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DMSIÓN DE CIENCIAS BIOLóGICAS Y DE LA SALUD DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA

OBTENCI~N DE MARCADORES GENÉTICOS EN Penicillium chrysogenum , UTILIZANDO MÉTODOS DE SELECCIóN RACIONAL Y CARACTERIZACI~N PARCIAL DE LAS

MUTANTES.

TESIS Para obtener el grado de

MAESTRO EN BIOTECNOLOGÍA Presenta

EDELMIRA MANZANO CUEVAS

Méxic0,D.F. 1998

Lista de abreviaciones. lndice de figuras. Indice de tablas.

I. Introducción

I1 Hipótesis.

IIl. Objetivo.

1 V. Generalidades.

CONTENIDO.

1. Clasificación. 2. Metabolites ligados y no ligados al Crecimiento. 3. Penicilina. 4. Fermentación sólida.

4. l. Definición. 4.2. Ventajas y desventajas.

5.1 . Mutación. 5. Mejoramiento genético.

I11 1v V

1

3

3

4

V Antecedentes.

I

16

VI. Materiales y Métodos. 21

l . Microorganismos. l . 1 . Conservación.

2. Medios de cultivo. 3. Condiciones de cultivo.

3.1 Fermentación Líquida. 3.2 Fermentación Sólida.

4. Mutagénesis y Curva de Sobrevivencia. 5. Obtención de mutantes Auxótrofas a aminoácidos.

5. l . Procesos de enriquecimiento por filtraciones sucesivas. 5.2. Enzima lítica Novozyme.

6. l . Aslamiento de mutantes resistentes al 5 FOA. 6. Obtención de mutantes Auxótrofos a uridina.

VII. Resultados.

l . Selección de cepas. 2. hslamiento de auxótrofos.

2. I . Mutagenesis. 2.2. Mutantes Auxótrofos a aminoácidos. 2.3. Mutantes Auxótrofos a uridina.

en mutantes auxótrofas. 3. Evaluación del nivel de producción de penicilina

VIII. Discusión.

l . Selección de cepas. 2. Aslamiento de auxótrofos.

2. l . Mutagénesis. 2.2. Mutantes Auxótrofos a aminoácidos. 2.3. Mutantes Auxótrofos a uridina.

3. Caracterización de las cepas parentales y auxótrofas. 4. Evaluación del nivel de producción de penicilina

en mutantes auxótrofas.

21 21 21 24 24 26 27 28 28 30 31 31

33

33 38 38 42 44

45

54

54 55 55 56 58 59

60

1X. Conclusiones. 63

X. Bibliografía. 64

11

Lista de abreviaciones.

AFA " C cm DNA EMS ESP 5FOA FS FL Fig. g h MC MM mg m1 Pg min MET NTG OMP PSIPI PSff L PDA PEG rP9 S orgánico SFS SFL SMM TSA UMP uv

-

Acido fenil acético. grados centígrados. centímetros. ácido desoxi-ribonucleico. etil metano sulfonato esporas. ácido 5 fluororótico. fermentación sólida. fermentación líquida. figura. gamos. horas. medio completo. medio mínimo. miligramos. mililitros. microgamos. minutos. fenotipo de auxotrofia a metionina. nitroso metil guamdina orotidin monofosfato. producción relativa. productividad relativa. agar papa dextrosa. polietilenglicol. revoluciones por minuto. fenotipo de auxotrofia a fuentes inorgánicas de azufre. sistema de fermentación sólida. sistema de fermentación líquida. sólidos de maceración del maíz. agar de soya y tripticaseina. uridin monofosfato. radiación ultravioleta.

111

Indice de figuras.

Figura 1 : (pag. 5) Estructura química de las penicilinas.

Figura 2 : (pag. 13) Ruta biosintética de la U M P en hongos filamentosos

Figura 3 : (pag. 36) Cinéticas de a) producción de penicilina, b)pH y c)humedad de las cepas P2-32 y P2-37 de P. chrysogenum cultivadas en FS a 25 "C y con un flujo de aire de 2.4 V h .

Figura 4 : (pag. 37) Cinéticas de a) producción de penicilina, b)pH y c)humedad de las cepas P2-32 y P2-37 de P. chrysogenum cultivadas en FL a 25 "C y 270 rpm.

Figura 5 : @ag. 39) Curva de sobrevivencia. Porciento en función de la irradiación con luz UV y esporas sobrevivientes de la cepa de P. chrysogenum P2-32. Condiciones : 27 ml de suspención acuosa a una concentración de esporas totales de 8 X 1 O6 esp /ml, agitación de 36 rprn e intencidad de irradiación UV de 250pW/cm2.

Figura 6 : (pag. 40) Curva de sobrevivencia. Porciento en función de la irradiación con luz U V y esporas sobrevivientes de la cepa de Y. chrysogenum P2-37. Condxiones : 27 ml de suspención acuosa a una concentración de esporas totales de 8 X IO6 esp /ml, agitación de 36 rpm e intencidad de irradiación UV de 250pW/cm2.

Figura 7 : (pag. 41) Comparación entre las mutantes morfológicas y el porcentaje de sobrevivencia de la cepa de P. chrysogenum P2-37.

Figura 8 : (pag. 48) Cinéticas de producción de penicilina de las cepas a) P2-32 y b) P2-37 de P. chrysogenum tanto de su primera (al inicio del trabajo experimental) como de su segunda caracterización (al caracterizar las mutantesauxótrofas aisladas), cultivadas en FS a 25 "C y con un flujo de aire de 2.4 vh.

IV

Figura 9 : (pag. 49) Cinéticas de producción de penicilina de las cepas a) P2-32 y b) P2-37 de P. chrysogenum tanto de su primera (al inicio del trabajo experimental) como de su segunda caracterización (al caracterizar las mutantesauxótrofas aisladas), cultivadas en FL a 25 "C y 270 rpm.

Figura 10 : (pag. 50) Cinéticas de a) producción de penicilina, b)pH y c)humedad de la cepa parental P2-32 y de la mutante auxótrofa E-32U de 1'. chrysogenum cultivadas en FS a 25 "C y con un flujo de aire de 2.4 V h .

Figura 11 : (pag. 5 1) Cinéticas de a) producción de penicilina, b)pH y c)humedad de la cepa parental P2-32 y de la mutante auxótrofa E-32U de P. chrysogenum cultivadas en FL a 25 "C y 270 rpm.

Figura 12 : (pag. 52) Cinéticas de a) producción de penicilina, b)pH y c)humedad de la cepa parental P2-37 y de la mutante auxótrofa E-37Ml de P. chrysogenum cultivadas en FS a 25 "C y con un flujo de aire de 2.4 V h .

Figura 13 : (pag. 53) Cinéticas de a) producción de penicilina, b)pH y c)humedad de la cepa parental P2-37 y de la mutante auxótrofa E-37Ml de Y. chrysogenum cultivadas en FL a 25 "C y 270 rpm.

Inhce de Tablas.

Tabla 1 : (pag. 30) Suplementación de aminoácidos al MM para determinar tipo de auxotrofia presente en los mutantes (Gunasekaran 1995).

Tabla 2 : (pag. 3 3 ) Comparación de la producción y productividad máxima de penicilina alcanzadas por cinco cepas de P. chrysogenum cultivadas en FS a 25 "C y flujo de aire de 2.4 Vh y en FL a 25 "C y 270 rpm .

Tabla 3 : (pag. 34) Comparación de los factores de producción y productividad relativa entre las cinco cepas de P. chrysogenum cultivadas en FS a 25 "C y flujo de aire de 2.4 I/h y en FL a 25 "C y 270 rpm .

Tabla 4 : (pag. 42) Eficiencia de filtración de tres materiales diferentes.

Tabla S : (pag. 43) Resultados de los procesos de enriquecimiento.

Tabla 6 : (pag. 43) Mutantes aisladas de la cepa P2-37.

Tabla 7 : (pag. 44 ) Efecto de tres dosis de 5FOA empleadas para determinar la resistencia de la cepa P2-32 sin mutar de P. chrysogenum, en MM con lactosa y suplementada con 100 p g / d de uridina.

Tabla 8 : (pag. 46) Comparación de la producción y productividad máxima de penicilina alcanzadas entre las cepas de P. chrysogenum parentales P2-32 y P2-37 y entre las mutantes auxótrofas E-32U y E-37 M1 cultivadas en FS a 25 "C y flujo de aire de 2.4 l/h y en FL a 25 "C y 270 rpm.

Tabla 9 : (pag. 47) Comparación de los factores de producción y productividad relativa entre las cepas de P. chrysogenum parentales P2-32 y P2-37 y entre las mutantes auxótrofas E-32U y E-37 MI cultivadas en FS a 25 "C y flujo de aire de 2.4 Vh y en FL a 25 "C y 270 rpm.

VI

lntroduccron

1 Introducci6n.

Después de la segunda guerra mundial el sistema de fermentación sólida (SFS) h e restringido por mucho tiempo a solamente la fermentación de alimentos tradicionales y a la producción de algunas enzimas líticas (Nagai, 1979). La producción a escala industrial se desarrolló para fermentación líquida (FL), por medio de la cuál se obtienen productos de importancia tales como : enzimas hidrolíticas, aminoácidos, antibióticos y otros productos bajo condiciones perfectamente controladas; esta situación no favoreció el desarrollo de cultivos por fermentación sólida. Sin embargo, desde hace algunos años la fermentación sólida (FS) ha sido reevaluada, permitiendo su modernización y aplicación en nuevos campos (Nagai, 1979; Abdullah y col., 1985; Oriol y col., 1988a; Barrios y col., 1988; Mudget, 1986; Barrios y Mejía 1996).

El SFS constituye una interesante alternativa para antibióticos y otros metabolitos secundarios ya que ha mostrado tener un gran potencial (Barrios y col., 1988), además de que los productos generados por este sistema se obtienen más concentrados y los costos de proceso de purificación son menores (Rivera y col., 1991).

Se ha desarrollado un SFS en el que se utiliza un soporte inerte (bagazo de caña de azúcar) impregnado con medio líquido (Barrios y col., 1988; Viniegra 1997). Este SFS fue aplicado exitosamente para producir penicilina por Barrios y col. (1988). Los rendimientos obtenidos fueron varias veces mayores a los obtenidos en FL bajo condiciones similares de cultivo, además de producirse en tiempos más cortos.

Debido a que uno de los principales aspectos positivos del SFS es que los metabolitos se producen, generalmente, en mucho mayor cantidad que por el sistema de fermentación líquida (SFL) (Barrios y co1.,1988; Barrios y col., 1993) resulta de gran importancia el realizar mayores estudios en cuanto a los niveles de producción de la cepa, ya que estos estuhos se han realizado con cepas de baja producción, que son más parecidas a las cepas silvestres que a las mutantes hiperproductoras usadas en fermentaciones líquidas industriales.

En un estudio realizado en producción de enzimas (Shankaranand y co1.,1992) se llevó a cabo la adaptación de cepas de Bacillus de alta producción desarrolladas para FL, en procesos de FS, observándose discrepancias en el nivel de producción de enzimas en ambos sistemas. Los autores concluyen que no se puede confiar en

1

que una cepa de alta producción en FL vaya a expresar este mismo nivel de producción en FS. Puede suponerse que durante los procesos de mejoramiento genético para la obtención de cepas especialistas y sobreproductoras para FL, se hayan perdldo características o capacidades que permitan un buen desarrollo y rendlmiento en FS. Surge entonces la necesidad de programas de mejoramiento y selección de cepas mejor adaptadas al medio sólido (Barrios y Mejía, 1996).

Una alternativa de solución a esta necesidad es la mutagénesis, la cuál ha constituido el método empírico tradlcional para el mejoramiento de cepas; esta es s e p d a de una selección por pruebas directas de un gran número de purificaciones. Sin embargo el examen al azar representa un proceso de mucho trabajo debido al gran número de aislamientos que deben realizarse para poder detectar las cepas mejoradas.

La cantidad de trabajo puede reducirse sigmficativamente mediante el uso de otros procedimientos que además disminuyen los elementos empíricos, tanto en el mejoramiento como en la selección, mediante la aplicación de principios específicos de bioquímica y genética. Puede entonces recurrirse a procesos naturales de recombinación genética que permite el intercambio de información de dos organismos con diferentes características. Estos procesos ocurren en diferentes microorganismos incluyendo la conjugación y transducción en bacterias y la heterocariosis y ciclo sexual en hongos.

Aunque todos ellos tienen aplicaciones en el contexto industrial, los métodos más ampliamente usados en la transferencia de genes para el mejoramiento de cepas incluyen a la reproducción parasexual (en hongos), fusión de protoplastos e ingeniería genética.

Hasta hace poco la reproducción parasexual era prácticamente el único método disponible para la cruza de hongos industriales, debido a la ausencia del ciclo sexual en cepas comerciales. La reproducción parasexual es un proceso que se lleva a cabo lentamente, lo que resulta poco conveniente, sin embargo, con la aplicación de procesos de fusión de protoplastos la situación cambió y ahora existen técnicas de reproducción basadas en la fusión de protoplastos para una gran variedad de organismos industriales. El trabajo experimental planteado en esta tesis se desarrolla a partir de la necesidad existente de generar una metodología que permita la obtención de cepas especializadas para SFS, aspecto importante que ha limitado el desarrollo de esta técnica de cultivo.

L

Hipótesis v Obretivo

111 Objetivo.

Obtención de marcadores genéticos en cepas de Penicillium chrysogenum con caractensticas complementarias para una eventual obtención de recombinantes.

Objetivos Particulares.

1. Evaluación de la capacidad de producción de penicilina de 5 cepas de Penicillium chrysogenum (P2-32, P2-37, P2-47, P2-2V2, ASP-2A) en fermentación sólida y fermentación líquida.

3. Mutagénesis y selección de mutantes : -Auxótrofa a aminoácido. -Auxótrofa a uridina.

4. Evaluación del nivel de producción de penicilina de las cepas mutantes obtenidas en fermentación sólida y en fermentación líquida.

3

Generalidades

1V Generalidades.

1. Clasificación.

El microorganismo utilizado para el desarrollo experimental de esta tesis fue Penicillium chrysogenum, que pertenece a la subdivisión Deuteromycetes. Esta subdivisión comprende una gran cantidad de especies de hongos en las que la reproducción se realiza solamente por mecanismos asexuales o parasexuales. Debido a que los Deuteromycetes aparentemente carecen de una fase de reproducción sexual, también llamada “perfecta”, por lo común son denominados “hongos imperfectos” o técnicamente “Fungi imperfecti” (Herrera, 1990).

2. Metabolitos lipados y no Ibados al crecimiento.

Los metabolitos generados durante la fase log de crecimiento son esenciales para el crecimiento de las células. Estos productos incluyen aminoácidos, proteínas, vitaminas, polisacáridos y etanol y son llamados metabolitos primarios (Bodie, Ward, 1991).

Los metabolitos secundarios no se encuentran involucrados en el metabolismo celular, no son necesarios para el crecimiento, y sólo son generados cuando algún nutriente se ha agotado. Es decir la velocidad de crecimiento es limitada por uno o más nutrientes, lo cual resulta en una diferenciación bioquímica en el organismo y consecuentemente son producidos en la fase estacionaria o fase de mantenimiento (Bodie, Ward, 1991). Los metabolitos secundanos incluyen productos que tienen actividad antimicrobiana (antibióticos) y promotores del crecimiento, así como otros agentes terapéuticos. Especies de Penicillium y otros hongos, producen una gran diversidad de estos metabolitos, identificándose los sigwentes : alcaloides, terpenos, esteroles, p- lactámicos, derivados del ácido shikirmco y derivados de ácidos grasos (Peberdy, 1985). La importancia de muchas especies de Penicillium radica en los metabolitos secundarios que producen, de esta forma la penicilina tiene interés industrial como antibiótico.

3. Penicilina.

Los antibióticos (3-lactámicos incluyen las penicilinas, cefalosporinas y cefamicinas, todas ellas útiles médicamente como antibióticos. Estos antibióticos se llaman p- lactámicos porque contienen un sistema de anillo (3-lactámico (Fig. 1) (Sullivan y

4

&nrrulidudes

Abraham, 1981). Los antibióticos p-lactámicos actúan por inhtbición de la síntesis de peptidoglucanos en las paredes celulares de las eubacterias. El blanco de estos antibióticos es la reacción de transpeptidación que participa en la etapa de entrecruzamiento de la biosíntesis de los peptidoglucanos. Debido a que esta reacción es única para las bacterias los antibióticos p-lactámicos tienen una alta especificidad y toxicidad relativamente baja. La estructura básica de las penicilinas es el ácido 6-aminopenicilánico (6-APA), que consiste en un anillo de tiazolidina con un anillo p-lactámico condensado (Fig 1) (Sullivan y Abraham, 1981). El 6-APA lleva una mitad acil variable (cadena lateral) en la posición 6.

R - c - NH?. I I O / F> CH3 CH3

O

coo-

Cadena Anillo Anillo I;1teral B-lactilnico Tiazolidínico

FIG 1 : Estructura química de las penicilinas

4. Fermentación Sólida.

4.1. Definición.

La fermentación en estado sólido puede ser definida (Lonsane y col., 1985) como un cultivo microbian0 que se desarrolla en la superficie y al interior de una matriz sólida y en ausencia de escurrimiento de líquido. La matriz porosa puede ser un sustrato húmedo o un soporte inerte capaz de absorber los nutrientes disueltos en una

5

Generalidades

solución. De esta manera se pueden distinguir dos tipos de FS en función de la naturaleza de la fase sólida utilizada : 11 Cultivo sólido con una fase sustrato-soporte. La fase sólida está constituida de un material que asume simultáneamente la función de soporte y de fuente de nutrientes (Barrios, 1994). 21 Cultivo sólido con un soporte impregnado de un medio líquido. En este tipo de fermentaciones, la fase sólida está constituida por un soporte inerte que sirve de repertorio de una solución nutritiva. Los materiales utilizados son diversos y entre ellos se encuentra el bagacillo de caña de azúcar (Barrios y col., 1988). Mudgett (1986) menciona que se puede Qstinguir a los substratos sólidos como una mezcla de gas líquido sólido en donde la fase acuosa está íntimamente asociada con las superficies sólidas en varias etapas de la sorción y está en contacto continuo con una fase gaseosa que proviene de un ambiente externo. Dependiendo del contenido de humedad del sólido, una parte del agua está firmemente asociada a la superficie sólida, otra parte solo parcialmente asociada y otra existe en estado libre en regiones capilares del sólido. La interfase gas-líquido provee de una zona para el intercambio de dióxido de carbono oxígeno y para la transferencia de calor.

4.2. Ventajas y desventajas.

Se presentan algunas ventajas y desventajas de este método en comparación con el SFL. Algunas ventajas del SFS citadas por Mugett (1986) y Barrios (1994) incluyen las siguientes : 1. Los contenedores de fermentación pueden ser pequefios debido a que se utiliza poca agua y los substratos obtenidos se encuentran concentrados. 2. No se requieren de tanques para medio semilla, ya que se pueden incluir inoculaciones con esporas. 3 . La baja humedad reduce los problemas de contaminación, 4. Las condiciones del crecimiento fúngico son similares a aquellas de sus hábitats naturales. 5. La aireación es facilitada debido a la porosidad del material. 6. Las producciones obtenidas pueden ser mucho mayores a las obtenidas por medio líquido. 7. Se requiere menor energía de proceso que las correspondientes en FL. 8. Disminución de efluentes líquidos a tratar si el producto se utiliza directamente o el producto se obtiene más concentrado. 9. Muchas veces se hace un uso directo de los sólidos fermentados. 10. Para las fermentaciones tradicionales la microflora del soporte sirve como inóculo.

6

Generalrdodes

En lo concerniente a l a s desventajas, se citan las sigwentes : l . La adición de agua en fases tempranas de la fermentación, puede incrementar los riesgos de contaminación bacteriana. 2. La inoculación de esporas puede necesitar que se produzcan y siembren asépticamente. 3. Dificil regulación de parámetros de cultivo como pH. 4. Falta de conocimientos básicos y tecnológicos. 5. La dificil adlción de nutrientes y agentes controladores. 6. Se puede dificultar el recobrar el producto, si este es absorbido o contaminado con residuos sólidos.

5. Meioramiento Penético.

El mejoramiento de una cepa generalmente significa aumentar la productividad de un organismo, aunque también puede ser deseable el manipular características específicas tales como : la habilidad para utilizar diferentes tipos de sustratos que pueden resultar más baratos, capacidad de esporulación etc. Un buen ejemplo en la aplicación del mejoramiento de una cepa lo constituye el proceso de fermentación de penicilina donde los rendimientos de penicilina producidos por P. chrysogenum han sido incrementados aproximadamente hasta unas 500 veces desde su aislamiento original (Rowlands, 1984a).

En general el mejoramiento de cepas de hongos que son utilizados en procesos biotecnológxos involucra mutagénesis al azar y una subsecuente selección de las cepas mutantes con productividades incrementadas. Aunque este tipo de estrategia ha sido provechosa en muchos casos, existen desventajas y limitaciones. La repetición de tratamientos mutagénicos puede provocar incrementos en el número de mutaciones que en un inicio no son detectables (&os en la información genética) lo cual puede resultar en la inestabilidad de la cepa y subsecuentemente en la pérdida de una cepa de buena producción ( Swart y col., 1990).

Existen procesos alternativos, básicamente dos, para aumentar el rendimiento de producto de microorganismos industriales : recombinación e ingeniería genética. Cada una presenta diferentes ventajas, pudiéndose emplear estas dos técnicas además de la mutagénesis en conjunto, para maximizar la producción. La recombinación genética permite la construcción de cepas con un gran número de diferentes combinaciones de mutaciones que determinan la proporción de los productos de interés. Con el desarrollo de las técnicas de fusión de protoplastos es

I

relativamente simple el recombinar propiedades de una amplia variedad de microorganismos industriales que no están bien caracterizados tanto genética como bioquímicamente (Baltz ,1986). La ingeniería genética, recibe desde hace algunos años atención seria para la producción de metabolitos h g i c o s de interés, lo cuál permitirá comprender mejor los mecanismos que controlan la expresión de los genes involucrados en la biosíntesis del antibiótico (Timberlake y Marshall 1989, Barredo y col., 1989b).

5.1. Mutación.

Muchos productos generados por hongos filamentosos han sido aprovechados a nivel industrial, sin embargo se ha requerido de la implementación de metodologías que permitan obtener mejores rendimientos de los productos generados por estos. El método estándar por medio del cuál la industria los ha explotado ha sido la mutación, segwda de la búsqueda de una cepa mejorada mediante un gran número de aislamientos(Upshal1, 2992). Sin embargo los aislamientos de mutantes al azar son procedimientos laboriosos debido al gran número de aislamientos que deben llevarse a cabo para así detectar la cepa mejorada (Davies, 1964; Rowlands, 1984b). La mutagénesis se define como la inducción de cambios heredables, mutaciones, en el material genético de cualquier organismo. Estas mutaciones son causadas por cambios en el genotipo y pueden ser detectadas como una modificación fenotípica del organismo (mutante). Las mutaciones pueden ocurrir in vivo espontáneamente o después de la inducción por mutágenos tales como agentes químicos o radiaciones. Las mutaciones pueden así mismo ser inducidas in vitro mediante técnicas de ingeniería genética (Crueger, 1993). Las mutaciones sufndas por un organismo varían según las alteraciones presentadas en el genoma, así se distinguen tres clases : 1 .Mutaciones en el genoma, que pueden causar cambios en el número de cromosomas 2. Mutaciones en el cromosoma que pueden causar cambios en el orden de los genes dentro del cromosoma. 3. Mutaciones en el gen o mutaciones puntuales que pueden resultar de cambios en la secuencia de bases en el gen. Las mutaciones en el cromosoma pueden ser inducidas por mutágenos químicos, o

por radiaciones como la luz U.V. o rayos X. Las mutaciones en el gen implican la generación de nuevos alelos en el mismo. En el caso de macrolesiones se involucran un gran número de nucleótidos. Por errores de inversión en la replicación, pueden ocurrir deficiencias e inserciones, en las que se ven involucrados grandes secuencias de un gen. En microlesiones o mutaciones puntuales una base es substituida por otra , o bien, uno o pocos nucleótidos son

n

Generalidades

borrados o insertados. Una característica de las mutaciones puntuales es que éstas pueden revertir (Crueger, 1993). Las mutaciones puntuales se dividen en dos clases : substituciones de pares de

bases y mutaciones en el marco de lectura. Cuando la substitución de pares de bases ocurren en un gen, produce efectos sobre las proteinas, produciendo ya sea substituciones en aminoácidos, o bien codones de cadenas terminales. Las mutaciones en el marco de lectura consisten en la deleción o adición de un pequeño número de pares de bases, alterando el marco de lectura en las etapas de transcripción y traducción. Tanto la radiación como un gran número de agentes químicos pueden producir mutaciones puntuales a bajas dosis de mutágeno. Los cambios mutacionales se llevan a cabo ya sea por errores en la replicación o reparación mediante la incorporación de bases incorrectas en la cadena polinucleótida, o mediante la interacción química directa con una base (Crueger, 1993).

Por otro lado, para el éxito en el mejoramiento de una cepa, se requiere de la selección apropiada tanto del tipo de mutágeno como de la dosis correcta. Para cada tipo de mutágeno así como para cada organismo, existen una serie de combinaciones que permiten obtener la más alta proporción de una clase de mutante en particular entre los sobrevivientes del tratamiento mutagénico, tales como: concentración del mutágeno, tiempo de exposición y condiciones del tratamiento (Queener y col., 1986). En cuanto a la dosis, debe tomarse en cuenta que altas dosis de mutágeno

usualmente incrementan la posibilidad de producir simultáneamente mutaciones secundarias indeseables (Rowlands, 1984a; Bos, 1987). Un factor de importancia que debe considerarse es la facilidad de uso y segundad del mutágeno. Todos los mutágenos son potencialmente cancerígenos ya que actúan dañando al DNA. La radiación UV lejana es indudablemente el mutágeno de mejor conveniencia, ya que puede producir muchos de los tipos de daiios conocidos en el DNA y fácilmente se pueden tomar las precauciones de seguridad necesarias para su uso. De los mutágenos líquidos como el EMS son mucho más fáciles de manipular que los de polvo como el NTG. Otra desventaja del NTG es su tendencia a producir mutaciones en clusters cercanamente relacionados, aunque ello puede ser una ventaja para algunos sistemas (Rowlands, 1984a). Por otro lado, es conveniente obtener una curva de sobrevivencia antes de poder determinar las condiciones óptimas para la mutagénesis. Además, para el caso de tratamientos mutagénicos realizados con luz UV, es conveniente llevarlos a cabo en ausencia de iluminación directa, además de cuidar que el crecimiento celular se lleve a cabo en la obscuridad o con luz roja después de una exposición a la luz UV, para

Y

Generalidades

de esta forma evitar que se lleven a cabo los mecanismos de reparación estimulados por la luz visible (Mller, 1972).

A las células mutadas se les debe permitir una etapa de replicación del DNA y crecimiento celular para convertir de esta forma el daño inducido en el material genético en un daño estable (Queener y col., 1986; Campuzano y col., 1993). La distinción más importante entre los diferentes tipos de mutágeno es el tipo de mutación que se induce (Rowlands, 1984a), la cual depende de dos factores : El tipo de daño causado por el mutágeno al DNA y la acción de los mecanismos de reparación celular sobre el daílo causado al DNA. Muchos de los mutágenos producen más de un tipo de desarreglo sobre el DNA, aunque el grado con que lo inducen varía con cada uno de ellos. Por ejemplo la radiación lejana de UV (-260 nm) produce una alta proporción de dímeros de pirimidma mientras que la rahación ionizante provoca un alto grado de rompimientos en el cromosoma, en tanto que la EMS y la NTG son agentes alquilantes. Sin embargo la luz UV lejana, suele producir bases hidroxiladas y entrecruzamiento (crosslinlung) de las cadenas del DNA. Las rutas de reparación del DNA pueden ser por sí mismas no mutagénicas (libre de errores) o bien mutagénicas, dependiendo del mecanismo enzimático involucrado. Las rutas de reparación no mutagénicas incluyen a la fotoreactivación, reparación por excisión y la reparación por recombinación. La ruta mutagénica principal y mejor conocida es el mecanismo de reparación SOS en Escherichia coli, la cuál se presenta como mecanismo de reparación en daiios causados tanto por mutágenos químicos como fisicos incluyendo la rahación UV lejana. Otras rutas de reparación menos caracterizadas se ven involucradas al inducirse mutaciones mediante EMS o NTG (Rowlands, 1984a).

Estrategias de selección.

Debido a que las especies de hongos filamentosos de importancia industrial son generalmente imperfectos, se ha recurrido a métodos de genética parasexual que penniten llevar a cabo procesos de mejoramiento genético para lo cuál se hacen necesarias mutaciones genéticas selectivas del tipo de la auxotrofia que permiten recobrar productos de fusión derivados de cruzas entre dos cepas lográndose el reconocimiento de la etapa de heterocarión o de diploidia (Peberdy, 1984).

Los sistemas de complementación auxotrófica son más diversos debido a la clonación de genes. Muchos de los sistemas de selección positiva, están basados en la resitencia a una toxina; el primer sistema desarrollado para hongos filamentosos

10

Generalidades

se basó en la donación del gen AmdS de A . nidulans. Este gen permite al hongo utilizar acetamida como única fuente de carbono ( Upshall, 1992 ).

Otro sistema de selección positiva que resulta particularmente apropiado para hongos filamentosos, está basado genéticamente en la resistencia de dominancia a los füngicidas. Se han utilizado dos sistemas, uno basado en la resistencia al füngicida benomyl y el otro basado en la resistencia a la oligomicina. El gene de resistencia al benomyl de A. niger ha sido usado para transformar P. chrysogenum (Upshall, 1992). También pueden ser introducidos por transformación marcadores selectivos del tipo de la resistencia a antibióticos tales como higromicina y fleomicina (Talbot y col., 1988; Peberdy, 1991).

Auxotrofia a pirimidina mediante la resistencia al 5 FOA.

Se ha desarrollado un método de selección positiva para la selección drecta de mutates ura 3 auxótrofas a uracil, usando 5 AFO, reportado por primera vez en Saccharomyces cerevisiae por Boeke y col. (1984). Se pueden inducir mutaciones en el locus URA 3 de Sacharomyces cerevisiae mediante un sistema de selección positiva. Cepas de levaduras silvestres son incapaces de crecer en medios que contienen 5 AFO, el cuál es un análogo de la pirimidina, mientras que los mutantes ura 3 crecen normalmente. Este tipo de selección puede ser aplicada en una gran variedad de células eucariotas y procariotas, la cuál está basada en la pérdida de actividad de la descarboxilasa orotidin 5 fosfato. En experimentos donde se seleccionaron mutantes resistentes al 5 AFO inducidas por radación UV sólo un 5- 10 % de los mutantes fueron ura 3 . No se sabe cuántos tipos dferentes de mutates puedan causar el fenotipo de resistencia; sin embargo los mutantes URA 1, URA 2 y URA 4 son sensibles al 5 AFO mientras que los mutantes URA 3 y URA 5 son resistentes (los mutates U R A 5 son sólo parcialmente resistentes) (Boeke, 1984). El 5 AFO puede ser muy útil para el aislamiento de mutantes ura 3 - en levaduras de interés industrial, para las cuales no existen sistemas de transformación útiles que permitan obtener marcadores auxótrofos (Boeke, 1984). La biosíntesis del UMP en hongos filamentosos procede del aspartato y del carbamil fosfato a través del intermediario ácido orótico al orotidin 5 monofosfato (Fig. 2). Los genes involucrados en la conversión del ácido orótico a Uh4P se conocen como Pyr F ( O W pirofosforilasa) y Pyr G (OMP descarboxilasa) en-Aspergillus. Al parecer el 5 AFO tiene un amplio espectro de acción, ya que se ha encontrado que inhibe el crecimiento de Saccharomyces, Schizosaccharomyces y Candida, permitiendo el crecimiento de células deficientes en enzimas OMP pirofosforilasa u

-

-

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Generalidades

OMP descarboxilasa. La toxicidad del 5 AFO radica en su conversión a 5 Fluoro UMP un metabolito que interfiere con la síntesis del DNA . El sistema de selección implementado por Boeke y col. (1984) se ha aplicado exitosamente en otros hongos (Oakley y col., 1987; Smit y Tudzynsky, 1992; Akileswaran y col., 1993). En la mayoría de los casos se encontraron mutantes deficientes en el gen Pyr G y en el gen Pyr F. En el trabajo realizado por Campuzano y col. (1993), se describe el aislamiento, caracterización bioquímica y mapeos de una serie de mutantes de Phycomyces. Los resultados mostraron que los auxótrofos a pirimidina aislados por resistencia al 5FOA caen dentro de dos grupos de complementación, los mutantes deficientes en el gen Pyr F y en el gen Pyr G. La proporción de auxótrofos de pirimidina entre los mutantes resistentes fué del 7 %. La mayoría de ellos aproximadamente el 85 % fueron Pyr F mientras que el restante 15 % fueron mutantes Pyr G. En un trabajo realizado por Diez y col. (1987) se aislaron auxótrofos a pirimidma de P. chrysogenum de entre mutantes resistentes al 5 AFO, denominándolos como mutantes Pyr G. No se sabía si todos los mutantes aislados eran deficientes de la enzima OMP descarboxilasa o si había otros tipos dferentes de mutantes que conferían el mismo fenotipo de resistencia. Se mostró por otro lado, que la frecuencia de mutantes resistentes al 5 AFO fue más alto en P. chrysogenum que en S. cerevisiue, lo cual sugere un mayor nivel intrínseco de resistencia al 5 AFO que en las levaduras.

Auxotrofia a aminoácidos mediante procesos de enriquecimiento.

Una práctica frecuente en cepas de interés industrial (Bos, 1987) es la generación de cepas de alto nivel de producción con niveles de sobrevivencia de O. 1-1 % mediante altas dosis de mutágeno, incrementando con ello mutaciones indeseables, especialmente cuando se aplican tratamientos mutagénicos recurrentes. Se ha observado que altas dosis de mutágeno producen nuevos arreglos en el cromosoma y mutaciones que no son percibidas que alteran los antecedentes de la información genética. Se ha observado en Aspergillus niduluns la relación entre la frecuencia del mutante y la sobrevivencia; mostrándose que para diferentes tipos de mutantes, el rendimiento más alto, se obtiene a bajas dosis de mutágeno (20-50% de sobrevivencia). La frecuencia de mutantes se incrementa cuando a su vez se incrementa la dosis del mutágeno, pero se estabiliza y después decrece a dosis más altas. No hay una relación linear simple entre la fiecuencia de mutantes y el logaritmo de la dosis del mutágeno. Estos estudios dan lugar a elaborar prácticas

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HN I

+- &OP O

COOH P O

ASPARTATO

CARBAMIL FOSFATO CARBAMIL ASPARTATO

ENZIMAS

A ........ Sintetasa carbamil fosfato B ........ Transferasa carbamil aspartato C ........ Dihidro orotasa D ........ Hidrogenasa dihidro orotato E ........ Pirofosforilasa OMP F ........ Descarboxilasa OMP

ZADP + GLU +P

GLUN +ZATP

c02

OROTIDIN 5-MONO FOSFATO

OH

OH pp PRPP

I I O

URIDIN 5-MONO FOSFATO OH OH

O

N Iz1 DIHIDRO OROTATO

I F202 O

O A>cooH OROTATO

FIG 2 : Ruta biosintética de la UMP en hongos filamentosos

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Generalidades

que resulten en la inducción de bajos niveles de mutágeno para obtener un mayor rendimiento de mutanes. Se ha llevado a cabo la búsqueda de metodologías que permitan una selección eficiente de las mutantes deseadas incluyéndose la resistencia a antibióticos así como métodos de enriquecimiento utilizando enzimas que degradan la pared celular (Piedra y Herrera, 1976; Sipiczky y Ferenczy, 1978; Delgado y col., 1979). Con procedimientos apropiados de enriquecimiento, pueden llevarse a cabo mejores aislamientos de mutantes auxotróficas a bajas dosis de mutágeno. El método de enriquecimiento por filtración ha probado ser muy eficiente para el aislamiento de mutantes de A. nidulans que requieren una fuente específica de carbono (Bos y col., 1981; Uitzetter y col., 1986), así como el enriquecimiento medante una preparación de enzima lítica Novozyme 234 (Debets y col., 1989). El procedimiento de enriquecimiento por filtración es un método clásico basado en la remoción selectiva de protótrofos, desarrollada originalmente por Fries (1947) para Ophiostomu multiannulatum y subsecuentemente adaptada a Neurospora crussu por Woodward y col. (1954). Bos y col., (1992) indujeron mutantes de A. niger con bajas dosis de mutágeno (luz UV) para eliminar &os en la información general o aberraciones cromosómicas (Bos, 1987), obteniéndose un alto nivel de sobrevivencia y por tanto una baja frecuencia de mutantes entre los protótrofos sobrevivientes. Consecuentemente se luz0 necesaria una etapa eficiente de enriquecimiento como prerequisito. Más de 100 mutantes auxótrofas de A. niger fueron aisladas mediante procesos de enriquecimiento por filtración. Los mutantes obtenidos de esta manera fueron predominantemente auxótrofos a aminoácidos y dificilmente se encontraron mutantes deficientes a vitaminas. La fiecuencia fue baja con promedio de una mutante por experimento. Un aspecto importante relacionado con la baja eficiencia de aislamiento de mutantes es que muchas de las conidias que no germinaron fueron descargadas junto con aquellas que si lo lucieron, debido a que probablemente quedaron atrapadas en la red micelial formada durante la filtración o bien debido a la agregación de las coni&osporas durante la incubación en medio líquido. De tal forma que la mayoría de las mutantes que no germinaron se perdieron durante el enriquecimiento. Para eliminar estas limitaciones, se cuenta con otro método de enriquecimiento la utilización de la preparación de enzima lítica Novozyme 234. Esta técnica fue originalmente desarrollada para el aislamiento de auxótrofos diploides recombinantes y ha sido descrita con anterioridad por Debets y col. (1989). El principio del procedimiento por enriquecimiento con Novozyme, es que la conila germinada inmovilizada en medio agar es eliminada selectivamente después de cierto periodo de incubación. Las puntas de hifas jóvenes de A. niger son lisadas

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Generahdades

eficientemente con Novozyme 234, provocando que el citoplasma fluya y se efectúe la muerte celular debido a los bajos valores osmóticos de la solución enzimática. Las paredes conidales, así como las paredes füngcas subapicales, no son susceptibles a la acción de la Novozyme 234. La conidia germinada con una hifa septada y ramificada, por otro lado, no es eliminada apropiadamente ya que a pesar de que las puntas de las hfas si son lisadas, no se alcanza a desintegrar todo el citoplasma. La eficiencia de este procedirmento se ve reducido considerablemente si la conidia germinada es sometida a bajas temperaturas por algunas horas, evitándose la lisis por la Novozyme 234. Es esencial por esta razón que el tratamiento enzimático se realice inmediatamente después de la incubación. Consecuentemente, solamente las conidiosporas activas metabólicamente con una hifa muy joven pueden ser eliminadas con tratamientos con Novozyme. Otro aspecto de importancia es la necesidad de incluir una etapa de propagación en MC de las esporas, debido a que la radiación con UV afecta su fisiología origmando que la genninación se desincronice, repercutiendo de forma importante en la eficiencia del procedimiento con Novozyme. Es probable que con altas dosis de mutágeno se vea alterada por completo la sincronización de la germinación conihal (1-2 % de sobrevivencia), lo cuál es una práctica común llevada a cabo por muchos investigadores; en tal caso el enriquecimiento de auxótrofos mediante enzimas líticas no es posible. Es de suponer que el efecto en el enriquecimiento se vea limitado en aquellos procehentos de enriquecimiento en donde la etapa de propagación es omitida. La sincronización de la germinación después del tratamiento mutagénico probablemente pueda mejorar el procedimiento de enriquecimiento. Además otra ventaja de la etapa de propagación, es la posibilidad de la segregación de alelos mutantes, y la expresión fenotipica de las mutaciones inducidas. Dependiendo del tipo de mutante deseada, uno o ambos procehentos pueden determinar un método efectivo para el enriquecimiento de mutantes con una deficiencia metabólica (Bos y col., 1992).

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Antecedentes

V Antecedentes.

Fusión de protoplastos.

Desde hace algunos años, existe un gran interés en la aplicación de la recombinación genética para la obtención de productos de importancia industrial, tal como los antibióticos (Kurth, 1985). Con el descubrimiento del polietilenglicol como mehador en la fusión de protoplastos, se cuenta con una herramienta de gran importancia para la recombinación genética de microorganismos productores de antibióticos.

En un inicio la fusión de protoplastos, se utilizó en células animales y en células de plantas y posteriormente en hongos y bacterias unicelulares. Finalmente el trabajo de Okanishi y col. (1974) en formación de protoplastos, fusión y regeneración, aceleró el uso de esta técnica para la manipulación genética en Streptomyces (Kurth, 1985).

Recientemente Kazunobu y col. (1996) realizaron la recombinación entre dos levaduras utilizando una cepa de K. mamianus y otra de S. cerevisiae; los autores pretendían conjuntar la mejor capacidad fermentativa de la cepa de S. cerevisiae a 30 OC con el buen crecimiento a altas temperaturas (43 o C ) de K. marxianus usando la técnica de fusión de protoplastos. Obtuvieron un grupo de fusionantes que presentaba características superiores a las cepas parentales en cuanto a crecimiento a alta temperatura y capacidad fermentativa. Sin embargo éste grupo no mantuvo la característica de termoestabilidad de la cepa de K. marxianus.

Por su parte Anné y Peberdy (1 975) utilizaron a P. chrysogenum entre otros hongos, para sus estuhos iniciales sobre fusión de protoplastos. Los métodos y principios importantes de esta metodología han sido discutidos por (Peberdy, 1980). Se ha llevado a cabo exitosamente la fusión de protoplastos entre interespecies de P. chrysogenum y Penicillium cyaneo-julvum utilizando marcadores nuticionales (Peberdy y col., 1977).

Así mismo, se aisló una progenie híbrida de interespecies de P. chrysogenum y P. stolonverum, P. patulum y P. verrucosum var cyclopium, mediante la inducción de fusión de protoplastos encontrándose una correlación entre la estabilidad de las colonias híbridas y los rendimientos de penicilina, ya que los híbridos más estables son los que produjeron los mayores rendimientos (Anné, 1982).

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En ese mismo aiio, Chang y col. (1982), lograron producir híbridos de l a s especies de P. chrysogenum y Cephalosporium acremonium mediante fusión de protoplastos. Los autores concluyen que dada la prototrofia y la alteración morfológica observada en los productos de fusión, se sugiere la posibilidad de transferencia de genes entre Cephalosporium y Penicillium.

Posteriormente Anné y Peberdy (1985) comentan que la viabilidad de híbridos generados después de un proceso de fbsión de protoplastos es debida a la compatibilidad genética y bioquímica de las especies relacionadas. Y en el sentido inverso, tanto la letalidad como el comportamiento anormal de una progenie híbrida, es consecuencia de las diferencias relacionadas con el carácter nuclear ylo del citoplasma de las especies involucradas en la fusión.

Así mismo, estos autores (Anné y Peberdy 1985), también mencionan que se refleja un mayor nivel de compatibilidad entre especiese de Penicillium, que entre otras especies menos relacionadas de Aspergillus o que entre especies de levaduras, debido a las mayores fiecuencias de fusión observadas entre cruzas de interespecies de Penicillium.

Se plantea entonces, la viabilidad de la generación de organismos híbridos estables en donde se realiza la fusión del genoma de las especies involucradas, tanto en especies de Penicillium como en otros microorganismos.

El inicio en la capacidad de producción de híbridos entre especies fúngicas se debió al desarrollo de mejores cultivos y métodos de fksión de protoplastos (Anné y Peberdy, 1975, 1976). Estos estudios permitieron la investigación de nuevas rutas bioquímicas dadas en un nuevo ambiente celular.

Años más tarde, López Nieto y col. (1980), valiéndose de esta metodología, cruzaron por fbsión seis diferentes cepas auxotróficas de P. chrysogenum con la finalidad de obtener recombinantes con mayores producciones de penicilina que las cepas progenitoras. Los resultados mostraron que los recombinantes obtenidos de una cepa de baja y otra de alta producción nunca produjeron tanto como la cepa parental de alta producción, suguiendo que los mecanismos regulatorios de las cepas progenitoras de baja producción existen en l a s recombinantes y pueden contrarrestar la producción eficiente que existe en la cepa progenitora desregulada. En cambio, los recombinantes obtenidos a partir de cepas de baja producción o de cepas no productoras en algunos casos produjeron penicilina en niveles superiores a las de l a s cepas parentales; esto puede ser explicado como un rearreglo de la información

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Antecedentes

genética codificada para la biosíntesis de penicilina, resultando en una cepa mejor productora. Los autores concluyen que para obtener cepas de alta producción por fusión de protoplastos, es recomendable partir de cepas parentales de alta producción.

La fusión de protoplastos, se plantea entonces como una metodología para generar cepas de alta producción, la cuál, se puede enfocar al desarrollo de cepas altamente productoras para FS.

Fermentación sólida.

Viniegra González (1989) realizó urÍ análisis de las perspectivas y limitaciones de la FS, concluyendo que este es un proceso tradicional que puede funcionar como una alternativa para la producción de alimentos (sabores), probióticos, aditivos, biopesticidas, enzimas y metabolitos secundarios (antibióticos, giberelina etc.). Menciona que hace falta investigación para el desarrollo de productos, además que a excepción del Japón, hay muy poca experiencia en cuanto a la construcción y operación de plantas industriales que utilizan FS. La investigación necesaria, debe cubrir aspectos enfocados tanto a las condiciones que afectan éste sistema de cultivo, al control de la fermentación y a la generación de cepas especiales para el SFS.

Entre los trabajos enfocados al conocimiento de las condciones que afectan la FS se encuentran los siguientes :

-Se han llevado a cabo investigaciones sobre cinéticas de crecimiento de Aspergillus niger en soportes sólidos de bagazo de caíla impregnados con medo líquido, observándose elevados niveles de crecimiento y demostrándose la viabilidad del cultivo de hongos filamentosos en FS para la producción de metabolitos con tecnología de bajo costo (Oriol y col., 1988a).

-También se han realizado estudos para determinar la dsponibilidad de oxígeno en la fase liquida, lo cuhl permite estudiar la influencia que tienen los flujos de aire y el porciento de materia seca en el medio sobre el coeficiente de transferencia voluméhca de oxígeno (Durand, 1988). Así mismo se han hecho estudios en donde se observa la influencia de la actividad de agua (aw) sobre el crecimiento de hongos en sustratos sólidos (Oriol, 1988b).

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Antecedentes

-Se cuenta también con trabajos relacionados con la transferencia de calor en FS, en donde medlante modelos matemáticos, se pretende comprender mejor los fenómenos de transporte que se llevan a cabo en FS, permitiendo al mismo tiempo evaluar varias alternativas de control de temperatura en FS , como lo son por ejemplo flujos de aire e incrementos del contenido de agua (Saucedo y col., 1989).

-Se han efectuado investigaciones en relación a factores que afectan el desarrollo de la fermentación sólida. De esta forma se ha determinado, que ciertas concentraciones de COZ en el ambiente gaseoso pueden ejercer diversos efectos, de acuerdo con el tipo de microorganismo involucrado, en el crecimiento, en la conilación y en la producción (Desgranges, 1990; Mejía y col. 1996).

-Por su parte Barrios y col. (1 993) consideran que el tamdo de partícula del soporte sólido, la densidad de empaque y la agitación son variables de importancia a considerar en FS. En la producción de penicilina, obtienen incrementos del 37 % al utdizar partículas grandes (14mm) de soporte sólido (caña de azúcar); así mismo, obtuvieron 20% más producción de penicilina al utilizar altas densidades de empaque (0.35 g/ ml), y observaron que la agtación no muestra efectos negativos en la producción si se restituye la humedad perdlda durante el progreso de la fermentación.

Por otro lado, también existen antecedentes en cuanto a la producción de enzimas y metabolitos secundarios, que gracias a un buen control del SFS se han generado resultados exitosos en su producción; ejemplos de ello son los siguientes :

-Tradicionalmente, se han obtenido enzimas de inter& industrial mediante FL debido a su facilidad de manejo y control. Sin embargo actualmente se han comenzado a producir por FS. Se han efectuado estudios sobre la producción microbiana de lipasas tanto por FL como por FS utilizando Penicillium candidum observándose para Cste liltimo sistema de cultivo los más altos rendmientos y producciones estables (Muiioz y col., 1991).

-Posteriormente Antier y col. ( 1 993), mencionan que la productividad de pectinasas en procesos de FS es mucho mayor que la productividad obtenida por FL, además de que la industria utiliza ambos procesos de cultivo para la producción de pectinasas utilizando Aspergillus niger, resultando ser más apropiado el proceso de FS debido a los mayores rendimientos de pectinestereasa y poligalacturonasa obtenidos.

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Antecedentes

-Por su parte Barrios González y col. (1988) obtuvieron rendmientos y productividades muy altos en relación con el método convencional de FL en la producción de penicilina. Estos resultados indlcan que la FS es una alternativa para la producción de metabolitos secundarios. Los autores enfatizan que un factor limitante importante para la explotación del potencial de este sistema es la falta de conocimiento de la fisiología fúngxa en medio sólido. Además de que deben realizarse mayores esfuerzos enfocados al desarrollo de cepas especialistas para este sistema.

En lo referente a la selección de cepas especialistas para FS no se encuentran suficientes trabajos al respecto, de ahí la importancia de este estudio. Una referencia del tema se presenta a continuación :

-Algunos años más tarde este mismo autor (Barrios Gonzhlez y col., 1993) determinó la producción de penicilina de cinco cepas de P. chrysogenum tanto en FS como en FL. Los resultados mostraron que las cepas de mayor producción en FL también eran las de mayor producción en FS. De estas mismas cepas se aislaron mutantes observándose variaciones importantes en el nivel de producción, de tal forma que se observó una tendencia inversa a las cepas de las cuáles provenian, es decir, las mutantes más altamente productoras en FS tienden a ser las menos productoras en FL. Los autores concluyeron que la capacidad de una cepa para producir penicihna en FS no está directamente relacionada con la capacidad para producir el antibiótico en FL, es decir que algunas cepas expresan mejor su potencial de producción en FS, de ahí la necesidad de buscar una metodología que permita generar cepas especialistas para este sistema.

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hfateriales v Métodos

VI Materiales y Métodos.

1. Microowanismos.

Las cepas de Y. crhysogenum usadas fueron : P2-32, P2-37, P2-47, P2-2V2, ASP- 2A, todas ellas aisladas por Barrios y col. (1993). Para iniciar los experimentos, se partió de stocks de suspensión de esporas en glicerol al 25 % almacenados a -2O"C, de cada una de las cepas anteriormente citadas. Para la realización de los bioensayos de actividad antibiótica se utilizó Bacillus subtilis ATCC 6633 el cual fue mantenido en medio de esporulación a 4 "C.

1.1.Conservación.

Se prepararon stocks de esporas de las cepas seleccionadas, P2-32 y P2-37, así como de las mutantes aisladas, en glicerol al 25 % a -70°C para su conservación a mediano plazo y para su conservación a largo plazo se hizo un preparado de liofilizados de cada una de ellas.

2. Medios de cultivo.

Fermentación Sólida.

Se utilizaron como medio de cultivo para el SFS aquellos reportados por Somerson y col. (1 961) modificados, donde la composición del medio complejo de FS para las cepas P2-32, P2-37, P2-47 Y P2-2V2 en g/l es la siguiente: Lactosa (Bioxon) 110; Glucosa (Bioxon) 14; Caco3 (Baker) 20; K H 2 P 0 4 (Baker) 6; MgS04 (Baker) 6; sólidos de maceración del maíz (S") (donación ClBIOSA Saltillo Coahuila [Centro Industrial Bioquímico S.A.]) 70; ácido fenil-acético (AFA) (CIBIOSA) 1.3. El pH se ajustó a 6.5. La composición en g/1 del medio complejo de FS para la cepa ASP-2A es la reportada por Luengo y col. (1 980) modificada, siendo la siguiente : Glucosa (Bioxon) 14; Lactosa (Bioxon) 75; CaC03 (Baker) 7.5; Pharma media (CIBIOSA) 30; AFA 1.2. El pH se ajustó a 6.5.

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Materiales Y Metodos

Fermentación Líquida.

Los medios complejos de inóculo y los mehos complejos de producción usados, fueron aquellos reportados por Somerson y col. (1961). El medio de inóculo utilizado para las cepas P2-32, P2-37, P2-47 y P2-2V2 en g/l íüe la siguiente: CaC03 (Baker) 5; SMM (CIBIOSA) 20; extracto de levadura (Bioxon) 5; melazas de remolacha 26. ajustando el pH entre 6 - 6.5. El medio de producción para éstas mismas cepas en g/l fue de : Lactosa (Bioxon) 55; CaC03 (Baker) 10; SMM (CLBIOSA) 35; MgS04 7H20 (Baker) 3; KH2PO4 (Baker) 7; AFA (CLBIOSA) 2.5. Ajustando el pH a 6.5. El medro de inóculo utilizado para la cepa ASP-2A en g/1 fue el siguiente (Luengo y col., 1980) : SMM (CLBIOSA) 20; Sacarosa (Bioxon) 20; extracto de levadura (Bioxon) 5; Cacot (Baker) 5; ajustándose el pH a 5.7. El meho complejo de producción en g/l para esta misma cepa fue el siguente : Lactosa (Bioxon) 50; (N& )2 SO4 (Baker) 4; Caco3 (Baker) 5; Pharma media (CIBIOSA) 20; AFA (CLBIOSA) 2.5. Se ajustó el pH a 6.8.

Medio de esporulación para Bacillus subtillis.

El medio de esporulación de B. subtillis, tiene la siguiente composición en dl: peptona (Bioxon) 8; extracto de came (Bioxon) 3; MnC12 (Baker) 1 O -5 M. Se ajustó el pH a 7.2.

Medio para Bioensayo.

Para la cuantificación de penicilina se realizaron bioensayos, utilizando el meho agar de soya y tripticaseina (TSA) (Bioxón) siendo su composición en g/l : peptona de caseína 17; peptona de soya 3; NaCl 5; K2 H P 0 4 2.5; Dextrosa 2.5; Agar bacteriológco 10; se ajustó el pH a 7.3.

Medio de esporulación,

Para las cepas parentales, se empleó como medio de esporulación de P. chrysogenurn, medio Power cuya composición en g/1 es la siguiente : Sacarosa (Bioxon) 15; Lactosa (Bioxon) 15; NaNO.1 (Baker) 1; K2 H P 0 4 (Baker) 0.25; CuSO4 7H20 (Técnica quimica) 0.0005; FeCI:, 6H2O (Baker) 0.0015; K H 2 P 0 4 (Baker) 0.03; MgS04 7Hz0 (Baker) 0.275; FeSO4 7H20 (Baker) 0.005; Bactopeptona (Difco) 2.5; SMM (CLBIOSA) 0.25; NaCl (Baker) 2.0; Agar bacteriológico (Bioxon) 20.0.

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h4ateriales v Métodos

Medio de esporulación para cepas auxótrofas.

Para llevar a cabo la esporulación de las cepas auxótrofas (Met” y Uri -), se empleó medio completo (MC), reportado por Anné y col. (1974). La composición en g/l es la siguiente : KC1 (Técnica química) 0.5; MgS04 7H20 (Baker) 0.5; KH2PO4 (Baker) 1.0; FeS04 7H20 (Baker) 0.01; SMM 10; Difco Bacto Casitone (Difco) 2.0; Extracto de levadura (Bioxon) 2.0; D-L Metionina (Sigma) 0.05; Sacarosa (Bioxon) 30.0; Agar (Bioxon)l8.0; ajustándose el pH a 6.0.

Medios de cultivo involucrados en la selecci6n de mutantes auxótrofas a aminoácidos.

Procesos de enriquecimiento.

Se utilizó medio mínimo (MM) para los procesos de filtración, reportado por Diez y col. (1 987), utilizándose glucosa en lugar de lactosa y sin la adición de agar ya que el medio fue líquido; su composición en g/l : Glucosa (Bioxon) 30; NaNO3 (Baker) 2; KzHP04 (Baker) 1; MgS04 7H20 (Baker) 0.5; KC1 (Técnica química) 0.5; FeS04 7H20 (Baker) 0.01; se ajustó el pH a 6.5.

Medios para prueba de auxotrofia.

Para probar la auxotrofia de las cepas se emplearon MM y MC reportados por Diez y col. (1987) y Anné y col. (1974) respectivamente. La composición del MM (adicionado de 30 gA de agar [Bioxon]) y MC ha sido descrita anteriormente.

Medios para definir tipo de auxotrofia.

Se utilizó MM suplementado de aminoácidos a concentraciones finales de 200 mdml (Swart y col., 1990; Bos y col., 1992). Los aminoácidos adicionados al MM como suplemento, se esterilizaron en autoclave a excepción de la metionina la cual se esterilizó por filtración a través de una membrana millipore de 0.22 pm. Se preparó un stock de la metionina así esterilizada y se mantuvo almacenado a 4°C.

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Materiales Y Metodos

Medios de cultivo involucrados en la selección de mutantes auxótrofos a uridina.

Aislamiento de mutantes resistentes al 5 AFO.

Se utilizó MM con lactosa (adxionado con 30 gA de agar [Bioxon]) como fuente de carbono, descrito anteriormente. Este medio se suplementó con 100 p g / d de uridina (Sigma) y con 1 mg/ml de 5 AFO (Sigma). El 5 AFO se esterilizó por filtración a través de una membrana millipore de 0.22 pm.

Medos para prueba de auxotrofia.

Se emplearon MM lactosa y MM lactosa suplementado con 100 pghl de uridina (Sigma) (adicionados con 30 g/l de agar [Bioxon]).

3. Condiciones de cultivo.

3.1 Fermentación Líquida.

Obtención de suspensión de esporas.

Se prepararon matraces con 40 m1 de medio power, se inocularon con 0.25-0.3 ml de suspención de esporas y se incubaron a 25 "C durante el tiempo necesario para alcanzar la esporulación. Una vez presentada la coloración verde característica de la formación de esporas, éstas se suspendieron en agua estéril con tween 80 al 0.2 % con ayuda de un agitador y barra magnética. Se realizó la cuenta de esporas cosechadas en cámara de Neubauer. La suspensión obtenida se utilizó para inocular tanto los medios semilla para FL como para los medios de FS.

lnóculo.

La FL requiere de un inóculo en forma de micelio, para lo cuál se preparó medio complejo de semilla para cada una de las cepas. Se inoculó con 2 X 1 O esporas/ml. Se incubaron matraces con 50 ml de medlo a 25 O C y con una agitación de 270 rpm. Este medio se utilizó para la obtención de micelio necesario para la inoculación del medio complejo de producción.

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Materiales y Metodos

Producción.

Para la producción de penicilina se prepararon matraces con 45 m1 de medio complejo de producción para cada una de las cepas. Se inocularon con 5 m1 de micelio crecido en medio complejo semilla y se incubaron a 25°C y 270 rpm. El tiempo de producción varía conforme a la cepa.

Análisis de las muestras.

Biomasa (peso seco). Las muestras de FL se filtraron, se lavaron y se secaron en homo a 80 "C hasta peso constante para determinar la cantidad de biomasa. El filtrado se separó antes de los lavados, y se colocó en tubos de ensaye; la cantidad de penicilina y pH se determinaron del filtrado.

PH. La medición de pH se efectuó directo del sobrenadante mediante un potenciómetro. Penicilina.

Para la cuantificación de penicilina, se realizaron bioensayos, utilizando B. subtilis ATCC 6633. Esta técnica se basa en la formación de un halo de inhibición del crecimiento, cuyo diámetro es proporcional al logaritmo de la concentración de penicilina.

Para poder efectuar el bioensayo se requirió obtener una suspensión de esporas de B. subtilis, para lo cuál se inoculó el medio de esporulación indicado anteriormente, con dos asadas procedentes de una colonia aislada con anterioridad en agar nutritivo. Se incubó en matraces de 250 m1 con 125 m1 de medio a 30 O C durante 24 horas con una agitación de 200 rpm. Cuando se obtuvo la suspensión, se determinó su densidad óptica a 340 nm y se inoculó el medio TSA.

Se utilizaron cajas de acrílico de 30 X 30 cm y se colocaron 350 m1 de TSA inoculando con 0.2 m1 de inóculo por cada 100 m1 de medio TSA para una suspensión de esporas de 13. subtiffis con densidad óptica de 1. Una vez gelificado el medio se hcieron pozos con un sacabocados y se llenaron con 60 p1 de muestra de fermentación y solución patrón. Las cajas se incubaron a 35 "C durante 16 horas para la formación de los halos de inhibición.

25

Materiales v Metodos

3.2. Fermentación Sólida.

Pretratamiento del soporte.

Se empleó como soporte bagacillo de caña. El bagacillo se tamizó en mallas No. 30 y 50 utilizando únicamente las partículas retenidas entre éstas dos mallas.

Para el pretratamiento del bagacillo, se mezcló este con el 50 % del agua total que se iba a utilizar en el medio y se llevó a 3 Ib/pul$ ( 101°C) de presión durante 30 minutos y una vez transcumdo el tiempo de pretratamiento se esterilizó a 15 lb/pul? (12 1 "C) durante 15 minutos.

Condiciones de cultivo.

Al bagacillo de caña tratado se le adicionó el medio apropiado para cada una de las cepas. El medio sólido conteniendo bagacillo, nutientes y las esporas (2 X 10 esporas/ml) tiene una humedad inicial de 70 % y 30 % de sólidos. El cultivo se realizó en columnas de vidrio conteniendo 12 g de medio de cultivo con una densidad de empaque de 0.26 g/ml, sumergdas en bailo de agua a 25°C para el control de temperatura y se mantuvo un sistema de aireación a un flujo de aire de 2.4 l/h. El flujo de aire se hizo burbujear en agua antes de pasar por cada columna con el fin de humihficar el aire.

Análisis de muestras,

Para el muestre0 en FS se tomaron dos columnas completas de cada tiempo, y se pesó la cantidad de medlo de la columna. Del meho se tomó 1 g para la determinación de pH, 1.5 g para la determinación de penicilina producida y 3 g se pesaron y se secaron para determinar la humedad del medio.

PH. Para la determinación de pH se mezcló 1 g de muestra con 10 ml de agua destilada agtando durante 1 O min. con agitador magnético antes de la determinación.

Penicilina. Para la extracción de penicilina, se pesó 1 g de muestra y se añadieron 6 ml. de amortiguador de fosfatos (pH 5.9, se agtó y se ajustó el pH entre 5 - 5.15, midiendo la cantidad de ácido o base empleadas para posteriormente tomarlas en cuenta en los cálculos de dilución. Se centrifbgó a 163 x g durante 20 min. y se

26

Materiales v Métodos

separó el sobrenadante, el cual se utilizó para determinar la concentración de penicilina por bioensayo.

Humedad. Para determinar humedad se pesaron 3 g de muestra y se colocaron en papel aluminio previamente puesto a peso constante. Las muestras se colocaron en estufa a 80" C por 24 horas determinándose su peso final.

4. Mutavénesis Y Curva de Sobrevivencia.

Siembra y cosecha de esporas.

Se sembraron esporas de P . chrysogenum de las cepas P2-32 y P2-37 con un inóculo de 0.3 m1 de suspensión de esporas en medio power; una vez esporulado el medo, se realizó la cosecha de esporas con tween 80 al 0.2%, agitador y barra magnética. La suspensión de esporas asÍ obtenida se filtró a través de fibra de vidrio con el fín de eliminar el micelio que pudlera haberse desprendido durante la cosecha de esporas.

Radiación con l u z U.V.

Se realizó una cuenta de esporas de la suspensión filtrada y en base a ella se realizó una dilución para obtener una concentración de 8 X 1 O esporadml. Se colocaron 27 m1 de la suspensión de esporas a la concentración antes mencionada en una caja petri estéril y manteniendo una agitación de 30 rpm, mediante un agitador magnético. Se llevó a cabo la irradiación con luz U.V. aplicándose con una intensidad de 250 pW/cm2 durante 10 min. Se tomaron muestras de Iml a los siguentes tiempos : 0,1,2,3,4,5,6,8 y 10 min. Las muestras irradladas se colocaron en viales y se conservaron en glicerol al 25% envolviéndose en papel aluminio, para mantenerlas en la obscuridad.

Después de la mutagenesis, se llevó a cabo un periodo de replicación del DNA y crecimiento micelial de las esporas mutadas, para que de ésta forma el dairo causado en el material genético se estableciera como un daiio estable y se permitiera transferirlos como mutaciones heredables. (Queener y Lively, 1986).

Así mismo se incluyó un período de sincronización de la germinación de las conidiosporas, una vez fijada la mutación, ya que de acuerdo a un estudio realizado por Bos y col., (1992), se observó que la irradiación con luz U.V. afecta la

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Materiales v Metodos

fisiología de las conidiosporas, reflejándose en una desincronización de su germinación. Para sincronizar la germinación se mantuvo el cultivo de esporas mutadas por un periodo de 7 días en almacenamiento a 4°C (Bos, 1993).

Elaboración de la curva de sobrevivencia.

Se tomó 0.1 ml de las muestras obtenidas para cada una de los tiempos de irradiación , y se realizaron diluciones que abarcaron un intervalo desde

1 X hasta 1 X 1 O4 . Cada una de las diluciones se plaquearon en PDA, por duplicado (0.1 ml de la dilución por placa) y se incubaron en la obscuridad (envueltas en bolsas negras) a 25 "C durante el tiempo necesario para el crecimiento de las colonias ( 7-9 días). Una vez que surgieron las colonias, se realizó un conteo de las mismas y se generó la curva correspondente de sobrevivencia.

Cuantificación de las mutantes morfológicas.

Las colonias se desarrollaron en PDA para determinar la viabilidad, y se llevó a cabo el conteo de aquellas colonias que presentaban diferencias morfológcas con respecto a la cepa parental sin mutagenizar.

5. Obtención de mutantes Auxótrofas a aminohcidos.

5.1 Procesos de enriquecimiento por filtraciones sucesivas.

Preparación de inóculo de esporas irradadas.

Se sembraron 0.3 ml. de la suspensión de esporas irradiadas de la cepa P2-37 en MC, llevándose a cabo su crecimiento en la obscuridad (cubriendo los matraces con papel aluminio). Una vez que el micelio completó la etapa de esporulación, se introdujo un periodo de sincronización de la germinación, almacenando el micelio esporulado a 4°C durante 7 días en la obscuridad (cubriendo los matraces con papel aluminio). Posteriormente se realizó la cosecha de esporas, como ya se mencionó anteriormente. Inmediatamente después se comenzaron los procesos de filtración

28

Materiales Y Metodos

Procesos de filtración.

Una vez preparado el inócdo de esporas irradiadas, se inocularon matraces con 50 m1 de MM líquido (2.5X105 esp/ml). Se agregaron perlas de ebdlición a los matraces para evitar la agregación del micelio germinado y con ello el atrapamiento de esporas con probabilidad de ser auxótrofas. Los matraces inoculados se incubaron a 25°C y con agitación de 150 rpm durante 60 horas. A intervalos de 30 horas se realizaron filtraciones del MM a través de fibra de vidno para remover el micelio que llegó a desarrollarse. El filtrado resultante se centrifügó a 1200 x g por 30 minutos y por decantación se recuperaron las esporas residuales que aún no habían germinado, para posteriormente resuspenderlas en MM nuevo y volver a incubación. Para la última filtración, las esporas no germinadas recuperadas se resuspendieron en agua con tween y se efectuó una cuenta de esporas. Se realizaron las diluciones correspondientes para efectuar el plaque0 de cajas de MC y lograr un crecimiento de alrededor de 300 colonias por caja.

Aslamiento de colonias.

De las esporas residuales no germinadas recuperadas que se desarrollaron en MC, se seleccionaron aquéllas que presentaban un menor tamaño, ya que se suponía que podían una mayor dificultad para crecer debido a algún desarreglo genético provocado por la mutagénesis, que resultara en un tipo de auxotrofia, mientras que aquellas colonias sanas mostrarían un crecimiento vigoroso. Se llevó a cabo el aislamiento de las colonias así seleccionadas en MC hasta su esporulación.

Prueba de auxotrofia.

La prueba de la auxotrofia se hizo después de impregnar la punta de un palillo con esporas de las colonias aisladas en MC, por picadura directa con el palillo en cajas petri con MM y MC respectivamente. Una vez comprobado que una colonia creció en MC y no lo hizo en MM, es decir que presentó una auxotrofia, entonces se continuó con la determinación del tipo de auxotrofia, la cual se realizó haciendo crecer la colonia auxótrofa en MM suplementados con los diferentes aminoácidos.

29

Materiales v Metodos

Determinación del tipo de auxotrofia.

Se prepararon 9 cajas petri con "-agar suplementados con una combinación específica de aminohcidos (ver tabla 1) y a una concentración de 200 mg/ml. Se sembraron por medio de picadura con palillo, esporas de las colonias que presentaron auxotrofia. La siembra de las mismas, se realizó en una posición específica, manteniéndose el mismo orden en todas las cajas, con el fin de seguir su identificación.

Caja No. 5 4 3 2 1 6

Arginina Aspártico Alanina Serina Glutámico 9 Prolina Treonina Triptofano Tirosina Fenilalanina 8 Lisina Valina Isoleucina Leucina Histidma 7

Uracil0 Metionina Cisteína Guanina Adenina

Tabla 1: Suplementación de aminoácidos al MM para determinar tipo de auxotrofia presente en los mutantes (Gunasekaran, 1995).

Cuando una colonia crece en alguna de las combinaciones dadas para las cajas 1-5, y lo hace también en alguna de las combinaciones dadas para las cajas 6-9, se permite la identificación &recta de un factor de crecimiento. Por ejemplo, si una colonia crece en la caja 1 y en la 7 requiere como factor de crecimiento histidma; si crece en la caja 3 y también lo hace en la 8 entonces requiere triptofano. Si una colonia crece solamente en una de las 9 cajas entonces probablemente requiera más de un nutriente.

5.2. Enzima lítica Novozyme.

Se preparó una suspensión de esporas irradadas de la cepa P2-37 como se mencionó anteriormente. Se sembraron IO4 esporas por caja petri de 5 cm de diámetro conteniendo "-agar (triplicado). Se incubaron a 25 "C durante 29 horas, período durante el cual los tubos germinales comienzan a ramificarse, siendo entonces el momento más propicio para la acción de la enzima. El monitoreo de la germinación se efectuó a través de un microscopio óptico. Al salir del periodo de incubación, se adicionó 1.5 ml de la enzima Novozyme (enzima lítica de Zrichodermu harziunum; Sigma Chemical C.O. L-2265) en cada una de las cajas, en una concentración de I O m g / d y se incubaron nuevamente a 25 "C por un periodo de 1 hora. Terminado éste se llevó a cabo la remoción de la enzima, seguida de lavados con agua estéril para asegurar su total eliminación. Se incubaron

30

Matenoles Y híetodos

nuevamente a 25 "C por 30 horas para dar oportunidad de que las esporas que no germinaron, lo hicieran. Se repitió posteriormente el tratamiento con Novozyme y se incubaron las cajas con la enzima a 25 "C toda la noche. Después se realizó la remoción de la enzima y los lavados. Se agregó una pequeña capa de MC a las cajas con 0.8 % de agar y se regresó a incubación a 25 "C por el tiempo necesario para la germinación de las esporas residuales que probablemente eran auxótrofas. Una vez germinadas, se seleccionaron con el criterio antes descrito y se aislaron en MC. El agua de lavado (lml por caja) se recuperó y se centrifugó a 1200 x g durante 30 min para recuperar las esporas que no germinaron y que fueron arrastradas en el agua de lavado. Estas esporas recuperadas se sembraron en MC y una vez germinadas las colonias se seleccionaron las más pequeñas y se aislaron en el mismo medio. La prueba y la determinación de la se realizó así mismo como se describe anteriormente.

6. Obtención de mutantes Auxótrofos a uridina.

Determinación de la dosis más adecuada de 5 AFO para la cepa P2-32.

Para llevar a cabo el aislamiento de mutantes de P. chrysogenum de la cepa P2-32 resistentes al 5 AFO, se implementó la metodología reportada por Diez y col. (1 987). Sin embargo antes de llevarla a cabo, se requirió determinar la concentración de 5 AFO que inhibiera el crecimiento y permitiera el desarrollo de colonias resistentes, en la cepa P2-32. Este proceso se llevó a cabo en la cepa sin mutar con el fin de detectar qué tan sensible era al 5 AFO, y posteriormente aplicar la dosis encontrada en la cepa mutada. Se aplicaron tres dosis diferentes de 5 AFO: 0.75 mg/ml, 1 mg/ml y 1.25 mg/ml.

6.1. Aislamiento de mutantes resistentes al 5 AFO.

Una vez determinada la concentración de 5 AFO más adecuada para la cepa P2-32, se preparó el inóculo de esporas irradiadas de la cepa por el método descrito anteriormente. Se realizaron las diluciones necesarias y se sembraron por plaque0 1.2 X 1 O6 esporas por caja petri con MM con lactosa suplementadas con 1 O0 pg / m1 de uridina y con 1 mg / m1 de 5 AFO (Diez y col., 1987). Se incubaron a 25 "C durante el tiempo necesario para el crecimiento de las colonias (8-10 días aproximadamente). Se aislaron en MC algunas de las colonias resistentes que lograron crecer a la concentración de 5 AFO empleada. El aislamiento de las

3 1

Materiales v Método!

colonias resistentes se llevó a cabo antes de su esponilación para evita contaminación de esporas de colonias adyacentes. De tal forma que se efectuó Ir propagación de micelio de las colonias resitentes en MC.

Prueba de auxotrofia a uridma.

Se probó la auxotrofia específicamente a uridina en MM con lactosa y MM cor lactosa suplementado con 100 pg / ml de uridina, inoculando esporas de las colonia: aisladas por medio de la picadura directa con palillo en estos medios.

32

Resultados

VI1 Resultados.

1. Selección de ceDas.

Se caracterizaron 5 cepas de P. chrysogenum: P2-32, P2-37, P2-47, P2-2V2 Y ASP- 2A, las cuales provenían de clones P2 y ASP aislados por Barrios y col. (1993) y que presentaban la característica de ser buenos productores de penicilina en SFS. La caracterización consistió en el desarrollo de fermentaciones tanto por el SFS como por el SFL de las cepas anteriormente mencionadas

En la tabla 2 se muestran las producciones y tiempos de producción máxima así como la productividad presentada por las diferentes cepas en ambos sistemas de cultivo.

Producción máxima I

en Tiempo FS FL CeDa FS FL Productividad

(pgog -* *oh")(pgoml".h") 116.01 19.34 29.54 36.68

44 168 24.01 7.38 44 152 I 12.02 14.87 I

~~ ~

I ASP-2AI 1235 1525 I 168 120 1 13.30 12.71 I g : gramo de materia seca.

Tabla 2 : Comparación de la producción y productividad máxima de penicilina alcanzadas por cinco cepas de P. chrysogenum cultivadas en FS a 25 "C y flujo de aire de 2.4 I I h y en FL a 25 "C y 270 rpm.

La producción relativa proporciona una medda que nos dice qué tan buena es una cepa en FS en relación a su capacidad para producir en FL, y ha sido interpretada como el número de veces que la producción en 1 g de medio sólido seco en el SFS es mayor que la producción en 1 m1 en el SFL (Se asume que 1 ml pesa 1 g para así obtener un parámetro adimensional). Este factor se obtiene dividiendo la producción máxima en FS entre la producción máxima en FL. De manera similar se calculó la productividad relativa, dwidiendo productividad en sólido entre productividad en líquido (Barrios y col., 1993). Estos dos parámetros se muestran en la tabla 3.

33

Producción Productividad .

Cepa Relativa Relativa (ps I pl) (PS / PL)

P2-32

0.81 0.77 P2-2v2 3.25 2.8 P2-47 0.81 0.75 P2-37 5.99 4.5

ASP - 2A 1.47 1 .O5

Tabla 3: Comparación de los factores de producción y productividad relativa entre las cinco cepas de P. chrysogenum evaluadas.

Los resultados muestran que la cepa de mejor producción de penicilina en el SFS es la cepa P2-32 ya que produjo aproximadamente 4.5 veces más que las otras cepas evaluadas. Mientras que la mejor producción de penicilina en el SFL lo muestra la cepa P2-37, sin embargo no se observó una diferencia muy marcada (1.4 veces) con respecto a las otras cepas. Los tiempos de producción máxima son diferentes para cada cepa, observándose que la que alcanza la mayor producción de penicilina en menor tiempo es la cepa P2-37, esto tanto para FS como para FL (tabla 2).

Las cepas P2-32 y P2-47 presentaron niveles mayores de producción en FS que en FL. Mientras que un comportamiento inverso es mostrado por las cepas P2-37, P2- 2V2 y ASP-2A. La producción y productividad relativas son así mismo diferentes para cada cepa, es decir, se confirma que no todas las cepas tienen la misma capacidad para producir en FS. La cepa P2-32 presenta la mayor eficiencia de producción en FS.

Por los datos anteriores se seleccionaron estas dos cepas, para conjuntar en un solo organismo la capacidad de biosíntesis de penicilina mostrada por la P2-37 en FL y las caractensticas que permiten una buena producción de penicilina mostrada por la P2-32 en FS. Es decir, una cepa de alto ps/pl con una de bajo pdpl.

En la Figura 3 se muestran las cinéticas de producción penicilina, pH y humedad en FS de l a s cepas seleccionadas. Se observa que la humedad tiende a aumentar conforme transcurre la fermentación para ambas cepas. El comportamiento de pH muestra una tendencia al incremento durante la fermentación. La cepa P2-32 muestra una producción de peniciha superior (10 325 &g) a la producción mostrada por la P2-37 (2 570 pglg) para este sistema de fermentación.

34

En tanto que en el sistema de FL se observa que la cepa P2-37 creció mejor (0.25 g /ml) que la P2-32 (0.015 g / ml) lo que se ve reflejado en la producción de penicilina. La P2-37 produjo 2.3 veces más de penicilina que la cepa P2-32 ( Fig 4). En cuanto al pH, este se incrementa en ambos casos hasta las 72 horas y observa un decremento posterior para la cepa P2-32 hasta el final de la fermentación.

35

Resultados

12000

a 8000 -

I

O 30 60 90 120 150 180 8.0

7.5

7.0

6.5

6.0 O 30 60 90 120 150 180

6 3 t 4 - t + t J 60 O 30 60 90 120 150 180

TIEMPO (horas)

+ CEPA P2-32 U CEPA P2-37

Fig 3 : Cinéticas de a) produccibn de penicilina, b) pH y c) humedad de las cepas P2- 32 y P2-37 de P. chrysogenurn cultivadas en FS a 25 "C y con un flujo de aire de 2.4 ¡/h.

36

5000

4000 -- a S - 2 E 3000 o - 2 2 2000 a-

--

”

w

l

O 30 60 90 120 150 180

6.5 6.0 5 O 30 60 90 120 150 180

.O30

.O25 C F”-Q . m .o20 2 .O15

o m .O05

v

S .o10

0.000 7 O 30 60 90 120 150 180

TIEMPO (horas)

U CEPA P2-37 L I

FIG 4 : Cinéticas de a) producción de penicilina, b) pH y c) biomasa de las cepas P2-32 y P2-37 de P. chrysogenum cultivadas en FL a 25 “C y 270 rpm.

31

Hesultndos

2. Aislamiento de Auxótrofos.

Las cepas seleccionadas como cepas parentales , la P2-32 y la P2-37, no tienen marcadores genéticos, como auxotrofias, por lo que se hzo necesario introducir algún marcador de este tipo, para posteriormente realizar la recombinación genética.

Los aminoácidos que intervienen en la ruta de biosíntesis de la penicilina son: valina, cisteína y lisina, por lo que se buscaron marcadores nutricionales diferentes a estos.

2.1. Mutagénesis.

Se generaron las curvas de sobrevivencia para ambas cepas parentales seleccionadas, mediante las cuáles, se permite establecer la dosis adecuada para la obtención de sobrevivencia de entre 50-60 %, para cada una de ellas (Fig 5 y Fig 6).

De acuerdo a las curvas de sobrevivencia generadas para ambas cepas, se puede observar, que para que los niveles de sobrevivencia sean de 50 % se requiere de la irradiación de luz U.V. sobre las esporas, por un tiempo de 2.5 minutos para el caso de la cepa P2-37 (Fig 6), mientras que para la cepa P2-32 se requiere un tiempo de 2.1 minutos a las condlciones establecidas (Fig 5). Los resultados muestran que la cepa P2-32 es más sensible a la radación U V al requerir menor tiempo de exposición de la radiación que la cepa P2-37. Además los resultados de cuenta viable observados en la cepa P2-32 fueron menores que los observados para la cepa P2-37 (Fig 5 y Fig 6) .

Se realizó un seguimiento de las mutantes morfológicas aleatoriamente en la cepa P2-37, que surgieron a cada tiempo de la curva de sobrevivencia (Fig 7).

Resultados

1 O0

80

20

O O 1 2 3 4 5 6 7

TIEMPO (min)

30000

25000 - E . o W I-

20000 2 - ?i

$ n:

15000 O0

3 10000 2

cn W

5000

O

1 -0- CEPA P2-32

FIG 5 : Curva de sobrevivencia. Porciento en función del tiempo de irradiación con luz UV y esporas sobrevivientes de la cepa P2-32 de P. chrysogenurn. Condiciones : 27 ml de suspención acuosa a una concentración de esporas totales 8 X 10 esplml, agitación de 36 rpm e intensidad de irradiación UV de 250 pWkm '.

39

Resultados

1 O0

80

20

O

27000

24000

w 18000

2 15000 2

m

-

12000 52 3

9000 g

6000

3000

O O 1 2 3 4 5 6 7

TIEMPO (min)

r"---l U CEPA P2-37

FIG 6 : Curva de sobrevivencia. Porciento en función del tiempo de irradiación con luz UV y esporas sobrevivientes de la cepa P2-37 de P. chfysogenum. Condiciones : 27 ml de suspención acuosa a una concentración de esporas totales 8 X 10 esplml, agitacidn de 36 rpm e intensidad de irradiación UV de 250 pW/m '.

40

1 O0

80

60

40

20

O O 1 2 3 4 5 6 7

TIEMPO (min)

-A" Yo DE MUTANTES U % DE SOBREVIVENCIA

~ ~~

FIG 7 : Comparación entre las mutantes morfológicas y el porcentaje de sobrevivencia de la cepa P2-37 de P. chrysogenum.

41

Resultados

2.2. Mutantes auxótrofos a aminoácidos.

Se aplicaron 2 procesos de enriquecimiento en la cepa P2-37 para el aislamiento de mutantes auxótrofas a aminoácidos. Los fundamentos de estas técnicas son distintos pero persiguen un mismo fin: recuperar esporas no germinadas, con alta probabilidad de ser auxótrofas, de entre un gran número de ellas que sí pueden hacerlo.

El primer proceso de enriquecimiento empleado consistió en la eliminación paulatina de las esporas germinadas capaces de crecer en M M , medante filtraciones sucesivas, con objeto de concentrar y recuperar las esporas no germinadas con alta probabilidad de ser auxótrofas (Bos y col., 1981; Uitzetter y col., 1986). Para lo cual se evaluó la eficiencia de algunos medios filtrantes determinando el porcentaje de esporas que lograban atravesarlo, y de ésta forma lograr la menor pérdda de esporas posible al momento de realizar la remoción del micelio germinado. Se probaron 3 tipos de filtros diferentes y la fibra de vidno resultó el medio filtrante más adecuado (Tabla 4). Finalmente se hicieron germinar esas esporas en medios específicos, con la finalidad de probar si eran o no auxótrofas.

I I Material

filtrante I I Gasa

E Fibra de vidrio

c

* La cuenta de esporas de la suspensión sin filtrar fue de 16.85 X IO6 Esporas/ml

Porciento de esporas esporas *

I

28.0 I 4.8 X 10 1 44.8 74.8

7.55 x 10 12.6 X 10

Tabla 4: Eficiencia de filtración de 3 materiales diferentes.

El segundo proceso de enriquecimiento empleado fue a base de una preparación de enzima lítica Novozyme 234 (Debets, 1989) basado en la eliminación selectiva de micelio germinado inmovilizado en una base de medio-agar, mediante la degradación de la pared celular. Se realizó un seguimiento del progreso de la germinación de las esporas mutadas, por me&o de un microscopio óptico, ya.que se precisaba llevar a cabo el tratamiento con la enzima lítica en un estadio germinativo específico del hongo. Es decir, la enzima Novozyme 234 sólo actúa sobre

42

conidiosporas activas metabólicamente, con una hifa muy joven (tubos germinales), su acción es poco eficiente en una conidia ramificada (Bos y col., 1992), de tal forma que se hzo actuar la enzima en micelio de Y. chrysogenum con 29 horas de germinación, periodo en el que el micelio comenzaba a ramificarse.

Cabe mencionar, que se realizaron varios procesos de enriquecimiento tanto por filtraciones sucesivas como por muerte selectiva mediante la acción de la enzima Novozyme 234 y finalmente se logró aislar 4 mutantes auxótrofas (Tabla 5).

Porciento de sobrevivencia en cada YO de Mutantes Colonias

Cepa

O 166 50-60 Novozyme P2-37

mutantes auxótrofas aisladas proceso de Tratamiento enriquecimiento

P2-37 0.74 % 4 539 50-60 Filtraciones sucesivas

Tabla 5 : Resultados de los procesos de enriquecimiento.

Una vez aisladas las mutantes auxótrofas a través de filtraciones sucesivas, se procedió a establecer el tipo de auxotrofia que presentaban, lo cuál se logró por medio de pruebas en MM suplementado con los diferentes aminoácidos. Se aislaron 4 mutantes auxótrofas (Tabla 6). Las mutantes se denominaron de la siguiente manera : mutante E-37M1 (Met -), E-37M2, E-37M3 y E-37M4 (S orgánico).

Tabla 6 : Mutantes aisladas de la cepa P2-37.

43

2.3. Mutantes Auxótrofos a uridina.

Determinación de la dosis más adecuada de 5 AFO para la cepa P2-32 sin mutar.

Se encontró que en la cepa P2-32 de P. chrysogenum sin mutagenizar, se mhibió el crecimiento a concentraciones superiores a 0.75 mg/ml de 5 AFO, mientras que se obtuvieron mutantes resistentes a la concentración de 1 y 1.25 mg/ml de 5 AFO, sin embargo se decide emplear la dosis de 1 mg/ml ya que no se observan diferencias en el número de mutantes resistentes obtenidas (Tabla 7). Se observó una frecuencia de 5 X 1 O ' para las mutantes espontáneas resistentes para ambas concentraciones de 5 AFO (Tabla 7 ) . Se lograron aislar nueve mutantes espontáneas, las cuales se probaron en su auxotrofia, sin embargo no se logró aislar ninguna mutante awótrofa a uridina.

Cepa

P2-32 6 X 1 0 5 1.25 3

Frecuencia de Auxotrofia mutación a uridina

5x10'' 5X 10 - 6

Aislamiento de mutantes resistentes al 5 AFO.

Una vez encontrada la dosis de 5 AFO a la cual se aislan mutantes con resistencia a este compuesto, para la cepa P2-32, se sembraron esporas mutadas con UV de esta misma cepa (50-60 % de sobrevivencia) en MM con lactosa con suplementación de 1 mg/d de 5 AFO y 100 pg/d de uridma (Diez y col., 1987). Se inocularon 1.2 X 10 esporas por caja, un inóculo mayor del que se había estado aplicando anteriormente (Tabla 7), con el objeto de incrementar el número de colonias resistentes aisladas. La fiecuencia de mutantes resistentes que se observó fue de 5 X 10" , lo que llevó al aislamiento de un gran número de colonias resistentes, contando un promedio de 60 colonias resistentes al 5 AFO por caja.

44

Resultados

Finalmente, se lograron aislar 128 colonias resistentes al 5 AFO, y mediante pruebas en h4M y MM suplementado con uridina, se encontró una mutante auxótrofa a uridina. La mutante aislada se denominó E-32U.

3. Evaluación del nivel de uroducción de uenicilina en mutantes auxótrofas.

Es necesario hacer mención de que muchas de las investigaciones que involucran el trabajo con microorganismos marcados genéticamente han recibido tratamientos mutagénicos que generan niveles de sobrevivencia muy bajos, menores al 10 YO, y10 bien tratamientos con mutágenos químicos.

Sin embargo, a pesar de que los niveles de sobrevivencia generados en las cepas seleccionadas fueron de entre 50-60 YO para prevenir daílos indeseables en el material genético, aún así es necesario evaluar el nivel de producción de penicilina en las mutantes auxótrofas aisladas y asegurar de esta forma que la producción de penicilina no ha sido afectada. Esto se observó al realizar una comparación entre las cinéticas de producción de penicilina de las mutantes y las cepas parentales.

En la tabla 8 se muestran las producciones máximas, los tiempos de producción máximos y la productividad de las cepas parentales P2-32 y P2-37 en una segunda caracterización llevada a cabo, así como de las mutantes auxótrofas E-32U y E- 37M1 en cultivos de FS y FL. Las producciones y productividades relativas se muestran en la Tabla 9.

En la segunda caracterización de las cepas parentales, se observa una reducción en la producción de penicilina en el SFL con respecto a la primera tanto en la cepa P2- 32 como en la P2-37 (tabla 2 y tabla 8) y (Fig 9); un comportamiento similar es presentado en la cepa P2-32 en el SFS, mientras que la cepa P2-37 por lo contrario, incrementa su producción en este mismo sistema (tabla 2 y tabla 8) y (Fig 8 ).

La producción relativa de la cepa P2-32 (tabla 9) disminuye considerablemente en su segunda evaluación con respecto a la primera (tabla 3 y tabla 9), mientras que la P2- 37, la aumenta también de forma importante (tabla 3 y tabla 9).

Al llevar a cabo una comparación entre las mutantes y las cepas parentales en su última evaluación (tabla 8), se observa una disminución de la producción en el SFS tanto para la cepa P2-32 como en la P2-37, presentando la mutante E-32U una disminución del 40 %, en tanto la E-37M1, muestra una disminución del 8%. Un comportamiento inverso se pone de manifiesto en el SFL en donde un aumento de

45

Resultados

entre 25-30 % en la producción es observado para ambas mutantes. Se presenta entonces una dlsminución de la eficiencia de producción en sólido en ambas mutantes aisladas, la E-32U y la E-37M1.

En la Fig. 10 se muestran las cinéticas de producción de penicilina, pH y humedad de la mutante E-32U comparada con la cepa parental P2-32 en el SFS. La Fig. 11 muestra las cinéticas de producción de penicilina, pH y biomasa de las mismas cepas pero en el SFL. En la Fig. 12, se muestran así mismo las cinéticas de producción de penicilina, pH y humedad de la mutante E-37Ml comparada con la cepa parental P2-37 en el SFS. En tanto que la Fig 13 muestra las cinéticas de producción de penicilina, pH y biomasa de las mismas cepas para el SFL.

Se observa en la Fig. 10 que la humedad se incrementa gradualmente conforme transcurre la fermentación tanto para la cepa P2-32 como para la auxótrofa E-32 U. El comportamiento general del pH para ambas cepas es de un incremento gradual hasta el final de la fermentación. En la Fig. 11 la biomasa de ambas cepas se incrementa, en tanto que el pH pra la cepa P2-32 aumenta para luego permanecer estable; el pH de la auxótrofa E-32U disminuye después de las 60 horas de fermentación para luego incrementarse de forma gradual hasta el final del cultivo.

En la Fig 12 el comportamiento de la humedad en las cepas P2-37 y E-37 M1 es de un incremento gradual hasta el final de la fermentación al igual que el pH. A s í mismo, en la Fig. 13 la biomasa también se incrementa de forma gradual hasta el final de la fermentación. Se observa el mismo comportamiento en el pH para la cepa P2-37 mientras que el pH de la auxótrofa E-37 M1 decrece después de las 80 horas de fermentación y hasta el final de la fermentación.

46

mamma en Productividad

* g : gramo de materia seca.

Tabla 8 : Comparación de la producción y productividad máxima de penicilina alcanzadas entre las cepas de P. chrysogenurn parentales P2-32 y P2-37 y entre las mutantes auxótrofas E-32U y E-37M1 cultivadas en FS a 25 O C y flujo de aire de 2.4 Ilh y en FL a 25 O C y270 rpm.

Cepa Productividad Producción relativa relativa (ps I PI) (PS I PL)

P2-32 4 2.4 E-32U

5.08 2.62 E-37M1 5.30 3.66 P2-37 0.98 1.12

Tabla 9 : Comparación de los factores de producción y productividad relativa entre las cepas de P. chrysogenurn parentales P2-32 y P2-37 y las mutantes auxótrofas E-32U y E-37M1 cultivadas en FS a 25 O C y en FL a 25 O C y 270 rpm.

47

Resultados

O 30 60 90 120 150 180 TIEMPO (horas)

5000

4000 I

~~

2 3000 "p 0 0 z a 2000 a

1 O00 w

O

+" CEPA P2-32 (lera) promedio

-+ CEPA P2-32 (2da) promedio 0 CEPA P2-32 (lera) muestras duplicado

O CEPA P2-32 (2cta) muestras duplicado

O 30 60 90 120 150 180 TIEMPO (horas)

A CEPA P2-37 (lera) muestras duplicado -0- CEPA P2-37 (2da) promedio

Fig 8 : Cin6ticas de produccidn de penicilina de las cepas a) P2-32 y b) P2-37 de P. chrysogenom tanto de su primera (al inicio del trabajo experimental) como de su segunda caraderizacibn (al caracterizar las mutantesauxdtrofas aisladas), cultivadas en FS a 25 "C y con un flujo de aire de 2.4 Ilh.

48

5000

4000 a 2 - 3000 d E

3 2000 a

1 O00

O O 30 60 90 120 150 180

TIEMPO (horas)

-0- CEPA P2-32 (lera) promedio -t CEPA P2-32 (2da) promedio 0 CEPA P2-32 (2da) muestras duplicado O CEPA P2-32 (lera) muestras duplicado

4000

5 = 3000 U

5s 3 2000 a

I O00

O I

O 30 60 90 120 150 180

TIEMPO (horas)

CEPA P2-37 (1 era) promedio

-0- CEPA P2-37 (2da) promedto 0 CEPA P2-37 (lera) muestras duplicado

O CEPA P2-37 (2da) muestras duplicado

FIG 9 : Cinéticas de producción de penicilina de las cepas a) P2-32 y b) P2-37 de P. chrysogenurn tanto de su primera (al inicio del trabajo experimental) corno de su segunda caracterización (al caracterizar las mutantesauxótrofas aisladas), cultivadas en FL a 25 "C y 270 rpm.

49

Resultados

5000 11 4000

2 3000 S 0 - z 9 2000 2 -

1 O00

O O 30 60 90 120 150 180

8.0 I 1

5.5 5.0

"

U

I I I I I

O 30 60 90 120 150 180

60

O 30 ~ 60 90 120 150 180

TIEMPO (horas)

-0- AUXOTROFA E-32U

FIG I O : Cinéticas de a) produccibn de penicilina, b) pH y c) humedad de la cepa parental P2-32 y de la mutante auxótrofa E-32 U de P. chrysogenum cultivadas en FS a 25 "C y con un flujo de aire de 2.4 I/h.

50

2 2 2 2 6 3

Resultados

4000

2 E 3000

--

a-

0 - -- S -

z 2 2000

a

"

w

O 30 60 90 120 150 180

8*o *

6.0 {I O 30 60 90 120 150 180

.O25 N

--

" ul .o20 C

O 30 60 90 120 150 180

TIEMPO (horas)

r 1 +- PARENTAL P2-32 -0- AUXOTROFA E-32U

FIG 11 : Cinéticas de a) producción de penicilina, b) pH y c) biomasa de la cepa parental P2-32 y de la mutante auxótrofa E-32 U de P. chfysogenum cultivadas en FL a 25 "C y 270 rpm.

51

5000

O 30 60 90 120 150 180 8.0 11

6.0 1 1 O 30 60 90 120 150 180

3 x 63 --

60 3 O 30 60 90 120 150 180

TIEMPO (horas)

+ AUXOTROFA E-37-M 1

FIG 12 : Cinéticas de a) producción de penicilina, b) pH y c) humedad de la cepa parental P2-37 y de la mutante auxótrofa E-37Mlde P. chrysogenum cultivadas en FS a 25 "C y con un flujo de aire de 2.4 Ilh.

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Resultados

5000 11

O 30 60 90 120 150 180 8.0 1

6.0

O 30 60 90 120 150 180

.O30 I 1

0.000 i j O 30 60 90 120 150 180

TIEMPO (horas)

-0- AUX~TROFA E-W-MI U PARENTAL P2-37

FIG 13 : Cinéticas de a) producción de penicilina, b) pH y c) biomasa de la cepa parental P2-37 y de la mutante auxótrofa E-37Mlde P. chrysogenorn cultivadas en FL a 25 "C y 270 rprn.

53

VI11 Discusión.

1. Selección de ceDas.

De acuerdo con la hipótesis, en donde se establece que para lograr generar cepas especialistas en el SFS se requiere partir de cepas que cuenten con características deseables complementarias para este sistema de fermentación, y que a través del proceso de recombinación genética éstas lleguen a reunirse en un sólo organismo recombinante, la mejor opción en cuanto a complementación de Características deseables la presenta la pareja de cepas P2-32 y P2-37, ya que por una parte, la cepa P2-32 presenta un alto potencial de producción de penicilina en el SFL @dpl bajo). En tanto que la cepa P2-37, desarrolla una alta eficiencia de producción en el SFS (pdpl alto). Esta elección esth sustentada en evidencias experimentales generadas por Barrios y col. (1993). Los autores evaluaron mutantes espontáneas, aisladas de cepas altamente productoras en FL y encontraron que algunas de éstas mutantes expresaron mejor su potencial de producción en el SFS que l a s otras. Ellos determinaron esta habilidad, mediante el cálculo de su pdpl, de tal modo que l a s cepas con una elevada producción del antibiótico en FS mostraban un pdpl alto, y tendían a expresar una menor producción en FL, mientras que por lo contrario, l a s cepas con una baja producción del antibiótico en FS mostraban un ps/pl bajo y tendían a expresar una mayor producción en FL. La posible interpretación que dan a estos resultados es que las cepas con bajas producciones en FL poseen ciertas Características que, aunque no están directamente relacionadas con la biosíntesis del antibiótico, son útiles para su crecimiento y producción en el SFS.

Por tanto, se sugiere que la cepa P2-37 posee alguna o algunas Características, que le permite expresar mejor su potencial de producción en FS que la P2-32; mientras que la cepa P2-32 esth expresando, probablemente, otras características que le penniten mostrar una buena producción en FL.

Las características de interés mostradas independientemente por las cepas P2-32 y P2-37 permiten sugerir la existencia de dos grupos de genes independientes entre sí, que c o a c a n para cada una de éstas dos Características deseables, en donde el grupo de genes que participa en la generación de mformación para una alta eficiencia de produccibn @s/pl) codifica Características útiles para el crecimiento y producción del hongo en el SFS y que no aportan ningún beneficio para el SFL. Mientras que el otro grupo de genes contiene la Sonnación relacionada de biosíntesis necesaria para codificar un alto potencial de producción expresado en el SFL. De esta forma, al fusionarse las cepas y generarse recombinación genética de

54

Discusión

cada una de ellas, podrían conjuntarse ambos grupos de genes, es decir, ambas caracteristicas en un solo organismo, de tal forma que le permitiera desarrollarse eficientemente en FS y expresar un potencial de producción aún mayor que el presentado por las cepas parentales de las c d e s proceden.

2. Aislamiento de Auxótrofos.

2.1 Mutagénesis.

Los marcadores que se buscaron en la cepa P2-37 fueron auxotrofias a aminoácidos como leucina, metionina y prolina (Anné y col., 1975; Peberdy y col., 1977, Anné, 1982) y en la cepa P2-32, awótrofos a uridina (Diez y col., 1987). La elección de este tipo de marcadores para cada una de las cepas, fue aleatoria, de este modo, pudo haberse realizado de forma invertida, es decir, buscar auxotrofias a aminoácidos en la cepa P2-32 y auxotrofia a uridina en la p2-37. En el caso de los auxótrofos a aminoácidos, se buscaron éstos ya que, ademk de no intervenir en la ruta de biosíntesis de penicilina (valina, cisteína, lisina), otros autores que han realizado trabajos similares con Pxhrysogenum han obtenido este tipo de marcadores; la importancia de aislar marcadores similares radica, en que si se genera un seguimiento en los trabajos por parte de otros investigadores, se genera más información que puede ser útil ó aplicable en ciertas áreas, de tal forma que con los resultados generados de este estudio, también se tenga acceso a dar seguimiento a trabajos posteriores relacionados, e inclusive encontrar información adicional igualmente importante. Ahora bien, para el caso del awótrofo a uridina se busc6 este tipo de mutante por la ventaja que representaría si fuera un mutante pyr G (que codifica para la enzima descarboxilasa orotidin 5- monofosfato, 0" - descarboxilasa) debido a que estos mutantes tienen aplicabilidad en el área de ingeniería genética, donde este gen es marcador de los principales vehículos moleculares para hongos. De tal modo que se llevaron a cabo mutaciones de las cepas parentelas mediante radiación con luz U.V., debido a que presenta ciertas venfajas sobre algunos otros tipos de mutágeno (Rowlands, 1984a). Se ha observado que mutantes auxótrofas de Aspergillus niger obtenidas por tratamiento con nitrosoguanidiua mostraron un crecimiento lento y una esporulación pobre en contraste con rnutantes similares obtenidas con tratamiento de luz U.V., en base a lo cual se decidió no utihzar mutágenos químicos, sino inducir la mutación en las cepas parentales mediante la aplicación de luz U.V. Se observaron diferencias entre las curvas de sobrevivencia de las cepas P2-32 y P2- 37. La cepa P2-32 requirió de menos tiempo para generar niveles de sobrevivencia

55

Discusibn

del 50 %, en tanto que la cepa P2-37 necesitó más tiempo para generar los mismos resultados. De acuerdo a referencias bibliográficas, se tiene que la coloración de las esporas determina la resistencia a la radiación U.V. @os y col., 1992; Loera 1994) de esta forma esporas negras de A. niger requieren de una intencidad de radiación U.V. de 700 pW/cmz mientras que esporas más claras como las de P. chrysogenum requieren de 250 pW/cmz . Las esporas de ambas cepas la P2-32 y la P2-37 son verdes y es posible que se presente alguna diferencia en pigmentación de poca intensidad entre ellas sin embargo no es apreciable a simple vista. Esto podría explicar la mayor sensibilidad de la cepa P2-32. El porcentaje de mutantes morfológicas se consideró como un estimador que permitiera comprobar que realmente se habían inducido cambios a nivel de material gendtico y particularmente se consideraba importante que estas mutaciones se presentaran a los niveles de sobrevivencia de interés, es decir, a niveles entre 50- 60%.

2.2. Mutant- Auxótrofos a aminoácidos.

El utilizar bajas dosis de mutágeno para cancelar aberraciones cromosómicas, implica el obtener una alta proporción de sobrevivientes y una baja frecuencia de mutantes entre los protótrofos sobrevivientes por lo que se requiere una etapa eficiente de enriqueciemiento @os y col., 1992).

El proceso de enriquecimiento por filtraciones sucesivas resultó ser eficiente para el aislamiento de mutantes que se encuentran - bloqueados - en alguna vía metabólica, en este caso se aislaron mutantes Met y S orgánico, a dosis bajas de mutágeno (50-60%), logrimdose el aislamiento de las cepas E-37M1, E-37M2 E-37M3 y E-37 M4 a partir de la cepa P2-37. La mutante E-37 M1 (Met -) fue incapaz de metabolizar metionina, por lo que se hizo necesario la suplementación de este aminoácido en el medio de cultivo, es decir se afectó la ruta de biosíntesis de la metionina. Mientras que las mutantes, E-37M2, E-37M3 y E-37 M4 fueron auxótrofas a S - orgánico, es decir presentaron la incapacidad de asimilar azufre inorgánico, por lo que el suministro de una fuente orgánica del mismo se huo necesario, siendo la metionina o bien la cisteína aquellos aminoácidos que podían proporcionar esta fuente orgánica de azufre. Trabajos anteriores realizados en este sentido (Bos, 1992), mostraron que al aplicar el método de filtraciones sucesivas, permitió el aislamiento de una gran variedad de mutantes deficientes en la síntesis de aminoácidos, así como de mutantes que requieren adenina además de un pequeiío número de mutantes deficientes en vitaminas. Encontraron que la aplicación de este metodo deriva en una baja

56

fiecuencia de aislamiento de mutantes auxótrofas obteniéndose en promedio un mutante por experimento o por proceso de filtración. En este estudio se encontró una frecuencia de aislamiento de mutantes de un mutante por cada tres procesos de filtración.

En el proceso de enriquecimiento mediante la aplicación de la enzima lítica Novozyme, se hizo un seguimiento de la germinación con la ayuda del microscopio óptico, pretendendo encontrar un tamaiio determinado de los tubos germinales. En trabajos similares (Debets y col., 1989), se reporta que la acción de la enzima lítica es más eficiente cuando el tamaño de los tubos germinales es de 20 veces el tamaño del diámetro de la espora. En el caso de P.chrysogenum, se monitoreó la germinación conforme transcurria el tiempo de incubación, y cuando el tubo germinal contaba con un tamaño aproximado de de 3-5 veces el diámetro de la espora, se dio inicio una compleja ramificación generando por tanto varios tubos germinales en varias direcciones con longitudes diferentes, de tal forma que se decidió realizar la adición de la enzima al presentarse una estructura compleja en cuanto a forma (ramificación) actuando así en el micelio joven y poco ramificado; esto se llevó a acabo a l a s 29 horas de incubación. Debido a las observaciones encontradas en el monitoreo de la germinación para el caso de P. chrysogenum y bajo las condiciones experimentales reportadas en este estudio, se tiene que el valor promedio del tamaño de los tubos germinales que permite ías condiciones más propicias para la adición de la enzima Novozime es de 10 veces el diámetro de la espora. Este valor se encuentra por debajo del reportado en literatura, el cuál era a su vez el más propicio para un microorganismo diferente (A. niger) y bajo condiciones también diferentes.

El proceso de enriquecimiento con la enzima lítica Novozyme se implementó en una etapa posterior al de filtraciones sucesivas, de tal forma que no se logró la aplicación de forma importante de esta metodología, y se suspendió al encontrarse las mutantes requeridas encontradas por procesos de filtraciones sucesivas. De este modo no resulta posible el poder evaluar la eficacia del método. Sin embargo la aplicabilidad de esta metodologia fue así mismo discutida por Bos y col. (1992) encontrando nuevos tipos de mutantes con requerimientos a aminoácidos, a vitaminas o nuclebtidos, Adem& de que el número de mutantes independientes por experimento y el aislamiento de nuevos tipos de mutantes, mostraron que el enriquecimiento por medio de enzjmas líticas es mucho más eficiente que el mCtodo de enriquecimiento por filtraciones sucesivas.

2.3. Mutantes Auxótrofos a uridina.

Esta metodología se fundamenta en el aislamiento de mutantes resistentes al compuesto 5 AFO, las cuales son deficientes en enzimas OMP descarboxilaza, por lo que la ruta de biosíntesis de la UMP precursor de las bases pirimídicas se bloquea, y con ello la síntesis del ADN, en consecuencia se requiere el suministro de uridina en el medio para permitir el crecimiento del organismo.

La mutante auxótrofa a uridina se aisló en MM lactosa en lugar de glucosa. La glucosa es un represor de la biosíntesis de penicilina y la lactosa no lo es; en el transcurso de la fermentación, al acabarse la glucosa se activa la acción de la f3- galactosidasa y desdobla a la lactosa en sus unidades : glucosa y galactosa. La glucosa entonces se administra poco a poco evitando la represión en la producción de penicilina. Si se adicionara glucosa en el MM habría la posibilidad de aislar una mutante que no sintetice la P-galactosidasa, es decir, una P-galactosidasa y esa mutante no es de interés ya que se requiere el desdoblamiento de la lactosa.

-

Para el aislamiento de mutantes resistentes al 5 AFO se requiere de por lo menos una etapa de crecimiento y esponrlación del stock original de esporas mutagenizadas, ya que después de la mutagénesis, las esporas se encuentran adas debido al tratamiento de irradiación por lo que tienden a manifestar bajas expectativas de vida. Es por ello que una etapa de germinación de las esporas sobrevivientes tan pronto como sea posible, resultará ventajoso para la obtención de esporas saludables con el mismo porcentaje de mutantes que el stock original de esporas mutagenizadas (Campuzano, 1993).

Se requirió encontrar la dosis de 5 AFO más adecuada para la cepa P2-32 que permitiera el aislamiento de colonias resistentes a este compuesto. Este proceso se implementó en la cepa sin mutar, debido a que se necesitaba determinar que tan sensible era la cepa al compuesto tóxico. Además se permitía contar con el aislamiento de mutantes espontáneas que mantenían la probabilidad de contar con la auxotrofia a uridina. La proporción de awrótrofos a pirimidina de entre las colonias resistentes al 5 AFO aisladas de la cepa mutagenizada P2-32, en este caso fue de 1 de entre 128 , es decir, el 0.78%. La proporción encontrada en trabajos similares (Diez y col., 1987) ha sido superior, reportando porcentajes de hasta 10 %; cabe aclarar que el tratamiento mutagénico ha sido realizado con mutágenos químicos además de haber generado bajos niveles de sobrevivencia de entre 10-20 % (Diez y col., 1987). A s í mismo, Campuzano (1 993), usando la misma metodología en Phycomyces

58

Discusión

blakesleeanus, reportó porcentajes de hasta 7 % utilizando de igual forma mutágenos químicos y niveles de sobrevivencia aún menores (517%). Sin embargo a pesar de lo anterior, el proceso de aislamiento de mutantes a pirimidina es eficiente y se logró aislar la mutante E-32U a partir de la cepa P2-32. En la mayoría de los casos en donde se han obtenido awótrofos a pirimidina por medio de la resistencia al 5 AFO, se han realizado paralelamente caracterizaciones bioquimicas de estas mutantes y se ha encontrado que en la mayoría de los casos los mutantes auxótrofos a pirimidina están alterados en el gen pyr G (que codifica para la enzima descarboxilasa orotidin 5- monofosfato, OMP - descarboxilasa) y en el gen pyr F (que codifíca para la enzima orotato fosforibosil transferasa, OPR- Transferasa) (Oakley y col., 1987; Smit y Tudzynsky, 1992; Akileswaran y col., 1993). Por su parte Diez y col. (1987) para determinar si la mutación de una cepa de P. chrysogenum auxótrofa a pirimidina obtenida por resistencia al 5 AFO, se encontraba en el gen pyr G, realizaron mediciones de la actividad enzimática de la OMP descarboxilasa; los resultados mostraron la carencia de actividad enzimática de la OMP descarboxilasa por lo que concluyen que la mutante era un auxótrofo pyr G. Además confirman sus resultados al complementar la mutación con el uso de los plásmidos pDJBI y pDJB2 los cuales portaban el gen pyr 4 de Neurospora crassa (gen que codifica para la enzima OMP descarbodasa). Recuperaron la actividad de la OMP descarboxilasa en la mutante auxótrofa a pirimidina, lo cuál indica que el gen pyr 4 de Neurospora crassa se puede expresar en P. chrysogenum y que la enzima OMP descarboxilasa codificada por este gen es funcional en la ruta de biosíntesis de la pirimidina en P. chrysogenum. Se considera importante dar seguimiento a estudios relacionados con la identificación de la mutación del auxótrofo a uridina E-32U7 ya que si se trata de un mutante pyr G, resultaría de utilidad en estudios de Ingeniería genktica. Actualmente es un hecho que el gen Pyr F de P. chrysogenum ya ha sido clonado y es posible construir vehículos moleculares con ese marcador (J.F. Martín comunicación personal).

3. Caracterizaci6n de las ceDas Darentales Y aux6trofas.

En la caracterización efectuada de las cepas parentales y auxótrofas, se consideran las cinéticas de pH, humedad y biomasa como parámetros que proporcionan información acerca de la fermentación. A s í el pH cambia y se baslfica conforme transcurre la fermentación debido a que la concentración del ácid0 fenil acético (MA) presente en el medio de cultivo disminuye para incorporarse en la ruta metabólica de biosíntesis de penicilina; además puede ser indicador de posibles

59

contaminaciones del cultivo. Por otro lado, se considera que el contenido de agua, la humedad, aumenta en la FS durante el cultivo y de esta forma se puede inferir el comportamiento en cuanto al crecimiento del hongo. Además la humedad se establece como un control que permite adjudicar la producción de penicilina al microorganismo en sí y no a cambios en la humedad ya que se ha comprobado que la humedad inicial en intervalos de 60-78 % no afecta el tiempo de inicio de la producción pero sí tiene una importante influencia en la producción de penicilina, encontrándose que se obtiene una producción máxima utilizando 70 y 73 % de humedad inicial (Barrios y col., 1988). En las caracterizaciones efectuadas tanto en las cepas parentales P2-32 y P2-37 como en las auxótrofas E-32 U y E 37 M1, las fermentaciones comenzaron con humedades iniciales de entre 68-71% para de esta forma proporcionar las condiciones de humedad más favorables y obtener los niveles máximos de producción de penicilina. Por tanto los cambios observados en las producciones de penicilina generados por las diferentes cepas, son atribuibles al microorganismo ya que no se observan variaciones importantes en lo que a humedad inicial se refiere.

4. Evaluación del nivel de uroducci6n de Denicilina en mutantes auxótrofas.

De acuerdo a los resultados obtenidos de la primera y segunda caracterización de las cepas parentales P2-32 y P2-37 en cuanto al nivel de producción de penicilma, se observa que la producción disminuye en ambos sistemas de cultivo a excepción de la P2-37, la cuál presenta un incremento importante en la producción de penicilina en el SFS durante su segunda caracterización (Tabla 2 y Tabla 8) y (Fig 8 y Fig 9). El comportamiento anterior puede sugerir un cierto grado de inestabilidad genética presente en las cepas y/o bien una variación clonal de las esporas empleadas, es decir, heterogeneidad en los niveles de producción generadoscabe mencionar que tanto las condiciones del proceso de caracterización de las cepas y el equipo empleado, fueron los mismos en la primera y segunda caracterización. Los cambios observados en producción pueden ser consecuencia del manejo de inadecuados sistemas de conservación que causaran un ambiente propicio para permitir alteraciones en el genoma. En este estudio, la conservación efectuada a lo largo de casi 12 meses fue en un sistema de ghcerol al 25 % a -70°C. Se sugiere entonces considerar sistemas alternativos de conservación que aseguren estabilidad de las características presentes en una cepa. Estos resultados sefialan la necesidad de hacer estuhos de estabilidad genktica como parte de la caracterización de las cepas parentales.

222263 Discusión

Ahora bien, si se observan las cinéticas de producción de penicilina, de la cepa parental P2-32 y de la mutante auxótrofa E-32U en FL (Fig. 1 I), se tiene que esta, prácticamente es igual en ambas cepas. Es decir, el proceso de mutagénesis no afectó a la mutante en su desempeño en FL. En cambio al observar l a s cinéticas de producción de penicilina de l a s mismas cepas pero en FS (Fig. IO), se detecta claramente, que el proceso de mutagénesis afectó funciones en la mutante E-32U que sólo son necesarias para producir en FS, ya que se observa una pérdida importante en la producción máxima de penicilina (del orden del 40 %) (Tabla 8).

Es poco probable que la auxotrofia a uridina sea la responsable de este fenotipo en la mutante ya que se han obtenido auxótrofos a uridina en otro tipo de microorgamsmos por la vía de la resistencia al 5 M 0 sin alterar otras características, además se ha determinado que en la mayoría de los casos las mutantes awótrofas a uridina están alterados en el gen pyr G y en el gen pyr F. Lo más probable es que haya otra(s) mutacion(es); en este caso el otro gen mutado sería un gen que permite una mayor producción en FS. La existencia de esta mutante, da margen a realizar estudios posteriores enfocados a la-identificación del gen que permite una mejor producción en FS. El llevar a cabo este tipo de estudios sería de gran importancia ya que se reconocería el gen (o los genes) activador de la producción de penicilina en FS. Estos estuhos contemplarían la búsqueda del gen en una genoteca que complemente esta mutación. Cabe mencionar que además de esta importante disminución en la producción del antibiótico, se presume un desajuste general de la fisiología de la mutante E-32U, debido a que presentó deficiencia en la formación de esporas. Esto hizo necesario realizar modificaciones en la metodología respectiva a la evaluación de la producción en el SFS ya que se inoculó con micelio y no con esporas como se hace habitualmente; esto se llevó a cabo tanto en la cepa parental como en la mutante con la finalidad de estandarizar los resultados, y poder efectuar comparaciones entre las producciones de penicilina registradas para ambas cepas. Esta modificación en la metodología, introduce una variable no considerada en la primera evaluación de la cepa parental, ya que esta se efectuó utilizando un inoculo de esporas y no de micelio. De esta forma se podrían generar cambios en características como el pdpl. La deficiencia en espodación de la mutante E-32U indica que el proceso de mutación aplicado, modificó información a nivel genético que afectó la formación de esporas; este evento, no era deseable, sin embargo la característica de deficiencia en esporulación permite contar además con un marcador de tipo morfológico en esta mutante, lo cud facilitaría el proceso de aislamiento de recombinantes.

Discusion

En la Tabla 9 se observan los pdpl de las mutantes auxótrofas aisladas. Estos mantienen la característica de ser uno menor que el otro (E 32U pdpl = 1.12; E 37M1 pdpl = 2.62), lo que permite una complementariedad entre ambas es decir, en trabajos posteriores en donde el objetivo sea efectuar fusión de protoplastos, se contaría con una cepa que aporta una alta eficiencia de producción en medio sólido (alto pdpl) y otra que aporta una alta producción de penicilina (alta producción en medio líquido y bajo pdpl). Es deseable que las diferencias entre ps/pl de ambas cepas sean grandes para poder interpretar los resultados de una forma más sencilla. Es decir, una ves realizada la cruza entre ambas cepas se generarán recombinantes, y entre ellos pueden encontrarse algunos en los que se haya conjuntado tanto la Característica de eficiencia en sólido (pdpl alto) y la de alta producción, de tal forma que si la diferencia entre pdpl de ambas cepas es grande, la producción de penicilina del recombinante se incrementará de tal forma que sea mucho más alta que aquella mostrada por las .cepas parentales ( p s = [ps/pl alto] X [alta producción de penicilina]) . Por lo que se genera la sugerencia, para trabajos futuros, de mutagenizar nuevamente a la cepa E-32U con la halidad de aumentar su producción de penicilina en FL y de esta forma disminuir su pdpl y generar una mayor diferencia con el ps/pl de la cepa E-37 M1 . Ello contemplaría comprobar mediante pruebas en discos de agar, primero, que la mutante conserva la auxotrofia y segundo, que la producción de penicilina en FL efectivamente se incremente, para de esta forma generar una mayor diferencia entre los pdpl de las mutantes que se sometan a estudios de recombinación genética.

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Conclusion

IX Conclusiones.

Se re&ó la evaluación de producción de penicilina de cinco cepas de P. chrysogenum tanto por FS como por FL y se encontró que la cepa de mejor producción de penicilina en FS fue la cepa P2-32 (10 325 pglg), mientras que la de mejor producción del antibiótico en FL fue la P2-37 (3 41 1 pglml). De las observaciones anteriores, se llega a la selección de las cepas la P2-32 y la P2-37 como cepas parentales.

Se obtuvieron las curvas de sobrevivencia de las cepas de P. chrysogenum P2-32 y P2-37, y se determinó que para garantizar una sobrevivencia de 50%, se deben irradiar las esporas de la cepa P2-37 por un tiempo de 2.5 min, mientras que la cepa P2-32 requiere un tiempo de 2.1 min a una intensidad de irradiación de luz UV de 250 pW/cm2, bajo l a s condiciones experimentales establecidas.

Los procesos de enriquecimiento por fltraciones sucesivas fueron eficientes para encontrar mutantes Met - y Met - ó Cis - con bajas dosis de mutágeno (50-60 % de sobrevivencia), logrando el aislamiento de l a s mutantes E-37 M1 (Met -), E-37 M 2 , E-37 M3, E-37 M4 (estas liltimas Met - ó Cis - ) originadas de la cepa parental P2- 37 con un porciento de mutantes de 0.74%.

Se logró obtener y aislar mutantes de P. chrysogenurn de la cepa P2-32 resistentes a 1 rnglrnl del compuesto 5 AFO con una frecuencia de 5 X lo-’. Y a partir de las mutantes resistentes se efectuó el aislamiento de una mutante auxótrofa a uridina la E-32. U a partir de la cepa parental P2-32 con un porciento de mutantes de 0.78 %, empleando la metodología propuesta por Diez y col., (1987).

Se llevaron a cabo dos evaluaciones en cuanto a la producción de penicilina de las cepas parentales P2-32 y P2-37, una al inicio de la experimentación y otra al final, así como una evaluación de la producción de penicilina de las mutantes auxótrofas E-32 U y E-37 M1, en cultivos llevados a cabo por FS y por FL. Los resultados sugieren un cierto grado de inestabilidad en las cepas parentales dada la diferencia en producción de penicilina de ambas cepas en la primera y segunda caracterización realizadas.

En base a la hipótesis planteada, se concluye que no fue posible introducir marcadores genéticos en P.chrysogenum y obtener mutantes auxótrofas sin modificar sensiblemente la producción en FS, no siendo así para FL en donde los niveles de producción no se encontraron modificados.

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