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CAMPUS PUERTO ESCONDIDO
ASIGNATURA:
Biología de procariotas
PROFESOR:
M. EN C. francisco Ruíz Ruiz
Trabajo:Análisis microbiológico del agua para consumo
humano
ALUMNOS:
CARLOS ALAN RODRIGUEZ SILVAIsai Alejandro Bohórquez Martínez
LICENCIATURA EN BIOLOGIA
SEGUNDO SEMESTRE GRUPO 208
BIOLOGIA DE PROCARIOTAS Página 1
PUERTO ESCONDIDO OAX., 24 DE JUNIO DE 2010
PRACTICA # 10ANALISIS MICROBIOLOGICO DEL AGUA PARA CONSUMO HUMANO
INTRODUCCIÓN:
La determinación de la calidad bacteriológica reviste gran importancia en el
ámbito de la salud pública ya que permite garantizar la inocuidad del agua destinada al
consumo evitando así epidemias gastrointestinales.
El agua destinada al consumo humano puede ser contaminada por las agua residuales o
por desechos humanos y animales que pueden contener microorganismos patógenos
(principalmente intestinales) como son los causantes de la tifoidea (Salmonella typhi), la
disentería (Shigella dysenterieae) o el cólera (Vibrio cholerae) entre otros.
El grupo de bacterias coliformes ha sido siempre el principal indicador de calidad de los
distintos tipos de agua; el número de coliformes en una muestra se usa como criterio de
contaminación y por lo tanto, de calidad sanitaria de la misma.
La sobrevivencia de los coliformes en el agua es mayor que la de cualquier bacteria que
sea enteropatógena y su identificación es fácil y confiable.
Por todo ello, el aspecto más importante del análisis bacteriológico del agua es la
determinación de coliformes que puede hacerse por el método del número más
probable (NMP) o por el método de filtración de membrana (FM).
Existen otros métodos microbianos que son “indicadores” de otros tipos de
contaminación:
Bacterias mesófilas aerobias que reflejan la exposición de la muestra a la contaminación
en general, la existencia de condiciones favorables para la multiplicación de
microorganismos y la presencia de materia orgánica.
La determinación de bacterias mesófilas aerobias también es rutinaria en el análisis
bacteriológico del agua.
Streptococcus de origen fecal, que son más abundantes que los coliformes en el tracto
intestinal y heces de los animales, pero sobreviven menos que los coliformes porque
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prácticamente no se multiplican en el agua, por ello su predominio en el agua indica
contaminación fecal proveniente de animales o contaminación relativamente reciente.
Generalmente este tipo de organismos encontrados en aguas residuales son ele
resultado de descargas biológicas hechas por seres humanos infectados por estos
agentes. Los organismos comunes excretados por el hombre ocasionan enfermedades
gastrointestinales como tifoideas, fiebre parasitofoidea, disentería, diarrea y cólera.
Debido a su alto poder infeccioso, estos organismos son los responsables de cientos de
muertes cada año en zonas donde las condiciones de sanidad ambiental no son
adecuadas.
Norma Oficial Mexicana (NOM-127-SSA1-1994) establece que el agua potable debe
contener los siguientes caracteres microbiológicos:
_ Hasta 100 bacterias aerobias por ml de agua a 22 ºC.
_ Ausencia total de bacterias coliformes en 100 ml de agua.
_ Ausencia de esporos de clostridios sulfitos reductores en 20 ml de agua.
_ Como límite máximo se permite un contenido total de 200 bacterias aerobias por ml
de agua a 37 °C (www.salud.gob.mx/unidades/.../nom/m127ssa14.html).
REALIZACIÓN DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Para la determinación taxonómica de microorganismos existen pruebas bioquímicas,
inmunológicas y moleculares entre otras. El examen y conocimiento de características
morfológicas, bioquímicas y fisiológicas combinadas todas, permiten no solo conocer
caracteres fenotípicos útiles para la identificación de los microorganismos, sino también
ponen en evidencia sus capacidades que ayudan a explicar propiedades ecológicas de
los microorganismos en estudio.
Existen diferentes guías para la interpretación rápida de algunas pruebas bioquímicas,
en el siguiente cuadro se exponen una variedad de pruebas bioquímicas y el resultado
esperado en el medio de cultivo:
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OBJETIVOS:
1.- Aplicar las técnicas de cuantificación más adecuadas para determinar la cantidad de
microorganismos en una muestra de agua.
2.-Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua tomadas de los dispensadores
ubicados en las instalaciones de la UMAR, mediante la búsqueda de microorganismos
coliformes totales y coliformes fecales.
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MATERIAL:
1 Autoclave2 Probeta graduada 100 mL3 Pipeta graduada 5 mL5 Matraz Erlenmeyer 250 mL3 Vaso de precipitados 250 mL1 Propipeta de llenado simple1 Piceta 250 mL1 balanza analítica1 Gradilla para tubo de ensaye1 Asa de cultivo de aro2 Mechero BunsenCinta Parafilm 5 Cajas Petri Desechables estériles5 Tubos de ensaye de 15*22mm1 Espátula con punta redondeada1 Espátula acanalada2 Varillas de vidrio
2 Jeringa de 10 mLTijeras*1 Jabón antibacterial*1 Franela*1 Papel higiénico*1 Algodón*1 Cerillos*1 Encendedor*1 Cinta Maskintape*1 Plumón indeleble punto fino y grueso*Cloro20 Gasas*1 Paquete de algodón*Papel estraza*Etiquetas*3 Frascos de jugo de vidrio, vacío y limpio*
*material que deberá de traer el alumno.
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METODOLOGÍA:
En cada sesión se deberán de seguir estos tres puntos principales, todo esto para tener
un espacio limpio y ordenado, y con ello evitar algún accidente o un mal resultado en las
pruebas a realizar.
1.- Limpiar perfectamente el área de trabajo.
2.- Pedir el material de trabajo al responsable del laboratorio, revisándolo
cuidadosamente (que se encuentre completo y que no se encuentre sucio o dañado).
3.- Colocar de manera ordenada el material a emplear, además, limpiarlo y secarlo a la
hora de entregarlo al encargado de laboratorio al término de la sesión.
PRIMERA SESION: PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y SU ESTERILIZACIÓN
DIA 27 DE MAYO DE 2010
En esta sesión se prepararon los medios de cultivo necesarios para la realización del
sembrado de bacterias, realizándolo en el siguiente orden.
ACTIVIDAD 1: PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
MEDIO DE CULTIVO: CALDO COMUN AGAR MAC-KONKEY SIN CRISTAL VIOLETA
1.- Se prepararon 70ml de medio de cultivo, para lo cual, previamente se realizaron los
cálculos convenientes para la preparación del volumen estipulado.
2.- Una ves pesadas las cantidades correspondientes del medio, se procedió a verterlo
en un matraz Erlenmeyer de 250 ml, disolviéndolo con la cantidad correspondiente de
agua destilada.
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Fórmula (en gramos por litro) InstruccionesBilis de buey 5.0 Suspender 35 g de polvo por litro de agua
destilada. Disolver y distribuir 10 ml por tubo con campanita de Durham. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
Peptona 20.0Lactosa 10.0
Púrpura de bromocresol 0.01
3.- Se coloca al fuego el matraz Erlenmeyer, manteniéndolo en movimiento, todo esto,
para obtener una mejor dilución de la mezcla.
4.- Posteriormente se prosigue a la repartición del medio a los tubos de ensaye de la
siguiente manera: 5 tubos de ensaye con diez mililitros de caldo Mac-konkey , mismos
que serán etiquetados de la forma siguiente: 1,2…4,5, (el tubo marcado con el numero
uno será ocupado como control de crecimiento).
5.-El sobrante de medio de guarda en un frasco de vidrio.
6.- Se le colocaran tapones de algodón graso envuelto en gasa.
(http://www.scharlau.com/administrador/ebook/57_ES/pdf/Aguas.pdf)
MEDIO DE CULTIVO: AGAR E.M.B.
1.-
Preparar 70ml de medio de cultivo, para lo cual, previamente se deben de realizar los
cálculos convenientes para la preparación del volumen estipulado.
2.- Una ves pesadas las cantidades correspondientes del medio, se procede a verterlo en
un matraz Erlenmeyer de 250 ml, disolviéndolo con la cantidad correspondiente de agua
destilada.
3.- Se coloca al fuego el matraz Erlenmeyer para obtener una mejor dilución de la
mezcla.
4.-Se le colocara un tapón de algodón graso envuelto en gasa.
(http://www.scharlau.com/administrador/ebook/57_ES/pdf/Aguas.pdf).
ACTIVIDAD 2: ETERILIZACIÓN
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Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Peptona 10.0 Suspender 36 g del polvo en un litro de agua
destilada. Reposar 5 minutos; mezclar, calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos hasta su disolución. Esterilizar en autoclave a no más de 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 45°C y distribuir agitando suavemente.
Lactosa 5.0 Sacarosa 5.0 Fosfato dipotásico 2.0 Agar 13.5 Eosina 0.4 Azul de metileno 0.065
1.- Una ves preparados los medios de cultivo, se procederá a esterilizarlos en la
autoclave.
2.- Se esterilizara el material y los medios de cultivo a 121°C durante 15 minutos.
3.- una ves esterilizado el medio, se retira de la autoclave y se realiza el vertido en cinco
cajas de petri.
ACTIVIDAD 3: REFRIGERACIÓN Y ENTREGA DE MATERIAL
1.- Una ves enfriado y solidificado los medios de cultivo, serán sellados y se procede a
guardarlos en el refrigerador para su posterior uso en las sesiones siguientes.
2.-Se lava el material sobrante y se realiza la entrega al encargado del laboratorio.
SEGUNDA SESIÓN: RECOLECCION DE MUESTRA, SEMBRADO DE BACTERIAS E
INCUBACIÓN. DIA 03 DE JUNIO DE 2010
En esta sesión, se recolecto muestras de agua del dispensador que se localiza en las
instalaciones de la Universidad del Mar a un costado de la sala de cómputo “c”, así como
también se prosiguió al sembrado en los medios de cultivo preparados en la sesión
anterior. La sesión de laboratorio se rigió en el siguiente orden.
ACTIVIDAD 1: TOMADO DE MUESTRAS
Previamente se realizo la compra de dos frascos estériles para el tomado de muestras,
las cuales se realizaron de la siguiente manera:
A) Preparación de los frascos
B) Toma de la muestra
1. Lavarse las manos y desinfectarlas con etanol al 70%
2. Se desinfecta el grifo de donde se tomara la muestra de agua con algodón y etanol.
3. Dejar correr el agua por 3 minutos, destapar el frasco y tomar la muestra
inmediatamente.
4. Generar zona aséptica cuando sea posible hacerlo.
ACTIVIDAD 2: SEMBRADO DE BACTERIAS
PRUEBA PRESUNTIVA
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Para la realización del sembrado en los tubos de ensaye, primero organizamos la mesa
de trabajo y generamos una zona aséptica con la utilización de mecheros bunsen.
En esta ocasión, el sembrado de bacterias se realizó en la campana de destilación, de la
siguiente manera:
1.-Se preparan los tubos para ser inoculados con la muestra de agua.
2.- posteriormente se distribuye en el medio de cultivo de tal forma que en cada tubo se
introduzca 1ml de la muestra de agua (cabe mencionar que el tubo marcado con el
numero uno no será inoculado con la muestra de agua, ya que servirá como control de
crecimiento).
ACTIVIDAD 3: INCUBACIÓN
1.- Una ves terminado de realizar el sembrado en los tubos, se tapan y se prosigue a
incubarlos para obtener crecimiento de microorganismos.
2.- Para la identificación de coliformes fecales se incubara a 44°C durante 24-48 horas.
3.- Se dejan en la incubadora hasta obtener crecimiento en los tubos, posteriormente
serán retirados y guardados en el refrigerador para su posterior uso.
TERCERA SESIÓN: OBSERVACIÓN DE RESULTADOS, RESEMBRADO DE BACTERIAS,
PREPARACIÓN DE MEDIOS PARA LA REALIZACIÓN DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS Y
ESTERILIZACIÓN. DÍA 10 DE JUNIO DE 2010
En esta sesión se realizó la observación macroscópica y microscópicamente de
microorganismos crecidos en los medios de cultivo, así como también se realizaron
tinciones Gram y se realizo el resembrado en placas con medio EMB, cabe destacar que
este medio, es un medio diferencial con lo cual podemos obtener microorganismos
característicos como coliformes, con lo cual podemos asegurarnos que los
microorganismos ahí crecidos serán coliformes únicamente.
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ACTIVIDAD 1: OBSERVACIÓN DE RESULTADOS
Se realizo la observación microscópica y macroscópica de los tubos de ensaye donde se
obtuvo crecimiento bacteriano (Para este caso, obtuvimos crecimiento en todos los
tubos sembrados).
Para lo cual se realizaron tinciones Gram, observándose lo siguiente:
ACTIVIDAD 2: RESEMBRADO EN PLACAS EMB
PRUEBA CONFIRMATIVA
1.-En los tubos donde se observan resultados positivos de la prueba presuntiva, se
introduce un asa de siembra estéril y se toma una porción que va a sembrarse en estría
en una placa Petri con medio EMB.
2.-Para este paso deberá apropiarse la zona de trabajo de tal manera de crear una zona
de seguridad y de asepsia.
3.-Se incuban las cajas de 24 - 48 horas a la temperatura correspondiente.
ACTIVIDAD 3: PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO PARA LA REALIZACIÓN DE
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
El examen y conocimiento de características morfológicas, bioquímicas y fisiológicas
combinadas todas, permiten no solo conocer caracteres fenotípicos útiles para la
identificación de los microorganismos, sino también ponen en evidencia sus capacidades
que ayudan a explicar propiedades ecológicas de los microorganismos en estudio.
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Muestra de agua teñida por el método de tinción Gram, dando como resultado negativo.
Por tal motivo es de vital importancia la realización de pruebas bioquímicas, ya que con
ello se llega a la identificación del microorganismo problema.
Para esta práctica las pruebas bioquímicas realizadas fueron las siguientes:
Fermentación de carbohidratos Prueba de la catalasa
Licuefacción de la gelatina Prueba de motilidad
Producción de H2S
ACTIVIDAD 4: ESTERILIZACIÓN
1.- Se esterilizó el material preparado para la realización de las pruebas bioquímicas;
cabe mencionar que, además de las pruebas bioquímicas, se preparo Agar nutritivo para
el resembrado de la cepa “X” misma que fue proporcionada por el profesor en el
laboratorio. Todo esto con la intención de poder obtener una cepa pura.
2.- Esperamos a que solidificara el medio para posteriormente ser guardados en el
refrigerador.
CUARTA SESIÓN: OBSERVACIÓN DE RESULTADOS, RESEMBRADO EN PRUEBAS
BIOQUÍMICAS Y ESTERILIZACIÓN EN SUCIO. DIA 17 DE JUNIO DE 2009
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Autoclave lista para usarse El material será guardado en el
refrigerador para su conservación
ACTIVIDAD 1: REALIZACIÓN DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS
1.- De todos y cada uno de los tubos y placas donde existió crecimiento, se analizara con
cada una de las pruebas bioquímicas previamente estipuladas, así como también se
realizaron tinciones, dando como resultado lo siguiente:
Estas imágenes fueron tomadas en el laboratorio de biología con el “microscopio de
contraste”, con la idea de obtener mejores resultados al observarlo, ya que dicho
microscopio tiene una buena resolución. Pero por algún motivo no se pudieron obtener
imágenes nítidas.
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FERMENTACION DE
CARBOHIDRATOS
PRUEBA DE LA
CATALASA
LICUEFACCIÓN DE GELATINA PRUEBA DE MOTILIDAD PRODUCCION DE H2S
Muestra de agua -------------
POSITIVO
Se observa la presencia inmediata de burbujas
------------- ------------- -------------
Muestra
de agua
Positivo
se observan colonias de color amarillo
------------- ------------- ------------- -------------
Muestra
de agua
------------- -------------
NEGATIVO
En nuestro medio de cultivo no obtuvimos
crecimiento
------------- -------------
Muestra
de agua ------------- ------------- -------------
Esta prueba no se llevo acabo debido a una mala reacción del medio de cultivo.
-------------
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Muestra
de agua
------------- ------------- ------------- -------------
NEGATIVA
no se obtuvo
crecimiento
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ACTIVIDAD 2: ESTERILIZACION EN SUCIO.
1.- Preparar el material para esterilizar. La esterilización se realizara en la autoclave a
una temperatura de 121°C durante 15 minutos.
2.- Retirar el material de la autoclave para su posterior lavado.
3.- Entrega de material limpio y seco al encargado de laboratorio.
4.- Lavar la autoclave.
ACTIVIDAD 3: LAVADO Y ENTREGA DE MATERIAL
1.-Una vez terminado los procesos de identificación bacteriana, se prosigue a el lavado
del material y su posterior entrega al encargado del laboratorio.
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CONCLUSION:
La identificación de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes
combinaciones de características y diferentes criterios en la evaluación de similitudes.
Los ensayos bioquímicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioquímicas
convencionales, generalmente determinan la actividad de una vía metabólica (conjunto
de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo
y que la bacteria al crecer transforma o no.
Existen diferentes sistemas que facilitan la realización de tales ensayos, porque
proponen el mejor conjunto de pruebas bioquímicas para la identificación de un grupo
bacteriano, porque simplifican la interpretación de un resultado utilizando un valor
numérico, porque proveen los reactivos listos para su uso o porque son totalmente
automatizables.
Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado para
demostrar en forma clara una determinada característica bioquímica como presencia o
ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o determinada vía
metabólica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de
inhibidores, etc.
BIBLIOGRAFIA
http://www.scribd.com/doc/7262714/Analisis-Microbiologico-de-Muestras
http://www.condalab.com/industrias/aguas.html
http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/maconkeycaldo.htm
http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/embagar.htm
http://www.scharlau.com/administrador/ebook/57_ES/pdf/Aguas.pdf
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