DIVISIÓN DE

CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD

LABORATORIO DE QUIMICA

TÍTULO DEL PROYECTO DEL QUE SE DERIVA: “ FENOMENOS DE ADSORCION MOLECULAR EN LA

INTERFASE ELECTRODO/ELECTROLITO, UN

ESTUDIO DE MICROSCOPIA POR SONDA”

TÍTULO DEL PROYECTO DE SERVICIO SOCIAL:

ASESOR: Dr. NIKOLA BATINA

LICENCIATURA EN BIOLOGIA EXPERIMENTAL MATRICULA:99221722

TEL: 017717153041

CLAVE DE REGISTRO: BE.038.03 .

TRIMESTRE LECTIVO

04-P.

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA

CARACTERIZACION DE MATERIALES DE ORIGEN BIOLOGICO CON MICROSCOPIA DE FUERZA ATÓMICA

INTRODUCCION

La principal composición química de la membrana celular son las proteínas y

lípidos. El colesterol es uno de los lípidos más importantes de la membrana

celular. Este está presente en todos los sistemas vivos, principalmente en la

estructura de la membrana celular, en el aislamiento de los nervios, la producción

de ciertas hormonas y la síntesis del ácido biliar, el colesterol es altamente

insoluble en agua y dentro del cuerpo normalmente en el colesterol esta adherido

a lipoproteína o incorporados en lípidos en forma de agregación tanto como en

micelas biliares y sales biliares. Cuando el colesterol es insoluble en los sistemas

biológicos, es separado en la fase de aceites o cristales. Las causas que provocan

la precipitación del colesterol no están del todo bien entendidas. Pero se puede

incrementar la concentración del colesterol o bajarla. El depósito del colesterol en

las paredes internas de las arterias, causa lo que se llama arteriosclerosis.

La molécula del colesterol contiene un núcleo ciclopentanoperhidrofenantreno y

presenta un grupo hidroxilo en el carbono 3, una cadena lateral de 8 átomos de

carbono, doble enlace en el C-5 y además de los grupos metilos C-18, C-19, C-

21, C-26 y C-27, cuando se produce en un plano tiene torsiones en la región de

los carbonos número 4-5-10-1 y 5-10-1-2, tiene un carácter hidrofóbico y en su

estructura denota dos planos de superficie muy importante, la parte hidrofóbica

(CH3 – Terminal ) y la parte hidrofílica (OH – terminal). Fig.(1)

Fig. 1 Estructura del Colesterol

El microscopio de fuerza atómica (AFM, Atomic Force Microscope) o SFM

(Scanning Force Microscope), fue inventado en 1986 por Binnig, Quate y Gerber.

Fig.2.

Fig.2.Microscopio de Fuerza Atómica (AFM).

El AFM registra la información de la superficie de una muestra a través del

movimiento de una punta muy delgada y aguda sobre la muestra. Fig.3. La punta

está situada en el extremo de un pequeño brazo de palanca que, cuando la punta

se mueve sobre la superficie de la muestra, se dobla como respuesta a la fuerza

de interacción atómica entre la punta y la superficie.

El primer AFM utilizaba un microscopio de transmisión de electrones (STM,

Scanning Tunneling Microscope) para detectar el doblez del brazo de palanca en

presencia de la superficie, pero ahora los microscopios de fuerza atómica

modernos utilizan un dispositivo óptico. Una ventaja inmediata es que la punta no

necesita ser conductora y las propiedades de conducción de electrones de la

muestra a analizar no son importantes.

La punta del AFM se mantiene en la misma posición todo el tiempo y es la

muestra la que se mueve bajo la punta. Esto se logra colocando la superficie

sobre el extremo de un cilindro hecho de un material piezoeléctrico, el cual, al

aplicarle una diferencia de potencial, cambia sus dimensiones. Por medio del

material piezoeléctrico podemos mover la muestra en cualquier dirección en el

espacio. El coeficiente piezoeléctrico de dicho material, cuando deseamos analizar

muestras a escalas atómicas, es del orden de 15-20 A°/Volt, lo que nos permite

tener una precisión de alrededor de 0.01 A° para el movimiento de la muestra.

Cuando queremos analizar superficies de mayor escala, como por ejemplo de

100:m x 100:m, el coeficiente del piezoeléctrico utilizado es del orden de 200-300

nm/Volt.Fig.4.

Fig. 3. Punta utilizada en AFM Si3N

Fig. 4. Esquema de un microscopio de fuerza atómica, en el se aprecian los componentes

básicos que lo conforman: punta de sondeo, explorador piezoeléctrico, censor de

desplazamiento o censor de posición y equipo de control.

La resolución del AFM depende del tamaño del área analizada de la muestra, ya

que el AFM siempre tomará 512 x 512 datos sin importar que tan grande sea el

área analizada, de modo que entre más pequeña sea el área analizada, mayor

será la resolución.

El conjunto de puntos tomados por el AFM se pueden representar como una

imagen en dos dimensiones, en donde las alturas relativas entre punto y punto se

diferencian por tonalidades. Las partes más claras representan zonas de mayor

altura, respecto a la media, y las zonas más oscuras las zonas de menor altura en

la superficie.

Del archivo de datos, también se puede generar una imagen en tres dimensiones

de la superficie, en donde la tercera dimensión es la altura de cada punto.

Si pretendemos detectar rugosidades en la superficie producidas por átomos y

analizar las muestras en rangos de sub-ángstrom entonces es de vital importancia

lograr aislar la punta del AFM de vibraciones externas. Para evitar interferencia de

las vibraciones producidas en el laboratorio, la cabeza del AFM (donde se

encuentra la muestra, la punta, el sistema óptico, etc.), se encuentra suspendida a

través de un sistema de hule que posee una frecuencia natural de vibración del

orden de 1 Hz. Esta suspensión de hule es efectiva para eliminar vibraciones

verticales y horizontales del medio ambiente. Además, el material con el que está

hecha la cabeza del AFM es un material rígido con una frecuencia natural de

vibración alta, del orden de Khz. Con esta combinación de frecuencia de

resonancia se logra eliminar ruidos de vibración provenientes del laboratorio con

frecuencia entre los hertz y los kilohertz. Además, los brazos de palanca comunes

poseen una frecuencia natural de vibraciones mayores a 80 Khz., lo que ayuda al

aislamiento vibracional. El ruido acústico también representa un problema para las

mediciones del AFM por esto se requieren laboratorios tranquilos, además de que

resulta conveniente colocar una caja de protección sobre el AFM.

Si el sistema de retroalimentación está activado entonces el material

piezoeléctrico, conforme la punta se mueva sobre la superficie, responderá a

cualquier cambio en la fuerza, alterando la separación de la punta y la muestra

con el fin de restablecer el valor predeterminado de la fuerza. De este modo la

fuerza ejercida por el material sobre la punta se mantiene constante. A este modo

se le conoce como modo de fuerza constante.

Si por el contrario, el sistema de retroalimentación está desactivado, entonces el

microscopio operará con una separación entre la punta y la muestra constante, por

lo que se llama modo de altura constante. Este modo es útil cuando se van a

analizar superficies muy planas con una alta resolución.

Sin embargo, debido a que la fuerza entre la punta y la superficie es una función

complicada de la separación, existen diferentes tipos de imágenes que se pueden

obtener con el AFM, las tres principales clases de interacción son: modo de

contacto (Contac Mode), modo oscilante (Tapping Mode) y modo de no-contacto

(non-contactmode).Fig.5.

Fig.5.Modos de contacto de la punta (AFM).

Las ventajas del Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) es una alta resolución, se

maneja en diferentes ambientes de trabajo, da información adicional a la

morfología y nos proporciona imágenes tridimensionales. Entre las desventajas

que podemos mencionar para este microscopio son, la velocidad de adquisición

lenta, sensibilidad a la temperatura y sensibilidad a vibraciones.

A continuación la representación de un arreglo estructural de la ultima capa de la

superficie de Au (111), mostrándose cada átomo de oro que se encuentra rodeado

de seis átomos Fig.6. Esta estructura es interesante, ya que dependiendo del

arreglo de substrato las moléculas podrían en un momento dado adsorberse y

arreglarse respetando la estructura del substrato .Es interesante observar y hacer

notar la posición que adoptan los átomos de una capa sobre otra. Es un buen

sustrato para usarlo en AFM ya que la superficie es completamente plana.

Fig.6. Arreglo de átomos definidos en la última capa de una superficie Au(111)

OBJETIVO GENERALES

Conocer la función y manejo del Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) para

obtención de imágenes de colesterol en sustrato plano Au (111) a nivel molecular.

OBJETIVOS ESPECIFICOS -Entender el principio del Microscopio de Fuerza Atómica (AFM)

-Obtener imágenes de colesterol a nivel atómico

-Desarrollo de metodología para la fijación de material biológico (colesterol) en

AFM desde la solución de etilenglicol en sustrato sólido metálico perfectamente

plano

EQUIPO UTILIZADO

1. Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) Nanoscope III .

2. Sistema purificador de Agua Milli-Q.

3. Baño ultrasonido (Branson 1210)

MATERIAL Y REACTIVOS

1. Placas de vidrio con película de Au (111); Berliner Glas Co. Berlin,

Germany

2. Colesterol (origen humano), 99+% pureza, Marca Aldrich

3. Etilenglicol, 99.8% anhidro, Marca Aldrich Chemical

4. Hidrogeno (H2) Gas Inflamable; Infra S.A de C.V .México D.F. México

5. Dicromato de Potasio (KCr2O7), Grado técnico; Reasol S.A de C.V México

D.F.; México.

METODOLOGÍA Preparación de Soluciones

-Se preparo una mezcla de dicromato de potasio (dos cucharas pequeñas

aproximadamente, 10 grs.). Agua purificada (300 ml) y ácido sulfúrico la cantidad

necesaria hasta alcanzar la saturación.

-Todo el Material de cristalería fue previamente lavado con la mezcla crómica y se

enjuago con abundante agua purificada con el sistema Milli-Q Millipore.

-Se prepararon 5 ml de solución de colesterol 2x10-4M pesamos 3.98301 x10-4 g

de colesterol, se colocaron en un matraz volumétrico y se aforaron a 5 ml con

etilenglicol, posteriormente la solución fue sometida a baño de ultrasonido por 1

hora con la finalidad de disolverla por medio de ondas de sonido.

-Se prepararon 500 ml de hidróxido de sodio (NaOH) 6 N, se pesaron 24 g de

hidróxido de sodio, los cuales se colocaron en un matraz volumétrico para

posteriormente aforar a 500 ml con agua ultra pura.

Preparación del Sustrato de Au (111)

Se corto aproximadamente 1 cm2 de placa de vidrio con película de oro

depositado en su superficie de marca Berliner Glass y se enjuagado con agua

ultra pura para eliminar toda las impurezas generadas en el corte. Posteriormente

se le aplico calor, con el método de annealing que consiste en calentar con flama

de Hidrogeno a la placa con película de oro a una temperatura 400 °C de 25-30

segundos, para tener una superficie con terrazas mas planas y grandes, es decir

una superficie plana y ordenada. Después se enfrió a temperatura ambiente

cubriéndola con una caja petri para evitar que se adsorban impurezas. Una vez

enfriada dicha placa se utiliza para la colocación de muestra.

Preparación de muestra

Se coloco una gota de la disolución (2x10-4 M) del colesterol en etilenglicol sobre

el sustrato Au (111), la muestra se sometió a movimientos rotatorios durante 4

minutos, para mejorar la dispersión de la solución sobre el substrato. Se dejo

secar y se coloco en una caja petri de vidrio para protección contra el ambiente.

ACTIVIDADES REALIZADAS

Programación en meses Actividad Mes1 Mes 2 Mes 3 Mes 4 Mes 5 Mes6

Revision Bibliográfica

X X X X X X

Investigación de métodos

X X

Preparación de muestras

X X

Visualización X X Interpretación de resultados

X

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS

Entre los objetivos alcanzados durante el tiempo de la prestación del servicio

social están el conocimiento del fundamento y manejo de un microscopio de alta

resolución como es el Microscopio de Fuerza Atómica (AFM), el desarrollo de una

metodología para la fijación de muestras biológicas y visualización de imágenes.

Las metas logradas fueron el conocimiento de nuevas técnicas para trabajar en un

laboratorio de Nanotecnología, como son; Preparación de soluciones, preparación

de placas de oro y muestras para observar en los microscopios.

RESULTADOS

Fig.1. Imagen tridimensional de una película de colesterol monohidratado 2x10-4

M en etilenglicol y adsorbidas a temperatura ambiente sobre Au (111) con el

microscopio de fuerza atómica (AFM).

Fig. 2. Imagen tridimensional de capas de moléculas de colesterol monohidratado

2x10-4 M en metanol (AFM).La mayoría de las moléculas están acumuladas sobre

las orillas del sustrato del oro, color blanco (colesterol).

CONCLUSION

Las moléculas de colesterol monohidratado (colesterol 99% Aldrich) con una

concentración 2x10-4 M es preparado en diferentes solventes como, metanol y

etilenglicol, que son absorbidas sobre placas Au (111) a temperatura ambiente

(20°C) y visualizado por medio de Microscopia de Fuerza Atómica (AFM). En el

caso del colesterol en etilenglicol, en la imagen se muestra una película compacta

delgada sin posibilidad de disolver el sustrato en oro, esto es posible por la

tendencia que tiene el etilenglicol y el colesterol para coabsoberse en una

superficie de oro y formar una película compacta. En el caso del metanol se

observo que esta molécula se agrega en las orillas de los granos de Au, la

diferencia se debe probablemente a que la polaridad del etilenglicol (1.99) es más

baja en comparación con el metano (5.1).

La Visualización con el Microscopio de Fuerza Atómica tiene una gran importancia

para los materiales biológicos, ya que puede trabajar con cualquier tipo de

muestra y determina la estructura de material biológico e interacciones con

sustrato sólido u otros materiales.

CRITERIOS DE EVALUACIÓN

Las evaluaciones se realizaron de la siguiente forma:

-Semanalmente el asesor junto con otros participantes del servicio social

discutíamos los resultados obtenidos en el periodo semanal.

- Al final de cada actividad se realizaba una junta en la cual se discutían los

resultados obtenidos y se planeaba las actividades para el siguiente mes.

- También se realizo una evaluación final donde se valoro el trabajo realizado

durante el periodo total del servicio social.

BIBLIOGRAFIA

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*G.Binnig, C.F. Quate , Ch .Gerber.Physical review letters. V56 NO. 9 . (1986) 930-933 *S,Morita.R,Wiesendanger.E,Meyer.Noncontact atomic force microscopy.Germany ,Springe.P.11-14