, a partir, de L. monocytogenes en caldo soya tripticasa a 25º C por 18 h, el cual de diluye con buffer fosfato (10 µL de caldo ST en 10 mL de buffer fosfato), para posteriormente traspasar 700 µL a 7 ml de agar D-MRS semisólido (0,5% de agar agar). Este césped con Listeria se adiciona sobre una placa de Petri con agar soya tripticasa (ST), para posteriormente distribuir sobre este césped. Cada una de las gotas de 20 µL a diferentes soluciones del sobrenadante con la bacteriocina, se encuentran diluidas con buffer dos sales (para este buffer se preparan dos soluciones de 100 mL cada una, la primera lleva 0,71 g de Na2HPO4 a pH 9,0 y la otra solución contiene 0,6 g de NaH2PO4 12 Universal 320R Hettich Zentrifugen. 13 Millex Gv, durapore PVDF Membrana, Millipore® de Millipore Corporation, Bedford, MA.

17

a pH 4,0, se ajusta el pH del buffer dos sales agregando pequeñas fracciones de la solución más ácida a más básica hasta que el pH disminuya a un valor de 7,2); además se siembra una gota control de la STB. Las gotas sobre el césped de la placa de Petri se dejan secar aproximadamente 30 minutos, bajo una campana de flujo laminar14 y posteriormente se incuban a 25ºC por 24 h. El protocolo de trabajo para la determinación de la actividad de la bacteriocina se muestra en la FIGURA 3 y FIGURA 4.

FIGURA 3 Esquema de preparación del césped con la cepa indicadora.

FIGURA 4 Esquema de la técnica de la gota sobre césped.

14 Campana de flujo laminar Labconco.

18

3.7.3 Interpretación de placas resultantes. Se considera positiva la prueba de actividad, cuando se observan halos de inhibición nítidos, transparentes, con bordes limitados sobre las gotas antes dispuestas en el césped con la cepa indicadora y que no presenten desarrollo interior. La actividad de la bacteriocina se expresa en UA/mL, y la cuantificación para esta actividad corresponde a la mayor dilución en que se observe el halo de inhibición más nítido, la cual se considera como positiva y el resultado de la actividad es el recíproco de dicha dilución expresada por mL. 3.7.4 Análisis estadísticos. Con los datos de actividad obtenidos, mediante el uso del programa estadístico SPSS v10, donde se aplica la dócima de Friedman, correspondiente a método estadístico no paramétrico que sustituye al análisis de varianza. 3.8 Formulación del medio de cultivo modificado Una vez definidas aquellas fórmulas con los mejores resultados de actividad, estadísticamente probados, se procedió a efectuar un cultivo adicional, de mayor volumen para que además de determinar la cinética de crecimiento y producción de bacteriocina (recuentos celular y actividad de bacteriocina), se determina la variación de la concentración en el medio de cultivo tanto de proteína soluble, como de azúcar residual (método enzimático).

3.9 Aplicación del medio de cultivo modificado a nivel de minifermentador Para la aplicación a nivel de minifermentador para la producción de la STB, se utilizó un volumen de 500 mL de medio de cultivo modificado, siguiéndose el protocolo que se esquematiza en la FIGURA 5.

FIGURA 5 Esquema de propagación de la cepa láctica C. piscicola a nivel de minifermentador.

Carnobacterium piscicola L103

100mL caldo D-MRS

50mL caldo D-MRS

500mL caldo D-MRS modificado en

minifermentador

Inoculación al 1% (1000µL)

25ºC por 24h

Inoculación al 1% (500µL)

25ºC por 24h

Inoculación al 10% (50mL)

25ºC por 24h a 150 rpm

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El sistema de mini fermentación consta de:

• Minifermentador de 1 L, con vaso de vidrio Pyrex y tapa de acero inoxidable con diversas aberturas; posee un agitador central de 6 paletas planas por cuyo fondo se permite el ingreso del aire filtrado y un serpentín donde circula agua a temperatura constante

• Circulador termostatado (HAAKE) Electromecánica, Modelo 1471H202), para mantener la temperatura a 25 ºC

• pH-ímetro (VERNON HILLS, ILLINOIS 60061) y adición manual de NaOH a 1N usando jeringa de 60 mL, para controlar el pH a 6,5

• Agitador magnético (THERMOLYNE, Nuova Stir Plate), para asegurar la agitación interior durante el cultivo batch

• Bomba de aire, que aporta 500 ml de aire/min (bomba de acuario)

Este minifermentador se mantuvo a una temperatura de 25ºC, durante 24 horas. 3.9.1 Consumo de NaOH. Se registra el consumo de NaOH 1N o 2N según sea el caso, para mantener el medio de cultivo en un pH de 6,5 condición necesaria para que la cepa láctica se desarrolle y produzca la STB. Este consumo es acumulativo por lo que se ve el incremento de NaOH cada 3 horas 24 horas. 3.9.2 Determinación de actividad de la STB. La determinación de la STB sigue el mismo protocolo de trabajo mencionado en la sección 3.7.

La toma de muestras para el análisis de actividad se realiza a las 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 y 24 horas.

3.9.3 Determinación contenido proteico. El contenido proteico de cada una de las muestras, se determina mediante el método de Lowry (Anexo 1 y 2). Se determina el contenido de proteína soluble de los extractos de harina de lupino y harina de pescado a diferentes concentraciones, para las distintas formulaciones probadas. Además se compara el contenido de proteína soluble en harina de lupino de diferentes fechas de elaboración.

Se determina el contenido de proteína soluble de las muestras de caldo D-MRS modificado en distintos tiempos durante la incubación en el minifermentador, estas mediciones se efectuan inmediatamente después de la inoculación, a las 6, 12, 18 y 24 horas.

3.9.4 Determinación de concentración de glucosa. La concentración de azúcar se determina mediante un método enzimático, test de glucosa Merckotest. Este test consta de los siguientes reactivos:

• Solución buffer.

• Solución estándar de glucosa.

• Solución de enzima (100mg/dL = 5,55mmol/L).

La solución reactivadora se activa añadiendo 250 µL de la solución de enzima en el frasco que contiene 100mL de solución buffer.

20

Antes de aplicar este método enzimático se debe hidrolizar la muestra debido a que el azúcar del medio de cultivo D-MRS modificado corresponde a sacarosa y no glucosa. La hidrólisis de la muestra se realiza de la siguiente manera:

• Se filtra 1mL de muestra.

• Se adicionan 2 gotas de HCL fumante

• SE hierve durante 10 minutos

Una vez que se hierve la muestra, esta se enfría y se prepara la dilución en proporción 1:5, ósea 200 µL de la muestra hidrolizada y enfriada más 800 µL de agua destilada, posteriormente se toman 20 µL de esta dilución y se adicionan a un tubo con 2mL de la solución reactivadora, una vez mezclada la muestra con la solución reactivadora se dispone en un baño termorregulado15 a 37ºC por 20 minutos, al transcurrir los 20 minutos se mide absorbancia a 546nm16.

En este método el blanco corresponde a agua destilada y el estándar a la solución de glucosa, para poder medir la absorbancia de este estándar se realiza el mismo procedimiento que se aplica a la muestra, se toman 20µL y se adicionan a un tubo con 2mL de la solución reactivadora, luego se dispone en un baño termorregulado y se mide la absorbancia (tanto al estándar de glucosa como al blanco se disponen en baño termorregulado antes de leer la absorbancia correspondiente).

Una vez medida la absorbancia del estándar y de las muestras se debe aplicar una fórmula donde AS, corresponde a la absorbancia de la solución muestra y AST a la absorbancia del estándar de glucosa. Dicha fórmula es la siguiente:

(2)

Se determina la concentración de glucosa remanente de las muestras de caldo D-MRS modificado en distintos tiempos durante la incubación en el minifermentador, estas mediciones se efectuan inmediatamente después de la inoculación, a las 6, 9, 12, 18 y 24 horas.

3.9.5 Crecimiento de BAL. Para la cinética de crecimiento de la cepa BAL B en el medio de cultivo D-MRS modificado, se efectuaron recuentos por el método en superficie sobre placas de agar, incubadas a 25ºC durante 24 horas a muestras extraídas inmediatamente realizada la inoculación, a las 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 y 24 horas. La metodología seguida para el recuento en placa en superficie se presenta detallada en el ANEXO 3.

15 Baño termorregulado Memmert 16 Espectofotómetro Genesys V. Espectro Spec.

[ ] ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛×=⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛×=

Lg

AA

dLmg

AAagludeiónConcentrac

ST

S

ST

S 100cos

21

4. PRESENTACIÓN DE RESULTADOS

4.1 Agua de levadura

Al preparar las tres formulaciones propuestas para en ensayo de agua de levadura y observar los resultados de actividad de STB, se vio una notable diferencia entre dichos valores medidos en los tres tiempos, al momento de la inoculación (tiempo 0 h) no se observó inhibición de L. monocytogenes por parte de la STB de C.piscicola en ninguna formulación probada ni en el testigo caldo D-MRS, a diferencia del tiempo 6 y 12 h, donde si hubo inhibición. La fórmula 1, correspondiente a un 100% de agua de levadura como diluyente del medio, obtuvo una actividad de 400 UA/mL (dilución 1:8) a las 6 h, actividad que se mantuvo constante hasta las 12 h. La fórmula 3, correspondiente a un 50% de agua de levadura como diluyente en el medio, obtuvo una actividad de 400 UA/mL (dilución 1:8) a las 6 h y 800 UA/mL (dilución 1:16) a las 12 h. Para la fórmula 3 correspondiente a 10% de agua de levadura y 90% de tampón fosfato como diluyentes, se obtuvo una actividad de 200 UA/mL (dilución 1:4) a las 6 h y 400 UA/mL (dilución 1:8) a las 12 h. Comparadas las tres formulaciones con el medio de cultivo testigo caldo D-MRS, la formula 3 cumpliría con los valores mínimos de actividad ya que tiene valores idénticos de actividad con el testigo caldo D-MRS en los tres tiempos de muestreo, la fórmula 1 lo supera alcanzando una mayor actividad a las 6 h pero ésta se mantiene hasta las 12 h y no aumenta en mayor proporción, lo que si sucede en la fórmula 2 la cual a las 6 h presenta la máxima dilución que tiene el D-MRS a las 12 h, y a las 12 horas supera a lo alcanzado por el testigo con una actividad correspondiente a 800 UA/mL, por lo que esta formulación sería la más adecuada de reemplazar por el extracto de levadura en el medio de cultivo alternativo.

El ANEXO 4 muestra los resultados del análisis estadístico “dócima de Friedman” para los resultados de actividad a diferentes tiempos de muestreo, el cual calcula un rango promedio para cada fórmula, dando un mayor rango promedio a la fórmula 2 con un 3,33 superando al testigo D-MRS que tiene un 2,00, por lo que se corrobora que es la fórmula más apropiada para usar en reemplazo del extracto de levadura. Sin embargo, por tratarse de datos discretos, aún con un 95% de significancia no hay diferencias significativas ente las fórmulas (Sig. asintót: 0,194>0,05), lo que indica que para tener una mayor certeza se deberia muestrear más de tres tiempos en el ensayo.

En la FIGURA 6 se muestran las apariencias de las tres formulaciones probadas, y los resultados de actividad de STB para los distintos tiempos de muestreo y actividad de STB correspondiente a las 12 horas de muestreo para las tres formulaciones se muestran en las FIGURAS 7 y 8 respectivamente.

21

22

0100200300400500600700800900

0 6 12

Tiempo (h)

Act

ivid

ad d

e ST

B (U

A/m

L)

Fórmula 1 Fórmula 2 Fórmula 3 Testigo D-MRS

FIGURA 6 Apariencia de los medios de cultivo para las distintas formulaciones probadas para reemplazar el extracto de levadura del medio de cultivo testigo caldo D-MRS.

FIGURA 7 Actividad de STB en cada tiempo de muestreo para las formulaciones propuestas en el ensayo de agua de levadura.

23

55,25,45,65,8

66,26,46,6

0 6 12

Tiempo (h)

pH


FIGURA 8 Actividad de STB correspondiente a las 12 horas, para las distintas fórmulas probadas en el ensayo de agua de levadura.

FIGURA 9 pH en cada tiempo de muestreo para las formulaciones propuestas en el ensayo de agua de levadura y caldo D-MRS.

24

Con respecto al pH durante el crecimiento, no obstante el uso de tampón en los medios, éste desciende en la misma proporción en las fórmulas y en el medio testigo, ello a medida que la bacteria láctica va creciendo y acidificando el medio, al ir consumiéndose los nutrientes necesarios para su desarrollo y producción de STB. El pH en cada tiempo de muestreo para las diferentes formulaciones propuestas se muestra en la FIGURA 9.

4.2 Carbohidratos De las tres formulaciones propuestas para en ensayo de carbohidratos se observan mínimas diferencias para la actividad de STB. Como era de esperarse a las 0 h no se observó inhibición de L. monocytogenes por parte de la STB de C.piscicola en ninguna formulación probada ni en el caldo D-MRS. La fórmula 1 y fórmula 3 correspondiente a 40 g/L de melaza y 10 g/L melaza más 10 g/L sacarosa respectivamente obtuvieron una actividad de 100 UA/mL (dilución 1:2) a las 6 h, aumentando a las 12 h a 200 UA/mL (dilución 1:4). La fórmula 2 correspondiente a 20 g/L melaza más 10g/L sacarosa arrojó una actividad constante durante las 6 y 12h de 200 UA/. De tres formulaciones probadas ninguna supera al medio de cultivo testigo, lo cual indica la no conveniencia de reemplazar la sacarosa en el medio de cultivo original, por lo tanto se deberían probar nuevas proporciones de sacarosa y melaza-sacarosa para obtener la fórmula más conveniente a reemplazar; no obstante de las tres formulaciones probadas la más conveniente para ser usada17 corresponde a la fórmula 2, ya que aunque no supera la actividad del caldo D-MRS se mantiene a 200 UA/mL durante las 12h que dura el experimento.

El ANEXO 5 muestra los resultados del análisis estadístico aplicado a los resultados de actividad en los diferentes tiempos de muestreo, según los rangos calculados para cada formula, el mayor rango lo obtiene las fórmula 2 con un 2,67,siendo esta la más conveniente a ser usada, aunque en ningún caso supera al rango promedio alcanzado por el caldo D-MRS que corresponde a un 3,33, lo que corrobora que no se debería reemplazar la sacarosa en el medio de cultivo original por ninguna de las tres fórmulas probadas. Debido a que son resultados discretos, aun con un 95% de significancia no hay diferencias significativas ente dichas fórmulas (Sig. asintót: 0,194>0,05), lo que indica que para tener una mayor certeza se debería aplicar el ensayo a más tiempos de muestreo, además de probar otras formulaciones para el ensayo de carbohidratos para así encontrar la más apropiada. El procedimiento aplicado para el análisis estadístico se realizó conforme lo recomendado por PEREZ, (2001).

En la FIGURA 10 se muestran las apariencias de las tres formulaciones probadas, y los resultados de actividad de STB para los distintos tiempos de muestreo y actividad de STB correspondiente a las 6 y 12 horas de muestreo para la fórmula 2 se muestran en las FIGURAS 11 y 12 respectivamente.

17 Para reducir costos

25

0

100

200

300

400

500

0 6 12

Tiempo (h)

Act

ivid

ad d

e ST

B (U

A/m

L )


FIGURA 10 Apariencia de los medios de cultivo para las distintas formulaciones probadas para melaza y combinación melaza-sacarosa en reemplazo de sacarosa y medio de cultivo testigo caldo D-MRS.

FIGURA 11 Actividad de STB en cada tiempo de muestreo para las formulaciones propuestas en el ensayo de carbohidratos y caldo D-MRS.

26

55,25,45,65,8

66,26,46,6

0 6 12

Tiempo (h)

pH

Fórmula 1 fórmula 2 Fórmula 3 Testigo D-MRS

FIGURA 12 Actividad de STB correspondiente a las 6 y 12 horas, para la fórmula Nº2 probada en el ensayo de carbohidratos.

FIGURA 13 pH en cada tiempo de muestreo para las formulaciones propuestas en el ensayo de carbohidratos y caldo D-MRS.

27

En este ensayo las tres formulaciones tuvieron un mismo descenso de pH con un ∆pH de 0,5 cada 6 horas, lo que indica que la bacteria láctica esta tomando del medio los nutrientes necesarios para su crecimiento y desarrollo de STB, trayendo como consecuencia la acidificación del medio. El pH en cada tiempo de muestreo para las diferentes formulaciones propuestas se muestra en la FIGURA 13.

4.3 Proteínas En las cuatro formulaciones propuestas para en ensayo de proteína vegetal y animal, se observan mínimas diferencias para la actividad de STB, siendo muy bajos los valores de actividad. La fórmula 1 y fórmula 2 mantuvieron constante su actividad en 100 UA/mL (1:2) durante las 6 y 12 h, lo que indica que una alta concentración proteica hace que la bacteria solo se dedique a crecer y no a producir la STB, hecho no muy conveniente para esta investigación. La fórmula 3 presentó una actividad de 100 UA/mL a las 6 h y 200 UA/mL a las 12 h, de la misma manera la fórmula 4 presentó un aumento de actividad de las 6 a las 12 h, pasando de 50 a 100 UA/mL respectivamente. De cuatro formulaciones probadas ninguna supera al medio de cultivo testigo, lo cual indica que no es muy conveniente reemplazar la proteína vegetal y animal en el medio de cultivo original, por lo tanto se deberían mantener las proporciones escogidas en estudio anterior al presente; no obstante de las cuatro formulaciones probadas la más conveniente para ser usada corresponde a la fórmula 3, ya que aunque no supera la actividad del caldo D-MRS aumenta su actividad a 200 UA/mL a las 12 h.

El ANEXO 6 muestra los resultados del análisis estadístico aplicado a los resultados de actividad en los diferentes tiempos de muestreo, según los rangos calculados para cada formula, el mayor rango promedio lo obtiene las fórmula 3 con un 3,33, siendo ésta la mejor a ser usada, aunque en ningún caso supera al rango promedio alcanzado por el caldo D-MRS que corresponde a un 4,33, lo que corrobora que no se debería reemplazar la proteosa peptona y el extracto de carne en el medio de cultivo original por ninguna de las cuatro fórmulas probadas. Siendo los resultados discretos, y aun con un 95% de significancia no hay diferencias significativas ente dichas fórmulas (Sig. asintót: 0,136>0,05), lo que indica que para tener una mayor certeza se debería aplicar el ensayo con un número mayor de muestreos, y nuevas formulaciones para el ensayo de carbohidratos para así encontrar la más apropiada.

En la FIGURA 14 y 15 se muestran las apariencias de las cuatro formulaciones probadas y los resultados de actividad de STB para los distintos tiempos de muestreo respectivamente.

Es conveniente señalar que las fuentes proteicas del medio testigo son preparados hidrolizados (proteosa peptona y extracto de carne) y dado que las fuentes proteicas de reemplazo propuestas son proteínas no hidrolizadas, resultaría conveniente efectuarles hidrólisis enzimáticas y probarlas en un próximo estudio.

28

0

100

200

300

400

500

0 6 12

Tiempo (h)

Act

ivid

ad d

e ST

B (U

A/m

L)

Fórmula 1 Fórmula 2 Fórmula 3 Fórmula 4 Testigo D-MRS

FIGURA 14 Apariencia de los medios de cultivo para las distintas formulaciones probadas para harina de lupino-harina de pescado en reemplazo de proteosa peptona-extracto de carne respectivamente.

FIGURA 15 Actividad de STB en cada tiempo de muestreo para las formulaciones propuestas en el ensayo de proteínas y caldo D-MRS.

29

En este ensayo el descenso de pH varió levemente a las 0 h la fórmula 1 y 2 iniciaron con un pH de 6,5 y la fórmula 3 y 4 con un pH de 6, lo que se explica por las diferentes concentraciones de proteínas las cuales están a diferentes pHs, estando a pH 8 la proteína vegetal (harina de lupino) y pH 6,5 la proteína animal (harina de pescado), a las 6 horas las cuatro formulaciones se mantienen a un pH de 6, y a las 12 h el pH de las fórmulas 1, 3 y 4 descienden a 5,5, con excepción de la fórmula 2, la cual mantiene su pH constante a 6,0 durante las 12 horas. La variación de pH a las diferentes horas de muestreo van variando de acuerdo al consumo de nutrientes por partes de las BAL. El pH en cada tiempo de muestreo para las diferentes formulaciones propuestas se muestra en la FIGURA 16. 4.4 Aplicación del medio de cultivo modificado a nivel de minifermentador Según los mejores datos de actividad para los ensayos preliminares se elaboró el medio de cultivo alternativo final cuya composición se presenta en el CUADRO 5.

El fosfato de potasio se eliminó, ya que los componentes acuosos se preparan con tampón fosfato, el cual ya contiene esta sal en exceso para los requerimientos del microorganismo.

De los cuatro componentes que se van a reemplazar, los tres primeros están en forma acuosa por lo que se prepararan a distintas concentraciones y volúmenes para que al combinarse los cuatros componentes logren la concentración final deseada.

FIGURA 16 pH en cada tiempo de muestreo para las formulaciones propuestas en el ensayo de proteínas y caldo D-MRS.

55,25,45,65,8

66,26,46,6

0 6 12

Tiempo (h)

pH

Fórmula 1 fórmula 2 Fórmula 3 Fórmula 4 Testigo D-MRS

30

Para la aplicación del medio de cultivo a nivel de minifermentador se utilizaron 500 mL de medio. Para 500 mL de medio de cultivo alternativo fue necesario efectuar los siguientes ajustes y procedimientos:

• Extracto de harina de lupino: se requiere un volumen de 125 mL que debe estar a una concentración del 0,5%, pero como este extracto en volumen corresponde a la cuarta parte del volumen total del medio, el extracto debe preparase cuadruplicando la concentración inicial, es decir, el extracto debe tener una concentración del 2% para que al juntarse con los 125 mL de extracto de harina de pescado y 250 mL de agua de levadura se rebaje la concentración al 0,5%.

• Extracto de harina de pescado: se requiere un volumen de 125 mL que debe estar a una concentración del 3%, pero como este extracto en volumen corresponde a la cuarta parte del volumen total del medio, el extracto debe preparase cuadruplicando la concentración inicial, es decir, el extracto debe tener una concentración del 12% para que al juntarse con los 125 mL de extracto de harina de lupino y 250 mL de agua de levadura se rebaje la concentración al 3%.

• Agua de levadura: debido a que el agua de levadura tiene una concentración del 10% y solo se necesita como diluyente en el medio final un 50% de volumen, se necesita un total de 250 mL pero esta agua de levadura debe prepararse al doble de la concentración inicial , ósea debe ser preparada al 20% (20 g por 100 mL de tampón), para que así al juntarse con los otros 250 mL de extractos de proteínas (125 mL extracto de harina de lupino y 125 mL extracto de harina de pescado) se rebaje la concentración a la mitad y cumpla además con el 50% de volumen como diluyente.

• Tween 80: 0,5 g

• Citrato de amonio: 1 g

• Sulfato de magnesio: 0,05 g

COMPONENTES Concentración Extracto de harina de lupino 0,5% Extracto de harina de pescado 3% Agua de levadura 50% como diluyenteTween 80 1 g/L Citrato de amonio 2 g/L Sulfato de magnesio 0,1 g/L Sulfato de manganeso 0,05 g/L Melaza-sacarosa 20 g/L melaza + 10

g/L sacarosa Fosfato de potasio* 2 g/L

CUADRO 5 Composición final del medio de cultivo alternativo al D-MRS.

31

• Sulfato de manganeso: 0,025 g

• Melaza-sacarosa: 10 g melaza + 5 g sacarosa

Una vez preparado el medio de cultivo final se esteriliza a 121ºC durante 15 minutos, ya estéril el medio se introduce al minifermentador por medio de un embudo estéril, el cual se lava con agua estéril para poder utilizarlo en la incorporación del inóculo seguidamente. La inoculación con la cepa láctica corresponde al 10%, tal cual como se explica en la FIGURA 5, tanto la inoculación como la adición del medio de cultivo al minifermentador se lleva a cabo bajo campana de flujo laminar, para así proporcionar la esterilidad necesaria y evitar cualquier tipo de contaminación.

Ya incorporado el medio de cultivo y el inóculo, también bajo campana de flujo laminar se acopla una jeringa con capacidad de 60 mL con NaOH 1N, para así dosificar hidróxido de sodio cuando se necesite ajustar el pH a 6,5, pH óptimo requerido para que la cepa de bacteria láctica produzca la STB requerida.

Antes de comenzar la agitación en el minifermentador y la incorporación de aires se verificó que el pH inicial fuera de 6,5, en este caso se usó NaOH más concentrado que el contenido en la jeringa, se ocupó NaOH al 40%, y una vez ajustado el pH se tomó el tiempo y empezó la agitación y la incorporación de aire.

4.4.1 Consumo de NaOH. Se registró el consumo de NaOH cada tres horas durante las 24 horas que duró el experimento, este consumo es acumulativo, tal cual como se

FIGURA 17 Sistema de Fermentación y sus componentes. (1) Minifermentador de 1 L de capacidad, (2) Circulador termostatado, (3) pH-ímetro, (4) Jeringa con NaOH, (5) Agitador magnético, (6) Bomba de aire

32

explica en la FIGURA 18. Desde el comienzo del experimento se utilizó NaOH 1N, pero debido a que el pH disminuía constantemente y la adición se hacía muy seguida, el medio se estaba diluyendo demasiado, y se decidió aumentar la concentración del hidróxido de sodio para que así se consuma menos de éste, y por ende no se diluya tanto el medio de cultivo alternativo. La concentración de NaOH se cambió a las 12 horas de transcurrido el experimento, por lo que desde esta hora en adelante se utilizó una concentración 2N, pero con fines de comparar el consumo de NaOH en los siguientes ensayos se utilizó la gráfica a una concentración 1N, suponiendo que desde que se comenzó a usar NaOH 2N a las 12 horas, en cuanto a volumen sería la mitad que si se utilizara NaOH a una concentración 1N. El volumen total consumido de NaOH 1N fue de 98,6mL y el consumo de NaOH 1N-2N fue de 90,3mL. Los valores específicos de consumo cada tres horas de realizado el experimento se encuentra detallado en el ANEXO 7.

0

20

40

60

80

100

120

0 3 6 9 12 15 18 21 24

Tiempo (h)

Con

sum

o de

NaO

H (m

L)

NaOH 1N NaOH 1N y 2N

4.4.2 Actividad de la STB. En la FIGURA 19 se compara la actividad de la STB en cada tiempo de muestreo versus el consumo de NaOH 1N. Se omitió la medición de actividad a las 0h, ya que según los ensayos preliminares no hay producción de STB justo en el momento de la inoculación. En la FIGURA 19 se observa que la actividad de STB va aumentando a medida que va aumentando el tiempo de residencia en el minifermentador, la actividad de STB se mantuvo en 200 UA/mL desde las 9 h hasta las 15 horas, donde a las 18 h de incubación la actividad aumento a 400 UA/mL, siendo este valor la mayor actividad alcanzada por la BAL; este resultado indica que la BAL produce una STB con mayor actividad a pocas horas de terminar la incubación, hecho que podría explicarse por déficit de nutrientes y/o micronutrientes necesarios para que la BAL produzca la STB.

FIGURA 18 Consumo de NaOH durante el crecimiento de C. piscicola.

33

La tabla con resultados de actividad para cada tiempo de muestreo se encuentra detallada en el ANEXO 8.

050

100150200250300350400450

3 6 9 12 15 18 21 24

Tiempo (h)

Act

ivid

ad d

e ST

B

(UA

/mL)

0

20

40

60

80

100

120

Con

sum

o de

NaO

H

(mL)

Actividad de STB (UA/mL) Consumo de NaOH(mL)

4.4.3 Contenido proteico de los extractos. Los datos que se utilizaron para construir la curva de calibración que se utilizará para la determinación de proteína soluble, tanto en los extractos como en el medio de cultivo alternativo, se encuentran detallados en el ANEXO 9. Según otra investigación en curso GONZALEZ, (2008), el contenido de proteína soluble para la proteosa peptona y extracto de carne en medio de cultivo D-MRS corresponde a 7078,6 y 5746,5 mg/mL respectivamente; en dicha investigación se encontró óptima la concentración del extracto de harina de lupino al 1,25% y el extracto de harina de pescado con una concentración de 7,5%, extractos que tienen un contenido de proteína soluble correspondiente a 6230,4 mg/mL y 5619,0 mg/mL respectivamente, contenidos proteicos que se asemejan mucho a los contenidos en el medio de cultivo original D-MRS, indicando que corresponde a una combinación adecuada que otorga la misma cantidad proteica entregada por los componentes alternativos en reemplazo de los originales en el medio.

En esta investigación se probaron cuatro formulas distintas, de las cuales la formula 1 contenía una concentración mucho más elevada que la escogida en el estudio anterior con el fin de observar si la bacteria láctica en un medio de cultivo con mayor cantidad de nutrientes es capaz de producir STB con una alta actividad y crecer al mismo tiempo, lo cual no se cumplió, ya que según los resultados de actividad mencionados

FIGURA 19 Actividad de STB en cada tiempo de muestreo para la formulación final del medio de cultivo alternativo y consumo de NaOH durante el crecimiento de C. piscicola.

34

anteriormente indican que no se produjo una STB con elevada actividad capaz de inhibir L. monocytogenes, lo que indicaría que esta cepa láctica se debe someter a ciertas condiciones de estrés para que pueda producir, sin otorgar demasiados nutrientes, lo cual sólo haría crecer al microorganismo, no siendo éste el objetivo del presente estudio. Las otras tres fórmulas se elaboraron con un menor contenido proteico que las establecidas en la investigación anterior, con el fin de observar si se produce STB con menor cantidad de nutrientes y por ende que el medio de cultivo sea mucho más económico, de acuerdo a lo mencionado anteriormente no es recomendable modificar a una concentración más baja de lo ya establecido por GONZÁLEZ, (2008), ya que según los datos de actividad obtenidos estos hubieran sido más altos si no se hubieran cambiado las proteínas de origen vegetal y de origen animal a una menor concentración.

Se realizó también una comparación del contenido proteico de harina de lupino con diferentes fechas de elaboración, aproximadamente con un año de diferencia, estos extractos no presentaron una gran diferencias significativas en cuanto al contenido proteico, correspondiendo la diferencia a 184,3 mg/mL entre ambas harinas de lupino, lo que indicando que la antigüedad de la harina utilizada no influyó en el contenido proteico del extracto preparado para el medio de cultivo alternativo.

Los resultados de cada extracto contenido en la FIGURA 20, se detalla en el ANEXO 10.

010002000300040005000600070008000

H.pescado

3%

H.pescado7,5%

H.lupinoaño 2006

0,5%

H. lupinoaño 2007

0,5%

H.lupinoaño 2006

1,25%

Extractode carne

Proteosapeptona

Muestras

Con

teni

do p

rote

ína

solu

ble

(mg/

mL)

4.4.4 Contenido proteico del medio D-MRS modificado. Se midió el contenido proteico del medio de cultivo alternativo inmediatamente realizada la inoculación y cada seis horas durante las 24 horas de cultivo. De acuerdo a los resultados obtenidos del medio de cultivo alternativo, se observa una disminución de proteína soluble al transcurrir las horas, este descenso indica que no hay un gran consumo de proteína

FIGURA 20 Contenido de proteína soluble de los extractos usados en la formulación del medio de cultivo alternativo y extractos originales en el medio de cultivo caldo D-MRS.

35

por parte de la BAL que esta creciendo en el medio de cultivo, aunque si se observó entre las 12 h y 18 h el mayor descenso de proteína soluble en el medio, el cual es equivalente a 914 mg/mL. Además se observa que en el medio de cultivo alternativo quedó bastante proteína soluble remanente que no es utilizada por la cepa láctica, lo que se comprueba al comparar este contenido proteico con el consumo de NaOH. Todo lo antes mencionado indica la fórmula descrita por GONZALEZ, (2008), como la más adecuada. Los resultados de proteína soluble de cada muestra de caldo de medio de cultivo alternativo contenido en la FIGURA 21, se detalla en el ANEXO 11.

01000200030004000500060007000

0 6 12 18 24

Tiempo (h)

Con

teni

do d

e pr

oteí

na s

olub

le

(mg/

mL)

0

20

40

60

80

100

120

Con

sum

o de

NaO

H

(mL)

Contenido de proteína soluble (mg/mL) Consumo de NaOH (mL)

4.4.5 Consumo de fuente de carbono. Según los tiempos de muestreo del medio de cultivo alternativo, se observa que el consumo de azúcares va disminuyendo considerablemente, de acuerdo a las condiciones iniciales del medio, medio el cual comenzó con un contenido de glucosa18 de 6,500 g/L y terminó a las 24 horas con una concentración de 0,207 g/L. La mayor variación de contenido azúcar ocurre entre las 6 h y las 9 h, lo que es explicado a que en este momento el crecimiento está en la fase exponencial de crecimiento, después de las 12 h el consumo de glucosa por parte de la cepa láctica va disminuyendo lentamente, lo que evidencia que la BAL esta deteniendo su crecimiento, por escasez de la fuente de carbono. El consumo de hidróxido de sodio que evidencia la baja de pH se relaciona directamente con el

18 Como indicativo de sacarosa remanente

FIGURA 21 Contenido de proteína soluble en cada tiempo de muestreo para la formulación final del medio de cultivo alternativo y consumo de NaOH durante el crecimiento de C. piscicola.

36

consumo de la fuente carbono y por tanto resulta inversamente proporcional a la concentración de azúcar remanente en el medio.

Los resultados de cada extracto contenido en la FIGURA 22, se detalla en el ANEXO 12.

0,01,0

2,03,0

4,05,0

6,07,0

0 6 9 12 18 24

Tiempo (h)

Con

cent

raci

ón d

e gl

ucos

a (g

/L)

0

20

40

60

80

100

120

Con

sum

o de

NaO

H

(mL)

Concentración de glucosa (g/L) Consumo de NaOH (mL)

4.4.6 Crecimiento de BAL. Al extraer la muestra de las 3 h se produjo un accidente de laboratorio, por lo cual no registró en los resultados mostrados en la FIGURA 23 y 24. En cuanto al crecimiento la mayor pendiente de crecimiento se evidencia durante las primeras 6 h de incubación, aumentando después el crecimiento más lentamente, de acuerdo a los resultados obtenidos y la curva de crecimiento que se conoce en bibliografías (FIGURA 1) se esperaba que la fase de crecimiento exponencial llegara aun pick de más de 6 h, una de las razones puede ser que no se le dio al medio de cultivo las fuentes mas importantes como lo son la fuente de carbono y nitrógeno, en la proporción adecuada, para que así las BAL tomen estos nutrientes para poder desarrollarse. Como se ha señalado, el consumo de NaOH sí es directamente proporcional con el crecimiento bacteriano, ya que a medida que aumenta el crecimiento de la BAL, hay formación de ácido láctico a partir de la fuente de carbono, el cual en este medio de cultivo alternativo elaborado fue sacarosa, hecho que trae como consecuencia que el pH del medio disminuya a valores inferiores de 6,5, haciéndose necesario la adición de NaOH para mantener el pH. Este hecho ocurre también si el crecimiento bacteriano se compara con la actividad de la STB, la que al transcurrir el tiempo va en aumento. El desarrollo de la cepa bacteriana se puede explicar a que medio de cultivo no provocó un ambiente de estrés para producir STB.

En el ANEXO 3 se detalla los recuentos en placa de la BAL.

FIGURA 22 Concentración de glucosa remanente en cada tiempo de muestreo y consumo de NaOH durante el crecimiento de C. piscicola.

37

1,00E+08

1,00E+09

1,00E+10

0 3 6 9 12 15 18 21 24

Tiempo (h)

Car

noba

cter

ium

pi

scic

ola

(ufc

/mL)

0

20

40

60

80

100

120

Con

sum

o de

NaO

H

(mL)

Carnobacterium piscicola (ufc/mL) Consumo de NaOH (mL)

1,00E+08

1,00E+09

1,00E+10

0 3 6 9 12 15 18 21 24

Tiempo (h)

Car

noba

cter

ium

pi

scic

ola

(ufc

/mL)

050100150200250300350400450

Act

ivid

ad d

e ST

B

(UA

/mL)

R. Carnobacterium piscicola (ufc/mL) Actividad de STB (UA/mL)

FIGURA 23 Recuento en placa mediante el método en superficie y consumo de NaOH durante el crecimiento de C. piscicola.

FIGURA 24 Recuento en placa mediante el método en superficie y actividad de STB durante el crecimiento de C. piscicola.

38

4.4.7 Comparación de costos de los ingredientes del medio de cultivo alternativo al D-MRS

COMPONENTE PRECIO $/ kg

Proteosa peptona 144.560 Extracto de carne 160.060 Extracto de levadura 41.844 Tween 80 (1L) 160.000 Citrato de amonio 70.000 Sulfato de magnesio 17.000 Sulfato de manganeso 31.900

K2HPO4 29.265

KH2PO4 14.207 Sacarosa 28.000

Según los precios detallados de cada componente utilizado en el medio de cultivo descritos en el CUADRO 6, se hará una comparación entre el costo del medio de cultivo alternativo y el medio de cultivo original D-MRS.

COMPONENTE CANTIDAD (g) / L $

Proteosa peptona 10 1.446 Extracto de carne 10 1.601 Extracto de levadura 5 209 Tween 80 (1L) 1 160 Citrato de amonio 2 140 Sulfato de magnesio 0,1 2 Sulfato de manganeso 0,05 2

K2HPO4 3,23 95

KH2PO4 9,54 136

Sacarosa 20 560

Total 4.349

CUADRO 6 Precios ($/ kg) de cada componente del medio de cultivo D-MRS.

CUADRO 7 Costo de preparación de 1 L de medio de cultivo D-MRS.

39

COMPONENTE CANTIDAD / L $

Extracto de harina de lupino* 250 mL 2 Extracto de harina de pescado* 250 mL 145 Agua de levadura* 500 mL 199 Tween 80 (1L) 1 g 160

Citrato de amonio 2 g 140

Sulfato de magnesio 0,1 g 2

Sulfato de manganeso 0,05 g 2 Melaza* 20 g 2 Sacarosa 10 g 280

Total 932

De acuerdo a los costos obtenidos para la preparación de 1 L de medio de cultivo D-MRS y D-MRS modificado detallados en los CUADROS 7 y 8, se puede inferir que el costo del medio modificado corresponde a un 21,43% del valor del medio D-MRS, indicando así que es mucho más rentable su utilización para así disminuir costos de laboratorio, no obstante aunque esta formulación no es la más apropiada a aplicar (se explicó anteriormente que las proporciones adecuadas de extractos proteicos son definidos en estudio anterior) y si se aplicara la formulación adecuada descrita por GONZALEZ, (2008) aún sería más conveniente la utilización de este medio alternativo que el medio de cultivo original D-MRS.

Los costos tanto para el agua de levadura, extracto de harina de lupino y extracto de harina de pescado están detallados en los ANEXOS 14, 15 y 16 respectivamente.

CUADRO 8 Costo de preparación de 1 L de medio de cultivo D-MRS modificado.

40

5. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Bacteriocinas, son un grupo heterogéneo de proteínas anti-bacterianas que varían en el espectro de actividad, el modo de acción, peso molecular, origen genético y propiedades bioquímicas. Actualmente, los conservantes químicos artificiales se emplean para limitar el número de microorganismos capaces de crecer en los alimentos, pero el aumento de la sensibilización de los consumidores de posibles riesgos para la salud asociados a algunas de estas sustancias ha llevado a los investigadores a examinar la posibilidad de usar bacteriocinas producidas por BAL como biopreservantes (ABEE et al., 1995).

Según CHEN et al., (2007) la producción de bacteriocinas en medios de cultivo complejos son por lo general de alto costo (YANG y RAY 1994), donde estudios anteriores reportan múltiples factores que afectan la producción de bacteriocinas, dentro de los cuales se encuentran la cantidad y tipo de nutriente, temperatura y pH.

La acción de bacteriocinas contra los microorganismos sensibles se ve influida en gran medida por factores como el pH, concentración celular, contenido en lípidos, enzimas proteolíticas, y líquido versus sistema sólido (ABEE et al., 1995).

Debido a su eficacia contra L. monocytogenes, la clase IIa bacteriocinas tienen gran potencial como agentes antimicrobianos en los alimentos (EIJSINK et al., 1998). La bacteriocina del C. piscicola L103 se ubicaría en la clase II de acuerdo con lo citado por BORQUEZ (2000)

La especie Carnobacterium, además de ser Buenos candidatos para una biopreservación de alimentos, como muchas cepas secretan compuestos antimicrobianos llamado bacteriocinas, capaz de inhibir las bacterias relacionadas con el como L. monocytogenes (BRILLET et al., 2004).

HIMELBLOOM, (2001), dice que para la producción de STB de Carnobacterium spp. se ha demostrado la importancia la modificación y control de pH en el caldo MRS. Según SCHÖBITZ et al., (2006), la composición del medio de cultivo puede tener efectos muy importantes sobre el rendimiento de la bacteriocina, donde la proteosa peptona promueve el crecimiento de C. piscicola, influyendo así en la producción de STB. Otros componentes sin embargo, no tienen efectos sobre la producción. En el presente estudio se modificaron las proteínas vegetal y animal, fuente de carbohidratos y micronutrientes, en el medio de cultivo D-MRS, donde al modificarse el medio de cultivo se observó una gran influencia de estos componentes en la producción de STB, principalmente de las fuentes proteicas.

Las condiciones más apropiadas para la producción de STB a partir de C.piscicola L103, corresponden a 25ºC, pH 6,5 y con agitación en el medio de cultivo caldo D-MRS (LAMA, 2002).

41

Según GONZÁLEZ (2004) debido a que la cepa utilizada para la producción de la STB se encontraba almacenada por un tiempo largo a -20ºC, puede ser otro factor a considerar, ya que durante el tiempo de almacenamiento pudo haber sufrido transformaciones en su composición espacial, lo que puede haber provocado una menor actividad contra L. monocytogenes Lsa 4/00. Según SCHÖBITZ et al., (1999) la STB de C. piscicola es capaz de inhibir diferentes especies de L.monocytogenes, donde un espectro antibacteriano similar se ha reportado en Piscicolin 126, bacteriocina producida por C. piscicola JG126, además experimentos confirman que C. divergens V41, C. piscicola SF668 y C. piscicola V1 fueron capaces de inhibir en forma parcial o total el crecimiento de las cepas de Listeria, C. piscicola SF668 también posee efecto inhibitorio pero más debil que los anteriormente mencionados (BRILLET et al., 2004) Según AZUMA et al., (2007) recientemente se ha demostrado que Carnobacterium piscicola CS526, aislado de surimi congelados, produce una clase IIa bacteriocina llamado piscicocin CS526 y cuenta con una gran capacidad para inhibir el crecimiento de L. monocytogenes en salmón ahumado en frío (Yamazaki et al. 2003, 2005) Según DUFFES et al., (1999) de 22 cepas aisladas con actividad inhibitoria contra Listeria fueron todos carnobacterium, de la cual el 68% eran C. piscicola y el 11% C. divergens.

La primera etapa de esta investigación consistió en escoger las proporciones adecuadas tanto de sacarosa y/o combinación melaza-sacarosa, harina de lupino y harina de pescado y finalmente agua de levadura, en reemplazo de sacarosa, proteosa peptona, extracto de carne y extracto de levadura respectivamente, los cuales son componentes del medio de cultivo original caldo D-MRS, los ensayos preliminares se realizaron con el fin de producir STB de la cepa BAL B a nivel de matraces de 50 mL con un inóculo del 10% de la BAL, estos ensayos arrojaron valores más elevados de actividad de STB que los obtenidos a nivel de minifermentador con la formulación final del medio de cultivo alternativo, el cual se inoculó igualmente al 10%.y se aumento el volumen de medio de cultivo a 500 mL.

Según JAY (2000) Un aspecto relevante a considerar es el oxígeno, ya que como se utiliza un medio de cultivo líquido, este debe proporcionarse de forma continua. La aireación de los medios de cultivos líquidos se realiza generalmente con aire o mezclas de oxígeno, nitrógeno y anhídrido carbónico. Hay que considerar que, incluso en un fermentador bien aireado o en las aguas naturales, la distribución de oxígeno no es siempre homogénea. Por aireación y agitación mecánica se consigue en el recipiente de cultivo un suministro óptimo de oxígeno y una distribución homogénea lo más rápido posible de los nutrientes contenido en el medio de cultivo.

Por lo antes mencionado se puede decir que al no controlar tanto la agitación como la aireación durante el cultivo batch a nivel de minifermentador, no se proporcionó el oxígeno necesario requerido por el medio de cultivo que contiene la cepa láctica C.piscicola, y por ende influye en la actividad de STB alcanzada por el mismo.

En cuanto al costo que conlleva la elaboración de este medio de cultivo alternativo formulado, resultan ser bastantes más bajos comparados con el medio de cultivo original D-MRS. Estos costos se detallan en los CUADROS 7 y 8.

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6. CONCLUSIÓN

• Ensayos preliminares mostraron que es factible reemplazar un 50% de agua de levadura como componente acuoso del medio de cultivo alternativo en reemplazo del extracto de levadura, componente del medio original, caldo D-MRS. Esta formulación escogida obtuvo 800 UA/mL como mayor producción de STB a nivel de matraces.

• La utilización de harina de lupino y harina de pescado a una concentración de 0,5% y 3% respectivamente, dieron como resultado la mayor producción de STB de 200 UA/mL, valor que está por debajo de 400 UA/mL, correspondiente al medio de cultivo testigo, D-MRS. Debido a esto debe mantenerse la proporción escogida en estudio anterior correspondiente a 1,25% harina de lupino y 7,5% harina de pescado dando la mayor producción de STB de 800 UA/mL a nivel de matraces

• La utilización de una combinación de 20 g/L de melaza y 10 g/L de sacarosa obtuvo una actividad de 200 UA/mL como mayor producción de STB, valor inferior al obtenido por el medio de cultivo D-MRS, lo que indica claramente que esta fuente de carbono no debe modificarse o bien se podrían probar nuevas concentraciones para la concentración de melaza o combinación melaza-sacarosa.

• A nivel de minifermentador la mayor producción de STB obtenida fue de 400 UA/mL correspondiente a la fase estacionaria y principio de la fase de muerte. Este bajo valor de actividad corrobora que se debe mantener la proporción ya establecida para los contenidos proteicos y mantener o cambiar las fuentes de carbono, hecho que probablemente aumentaría la actividad de STB obtenida por el medio de cultivo alternativo.

• El medio de cultivo alternativo elaborado es considerablemente más económico y por ende rentable que el medio de cultivo original D-MRS, lo que también se cumpliría si al medio de cultivo alternativo no se modificaran las proporciones de extractos proteicos y se mantuvieran los ya establecidos por GONZALEZ, (2008) y si también se mantuviera la proporción de carbohidratos antes establecida.

43

7. RESUMEN

Este trabajo tuvo como objetivo diseñar un medio de cultivo económico y alternativo para la producción de la sustancia tipo bacteriocina de Carnobacterium piscicola L103, inhibitoria de Listeria monocytogenes, generado por el reemplazo de las fuente de carbono y micronutrientes en la composición original del medio D-MRS. Para el diseño del medio de cultivo alternativo se realizaron tres ensayos preliminares, para elegir la mejor o a la más adecuada proporción de los ingredientes de reemplazo, conforme a la actividad de STB mostrada. El primer ensayo para reemplazar el extracto de levaduras por el agua de levadura dio buenos resultados arrojando los mayores valores de actividad de STB para la utilización de un 50% de agua de levadura. El segundo ensayo para ver si resultase adecuada la utilización de melaza o combinación de melaza-sacarosa en reemplazo de la sacarosa en el medio de cultivo original, indicó que la formula más adecuada corresponde a 20 g/L de melaza y 10 g/L de sacarosa, no obstante los valores de actividad nunca superaron a los obtenidos por el testigo caldo D-MRS. El tercer y ultimo ensayo preliminar referido a la utilización de extractos de harina de lupino y harina de pescado, en reemplazo de la proteosa peptona y extracto de carne respectivamente, arrojaron valores de actividad de STB muy bajos en comparación al estándar, pero de las cuatro fórmulas probadas, la fórmula que contiene una concentración del 0,5% de extracto de harina de lupino y 3% de extracto de harina de pescado obtiene los mayores valores de actividad. El ensayo final realizado en fermentador con el medio alternativo conteniendo las fuentes proteicas de reemplazo, mostró un gran crecimiento y baja actividad de STB, comprobándose que no es factible el reemplazo de todos los componentes en las proporciones probadas. Como los ensayos preliminares mostraron la conveniencia de usar agua de levadura, por lo tanto con respecto de las fuentes proteicas se deberían mantener las proporciones ya definidas en otro estudio anterior. Un somero análisis de costos de los nuevos ingredientes indica la conveniencia del reemplazo, aún utilizando las proporciones propuestas por estudio anterior.

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SUMMARY

This study aimed to develop a culture medium and economic alternative for the production of the bacteriocin like substance of Carnobacterium piscicola, inhibitory of Listeria monocytogenes generated by the replacement of carbon source and micronutrients in the original composition of the medium-D MRS. For the design of the alternative culture medium, three preliminary tests were conducted to select the best or most appropriate proportion of ingredients replacement, according to the activity of BLS shown. The first test to replace the yeast extract for water yeast was successful throwing the higher values of activity of BLS for the use of a 50% water yeast. The second test to see if it was appropriate use of molasses or combination of molasses-sucrose to replace sucrose in the original culture medium, indicated that the most appropriate formula corresponding to 20 g/L molasses and 10 g/L sucrose, however these values of activity never exceeded those obtained by the witness broth D-MRS. The third and last preliminary test referred to the use of extracts of lupin flour and fishmeal to replace the proteosa peptone and meat extract respectively threw values activity BLS very low compared to the standard, but of the four tested formulas, the formula contains a concentration of 0.5% lupin flour extract and 3% extract of fishmeal gets the highest values of activity. The last test conducted in fermenter with alternative sources containing protein replacement, showed a high growth and low activity of BLS, checking that it is not feasible to replace all components in the proportions tested. As preliminary tests showed, the advantages of using yeast water, therefore with respect to the protein sources should be maintained proportions already defined in other previous study. A cursory analysis of costs of new ingredients indicates the suitability of replacing, even using the proportions suggested by previous studies.

45

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48

9. ANEXOS

49

ANEXO 1

Determinación de proteínas de acuerdo al método de LOWRY et al., ( 1951)

Principio. La determinación se basa en el desarrollo de color debido a la reacción de los enlaces peptídicos de las proteínas y cobre alcalino del reactivo y la reducción del fosfomolibdato – fosfotungsteno del reactivo Folin – Ciocalteau, por los aminoácidos aromáticos.

Equipos y materiales. - espectrofotómetro.

- pipetas 0,5 y 1,0 ml.

- Jeringa Hamilton 100 µl.

- Solución A: Na2 CO3 2% P/V disuelto en NaOH 0,1 N.

- Solución B: CuSO4 x 5 H2O al 1% P/V y Tartrato de Na y K al 2% P/V.

- Solución C: mezclar solución A y B en proporción 50:1.

- Solución E: reactivo Folin – Ciocalteau 1N.

A una cantidad de k caseína, se le adiciona solución A y B las cuales reaccionan con los enlaces peptídicos. Al agregar reactivo Folin – Ciocalteau se desarrolla color azul al reaccionar con los aminoácidos aromáticos. La intensidad del color se mide en un espectofotómetro a 750 nm.

Determinación. - Se mide 0,6 ml de k caseína diluida en agua (1 ml en 3 ml).

- Se agrega 3 ml de solución C y 0,3 ml de reactivo Folin – Ciocalteau 1N.

- Se deja 30 minutos a temperatura ambiente.

- Se mide la absorbancia a 750 nm.

Blanco: 0,6 ml de agua.

Se expresan los resultados en % de proteína en la muestra original.

Referencia CASANOVA (2001)

50

ANEXO 2

Curva de calibración para determinación proteica de acuerdo a método propuesto por LOWRY et al., (1951)

Curva estándar. - Solución patrón: seroalbúmina de bovino (BSA) 2 mg/ml.

- Medir de la solución de BSA 10, 20, 30, 40, 50 y 60 µl (20, 40, 60, 80, 100 y 120 µg de proteína) en tubos de ensayo, agregar agua hasta completar 0,6 ml.

- Se agrega a cada tubo 3 ml de solución C y se deja a temperatura ambiente 10 min.

- Se agrega 0,3 ml de reactivo Folin – Ciocalteau 1N.

- Se deja 30 minutos a temperatura ambiente.

- Se mide la absorbancia a 750 nm.

- Se grafica µg de proteína v/s D.O 750 nm

D.O. 750 nm. µL solución BSA ( 2mg/mL) µg de proteína

1º y 2º muestreo 3º y 4º muestreo 10 20 0,077 0,103 20 40 0,182 0,157 30 60 0,270 0,275 40 80 0,334 0,340 50 100 0,417 0,419 60 120 0,474 0,485

Para efectuar las determinaciones correspondientes a los cuatro muestreos se construyeron dos curvas de calibración. Una se utilizó para el muestreo 1 y 2, y la restante para el muestreo 3 y 4.

51

Continuación ANEXO 2

Muestreo 1 y 2

y = 0,0039x + 0,0169R2 = 0,9911

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 20 40 60 80 100 120 140

µg proteína/0,6mL

D.O

Muestreo 3 y 4

y = 0,0039x + 0,0204R2 = 0,9919

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 20 40 60 80 100 120 140

µg proteína/0,6mL

D.O

Referencia CASANOVA (2001)

52

ANEXO 3

Esquema de recuento en placa de C. piscicola por el método en superficie

53

ANEXO 4 Resultados de actividad de STB y pH para ensayo de agua de levadura y análisis

estadístico: “Dócima de Friedman”

Actividad de STB para ensayo de agua de levadura:

Nº Fórmula Tiempo (h) Actividad ( UA/mL) pH 0 0 6 6 400 6 1

12 400 5,5 0 0 6 6 400 6 2

12 800 5,5 0 0 6 6 200 6 3

12 400 5,5 0 0 6,5 6 200 6,5 Testigo D-MRS

12 400 6

Dócima de Friedman:

Rangos

2,673,332,002,00

FÓRMULA1FÓRMULA2FÓRMULA3DMRS

Rangopromedio

Estadísticos de contrastea

34,714

3,194

NChi-cuadradoglSig. asintót.

Prueba de Friedmana.

54

ANEXO 5

Resultados de actividad de STB y pH para ensayo de carbohidratos y análisis estadístico: “Dócima de Friedman”

Actividad de STB para ensayo de carbohidratos:

Nº Fórmula Tiempo (h) Actividad (UA/mL) pH 0 0 6,5 6 100 6 1

12 200 5,5 0 0 6,5 6 200 6 2

12 200 5,5 0 0 6,5 6 100 6 3

12 200 5,5 0 0 6,5 6 200 6,5 Testigo D-

MRS 12 400 6


Rangos

2,002,672,003,33

FÓRMULA1FÓRMULA2FÓRMULA3DMRS

Rangopromedio

Estadísticos de contrastea

34,714

3,194



55

ANEXO 6

Resultados de actividad de STB y pH para ensayo de proteínas y análisis estadístico: “Dócima de Friedman”

Actividad de STB para ensayo de proteínas:

Nº Fórmula Tiempo (h) Actividad (UA/mL) pH 0 0 6,5 6 100 6 1

12 100 5,5 0 0 6,5 6 100 6 2

12 100 6 0 0 6 6 100 6 3

12 200 5,5 0 0 6 6 50 6 4

12 100 5,5 0 0 6,5 6 200 6,5 Testigo D-

MRS 12 400 6


Rangos

2,672,673,332,004,33

FÓRMULA1FÓRMULA2FÓRMULA3FÓRMULA4DMRS

Rangopromedio

Estadísticos de contraste a

37,000

4,136



56

ANEXO 7

Aplicación del medio de cultivo modificado a nivel de fermentador: Resultados del consumo de NaOH

Intervalo de Tiempo (h) Consumo NaOH (mL) 1N

Consumo NaOH (mL) 1N y 2N

3 3 3 (1N) 6 20,5 20,5 (1N) 9 50,5 50,5 (1N)

12 82 82 (1N) 15 90 86 (2N) 18 95 88,5 (2N) 21 98 90 (2N)

24 98,6 90,3 (2N)

57

ANEXO 8

Aplicación del medio de cultivo modificado a nivel de fermentador: Resultados de la Actividad de STB

Tiempo Actividad de STB ( UA/mL) Consumo de NaOH ( mL) 3 50 3 6 100 20,5 9 200 50,5

12 200 82 15 200 90 18 400 95 21 400 98

24 400 98,6

58

ANEXO 9

Curva de calibración usada en el método de Lowry

Curva de calibración

µg Proteína/0,6mL D.O

20 0,111

40 0,226

60 0,292

80 0,364

100 0,447

120 0,516

y = 0,0039x + 0,05R2 = 0,9932

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 20 40 60 80 100 120 140µg Proteína/0,6mL

D.O

59

ANEXO 10

Aplicación del medio de cultivo modificado a nivel de fermentador: Resultado del contenido proteico de los extractos

Muestra mg Proteína/mL

Harina pescado al 3% 1864,3

Harina pescado al 7,5% 5619,0

Harina lupino año 2006 al 0,5% 2305,0



Extracto de carne 5746,5

Proteosa peptona 7078,6

60

ANEXO 11

Aplicación del medio de cultivo modificado a nivel de fermentador: Resultado del contenido proteico del medio de cultivo D-MRS modificado

Absorbancia Tiempo (h) 1º medición 2º medición Promedio

medicionesµg

Proteína/0,6mL Dilución 0 0,254 0,260 0,257 53,077 75 6 0,258 0.236 0,247 50,513 75

12 0,242 0,240 0,241 48,974 75 18 0,214 0,211 0,213 41,667 75 24 0,213 0,195 0,204 39,487 75

Tiempo (h) mg Proteína/mL Consumo NaOH (mL) 0 6635 0 6 6314 20,5 12 6122 82 18 5208 95 24 4936 98,6

61

ANEXO 12

Aplicación del medio de cultivo modificado a nivel de fermentador: Resultado de la concentración de glucosa

Tiempo (h)

D.O 546 nm

D.O 546 nm

D.O prom 546nm [glucosa](g/L)

Consumo NaOH (mL)

0 0,860 0,960 0,910 6,500 0

6 0,516 0,471 0,494 3,525 20,5

9 0,064 0,070 0,067 0,479 50,5

12 0,057 0,042 0,050 0,354 82

18 0,047 0,046 0,047 0,332 95

24 0,037 0,021 0,029 0,207 98,6

62

ANEXO 13

Aplicación del medio de cultivo modificado a nivel de fermentador: Resultado del crecimiento de BAL

Tiempo (h) Recuento C. piscicola (ufc/mL) Consumo de NaOH (mL)

0 2,00E+08 0

6 4,00E+09 20,5

9 4,00E+09 50,5

12 4,30E+09 82

18 4,40E+09 95

21 5,40E+09 98

24 5,60E+09 98,6

63

ANEXO 14

Precio de elaboración de agua de levadura

Para efectuar el rendimiento de costo de la preparación de 1 L de medio de cultivo D-MRS modificado, se considero un volumen bruto de 600 mL de agua de levadura a preparar, debido a que en la etapa de decantación queda precipitada la levadura en el fondo y se pierde solución, de los 600 mL preparados se pueden obtener los 500 mL de agua de levadura pura (sin precipitado) requeridos para la preparación de 1 L de medio modificado.

Se considero una concentración al 20% de solución, para que al mezclar con los otros componentes acuosos quede en la concentración final deseada correspondiente a un 10%

Se tiene como referencia que el kilo de crema de levadura tiene un valor de $1656.

COMPONENTE CANTIDAD (g) $Crema de levadura 120 199

199Total

64

ANEXO 15

Precio de elaboración de extracto de harina de lupino El extracto de harina de lupino al prepararse solo en agua destilada y no tampón fosfato no adquiere mayor costo que el de la materia prima, en este caso harina de lupino. Dicho extracto debe estar a una concentración final del 0,5%, y como corresponde a la cuarta parte del volumen total del medio, su concentración se cuadruplica, y por ende también la cantidad en gramos requerida.

Se considera la preparación de un volumen 500 mL de extracto, ya que al decantar la solución se pierde gran parte del sobrenadante utilizado.

Se tiene como referencia que el kilo de harina de lupino tiene un valor de $220.

COMPONENTE CANTIDAD (g) $ Harina de lupino 10 2

Total 2

65

ANEXO 16

Precio de elaboración de extracto de harina de pescado

Para efectuar el rendimiento de costo de la preparación de 1 L de medio de cultivo D-MRS modificado, se considero un volumen bruto de 500 mL, debido a que en la etapa de decantación queda precipitada parte de la harina y se pierde sobrenadante, de los 500 mL preparados se pueden obtener los 250 mL de extracto de harina de pescado requeridos para la preparación de 1 L de medio modificado.

Dicho extracto debe estar a una concentración final del 3,0%, y como corresponde a la cuarta parte del volumen total del medio, su concentración se cuadruplica, y por ende también la cantidad en gramos requerida.

Se tiene como referencia que el kilo de harina de pescado tiene un valor de $500

COMPONENTE CANTIDAD (g) $ Harina de pescado 60 30

K2HPO4 1,62 47

KH2PO4 4,77 68

Total 145

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