DISRUPCIÓN CELULAR

Operaciones y Procesos Biotecnológicos II

DISRUPCIÓN CELULAR

1) Estudiar los procesos habitualmente empleados en la

industria para separar y/o purificar productos de

interés.

Objetivos de Operaciones y Procesos Biotecnológicos II:

2) Evaluar las variables que permiten optimizar los

procesos habitualmente involucrados en la separación

de residuos insolubles, el aislamiento y la purificación

de un determinado producto.

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Productos de interés liberados

naturalmente al medio

Disrupción celular Lípidos

Proteínas recombinantes

Enzimas

Antibióticos

?

ADN, ARN Microorganismo

Productor

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DISRUPCIÓN CELULAR

Proceso General

Que clase de célula se quiere destruir?

Cuál es el producto que queremos

extraer?

Selección del método de

disrupción celular a emplear

Puesta a punto del método seleccionado

Evaluación acerca de los rendimientos

obtenidos

Conclusiones

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DISRUPCIÓN CELULAR

¿Qué es lo que debemos

conocer de la célula a la

hora de diagramar una

disrupción?

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DISRUPCIÓN CELULAR

Estructura de la Membrana Plasmática

Membrana Plasmática

- Actualmente el modelo que describe la membrana plasmática es el del

“mosaico fluido”.

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DISRUPCIÓN CELULAR

Las principales funciones de la membrana plasmática son:

Membrana Plasmática

Servir de sitio estable para la catálisis enzimática.

Servir de receptores que reconocen señales de determinadas moléculas

y transducir la señal al citoplasma.

Ayudar a la compartimentalización sub-celular .

Protección.

Comunicación intercelular.

Regular el intercambio de sustancias entre el interior y exterior celular

(lo que entra y sale de la célula).

Aislar selectivamente el contenido de la célula del ambiente externo.

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DISRUPCIÓN CELULAR

o El tipo de célula con el que se vaya a trabajar es importante:

o La pared celular es una estructura rígida y compleja que

protege a la célula del ambiente, manteniendo su forma y

presión osmótica.

Pared Celular

- células vegetales (plantas y algas)

- hongos y levaduras

- bacterias (Gram positivas y Gram negativas)

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DISRUPCIÓN CELULAR

- La red de mureína (peptidoglicano) esta

muy desarrollada (puede presentar hasta

50 capas).

- Es frecuente la presencia de los

aminoácidos L-diaminopimélico o de

lisina.

- En ella se encuentran ácidos teicoicos y

lipoteicoicos.

- No presentan lipo-polisacáridos.

- Presentan una sola bicapa lipídica.

Pared Gram Positiva

- Presentan bajo contenido proteico.

- Alto contenido de lípidos.

Staphylococcus Operaciones y Procesos Biotecnológicos II

DISRUPCIÓN CELULAR

- La red de mureína presenta una sola

capa.

- Contiene únicamente meso-

diaminopimélico y nunca contiene lisina.

- Hasta ahora no han podido

encontrarse ácidos teicoicos o lipo-

teicoicos.

- Se encuentran grandes cantidades de

lipoproteínas y lipo-polisacáridos que

representan hasta el 80 % del peso seco

de la pared celular.

- Tienen dos bicapas lipídicas.

- Presentan porinas en la membranas

externa.

Pared Gram Negativa

E. Coli Operaciones y Procesos Biotecnológicos II

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Pared celular de Hongos y Levaduras

- Es una estructura muy gruesa (100-200 nm)

- La pared celular esta compuesta por dos capas de polisacáridos, una

capa interna transparente y amorfa, constituida principalmente de β-1,3 y β-1,6-glucanos. En la capa externa se encuentran ubicadas las mano-proteínas, ancladas a la capa interna de β-glucanos o bien atravesándola.

- Representa del 15-25% del peso celular en base seca.

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Pared celular Células Vegetales

- Pared primaria: mide entre

100 y 200 nm de espesor,

compuesta entre un 9 y un

25% de celulosa

- Laminilla media: Es el lugar

que une las paredes primarias

de dos células contiguas.

- Pared secundaria: (cuando existe) se

relaciona con la especialización de cada tipo

celular. A diferencia de la pared primaria,

contiene una alta proporción de celulosa,

lignina y/o suberina. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II

DISRUPCIÓN CELULAR

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DISRUPCIÓN CELULAR

Células Animales

Micelios

Bacilos Gram (-)

Bacilos Gram (+)

Células Vegetales

Levaduras

Cocos Gram (-)

Esporas

Dificultad Para la Disrupción Celular

Métodos de Disrupción Celular

Métodos mecánicos:

- Son inespecíficos. -Suelen ser mas efectivos

que los métodos químicos.

Se basan en fuerzas de corte (shear stress) que deforman las células

hasta el rompimiento de sus cubiertas.

- Generalmente son mas

fáciles de escalar que los

métodos no-mecánicos .

- La separación del producto

deseado de otros materiales (ac.

nucleicos, proteínas, trozos de la

pared celular, etc.) puede llegar a

ser dificultosa.

- Pueden llegar a dañar productos

lábiles.

- Requieren mucha energía.

- Generan elevadas temperaturas.

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DISRUPCIÓN CELULAR

Métodos de Disrupción Celular

Métodos no mecánicos:

- Por sí mismos, estos métodos

no suelen ser muy eficientes.

- Por lo general son menos

severos que los mecánicos.

Rompen las cubiertas celulares induciendo la lisis celular, a través

de medios químicos, físicos o enzimáticos.

- No generan grandes daños

a las célula, facilitando la

posterior purificación del

producto de interés.

- Son mas específicos.

- Pocos métodos no mecánicos

pueden llegar a ser escalados

exitosamente.

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DISRUPCIÓN CELULAR

Métodos mecánicos

Homogenizadores de alta presión

Se aplica una elevada presión a una

suspensión de células forzándolas a

través de una válvula, sometiendo a las

células a un alto estrés de corte,

rompiendo las membranas.

Es uno de los mas utilizados para disrupción celular a gran escala.

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DISRUPCIÓN CELULAR

El mecanismo de disrupción se

daría por fuerzas de corte en la

región de la válvula, cavitación

(debido a las regiones de baja

presión generadas) y al impacto

contra el anillo.

Métodos mecánicos

Homogenizadores Microfluidizadores (microfluidizer homogenizer)

El mecanismo de disrupción

realizado por este equipo

genera partículas de mayor

tamaño que el homogenizador

de alta presión.

En los microfluidizadores, el líquido se divide en dos o más corrientes que se

bombean a elevadas presiones (en algunos equipos más de 270 MPa) y

grandes velocidades, unas contra otras en un ángulo de 180° cayendo

repentinamente la presión tras chocar ambas corrientes.

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DISRUPCIÓN CELULAR

Métodos mecánicos

Bead mills (molinos a esferas)

- Aspectos a considerar al trabajar con estos equipos: tamaño de las

esferas (0,2-15mm), cantidad y material de las esferas; velocidad de

agitación; temperatura de trabajo; velocidad de flujo y concentración de

la suspensión a tratar.

- Básicamente consiste en un agitador a

discos montado sobre un motor central

que gira en una cámara central, la cual

es cargada con esferas de vidrio, metal

u otro material.

- Son de los mas utilizados a gran escala.

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DISRUPCIÓN CELULAR

Métodos mecánicos

- Las ondas de ultrasonido crean muchas micro-

burbujas en muchos sitios de nucleación

dentro de la suspensión celular. Estas micro-

burbujas luego colapsan implosionando durante

el período de rarefacción (compresión) de la

onda.

- Este fenómeno, denominado cavitación,

produce un shock de ondas muy intenso,

generando un fuerte estrés local, deformando

al límite las células y produciendo así su

consecuente ruptura.

- El ultrasonido utiliza frecuencias entre 20 y 50

kHz.

Sonicadores (ultrasonido)

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DISRUPCIÓN CELULAR

Métodos no-mecánicos

Dentro de estos tipos de métodos podemos clasificar tres

sub-clases principales:

3) Métodos enzimáticos

2) Métodos físicos

1) Métodos químicos

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Métodos no-mecánicos

1) Métodos Químicos

Agentes Caotrópicos (urea, clohidrato de guanidina)

Interfieren con los enlaces no covalentes (puentes de hidrógeno,

fuerzas de van der Walls) desorganizando la estructura del agua

haciéndola menos hidrofílica, debilitando las interacciones soluto-

soluto.

Tratamiento con álcalis (hidróxido de sodio e hipoclirito)

Se produce la saponificación de los lípidos de las membranas. Es una

técnica muy severa pero efectiva y de bajo costo, siempre y cuando el

producto de interés sea resistente a la degradación a pH elevados.

Tratamiento con solventes orgánicos (cloroformo, tolueno)

Los solventes orgánicos permeabilizan las membranas celulares

disolviendo componentes hidrofóbicos de la pared, como los

fosfolípidos de la membrana interna en bacterias Gram (-).

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Métodos no-mecánicos

1) Métodos Químicos

Agentes Quelantes (EDTA):

Este agente quela los iones Ca2+ y Mg2+ que unen los LPS adyacentes

haciendo que se liberen parte de los LPS conteniendo proteínas y

fosfolípidos de la membrana (Gram -).

Antibióticos:

Son efectivos contra bacterias Gram (-) (β-lactámicos) . Distintos

antibióticos causan la lisis por distintos mecanismos. No se utilizan a

gran escala.

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DISRUPCIÓN CELULAR

Métodos no-mecánicos

Tratamiento con detergentes

La efectividad del método radica en la

química del detergente, ya que son

anfipáticos.

Se clasifican en tres tipos: catiónicos

(sales de tetra-alquil-amonio, pH

básico), aniónicos (SDS, pH ácido) y

no-iónicos (Triton-X,).

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DISRUPCIÓN CELULAR

1) Métodos Químicos

Forman micelas con los lípidos de las

membranas, desestabilizándolas.

Métodos no-mecánicos

Shock osmótico

- Las células con paredes celulares son mas difíciles de romper.

- El estrés osmótico es generado cuando las células son situadas en

medios hiper/hipotónicos.

- Es el método químico mas simple.

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2) Métodos Físicos

Congelamiento/descongelamiento:

Los cristales de hielo que se forman y crecen durante el

congelamiento, rompen mecánicamente la integridad del interior de

la membrana celular, haciéndola mas permeable.

Enfriamiento lento Enfriamiento rápido

Se ha visto que la congelación lenta no funciona tan bien como la

rápida. La congelación rápida lesiona más específicamente las

membranas celulares produciendo lisis celular.

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2) Métodos Físicos

Métodos no-mecánicos

Descompresión:

- Es un proceso por el cual las células se mezclan con un gas

presurizado por un tiempo específico. El gas entra en las células y

luego al liberar la presión aplicada el mismo se expande causando

la disrupción.

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Termólisis:

- Es un proceso bastante común a gran escala. Las células son

llevadas a mayores temperaturas con el fin de romper o debilitar la

membrana externa.

2) Métodos Físicos

Métodos no-mecánicos

Métodos no-mecánicos

Disrupción Enzimática:

Lisozima

(muramidasa)

- La principal limitación de este método es su elevado costo. La

inmovilización puede ser una herramienta útil para la reducción de

costos

- La lisis enzimática es un método muy

preciso, pero que requiere de una

comprensión precisa de la estructura de

las paredes celulares que se desean

destruir.

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3) Métodos Enzimáticos

Auto-lisis:

Métodos no-mecánicos

- Por sí mismo es un mecanismo lento. Lo que se hace es

transformar cepas a fin de hacer estos sistemas auto-líticos mucho

mas activos, introduciendo genes que codifican antibióticos y

enzimas que degraden mas rápidamente las distintas organelas y

membranas celulares.

- Es un proceso por el cual las células inducen su propia destrucción.

Se produce la activación de señales que activan la liberación de

enzimas que degradan las organelas y membranas de las mismas

células.

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3) Métodos Enzimáticos

Métodos Combinados

Puede verse que los distintos métodos de disrupción poseen diversos

principios de acción, lo que hace factible su combinación de forma

sinérgica para aumentar el rendimiento del proceso en un solo

método combinado.

Métodos no-mecánicos combinados

Disrupción mecánica con pre-tratamientos no mecánicos

Evaluación de la eficiencia de los métodos de disrupción

Métodos directos: Consisten en contar el número total de células

destruidas e intactas. - Recuentos en cámara.

- Contadores electrónicos.

- Recuentos en placa.

- Utilización de centrífugas analíticas.

Métodos indirectos: Consisten en determinar el grado de

liberación al medio externo de algún metabolito celular luego de

que las membranas celulares son destruidas (determinación de

proteínas solubles, actividades enzimáticas, etc.).

Se determina el rendimiento alcanzado en función de la eficiencia de los

métodos realizados, teniendo en cuenta no solo la disrupción celular o

el porcentaje de producto recuperado, sino también las condiciones

operativas que se necesitaron para llevarlo a cabo.

Cálculo del Rendimiento Alcanzado

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DISRUPCIÓN CELULAR

Conclusiones

- Existen una gran diversidad de métodos de disrupción.

- Necesidad de desarrollar y poner a punto técnicas que permitan

la determinación de la eficiencia de los métodos utilizados.

- Cada método posee diferentes principios de acción, por lo que

presentan una serie de ventajas y desventajas frente a los demás.

- Existen distintas clases de microorganismos productores con una

gran diversidad de metabolitos de interés.

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- No existen protocolos universales de disrupción celular.

¿CUÁL ES EL MEJOR MÉTODO?