Distemper

DeteccindelvirusDistempercaninoporRTPCRentiemporealycaracterizacingenticadeaislamientosdelRodelaPlatamedianteelanlisisdelosgenesdela

hemaglutininaylaprotenadefusin

Lic.NicolsSarute

TesisdeMaestraPEDECIBABiologa

SubreaGentica

Orientadora:Dra.YaninaPanzera

CoOrientador:Dr.RubenPrez

SeccinGenticaEvolutiva

Agradecimientos

A la Seccin Gentica Evolutiva por permitirme realizarmis estudios de posgrado,especialmenteamisorientadoresYaninayRuben.

Aloschicos/asdellaboratorio,compaerosdetrabajoyamigosdelavida.

ALourdesporfacilitarnoslasmuestrasycolaborarconnuestroestudio.

AMartnporsuinagotableenerga,apoyoypalabrasdealiento.

A las personas que en algnmomento transitaron por el proyecto CDV, y que ansiguenestandopresentes.

Alafamiliayamigos.

A laAgenciaNacionalde Investigacin (ANII),ProgramadeDesarrollode lasCienciasBsicas (PEDECIBA), Red AMSUDPasteur y Comisin Sectorial de InvestigacinCientfica(CSIC)porapoyarelproyectoatravsdebecaspararealizarestudiosenelpasyenelexterior,yparadifundirnuestrosresultados.

Gracias.

Abreviaturasydefiniciones I

Publicaciones II

Resumen III

1.INTRODUCCIN 11.1VirusDistempercanino 11.1.1Clasificacintaxonmica 11.1.2Estructura,genomayprotenasvirales 11.1.2.1Estructuraviral 11.1.2.2Genomaviral 21.1.2.3Protenasvirales 31.1.2.3.1Protenadenucleocpside(N) 31.1.2.3.2ProtenascodificadasporelgenP/V/C:fosfoprotenaP 3yprotenasVyC1.1.2.3.3Protenadematriz(M) 41.1.2.3.4Protenadefusin(F) 41.1.2.3.5Protenahemaglutinina(H) 51.1.2.3.6Protenalarge(L) 561.1.3CicloreplicativodeCDV 61.1.3.1Uninyfusinvirusclula 61.1.3.2Transcripcinyreplicacindelgenomaviral 61.1.3.3Formacindelcomplejoribonucleoprteico(RNP)ybrotacin 71.1.3.4Propagacinentreclulashusped 781.2Distemper:patognesis,sintomatologaclnica,epidemiologa, 8prevencinycontrol1.2.1Patognesis 81.2.2SintomatologaClnica 9101.2.3Epidemiologa 111.2.4Prevencinycontroldelaenfermedad 11121.3DeteccindeCDVenmuestrasclnicas 131.3.1Ensayosserolgicos 141.3.2Tcnicasmoleculares 141.3.2.1RTPCRtiempofinal 14151.3.2.2RTPCRentiemporeal 15161.4CaracterizacingenticadeCDV 161.4.1Hemaglutinina 17191.4.2Pptidosealdelaprotenadefusin 19201.5Antecedentesdelgrupodetrabajo 20211.6Hiptesisdetrabajo 221.7Objetivos 22

2.MATERIALESyMTODOS2.1Muestras 232.2Extraccindelgenomaviral 23262.3EnsayosderetrotranscripcinyPCR 262.3.1Retrotranscripcin 26272.3.2PCRentiemporeal 27 2.3.3PCRtiempofinal 292.3.3.1AmplificacindelasecuenciacodificantedelgenH 292.3.3.2AmplificacindelaregincodificantedelFsp 292.4Electrofresis 302.5PurificacindelosfragmentosamplificadosporRTPCR 312.6ClonacindelosampliconesdelgenH 3133 2.7Secuenciacin 332.8Anlisisbioinformticodesecuenciasnucleotdicasyaminoacdicas 332.8.1Diseodecebadoresysondas 33342.8.2Edicinyalineamientodesecuenciasnucleotdicas 342.8.3Anlisisfilogenticos 342.8.3.1Hemaglutinina 352.8.3.1.1Anlisisdelasecuenciacompleta 352.8.3.1.2Anlisisdeunasecuenciaparcial(134aa) 352.8.3.2Pptidosealdelaprotenadefusin 35 2.8.4Identificacindesitiosdeglicosilacin 352.8.5Estudiodepresionesselectivas 36

3.RESULTADOS

3.1DeteccindelgenomaviralporRTPCRentiemporeal 40 3.2CaracterizacingenticadeaislamientosdelRodelaPlata 433.2.1Hemaglutinina 433.2.1.1AmplificacinporRTPCRtiempofinal 433.2.1.2Edicinyanlisisdesecuenciasnucleotdicasyaminoacdicas 443.2.1.3Estudioscomparativos 44453.2.1.4Anlisisfilogenticos 533.2.1.4.1Anlisisdelasecuenciacompletadelahemaglutinina 533.2.1.4.2Anlisisdesecuenciasparciales(134aminocidos) 553.2.1.5ComparacinconlacepavacunalOP 573.2.1.6Identificacindesitiospotencialesdeglicosilacin 57 3.2.1.7Estudiodepresionesselectivas 583.2.2Pptidosealdelaprotenadefusin 59 3.2.2.1AmplificacinporRTPCRtiempofinal 59

3.2.2.2Estudioscomparativos 603.2.2.3Anlisisfilogentico 62633.2.2.4ComparacinconlacepavacunalOP 653.2.2.5Estudiodepresionesselectivas 66

4.DISCUSIN 6778

4.1Conclusionesyperspectivas 7880

Referenciasbibliogrficas 8191

Abreviaturasydefiniciones

aa:aminocido/sBuffer:solucinqumicaquemantieneconstantesupHC:gradoscentgradosCDV:virusDistempercaninoCebadores:oligonucletidosiniciadoresCI:controlinternoDNA:cidodesoxirribonucleicoDNAsas:enzimasquedegradanelDNADNA ligasa:enzimaqueformaenlacescovalentesentreelextremo5deunacadenapolinucleotdicayelextremo3deotracadenapolinucleotdicadNTPs:deoxinucletidosEDTA:cidoetilendiaminotetraacticoELISA:Enzymelinkedimmunosorbentassay.EnsayoinmunoenzimticoporadsorcinF:protenadefusinH:hemaglutininaIF:immunofluorescenciaIgM:inmunoglobulinadetipoMKb:kilobasel:litroL:large(protena)LCR:lquidocefalorraqudeoM:matriz(protena)mAbs:anticuerposmonoclonalesMgCl2:clorurodemagnesiol:microlitrosM:micromolarmg:miligramosml:mililitrosmRNA:cidoribonucleicomensajeroMV:Measlesvirus.VirusSarampinN:nucleoprotenanm:nanmetrosnt:nucletidosORF:OpenReadingFrame.Marcoabiertodelecturapb:paresdebasesP:fosfoprotenaPBS:phosphatebufferedsaline.SolucinsalinadefosfatosPCR:PolymeraseChainReaction.ReaccinenCadenadelaPolimerasaPDV:virusDistemperdefcidosPellet:precipitadoluegodelacentrifugacin

pH:logaritmodelainversadelaconcentracindeprotonesPI:postinfeccinpMol:picomolesRE:retculoendoplasmticoRFLP:RestrictionFragmentLengthPolymorphism.Polimorfismoen la longitudde losfragmentosderestriccinRNA:cidoribonucleicoRNasa:nucleasaquecatalizalahidrlisisdeRNArpm:revolucionesporminutoRTPCR:RetroTranscripcinReaccinenCadenadelaPolimerasaSDS:dodecylsulfatodesodio.Detergentedeaccindesnaturalizanteseg:segundosSLAM:Signaling lymphocyticactivationmolecule (CD150).Molculaactivadorade lasealizacindellinfocitoSNC:sistemanerviosocentralUTR:Untranslatedregion.ReginnotraducidaUV:luzUltravioletaVero:clulasepitelialesderindemonoverdeafricanoVeroSLAM:clulasVeroqueexpresanpor transfeccin lamolculaactivadorade lasealizacindellinfocito(CD150SLAM)vol:volumenVVA:vacunasavirusvivoatenuado

Publicaciones

Primerdiagnsticomoleculary caracterizacinparcialdelgende lanucleoprotena

delVirusDistemperCaninoenUruguay.Sarute,N.,Prez,R.,Francia,L.,Hernndez,

M., Bed, G., Bonilla, B., Guasco, S., Cardeillac, A., Panzera, Y. (2011). Veterinaria

(Montevideo),47(182):915.

Evidence of two cocirculating genetic lineages of CanineDistemperVirus in South

America.Panzera,Y.,Caldern,M.G.,Sarute,N.,Guasco,S.,Cardeillac,A.,Bonilla,B.,

Hernandez,M.,Francia,L.,Bed,G.,LaTorre,J.,Prez,R.(2011).VirusRes.163,401

404.

Resumen

El virus Distemper canino (CDV) es un virus envuelto del gnero Morbillivirus

perteneciente a la familia Paramyxoviridae; ste presenta un genoma de RNA no

segmentado, cadena simple, polaridad negativa y 15.7 kilobases. CDV es el agente

etiolgicodeunaseveraenfermedad infecciosa,denominadaDistemperoCarr,que

afectaatodaslasfamiliasdecarnvorosterrestres.

Distemperesunade lasprincipalesenfermedades infecciosasdecanesdomsticosy

secaracterizaporpresentarunampliorangodesntomasclnicosasociadosalesiones

enelaparatorespiratorio,digestivoy/oelsistemanerviosocentral.Laenfermedadse

controlaatravsdevacunasconvirusvivosatenuados;sinembargo,recientementese

hanregistradonumerososbrotesinfecciososennuestrareginyalrededordelmundo,

inclusoenpoblacionesdecanescorrectamentevacunados.Aunquesedesconocenlas

causas,dichosbrotespodranexplicarsepor lareversinde lascepasatenuadasa la

virulencia,laemergenciadenuevascepascapacesdeevadirlarespuestainmune,y/o

fallasenlosplanesdevacunacin.

Uruguay no parece estar exento de esta problemtica, registrndose brotes de la

enfermedad en canes vacunados. El desarrollo de metodologas de diagnstico y

caracterizacin en nuestro laboratorio basadas en RTPCR tiempo final, y posterior

secuenciacindelosamplicones,nospermiticonstatarquelainfeccindeloscanes

sedebaavirusdecampoynoalareversindelacepavacunal.Debidoaello,resulta

fundamentalimplementarenelpasplanesdevigilanciasanitariabasadosenlarpida

deteccindelgenomaviralysuposteriorcaracterizacin.

En este sentido, durante esta tesis desarrollamos por primera vez en Uruguay un

mtododediagnsticobasadoenRTPCRentiemporealconqumicaTaqMan,elcual

brindaresultadosconf iab les , con elevada espec i f ic idad y enmenortiempo.

Asuvez,serealizlacaracterizacingenticadeaislamientosdecampodelRodela

Platamedianteelanlisisdelgendelahemaglutinina(H)ydelaregincodificantedel

pptidoseal (Fsp)de laprotenade fusin (F).Estas regionesgenmicaspresentan

una elevada variabilidad gentica lo cual permite establecer relaciones evolutivas

entrelascepascirculantes.MedianteRTPCRseamplificlasecuenciacodificantedel

genHylareginFspdeaislamientosdecampouruguayosyargentinos,constituyendo

el primer estudio de caracterizacin basado en estas regiones genmicas en

Sudamrica.

Elanlisisdelassecuenciasobtenidasdelahemaglutininarevellaexistenciadeuna

elevada variabilidad gentica entre los aislamientos de Sudamrica, los cuales se

agrupan en dos linajes cocirculantes en el continente con distinta distribucin y

prevalencia.Unodeelloscorrespondeaun linajeyacaracterizado, Europa 1 (EU1),

por tanto proponemos denominar a este linaje como Europa 1/Sudamrica 1

(EU1/SA1),mientrasqueelotrorepresentaunlinajeexclusivodenuestrocontinente

descritoporprimeravez,alcualdenominamosSudamrica2(SA2).El linajeEU1/SA1

seraelresultadodel intercambiodeanimalesentreamboscontinentesfavoreciendo

la transmisin del virus,mientras que el linaje SA2 se habra originado en la fauna

silvestredeSudamricaysetransmitialoscanesdomsticos.

El anlisis de la regin Fsp de los aislamientos sudamericanos revel las mismas

relaciones evolutivas observadas en el anlisis de la hemaglutinina, registrndose

elevadosvaloresdevariabilidadgentica.Estosresultadossustentansuutilidadcomo

marcadorparaestudiosde caracterizacin gentica yevolucindeCDV,por lo cual

proponemos un nuevo criterio para definir linajes genticos de CDV en base a la

variabilidaddeFsp.

LacomparacindelosaislamientossudamericanosconlacepavacunalOnderstepoort

(OP),utilizadacomnmenteennuestropas,mostrelevadosnivelesdevariabilidad

tantoaniveldelahemaglutinina,comodeFsp,confirmandoqueloscasosdeinfeccin

porCDVfueroncausadosporvirusdecampo,ynoporlareversindelacepavacunal.

Introduccin

INTRODUCCIN

1.1VirusDistempercanino

1.1.1ClasificacinTaxonmica

El virus Distemper canino (CDV) es un virus envuelto del gnero Morbillivirus

perteneciente a la familia Paramyxoviridae. LosMorbillivirus presentan genoma de

RNAno segmentado,cadena simple,polaridadnegativayaproximadamente15.7kb

(Lamb&Parks,2007).

1.1.2Estructura,genomayprotenasvirales

1.1.2.1Estructuraviral

CDVesunviruspleomrfico,conundimetroaproximadoentre150300nm(Zipperle

et al., 2010). El RNA genmico se encuentra empaquetado por la protena de

nucleocpside(N)yesreplicadoporelcomplejodelapolimerasaviralformadoporla

protenalarge(L)ysucofactor,lafosfoprotena(P).LasprotenasN,PyL,juntoalRNA

viralformanelcomplejoribonucleoproteico(RNP),elcualdirige lasntesissecuencial

demRNAapartirdelosgenesvirales,obienlareplicacindelosantigenomas(RNAs

viralesdepolaridadpositiva).Laenvolturalipdicacontienedosprotenasintegralesde

membrana,laprotenadefusin(F)ylahemaglutinina(H),yunaprotenaasociadaa

lamembranaqueinteractaconelcomplejoRNP,laprotenadematriz(M)(Figura1)

(vonMesslingetal.,2001).

Figura1.RepresentacinesquemticadeunMorbillivirus.Tomadodelapginaweb

www.expertreviews.org.

1

Introduccin

1.1.2.2Genomaviral

ElgenomadeCDVpresentaseisgenesllamadosN,P/V/C,M,F,HyL,quecodificanlas

seisprotenasestructuralesdelvirin.Cadagencodificaunanicaprotena,exceptoel

gen P/V/C que codifica la fosfoprotena P y dos protenas no estructurales

denominadasCyV(Figura2).

EnlosextremosdelRNAgenmicoexistenregionesUTRnocodificantes,denominadas

leader3'ytrailer5',quesonesencialesparalareplicacinytranscripcindelosgenes

virales (Lamb& Parks, 2007). Entre genes adyacentes existe un triplete intergnico

consenso(GAA)quenosetranscribeyqueseparaalossitiosdepoliadenilacindelos

sitiosdeinicidelatranscripcin(Liermannetal.,1998).

Los genes son transcriptos por el complejo RNP a partir de un promotor simple

mediante un mecanismo denominado startstop. Este mecanismo implica que la

transcripcin se iniciaenelprimergendelextremo3 (genN)y sedetieneencada

reginintergnica,debidoaquelapolimerasaviralseescindedelRNAmolde,locual

puededeterminar la interrupcindelproceso.Por tanto,estemecanismoconducea

ungradientetranscripcionalquesemantienedurantelainfeccin;detalmodoquelos

genesprximosalextremo3delgenomasetranscribenmsqueaquelloscercanosal

extremo5delgenoma(Anderson&vonMessling,2008).

Figura2.RepresentacinesquemticadelgenomadeCDV.Imagentomadadelsitioweb

http://expasy.org/viralzone.

1.1.2.3Protenasvirales

1.1.2.3.1Protenadenucleocpside(N)

LaprotenadenucleocpsideescodificadaporelgenNypresenta525aminocidos

(aa).LanucleocpsideesunaprotenadeuninalRNAqueseautoensamblasobreel

genomaviralyelRNAantisentidoparaformar,juntoalasprotenasPyL,elcomplejo

RNP(Figura1)(Lamb&Parks,2007).

2

Introduccin

1.1.2.3.2ProtenascodificadasporelgenP/V/C:fosfoprotenaPyprotenasVyC

LafosfoprotenaPestconstituidapor507aayesuncofactordelapolimerasaquese

activa por fosforilacin y forma parte activa del complejo RNP (Figura 1) (Lamb&

Parks,2007).

LaprotenaCestraducidaapartirdelmismomRNAqueP,peropresentauncodnde

inicio alternativo situado 22 nucletidos corriente abajo del codn iniciador de la

protena P. Esto produce un corrimiento en el marco abierto de lectura (ORF)

generandouncodnstopprematuro, locualdeterminaque laprotenaC tengauna

extensinde174aa(Bellinietal.,1985).

Porotraparte,laprotenaVconstade299aayestraducidaapartirdelmismocodn

de inicio que la protena P, sin embargo,mediante un proceso de edicin del RNA

mensajero (mRNA)seaadeunaguaninaquedeterminauncorrimientoenelmarco

delecturaylaformacindeuncodnstopprematuro.Ambasprotenaspresentanla

misma secuencia aminoacdica en los primeros 231 aa, pero los 68 aa del extremo

carboxiterminalde laprotenaVdifierende lospresentesen laprotenaP(Cattaneo

etal.,1989).

SehasugeridoquelasprotenasaccesoriasVyCestninvolucradasenlaevasindela

respuestainmunemediadaporelInterfern(Lamb&Parks,2007).

1.1.2.3.3Protenadematriz(M)

LaprotenadematrizescodificadaporelgenMyestconstituidapor335aa.Esta

protenaseposicionadebajodelaenvolturalipdica,einteractaconelncleoRNP,la

bcapalipdicayconlascolascitoplasmticasdelasglicoprotenasdemembranaHyF

(Figura1).Debidoalasinteraccionesqueestablece,presentaunpapelfundamentalen

lamorfologayelensamblajedelvirin(Lamb&Parks,2007).

1.1.2.3.4Protenadefusin(F)

La protena de fusin es una glicoprotena transmembrana tipo I de 662 aa que

participaen la fusinde laenvoltura viral con lamembranaplasmticade la clula

hospedero(Lamb&Parks,2007).LaprotenaFescodificadaporelgenFbajolaforma

deunprecursorinactivodenominadopreF0;elprocesamientodelaprotenaimplica

elreconocimientodelpptidoseal(Fsp)porunamolculaespecficayelsubsecuente

3

Introduccin

transportehaciaelretculoendoplsmico(RE),dondeelprecursorpreF0esprocesado

cotraduccionalmente(vonMessling&Cattaneo,2002).Elprocesamientoocurreentre

losaminocidos135136porlaaccindeunapeptidasacelular(SPase),generandoal

Fspde135aayalprecursor inmaduroF0de527aa.ElprecursorF0esglicosiladoy

clivadoporunafurinacelularqueactaenelcompartimientodelGolgi,formandolas

subunidades F1 y F2. Estas subunidades forman un heterodmero que constituye la

formaactivadelaprotenaF(Plattetetal.,2007).Aniveldelaenvoltura,laprotena

formaun trmeroque interacta con lahemaglutininaduranteelprocesode fusin

virusclula(Figura3)(vonMesslingetal.,2004).

Figura3.EsquemadelgenFconlasregionesquecodificanparalassubunidadesdelaprotenaF.

ModificadodeVonMessling&Cattaneo(2002).

1.1.2.3.5Protenahemaglutinina(H)

Lahemaglutininapresenta607aayescodificadaporelgenH;dichaprotenaesuna

glicoprotena transmembrana tipo II que media la unin de los viriones a los

receptorescelulares,yposeelacapacidaddepromoverlafusinvirusclula(Lamb&

Parks,2007).LaprotenaHpresentaundominiocitoplasmticocortoensuextremo

aminoterminal,undominiohidrofbicotransmembranaconfuncionesdelocalizacin

yanclajea lamembrana,yunectodominiocarboxiloterminal (Zipperleetal.,2010).

Dichaprotenaformauntetrmeroanivelde laenvolturaque interactafsicamente

conlaprotenaF(Figura4)(vonMesslingetal.,2004).

EstudiosinvitromostraronquelaprotenaHeseldeterminanteprincipaldeltropismo

celular(Sternetal.,1995).EsprobablequenosoloeltropismodeCDV,sinotambinla

fusogenicidad en clulas Vero se mantenga fundamentalmente por accin de la

protenaH(vonMesslingetal.,2001).

4

Introduccin

Figura 4. Representacin del mecanismo de fusin virusclula mediado por la hemaglutinina y la

protenade fusin.ModificadodeExpertReviews inMolecularMedicine.CambridgeUniversityPress

(2002).

1.1.2.3.6Protenalarge(L)

La protena large codificada por el gen L, consta de 2184 aa y es la subunidad

fundamentaldelcomplejode laRNApolimerasaporsurolcatalticoen lasntesisdel

RNAviral.LaprotenaLinteractaconlafosfoprotenaPparaformarelcomplejodela

polimerasaactivoyesconstituyente integralde lanucleocpsidedelvirin(Figura1)

(LambyParks,2007).

1.1.3CicloreplicativodeCDV

1.1.3.1Uninyfusinvirusclula

La fusin de la envoltura lipdica viral con la membrana plasmtica de la clula

hospederoocurreapHneutro,permitiendoelingresodelcomplejoRNPalaclula.La

actividadde fusinse realizamediante laaccinconcertadade lasglicoprotenasde

membranaHyF(Sternetal.,1995;VonMesllingetal.,2001;Zipperleetal.,2010).El

procesodefusincomienzaporlaunindelahemaglutininaalreceptorcelularSLAM

(Signaling Lymphocytic ActivationMolecule) presente en linfocitos B y T activados,

timocitos inmaduros y clulas dendrticas. Luego de la unin, la protena H induce

cambiosconformacionalessobre laprotenaFquefavorecensuactividadfusognica,

desencadenandolafusindelamembranacelularylaenvolturaviral(Sawatsky&von

Messling,2010).Dichoprocesoocurrepor laaccinespecficadelpptidode fusin,

localizado en la subunidad F1, sobre lamembrana celular del hospedero (Figura 4)

(VonMesslingetal.,2004).

5

Introduccin

1.1.3.2Transcripcinyreplicacindelgenomaviral

Trasel ingresodelcomplejoRNPenelcitoplasmaocurre latranscripcindelgenoma

viral. La sntesis delmRNA comienza en el extremo 3' del genoma y los genes son

transcriptosenmensajerosquecodificarnparalasprotenasvirales.Unavezocurrida

latranscripcin,lapolimerasaviralcomienzalasntesisdelosantigenomasquesern

utilizados comomolde para la produccin denuevosRNA genmicos. Los genomas

virales neosintetizados son encapsidados y transportados hacia la membrana

plasmticaparaformarnuevaspartculasvirales(Figura5)(Lamb&Parks,2007).

1.1.3.3Formacindelcomplejoribonucleoprteico(RNP)ybrotacin

ElRNAgenmicoencapsidadoporlasprotenasN,PyLformaelcomplejoRNP.Dicho

complejo seasocia con laprotenaM localizadaen lamembranaplasmtica,donde

yacen las glicoprotenas H y F previamente exportadas. Las partculas virales

neosintetizadassonliberadasmediantebrotacindelamembranacelularyposeenla

capacidaddeinfectarnuevasclulassusceptibles(Figura5)(Lamb&Parks,2007).

Figura5.RepresentacindelciclodevidadeunMorbillivirusenlacluladelhospedero.Tomadode

Moss&Griffin(2006).

6

Introduccin

1.1.3.4Propagacinentreclulasdelhospedero

Mediante laformacindeclulasmultinucleadas(sincitios),elvirussepropagaentre

las clulas del hospedero. Los sincitios son el resultado de la fusin de clulas

infectadas que expresan las glicoprotenas virales en su superficie, con clulas

susceptiblesquepresentanelreceptorSLAM (Sternetal.,1995).LaprotenaHesel

determinante principal de la fusogenicidad, por tanto el grado y la eficiencia de la

fusinclulaclulasedebeprincipalmenteaestaprotena(VonMesslingetal.,2001).

1.2 Distemper: patognesis, sintomatologa clnica, epidemiologa, prevencin y

control

1.2.1Patognesis

Elmodo principal de transmisin del virus es a travs de aerosoles de secreciones

respiratorias.Elvirusingresaatravsdeltractorespiratorioy,dentrodelasprimeras

24 horas, se disemina vamacrfagos desde los ganglios linfticos locales hacia las

amgdalas y los ndulos linfticos bronquiales. La replicacin viral ocurre en estos

rganosentre24daspostinfeccin(PI).Dentrodelos46dasPI,elvirusproliferaen

losrganos linfoides,ysediseminavasanguneaa lostejidosepitelialesyalsistema

nerviosocentral(SNC)entre89dasPI(Appel&Summers,1999).

Lapatognesisentrelos9y14dasdependedelarespuestainmunehumoralycelular

del hospedero. Animales con ttulos adecuados de anticuerpos y de citotoxicidad

celular pueden eliminar al virus de lamayora de los tejidos sin que se evidencien

sntomasclnicos,mientrasqueanimalesconunarespuestainmuneinadecuadasufren

la diseminacin del virus a diversos tejidos. En trminos generales, la diseminacin

viralpuededeterminarinfeccinporunperodode6090das(Figura6)(Deemetal.,

2000).

7

Introduccin

Figura6.EsquemadelapatognesisdeDistemper.PI:postinfeccin.ModificadodeAppel&

Summers(1999).

1.2.2SintomatologaClnica

La sintomatologa clnica asociada a la enfermedad depende de la virulencia de la

estirpe viral, y de la edad, estado inmune y sanitario del animal. En especies

susceptibles, los sistemas respiratorios, gastrointestinal y el SNC son los ms

comprometidos.Hastael70%delasinfeccionesencanesdomsticossonsubclnicas,

manifestndose laenfermedadde forma leveconocurrenciade languidez,anorexia,

fiebree infeccindeltractorespiratoriosuperior.Sinembargo, la formaagudade la

enfermedad presenta una elevada mortalidad con ocurrencia de sntomas clnicos

asociadosalsistemarespiratorioygastrointestinal,incluyendoconjuntivitis,descargas

culonasales (Figura 7A), neumona, diarrea (muchas veces hemorrgica) y

deshidratacinsevera(Deemetal.,2000).Losanimalesinfectadoseliminanalvirusen

todas las excreciones corporales, independientemente de los sntomas clnicos que

presenten(Frolichetal.,2000).

8

Introduccin

Laprimeraviremiaocurreentre losdas46PIyproduce la infeccinde los tejidos

linfticosconaparicindefiebreyelcomienzodelalinfopenia.Lasegundaviremiase

acompaadepirexia ydetermina la infeccinde las clulasepitelialesde todos los

tejidos del cuerpo. Esta viremia se acompaa por la aparicin de sarpullidos e

hiperqueratirosis, y determina el comienzo de la fase sintomtica (Figura 7B y 7C).

Dependiendo de la cepa viral, puede ocurrir encefalomielitis aguda en asociacin o

inmediatamente despus de lamanifestacin sistmica (vonMessling et al., 2003);

dentrodelasnumerosasmanifestacionesneurolgicasasociadasalainfeccin(rigidez

cervical, convulsiones, sntomas vestibulares y cerebrales y ataxia sensorial), la

miocloniaeselnicosntomaneurolgicosugestivodeDistemper(Deemetal.,2000).

La inmunosupresin severa yduradera asociada a la infeccinporCDV,potencia la

susceptibilidad individuala infeccionessecundarias, locualcontribuyea laselevadas

tasasdemortalidaddelaenfermedad.Elingresodelvirusaloslinfocitosmediadapor

la interaccin con el receptor SLAM, es considerado un posible determinante de la

inmunosupresin; de hecho, la expresin del SLAM en diversos tipos celulares se

asociacon ladiseminacinde la infeccinatravsdelsistema linftico(vonMessling

etal.,2005).

Figura7.ManifestacionesclnicassecundariascaractersticasdeinfeccinporCDV.Adescargaculo

nasal;Bhiperqueratirosisplantar;Csarpullido.Tomadodelsitiowebwww.adoptagdl.com

1.2.3Epidemiologa

CDV representauna importanteamenazaparacarnvorosdomsticosy silvestresen

todoelmundo.Encnidosdomsticos,Distemperesunadelasenfermedadesvirales

demayorincidenciaconelevadastasasdemortalidad(Appel&Summers,1999),yen

lasltimasdcadas sehan reportado infeccionesen todas las familiasdecarnvoros

9

Introduccin

terrestres:Canidae,Felidae,Hyaenidae,Mustelidae,Procyonidae,Ursidae,yViverridae

(Deemetal.,2000;Frolichetal.,2000).

Enalgunasregionesgeogrficas loscarnvorossilvestresrepresentanelreservoriodel

virus en la naturaleza, posibilitando su transmisin a canes domsticos. En

Norteamrica se han registrado epidemias regulares de Distemper en mapaches

(Procyon lotor), y en Japn se han registrado brotes de la enfermedad en civetas

(Paguma larvata), los cuales tienen un rol fundamental en la transmisin de la

enfermedadacanesyaotrasespeciessilvestressusceptibles(Hashimotoetal.,2001;

Lednickyetal.,2004).Alternativamente,endiversas regionesdefricadondeno se

implementanplanesdevacunacinadecuados, loscanes sonel reservoriodelvirus,

loscualeslotransmitenalafaunasilvestre(Deemetal.,2000).

1.2.4Prevencinycontroldelaenfermedad

La vacunacin es la principal estrategia para controlar a la enfermedad en canes

domsticos. Las vacunas con virus vivos atenuados (VVA) estimulan la respuesta

inmune humoral y celular e inducen memoria inmunolgica. El desarrollo y la

utilizacin de estas vacunas desde la dcada del 50, ha contribuido a una drstica

reduccin en la incidencia de Distemper en canes domsticos. Sin embargo,

recientementesehanobservadobrotesdelaenfermedadenpoblacionesinmunizadas

decanesdediversas regionesgeogrficas (Gemmaetal.1996,Boltetal.,1997,Ek

Kommonenetal.1997,Keawcharoenetal.2005,Lanetal.2006,Caldernetal.2007).

Aunque no se han determinado las causas, dichos brotes podran explicarse por la

reversindelascepasatenuadasalavirulencia(Appel,1987),oporlaemergenciade

nuevas cepas lo suficientemente variables como para evadir la respuesta inmune

generada por las vacunas (Pardo et al., 2005). Los casos en poblaciones vacunadas

tambinpodranexplicarseporfallasenlaadministracindelasvacunas,obienporel

estadosanitarioeinmunolgicodelanimal(Figura8)(Rikula,2008).

Las vacunasutilizadasennuestropasestnprincipalmente formuladas con la cepa

Onderstepoort(OP),lacualfueatenuadapornumerosospasajesenlneascelularesy

huevosembrionados(Haig,1956).Dichacepadatadeunbrotedelaenfermedaddela

dcada del 30 ocurrido en zorros de Norte Amrica. Se estableci que las cepas

10

Introduccin

circulantesenlaactualidadpresentanelevadosvaloresdedivergenciarespectoaesta

cepavacunal(Martellaetal.,2006).

Figura8.Razonesgeneralesdefallasasociadasalavacunacin.ModificadodeRikula(2008).

1.3DeteccindeCDVenmuestrasclnicas

Lossntomasclnicosasociadosa la infeccinporCDVsonsimilaresa losproducidos

porotrosagentesvirales,comoelvirusparainfluenzacanino,adenoviruscaninotipo2

o coronavirus respiratorio canino, provocando frecuentemente confusin en el

diagnstico clnico (Demeter et al., 2007). Por tanto, se han desarrollado diversas

metodologasdediagnstico complementario,entre lasque se incluyen las tcnicas

serolgicas como ensayos de inmunohistoqumica y ELISA (EnzymeLinked

InmunoSorbentAssay),y las tcnicasmolecularescomoelensayodeRTPCR (Retro

TranscripcinReaccinenCadenadelaPoliermasa).

11

Introduccin

1.3.1Ensayosserolgicos

EldiagnsticoserolgicoserealizamedianteladeteccindeanticuerposdeltipoIgM

antiCDV(BlixenkroneMolleretal.,1991).Actualmenteseaceptaqueexisteunnico

serotipo de CDV, observndose que aislamientos con diferentes propiedades

biolgicaspuedenreaccionardeigualmodoenensayosconanticuerposmonoclonales

(mAbs) (Appel & Summers, 1999). La tcnica ELISA se emplea para detectar estos

anticuerpos,ydeterminareliniciooeldesarrollorecientedelainfeccinenanimales

consntomasclnicospresuntivosdeDistemper.Sinembargo,animalescon infeccin

agudapuedenperecer sinpresentar ttulosmensurablesdeanticuerpos,oanimales

con infecciones subclnicas pueden presentar ttulos de IgM semejantes a los de

animalesvacunados(Appel&Summers,1999).

Elensayodeinmunohistoqumicaseutilizaparadetectarantgenosviralesy/ocuerpos

deinclusinenclulasbronquiales,nduloslinfticos,vejigaurinaria,obienentejidos

delSNC.Estatcnicaofreceresultadosconfiablesnicamenteenaquelloscasosdonde

seregistraunamarcadaviremia,ademspuederealizarseexclusivamenteenmuestras

tomadaspostmortem(Frisketal.,1999).

1.3.2Tcnicasmoleculares

1.3.2.1RTPCRtiempofinal

En lasltimasdcadassehandesarrolladometodologasmolecularesbasadasenRT

PCR, las cuales permiten realizar un diagnstico antemortem preciso en casos

presuntivosdeinfeccinporCDV(Sternetal.,1995;Frisketal.,1999).Enlosestudios

diagnsticos, los blancos de amplificacin son genes o regiones genmicas que

presentanunaltogradode conservacinentre losaislamientos, como serN,PyM

(Frisketal.,1999;Kimetal.,2001;Golleretal.,2009;Sietal.,2010).Frisketal.(1999)

desarrollaronunmtodomuyeficazdedeteccindelgenomadeCDVbasadoen la

amplificacindeun fragmentoconservadode287pbdelgenN,elcual fueutilizado

posteriormentepordiversosautores(Gebaraetal.,2004;Eliaetal.,2006;Saitoetal.,

2006;Caldernetal.,2007;Saruteetal.,2011).

Sibien laRTPCRen tiempo final seutiliza comnmenteenensayosdediagnstico

molecular,presentaalgunas limitacionestalescomoelbajorendimientode lamisma

12

Introduccin

enmuestrasconttulosviralesdiscretos,yproblemasdecontaminacinasociadosala

manipulacindelamplicn(Eliaetal.,2006).

1.3.2.2RTPCRtiemporeal

EldesarrollodelatecnologadelRTPCRentiemporealconstituyeunodelosaportes

ms relevantes aplicado al diagnstico viral (Mackay, 2007; Scagliarini et al., 2007).

Medianteestatcnica,sehanimplementadometodologasdiagnsticasmsrpidasy

especficas,capacesdedetectaralagenteviral inclusoenmuestrasconcargasvirales

discretas. Adems, presenta la ventaja de no requerir manipulacin postreaccin

evitando posibles problemas de contaminacin (Mackay, 2007). La deteccin de un

bajonmerodecopiasdeRNAviralestilpara la identificacindeperros infectados

que no presentan sintomatologa (manifestacin subclnica) pero que contribuyen

activamentealadiseminacindelvirus(Scagliarinietal.,2007).

A lafecha,secuentaconslotresestudiosdedeteccindelgenomadeCDVporRT

RTPCRentiemporeal.EnSudamrica,existeunnicoestudiobasadoenlautilizacin

delagente intercalanteSYBRGreenpara ladeteccindelgenomaviral(DelPuertoet

al.,2010).EnEuropa,Eliaycols(2006)desarrollaronunmtododedeteccinbasado

enlahibridacinyamplificacindeunareginconservadadelgenNmediantequmica

TaqMan,mientrasqueScagliariniycols(2007) implementaronunmtodobasadoen

lamismaestrategia,amplificandounareginconservadadelgenP.

Los mtodos basados en sondas de hidrlisis TaqMan son sistemas de deteccin

especficos,debidoaquepermitendiscriminarentrelasecuenciadeintersyposibles

amplicones inespecficos o dmeros de cebadores. Estas sondas presentan un

fluorforo unido al extremo 5, y unamolcula quencher en el extremo 3 la cual

absorbe la energa emitida por el fluorforo si ambos se encuentran prximos

fsicamente. Cuando la Taq polimerasa comienza a polimerizar a partir de los

cebadores y se encuentra con el extremo 5 de la sonda, lo degrada gracias a su

actividadexonucleasa35.Esteprocesoliberaalfluorforoyloseparadelquencher,

locualocasionaunincrementodelafluorescenciaqueesdetectadaporelequipode

PCR (Figura 9). El parmetro fundamental de la reaccin es el ciclo umbral (Ct),

definido cmo el nmero de ciclos necesarios para que se produzca un aumento

13

Introduccin

significativodelafluorescenciarespectoalasealdebase;estevaloresinversamente

proporcionalalacantidadinicialdemolculasdeDNAmolde(Mackay,2007).

Figura9.RepresentacinesquemticadeamplificacinporPCRtiemporealmediantesondasTaqMan.

TomadodeMackay,2007.

1.4CaracterizacingenticadeCDV

LaamplificacinporRTPCRtiempofinalyposteriorsecuenciacinde losamplicones

permiteconocerycomparar losaislamientosdecampo,conel findeestablecersus

niveles de variabilidad gentica respecto a aislamientos de diferentes regiones

geogrficas y las cepas vacunales. En los estudios de caracterizacin los blancos de

amplificacin son genes o regiones genmicas con altos niveles de variabilidad

gentica.

1.4.1Hemaglutinina

ElgenHeselmsvariabledelgenomade losMorbillivirus.Anivelde su secuencia

aminoacdicasedetectanvaloresdedivergenciadel8%entreaislamientosdecampo,

ydehastael 11% respecto a las cepas vacunales (Bolt et al., 1997;Martellaet al.,

2006).

EnbasealanlisisdelahemaglutininasehandescritoloslinajesdeCDVcirculantesen

elmundo.Elcriterioestablecequedosaislamientospertenecenaunmismolinajesise

agrupan dentro de un mismo clado en la filogenia y presentan una variacin

aminoacdica menor al 4%. Si los aislamientos se agrupan en clados distintos y

presentanvaloresdedivergenciamayoresal4%,pertenecenalinajesdistintos(Boltet

al.,1997;Martellaetal.,2006).Los linajesdeCDVsedistribuyensegnunpatrnde

14

Introduccin

distribucin geogrfica, salvo escasas excepciones (Martella et al., 2006). Hasta la

fecha, se han identificado ocho linajes en el mundo: frica, Amrica1

(correspondienteallinajedelascepasvacunales),Amrica2,Asia1,Asia2,Europa1,

Europa2(Europewildlife)yEuropa3(Arcticlike)(Figura10)(Mochizukietal.,1999;

Hashimoto et al., 2001; Lednicky et al. 2004;Martella et al., 2006;Demeter et al.,

2007;Anetal.,2008;Womaetal.,2009).

15

Introduccin

Figura10.CladogramaenbasealasecuencianucleotdicacompletadelgenH(1824pb)deaislamientos

deCDV.ExtradodeWomaetal.,2009.

16

Introduccin

LaprotenaHeseldeterminanteprincipaldeltropismocelularyaqueinteractaconel

receptorcelularSLAMmedianteaadereconocimientoespecficos(Sekietal.,2003).El

modelado de su estructura permiti identificar que los residuos 530 y 549 estn

involucradosenlaadsorcinviralmediadaporelreceptorSLAM(Vongpunsawadetal.

2004;vonMesslingetal.2005;McCarthyetal.,2007).Elanlisisdeaislamientosde

campo determin que dichos residuos difieren entre cepas aisladas de hospederos

domsticos y silvestres.Enel residuo530 seobservan los aminocidos glicina (G) y

cidoglutmico (E)en lamayorade losaislamientosdecanesdomsticos,mientras

quelascepasaisladasdeespeciessilvestresmuestranlosaaaspartato(D),asparagina

(N) y arginina (R). A nivel del residuo 549, el aa tirosina (Y) es caracterstico de

aislamientos de canes, mientras que en aislamientos de silvestres se registra la

sustitucinporhistidina(H),sugiriendoqueladispersindelvirusaotroshospederos

podraasociarseacambiosenestossitios(McCarthyetal.,2007).

LascadenasdeNglicanospresentesenlaprotenaHtambinpodraninfluirsobrelas

interaccionesconelreceptorSLAMyel ingresodelvirusa laclula.Sedemostren

otras glicoprotenasdeParamyxovirusque laNglicosilacin es fundamentalpara el

correctoplegamiento,transporteyfuncinde laprotena(vonMesslingetal.,2001).

ElposibleroldelaNglicosilacinenlafisiologadelahemaglutininadeCDVseanaliz

recientementemediantelaconstruccindevariantesconlaprotenadeglicosilada.Los

virusconprotenaHdeglicosiladamantenansufuncionalidad,aunquepresentabanun

fenotipoatenuadoinvivo,demostrandoqueserequiereunmnimodeNglicanospara

lavirulencia(Sawatsky&vonMessling,2010).

1.4.2Pptidosealdelaprotenadefusin

EL gen F es el segundo ms variable dentro del genoma de CDV. A nivel de su

secuencia aminoacdica, la protena F vara en torno al 4% entre aislamientos de

campo.Sinembargo,losprimeros135aacorrespondientesalFspvaranhastaun27%

(vonMessling&Cattaneo,2002). La comparacinentreaislamientosde campo y la

cepavacunalOP,mostrvaloresdevariabilidadaminoacdicaentre30y49%(Plattet

et al., 2007; Lee et al., 2008; Sultan et al., 2009). Los valores de variabilidad de la

reginFspsoninclusosuperioresalosdescritosparalahemaglutinina,comenzndose

17

Introduccin

autilizarenestudiosdecaracterizacinyevolucindeCDV(Leeetal.,2008;Sultanet

al.,2009).

El Fsp no se encuentra en las partculas virales debido a que lamaduracin de la

protena F requiere suprocesamientoproteoltico. Sin embargo,estara involucrado

indirectamenteenlaactividadlaprotenaF,limitandosuexpresinanivelintracelular

yen lasuperficie,con laconsecuentereduccinde losnivelesdefusinclulaclula

(Plattetet al.,2007).Esta regin tambin contribuira a la virulenciae inclusoen la

patognesis viral (Von Messling & Cattaneo, 2002; Plattet et al., 2007). Se han

analizado los efectos de la eliminacin de aa del Fsp y su posible relacin con la

funcindelaprotena;ladelecindelosprimeros60aadeterminunincrementode

laactividaddefusinde15rdenes,mientrasquelareduccinadicionaldelFspa8aa

resultenunincrementode70rdenesenlaactividaddefusin,sustentandoqueel

acortamientodelFspdeterminaunincrementoenlafusogenicidadviral(vonMessling

&Cattaneo,2002).Sinembargo,estudios invivosugierenqueelpptidosealnoes

esencialpara lavirulencia,yaque infeccionesexperimentales convirus carentesdel

Fsp, resultaron en el desarrollo de la enfermedad y la muerte de los animales

(Anderson&vonMessling,2008).

1.5Antecedentesdelgrupodetrabajo

EnlosltimosaossehanregistradonumerososcasosdeDistemperennuestropas,

inclusoencanesvacunados.Debidoaello,implementamosporprimeravezenelpas

una metodologa molecular de deteccin de CDV (Sarute et al., 2011); esta

metodologasebasaenlaamplificacinmedianteRTPCRdeunfragmentode287pb

del genN (Frisk et al., 1999). Su aplicacin nos permiti constatar la presencia del

genoma viral en el 86% de las muestras analizadas, de las cuales el 74%

correspondieron a animales vacunados. El anlisis de las secuencias de ocho

aislamientosdecampomostrelevadosvaloresdeidentidadnucleotdica(99.6100

%)confirmandoyextendiendoresultadospreviossobrelaconservacindeestaregin

genmicaysuutilidadenensayosdediagnsticomolecular.Lacomparacindeestas

secuenciascon lacepavacunalOP,revelnumerosasvariacionesnucleotdicas.Estas

diferenciasnospermitierondisearunmtododeRFLPparadiscriminarentrelacepa

vacunalylosvirusdecampo.Losresultadosobtenidosnospermitieronconstatarque

18

Introduccin

lainfeccindeloscanesfuecausadaporunvirusdecampoynodebidoalareversin

delacepavacunal(Saruteetal.,2011).

Con el objetivo de avanzar en la investigacin nos propusimos desarrollar nuevas

metodologas diagnosticas, as como relevar la variabilidad gentica de las cepas

circulantes en la regin. Durante el presente trabajo de Tesis, desarrollamos un

mtododedeteccindelgenomaviralporRTPCRen tiempo real,y caracterizamos

aislamientos de CDV del Ro de la Plata,mediante el anlisis de las regionesms

variableseinformativasdelgenoma:lasecuenciacompletadelgenHylareginFsp.

19

Introduccin

1.6Hiptesisdetrabajo

Losmtodosmoleculares permiten realizar un diagnstico rpido y sensible deDistemper.

El anlisis del gen H y la regin Fsp de aislamientos de nuestra regin nospermitirestablecerelgradodevariabilidadexistenteenlascepascirculantes.

1.7Objetivos

ObjetivoGeneral

DetectarycaracterizargenticamenteaislamientosdecampodeCDVdelRodela

Plata.

ObjetivosEspecficos

DesarrollarunsistemadediagnsticobasadoenRTPCRentiemporeal. Establecer la variabilidad gentica de aislamientos uruguayos y argentinosmedianteelanlisisde lasecuenciacompletadelgende lahemaglutininay laregin

Fspdelgendelaprotenadefusin.

Inferir lasrelacionesevolutivasentre losaislamientosdelRode laPlataycepascaracterizadas en otras regiones geogrficas,mediante el anlisis de las secuencias

nucleotdicasyaminoacdicasdeambosmarcadores.

20

MaterialesyMtodos

2.MATERIALESyMTODOS

2.1Muestras

Seanalizaronmuestrasdeorina,sangreysecrecionesculonasalesde30canescon

sntomaspresuntivosdeinfeccinporCDVprocedentesdeUruguayyArgentina(Tabla

1).Lacolectadelmaterialbiolgicofuerealizadapormdicosveterinariosyelmismo

sealmacena20Chastasuprocesamiento.

Lasmuestrasuruguayasfueroncolectadasenelperodo20062010,mientrasque las

argentinas se colectaron durante 20032010. Estas ltimas fueron procesadas y

analizadasenelmarcodeunapasantaregionalfinanciadaporlaredAMSUDPasteur

enelInstitutoMilstein(CONICET)deBuenosAires.

Adems, se utilizaronmuestras provenientes de animales sin sintomatologa clnica

como controles negativos. Para estandarizar los ensayos de diagnstico y

caracterizacinmolecular,seusaronmuestrasdevacunascomercialesdeCDV (cepa

Onderstepoort, Puppy DP Nobivac, Intervet, The Netherlands) y del Virus de la

BronquitisInfecciosaAviar(IBV)(cepaMassachussets,FortDodgeAnimalHealth,Iowa,

USA).

2.2Extraccindelgenomaviral

LaextraccindelRNAviralserealizmediantedosprotocolosdiferentesdependiendo

delorigendelamuestra.Enambosprotocolosseadicionalasmuestras0.5ldeunasolucinde1mgde lavacunade IBVdiluidaen1mlde1XPBSpH=8que seutiliz

comocontrolinterno(CI)enlasreaccionesdeRTPCRtiemporeal.

23

MaterialesyMtodos

Tabla1.Muestrasempleadasenelestudio.Sedetalla ladenominacin,edad,procedencia,estadodevacunacin y sintomatologa de los animales.NV: no vacunado; V: vacunado; DS: desconocido; SN:sintomatologia neurolgica;GI: sintomatologia gastrointestinal; SR: sintomatologia respiratoria; Conj:conjuntivitis.

SintomatologaClnica

Muestra

Edad(meses)

Procedencia

Vacunacin

SN

GI

SR

Conj

Otros

CDV75 5 SanJos(SantaLuca)

V + + + Leucopenia

CDV116 8 Montevideo V + + CDV127 24 Canelones

(SantaRosa)V + +

CDV128 6 Canelones(SantaRosa)

NV + +

CDV134 32 Colonia V + CDV139 12 SanJos

(SantaLuca)V + + Pirexia

CDV141 2 ND V + + + CDV142 20 Montevideo V + CDV143 18 Montevideo DS + + PirexiaCDV144 14 Montevideo NV + + + DepresinCDV145 10 Montevideo V + + + DepresinCDV146 6 Canelones

(SantaRosa)NV + + + Pirexia

CDV148 2 Tacuaremb V + + PirexiaCDV149 3 Montevideo NV + CDV150 4 Tacuaremb V + + + DepresinCDV162 12 DS V + + CDV164 36 DS V + + + PirexiaCDV166 3 Rivera V + CDV167 3 Montevideo V + + + CDV168 2 Montevideo NV + + DepresinCDV169 3 DS V + + + + CDV170 3 DS NV + PirexiaCDV172 2 Tacuaremb V + + DepresinCDV190 7 SanJos

(SantaLuca)V + Pirexia

CDV191 4 Montevideo V + CDV0801 12 Rocha(Chuy) V + Arg23 15 BahaBlanca V + + Arg24 4 BahaBlanca V + + + + Hiperquerat

irosisArg25 10 BuenosAires

(CapitalFederal)

V + + + + Pirexia,Hiperqueratirosis

Arg26 48 BuenosAires(CapitalFederal)

V + + + + Pirexia

1.En loscasosdeorinay liofilizadovacunalOP(unvialde lavacunaen800lde1XPBSpH=8),seutilizelkitdeextraccin libredeclulas"QIAmpViralRNAMiniKit"

(Qiagen)apartirde140ldefluido,segnelsiguienteprotocolo: Agregar560ldebufferdelisisy5.6ldeRNAcarrierauntubode1.5ml. Adicionar140ldefluido.Mezclarconvortexpor15s. Incubaratemperaturaambiente(TA)por10min.

24

MaterialesyMtodos

Centrifugarpor15sa13.000rpm. Adicionar560ldeetanolabsolutoymezclarconvortexpor15s. Agregar630ldelasolucinaunacolumnaQIAampMinicolumnycentrifugar

a8000rpmpor1min.Colocarlacolumnaenunnuevotuboydescartarelfiltrado.

Repetirelpasoanterior. Adicionar500ldebufferdelavado1ycentrifugara8000rpmpor1min.Colocar

lacolumnaenunnuevotuboydescartarelfiltrado.

Adicionar 500 l de buffer de lavado 2 y centrifugar a 13.000 rpm por 3min.Descartarelfiltrado.

Secarlacolumnacentrifugandoa13.000rpmpor1min. Colocar la columnaenunnuevo tubode1.5ml y adicionar60 ldebufferde

elucin.IncubaraTApor1minycentrifugara8000rpmpor1min.

2.Enloscasosdesecrecionesculonasalesysangreperifrica,laextraccinserealiz

mediante el reagente TRIzol (Invitrogen Life Technologies) a partir de un

homogeneizado de 200 l de muestra y 1 ml de TRIzol, de acuerdo al siguienteprotocolo:

MezclarconvortexeincubaraTApor5min. Adicionar200ldecloroformo,mezclarporinversineincubaraTApor3min. Centrifugara12.000rpmpor10mina4C. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1.5 ml y adicionar 500 l de

isopropanol.Mezclarporinversin.

IncubaraTApor10minycentrifugara12.000rpmpor20mina4C. Descartarel isopropanol.Adicionar500 ldeetanol70%ycentrifugara12.000

rpmpor5mina4C.

Aspirareletanol.SecarelpelletRNAaTApor10min. Adicionar2040ldeagualibredeRNAsasprecalentadaa50C. IncubaraTApor5min.ResuspenderelpelletRNA.

25

MaterialesyMtodos

2.3EnsayosderetrotranscripcinyPCR

2.3.1Retrotranscripcin

El DNA complementario (cDNA) se sintetizmediante retrotranscripcin con el kit

RevertAid MMLV Reverse Transcriptase (Fermentas), de acuerdo al siguiente

protocolo:

Colocarenuntubo510ldeRNAy1520pmoldecebadordirecto. Incubarlamezclaa70Cpor5min,llevarahielopor2min. Adicionar4ldebufferMMLV,2ldedNTPs10mMy1ldeRibolockRNAase

inhibitoreincubara37Cpor5min.

Agregar1ldeRTRevertAidMMLVReverseTranscriptase. Incubara42Cpor60minya70Cpor10min.

Se utilizaron distintos cebadores de acuerdo al ensayo. En los ensayos diagnsticos

medianteRTPCRentiemporeal,elcDNAdelgenNsegenerapartirdelcebadorp1

(Tabla 2). Cuando se incorpor el uso de un control interno en los ensayos de

diagnstico, la reaccin de RT se realiz con cebadores hexmericos universales

(Integrated DNA Technologies) capaces de retrotranscribir en forma conjunta al

genomadeCDVeIBV.

Paralosestudiosdecaracterizacin,segenerelcDNAcorrespondientealasecuencia

completa del gen H a travs de los cebadores FUP y FI7742 (Figura 11; Tabla 2),

mientrasqueeldelareginFspfueobtenidomedianteelcebadorF4784(Tabla2).

2.3.2RTPCRentiemporeal

ElgenomadeCDVsedetectmediante laamplificacindeun fragmentode101pb

conloscebadoresF906R1007ylasondaTaqManCDVNR(Tabla2).

Dicha sonda presenta en el extremo 5 a lamolcula 6carboxifluorescena (FAM)

como fluorforo y a la tetrametilrodamina (TAMRA) comomolculaquencher en el

extremo3.

MedianteeljuegodecebadoresIBVF391IBVR533ylasondaIBV5UTRseamplificy

detectun fragmentode142pbdelgenomade IBV,utilizadocomoCI (Tabla2).La

sondaIBV5UTRpresentaVICcomofluorforo,yTAMRAcomomolculaquencher.El

juegodecebadoresysondafuegentilmentecedidoporlaLicenciadaAnaMarandino.

26

MaterialesyMtodos

LascondicionesdecicladosedetallanenlaTabla3(Protocolo1).Losexperimentosse

realizaronenelequipoABI7500(AppliedBiosystems)delaSeccinGenticaEvolutiva

medianteelsoftwareABI7500versin3.0.

Tabla2.CebadoresysondasTaqManutilizadosenlasreaccionesdeRTPCRtiempofinalyPCRtiempo

real.Sesealaconasteriscoelcebadorp1descritoporFrisketal.(1999),yloscebadoresIBVF391R533

ylasondaIBV5UTRdescritosporCallisonetal.(2006).

Cebadoresysondas

Secuencianucleotdica(53)Posicinenelgenoma

genN(CDV)

p1* ACAGGATTGCTGAGGACCTAT 769789

F906 GCTAGTTTCATCCTAACTATCA 906926

R1007 CATAAGGGATTCAATAGTTGTTA 9841007

CDVNR FAMAGAGCCGGATACATAGTTTCTGCCATAMRA 939958

genF(CDV)

F4784 CCACGCACTTGCCTGATCTCA 47844805

F4854 TCCAGGACATAGCAAGCCAACA 48544876

R5535 GGTTGATTGGTTCGAGGACTGAA 55125535

genH(CDV)

FUP CACTCAAGCAGCATACTAAGGTCG 68546878

F7061 GGCTCAGGTAGTCCAGCAATG 70617083

FI7742 GCTATCTCAGACGGAGTGTATGG 77427765

RI8094 GAGCGACAGGTATCACCTCTTC 80728094

R8492 ACTGGTCTCCTCTACTTGCTTTG 84698492

RE8969 GTCGGTAAGGGATTTCTCACCAC 89468969

IBV(CI)

IBVF391* GCTTTTGAGCCTAGCGTT 391409

IBVR533* GCCATGTTGTCACTGTCTATTG 511533

IBV5`UTR* VICCACCACCAGACCTGTCACCTCTAMRA 444465

27

MaterialesyMtodos

2.3.3PCRtiempofinal

2.3.3.1AmplificacindelasecuenciacodificantedelgenH

La secuencia completa del gen H fue amplificada en dos fragmentos solapantes

mediantePCR(Figura11).Unfragmentode1038pbdelaregin3(fragmentoHI)se

amplific utilizando los cebadores F7061RI8094, y un fragmento de 1227 pb de la

regin5 (fragmentoHD) seobtuvomedianteel juegode cebadoresFI7742RE8969

(Tabla2).Sedisetambinuncebador(R8492)queseutilizjuntoalcebadorFI7742

paraamplificarunfragmentode750pb(Figura11).

Figura11.RepresentacindelgenHydeloscebadoresutilizadosenlosensayosdeRTPCR.La

secuenciadeloscebadoressedescribeenlaTabla2.

Lascondicionesempleadaspara laamplificacindelgenHporPCRsedetallanen la

Tabla3(Protocolo2).Lasreaccionesserealizaroneneltermocicladorcongradientede

temperaturaCG1/96(CorbettResearch).

2.3.3.2AmplificacindelaregincodificantedelFsp

Laamplificacindeunfragmentode681pbdelgenF,elcual incluyea lareginFsp

(405pb),serealizconeljuegodecebadoresF4854yR5535(Tabla2).Lareaccinde

PCR se realiz con las condiciones detalladas en la Tabla 3 (Protocolo 3), en un

termocicladorcongradientedetemperaturaCG1/96(CorbettResearch).

28

MaterialesyMtodos

Tabla 3. Protocolos estandarizados de PCR. Protocolo 1, amplificacin del gen N. Protocolo 2,

amplificacin del gen H. Entre parntesis se detalla la temperatura de hibridacin empleada para

amplificaralfragmentode750pb.Protocolo3,amplificacindelareginFsp.

Proceso Temperatura Tiempo

Protocolo1

LecturaprePCR 50C 2min

Desnaturalizacin 95C 30seg

Hibridacinextensin 55C 1min

40ciclos

LecturapostPCR 50C 1min

Protocolo2

Desn.Inicial 95C 3min


Hibridacin 57C(54C) 45seg

Extensin 72C 1:30min

35ciclos

Extensinfinal 72C 10min

Protocolo3

Desn.Inicial 95C 3min


Hibridacin 58C 45seg

Extensin 72C 1min

30ciclos

Extensinfinal 72C 5min

2.4Electrofresis

Los productos de PCR fueron separados mediante electroforesis en gel de

poliacrilamidaal6%duranteunahoraa110voltsconstantes.Lacorridaserealizcon

buffer1XTBE(TrisBase89mM,cidoBrico89mM,EDTApH8.0,2mM), losgeles

fueronreveladosportincinconnitratodeplata(10mg/ml).

29

MaterialesyMtodos

2.5PurificacindelosfragmentosamplificadosporRTPCR

Todos losampliconessepurificaronconelkitIllustraGFXPCRDNAandGelBand

PurificationKit(GeneralElectric)segnelsiguienteprotocolo:

Adicionar500ldebufferdecapturaa20100ldeproductodePCR.Mezclarporinversin.

Cargarlamezclaenunacolumna"GFXMicroSpincolumn.Centrifugara13.000rpmpor30s.Descartarelfiltrado.

Adicionar500ldebufferdelavadoalacolumna.Centrifugara13.000rpmpor30s.Descartarelfiltrado.

Secarlacolumnacentrifugandoa13.000rpmpor30sadicionales. Transferirlacolumnaauntubode1.5ml,agregar1050ldebufferdeelucin

eincubaraTApor1min.

RecuperarelDNApurificadocentrifugandoa13.000rpmpor1min. AlmacenarelDNAa20C.

LaconcentracindelDNApurificadofuemedidaconelespectrofotmetroNanoDrop

8000(ThermoScientific).

2.6ClonacindelosampliconesdelgenH

ELDNApurificadodelosfragmentosHIyHDdelgenHfueclonadoconelkitGeneJet

PCRProductCloning kit (Fermentas)utilizando clulas competentesdeE.ColiXL1

Blue.LosproductosdePCRcontienenunaregindepoliAenelextremo3,portanto

debensertratadosconunaenzimadebluntingquegeneraextremosromosantesde

serclonados.

ReaccindeBlunting

Mezclar

Bufferreaccin2X10l. ProductoPCR5l. AgualibredeDNAsas2l. EnzimaDNABlunting1l. Incubarlamezclaa70Cpor5min,llevarahielopor10s.

30

MaterialesyMtodos

ReaccindeLigacin

Adicionar

VectordeclonacinpJET1/Blunt(50ng/l)1l. T4DNALigasa(5U/l)1l. IncubarlamezcladeligacinaTApor20min.

Transformacin

PrecalentarplacasdeLBagarampicilinaa37C. Transferir5ldelamezcladeligacinauntuboeincubarpor2minenhielo. Agregar50ldeclulascompetentes(XL1Blue)eincubarpor15minenhielo. Realizarshocktrmicoa42Cpor45s. Incubarenhielopor1min. Incubarlamezclaenagitadorpor90min. Plaqueareincubara37Ctodalanoche(ON).

La extraccin delDNA plasmdico de las colonias se realizmediante la tcnica de

minipreparaciones(Sambrooketal.,1989),descritaacontinuacin:

ExtraerunacoloniadelaplacaLBagarycrecerlaen3mldeLBlquidocon1ldeampicilina(50g/ml).

IncubarONenagitadora37C. Transferir1.5mldelcultivoauntuboycentrifugara13.000rpmdurante5min,

eliminar el sobrenadante. Agregar al tubo el volumen restante y centrifugar

nuevamente,descartartodoellquido.

Resuspender el pellet en 300 l de solucin P1 (50mM TrisHCl; 10mM EDTApH=8).

Agregar300ldelasolucinP2(200mMNaOH;1%SDS).Mezclarporinversin. Aadir 300 l de solucin P3 fra (3M NaAc pH=5.5).Mezclar por inversin e

incubarpor15minenhielo.

Agitar por inversin y centrifugar a 13.000 rpm durante 15 min, recoger elsobrenadante.

31

MaterialesyMtodos

Adicionar 1 vol de fenol:cloroformo (1:1) y mezclar con vortex. Centrifugar a13.000rpmdurante15min.

Transferirlafaseacuosasuperioraunnuevotubo. Lavarconcloroformoycentrifugara13.000rpmdurante15min.Transferirlafase

superioraunnuevotubo.

PrecipitarelADN con0.1 volde acetatode sodio (NaAc)3M y3 voldeetanolabsolutofro.IncubarONa20C.

Centrifugara13.000rpmpor15min. Lavarconetanol70%,centrifugandoa13.000 rpmdurante15min.Descartarel

etanol.SecarelpelletaTA.

Resuspenderelpelleten30ldeH2OmiliQyalmacenara20C.

2.7Secuenciacin

Los plsmidos con inserto fueron secuenciados en ambas direcciones utilizando los

cebadoresdelvectorpJET,mientrasqueparaelDNApurificadode la reginFsp se

utilizaronloscebadoresespecficosF4854R5535(Tabla2).

La secuenciacin se realiz de forma automtica en el equipo ABI3130 (Applied

Biosystems)delaUnidaddeSecuenciacindelInstitutoPasteurdeMontevideo.

2.8Anlisisbioinformticodesecuenciasnucleotdicasyaminoacdicas

2.8.1Diseodecebadoresysondas

LoscebadoresF906R1007ylasondaCDVNRutilizadoseneldiagnstico,sedisearon

enbasealalineamientodesecuenciasdelgenNdeaislamientosuruguayosobtenidas

en nuestro laboratorio con secuencias de aislamientos provenientes de diversas

regionesgeogrficas(Saruteetal.,2011).LoscebadoresylasondadeIBVutilizadosen

elcontrolinternofuerondescritosporCallisonetal.(2006).

LoscebadorescapacesdeamplificaralgenHy lareginFspsedisearonenbaseal

alineamientodesecuenciasdisponiblesenelGenbank(Tabla4).

Los cebadores y sondas se analizaron con los programas Beacon Designer 7.5

(Applied Biosystems) y Oligo Analyzer 3.1 de Integrated DNA Technologies

(www.idtdna.com).

32

MaterialesyMtodos

2.8.2Edicinyalineamientodesecuenciasnucleotdicas

LassecuenciasdelgenHydelareginFspseensamblaronyeditaronconelprograma

Seqman(DNASTAR,Lasergene).LassecuenciasobtenidasdelgenHfuerondepositadas

enlabasededatosdelGenbank(Tabla4).Estassecuenciassealinearonycompararon

con tres secuencias de aislamientos uruguayos obtenidas previamente en nuestro

laboratorio, con seis secuencias de cepas sudamericanas publicadas en elGenbank

(dosargentinasycuatrobrasileras),ycon33secuencias representativasde losocho

linajes, a travs delmtodo ClustalW del programaMolecular EvolutionaryGenetic

Analysis(MEGA4.1)(Tabla4).

LassecuenciasdelFspdescritasenestetrabajo fueronalineadasmedianteClustalW,

consecuenciasdeaislamientosdeNorteamrica,AsiayEuropa(Tabla4).

2.8.3Anlisisfilogenticos

Los cladogramas fueron inferidosa travsdelmtodoNeighborJoiningutilizandoel

modelodedistanciapaminoacdicadelprogramaMEGA4.1.Elsoporteestadsticode

los nodos de la filogenia se obtuvo mediante anlisis por bootstrap con 1000

seudorplicas(Tamuraetal.,2007).

2.8.3.1Hemaglutinina

2.8.3.1.1Anlisisdelasecuenciacompleta

Seanalizaron46secuenciasaminoacdicasdeducidasdelalineamientodelasecuencia

codificantedelgenH.Destas,33correspondenaaislamientosrepresentativosdelos

ocho linajes,mientrasque lasotras13pertenecena losaislamientossudamericanos,

cuatrodeelloscaracterizadosenestaTesis(Tabla4).

2.8.3.1.2Anlisisdeunasecuenciaparcial(134aa)

Seanalizaronuntotalde38secuencias(completasyparciales)delgenHdescritasala

fecha en Sudamrica, incluyndose la secuencia completa de 13 aislamientos

sudamericanos, la secuencia parcial (134 aa)de dos aislamientos deUruguay,22

argentinos (Caldern et al., 2007) y un aislamiento de un zorro perro (Cerdocyon

thous) de Argentina (Ferreyra et al., 2009). El anlisis se realiz en base a un

fragmento solapante de 402 pb (134 aa) presente en todos las cepas

33

MaterialesyMtodos

sudamericanas analizadas.Tambin se incluyeron en el estudio las 33 cepas

representativasde losocho linajesanalizadaspara la secuencia completade

lahemaglutinina(Tabla4).

2.8.3.2Pptidosealdelaprotenadefusin

El anlisis del Fsp incluy 26 secuencias, de las cuales 11 correspondieron a los

aislamientos caracterizados en el presente trabajo, y las otras 15 a aislamientos de

diversasregionesgeogrficas(Tabla4).

2.8.4Identificacindesitiosdeglicosilacin

La identificacindesitiospotencialesdeglicosilacinde lassecuenciasaminoacdicas

delahemaglutininadelosaislamientosdeUruguay,ArgentinaylacepaOP,serealiz

con el programa MEGA 4.1. Estos sitios presentan la secuencia NXS/T, donde N

correspondeaArginina,XacualquieraaexceptoProlina,SaSerinayTaTriptfano.

2.8.5Estudiodepresionesselectivas

Mediante el algoritmo Single Likelihood Ancestor Counting (SLAC) del sitio web

DataMonkey(www.datamonkey.org)seanalizaron lassecuenciasaminoacdicasde la

hemaglutininadescritas en este trabajo, junto a las 198 secuenciasno redundantes

disponiblesenelGenbank.Tambinseanalizaronlas11secuenciasdelareginFspde

Uruguay y Argentina, junto con las 47 secuencias no redundantes de esta regin

publicadasenlabasededatos.

El algoritmo SLACesunmtodode conteobasado en verosimilitudpara identificar

presionesselectivasencadacodndelalineamiento.Elmtodo infiereelnmerode

cambiossinnimos(S)ynosinnimos(NS)porcodn,yestablecesilosNSporsitiono

sinnimo (dN) son significativamente diferentes de los S por sitio sinnimo (dS); el

niveldesignificanciaempleadoenlosanlisis()fuedel0,25.

34

MaterialesyMtodos

Tabla4.Secuenciasnucleotdicasutilizadasenlosanlisisbioinformticosyfilogenticos.EU1:Europa

1,EU2:Europa2,EU3:Europa3,NA1:Norteamrica1,NA2:Norteamrica2,OG:grupoexterno,SA1:

Sudamrica1;SA2:Sudamrica2,Vac:cepavacunal,ZA:frica.LosgruposSA1ySA2fuerondescritos

enestaTesisenbasealanlisisdelahemaglutininayelFspdeaislamientosdelRodelaPlata.

Aislamiento NaccesoGenbank Pas Secuencia Linaje/Grupo

Arg1 AM422846 Argentina 871pbgenH SA2






















Arg23 FJ392652 Argentina genH SA1

Arg24 FJ392653 Argentina genH SA2

Arg25 Argentina genH SA2

Arg26 Argentina genH SA2

ArgFox EU624414 Argentina 871pbgenH SA2

CDV75 Uruguay 1269pbgenH SA1

CDV102 JN215473 Uruguay genH SA1



CDV116 Uruguay 1269pbgenH SA1



BR1 EU098102 Brasil genH SA1




35

MaterialesyMtodos

5804 AY386315 Alemania genomacompleto EU1

DQ494319 Italia genomacompleto EU1

AF478543 Dinamarca genH EU1

AY093764 Turqua genH EU1

DQ494319 Italia genH EU1

DQ228166 Italia genH EU2 DQ889187 Hungra genH EU2 DQ889189 Hungra genH EU2 AF172411 China genH EU3 DQ226088 Italia genH EU3 DQ889186 Hungra genH EU3

AF164967EstadosUnidos

genH NA1

Z47765EstadosUnidos

genH NA1

Z54166EstadosUnidos

genH NA1

AF112189EstadosUnidos

genH NA1

AY526496EstadosUnidos

genH NA1


genomacompleto NA2


genomacompleto NA2

Onderstepoort(Vac) AF378705EstadosUnidos

genomacompleto NA2


genH NA2

DQ191765 Taiwan genH Asia1

DQ887547 Taiwan genH Asia1

D85754 Japn genH Asia1

AB212964 Japn genH Asia1



FJ461693 Sudfrica genH frica




FJ461721 Sudfrica genH fricavirusDistemperde

fcidos(PDV)AF479277 Dinamarca genomacompleto OG

Arg23 Argentina Fsp SA1




CDV75 Uruguay Fsp SA1





36

MaterialesyMtodos



CN1 EF596903 China genF Asia

CN2 EF445055 China genF Asia

Tw1 FJ694842 Taiwan genF Asia

Tw2 FJ694848 Taiwan genF Asia

Tw3 EU192008 Taiwan genF Asia

Tw4 EU192199 Taiwan genF Asia

Jp AB512286 Japn genF Asia

US1 AY443350EstadosUnidos

genF NA

US2 AY395984EstadosUnidos

genF NA

CDV3 EU263644 China genF Vac

SnyderHill GU138403 Canad genomacompleto VacvirusdelSarampin

(MV)U03760

EstadosUnidos

genomacompleto OG

37

Resultados

3.RESULTADOS

3.1DeteccindelgenomaviralporRTPCRentiemporeal

LadeteccindelgenomaviralporRTPCRentiemporealseestandarizconcDNAde

muestras positivas diagnosticadas por RTPCR en tiempo final, y cDNA de la cepa

Onderstepoort (OP)deunavacuna comercialdisponibleennuestropas (PuppyDP,

Novibac, Intervet). La cepa vacunal OP fue posteriormente utilizada como control

positivo de los ensayos diagnsticos. Posteriormente, se instrument el uso de un

controlinterno(CI)(liofilizadovacunaldeIBV)enlasreaccionesdeRTPCRentiempo

real.

Se analizaron 26 muestras de canes provenientes de Uruguay con sintomatologa

clnica asociada a Distemper, detectando al genoma viral en 19 de las muestras

analizadas (73%).Enestasmuestrasyen lacorrespondientea lacepaOPseregistr

incremento de fluorescencia para las sondas de CDV y el CI. En las sietemuestras

negativas (27%)slosedetect incrementode fluorescenciapara lasondadelCI.El

cicloumbral(Ct)seubicentrelosciclos32y35paraelcDNAdeCDV,mientrasqueel

CtparaelCIseencontrenelciclo36(Figura12).

40

Resultados

41

Resultados

Figura12.GrficosdeamplificacindelensayodeRTPCRen tiempo realde cincomuestrasdeCDV

utilizandocDNAdeIBVcomocontrolinterno.LacurvarojacorrespondealasondadeCDVylaazulala

sondadeIBV.A.BlancoPCR:noseobservalacurvadeamplificacinparaningunadelassondas.B.CDV

164:muestrapositiva, seaprecia la curvadeamplificacinparaambas sondas.C.CDV167:muestra

positiva, se aprecia la curva de amplificacin para ambas sondas. D. CDV 168:muestra positiva, se

aprecialacurvadeamplificacinparaambassondas.E.CDV169:muestrapositiva,seaprecialacurva

deamplificacinparaambassondas.F.CDV170:muestranegativa,seaprecialacurvadeamplificacin

solamenteparalasondadeIBVutilizadacomoCI.G.ControlpositivoCDV:cDNAOP,seaprecialacurva

deamplificacinparalasondadeCDV.H.ControlpositivoCDVyCI:cDNAOP+cDNAIBV,seapreciala

curvadeamplificacinparaambassondas.

De las 19 muestras diagnosticadas como positivas, 14 (74%) correspondieron a

animalesvacunados,cuatro(21%)aanimalesquenofueronvacunadosyunamuestra

(5%) corresponda a un animal sin informacin respecto al estado de vacunacin

(Figura 13). En los siete casos negativos, cuatro (57%) correspondieron a animales

vacunadosylastresrestantes(43%)aanimalessinplandevacunacin.

Figura13.NmerodeanimalesdiagnosticadosporRTPCRentiemporeal,discriminadosporpositivosynegativosparaelensayo.ND:Nodeterminado.

Se analiz la distribucin de los casos positivos segn clases etarias, al grupo de

animales entre tres y seismeses correspondi el porcentajems elevado de casos

(45%).Losanimalesentre sietey12meses,yentre13y36meses representaronel

20%de loscasos,mientrasque losmenoresatresmesesfueronel10%de loscasos.

42

Resultados

Tambinseanalizunamuestradeunanimalsin informacinsobre laedad (ND),el

cualrepresentel5%deloscasos(Figura14).

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

40%

45%

Resultados

Figura15. Electroforesis en gelde acrilamida al6%deproductosdePCRdel genHdemuestrasde

campoydelacepaOP(control+).

A. Carril1:blancoPCR,Carril2:CDV128fragmentoHI,Carril3:cepaOP(C+)fragmentoHI,Carril4:

CDV128fragmentoHD,Carril5:cepaOP(C+)fragmentoHD.

B. Carril1:blancoPCR,Carril2:CDV75 fragmentoHI,Carril3:cepaOP (C+) fragmentoHI,Carril4:marcadordepesmolecular (1200pb,850pb,450pb,200pb),Carril5:CDV75 fragmentoFI7742RI8492, Carril6:cepaOP(C+)fragmentoFI7742RI8492.

3.2.1.2Edicinyanlisisdesecuenciasnucleotdicasyaminoacdicas

Medianteelensamblajede los fragmentosHIyHDseobtuvo lasecuenciacompleta

delgenHdedosaislamientosuruguayos(CDV128yCDV141)ydosargentinos(Arg25y

Arg26).ElgenHpresentunORFde1824pbquecodificaparaunaprotenade607aa

(Figura16,17).Enelcasodeotrosdosaislamientosuruguayos(CDV75yCDV116),las

secuenciasensambladastuvieronunaextensinde1269pb, loscualescodificanpara

423aadelaprotena(Figura16,17).

3.2.1.3Estudioscomparativos

Los estudios se realizaron con las cinco secuencias completas del gen H de

aislamientos de campo uruguayos descritas a la fecha: las dos obtenidas en este

trabajo y otras tres descritas previamente por nuestro grupo (CDV102, CDV109,

CDV111)(Tabla4).Lassecuenciassealinearonycompararon,observndose23sitios

nucleotdicosvariablesy11cambiosaminoacdicos(Figura16,17).Estosaislamientos

presentaronunadivergenciaaminoacdicaentre01.5% (Tabla5A).Seobservaron

valoresdedivergenciasimilaresenelanlisisde lassecuenciasparcialesde1269pb

(resultadosnomostrados).

En cuanto a los aislamientos argentinos, los anlisis se realizaron con las dos

secuencias obtenidas en esta Tesis (Arg25 y Arg26), y otras dos publicadas en el

Genbank (Arg23 y Arg24) (Tabla 4). Estas secuencias se alinearon y compararon,

mostrandounamayordivergenciaquelaobservadaentrelosaislamientosdeUruguay,

con94sitiosnucleotdicosvariablesy31cambiosanivelaminoacdico(Figura16,17).

Ladivergenciaaminoacdicadeestosaislamientosseubicentre0.35.1%(Tabla5A).

Conelobjetivodeestudiartodas lassecuenciasdelgenHdescritashasta lafechaen

Sudamrica,seanalizaronademslassecuenciasdecuatroaislamientosdecampode

44

Resultados

Brasil publicadas en el Genbank (Tabla 4). Las secuencias brasileras presentaron

valoresdedivergenciaaminoacdicaentre1.03.5%(Tabla4,5A).

La comparacin de las secuencias sudamericanas revel que todos los aislamientos

uruguayos,brasilerosyunargentino (Arg23)presentaronunaelevada identidad,con

valores de divergencia entre 0 3,5% (Tabla 5A). El resto de los aislamientos

sudamericanos, todos argentinos (Arg24, Arg25 y Arg26), presentaron valores de

divergenciaconrespectoalosprimerosdehasta5.3%(Tabla5A).Sinembargo,entre

estos tres aislamientos presentaban una elevada identidad, con valores entre 0,3

1,8%(Tabla5A).

45

Resultados

46

Resultados

46

Resultados

47

Resultados

47

Resultados

48

Resultados

48

Resultados

49

Resultados

49

Resultados

Figura 16. Alineamiento de las secuencias nucleotdicas de la hemaglutinina de los aislamientos de

Uruguay,Argentina y la cepaOP. Se incluyeron las secuencias correspondientes a siete aislamientos

uruguayos, tres obtenidas previamente en nuestro laboratorio (CDV102, CDV109, CDV111), y otras

cuatro en este trabajo de Tesis (CDV128, CDV141, CDV75 y CDV116). Tambin se analizaron cuatro

secuenciasdeaislamientosargentinos,dosdeellasdescritaspreviamenteporCaldern(2008)(Arg23y

Arg24)yotrasdosobtenidasenestetrabajo(Arg25yArg26).

50

ResultadosResultados

51

51

Resultados

Figura 17. Alineamiento de las secuencias amioacdicas de la hemaglutinina de los aislamientos de

Uruguay,Argentina y la cepaOP. Se incluyeron las secuencias correspondientes a siete aislamientos

uruguayos, tres obtenidas previamente en nuestro laboratorio (CDV102, CDV109, CDV111), y otras

cuatro en este trabajo de Tesis (CDV128, CDV141, CDV75 y CDV116). Tambin se analizaron cuatro

secuenciasdeaislamientosargentinos,dosdeellasdescritaspreviamenteporCaldern(2008)(Arg23y

Arg24) y otras dos obtenidas en este trabajo (Arg25 y Arg26). Se destacan en recuadro los sitios

potencialesdeNglicosilacin,ylosresiduos530y549ubicadosenlazonadeuninalreceptorSLAM.

A

CDV102 CDV109 CDV111 CDV128 CDV141 BR1 BR2 BR3 BR4 Arg23 Arg24 Arg25CDV102 CDV109 0.008 CDV111 0 0.008 CDV128 0.007 0.015 0.007 CDV141 0 0.008 0 0.007 BR1 0.025 0.03 0.025 0.031 0.025 BR2 0.026 0.03 0.026 0.033 0.026 0.035 BR3 0.022 0.026 0.022 0.028 0.022 0.03 0.012 BR4 0.022 0.025 0.022 0.028 0.022 0.023 0.015 0.01 Arg23 0.026 0.031 0.026 0.033 0.026 0.031 0.033 0.028 0.028 Arg24 0.045 0.05 0.045 0.051 0.045 0.051 0.046 0.041 0.04 0.051 Arg25 0.046 0.05 0.045 0.051 0.045 0.051 0.045 0.041 0.04 0.048 0.017 Arg26 0.046 0.051 0.046 0.053 0.046 0.053 0.046 0.043 0.041 0.05 0.018 0.003

B

SA1 SA2 EU1 EU2 EU3 Asia1 Asia2 NA1 NA2 ZASA1 SA2 0.047 EU1 0.025 0.044 EU2 0.046 0.054 0.044 EU3 0.062 0.071 0.062 0.061 Asia1 0.055 0.065 0.049 0.054 0.068 Asia2 0.07 0.076 0.065 0.068 0.073 0.069 NA1 0.052 0.062 0.048 0.05 0.059 0.06 0.073 NA2 0.078 0.088 0.082 0.081 0.085 0.087 0.098 0.087 ZA 0.054 0.059 0.051 0.05 0.057 0.059 0.065 0.058 0.083 Vac 0.083 0.095 0.086 0.084 0.088 0.095 0.099 0.092 0.045 0.09

Tabla5.Anlisisdedistanciaaminoacdicadelahemaglutinina.

A.Anlisis de los aislamientos deUruguay, Brasil yArgentina. Se seala en recuadro los valores de

divergenciasuperioresal4%.

B. Porcentaje promedio de diferencias aminoacdicas entre los ocho linajes de CDV y los grupos

sudamericanos.Se recuadran losvaloresdedivergenciade los cladosSA1ySA2 respectoa losocho

linajesdeCDV. Losvalores son superioresal4%exceptoparael linajeEU1,dondeesdel2.5%.SA1:

Sudamrica1,EU1:Europa1,SA2:Sudamrica2,EU2:Europa2,EU3:Europa3,NA1:Norteamrica1,

ZA:frica,NA2:Norteamrica2,Vac:cepaOnderstepoort.

52

Resultados

3.2.1.4Anlisisfilogenticos

3.2.1.4.1Anlisisdelasecuenciacompletadelahemaglutinina

Esteanlisisserealizapartirdelalineamientode46secuenciasaminoacdicasde la

hemaglutinina, donde se incluyeron las secuencias de los cuatro aislamientos

caracterizadosenestaTesis, lassecuenciasde losnueveaislamientossudamericanos

caracterizadas hasta la fecha (tresuruguayos, dos argentinos y cuatro brasileros), y

secuenciasde33aislamientosrepresentativosde losocho linajesdeCDVdisponibles

enelGenbank(Tabla4).

Los13aislamientosdeSudamricaseseparanclaramenteendosclados.Uncladoest

constituidopordiezaislamientos (cincouruguayos,cuatrobrasilerosyelaislamiento

argentinoArg23),conunvalordebootstrapde97%.Todos losaislamientosdeeste

clado,alcualdenominamosSudamrica1(SA1),seasocianconelcladoquedefineal

linajeEuropa1(EU1)conunvalordebootstrapde100%(Figura18).Losaislamientos

pertenecientesaSA1presentanvaloresdedivergenciaaminoacdicade2,5%respecto

allinajeEU1,ysuperioresal4,6%respectoalrestodeloslinajescaracterizados(Tabla

5B).

El otro clado sudamericano est constituido nicamente por tres aislamientos de

Argentina (Arg24,Arg25 yArg26), y presenta un valor de bootstrap del 100%. Este

clado,alquedenominamosSudamrica2(SA2),sehallaseparadodelresto,aunquese

relacionaconellinajeEuropa2(EU2)conunbajovalordebootstrap(50%)(Figura18).

Los aislamientos de SA2muestran valores de divergencia de hasta 1,8% entre s, y

superioresal4,4%respectoaSA1yalrestodeloslinajescaracterizados,incluyendoa

EU2(Tabla5B).

53

Resultados

54

Resultados

Figura 18. Cladograma en base a la secuencia aminoacdica de la hemaglutinina de los aislamientos

sudamericanosyaislamientosdelosocholinajesdeCDV.Comogrupoexternoseempleolasecuencia

deunaislamientodelvirusDistemperdefcidos(PDV)(NaccesoZ36979).UY:Uruguay,BR:Brasil,AR:

Argentina,US: EstadosUnidos,GM:Alemania, IT: Italia,HU:Hungria,DK:Dinamarca, TK: Turkia, JP:

Japn, TW: Taiwan, SK:Coreadel Sur,CN:China,OP: cepaOnderstepoort. SA1: Sudamrica1, EU1:

Europa1, SA2: Sudamrica2, EU2: Europa2, EU3: Europa3,NA1:Norteamrica1, ZA: frica,NA2:

Norteamrica2.

3.2.1.4.2Anlisisdesecuenciasparcialesdelahemaglutinina(134aminocidos)

Este anlisis comprendi las 38 secuencias sudamericanas descritas a la fecha y las

33 secuencias representativas de los ocho linajes utilizadas en el anlisis de la

secuencia completa. Dicho anlisis mostr que los aislamientos sudamericanos se

dividenendoscladoscomoseobservenelanlisisdelahemaglutininacompleta.Un

clado comprende los mismos aislamientos de SA1 (excepto por EU098102

pertenecienteaBrasil)ytambinlosuruguayos(CDV75yCDV116),ypresentaunvalor

debootstrapde84%.EstecladoseagrupaconlasvariantesdellinajeEU1(queincluye

alacepaEU098102)conunbootstrapde60%(Figura19).

ElotrocladodeSudamricaagrupa lostresaislamientospertenecientesalcladoSA2

definidoconlasecuenciacompletadeH,los22decanesdomsticosyelproveniente

deunzorroperrodeArgentina,conunvalordebootstrapde99%(Figura19).

55

Resultados

56

Resultados

Figura19.Cladogramaenbasea134aade lahemaglutininade losaislamientossudamericanosyde

aislamientosrepresentativosdelosocholinajesdeCDV.Comogrupoexternoseempleolasecuenciade

unaislamientodelvirusDistemperde fcidos (PDV) (NaccesoZ36979).UY:Uruguay,BR:Brasil,AR:

Argentina,US:EstadosUnidos,GM:Alemania, IT: Italia,HU:Hungra,DK:Dinamarca,TK:Turqua, JP:

Japn,TW:Taiwan,SK:CoreadelSur,CH:China,IN:India,OP:cepaOnderstepoort.SA1:Sudamrica1,

EU1: Europa1, SA2: Sudamrica2, EU2: Europa2, EU3: Europa3, NA1: Norteamrica1, ZA: frica,

NA2:Norteamrica2.

3.2.1.5ComparacinconlacepavacunalOP

Enelalineamientode lassecuenciasaminoacdicasde lahemaglutininade todos los

aislamientos deUruguay y Argentina junto a los 604 aa de la cepaOP (N acceso

AF378705), se observ un rango de 134 149 diferencias nucleotdicas, y cambios

aminoacdicosenelrangode4756(Figura16,17).

La comparacin de dichas secuencias revel elevados valores de variabilidad

aminoacdica (~8,3% respecto a los aislamientos del clado SA1 y ~9,5% con los

aislamientosdelcladoSA2)(Tabla5B).

Elanlisisfilogenticoconlasecuenciacompletayparcialdelahemaglutinina,mostr

quetodos losaislamientosdeSudamricaaparecenclaramenteseparadosde lacepa

vacunalOP(Figura18,19).

3.2.1.6Identificacindesitiospotencialesdeglicosilacin

Las nueve secuencias completas de los aislamientos de Uruguay y Argentina

presentaron ocho sitios de glicosilacin en toda su extensin, excepto por el

aislamientodeArgentina(Arg23)quepresentsietesitios.En lacepaOP(Nacceso:

AF378705)seobservaronseissitios, locualconcuerdaconanlisispreviosdonde se

estableci que lamayora de los aislamientos de campo de CDV poseen sitios de

glicosilacinadicionalesenlahemaglutininarespectoalacepavacunalOP(Figura17y

20)(Mochizukietal.,1999;Sawatsky&vonMessling,2010).

57

Resultados

Figura20.Representacinesquemticadelossitiospotencialesdeglicosilacindelasecuencia

aminoacdicadelahemaglutininadelosaislamientosdeUruguay,ArgentinaylacepaOP.OP:

Onderstepoort,Uy:Uruguay,Arg:Argentina.

3.2.1.7Estudiodepresionesselectivas

El anlisis de presiones selectivas mediante el algoritmo SLAC se realiz con las

secuencias de la hemaglutinina descritas en esta Tesis y las 198 secuencias no

redundantespublicadasen labasededatos.ElvalordN/dSglobalde laprotenafue

menorque1(0.28),indicandoqueseencuentrabajoseleccinnegativa.Elanlisisde

las presiones selectivas en los codones individuales revel que 246 codones estn

seleccionadosnegativamente,347evolucionandeformaneutraly11estaransujetos

aseleccinpositiva(Tabla6).

Entre los codones seleccionados positivamente, se encuentran dos (530 y 549) que

estnlocalizadosenlaregincodificantedelazonadeuninalreceptorcelularSLAM.

Se observ que el aa codificado por el codn 530 difiere entre los grupos

sudamericanos SA1 y SA2, en los aislamientos de SA1 se identific glicina (530G),

mientrasqueenlospertenecientesaSA2seobservcidoasprtico(530D).Enelcaso

del codn 549, todos los aislamientos sudamericanos codificaron tirosina (549Y)

(Figura17).

58

Resultados

CodonCambios S

obsCambios NS

obs E [sitios S] E [sitios NS] dS dN dN-dS146 0 3 0.35 0.81 0 3.72 3.72160 0 4 0.32 0.78 0 5.12 5.12302 0 3 0.34 0.82 0 3.66 3.66309 0 4 0.30 0.86 0 4.64 4.64370 0 4 0.29 0.80 0 4.99 4.99376 1 7 0.30 0.86 3.28 8.18 4.90401 0 3 0.38 0.73 0 4.09 4.09412 0 4 0.38 0.78 0 5.14 5.14417 0 3 0.35 0.81 0 3.71 3.71530549

2.50 9.50 0.35 0.81 7.19 11.75 4.550 5 0.30 0.79 0 6.32 6.32

Tabla6.Representacindelosresiduossujetosaseleccinpositivaenlahemaglutinina.Sedestacaen

recuadrolosresiduos530y549.CambiosSobs:nmerodecambiossinnimosobservadosenelsitio,

Cambios NS obs: nmero de cambios no sinnimos observados en el sitio, E [sitios S]: nmero de

cambiossinnimosesperadosenelsitio,E[sitiosNS]:nmerodecambiosnosinnimosesperadosenel

sitio,dS:cambiosSobs/E[sitiosS],dN:cambiosNSobs/E[sitiosNS],dN:cambiosNSobs/E[sitiosNS]

cambiosSobs/E[sitiosS].

3.2.2Pptidosealdelaprotenadefusin

3.2.2.1AmplificacinporRTPCRtiempofinal

SerealizlaRTPCRparaamplificarlos681pbqueincluyenalareginFsp(405pb)en

todaslasmuestrasuruguayasdondesehabaobtenidolasecuenciaparcialocompleta

delgenH,aexcepcindeunaislamiento(CDV109).Seobtuvieronresultadospositivos

paraseisaislamientoscaracterizadospreviamenteporelgenH,yademsseobtuvoel

amplicnenunnuevoaislamiento(CDV127)(Tabla4)(Figura21).

Conlosaislamientosargentinossesiguielmismocriterio,yseamplificlareginFsp

deloscuatroaislamientoscaracterizadosmedianteelanlisisdelgenH(Tabla4).

59

Resultados

Figura21.Electroforesisengeldeacrilamidaal6%deproductodePCRdelareginFsp.Carril1:blanco

PCR, Carril 2: CDV75 fragmento F4854R5535, Carril 3: CDV128 fragmento F4854R5535, Carril 4:

marcadordepesomolecular(850pb,450pb,200pb,50pb).

3.2.2.2Estudioscomparativos

Las secuenciasnucleotdicasde405pbcorrespondientesa los135aadelFspde los

aislamientos de Uruguay y Argentina, se editaron, alinearon y compararon. Los

aislamientosuruguayospresentaronsietesitiosnucleotdicosvariablesycincocambios

aminoacdicos (Figura22,23).Elanlisisde lassecuenciasde loscuatroaislamientos

argentinos mostr una elevada variabilidad gentica con 45 sitios nucleotdicos

variablesy28cambiosanivelaminoacdico(Figura22,23).

60

Resultados

61

Resultados

Figura22.AlineamientodelassecuenciasnucleotdicasdelFspdelosaislamientosdeUruguay,

ArgentinaylacepaOP.

Figura23.AlineamientodelassecuenciasaminoacdicasdelFspdelosaislamientosdeUruguay,

ArgentinaylacepaOP.

3.2.2.3Anlisisfilogentico

Elestudio incluy las secuenciasaminoacdicasde los11aislamientosdeUruguayy

Argentina caracterizados en esta Tesis, y 15 secuencias de aislamientos de

Norteamrica,AsiayEuropapublicadosenlabasededatos(Tabla4).

Elanlisis filogentico revelque losaislamientosdeSudamricaseagrupanendos

cladosseparadosaligualqueloobservadoenelanlisisdelahemaglutinina.Elprimer

cladoestconstituidoportodoslosaislamientosuruguayosyelargentino(Arg23)con

un valor de bootstrap de 89%. Este clado se relaciona con cepas de Europa,

correspondientesallinajeEU1segnelanlisisdelahemaglutinina,conunbootstrap

de100%(Figura24).Ladivergenciaaminoacdicadentrodeestecladoseubicentre0

6,7%,dondelosaislamientosdeUruguaypresentaronvaloresdedivergenciaentre0

3%,yvaloresdel4,46,7%respectoalaislamientoargentinoArg23(Tabla7A).Este

cladoserelaciona con cepas de Europa,correspondientes al linajeEU1 segnel

anlisisde lahemaglutinina, conunbootstrapde100% (Figura24).Losaislamientos

62

Resultados

de este clado sudamericano mostraron un porcentaje promedio de diferencias

aminoacdicasdel10.5%respectoaloseuropeosconlasqueseagrupan,ysuperiores

al22.8%encomparacinalosaislamientosdeAsiayNorteamrica(Tabla7B).

Elotro clado sudamericano est constituidopor los aislamientos argentinos (Arg24,

Arg25yArg26),yposeeunvalordebootstrapdel100%,elcualaparececlaramente

separadodelrestodelosaislamientosenelcladograma.Losvaloresdedivergenciade

dichosaislamientosseubicaronentre0y2,2%(Figura24)(Tabla7A).Lacomparacin

deamboscladossudamericanosmostrvaloresdedivergenciadehasta22.2%(Tabla

7A). Sus valores de divergencia respecto a los aislamientos deAsia yNorteamrica

fueronsuperioresal23.8%(Tabla7B).

Debido a que los aislamientos sudamericanos presentan las mismas relaciones

filogenticas que las observadas con el anlisis de la hemaglutinina, tambin

denominamosSA1ySA2aambosclados.

63

Resultados

64

Resultados

Figura24.Cladogramaenbasea la secuenciaaminoacdicadel Fspde losaislamientosdelRode la

Plata,dediversasregionesgeogrficasycepasvacunales.Comogrupoexternoseempleolasecuencia

delFspdeunaislamientodelvirusdelSarampin (MV) (NaccesoU03670).SA1:Sudamrica1,SA2:

Sudamrica2,NA:Norteamrica,Vac:Cepasvacunales.

3.2.2.4ComparacinconlacepavacunalOP

En la comparacinde las secuencias aminoacdicasde ambos clados sudamericanos

con la cepaOP (n acceso AF378705), se observ un rango de 65 69 diferencias

nucleotdicas, y cambios aminoacdicos en el rango de 42 44 (Figura 22, 23). El

anlisis filogentico revel que todos los aislamientos de Sudamrica aparecen

claramenteseparadosde lacepaOP(Figura24).Elvalordedivergenciaaminoacdica

promedioparaelcladoSA1fuede32,4%,mientrasqueparaelcladoSA2elvalorse

ubicen32,1%(Tabla7B).

A

CDV75 CDV102 CDV111 CDV116 CDV127 CDV128 CDV141 Arg23 Arg24 Arg25CDV75 CDV102 0.015 CDV111 0.015 0 CDV116 0.022 0.007 0.007 CDV127 0.03 0.015 0.015 0.022 CDV128 0.03 0.015 0.015 0.022 0 CDV141 0.03 0.015 0.015 0.022 0 0 Arg23 0.044 0.052 0.052 0.059 0.067 0.067 0.067 Arg24 0.193 0.193 0.193 0.2 0.2 0.2 0.2 0.193 Arg25 0.215 0.215 0.215 0.222 0.222 0.222 0.222 0.215 0.022 Arg26 0.215 0.215 0.215 0.222 0.222 0.222 0.222 0.215 0.022 0

B

SA1 SA2 Europa NA AsiaSA1 SA2 0.211 Euro 0.105 0.207 NA 0.228 0.238 0.221 Asia 0.256 0.259 0.242 0.274 Vac 0.324 0.321 0.319 0.265 0.279

Tabla7.AnlisisdedistanciaaminoacdicadelFsp.

A.AnlisisdelosaislamientosdeUruguayyArgentina.Sedestacaenrecuadrolosvaloresdedivergencia

entrelosaislamientosdeloscladossudamericanosSA1ySA2.

B.Porcentajepromediodediferenciasaminoacdicasentrelosaislamientosdeloscladossudamericanos

yaislamientosdeEuropa,Norteamrica,AsiaylacepavacunalOnderstepoort.Serecuadranlosvalores

de divergencia respecto al grupo SA1. SA1: Sudamrica1, Euro: Europa, SA2: Sudamrica2, NA:

Norteamrica,Vac:cepaOnderstepoort.

65

Resultados

3.2.2.5Estudiodepresionesselectivas

El anlisis de presiones selectivasmediante el algoritmo SLAC se realiz con las 11

secuencias descritas en esta Tesis y las 47 secuencias no redundantes del Fsp

publicadasenlabasededatos.ElvalordN/dSglobalfuecercanoa1(0.97),indicando

queevolucionadeformaneutral.Elanlisisdelaspresionesselectivasenloscodones

individualesrevelque18codonesestnsujetosaseleccinnegativa,104evolucionan

demodoneutral,mientrasque12lohacenbajoseleccinpositiva(Tabla8).

CodonCambios S

obsCambios NS

obs E [sitios S] E [sitios NS] dS dN dN-dS3 0 5 0.79 2.43 0 2.06 2.064 0 6 0.82 2.32 0 2.59 2.5912 1 8 1.45 1.50 0.69 5.35 4.6519 0 4 1.08 2.15 0 1.86 1.8621 0 9 0.90 1.85 0 4.88 4.8828 0 7 1.06 2.17 0 3.23 3.2349 0 5 1.02 2.21 0 2.26 2.2651 0 3 1.32 1.23 0 2.43 2.4358 0 6 0.79 2.42 0 2.48 2.4864 0 5 1.06 2.17 0 2.31 2.3199 0 5 0.88 2.30 0 2.17 2.17110 0 4 1.04 2.18 0 1.83 1.83

Tabla8.RepresentacindelosresiduossujetosaseleccinpositivaenelFsp.CambiosSobs:nmerodecambios sinnimos observados en el sitio, Cambios NS obs: nmero de cambios no sinnimosobservadosenel sitio,E [sitiosS]:nmerodecambios sinnimosesperadosenel sitio,E [sitiosNS]:nmerodecambiosnosinnimosesperadosenelsitio,dS:cambiosSobs/E[sitiosS],dN:cambiosNSobs/E[sitiosNS],dN:cambiosNSobs/E[sitiosNS]cambiosSobs/E[sitiosS].

66

Discusin

4.DISCUSIN

Distemper es una de las afecciones virales demayor incidencia y relevancia a nivel

mundial en cnidos domsticos y salvajes. Desde hace unas dcadas, se registran

continuamente brotes de la enfermedad en el mundo (Appel & Summers, 1999;

Lednicky et al., 2004; Keawcharoen et al., 2005; Lan et al., 2006), as como una

preocupanteexpansinenelrangodehuspedes(Harderetal.,1996;Lednickyetal.,

2004; Goller et al., 2009). Sudamrica no est exenta de esta problemtica,

observndose un aumento en los casos de Distemper en canes domsticos de

Argentina yBrasil (Gebaraetal.,2004; Saitoetal.,2006;Caldernetal.,2007).En

Brasil,Distemperconstituyeademslaprincipalcausademuerteoeutanasiaencanes

domsticos (Del Puerto et al., 2010). En ambos pases tambin se han registrado

infeccionesnaturalesporCDVen felinosy zorros (Navaetal.,2008;Ferreyraetal.,

2009;Megidetal.,2009).

En los

Distemper

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Transcript of Distemper