DOCTORADO EN CIENCIAS NATURALES PARA EL DESARROLLO ENFASIS EN MANEJO DE...
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DOCTORADO EN CIENCIAS NATURALES PARA EL DESARROLLO ENFASIS EN MANEJO DE RECURSOS NATURALES
INSTITUTO TECNOLOGICO DE COSTA RICA
ESTUDIO COMPARATIVO DE LA ACTIVIDAD ANTIFUNGICA DE UN EXTRACTO DE PROPOLEO MEXICANO Y DE TRES PLANTAS QUE Apis mellifera USA PARA SU PRODUCCION
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTORA EN CIENCIAS NATURALES PARA EL DESARROLLO
PRESENTA
AMPARO LONDOÑO OROZCO
TUTORES DR. JOSE GUILLERMO PENIERES CARRILLO
DR. TONATIUH ALEJANDRO CRUZ SANCHEZ DR. CARLOS GERARDO GARCIA TOVAR
Cuautitlán Izcalli, Estado de México 2010
Este trabajo fue apoyado por el Proyecto IN211008 del Programa de Apoyo a Proyectos de
Investigación e Innovación Tecnológica, de la Universidad Nacional Autónoma de México,
Evaluación de la actividad antimicótica de compuestos sintéticos y naturales sobre la
estructura de las células micóticas y la Cátedra de Investigación GVC11.
Por ti y para ti... Gracias Señor,
porque separada de ti nada puedo hacer
Papa y mamá†: Ustedes sembraron la semilla, esto les pertenece. Los amo! Tona, Saraí, Etni Alejandra: Gracias por el amor, el apoyo y la paciencia. Sola no hubiera podido. A mi familia: La distancia no es obstáculo. A mis amigos y mi iglesia Siempre están presentes.
AGRADECIMIENTOS
Al Instituto Tecnológico de Costa Rica y a la Universidad Nacional Autónoma de
México, por permitirme formar parte de éste Programa que crea y fortalece
vínculos en pro del desarrollo de la región mesoamericana.
Al Dr. Tomás de Jesús Guzmán Hernández, por su asesoría, apoyo y paciencia
como Coordinador del Programa de Doctorado.
A los Doctores José Guillermo Penieres Carrillo, Tonatiuh Alejandro Cruz Sánchez
y Carlos Gerardo García Tovar, por su valiosa dirección para el desarrollo de este
trabajo.
A los Doctores José Guillermo Ávila Acevedo, María Margarita Canales Martínez y
Claudia Tzasna Hernández Delgado, por su asesoría y apoyo durante la
realización de mi Pasantía en la Unidad de Biotecnología y Prototipos de la FES
Iztacala, UNAM.
A la Dra. Lourdes Juárez Mosqueda y al Dr. Jorge Hernández Hernández del
Departamento de Morfología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia
de la UNAM, por la asesoría y el apoyo para la obtención e interpretación de las
micrografías electrónicas, así como a las Maestras en Ciencias Adriana Méndez B.
y Ana Luisa Ramírez N. de la Unidad de Microscopía Electrónica, por el apoyo
técnico para la realización de las mismas.
A mis compañeros del doctorado y de mi trabajo que compartieron conmigo esta
experiencia.
CONTENIDO
Página
1. INTRODUCCIÓN
1
1.1. Antecedentes del uso de productos naturales
1
1.2. Propóleo
2
1.3. Micosis
4
1.4. Hongos fitopatógenos
6
1.5. Micotoxicosis
7
1.6. Estructura fúngica
8
1.6.1. Levaduras
8
1.6.2. Hongos filamentosos
9
1.6.2.1. La hifa
9
1.6.2.2. Membrana celular
11
1.6.2.3. Pared celular
11
1.7. Antifúngicos
12
1.7.1. Mecanismo de acción de los antifúngicos
14
2. PERSPECTIVA TEÓRICA
17
3. JUSTIFICACIÓN
20
4. OBJETIVOS
21
4.1. OBJETIVO GENERAL
21
4.2. OBJETIVOS PARTICULARES
21
5. HIPÓTESIS
22
6. METODOLOGÍA
23
6.1. Diseño experimental 23
6.2. Obtención de compuestos de origen natural
24
6.2.1. Extractos de propóleo
24
6.2.2. Extractos herbales
24
6.3. Evaluación de la actividad antifúngica
28
6.3.1. Microorganismos utilizados
28
6.3.2. Pruebas de sensibilidad cualitativas
28
6.3.2.1. Hongos Levaduriformes: Método de difusión en agar
28
6.3.2.2. Hongos Filamentosos: Método de inhibición del crecimiento radial
29
6.3.3. Pruebas de sensibilidad cuantitativas
29
6.3.3.1. Hongos Levaduriformes
30
1. Determinación de la concentración inhibitoria
mínima (CIM): Método de dilución en placa
30
2. Método de microdilución para levaduras
30
3. Determinación de la concentración fungicida mínima
31
6.3.3.2. Hongos Filamentosos
32
1. Determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM): Método de dilución en placas de 24 pozos
32
6.4. Cinéticas de crecimiento
32
6.5. Observación de cambios estructurales
33
6.5.1. Microscopía de fluorescencia
33
6.5.2. Microscopía electrónica
33
6.6. Determinación comparativa de la composición química del propóleo y extractos activos
34
6.6.1 Cromatografía líquida de alta resolución
34
6.6.2. Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas
34
6.7. Análisis estadístico
35
7. RESULTADOS
36
7.1. Actividad antifúngica
36
7.2. Cinéticas de crecimiento
52
7.3. Cambios estructurales
56
7.3.1. Microscopía óptica
56
7.3.2. Microscopia electrónica de transmisión (MET)
63
7.3.2.1. Micrografías electrónicas de Candida
albicans ATCC 10231 sin tratamiento
65
7.3.2.2. Micrografías electrónicas de Candida
albicans ATCC 10231 incubadas 24 hrs con extracto etanólico de propóleo
67
7.3.2.3. Micrografías electrónicas de C. albicans ATCC 10231 incubadas 24 hrs con extracto metanólico de flores de Callistemon citrinus.
70
7.3.2.4. Micrografías electrónicas de Cryptococcus neoformans sin tratamiento
73
7.3.2.5. Micrografías electrónicas de Cryptococcus neoformans incubadas 24 hrs con extracto
etanólico de propóleo.
75
7.3.2.6. Micrografías electrónicas de Cryptococcus
neoformans incubadas 24 hrs con extracto metanólico de flores de Callistemon citrinus
78
7.4. Composición química
80
7.4.1. Cromatografía líquida de alta resolución
80
7.4.2. Cromatografía de gases acoplada a espectrometría 81
de masas (GC-MS) 8. DISCUSION
86
9. RECOMENDACIONES
94
10. CONCLUSIONES
95
11. ANEXOS 98
ANEXO I Identificación de especies vegetales
98
ANEXO II Espectros de cromatografía de gases acoplada a
espectrometría de masas
100
ANEXO III
Protocolo de microscopia electrónica de transmisión para levaduras
108
ANEXO IV Pasantía
109
12. BIBLIOGRAFÍA PUBLICACIONES 112
13. PUBLICACIONES 118
INDICE DE TABLAS
Página
Tabla 1
Clasificación de los antifúngicos por su estructura química y mecanismo de acción
15
Tabla 2 Rendimiento de los extractos 37
Tabla 3 Actividad antifúngica de los extractos de las especies vegetales y del propóleo sobre hongos levaduriformes
40
Tabla 4 Lectura visual de la prueba de microdilución de Candida albicans frente a extractos de propóleo y C. citrinus a las 48hrs de incubación
43
Tabla 5 Lectura visual de la prueba de microdilución de Cryptococcus neoformans frente a extractos de propóleo y C. citrinus a las 48hrs de incubación
44
Tabla 6 Lectura espectrofotométrica a 490 nm de la prueba de microdilución después de 48 hrs de incubación
45
Tabla 7 CMI y CFM obtenidas para los extractos etanólico de propóleo y metanólico de C. citrinus, con cepas de Candida albicans y Cryptococcus neoformans
46
Tabla 8 Prueba de inhibición del crecimiento radial de los extractos de las especies vegetales y del propóleo sobre hongos filamentosos
47
Tabla 9 Determinación de la CIM de diferentes extractos frente a Rhizoctonia solani
49
Tabla 10 CIM del extracto metanólico de R. communis frente Fusarium moniliforme
50
Tabla 11 Determinación de la CIM de diferentes extractos frente a Trichophyton mentagrophytes
50
Tabla 12 Número total de hongos inhibidos por cada extracto 51
Tabla 13 Constituyentes de las fracciones del propóleo determinados por Cromatografía Líquida de Alta Resolución
80
Tabla 14 Compuestos volátiles identificados a partir de los espectros de masas del EEP y el extracto metanólico de flores de C. citrinus
85
INDICE DE FIGURAS
Página
Fig. 1 Esquema de una levadura en proceso de gemación
9
Fig. 2 Esquema de una hifa 10
Fig. 3 Esquema de la pared celular de una levadura 13
Fig. 4 Representación esquemática de los sitios de acción de diversos grupos de antifúngicos sobre la célula micótica
14
Fig. 5 Flora estudiada de las instalaciones de la FES
Cuautitlán, UNAM
25
Fig. 6 Imágenes del Apiario de la FES Cuautitlán 26
Fig. 7 Obtención de extractos 27
Fig. 8 Prueba de difusión en agar para levaduras 39
Fig. 9 Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima para levaduras
39
Fig. 10 Prueba de microdilución para levaduras 42
Fig. 11 Prueba de inhibición del crecimiento radial de hongos filamentosos
48
Fig. 12 Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima para hongos filamentosos
48
Fig. 13
Cinética de crecimiento de C. albicans con y sin
extracto etanólico de propóleo 52
Fig. 14
Cinética de crecimiento de C. neoformans con y
sin extracto etanólico de propóleo 53
Fig. 15
Cinética de crecimiento de C. albicans con y sin
extracto metanólico de flores de C. citrinus
54
Fig. 16
Cinética de crecimiento de C. neoformans con y
sin extracto metanólico de flores de C. citrinus
55
Fig. 17
Formación de tubo germinativo por C. albicans
ATCC 10231
57
Fig. 18
Tinción de C. albicans ATCC 10231 con Blanco
de Calcoflúor
58
Fig. 19
Tinción de levaduras de C. neoformans con
Blanco de Calcoflúor
59
Fig. 20
Efecto del extracto etanólico de Propóleo y del extracto metanólico de C. citrinus sobre el diámetro de C. albicans ATCC 10231
60
Fig. 21
Efecto del extracto etanólico de Propóleo y del extracto metanólico de C. citrinus sobre la
longitud del tubo germinativo de C. albicans
ATCC 10231.
61
Fig. 22 Efecto del extracto etanólico de Propóleo y del extracto metanólico de C. citrinus sobre el diámetro de C. neoformans.
61
Fig. 23 Efecto del extracto etanólico de Propóleo y del extracto metanólico de C. citrinus sobre el
diámetro de C. albicans y de C. neoformans
62
Fig. 24 a 26 Micrografías electrónicas de Candida albicans
ATCC 10231 sin tratamiento
65
Fig. 27 a 32 Micrografías electrónicas de Candida albicans
ATCC 10231 incubadas 24 hrs con extracto etanólico de propóleo
67
Fig. 33 a 38 Micrografías electrónicas de C. albicans ATCC
10231 incubadas 24 hrs con extracto metanólico de flores de Callistemon citrinus
70
Fig. 39 a 42 Micrografías electrónicas de Cryptococcus neoformans sin tratamiento
73
Fig. 43 a 48 Micrografías electrónicas de Cryptococcus neoformans incubadas 24 hrs con extracto
etanólico de propóleo
75
Fig. 49 a 51 Micrografías electrónicas de Cryptococcus
neoformans incubadas 24 hrs con extracto 78
metanólico de flores de Callistemon citrinus
Fig. 52 Identificación del eucaliptol a partir de su espectro de masas
101
Fig. 53
Identificación del metil éster del ácido 3-acetoxi-3-hidroxipropiónico a partir de su espectro de masas
102
Fig. 54
Identificación del p-ment-1-en-8-ol a partir de su
espectro de masas
103
Fig. 55
Identificación del ethanone, 1-[4-[4-(dimethylamino) benzylienamino)phenyl]- a partir
de su espectro de masas
104
Fig. 56 Identificación del metil éster del ácido
hexadecanoico a partir de su espectro de masas
105
Fig. 57
Identificación del ácido hexadecanoico a partir de su espectro de masas
106
Fig. 58 Identificación del metil éster del ácido 7,10,13-hexadecatrienoico a partir de su espectro de
masas
107
GLOSARIO DE ABREVIATURAS
AcOEt
Acetato de etilo
ATCC American Type Culture Collection
CFM Concentración Fungicida Mínima
CIM Concentración Inhibitoria Mínima
CLSI
Clinical and Laboratory Standard Institute
DMSO Dimetilsulfóxido
EEP Extracto Etanólico de Propóleo
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
FES Facultad de Estudios Superiores
GC-MS Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas
h hora
MET Microscopia Electrónica de Transmisión
L microlitros
µg miligramos
mL mililitros
mm milímetros
MOPS
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid
NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standard
nm nanómetros
ºC Grados Celsius
UFC Unidades Formadoras de Colonias
UUnn eelleemmeennttoo ddee llaa nnaattuurraalleezzaa ssee ccoonnvviieerrttee eenn rreeccuurrssoo nnaattuurraall bbaajjoo ttrreess
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RESUMEN El uso de productos naturales actualmente es una alternativa válida para enfrentar
el proceso salud-enfermedad, siendo los productos apícolas y los extractos
herbales algunos de los más usados.
El objetivo del presente trabajo fue evaluar la actividad antifúngica del propóleo de
la abeja Apis mellifera, que es la especie con mayor distribución a nivel mundial, y
de los extractos de algunas de las plantas que son visitadas por dichas abejas
para recolectar resinas, néctar o polen, sobre levaduras y hongos filamentosos de
importancia mèdica
Con este fin se obtuvieron once extractos, dos de ellos provenientes de propóleo
de la abeja Apis mellifera, recolectado en el apiario de la Facultad de Estudios
Superiores Cuautitlán, UNAM, y nueve de flores de tres de las plantas visitadas
por las abejas dentro de la misma Facultad. Estas fueron Ricinus communis L,
Eucalyptus camaldulensis Dehnhartdt y Callistemon citrinus Stapf.
Se emplearon ocho cepas de hongos de importancia en medicina humana y/o
veterinaria o como fitopatógenos. Estos incluyeron dos hongos levaduriformes,
Candida albicans (ATCC 10231) y Cryptococcus neoformans y seis hongos
filamentosos, Aspergillus niger, A. flavus (ATCC 204304), Fusarium moniliforme,
Fusarium sporotrichum (ATCC NRLL3299), Rhizoctonia solani y Trichophyton
mentagrophytes.
Las pruebas de sensibilidad fueron previamente estandarizadas y se desarrollaron
en primera instancia pruebas cualitativas de difusión en agar, para tener un
panorama general de la sensibilidad de los hongos a cada uno de los extractos.
Con los extractos que presentaron actividad frente a uno o más hongos, se
realizaron pruebas cuantitativas, empleando los métodos de dilución en agar y de
microdilución, determinando así su concentración inhibitoria mínima (CIM) y su
concentración fungicida mínima (CFM).
Cuatro de las seis cepas probadas resultaron sensibles al extracto de propóleo.
Entre los extractos florales, los de C. citrinus fueron los que presentaron mayor
similitud con el propóleo. Llama la atención el hecho de que los extractos
preparados a partir de flores de E. camaldulensis no presentaron actividad frente
a ninguno de los hongos probados.
Al determinar la concentración inhibitoria mínima y la concentración fungicida
mínima de los extractos se encontró que estas oscilan entre los 0.25 y 2.0 mg/mL
para todos los extractos frente a las dos levaduras evaluadas, mientras que en los
hongos filamentosos los valores van desde 0.25 hasta más de 3.0 mg/mL.
Se realizaron pruebas comparativas de la composición química del propóleo con
el extracto metanólico de flores de C. citrinus, empleando técnicas de
cromatografía líquida de alta resolución y de cromatografía de gases acoplada a
espectrometría de masas, encontrando ocho compuestos comunes a ambos
extractos, los cuales fueron: eucaliptol, metil éster del ácido 3-acetoxi-3-
hidroxipropiónico, p-ment-1-en-8-ol, etil éster del ácido dodecanoico, ethanone,
(1-[4-[4-(dimetilamino) benzilienamino)fenil]-), metil éster del ácido hexadecanoico,
ácido hexadecanoico, metil éster del ácido 7,10,13-hexadecatrienoico.
De la misma manera, se observaron las alteraciones morfológicas ocasionadas
por dichos extractos a las células fúngicas mediante ensayos de microscopía
óptica y electrónica, encontrando cambios en la morfología de C. albicans y de C.
neoformans, con degeneración estructural después de la exposición a los
extractos.
Los datos obtenidos confirman la relación existente entre la composición del
propóleo y la de las plantas que visitan las abejas para recolectar algunos
ingredientes para su preparación y se plantea la posibilidad de emplear dichas
productos como fuentes de principios activos para el tratamiento de las micosis.
IInnttrroodduucccciióónn
DOCINADE Amparo Londoño Orozco Estudio comparativo de la actividad antifúngica de un extracto de propóleo mexicano y de tres plantas que Apis mellifera usa para su producción
1
1. INTRODUCCIÓN
1.1 Antecedentes del uso de productos naturales
La medicina tradicional ocupa un lugar importante en la realidad médica mundial.
Aproximadamente el 60% de la población recurre al uso de las plantas
medicinales. En 1976, la Organización Mundial de la Salud (OMS) incorporó la
medicina tradicional en sus programas de Salud. En 1991, en China, la OMS
declaró el 22 de octubre el "Día Mundial de la Medicina Tradicional", señalando
que la salud del género humano aún necesita la medicina tradicional, por lo que
recomienda a los estados miembros establecer medidas para su rescate,
fortalecimiento, promoción, investigación, regulación, aplicación y seguridad en su
práctica.
Del vocablo griego pharmakon, remedio y gnosis, conocimiento, la Farmacognosia
es una ciencia multidisciplinaria cuyo objetivo fundamental es el estudio de los
productos naturales con propiedades medicinales.
Las plantas medicinales son recursos naturales que aportan productos herbales
valiosos, los cuales son usados desde la antigüedad para tratar varios
padecimientos (Chandrasekaran y Venkatesalu, 2004) y algunas de éstas todavía
se incluyen como parte del tratamiento habitual de varias enfermedades, entre
ellas las provocadas por hongos (Ríos y Recio, 2005).
Desde la antigüedad hasta nuestros días los agricultores han utilizado los
productos naturales para el control de enfermedades y sus agentes patógenos. Se
han realizado preparaciones artesanales tales como: extractos acuosos de la
cebolla, del tabaco y piretro, entre otros. Además, en la actualidad existe un auge
a nivel mundial en el uso de fitosanitarios naturales debido a la gran
contaminación ambiental que existe por los residuos persistentes y tóxicos que
dejan los productos sintéticos y ya muchos de ellos han provocado el desarrollo
de resistencia de las plagas (Martín, 2003, Mareggiani, 1999).
DOCINADE Amparo Londoño Orozco Estudio comparativo de la actividad antifúngica de un extracto de propóleo mexicano y de tres plantas que Apis mellifera usa para su producción
2
Muchos compuestos naturales son capaces de inhibir el crecimiento de
microorganismos y actualmente se considera una realidad que el uso de
compuestos naturales puede tener un gran impacto en la protección de alimentos
y en el control de enfermedades humanas y vegetales (García, 2006), aunque la
mayoría de las veces existe un gran desconocimiento sobre cómo emplearlas, sus
principios tóxicos y su dosificación para lograr efectos terapéuticos (Martínez,
2003).
1.2. Propóleo
El término Propóleo, etimológicamente se deriva del griego Pro- “delante de” y
Polis “ciudad”, haciendo referencia a que se encuentra en la entrada y en el
interior de la colmena o “polis” de las abejas (Serrano, 2000). El propóleo es un
material multifuncional colectado por las abejas a partir de yemas y pecíolos de
las hojas y de sustancias activamente secretadas o exudadas por heridas de
diferentes vegetales. Lo elaboran mezclándolas en la colmena con ceras, sus
secreciones salivares y otras sustancias en proporciones variables y es usado en
la construcción y mantenimiento de sus colmenas (Badascarrasbure et al., 2006).
Es una sustancia resinosa, balsámica, gomosa, de consistencia viscosa y color
verde pardo, castaño o incluso negro, sabor acre, frecuentemente amargo y olor
agradable y dulce. Su color y composición dependen en gran medida de su origen
botánico y del tipo de abeja que lo produzca. Las muestras de propóleo presentan
diferencias químicas significativas de acuerdo a su procedencia, razón por la cual,
se ha convertido en un tema de interés para químicos y biólogos y ha resultado
recientemente ser una fuente de nuevos compuestos biológicamente activos
(Bankova et al., 2002).
Múltiples reportes indican que el propóleo es relativamente no tóxico y tiene
diversos efectos sobre bacterias, hongos, parásitos y virus, así como propiedades
antitumorales, antioxidantes, como cicatrizante y regenerador de tejidos, entre
otros. La composición química del propóleo es muy compleja y depende de varios
factores, entre ellos el tipo de vegetales de donde recolectan las abejas algunos
DOCINADE Amparo Londoño Orozco Estudio comparativo de la actividad antifúngica de un extracto de propóleo mexicano y de tres plantas que Apis mellifera usa para su producción
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ingredientes para su preparación (Bankova et al., 2002); se han aislado más de
180 compuestos, siendo sus principales componentes resinas y bálsamos que
contienen flavonoides y ácidos fenólicos o sus ésteres (50-55%), reportándose
éstos como las principales sustancias farmacológicamente activas; contenidos
muy variables de ceras (7.5-35%) que afectarán a los correspondientes
componentes restantes; aceites volátiles (10%); polen (5%) e impurezas (4.4-
19.5%). Además contienen pequeñas cantidades de terpenos, taninos, restos de
la secreción de las glándulas salivares de las abejas y posibles contaminantes y
se ha mencionado que se requiere la combinación de diferentes compuestos para
que sea biológicamente activo (Bedascarrasbure et al., 2006, González, 2007).
Los compuestos activos son:
Flavonoides, que incluyen:
Flavonas: ramnocitrina, kaempferol, crisina, galangina (3,5,7-
trihidroxiflavona), isalpinina, tectocrisina, acacetina, apigenina,
pectolinarigenina; 5,7-dioxi-3,4-dimetoxiflavona; 3,5-dioxi-7,4-
dimetoxiflavona y 5-oxi-7,4-dimetoxiflavona.
Flavonoles: kaempferido, quercetina, butelenol, ramnacina,
isoramnetina y ermanina.
Flavononas: pinocembrina, pinostrobina, sakuranetina, 5-oxi-7,4-
dimetoxiflavonona.
Terpeno del grupo del cariofileno: beta-bisabolol y alfa-acetoxibetulenol.
Aldehídos aromáticos: vanillina, isovanillina.
Ácidos aromáticos no saturados: ácido cinámico y derivados, ácido
cumárico, ácido caféico, ácido ferúlico (4-oxi-3-metoxicinámico) y ácido
isoferúlico).
Ácidos orgánicos: ácido benzoico y derivados (ácido 4-hidroxibenzoico,
ácido 4-metoxibenzoico, ácido protocatéquico y ácido gálico).
Sustancias tánicas.
Cumarinas: ácido cumarínico, esculetolo, scopoletolo.
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Vitaminas: vitamina B1 (tiamina), vitamina PP (ácido nicotínico),
provitamina A.
Microelementos: iones calcio, potasio, sodio, magnesio, hierro, aluminio,
fósforo, silicio, vanadio, estroncio. Algunos científicos han señalado
además boro, cromo, cobalto, manganeso, níquel, selenio, zinc, molibdeno,
plata y bario.
El propóleo de la especie Apis mellifera, especie de abeja con mayor distribución
en el mundo, ha sido reconocido en países como Cuba, Brasil y Argentina, por las
propiedades biológicas que posee. Su estudio científico inició en la década de los
40’s y se ha ido intensificando en la medida en que ha podido descifrarse su
compleja composición y se han descubierto nuevos aspectos de su actividad
biológica que permiten su uso en diversas áreas como la medicina, la biología y la
industria, ya que exhibe un amplio espectro de acciones terapéuticas, destacando
la actividad antibiótica, antiviral y antiinflamatoria (Bedascarrasbure et al., 2006,
González, 2007).
Los estudios de la actividad antifúngica del propóleo han sido limitados, y en
principio fueron enfocados casi exclusivamente al género Candida, considerando
que los sesquiterpenos, especialmente el bisabolol y flavononas (pinocembrina),
son los principales compuestos responsables de esta actividad (González et al.,
2007). En los últimos años su estudio se ha ampliado a otras especies de hongos
tanto levaduriformes como filamentosos.
1.3. Micosis
La micología es una rama de microbiología que tiene por objeto estudiar a los
hongos y las enfermedades que producen, las cuales se agrupan en tres campos
de estudio: intoxicaciones, alergias y micosis (López, 2008).
Las micosis son enfermedades causadas por la invasión de los tejidos por parte
de algunos hongos. La mayoría de hongos poseen escaso poder patógeno, por lo
que todas las micosis, en principio son oportunistas y es el estado inmunológico
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del paciente lo que determina la gravedad de la infección (López, et al., 2004 y
2009). El establecimiento de una micosis implica la capacidad del microorganismo
de crecer en las condiciones de pH, temperatura y potencial redox presentes en
los tejidos del hospedero, las cuales generalmente son poco favorables para el
crecimiento y desarrollo de los hongos. Los agentes infectantes deben poseer, por
lo tanto, ciertas características que les permitan sobrevivir en tal ambiente así
como mecanismos para evadir las defensas del hospedero (Casadevall, 1998). La
virulencia de un microorganismo depende tanto de sus características como de
factores propios del hospedero (Casadevall y Pirofski, 2001), por lo que el
establecimiento de una enfermedad infecciosa depende del estrecho equilibrio
entre ambos.
Las micosis se clasifican de acuerdo a su topografía en cuatro grupos:
superficiales, subcutáneas, sistémicas y las causadas por hongos de bajo poder
patógeno (oportunistas), estas últimas pueden ser localizadas o bien invadir
diferentes órganos y sistemas dependiendo del daño inmunológico que presente
el hospedero (López, 2008). En patología veterinaria tienen importancia las
enfermedades micóticas debido al carácter zoonótico de la mayoría de estos
procesos, a las pérdidas que provocan en animales de producción y a que pueden
afectar a especies protegidas (Pérez, 2000).
En las dos últimas décadas la frecuencia de las infecciones fúngicas ha
aumentado de manera preocupante, representando actualmente del 6-10% de las
infecciones nosocomiales, de las cuales el 80% es debido a infección por Candida
spp., seguida por la aspergilosis invasiva causada principalmente por el
Aspergillus fumigatus, considerada por algunos el mayor problema fúngico actual
(Arathoon, 2001). Entre los posibles factores implicados en los cambios
epidemiológicos de las micosis están: el aumento en el número de órganos
trasplantados, el uso de antibióticos de amplio espectro, la quimioterapia agresiva,
los tratamientos inmunosupresores para enfermedades autoinmunes,
procedimientos invasivos como el uso de catéteres intravenosos o en las vías
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urinarias, la intubación transtraqueal, los trasplantes de órganos y desde la
década de los 80s la aparición del SIDA (Escobar., 2004). Especies de Candida
sp. y Fusarium sp., tienen la capacidad de causar micosis en pacientes
inmunodeprimidos (Amantea et al.,1995). Algunas de las especies reportadas
como responsables de infecciones micóticas oportunistas en la corteza vegetal
son Fusarium solani, F. oxisporum, F. moniliforme, F. roseum (Matos et al., 1999).
Asimismo, las dermatofitosis son infecciones fúngicas de la piel, uñas y pelo
causadas por diferentes tipos de hongos filamentosos denominados dermatofitos
que se agrupan en tres géneros: Trichophyton, Epidermophyton y Microsporum.
Desde el punto de vista epidemiológico y preventivo, los dermatofitos también
pueden agruparse en tres categorías, según sus preferencias por el hospedero y
su hábitat natural: especies antropofílicas, zoofílicas y geofílicas (Begoña, 2001).
El género Trichophyton representa uno de los principales hongos causantes de
dermatomicosis en humanos, infectando de manera característica los tejidos
queratinizados. Estas infecciones son difíciles de erradicar, particularmente en los
habitantes de los países del tercer mundo, debido a la pobreza y condiciones de
sanidad de la población (Kuiate et al., 2006).
1.4. Hongos fitopatógenos
En lo referente a la importancia agrícola, en suelos cultivados aireados, los
hongos constituyen gran parte de la masa microbiana total. La patogenicidad por
hongos es una característica que se origina en el suelo, ya que algunas especies
que normalmente son saprobias pueden invadir tejido vivo y comportarse como
agentes patógenos. Pueden ser parásitos facultativos o verdaderos y permanecer
inactivos en el suelo por períodos largos si no encuentra la planta hospedera, o
bien desaparecer por completo (Moreno, 1988; Mitchell, 1992; Edwards, 1995;
Rao, 1995). Sólo una pequeña parte de los hongos del suelo causan
enfermedades en vegetales y los que las provocan con frecuencia pertenecen a
los géneros Armillaria, Fusarium, Helminthosporium, Ophiobolus, Phytophtora,
Plasmodiophora, Rhizoctonia, Sclerotium, Verticillium, Thielaviopsis, Phytium y
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Aspergillus. Otros son cosmopolitas y saprobios como Mucor y Penicillium, entre
otros (Sánchez, 2004).
Algunos hongos han afectado cultivos comerciales, entre los que se encuentra
Rhizoctonia solani, que es un hongo fitopatógeno muy común en el suelo y con
una gran diversidad de plantas hospederas, siendo un agente causal de
enfermedades en las raíces (Coll y Tandrón, 2005). Además, provoca
descomposición de los frutos y enfermedades del follaje, haciendo necesario el
uso de biocidas para su control, lo cual induce la resistencia en los patógenos y
promueve el uso excesivo de estos productos. Debido a lo anterior, se ocasiona
contaminación del ambiente, particularmente en el suelo y el agua, generando
gastos adicionales en la producción (Georgiev, 1988).
1.5. Micotoxicosis
Por otra parte, las micotoxinas, metabolitos tóxicos producidos por ciertas
especies de hongos fitopatógenos, han ocasionado enfermedades en animales y
humanos por el consumo de forrajes y alimentos invadidos por hongos. Cuando
son ingeridas en forma gradual y constante en pequeñas dosis, algunas de éstas
producen enfermedades graves e incluso la muerte (Agrios, 1996), otras pueden
ser neurotóxicas, hepatotóxicas, nefrotóxicas y carcinogénicas (Albright, 2001).
Los hongos que producen micotoxinas se encuentran en todo el mundo y los
alimentos pueden contaminarse cuando éstos se desarrollan en el campo, durante
la cosecha, en el almacenamiento o durante el procesamiento. Las cosechas
contaminadas frecuentemente incluyen: maíz, sorgo, cebada, trigo, centeno, arroz
y semilla de algodón. Determinadas condiciones ambientales de temperatura y
humedad favorecen el desarrollo de los hongos y por consiguiente la generación
de micotoxinas. Esto ocurre principalmente en granos, pastas de oleaginosas y en
alimentos terminados, siendo en algunos casos inevitable en la industria pecuaria
latinoamericana el tener que utilizar granos contaminados, sobre todo en el caso
de importaciones, por ser prácticamente imposible su devolución (Aguilar, 2006).
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Los alimentos son deteriorados por hongos cuando sufren cambios inaceptables
en su apariencia, textura, olor y sabor o cuando están contaminados con niveles
potencialmente peligrosos de una o más micotoxinas. Alimentos para animales
con niveles típicamente bajos de micotoxinas son habitualmente consumidos
especialmente por el ganado productor de leche y están asociados con pérdidas
subclínicas de la producción, aumento de enfermedades y desarrollo reproductivo
reducido. En algunos casos, las concentraciones de micotoxinas en alimentos son
suficientemente altas para ser asociadas con diversos problemas, incluyendo la
muerte (Aguilar, 2006).
1.6. Estructura fúngica
De acuerdo al tipo de crecimiento, los hongos pueden presentarse como
levaduras unicelulares, las cuales pueden reproducirse por gemación, o bien
como hongos filamentosos, los cuales corresponden a hongos “pluricelulares” u
organismos multinucleados.
Algunas levaduras, bajo determinadas condiciones ambientales, pueden sufrir
cambios morfogenéticos y comenzar a crecer como un hongo filamentoso. Este
fenómeno es conocido como dimorfismo.
1.6.1. Levaduras
Las levaduras no son un grupo taxonómico natural, esto quiere decir que reúne a
especies de hongos no emparentadas (Ascomycotas y Basidiomycotas), aunque
muestran varias características básicas en su organización celular (Fig. 1).
Los principales organelos citoplasmáticos son semejantes a los de cualquier célula
eucarionte. El citoplasma puede contener cuerpos lipídicos, glicógeno, e
inclusiones cristalinas, algunas de las cuales son esteroles (principalmente
ergosterol). Además, contiene una compleja red de microtúbulos, probablemente
relacionada con el movimiento de vesículas membranosas que participan en la
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síntesis de pared celular. La levadura se reproduce por gemación y al madurar, la
célula hija se separa de la célula madre mediante la formación de un septo. El
proceso deja una cicatriz de gemación tanto en la célula madre como en la hija
(Hermosilla, 2000, Deacon, 1988).
1.6.2. Hongos filamentosos
1.6.2.1. La Hifa
Es un filamento de pared rígida en el que fluye el protoplasma (Fig. 2). Su longitud
es variable, pero su diámetro es relativamente constante, variando de 1 a 30 μm.
El extremo terminal de la hifa se llama ápice o zona de extensión y corresponde a
la región de crecimiento más activo de la pared.
Figura 1. Esquema de una levadura en proceso de gemación. P, pared celular; Vac, vacuola; CG, cicatriz de una gemación; M, mitocondria; CL, cuerpo lipídico; AG, aparato de Golgi; RE, retículo endoplasmático; V, vesícula; CHP, corpúsculo
huso-polar; N, núcleo (Hermosilla, 2000).
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Figura 2: Esquema de una hifa (sección apical): AG, Aparato de Golgi; ER, retículo endoplasmático; L, cuerpo lipídico; M, mitocondria; MI, microcuerpos; N, núcleos; R, ribosomas; V, vesícula citoplasmática; VA, vacuola; W, pared celular
(Hermosilla, 2000).
La hifa no siempre es un filamento continuo. En hongos superiores, ésta posee
paredes transversales, espaciadas regularmente, denominadas septos. Los septos
son visibles fácilmente en el microscopio óptico y representan un rasgo
taxonómico valioso para la identificación de los distintos grupos fúngicos. Estos
septos por lo general tienen poros que permiten el paso del citoplasma e incluso
de los núcleos entre diferentes partes de la hifa. Por lo tanto, hablando
estrictamente, las hifas no constan de células sino más bien de compartimentos.
La membrana plasmática por lo general está muy próxima a la pared celular y
firmemente adherida a ésta. Los septos se encuentran en todos los hongos
filamentosos, excepto en los Zigomycotas. En este grupo los hongos son
aseptados o bien presentan septos muy irregularmente a lo largo de la hifa y por
ello son considerados hongos cenocíticos.
La longitud del compartimento apical de una hifa varía de acuerdo a la especie. En
su extremo prácticamente no hay organelos, pero se encuentran acumuladas
muchas vesículas membranosas. La disposición de estas vesículas difiere entre
los distintos grupos de hongos. En hongos septados la agrupación apical de
vesículas se observa como un cuerpo densamente teñido al microscopio óptico,
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llamado Spitzenkörper. Las hifas normalmente son ramificadas. Estas
ramificaciones pueden originarse casi en cualquier punto a lo largo de la hifa,
excepto en la región apical. Las ramificaciones primarias pueden formar ramas
secundarias y así sucesivamente, hasta constituir el micelio del hongo. A medida
que divergen unas de otras, las ramas le dan a la colonia fúngica su perfil circular
característico. La mayoría de las hifas son hialinas (incoloras), aunque algunas,
especialmente las de los hongos dematiáceos, pueden ser obscuras. Sin
embargo, muchos hongos presentan colonias con colores característicos debido a
la aparición de esporas reproductivas con pigmentación (Hermosilla, 2000,
Deacon, 1988).
1.6.2.2. Membrana celular
La membrana celular desempeña una importante función en la división celular y en
el metabolismo. Las complejas partículas lipídicas llamadas esterolatos,
representan aproximadamente el 25 % de sus componentes. Sin embargo, el
contenido de esterol en las células fúngica y mamífera es diferente. En los
mamíferos el colesterol es el esterol que predomina, mientras que en las células
fúngicas el esterol primario es el ergosterol y entre sus funciones están: dar fluidez
e integridad a la membrana, permitir la función apropiada de muchas enzimas
unidas a ella y, al favorecer la función de la quitina sintetasa, permitir el
crecimiento y la división celular. Esta característica ha sido explotada y se ha
convertido en el blanco de acción de la mayoría de los fármacos antifúngicos
(Tapia, 2005).
1.6.2.3. Pared celular
La pared celular de los hongos cumple varias funciones importantes. Una de ellas
es determinar la morfología celular. La forma en que se desarrolla el hongo, sea
filamentoso o levadura, junto con las distintas estructuras diferenciadas que se
puedan producir, es un resultado directo de los componentes de la pared celular y
la forma en que éstos se organizan durante el crecimiento. Además, la pared
celular es la interfase entre el hongo y su medio, protegiendo la célula de la lisis
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osmótica y probablemente de los metabolitos de otros organismos. También sirve
como sitio de unión para algunas enzimas y presenta componentes que le
permiten al hongo adherirse a distintos sustratos del hospedero. El análisis
químico de la pared celular revela un predominio de polisacáridos, pero también
grandes cantidades de proteínas y lípidos. Los polisacáridos difieren tanto
cuantitativa como cualitativamente en los distintos grupos de hongos, por lo que
constituye otro rasgo de valor taxonómico.
La composición de la pared celular en hongos es dinámica, variando de acuerdo a
las condiciones externas o de acuerdo a las distintas fases del ciclo de vida
(Hermosilla, 2000, Deacon, 1988). La pared de todos los hongos contiene una
mezcla de compuestos fibrilares y componentes amorfos. Los principales
componentes fibrilares incluyen la quitina y la celulosa. La quitina es un polímero
lineal de N-acetilglucosamina, con enlaces β (1-4), que forman microfibrillas
cristalinas debido a las cadenas lineales y con capacidad para compactarse. Otros
componentes importantes son los glucanos (polímeros de glucosa), proteínas,
polímeros de galactosamina y polímeros de manosas (mananos). La quitina,
aunque no es el componente más abundante en la pared celular de los hongos (1-
2%), se encuentra con la suficiente frecuencia como para ser considerada el
componente característico (Fig. 3) (Hermosilla, 2000, Deacon, 1988). La pared
celular es otro sitio de acción importante para los compuestos con actividad
antifúngica (Tapia, 2005).
1.7. Antifúngicos
El concepto de agente antifúngico o antimicótico engloba cualquier sustancia
capaz de producir una alteración tal de las estructuras de una célula fúngica que
consiga inhibir su desarrollo, alterando su viabilidad o capacidad de supervivencia,
bien directa o indirectamente, lo que facilita el funcionamiento de los sistemas de
defensa del hospedero (Gregorí, 2005).
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Figura 3: Esquema de la pared celular de una levadura. CW: pared celular;
EM, medio extracelular; PM membrana plasmática; gp, glico(mano)proteínas; β-g, β-glucanos; β-g+c, β-glucanos y quitina; ps, espacio periplásmico (Hermosilla, 2000).
El interés en el tratamiento de las infecciones por hongos se ha incrementado
notablemente y en las últimas décadas se han desarrollado diversos, aunque no
numerosos, nuevos fármacos dotados con actividad antifúngica y mayor
tolerancia, que contribuyen a mejorar el pronóstico de las micosis, particularmente
las oportunistas (Torres, 2004).
Las primeras sustancias utilizadas en el tratamiento de las infecciones fúngicas
fueron compuestos tales como el yoduro de potasio, metaloides y derivados
azufrados. Posteriormente se introdujeron los primeros antifúngicos, denominados
de primera generación, por ser derivados de productos naturales o productos de
la actividad metabólica de determinados microorganismos. Más tarde se
desarrollaron los de segunda generación, obtenidos predominantemente por
síntesis química (Escobar, 2004).
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Los primeros antimicóticos fueron descubiertos hace aproximadamente 50 años y
desde entonces ha habido grandes avances en la terapia antifúngica. Sin
embargo, las patologías han variado durante este período, haciendo necesaria la
permanente investigación de nuevos agentes. La mayoría de las micosis
superficiales responden bien a los tratamientos actuales, pero el creciente
espectro de micosis sistémicas diseminadas ha forzado el desarrollo de nuevas
moléculas (Gregorí, 2005).
La clasificación de los antifúngicos se realiza según criterios convencionales que
atienden a los siguientes aspectos: estructura o características (polienos, azoles,
alilaminas, etc), origen (sustancias producidas por organismos vivos o derivados
de síntesis química), espectro de acción (amplio o restringido), mecanismos de
acción (fungistáticos y fungicidas), vía de administración o empleo sobre el
hospedero (oral o parenteral, tópicos o sistémicos), toxicidad y selectividad de
acción (Vargas, 2005).
1.7.1. Mecanismo de acción de los antifúngicos
La figura 4 resume las estructuras de la célula micótica sobre las cuales actúan
los diversos grupos de antifúngicos.
Figura 4: Representación esquemática de los sitios de acción de diversos grupos
de antifúngicos sobre la célula micótica (Modificado de Tapia, 2005).
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Tabla 1. Clasificación de los antifúngicos por su estructura química y mecanismo de acción
Sitio de acción Grupo de
antifúngicos Ejemplos Mecanismo de acción
Antifúngicos interactuando en membrana celular
Polienos
Nistatina, nistatina liposomal, natamicina,
anfotericina B
Se unen de manera irreversible a los componentes de la membrana
plasmática e interactúa con el
ergosterol, pero sin inhibir su síntesis. Al unirse al ergosterol, se forman poros
que alteran la permeabilidad de la membrana lo que permite una pérdida
de proteínas, glúcidos y cationes monovalentes y divalentes, causando la
muerte celular (Gregorí, 2005; Tapia, 2005).
Azoles
Imidazoles:
miconazol, clotrimazol,
ketoconazol, econazol, bifonazol
Triazoles: fluconazol,
itraconazol
Triazoles de segunda generación:
voriconazol, ravuconazol,
posaconazol
Inhiben la biosíntesis de ergosterol en el
paso de desmetilación del lanosterol, en el carbono 14; por lo tanto, su blanco es
la lanosterol-14-alfa-desmetilasa, que es una de las especies del citocromo P-450
(P-450-3-A), localizada en el retículo
endoplasmático. La disminución del ergosterol más la acumulación de
esteroles metilados causa una alteración de la membrana celular, la que se vuelve
más permeable y vulnerable a daños. Así, se altera el transporte de nutrientes
y la síntesis de quitina, lo que puede inhibir el crecimiento (Gregorí, 2005;
Tapia, 2005).
Algunos de los azoles son menos selectivos y suelen actuar sobre
enzimas hepáticas causando hepatitis fulminantes, ya que el mecanismo
descrito compromete funciones que dependen de la membrana, en la que
puede haber otras enzimas. (Tapia, 2005).
Alilaminas
Terbinafina, naftifina
De forma similar a los azoles inhiben la síntesis del ergosterol, pero en un paso
temprano de su síntesis. Las alilaminas inhiben a la enzima escualeno
epoxidasa, de esta forma disminuye la concentración de ergosterol, aumentan
los niveles de escualeno, aumenta la
permeabilidad de la membrana celular, se interrumpe la organización celular y
disminuye el crecimiento del hongo (Gregorí, 2005).
Tanto la escualeno epoxidasa como la
lanosterol-14-alfa-desmetilasa, inhibida por los azoles, son enzimas codificadas
por una familia de genes que pueden
mutar y generar una resistencia secundaria a los antimicóticos (Tapia,
2005).
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Sitio de acción Grupo de
antifúngicos Ejemplos Mecanismo de acción
Antifúngicos interactuando en pared celular
Lipopéptidos
Papulacandinas
Triterpenos glicosilados
Equinocandinas: caspofungina, anidulofungina,
micafungina
Son antifúngicos que actúan sobre la
pared celular, y lo hacen inhibiendo la
síntesis de glucanos a través de la inactivación de la enzima 1,3-beta-
glucano sintetasa. La falta de glucanos en la pared
celular la vuelve débil e incapaz de soportar el estrés osmótico, por lo
que muere (Gregorí, 2005). Ya que
los glucanos no se encuentran en la célula eucarionte humana, estos
compuestos son relativamente selectivos (Tapia, 2005).
Antifúngicos interactuando en núcleo celular
Pirimidinas fluoradas
(Antimetabolitos)
Flucitosina o
5-fluorocitosina
Puede entrar en el citoplasma de la
célula fúngica gracias a la enzima citosina permeasa, que no está
presente en las células de mamíferos, por eso es específica. Al entrar en la
célula, esta molécula sufre
modificaciones y es convertida en 5-fluorouracilo (5-FU) por la citosina
diaminasa. El 5-FU es fosforilado e incorporado dentro del ARN en lugar
del uracilo y así origina una fluorouridina aberrante y por lo tanto
un ARN mutante. De esta manera se ve inhibida la enzima timidilato
sintetasa, que permite el paso de
uridina a timidina, porque el ADN está constituido por timidina y no por
uracilo, afectando entonces no sólo la síntesis de proteínas, sino también la
síntesis de ADN (Gregorí, 2005; Tapia, 2005)
Agentes misceláneos
Yoduro de potasio,
ciclopirox, tolnaftato, griseofulvina
En esta clase se encuentra la griseofulvina, cuyo mecanismo de
acción consiste en inhibir la mitosis de los hongos con la producción de
células multinucleadas. Interactúa con los microtúbulos polimerizados e
interrumpe el huso mitótico necesario para efectuar la división celular. Tiene
el inconveniente de que se debe administrar por períodos muy
prolongados, de seis meses a un año.
Además, como es poco selectiva, hay que controlar su uso con hemograma.
Por estos motivos, hoy está en desuso (Tapia, 2005).
PPeerrssppeeccttiivvaa
tteeóórriiccaa
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2. PERSPECTIVA TEÓRICA
Durante los últimos 30 años se han intensificado los estudios farmacológicos y
químicos del propóleo, demostrando que los extractos de diversas regiones
geográficas tienen diferente actividad biológica (Bankova, 2002, Kosalec, 2005), lo
cual se ha atribuido a diferencias en su composición química, y además influyen
diversos factores como son la época de recolección, el tipo de vegetación, la
especie de abeja, la temporada de recolección, el método de preparación de la
tintura y el disolvente usado para su extracción (Bankova, 2002, Kosalec, 2005,
Kujumgiev et al., 1999, Sforcin et al., 2000). Además, se sabe que se requiere la
combinación de diferentes compuestos para que sea biológicamente activo
(Bankova et al., 1995, Kujumgiev et al., 1999, Sforcin et al., 2000).
Por otra parte, las plantas medicinales se han usado desde la antigüedad para el
tratamiento de diversos padecimientos (Chandrasekaran y Venkatesalu, 2004;
Ríos y Recio, 2005). La OMS estima que entre el 60 y el 80 % de los habitantes de
nuestro planeta confían en las medicinas tradicionales para sus principales
necesidades, razón por la cual ha hecho un llamado a todos los países que la
conforman a promover su uso y establecer programas de investigación en este
campo.
Este proyecto contempló tres etapas: Primero, la evaluación antifúngica del
propóleo y extractos herbales contra cepas de hongos patógenos, segundo,
evaluar el efecto de los extractos sobre las estructuras micóticas y tercero
establecer la composición química de los extractos y determinar cuál o cuáles de
ellos se encuentran en más de un extracto.
Se evaluó la actividad antifúngica de extractos del propóleo y de las flores de tres
plantas, Callistemon citrinus Stapf, Eucalyptus camaldulensis Dehnhartdt y Ricinus
communis L, que son visitadas por las abejas para la elaboración del propóleo en
el Estado de México, y se comparó con la del propóleo producido por las abejas
en la misma zona.
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En cuanto a las plantas empleadas, se encuentra que el C. citrinus se reporta la
mayoría de las veces con uso ornamental y existen pocos reportes de su actividad
antibacteriana (Cock, 2008, Meléndez et al 2008). En diversas ocasiones se ha
demostrado la actividad antibacteriana del E. camaldulensis (Martos et al, 2000) y
en cuanto a R. communis, tradicionalmente se ha empleado su resina, con la
debida consideración de su alta toxicidad, pero además se ha demostrado que
posee diversas actividades biológicas como bactericida, insecticida y vermífuga,
entre muchas otras (Duke and Wain, 1981).
Actividad antifúngica
La actividad antifúngica de las plantas ha sido muy estudiada y su importancia
resulta mayor ante la gran problemática de las enfermedades causadas por
hongos que son muy difíciles de tratar por factores como inmunodeficiencias de
distintas etiologías o resistencia a los antifúngicos por muchos hongos patógenos
(Amantea et al.,1995).
El propóleo muestra, en distintos grados, efectos fungicidas frente a numerosas
especies como Candida albicans, Aspergillus niger, Botrytis cinerea, Ascosphaera
apis y Plasmopara vitícola (Krell, 1996). La mayor inhibición sobre hongos
patógenos se observa en Trichophyton mentagrophytes, Candida albicans y
Malassezia pachydermatis (Heinze, et al., 1998) y, en el género Candida, el efecto
del propóleo depende de las especies, siendo de mayor a menor en C. albicans,
C. tropicalis, C. krusei y C. guilliermondii. (Ota et al., 2001).
En un estudio se observó que la actividad antifúngica de los extractos etanólicos
de propóleo actúan de manera similar a la griseofulvina frente a dos variedades de
Aspergillus flavus, pues ambas sustancias reducen la masa miceliar seca, la
germinación de conidios, el crecimiento y la producción de aflatoxina B1, tanto
más cuanto mayor sea su concentración (Ghaly, 1998).
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Otros reportes indican que en mucosa oral frente a Candida albicans, el extracto
etanólico de propóleo al 20% se muestra tan efectivo como la nistatina y supera a
otros antifúngicos como clotrimazol, econazol y fluconazol que presentan
resistencias (Martins, 2002).
Desde 1988 se reportó la actividad del extracto etanólico de propóleo contra 23
cepas de levaduras aisladas de diferentes partes del cuerpo humano, encontrando
que fue fungistático a una concentración de 0,55 mg/mL (Rojas, 1988). Otros
autores reportaron que la mínima concentración fungicida del extracto etanólico de
propóleo contra 15 cepas probadas fue de 3 a 7 mg/mL siendo, C. albicans más
susceptible que otras especies como C. tropicalis, C. krusei, y C. guilliermondii
(Martins, 2002).
En un estudio previo realizado en nuestro laboratorio (Quintero, 2008), se evaluó
la actividad antifúngica de ocho extractos etanólicos de propóleo provenientes de
diferentes regiones de México frente a 36 cepas de C. albicans de origen clínico y
una de referencia (ATCC 10231) y se demostró que todos presentaron actividad
biológica contra C. albicans, aunque con variaciones en los valores de CIM, pero
dentro de los rangos reportados en otras partes del mundo, los cuales oscilan
entre 0,2 y 12 mg/ml (Palamin, 1999, Ota, 2001, Hegazi, 2001, Sawaya, 2002).
No se encontraron referencias para poder establecer una comparación con otros
estudios sobre la actividad antimicótica del propóleo mexicano fabricado por A.
mellifera con la mostrada por los extractos florales de las especies vegetales
visitadas por ellas.
En general, los estudios que relacionan compuestos florales con productos
apícolas tienen que ver con el uso del polen de Apis meliffera por los humanos,
como fuente de alimento, como adyuvante en el tratamiento de diversas
enfermedades o como suplemento nutricional.
JJuussttiiffiiccaacciióónn
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3. JUSTIFICACIÓN Este proyecto responde a la necesidad de contar con nuevos compuestos que
presenten actividad contra hongos, ya que:
Ha habido un notable incremento en la incidencia de micosis,
especialmente en las últimas décadas.
Pocos laboratorios realizan pruebas de sensibilidad a antifúngicos
Existen pocos principios activos contra hongos y la mayoría de los que
existen presentan alta toxicidad.
Muchas cepas de hongos desarrollan resistencia a los compuestos
antifúngicos.
Una buena parte de la población recurre a la medicina tradicional y el uso
de estos productos está ampliamente documentado, sin embargo, pocas
son las especies que se han estudiado científicamente.
OObbjjeettiivvooss
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4. OBJETIVOS 4.1. OBJETIVO GENERAL:
1. Evaluar la actividad antifúngica del propóleo de la abeja Apis mellifera y de
los extractos de plantas visitadas por las abejas, sobre levaduras y hongos
filamentosos.
4.2. OBJETIVOS PARTICULARES:
1. Obtener propóleo del apiario de la Facultad de Estudios Superiores
Cuautitlán, UNAM.
2. Evaluar la actividad biológica del propóleo frente a hongos filamentosos y
levaduriformes, empleando pruebas cualitativas y cuantitativas.
3. Determinar cuáles son las especies de plantas que son visitadas por las
abejas para recolectar resinas, néctar o polen y recolectar muestras de sus
flores.
4. Obtener los extractos de las plantas y determinar si presentan actividad
antifúngica frente a los hongos inhibidos por el propóleo.
5. Determinar mediante cromatografía líquida de alta resolución (CLAR/HPLC,
High performance liquid chromatography,) y cromatografía de gases
acoplada a espectrometría de masas, si el propóleo contiene el (los)
mismo(s) compuesto(s) activo(s) que las especies de plantas evaluadas.
6. Determinar si hay cambios estructurales en las células fúngicas, tras la
exposición al compuesto, mediante ensayos de microscopía óptica y
electrónica.
HHiippóótteessiiss
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5. HIPÓTESIS
Se ha determinado que el propóleo presenta metabolitos secundarios que poseen
actividad antimicrobiana; entonces, es muy probable que el propóleo colectado del
apiario de la FES Cuautitlán, al igual que los extractos de las especies vegetales
que visitan las abejas de esta región, presenten actividad sobre especies de
hongos filamentosos y levaduriformes.
MMeettooddoollooggííaa
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23
CCUURRVVAASS DDEE CCRREECCIIMMIIEENNTTOO
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6. METODOLOGÍA
6.1. Diseño experimental
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6.2. Obtención de compuestos de origen natural
Las muestras de las especies de plantas que son visitadas por las abejas y de
propóleo empleadas en el presente estudio fueron recolectadas en las
instalaciones de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán (Km 2.5 Carretera
Cuautitlán Teoloyucan, San Sebastián Xhala, Cuautitlán Izcalli, Estado de México,
CP 54700, Campus 4, Universidad Nacional Autónoma de México) (Fig. 5).
6.2.1. Extractos de propóleo
Se obtuvo propóleo de la abeja Apis mellifera, procedente del apiario de la FES
Cuautitlán (Fig. 6). La muestra de propóleo se pesó, maceró y cubrió con etanol al
96%. Se dejó en reposo y protegido de la luz durante dos semanas.
Posteriormente fue filtrado y se realizó una partición con hexanos. Se calculó el
rendimiento para cada extracto obtenido. Ambos extractos fueron almacenados en
lugar fresco y seco, protegidos de la luz (Fig. 7).
6.2.2. Extractos herbales
Colecta del material
Se colectaron flores dentro de la Facultad de tres plantas que son visitadas por las
abejas para la elaboración del propóleo y otros productos apícolas, comúnmente
conocidas como Cepillo, Eucalipto e Higuerilla. A la vez se colectaron ejemplares
para herbario, las cuales fueron prensadas y secadas para realizar la
identificación taxonómica de cada espécimen.
La identificación del material botánico fue realizada en el herbario de la FES
Iztacala y un ejemplar de cada una de ellas fue integrado a su colección
etnobotánica.
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Ricinus communis L
Higuerilla
Callistemon citrinus Stapf
Cepillo
EEuuccaallyyppttuuss ccaammaalldduulleennssiiss
DDeehhnnhhaarrttddtt
EEuuccaalliippttoo
E. camaldulensis Dehnhartdt
Eucalipto
Obtención de los extractos herbales
Las flores colectadas se dejaron secar completamente y posteriormente fueron
pesadas, molidas y almacenadas en un lugar seco.
Para obtener los extractos al material seco y triturado se le agregaron disolventes
en orden creciente de polaridad (hexano, acetato de etilo, metanol). Los extractos
se filtraron y concentraron a sequedad por destilación a presión reducida. Se
eliminaron los restos de disolventes por aireación (Fig. 7), se calculó el
rendimiento para cada extracto obtenido y se almacenaron en lugar fresco y seco.
Fig. 5. Flora estudiada de las instalaciones de la FES Cuautitlán, UNAM: Se muestran algunos de los ejemplares herbales de donde se obtuvo el material botánico para la preparación de los extractos.
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26
A
B
C
Fig. 6. Imágenes del Apiario de la FES Cuautitlán, UNAM. A: Colmenas. B y C: Personal recolectando productos de las colmenas.
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27
A
B C
D E F
Fig. 7. Obtención de extractos. A: Material floral y propóleo con diferentes disolventes. B y C: Partición para la obtención de fracciones etanólica y hexánica del propóleo. D: Concentración a sequedad por destilación a presión reducida. E: Extractos florales. F: Extracto blando de propóleo.
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6.3. Evaluación de la actividad antifúngica 6.3.1. Microorganismos utilizados:
Los microorganismos utilizados para la evaluación antimicótica fueron los
siguientes:
Levaduras: Candida albicans (ATCC 10231)1 y Cryptococcus neoformans1.
Filamentosos: Aspergillus niger2, A. flavus (ATCC 204304)1, Fusarium
moniliforme2, Fusarium sporotrichum (ATCC NRLL3299) 2, Rhizoctonia solani2 y
Trichophyton mentagrohytes2
6.3.2. Pruebas de sensibilidad cualitativas
6.3.2.1. Hongos Levaduriformes Método de difusión en agar:
Se sembraron las levaduras en Caldo Dextrosa Sabouraud (CDS, DIBICO) e
incubaron a 35ºC durante 24-48 horas. Se ajustó la densidad del inóculo de
acuerdo al tubo 0.5 del nefelómetro de McFarland (aprox. 1-5 x 106 UFC/mL),
(Vanden Berghe and Vlietinck, 1997, NCCLS/CLSI M44-A, Pfaller, 2004).
Medio de prueba: Agar Mueller-Hinton suplementado con 2% de glucosa y 0.5
µg/mL de azul de metileno.
Preparación de los discos:
Se emplearon discos de papel Whatman Nº 5, de 5 mm de diámetro. Se
impregnaron con 10 l de una solución de 2 mg/ 10 L de compuesto y se dejaron
secar a temperatura ambiente.
1 FES-Cuautitlán, 2 Laboratorio de Fitoquímica, UBIPRO, FES-Iztacala.
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Realización de la prueba:
A partir del inóculo con una concentración de 1x106 levaduras/ mL., se realizó un
sembrado masivo sobre las placas de SDA. Se incubaron por 24 horas y se midió
el diámetro de los halos de inhibición. Se reincubaron las placas y se midió
nuevamente el diámetro de los halos a las 48 horas de incubación.
Nota: Como testigos positivos se emplearon discos impregnados con 0.7 µg/mL
de un antifúngico conocido (Ketoconazol, SIGMA) y como testigos negativos se
emplearon discos impregnados con cada disolvente utilizado.
6.3.2.2. Hongos Filamentosos Método de inhibición del crecimiento radial:
Método modificado de Wang y Bun, 2002: Se sembraron los hongos en placas de
Agar de Dextrosa y Papa (ADP, DIBICO) y se incubaron a 28ºC durante 7 días o
hasta que el desarrollo se apreció en toda la superficie del agar.
Se colocó en el centro de una placa Petri (100 x 15) con 20 mL de ADP un
inóculo de 5 mm de diámetro del hongo a probar. Posteriormente se colocaron
alrededor del inóculo, a una distancia de 30 mm del límite micelial, los discos
impregnados con los extractos a una concentración de 2 mg/ disco. Se incubaron
las placas a 28º C durante 72 a 96 horas, hasta que la superficie del agar estuvo
cubierta por el micelio. Se observó la formación de zonas de inhibición con
formas de medias lunas (Wang, 2002, Terán, 2006, Ávila, 2005).
6.3.3. Pruebas de sensibilidad cuantitativas Fueron realizadas a aquellos hongos que mostraron sensibilidad con las pruebas
cualitativas.
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6.3.3.1. Hongos Levaduriformes: Determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM):
Método de dilución en placa: (Modificado de Koneman et al. 2003)
Se prepararon placas Petri (60 x 15) con 6 mL de Agar Dextrosa Sabouraud
(SDA, DIBICO), adicionadas con diferentes concentraciones del extracto: 3.0, 2.5,
2.0, 1.5, 1.0, 0.75, 0.50, 0.25, 0.125 mg/mL, partiendo de una solución patrón.
Se inoculó por punteo con la suspensión de la levadura (1-5 x 106 UFC/mL), tres
veces en una placa del medio, por cada concentración de cada compuesto y se
incubó a 35ºC durante 24 a 48 horas. Se empleó como control de crecimiento un
cultivo en un medio sin compuesto. Se determinó la Concentración Inhibitoria
Mínima (CIM) para cada levadura.
Método de microdilución para levaduras (Documento NCCLS/CLSI M27-A2)
Se realizó para corroborar los resultados obtenidos mediante una prueba
estandarizada de reconocimiento internacional.
Preparación del inóculo: Se sembraron las levaduras en SDA y se realizó un pase
para estar seguros de que el cultivo era puro y viable.
Medio de prueba: El medio de cultivo empleado es el RPMI 1640 (con glutamina,
sin bicarbonato y con rojo de fenol como indicador de pH), adicionado con buffer
MOPS [3-(N-morfolino) acido propanesulfonico] a una concentración de 0.165
mol/L con un pH 7.0 +/- 0.1 a 25ºC.
Para preparar el inóculo se tomaron alrededor de 5 colonias de aproximadamente
1mm de diámetro de 24 hrs de desarrollo a 35ºC para Candida albicans, o 48 hrs
para Cryptococcus neoformans. Se suspendieron las colonias en solución salina
fisiológica (NaCl 0.85%), se mezclaron en el vórtex por 15 segundos y se ajustó la
suspensión con un espectrofotómetro, hasta tener la absorbancia correspondiente
al tubo 0.5 del nefelómetro de McFarland (a 625 nm la absorbancia debe de ser de
0.08 – 0.10), logrando una suspensión de 1– 5 x 106 células/mL. Posteriormente
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se realizó una dilución 1:50, seguida por otra dilución 1:20, ambas con el medio
RPMI 1640, obteniéndose una suspensión de 1 - 5 x 103 unidades formadoras de
colonias por mililitro (UFC/mL).
Empleando placas de microdilución de 96 pozos, con fondo redondo, se añadieron
100 µL de cada dilución a los pozos rotulados con las 10 concentraciones a
probar. Se añadieron también 100 µL del inóculo a los 10 pozos y al pozo control
de crecimiento (control positivo). A éste último se adicionaron 100 µL de medio
RPMI 1640 y al pozo control de esterilidad (control negativo) se añadieron 200 µL
del mismo medio. Las placas se incubaron a 35ºC por 48 hrs. para C. albicans y
por 72 hrs. para C. neoformans.
Adicionalmente se realizó la prueba para ketoconazol como antifúngico con
actividad conocida.
Lectura de los resultados:
A las 24 horas de incubación se realizó la primera lectura visual, empleando un
espejo invertido (micro titulador). Se registraron los resultados y se reincubaron las
placas en las mismas condiciones iniciales. A las 48 horas de incubación, se
realizó la segunda lectura visual, comparando los resultados con la lectura de 24
hrs. Se agitaron los pozos utilizando palillos estériles y se observaron el pozo
control positivo (sin antifúngico) y el pozo control negativo (sin inóculo); después
de verificar que los resultados eran adecuados se procedió a la lectura
espectrofotométrica de la prueba, empleando un lector de ELISA (BIO RAD Model
680 Microplate Reader), a una longitud de onda de 490nm.
Determinación de la concentración fungicida mínima (CFM)
Después del período de incubación, se tomaron 10µL del último pozo que dio
positivo (crecimiento mínimo) y de tres siguientes de inhibición completa y se
cultivaron en SDA. Se incubaron a 35ºC de 3 a 4 días (Espinel, 2002).
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6.3.3.2. Hongos Filamentosos: Determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM):
Método de dilución en placas de 24 pozos: (Modificado de Ye et al, 1999)
Se preparó una solución patrón, igual que para levaduras y a partir de ella se
hicieron diluciones del compuesto: 3.0, 2.5, 2.0, 1.5, 1.0, 0.50, 0.25 mg/mL. Se
emplearon placas de 24 pozos, adicionando a cada pozo 1 mL de medio con cada
una de las diferentes concentraciones de los extractos. Se consideraron tres
pozos para cada dilución.
Se inoculó el centro de cada pozo con un fragmento del cultivo del hongo de 1
mm. de diámetro. Se empleó como control negativo el medio sin extracto. Se
incubaron las placas a 28º C durante 24 a 72 horas y se midió el área de
crecimiento micelial, para determinar la CIM.
En base a los resultados obtenidos con las pruebas de sensibilidad antifúngica, se
seleccionaron el extracto etanólico de propóleo y el extracto metanólico de flores
de C. citrinus metanol, para realizar las pruebas adicionales.
6.4. Cinéticas de crecimiento (Cantón y Pemán, 1999)
Se realizaron curvas de crecimiento para C. albicans (ATCC 10231) y C.
neoformans con el fin de observar la dinámica de la acción antifúngica del extracto
etanólico de propóleo y del extracto metanólico de flores de C. citrinus. Para cada
curva se inocularon 4 tubos con 10 mL de CDS, los cuales contenían diferentes
concentraciones de los extractos, equivalentes a media CIM, CIM, CFM y un tubo
testigo sin extracto.
De cada tubo se realizaron dos diluciones: para la primera dilución se tomaron 50
µL y se adicionaron a tubos con 4.95 mL de una solución de cloruro de sodio al
0.85% (SSF). Después de homogenizar por agitación, se realizó a partir de ésta la
segunda dilución tomando nuevamente 50 µL y adicionándolos a tubos con 4.95
mL de SSF, homogeneizándolos por agitación.
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Ambas diluciones fueron inoculadas en placas de SDA, depositando 100 µL sobre
la superficie del agar y dispersándolos con una varilla de vidrio, considerando éste
inóculo como el tiempo 0. Las placas fueron incubadas a 35º C y se tomaron
muestras periódicas hasta las 48 horas de incubación, siendo inoculadas en
placas de SDA, igual que en el tiempo 0. Después del período de incubación se
contaron las colonias y se hizo el cálculo de las UFC/mL, en base a la dilución
correspondiente.
6.5. Observación de cambios estructurales
Se prepararon inóculos en CDS a partir de cultivos frescos de C. albicans (ATCC
10231) y C. neoformans, empleando tres tubos para cada cepa, el primero de los
cuales se mantuvo como control sin tratamiento, al segundo se le adicionó la
concentración equivalente a la CFM del EEP para cada levadura y al tercero la
CFM del extracto metanólico de flores de C. citrinus para cada levedura. Todos
los tubos se incubaron a 35ºC durante 24 horas.
6.5.1. Microscopía de fluorescencia Se realizaron observaciones de Candida albicans (ATCC 10231) y de
Cryptococcus neoformans tratadas con los extractos y sin recibir tratamiento,
empleando un microscopio de luz con epifluorescencia, (Carl Zeiss, Axioscop 40)
teniendo acoplada una Cámara Evolution VF Cooled Color Media Cybernetics. Las
imágenes fueron analizadas usando un Software Q Capture Pro 6.0, considerando
10 observaciones por cada tipo celular.
6.5.2. Microscopía electrónica
También se obtuvieron micrografías electrónicas de transmisión de secciones
ultrafinas de ambas levaduras en un microscopio electrónico de transmisión (Carl
Zeiss, modelo 900).
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Las células de levadura fueron prefijadas en una mezcla de paraformaldehído,
glutaraldehído, MgCl2, CaCl2, dimetilsulfóxido (DMSO) y Azul de Alcian por 3 hrs a
temperatura ambiente, de acuerdo a las recomendaciones de Shepherd, 1987 y
Jabra-Rizk, 1999 (Ver Apéndice III).
6.6. Determinación comparativa de la composición química del propóleo y
extractos activos
Para determinar si el propóleo contiene el (los) mismo(s) compuesto(s) activo(s)
que las especies de plantas evaluadas, se realizó una cromatografía líquida de
alta resolución (CLAR/HPLC) y una cromatografía de gases acoplada a
espectrometría de masas (GC-MS).
6.6.1. Cromatografía líquida de alta resolución
Se realizó una cromatografía líquida de alta resolución de las fracciones etanólica
y hexánica del propóleo. El equipo utilizado fue Hewlett-Packard HP, modelo 1100
series (Hewlett-Packard, Wilmington, DE, USA), equipado con un detector de
arreglo de diodos (DAD) 1100, operado con una fase móvil ChemStation AO903
metanol: acetonitrilo: agua (25: 25: 50); columna Allsphere ODS 1 (250 x 4.6 mm)
5 mm de diámetro interior; flujo 1 mL/min; detector de arreglo de diodos con
detector de ajuste en 260 nm y barridos de 200 a 700 nm.
La identificación de los componentes fue asignado en base a la comparación de
sus índices de retención con aquellos indicados en la literatura (Harbone, J. B.
1994).
6.6.2. Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas
Se analizaron por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas
los compuestos volátiles emitidos por la muestra del EEP, así como del extracto
metanólico de flores de C. citrinus.
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35
Para el análisis se empleó un cromatógrafo de gases acoplado a un
espectrómetro de masas, marca Agilent Technologies. Cromatógrafo de gases
Modelo 6850, Espectrómetro de Masa Modelo 5975C (made in China). Columna
HP-5MS (made in USA), 30 m longitud, 0.25 mm diámetro interno, 0.25 micras
Film.
6.7. Análisis estadístico
Se realizó el análisis estadístico del efecto de los extractos sobre la estructura de
las células micóticas, mediante análisis de varianza unifactorial y bifactorial,
empleando el paquete estadístico GraphPad Prism 5 Project, Versión 5.01, 2007.
RReessuullttaaddooss
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7. RESULTADOS Se recolectaron muestras de flores de tres plantas que son visitadas por las
abejas para la elaboración del propóleo y otros productos apícolas, las cuales
fueron identificadas en el herbario de la FES-Iztacala, donde se depositó un
ejemplar de cada una de ellas.
Los ejemplares fueron identificados como Callistemon citrinus Stapf, número de
registro IZTA 42143, Eucalyptus camaldulensis Dehnhartdt, número de registro
IZTA 42144 y Ricinus communis L, número de registro IZTA 42146 (Apéndice I).
En la tabla 2 se describen las características organolépticas y el rendimiento
obtenido para cada uno de los extractos.
7.1. Actividad antifúngica
Mediante la prueba de difusión en agar para levaduras (Fig. 8) se determinó que
tanto la cepa de Candida albicans (ATCC 10231) como la de Cryptococcus
neoformans son sensibles a los extractos hexánico y etanólico de propóleo y a los
extractos de flores de R. communis y de C. citrinus con acetato de etilo y con
metanol, pero no al extracto hexánico de flores de R. communis y a ninguno de
los extractos de flores de E. camaldulensis. Por otra parte, sólo el C. neoformans
presentó sensibilidad frente al extracto hexánico de C. citrinus (Tabla 3).
Se determinaron la concentración inhibitoria mínima (CIM) y la concentración
fungicida mínima (CFM) para levaduras de los extractos que presentaron actividad
en las prueba de difusión (Fig. 9, Tabla 3).
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Tabla 2. Rendimiento de los extractos
Peso de flores (g)
Peso de extracto (g) Rendimiento
(%) Características organolépticas
Propóleo 94.05
Etanol 29.85 31.74 Color pardo,
olor característico
Hexano 13.85 14.73 Color verdoso +
ceras, olor característico
R. communis (Higuerilla)
119.30
Hexano 4.8 4.02 Color verdoso,
olor característico
Acetato de Etilo
4.9 4.11 Color verde
obscuro, olor característico
Metanol 4.8 4.02 Color pardo,
olor característico
E. camaldulensis
(Eucalipto) 136.74
Hexano 4.9 3.58 Color mostaza,
olor característico
Acetato de Etilo
4.2 3.07 Color verdoso,
olor característico
Metanol 4.9 3.59 Color pardo,
olor característico
C. citrinus (Cepillo)
33.86
Hexano 4.9 14.47 Color pardo,
olor característico
Acetato de Etilo
4.8 14.17 Color verde olivo, olor
característico
Metanol 4.9 14.47 Color rojizo,
olor característico
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Mediante la prueba de dilución en placa se encontró para C. albicans una CIM de
0.25 mg/mL y una CFM de 0.5 mg/mL con los extractos hexánico y etanólico de
propóleo; con los extractos de acetato de etilo y metanol de flores de R.
communis, se obtuvieron CIM de 0.75 y 1.5 mg/mL y CFM de 1.0 y 2.0 mg/mL
respectivamente; en el caso de los extractos de acetato de etilo y metanol de
flores de C. citrinus se obtuvieron CIM de 0.25 y 0.5 mg/mL y CFM de 0.5 y 0.75
mg/mL respectivamente.
Para C. neoformans se obtuvieron CIMs de 1.5 y 0.5 mg/mL y CFMs de 2.0 y 0.75
mg/mL con los extractos hexánico y etanólico de propóleo respectivamente; con
los extractos de acetato de etilo y metanol de flores de R. communis, se
obtuvieron CIM de 1.0 mg/mL y CFM de 1.5 mg/mL; el extracto hexánico de flores
de C. citrinus presentó una CIM de 1.5 mg/mL y una CFM de 2.0 mg/mL, mientras
que los extractos obtenidos con acetato de etilo y metanol presentaron CIMs de
0.75 y 0.25 mg/mL y CFMs de 1.0 y 0.25 mg/mL, respectivamente.
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2.5 mg/ml 3.0 mg/ml 2.0 mg/ml
1.5 mg/ml 1.0 mg/ml 0.75 mg/ml
0.50 mg/ml 0.25 mg/ml 0.125 mg/ml
Fig. 8. Prueba de difusión en agar para levaduras. Uso de agar Müeller Hinton suplementado con 2% de glucosa y 0.5 µg/mL de azul de metileno como medio de prueba (NCCLS/CLSI M44-A). Se observa la inhibición producida por la fracción etanólica del propóleo frente a C. neoformans.
Fig. 9. Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima para levaduras. Se observa la reducción del crecimiento de C. neoformans con el incremento en la concentración del extracto metanólico de flores de R. communis.
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Tabla 3. Actividad antifúngica de los extractos de las especies vegetales y del propóleo sobre hongos levaduriformes. Se presentan los resultados de la
prueba de difusión en agar (halos de inhibición) y de la determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM) y la concentración fungicida mínima (CFM) para los extractos que presentaron actividad antifúngica.
Extracto
Candida albicans Cryptococcus
neoformans
Halos de inhibición
(mm)
CIM (mg/mL)
CFM (mg/mL)
Halos de inhibición
(mm)
CIM (mg/mL)
CFM (mg/mL)
Propóleo Hexano 10.0 0.25 0.5 15.6 1.5 2.0
Etanol 12.0 0.25 0.5 17.6 0.5 0.75
R. communis
Hexano n.a na
Ac de Et 19.6 0.75 1.0 26.0 1.0 1.5
Metanol 21.0 1.5 2.0 27.6 1.0 1.5
E. camaldulen-sis
Hexano n.a na
Ac de Et n.a na
Metanol n.a na
C. citrinus
Hexano n.a 14.0 1.5 2.0
Ac de Et 17.3 0.25 0.5 23.0 0.75 1.0
Metanol 17.3 0.5 0.75 25.6 0.25 0.25
na: no presentó actividad
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La lectura de la prueba de microdilución se realizó de manera visual a las 24 hrs y
de manera visual y espectrofotométrica a las 48 para las levaduras C. albicans
ATCC 10231 y C. neoformans, habiendo probado 10 concentraciones entre 0.05 y
0.9 mg/mL de los extractos etanólico de propóleo y metanólico de C. citrinus,
determinando la CIM y posteriormente la CFM (Fig. 10, Tablas 4 y 5).
Simultáneamente se realizó la prueba de microdilución con ketoconazol, como
control de la prueba y de las cepas. Se obtuvieron valores de 0.031 µg/mL tanto
para C. albicans como para C. neoformans y en base a los criterios de
susceptibilidad de las levaduras frente a ketoconazol, se considera susceptible
cuando su CIM es menor a 0.125 µg/Ml (Tabla 6) (Silva, 2002).
Se encontró una alta similitud entre los resultados obtenidos a través de las
pruebas de dilución en placa y de microdilución, ya que C. albicans con extracto
etanólico de propóleo presentó en la prueba de dilución en placa una CIM de 0.25
mg/mL y en la de microdilución de 0.2 mg/mL. Con extracto metanólico de C.
citrinus presentó en la prueba de dilución en placa una CIM de 0.5 mg/mL y en la
de microdilución de 0.1 mg/mL.
C. neoformans tuvo un comportamiento similar, presentando CIM para el extracto
etanólico de propóleo de 0.5 mg/mL en la prueba de dilución en placa y de 0.2
mg/mL en la de microdilución, mientras que para el extracto metanólico de C.
citrinus se encontró una CIM de 0.25 mg/mL con la prueba de dilución en placa y
de 0.1 con la de microdilución (Tabla 7).
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42
Fig. 10. Prueba de microdilución para levaduras: desarrollada en placa de 96
pozos, de acuerdo al documento NCCLS/CLSI M27-A2. Incubación de 48 hrs. para C. albicans y de 72 hrs. para C. neoformans.
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43
Tabla 4. Lectura visual de la prueba de microdilución de Candida albicans frente a extractos de propóleo y C. citrinus a las 48hrs de incubación.
Control
(+) 0.05
mg/mL 0.1
mg/mL 0.2
mg/mL 0.3
mg/mL 0.4
mg/mL 0.5
mg/mL 0.6
mg/mL 0.7
mg/mL 0.8
mg/mL 0.9
mg/mL
Control (-)
CIM mg/mL
CIM 490 nm
C. albicans - Propóleo
+++ +++ ++ - - - - - - - - - 0.2 0.2
C. albicans - Propóleo
+++ +++ ++ - - - - - - - - - 0.2 0.2
C. albicans – C. citrinus
+++ +++ - - - - - - - - - - 0.1 0.1
C. albicans – C. citrinus
+++ +++ - - - - - - - - - - 0.1 0.1
(+++): Crecimiento igual al control +; ( ++) Reducción de crecimiento comparado con el control +; (-) Sin crecimiento
CIM: concentración inhibitoria mínima
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44
Tabla 5. Lectura visual de la prueba de microdilución de Cryptococcus neoformans frente a extractos de propóleo y C. citrinus a las 48hrs de incubación.
(+++): Crecimiento igual al control +; ( ++) Reducción de crecimiento comparado con el control +; (-) Sin crecimiento
CIM: concentración inhibitoria mínima
Control
(+) 0.05
mg/mL 0.1
mg/mL 0.2
mg/mL 0.3
mg/mL 0.4
mg/mL 0.5
mg/mL 0.6
mg/mL 0.7
mg/mL 0.8
mg/mL 0.9
mg/mL Control
(-) CIM
mg/mL CIM
490 nm
C. neoformans – Propóleo
+++ +++ ++ - - - - - - - - - 0.2 0.2
C. neoformans – Propóleo
+++ +++ ++ - - - - - - - - - 0.2 0.2
C. neoformans – C. citrinus
+++ +++ - - - - - - - - - - 0.1 0.1
C. neoformans – C. citrinus
+++ +++ - - - - - - - - - - 0.1 0.1
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45
Tabla 6. Lectura espectrofotométrica a 490 nm de la prueba de microdilución para ketoconazol, propóleo y C. citrinus después de 48 hrs de incubación.
16
µg/ml
8
µg/ml
4
µg/ml
2
µg/ml
1
µg/ml
0.5
µg/ml
0.25
µg/ml
0.125
µg/ml
0.062
µg/ml
0.031
µg/ml C+ C- CMI50
C. albicans -
Ketoconazol 0.249 0.263 0.268 0.271 0.261 0.285 0.320 0.353 0.357 0.421 0.912 0.291
0.031
µg/ml
C. neoformans -
Ketoconazol 0.240 0.236 0.239 0.241 0.242 0.242 0.245 0.254 0.272 0.376 0.621 0.267
0.031
µg/ml
0.9
mg/ml
0.8
mg/ml
0.7
mg/ml
0.6
mg/ml
0.5
mg/ml
0.4
mg/ml
0.3
mg/ml
0.2
mg/ml
0.1
mg/ml
0.05
mg/ml
C. albicans -
Propóleo 0.280 0.263 0.289 0.422 0.428 0.469 0.512 0.703 0.907 0.929 0.883 0.286
0.2
mg/ml
C. albicans –
C. citrinus 0.341 0.351 0.344 0.420 0.463 0.486 0.504 0.511 0.520 0.538 0.964 0.255
0.1
mg/ml
C. neoformans -
Propóleo 0.204 0.207 0.228 0.240 0.242 0.275 0.282 0.298 0.341 0.491 0.504 0.216
0.2
mg/ml
C. neoformans –
C. citrinus 0.297 0.275 0.293 0.307 0.312 0.319 0.321 0.332 0.334 0.460 0.575 0.289
0.1
mg/ml
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46
Tabla 7. Comparación de los resultados obtenidos para la Concentración inhibitoria mínima (CMI) en mg/mL y Concentración fungicida mínima (CFM) en mg/mL obtenidas para el extracto etanólico de propóleo y el extracto metanólico de C. citrinus, con cepas de Candida albicans y Cryptococcus neoformans, mediante las pruebas de microdilución y dilución en placa.
ORGANISMO
PROPÓLEO-ETANOL C. citrinus-METANOL MICRODILUCIÓN
CIM (PLACA)
MICRODILUCIÓN
CIM (PLACA) CIM (visual)
CIM50 (490nm)
CIM (visual)
CIM50 (490nm)
Candida albicans 0.2 0.2 0.25 0.1 0.1 0.5
Cryptococcus neoformans 0.2 0.2 0.5 0.1 0.1 0.25
Con la prueba de inhibición del crecimiento radial para hongos filamentosos se
encontró que fue inhibido el desarrollo de Fusarium moniliforme por el extracto
metanólico de flores de R. communis, la cepa de Rhizoctonia solani fue inhibida
por los extractos hexánico y etanólico de propóleo (Fig. 11), por el extracto
hexánico de flores de R. communis y por los extractos hexánico, etanólico y de
acetato de etilo de flores de C. citrinus, mientras que la cepa de Trichophyton
mentagrophytes fue inhibida únicamente por las dos fracciones del extracto de
propóleo y por el extracto metanólico de C. citrinus (Tabla 8).
Tabla 8. Prueba de inhibición del crecimiento radial de los extractos de las especies vegetales y del propóleo sobre hongos filamentosos.
EXTRACTO
HONGO
An A.fl Fm Fs Rs Tm
Propóleo Hexano - - - - + +
Etanol - - - - + +
R. communis
Hexano - - - - + -
Ac de Et - - - - - -
Metanol - - + - - -
E. camaldulensis
Hexano - - - - - -
Ac de Et - - - - - -
Metanol - - - - - -
C. citrinus
Hexano - - - - + -
Ac de Et - - - - + -
Metanol - - - - + +
An: Aspergillus niger; Afl: Aspergillus flavus; Fm: Fusarium moniliforme; Fs: Fusarium sporotrichum; Rs: Rhizoctonia solani; Tm: Trichophyton mentagrophytes. + : Activo; - : No activo
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48
A B
Fig. 11. Prueba de inhibición del crecimiento radial para hongos filamentosos. Cultivo de Rhizoctonia solani en agar dextrosa papa; A: se
aprecian las zonas de inhibición del crecimiento en forma de medias lunas causadas por los extractos hexánico (A) y etanólico (B) de propóleo. B: Ausencia de inhibición en presencia de extracto metanólico de flores de R. communis. (Método modificado de Wang y Bun, 2002).
Fig. 12. Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima para hongos filamentosos. Empleo de placa de 24 pozos, con tres repeticiones por cada dilución. Sólo se aprecia crecimiento en los tres pozos de control sin extracto para T. mentagrophytes en presencia de extracto hexánico de propóleo.
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49
En las tablas 9 a 11 se presentan los resultados obtenidos para la determinación
de la Concentración Inhibitoria Mínima en placa de 24 pozos, para los hongos
filamentosos que resultaron sensibles en la prueba de inhibición del crecimiento
radial (Fig. 12).
Con R. solani se encontró una CIM de 1.0 mg/mL para las fracciones hexánica y
etanólica de propóleo, mientras que para el extracto hexánico de flores de R.
communis y los tres extractos de flores de C. citrinus, se observó reducción de
crecimiento, pero se considera que las CIM son mayores a 3.0 mg/mL que fue la
máxima concentración probada, ya que no se alcanzó la inhibición completa del
crecimiento (Tabla 9).
Tabla 9. Determinación de la CIM de diferentes extractos frente a Rhizoctonia solani: Diámetro promedio de la colonia en mm.
Extracto mg/mL
Propóleo Hexano
Propóleo Etanol
R.
communis Hexano
C.
citrinus Hexano
C.
citrinus Ac de
Et
C.
citrinus Metanol
Control 15 15 15 15 15 15
0.25 5 5 11 14 14 15
0.5 3 5 10.66 12.66 12 14
1 0 0 10 10.66 10 10.33
1.5 0 0 10 8 7.66 9
2 0 0 9 7.33 7 7.66
2.5 0 0 8.66 7.66 5.66 7
3 0 0 8 6 5 5.66
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50
De la misma manera, la CIM del extracto hexánico de flores de R. communis
frente a F. moniliforme se considera mayor a 3.0 mg/mL por presentar reducción,
pero no inhibición total del crecimiento (Tabla 10), mientras que para T.
mentagrophytes se encontró una CIM de 0.25 mg/mL para las fracciones hexánica
y etanólica de propóleo y de 1.5 mg/mL para el extracto metanólico de flores de C.
citrinus (Tabla 11).
Tabla 10. CIM del extracto metanólico de flores de R. communis frente a Fusarium moniliforme: Diámetro promedio de la colonia en mm.
Extracto (mg/mL)
R. communis Metanol
Control 15
0.25 15
0.5 14.66
1 14
1.5 13
2 11.66
2.5 10.66
3 10
Tabla 11. Determinación de la CIM de diferentes extractos frente a Trichophyton mentagrophytes: Diámetro promedio de la colonia en mm.
Extracto (mg/mL)
Propóleo Hexano
Propóleo Etanol
C. citrinus Metanol
Control 13.66 12.66 12.66
0.25 0 0 10.33
0.5 0 0 8.66
1 0 0 2.66
1.5 0 0 0
2 0 0 0
2.5 0 0 0
3 0 0 0
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51
Se probaron once extractos frente a dos levaduras y seis hongos filamentosos . En
la Tabla 12 se resume el número total de hongos que fueron inhibidos por cada
extracto.
Tabla 12. Número total de hongos inhibidos por cada extracto.
EXTRACTO
NÚMERO DE HONGOS INHIBIDOS
LEVADURAS FILAMENTOSOS TOTAL
Propóleo – Hexano 2/2 2/6 4/8
Propóleo - Etanol 2/2 2/6 4/8
R. communis Hexano 0/2 1/6 1/8
R. communis – Ac de Et 2/2 0/6 2/8
R. communis - Metanol 2/2 1/6 3/8
E. camaldulensis - Hexano 0/2 0/6 0/8
E. camaldulensis – Ac de Et 0/2 0/6 0/8
E. camaldulensis - Metanol 0/2 0/6 0/8
C. citrinus - Hexano 1/2 1/6 2/8
C. citrinus – Ac de Et 2/2 1/6 3/8
C. citrinus – Metanol 2/2 2/6 4/8
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52
7.2. Cinéticas de crecimiento
Se realizó el recuento de colonias de las placas, expresándolos en UFC/mL
(unidades formadoras de colonias por mililitro). La representación gráfica de las
curvas de letalidad a distintas concentraciones de los extractos se presenta en las
siguientes figuras:
Se observa inhibición en el crecimiento de C. albicans desde el inicio de la curva
en presencia de diferentes concentraciones de extracto etanólico de propóleo
(media MIC, MIC, CFM), comparado con el testigo sin extracto (Fig. 13).
Fig. 13. Cinética de crecimiento de C. albicans con y sin extracto etanólico
de propóleo. Se observa inhibición en el crecimiento desde el inicio de la curva en presencia de diferentes concentraciones del extracto (media MIC, MIC, CFM), comparado con el testigo sin extracto.
0
50
100
150
200
250
300
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
UFC
/mL
C. albicans - PROPÓLEO
Testigo
1/2 MIC
MIC
CFM
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53
De manera similar, C. neoformans presenta una rápida reducción en su
crecimiento en presencia de diferentes concentraciones del extracto (media MIC,
MIC, CFM), comparado con el testigo sin extracto (Fig. 14).
Fig. 14. Cinética de crecimiento de C. neoformans con y sin extracto etanólico de propóleo. Se observa una rápida reducción del crecimiento en presencia de diferentes concentraciones del extracto (media MIC, MIC, CFM),
comparado con el testigo sin extracto.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
UFC
/mL
C. neoformans - PROPÓLEO
Testigo
1/2 MIC
MIC
CFM
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54
En la cinética de crecimiento de C. albicans con extracto metanólico de flores de
C. citrinus, no se presenta ddurante las primeras horas una inhibición aparente,
pero a partir del tiempo 4 (12 hrs de incubación) se observa reducción en el
crecimiento frente a la CFM y a partir del tiempo 6 (27 hrs de incubación) frente a
la media CIM y la CIM, en relación al desarrollo del testigo sin extracto (Fig. 15).
Fig. 15. Cinética de crecimiento de C. albicans con y sin extracto metanólico
de flores de C. citrinus. Durante las primeras horas no hay una inhibición aparente, pero a partir del tiempo 4 (12 hrs de incubación) se observa reducción en el crecimiento frente a la CFM y a partir del tiempo 6 (27 hrs de incubación)
frente a la media CIM y la CIM, en relación al desarrollo del testigo sin extracto.
0
50
100
150
200
250
300
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
UFC
/m
L
C. albicans - C. citrinus
Testigo
1/2 MIC
MIC
CFM
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55
En el caso de C. neoformans con extracto metanólico de flores de C. citrinus, se
observa reducción en el crecimiento frente a la CIM y la CFM a partir del tiempo 3
(9 hrs de incubación) y frente a la media CIM a partir del tiempo 7 (30 hrs de
incubación), comparado con el desarrollo del testigo sin extracto (Fig. 16)
Fig. 16. Cinética de crecimiento de C. neoformans con y sin extracto
metanólico de flores de C. citrinus. Se observa reducción en el crecimiento frente a la CIM y la CFM a partir del tiempo 3 (9 hrs de incubación) y frente a la media CIM a partir del tiempo 7 (30 hrs de incubación), comparado con el
desarrollo del testigo sin extracto.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
UFC
/mL
C. neoformans - C. citrinus
Testigo
1/2 MIC
MIC
CFM
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56
7.3. Cambios estructurales 7.3.1. Microscopía óptica
Mediante el empleo de un microscopio de luz con campo claro y con
epifluorescencia se observaron alteraciones en la estructura celular al estar en
presencia de los extractos.
Hubo ausencia de formación de tubo germinativo por la exposición al EEP o al
extracto metanólico de flores de C. citrinus (Fig. 17 B, 18 D y E).
Se observa la deformación de algunas levaduras de C. albicans en presencia de
0.25 mg/mL de EEP (Fig. 18 D), así como alargamiento celular tras el contacto
con 0.5 mg/mL de extracto metanólico de flores de C. citrinus (Fig. 18 F).
En el caso de C. neoformans, no se aprecia alteración aparente en la estructura
de las células incubadas en presencia de 0.5 mg/mL EEP, pero se observa
alargamiento de las células tras el contacto con 0.25 mg/mL de extracto
metanólico de flores de C. citrinus (Fig. 19 B y C).
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57
A
B Fig. 17. A: Formación de tubo germinativo por C. albicans ATCC 10231, después de 3 hrs de incubación a 35°C en suero fetal bovino (flecha). B: Inhibición de la formación de tubo germinativo en presencia de 0.25 mg/mL de EEP, bajo las mismas condiciones de crecimiento que en A (campo claro, 100X).
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58
Fig. 18. Tinción de C. albicans ATCC 10231 con Blanco de Calcoflúor, (tinción fluorescente, 100X). A y B: Se aprecia la tinción fluorescente de la pared celular de las levaduras (flechas), C: Se aprecia la formación de tubo germinativo después de incubación en suero fetal bovino a 35°C durante 3 hrs (flecha). D: Inhibición de la formación del tubo germinativo en presencia de 0.25 mg/mL de EEP. Se observa la deformación de algunas levaduras (flechas). E: Inhibición de la formación del tubo germinativo en presencia de 0.5 mg/mL de extracto metanólico de flores de C. citrinus. F: Alargamiento de las células de C. albicans tras el contacto con 0.5 mg/mL de extracto metanólico de flores de C. citrinus (flechas).
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59
A B
C D
E
Fig. 19. Tinción de levaduras de C. neoformans con Blanco de Calcoflúor (100X). A: Células no tratadas. B: No se aprecia alteración significativa en la estructura de las células incubadas en presencia de 0.5 mg/mL EEP. C, D y E: Alargamiento de las células de C. neoformans tras el contacto con 0.25 mg/mL de extracto metanólico de flores de C. citrinus.
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60
Al realizar el análisis de varianza unifactorial, se encontró que el efecto del extracto
etanólico de propóleo y del extracto metanólico de C. citrinus sobre el diámetro de C.
albicans ATCC 10231 y de C. neoformans no es significativo (P= 0.2067 y 0.4184
respectivamente) (Fig. 20 y 22), pero su efecto sobre la capacidad de C. albicans para
formar el tubo germinativo es sí lo es (P= <0.0001) (Fig. 21).
Con el análisis de varianza bifactorial, se asume que la levadura tiene el mismo efecto en
todos los niveles de tratamiento. Representa el 33% del total de la varianza. El efecto es
considerado significativo (P=0.0009). El tratamiento no tiene ningún efecto general y
representa el 7.03% del total de la varianza. El efecto es considerado no significativo
(P=0.7984) (Fig. 23).
Fig. 20. Efecto del extracto etanólico de Propóleo y del extracto metanólico de C. citrinus sobre el diámetro de C. albicans ATCC 10231. No hubo variación significativa en el diámetro de las levaduras por la exposición a los extractos (P= 0.2067). A: Diámetro de las levaduras sin ningún tratamiento. B: Efecto del EEP sobre las levaduras. C: Efecto del extracto metanólico de flores de C. citrinus sobre las levaduras.
Ca (+) Ca-PE Ca-CM
0
2
4
6
Diá
me
tro
de
la
s c
élu
las
(
m)
A B C
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61
Fig. 21. Efecto del extracto etanólico de Propóleo y del extracto metanólico de C. citrinus sobre la longitud del tubo germinativo de C. albicans ATCC 10231. Hubo ausencia de formación de tubo germinativo en presencia de ambos extractos. Efecto significativo (P= <0.0001). A: Longitud del tubo germinativo formado por las levaduras no tratadas. B: Inhibición de la formación de tubo germinativo en presencia de EEP. C: Inhibición de la formación de tubo germinativo en presencia de extracto de flores de C. citrinus.
Fig. 22. Efecto del extracto etanólico de Propóleo y del extracto metanólico de C. citrinus sobre el diámetro de C. neoformans. No hubo variación significativa en el diámetro de las levaduras tras la exposición a los extractos (P= 0.4184). A: Diámetro de
Ca (+) Ca- P Ca- Cc0
10
20
30
Lo
ng
itu
d d
el T
ub
o g
erm
inati
vo
(
m)
A B C
Cn (+) Cn-P Cn-Cc0
2
4
6
8
10
Diá
me
tro
de
la
cé
lula
s (
m)
A B C
DOCINADE Amparo Londoño Orozco Estudio comparativo de la actividad antifúngica de un extracto de propóleo mexicano y de tres plantas que Apis mellifera usa para su producción
62
las levaduras sin ningún tratamiento. B: Efecto del EEP sobre las levaduras. C: Efecto del extracto de flores de C. citrinus sobre las levaduras.
A B C D E F
0
2
4
6
8
10D
iám
etr
o d
e l
as
cé
lula
s (
m)
Fig. 23. Efecto del extracto etanólico de Propóleo y del extracto metanólico de C. citrinus sobre el diámetro de C. albicans y de C. neoformans. Es significativo el efecto de la levadura (P=0.0009), pero no el del tratamiento (P=0.7984).A: C. albicans ATCC 10231 sin ningún tratamiento. B: C. albicans ATCC 10231 tratada con EEP. C: C. albicans ATCC 10231 tratada con extracto de flores de C. citrinus. D: C. neoformans sin ningún tratamiento. E: C. neoformans tratada con EEP. F: C. neoformans tratada con extracto de flores de C. citrinus.
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63
7.3.2. Microscopia electrónica de transmisión (MET) Se observaron micrografías electrónicas de transmisión de secciones ultrafinas de
Candida albicans ATCC 10231 y de C. neoformans.
Las figuras 24 a 26 presentan las micrografías electrónicas de C. albicans ATCC
10231 sin tratamiento. En ellas puede observarse a 12000 aumentos, la estructura
normal de la levadura, incluyendo núcleo, mitocondrias, retículo endoplásmico,
vesículas, gotas de lípidos, gránulos de almacenamiento y su cubierta con
membrana citoplasmática y pared celular.
En las figuras 27 a 32 se presentan las micrografías electrónicas de Candida
albicans ATCC 10231 incubada 24 hrs con extracto EEP. En estas se encuentra
tanto células viables como degeneradas.
Los hallazgos ultraestructurales a 4400, 7000 y 12000 aumentos revelan diversas
alteraciones entre las que se cuentan la presencia de vacuolización, ruptura de la
cubierta celular con liberación de material intracelular e incremento en la
formación de gránulos de almacenamiento. También es visible la alteración en las
estructuras de la cubierta externa de la levadura.
En el interior de las levaduras pueden verse estructuras normales como
ribosomas, vesículas y retículo endoplásmico, así como puntos de fusión entre la
pared celular y la cápsula externa.
Las figuras 33 a 38 muestran las micrografías electrónicas a 4400, 7000 y 12000
aumentos de C. albicans ATCC 10231 incubada 24 hrs con extracto metanólico de
flores de Callistemon citrinus.
De manera característica se observa la inducción por parte del extracto, del
alargamiento de las células de C. albicans, lo cual había sido previamente
observado por microscopía de luz. Algunas de estas células alargadas parecen
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64
ser producto de la formación de tubos germinativos, sin embargo otras de ellas se
aprecian como simples formas alargadas.
En una célula se observaron dos partículas hiperdensas semejantes a las
estructuras intravesiculares descritas como pigmentos por Rodrigues para C.
neoformans (Rodrigues, 2008).
En las figuras 39 a 42 se encuentran las micrografías electrónicas obtenidas de
Cryptococcus neoformans sin tratamiento. Al igual que para C. albicans, en ellas
puede observarse a 12000 aumentos, la estructura normal de la levadura. Puede
observarse la formación de vesículas, lo cual es una observación frecuente para
C. neoformans (Rodrigues, 2008).
Las micrografías electrónicas de células de C. neoformans incubadas 24 hrs con
EEP se presentan el las figuras 43 a 48. En ellas se observan tanto células
normales como degeneradas. Entre las alteraciones encontradas están la
contracción del contenido intracelular y destrucción de organelos subcelulares,
observado como una marcada separación entre este y su cubierta externa y la
ruptura de la cubierta celular con la consecuente salida de los componentes
internos.
Las figuras 49 a 51 presentan las micrografías electrónicas de Cryptococcus
neoformans incubada 24 hrs con extracto metanólico de flores de Callistemon
citrinus, en las cuales se aprecian vesículas dentro y fuera de vacuolas, además
de material amorfo y granular intracelular. En la pared celular pueden observarse
regiones menos electrodensas que corresponden a alteraciones en su integridad
(Anderson, 1990).
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65
7.3.2.1. Micrografías electrónicas de Candida albicans ATCC 10231 sin
tratamiento
Fig. 24. Se aprecia material granular heterogéneo (MGH), en cuyo interior se observan mitocondrias (M), vesículas (V) y una gran gota de lípido (L), rodeados por la pared celular (P) (12000x).
Fig. 25. Célula de levadura mostrando el
núcleo (N) rodeado de material granular heterogéneo (MGH) (12000x).
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66
Fig. 26. Se aprecia una gran gota de lípido (L), una estructura no identificada (flecha) en el interior de un gránulo de almacenamiento (G), mitocondrias (M, posible retículo endoplásmico (RE), membrana citoplasmática (MC) y pared celular (PC) (12000x).
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67
7.3.2.2. Micrografías electrónicas de Candida albicans ATCC 10231
incubadas 24 hrs con extracto etanólico de propóleo
Fig. 27. Se observa una gran vacuola (V) con dos gránulos de almacenamiento (G) en su interior. Las flechas señalan sitios de ruptura de la cubierta celular. En uno de ellos se aprecia el inicio de la liberación de material granular electrodenso homogéneo (MEH) presente en el interior de la levadura (12000x).
Fig. 28. Todas las células presentan gránulos de almacenamiento (G) (7000x).
G
G
G
G
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Fig. 29. Se aprecian células de diferentes edades que pueden distinguirse por el grosor de su pared celular. Se observa vacuolización (V) y presencia de gránulos de almacenamiento (G) (4400x). Ver ampliación de la célula en el recuadro en la siguiente imagen.
Fig. 30. Se aprecia alteración en las estructuras externas de la levadura. En su interior pueden verse una vacuola (V), ribosomas (R) y retículo endoplásmico (RE) (12000x).
R V
RE
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69
Fig. 31. Posible sitio de salida de una vesícula de secreción (flecha) (20000x).
Fig. 32. Se aprecia vacuolización del citoplasma. Una de las vacuolas (V) contiene una vesícula fusionada (flecha) y otra presenta un gránulo de almacenamiento (G). Se observan también otras vesículas (Ve) y ribosomas (R), así como puntos de fusión entre la pared celular y la cápsula externa (flecha blanca) (12000x).
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70
7.3.2.3. Micrografías electrónicas de C. albicans ATCC 10231 incubadas 24
hrs con extracto metanólico de flores de Callistemon citrinus.
Fig. 33. Célula con dos partículas hiperdensas semejantes a
pigmentos (20000x).
Fig. 34. Se observan diferentes formas celulares. Al centro una
forma filamentosa (7000x).
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71
Fig. 35. Detalle de una forma filamentosa. Se aprecia un
septo transversal (20000x).
Fig. 36. Diferentes formas
celulares alteradas (4400x).
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72
Fig. 37. Se aprecia una levadura normal (N), otra en gemación (G) y una célula alargada
(A) posiblemente desprendida por filamentación de una levadura (7000x)
Fig. 38. Formación de tubo germinativo (TG) por una célula dañada (7000x).
A
N G
TG
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7.3.2.4. Micrografías electrónicas de Cryptococcus neoformans sin
tratamiento
Fig. 39. Célula viable, presenta su cubierta externa íntegra (12000x).
Fig. 40. Se aprecia material amorfo (A) y granular (G) en el interior de una célula en gemación. Se aprecia una vesícula secretada (V) (12000 x).
A
G
V
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74
Fig. 41. Pueden observarse vesículas (V) y un gran gránulo de almacenamiento (G) (20000x)
Fig. 42. Se aprecian vacuolas (V), vesículas (Ve) y material granular heterogéneo (MGH) (12000x)
G
V
MGH
V
V
Ve
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75
7.3.2.5. Micrografías electrónicas de Cryptococcus neoformans incubadas
24 hrs con extracto etanólico de propóleo.
Fig. 43. Se observan células normales y degeneradas (recuadro). Ver ampliación de la célula en el recuadro en la siguiente imagen (7000x).
Fig. 44. Levadura con ruptura de la cubierta celular (20000x).
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76
Fig. 45. Se aprecia material granular electrodenso homogéneo, saliendo de una célula degenerada (50000x).
Fig. 46. Células alteradas
mostrando contracción del contenido intracelular (7000x).
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77
Fig. 47. Ruptura de la cubierta celular antes del proceso de gemación (20000x).
Fig. 48. Células degeneradas por efecto del extracto con destrucción de organelos subcelulares (7000x).
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78
7.3.2.6. Micrografías electrónicas de Cryptococcus neoformans incubadas
24 hrs con extracto metanólico de flores de Callistemon citrinus.
Fig. 49. Regiones menos electrodensas (flecha)
corresponden a alteraciones en la integridad de la pared celular. Se observan ribosomas
(20000x).
Fig. 50. Se aprecia una gran vacuola (V) conteniendo material difuso no identificado
(7000x).
V
R
V
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79
Fig. 51. Célula degenerada con material amorfo (MA), material granular heterogéneo (MGH) y estructuras membranosas mal definidas. Además hay vesículas (Ve) dentro y fuera de vacuolas (V) (12000x).
MA
MGH
V
Ve
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80
7.4. Composición química
7.4.1. Cromatografía líquida de alta resolución
De acuerdo a la comparación de sus índices de retención con los indicados en la
literatura, los compuestos asignados fueron: 1 isoflavona, 5 flavonas, 1
quercetina, 6 derivados del ácido cinámico y 1 derivado del ácido caféico (Tabla
13).
Tabla 13. Constituyentes de las fracciones del propóleo determinados por Cromatografía Líquida de Alta Resolución.
Fracción Tiempo de
Retención (min) Max. (nm)
Asignación de Compuestos
Propóleo-Etanol 3.5 236, 260,294 Isoflavona
4.1 238, 276, 324 Flavona
4.6 250,322 Quercetina
4.8 242, 296 324 Flavona
5.9 236, 288 Flavona
9.7 236, 293 328 Flavona
11.9
238, 292 328 Flavona
14.1 282 Derivado del ácido cinámico
16.1 236, 290 Derivado del ácido cinámico
19.3 290 Derivado del ácido cinámico
Propóleo-Hexano
7.0 314 Derivado del ácido caféico
13.1 286 Derivado del ácido cinámico
16.2 236, 290 Derivado del ácido cinámico
16.9 236, 290 Derivado del ácido cinámico
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7.4.2. Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS)
Se analizaron por GC-MS los compuestos volátiles emitidos por las muestras del
EEP y del extracto metanólico de flores de C. citrinus. Su identificación se realizó
por comparación de los espectros de masas obtenidos con los espectros de estos
compuestos almacenados en la librería del equipo. En el Anexo II se presentan
dichos espectros para ambos extractos, y en la Tabla 13 su identificación.
Los metabolitos que estuvieron presentes en ambos extractos son:
Eucaliptol
Estructura:
Nombre químico: 1,3,3-Trimetil-2-oxabiciclo[2.2.2]octano
Otros nombres: 1,8-Cineol, 1,8-Epoxi-p-mentano
Fórmula Molecular: C10H18O
Peso Molecular: 154.2 g/mol
Punto de fusión: 1.5 oC
Punto de ebullición: 176-177 oC
Es un líquido incoloro y transparente con olor parecido al del alcanfor (RE2, RE3)
Metil éster del ácido 3-acetoxi-hidroxipropiónico
Estructura:
Fórmula Molecular: C6H10O5
Peso Molecular: 162.0 g/mol
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p-Ment-1-en-8-ol
Estructura:
Nombre químico: 2-(1-Metil-1-ciclohexen-4-il)propan-2-ol
Otros nombres: alfa-Terpineol, p- Ment-1-en-8-ol
Fórmula Molecular: C10H18O
Peso Molecular: 154.2 g/mol
Punto de fusión: 39 oC
Punto de ebullición: 219 oC (81-82 oC a 4.5 mm de Hg)
Hay tres isómeros, alfa-, beta-, y gamma- terpineol. El Terpineol es generalmente
una mezcla de estos isómeros con alfa- terpineol como el componente principal.
El Terpineol tiene un olor agradable similar a la lila y es un ingrediente común en
perfumes, cosméticos, y sabores (RE4).
Etil éster del ácido dodecanoico
Estructura:
Otros nombres: Dodecanoato de etilo, laurato de etilo
Fórmula Molecular: C14H28O2
Peso Molecular: 228.2 g/mol
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1-[4-(4-N,N-Dimetilamino)bencilaminofenil]etanona
Estructura:
Fórmula Molecular: C17H20N2O
Peso Molecular: 268.2 g/mol
Metil éster del ácido hexadecanoico
Estructura:
Otros nombres: Hexadecanoato de metilo, palmitato de metilo
Fórmula Molecular1: C17H34O2
Peso Molecular: 270.4 g/mol
Punto de fusión: 32-35 oC
Punto de ebullición: 185 oC (a 10 mm de Hg)
Sólido blanco. Se usa como fragancia en cosméticos y como saborizante (RE5,
RE6).
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Ácido hexadecanoico
Estructura:
Otros nombres: Ácido palmítico
Peso Molecular: 256.2 g/mol
Punto de fusión: 59-63 oC
Punto de ebullición: 350-351 oC
Sólido blanco, insoluble en agua (RE7).
Metil éster del ácido 7,10,13-hexadecatrienoico
Estructura:
Otros nombres: 7(Z),10(Z),13(Z)-Hexadecatrienoato de metilo, 16:3 (n−3)
Fórmula Molecular: C17H28O2
Peso Molecular: 264.4 g/mol (RE8).
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Tabla. 14. Compuestos volátiles identificados a partir de los espectros
de masas del EEP y el extracto metanólico de flores de C. citrinus.
COMPUESTO PROPÓLEO CEPILLO
T.R. min % DEL TOTAL
T.R. min % DEL TOTAL
EUCALIPTOL 6.297 0.337 6.288 35.56
METIL ÉSTER DEL ÁCIDO 3-ACETOXI-3-
HIDROXIPROPIÓNICO
8.059 0.208 7.922 5.705
p-MENT-1-EN-8-OL 9.182 0.190 9.167 2.757
ETIL ÉSTER DEL ÁCIDO DODECANOICO
15.639 0.185 15.923 14.903
1-[4-(4-N,N-
DIMETILAMINO)BENCILAMINOFENIL]ETANONA
16.382 0.888 16.243 3.235
METIL ÉSTER DEL ÁCIDO HEXADECANOICO
20.105 0.177 20.103 4.702
ÁCIDO HEXADECANOICO 20.513 0.160 20.487 2.548
METIL ÉSTER DEL ÁCIDO
7,10,13-HEXADECATRIENOICO
22.262 1.805 22.225 3.447
DDiissccuussiióónn
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8. DISCUSION
De acuerdo a los resultados obtenidos en el presente trabajo, se determinó que
tanto la cepa de Candida albicans (ATCC 10231) como la de Cryptococcus
neoformans son sensibles a los extractos hexánico y etanólico de propóleo y a los
extractos de flores de R. communis y de C. citrinus con acetato de etilo y con
metanol, pero no al extracto hexánico de flores de R. communis y a ninguno de
los extractos de flores de E. camaldulensis. En relación a estos últimos resultados,
es importante señalar que ellos son sorprendentes, debido a que era de esperarse
que presentaran cierta actividad antifúngica, principalmente por la presencia del
eucaliptol, uno de los principales metabolitos secundarios de esa especie vegetal
y que, además, fue identificado en el extracto metanólico de flores de C. citrinus
en este trabajo. Por otra parte, sólo el C. neoformans presentó sensibilidad frente
al extracto hexánico de C. citrinus.
Para hongos filamentosos se encontró que fue inhibido el desarrollo de Fusarium
moniliforme por el extracto metanólico de flores de R. communis, la cepa de
Rhizoctonia solani fue inhibida por los extractos hexánico y etanólico de propóleo,
por el extracto hexánico de flores de R. communis y por los extractos hexánico,
etanólico y de acetato de etilo de flores de C. citrinus, mientras que la cepa de
Trichophyton mentagrophytes fue inhibida únicamente por las dos fracciones del
extracto de propóleo y por el extracto metanólico de C. citrinus. Estos resultados
son muestra de la selectividad de los extractos empleados sobre algunas de las
cepas de los hongos filamentosos evaluados, lo que debe ser considerado para
su posible uso como tratamiento terapéutico.
La mayor actividad frente a C. albicans fue presentada por el extracto etanólico de
propóleo con valores de CIM de 0.25 mg/mL y CFM de 0.5 mg/mL y el extracto
metanólico de flores de C. citrinus, con valores de CIM de 0.5 mg/mL y CFM de
0.75 mg /mL, mientras que para C. neoformans el extracto etanólico de propóleo
presentó valores de CIM de 0.5 mg/mL y CFM de 0.75 mg/mL y el extracto
metanólico de flores de C. citrinus, presentó valores de 0.25 mg/mL tanto para la
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87
CIM como para la CFM. Entre los hongos filamentosos, la mayor sensibilidad fue
mostrada por T. mentagrophytes frente a estos mismos extractos, presentando
una CIM de 0.25 mg/mL para los extractos etanólico y hexánico de propóleo y de
1.5 mg/mL para el extracto metanólico de flores de C. citrinus. Estos resultados
coinciden por lo reportado por Heinze, et al. en 1998.
Se realizaron curvas de crecimiento para C. albicans ATCC 10231 y C.
neoformans con el fin de observar la dinámica de la acción antifúngica del extracto
etanólico de propóleo y del extracto metanólico de flores de C. citrinus.
Se observó inhibición en el crecimiento de C. albicans y de C. neoformans desde
el inicio de la curva en presencia de diferentes concentraciones de extracto
etanólico de propóleo, lo que indica su importante actividad antifúngica.
El extracto metanólico de flores de C. citrinus, C. albicans no presentó una
inhibición aparente durante las primeras horas de incubación, pero a partir de las
12 horas se observó reducción en el crecimiento de las levaduras. En el caso de
C. neoformans con extracto metanólico de flores de C. citrinus, se observó
reducción en el crecimiento a partir de las 9 horas de incubación.
Por todo lo anterior, es necesario indicar que la actividad presentada de algunos
de los extractos contra los hongos estudiados constituye un aporte importante en
el estado del arte de nuevos sistemas antifúngicos.
Alteraciones celulares encontradas por microscopia
A pesar de que muchos estudios se han centrado en demostrar la actividad
antimicótica del propóleo y de diversos extractos, pocos han demostrado sus
efectos sobre la morfología y estructura de los hongos.
Así, los estudios de microscopía óptica empleando el colorante fluorescente
Blanco de Calcoflúor y microscopía electrónica de transmisión, revelaron un
importante daño celular ocasionado por el contacto con los extractos.
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88
Tanto el EEP a concentraciones de 0.25 mg/mL, como el extracto metanólico de
flores de C. citrinus a 0.5 mg/mL, indujeron la inhibición de la formación de tubo
germinativo, lo cual revela que ambos tienen efecto sobre el proceso
morfogenético de C. albicans, impidiendo la transición de levadura a micelio.
Mello et al. habían encontrado en 2006 que el extracto de propóleo verde de Brasil
redujo la aparición de tubos germinativos de C. albicans después de dos horas de
exposición sin afectar el crecimiento de las células, mencionando los
investigadores que no es claro el mecanismo por el que esto ocurre (Mello, 2006),
sin embargo, en este trabajo se encontró inhibición completa de la formación de
tubo germinativo.
Se observó además en este trabajo la deformación de algunas levaduras de C.
albicans en presencia de 0.25 mg/mL de EEP, así como alargamiento celular tras
el contacto con 0.5 mg/mL de extracto metanólico de flores de C. citrinus.
En el caso de C. neoformans, no se apreció alteración aparente en la estructura
de las células incubadas en presencia de 0.5 mg/mL EEP, pero sí se observó
alargamiento de las células tras el contacto con 0.25 mg/mL de extracto
metanólico de flores de C. citrinus.
También se observaron micrografías electrónicas de transmisión de secciones
ultrafinas de Candida albicans ATCC 10231 y de C. neoformans. Los hallazgos
ultraestructurales revelaron que tras la incubación de C. albicans ATCC 10231 con
EEP, hay vacuolización, incremento en la formación de gránulos de
almacenamiento, además de alteración y ruptura de las estructuras de la cubierta
externa de la levadura, con liberación de material intracelular, mientras que al ser
incubada con extracto metanólico de flores de Callistemon citrinus, se observa de
manera característica la inducción por parte del extracto del alargamiento de las
células lo cual, como ya se mencionó, había sido previamente observado por
microscopía de luz. Es posible que se trate de un proceso de filamentación
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89
alterado, puesto que se demostró por microscopía óptica que este extracto inhibe
la formación de tubos germinativos.
Entre las alteraciones encontradas por el contacto de C. neoformans con el EEP
está ruptura de la cubierta celular con la consecuente salida de los componentes
internos y, al parecer, hay destrucción de organelos subcelulares, lo cual se
observa por una marcada separación entre el contenido intracelular y su cubierta
externa o la presencia de cubiertas completas pero vacías. En las preparaciones
de C. neoformans incubadas con extracto metanólico de flores de C. citrinus, se
apreciaron células degeneradas que contenían material granular heterogéneo con
estructuras membranosas mal definidas y alteraciones en la integridad de la pared
celular, las cuales fueron previamente descritas por Anderson como
incongruencias de la pared asociadas a la presencia de vesículas (Anderson,
1990).
Por su parte, Mello et al. reportaron en 2006 las alteraciones ultraestructurales de
C. albicans observadas por microscopía electrónica de barrido al ser tratadas con
propóleo verde de Brasil, señalando la presencia de cambios en la pared celular
de las levaduras, con sitios de gemación irregulares, y perturbación de la división
resultando en defectos en la textura de la pared de de las células hijas.
El tratamiento in vitro de Candida con derivados de imidazol fue reportado por De
Nollin et al. en 1976, quienes observaron invaginación de la membrana plasmática
y en 1991, Montes et al. reportaron la formación de vesículas, proponiendo que
esto tal vez causa la interrupción de la relación dinámica entre la biosíntesis de
ergosterol y quitina, mismas que fueron observadas en este estudio en células de
C. albicans tratadas con EEP y en C. neoformans tratadas con ambos extractos.
Sin embargo, también fueron observadas en las levaduras de C. neoformans no
tratadas, lo cual coincide con lo reportado para esta levadura (Rodrigues, 2008).
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90
Composición química de los extractos
La composición del propóleo es muy compleja y variada en función de la
diversidad fitogeográfica de las zonas de recolección. Aunque sus principales
componentes son los flavonoides y otros compuestos fenólicos, así como de
ácidos carboxílicos de cadena larga y sus ésteres, los métodos de análisis de que
se dispone en la actualidad permiten detectar un número cada vez mayor de
compuestos en el mismo, comprobándose que la variabilidad en su composición
es muy elevada (Farré, 2004).
En el presente estudio, mediante cromatografía líquida de alta resolución se
lograron identificar algunos de los componentes del EEP, correspondientes a una
isoflavona, cinco flavonas, una quercetina, seis derivados del ácido cinámico y un
derivado del ácido caféico, lo cual coincide con los reportes previos acerca de la
composición del propóleo (Bedascarrasbure et al., 2006, González, 2007).
Se ha propuesto que las proporciones del ácido caféico, los flavonoides y los
ésteres fenólicos son los principales responsables de la actividad biológica, pero
también se ha demostrado que existe un efecto sinérgico entre estos y otros
componentes del extracto (Kartal, 2003).
Los flavonoides (quercetina, apigenina, galangina, etc.) y los ácidos fenólicos
(caféico, isoferúlico, cinámico y benzoico) (Arvouet-Grand, 1994), además de ser
tóxicos para las levaduras (Bariliak, 1996), inhiben la actividad enzimática de la
hialuronidasa (Miyataka, 1997). Adicionalmente, el ácido caféico y la actividad de
dihidrofolato reductasa, podrían explicar la similitud entre algunos de sus efectos y
los de algunos antiinflamatorios no esteroideos (Strehl, 1994, Farré, 2004).
Por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas se analizaron el
extracto etanólico de propóleo y el extracto metanólico de flores de C. citrinus,
encontrando varios compuestos que estaban presentes en ambos extractos.
Estos fueron eucaliptol, metil éster del ácido 3-acetoxi-3-hidroxipropiónico, p-
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91
ment-1-en-8-ol, étil ester del ácido dodecanoico, 1-[4-(4-dimetilamino)
bencilaminofenil]etanona, metil éster del ácido hexadecanoico, ácido
hexadecanoico, metil éster del ácido 7,10,13-hexadecatrienoico.
El eucaliptol (1,8-cineol) que fue el componente mayoritario del extracto
metanólico de flores de C. citrinus, se sabe que constituye entre el 70 y el 85% del
aceite esencial del eucalipto el cual ha mostrado ser efectivo en el control de la
población de ácaros en las colonias de A. mellifera. El eucaliptol se encuentra
presente en otros aceites de plantas y se usa como comúnmente como
descongestionante y expectorante en infecciones respiratorias del tracto superior y
como ingrediente de algunos enjuagues bucales y preparados dentales como un
solvente endodóntico. En medicina veterinaria es usado de manera tópica por su
indicada actividad antibacteriana (RE2, RE3).
El p-ment-1-en-8-ol y el ácido hexadecanoico son usados en preparaciones
industriales o farmacéuticas, entre otros usos importantes (RE4, RE7).
En el año 2009, Jazet et al. trabajando con plantas de Camerún, encontraron que
monoterpenos oxigenados fueron los componentes predominantes del aceite
esencial de C. rigidus, mientras que en el aceite esencial de C. citrinus y sus
fracciones hubo tres compuestos principales, 1,8-cineol (73,8 %), α-pineno (16,3
%) y α-terpineol (4,8 %). 1,8-cineol y α-pineno fueron igualmente los componentes
principales en dos de las fracciones evaluadas, aunque estaban ausentes en otras
también estudiadas (Jazet et al., 2009).
En un estudio realizado en 2009 por Silva et al. en Brasil, encontraron también que
los aceites esenciales de Callistemon están compuestos en gran parte por
monoterpenoides oxigenados (Silva, 2009). El aceite esencial de C. viminalis y C.
citrinus se caracterizó por una gran cantidad de 1, 8-cineol (65,0 y el 77.0 %
respectivamente), un compuesto conocido por tener un pronunciado potencial
antimicrobiano y que fue encontrado también por Jazet como uno de los
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componentes mayoritarios. Además de la acción insecticida, este compuesto
también presenta actividad antiinflamatoria que está asociada a su capacidad para
inhibir la vía de la ciclooxigenasa, previniendo la biosíntesis de prostaglandinas.
Los compuestos del tipo del α-pineno reportados por Jazet, parecen ser capaces
de desintegrar la integridad celular, y causa inhibición de los procesos de
respiración y transporte de iones. Cerqueira et al. estudiaron el aceite esencial de
Myrcia nicaeensis (Myrtaceae) que presenta 87,3 % de α-pineno, compuesto
reportado por Jazet, y mostró fuerte actividad contra S. aureus, S. aureus
resistente a meticilina y C. albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus
fumigatus, Microsporum canis y Trichophyton rubrum (Jazet et al., 2009).
Los extractos de Callistemon probados en Australia exhibieron actividad contra
Bacillus cereus. Estos extractos también mostraron buena actividad antibacteriana
hacia bacterias Gram-negativas (Cock, 2008).
Aun cuando se han logrado importantes avances en la investigación acerca del
propóleo y plantas relacionadas en cuanto a su actividad biológica frente a
hongos, es recomendable ampliar los estudios enfocados a la caracterización de
estos productos, incluyendo la identificación de los principios activos, y determinar
su mecanismo de acción, así como su efecto en otros hongos patógenos.
Además, es importante recordar que las pruebas in vitro no reflejan las
condiciones reales encontradas en infecciones clínicas, si bien son de utilidad
para poder realizar posteriormente estudios in vivo, por lo que son necesarios
estudios adicionales con modelos animales para evaluar su efecto potencial in
vivo.
Cabe mencionar que existen reportes de diversos países sobre las alteraciones
celulares producidas por el extracto de propóleo en las levaduras mencionadas,
pero del daño producido por los extractos herbales empleados en este trabajo no
se encontraron en la literatura científica referencias que nos pudieran servir de
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comparación, por lo que se considera que se ha realizado un aporte importante en
el área con el trabajo realizado en este proyecto.
RReeccoommeennddaacciioonneess
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9. RECOMENDACIONES
Es recomendable ampliar los estudios enfocados a la caracterización del propóleo
y plantas relacionadas, incluyendo la identificación de los principios activos.
Determinar su mecanismo de acción sobre la célula micótica, así como su efecto
sobre otros hongos patógenos.
Debe recordarse que las pruebas in vitro son de utilidad para realizar
posteriormente estudios in vivo, pero no reflejan las condiciones reales
encontradas en infecciones clínicas, por lo que son necesarios estudios
adicionales con modelos animales para evaluar su efecto potencial in vivo.
CCoonncclluussiioonneess
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10. CONCLUSIONES En el presente trabajo se evaluó la actividad antifúngica de once extractos, dos de
los cuales fueron obtenidos a partir de propóleo de la abeja Apis mellifera,
recolectado en el apiario de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, UNAM,
y de tres de las plantas que son visitadas por las abejas para recolectar resinas,
néctar o polen dentro de la misma Facultad. Estas fueron Ricinus communis L,
Eucalyptus camaldulensis Dehnhartdt y Callistemon citrinus Stapf.
Se emplearon dos cepas de hongos levaduriformes, Candida albicans (ATCC
10231) y Cryptococcus neoformans y seis cepas de hongos filamentosos,
Aspergillus niger, A. flavus (ATCC 204304), Fusarium moniliforme, Fusarium
sporotrichum (ATCC NRLL3299), Rhizoctonia solani y Trichophyton
mentagrophytes.
Se estandarizaron y desarrollaron las pruebas de sensibilidad a antifúngicos,
encontrando que ninguno de los extractos preparados a partir de flores de E.
camaldulensis presentó actividad frente a ninguno de los hongos probados.
Los dos extractos de propóleo fueron activos frente a cuatro de las seis cepas
probadas, mientras que el C. citrinus presentó actividad frente a dos hongos con
el extracto hexánico, tres con el extracto de acetato de etilo y cuatro con el
extracto metanólico.
R. communis fue activo frente a un hongo con el extracto hexánico, dos con el
extracto de acetato de etilo y tres con el extracto metanólico.
Al determinar la concentración inhibitoria mínima y la concentración fungicida
mínima de los extractos se encontró que estas oscilan entre los 0.25 y 2.0 mg/mL
para todos los extractos frente a las dos levaduras evaluadas.
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En el caso de los hongos filamentosos hubo mayor variación, ya que para R.
solani se encontró una CIM de 1.0 mg/mL para las fracciones hexánica y etanólica
de propóleo, mientras que para el extracto hexánico de flores de R. communis y
los tres extractos de flores de C. citrinus, se observó reducción de crecimiento,
pero se considera que las CIM son mayores a 3.0 mg/mL que fue la máxima
concentración probada, ya que no se alcanzó la inhibición completa del
crecimiento.
De igual forma, la CIM del extracto hexánico de flores de R. communis frente a F.
moniliforme se considera mayor a 3.0 mg/mL por presentar reducción, pero no
inhibición total del crecimiento, mientras que para T. mentagrophytes se encontró
una CIM de 0.25 mg/mL para las fracciones hexánica y etanólica de propóleo y de
1.5 mg/mL para el extracto metanólico de flores de C. citrinus.
Tras evaluar los resultados obtenidos con las pruebas de sensibilidad antifúngica,
se seleccionó el extracto metanólico de flores de C. citrinus para realizar las
pruebas de comparación de la composición química con el propóleo y la
observación de alteraciones morfológicas ocasionadas por dichos extractos a las
células fúngicas. Se hizo el estudio comparativo con el extracto etanólico del
propóleo.
Se identificaron algunos de los componentes del propóleo mediante
cromatografía líquida de alta resolución, correspondientes a 1 isoflavona, 5
flavonas, 1 quercetina, 6 derivados del ácido cinámico y 1 derivado del ácido
caféico.
Para determinar si el EEP contiene el (los) mismo(s) compuesto(s) activo(s) que el
extracto metanólico de flores de C. citrinus, se analizaron ambos extractos en un
cromatógrafo de gases acoplado a u espectrómetro de masas y se encontró
coincidencia en 8 compuestos: eucaliptol, metil éster del ácido 3-acetoxi-3-
hidroxipropiónico, p-ment-1-en-8-ol, etil éster del ácido dodecanoico, ethanone,
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(1-[4-[4-(dimetilamino) benzilienamino)fenil]-), metil éster del ácido
hexadecanoico, ácido hexadecanoico, metil éster del ácido 7,10,13-
hexadecatrienoico.
Con las observaciones de microscopía óptica y electrónica, se observó la
presencia de cambios en la morfología de C. albicans y de C. neoformans,
presentando degeneración estructural después de la exposición a los extractos.
Con el análisis de los datos obtenidos, se corrobora la relación existente entre la
composición del propóleo y la de las plantas de las cuales recolectan las abejas
algunos ingredientes para su preparación, por lo que el espectro antimicrobiano
de cada propóleo varía dependiendo de la situación geográfica y la vegetación
circundante, pero además se plantea la posibilidad de emplear dichas plantas
como fuentes de metabolitos secundarios con actividad antimicótica.
AAnneexxooss
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11. ANEXOS
ANEXO I
Identificación de especies vegetales en el herbario de la FES Iztacala.
Especie 1:
Familia: Euphorbiaceae
Nombre científico: Ricinus communis L.
Etimología: Ricinus = garrapata, por la apariencia de las semillas. Communis, del
latín communis = muy común o corriente.
Nombre común: Higuerilla, Ricino, higuera del diablo.
Lugar de origen: Nativo de África tropical, y hoy día naturalizado en los climas
templados de todo el mundo.
Clima: templado
Ciclo biológico: perenne
Especie 2:
Familia: Myrtaceae
Nombre científico: Callistemon citrinus Stapf
Nombre común: Cepillo, Limpiatubos, Árbol del cepillo, Escobillón rojo,
Limpiabotellas
Lugar de origen: Australia, Nueva Gales del Sur y Victoria
Clima: Templado
Ciclo biológico: Perenne
Especie 3:
Familia: Myrtaceae
Nombre científico: Eucalyptus camaldulensis Dehnhartdt
Nombre común: Eucalipto
Lugar de origen: Australia y Tasmania
Clima: Templado
Ciclo biológico: Perenne
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ANEXO II
CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS
Se presentan espectros de masas obtenidos para los compuestos volátiles
presentes tanto en el extracto etanólico de propóleo como en el extracto
metanólico de flores de C. citrinus.
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FIGURA 52: Identificación del eucaliptol a partir de su espectro de masas.
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FIGURA 53: Identificación del metil éster del ácido 3-acetoxi-3-hidroxipropiónico a partir de su espectro de masas.
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FIGURA 54: Identificación del p-ment-1-en-8-ol a partir de su espectro de masas.
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FIGURA 55: Identificación del 1-[4-(4-dimetilamino)bencilaminofenil]etanona a partir de su espectro de masas.
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FIGURA 56: Identificación del metil éster del ácido hexadecanoico a partir de su espectro de masas.
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FIGURA 57: Identificación del ácido hexadecanoico a partir de su espectro de masas.
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FIGURA 58: Identificación del metil éster del ácido 7,10,13-hexadecatrienoico a partir de su espectro de masas.
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ANEXO III
PROTOCOLO DE MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN PARA LEVADURAS
(Shepherd, 1987; Jabra-Rizk, 1999.)
FIJACIÓN: Las células son prefijadas en una mezcla de paraformaldehído al 3%, glutaraldehído al 1%, MgCl2 1Mm, CaCl2 1mM, dimetilsulfóxido (DMSO) al 0.1%, 0.1% de Azul de Alcian en buffer de fosfatos (PBS) 01.M, pH 7.2, por 3 hrs a
temperatura ambiente. Se lavan las células 3 veces en el mismo buffer por 10 min.
POST-FIJACIÓN: Las muestras se incuban por 3 hrs a temperatura ambiente en una solución de OsO4 al 1%, K2Cr2O7 al 1%, NaCl al 0.85% (solución salina
fisiológica, SSF) y DMSO al 0.1% en el mismo buffer. Posteriormente se realizan 3 lavados por 10 min en SSF.
DESHIDRATACIÓN: Las células se deshidratan en una serie de etanol con acetato de uranilo. Etanol: 10, 25, 50, 70 % 30 min c/u, 90 % 1 hr, 100 % 1 hr (3
veces). INFLITRACIÓN:
A) Óxido de propileno: Etanol
3:1 24 hrs
2:1 12 hrs 1:1 12 hrs
B) Óxido de propileno: resina epóxica 3:1 1 día 1:1 1 día
1:3 1 día Epón 12 hrs
INCLUSIÓN en resina epóxica 100 % POLIMERIZACIÓN: 12 hrs 60 ºC
Posteriormente las muestras son cortadas con un micrótomo y posteñidas con acetato de uranilo al 2% en solución acuosa.
Realizar la observación en un microscopio electrónico de transmisión.
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ANEXO IV
PASANTÍA
Unidad de Biotecnología y Prototipos
UBIPRO
En cumplimiento de la Pasantía requerida como parte del plan de estudios del
Programa de Doctorado en Ciencias Naturales para el Desarrollo, se realizó una
estancia en laboratorio de Fitoquímica de la Unidad de Biotecnología y Prototipos
(UBIPRO) de la Facultad de Estudios Superiores Iztacala, UNAM, la cual se
encuentra ubicada en la Av. de los Barrios No. 1, Los Reyes Iztacala,
Tlalnepantla, Estado de México, México, bajo la asesoría de los Doctores José
Guillermo Ávila Ácevedo, María Margarita Canales Martínez y Claudia Tzasná
Hernández Delgado.
La UBIPRO forma parte de las obras financiadas por el Programa UNAM-Banco
Interamericano de Desarrollo, y se ha constituido como un centro de investigación
de alto nivel dentro de la UNAM. Su objeto de estudio es el proceso de deterioro
ambiental en las zonas áridas, con la finalidad de entenderlo desde varias
perspectivas y sentar las bases para revertirlo y lograr la restauración de los
sistemas alterados, así como fomentar la conservación y el manejo adecuado de
los recursos naturales. La existencia de este objeto de estudio común, ha
permitido la formación de un grupo multidisciplinario donde se engloban las
especialidades de Fisiología Vegetal, Edafología, Cultivo de Tejidos, Evaluación
de Recursos Naturales, Fitoquímica, Ecología, Bioquímica Molecular,
Microbiología y Biogeoquímica. Así mismo, la existencia de un proyecto único,
favorece un constante intercambio de ideas entre varias disciplinas, redundando
en un avance más profundo en el estudio, así como, un uso más eficiente del los
recursos de infraestructura y tiempo.
El buen funcionamiento de la estructura organizativa de la UBIPRO se refleja en
los altos estándares de productividad alcanzados, incluyendo la formación de
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recursos humanos y la productividad científica. Estos parámetros indican una
intensa labor de los investigadores de la Unidad en la incorporación de alumnos
de Licenciatura, Maestría y Doctorado, así como un proceso de maduración del
grupo de trabajo y del proyecto. Por otro lado, para el apoyo de los estudiantes en
todos los niveles y para el desarrollo de los proyectos de investigación, en la
UBIPRO, se cumplen funciones de obtención de recursos financieros, explorando
fuentes externas, tales como DGAPA (Dirección General de Asuntos del Personal
Académico de la UNAM), CONACYT (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología),
instancias nacionales e internacionales, y obtención de recursos extraordinarios a
través de la prestación de servicios a entidades públicas y privadas. Existe
además un Consejo de Asesores Académicos externos, que evalúan el desarrollo
del proyecto y el desempeño individual de los académicos adscritos a la unidad.
Finalmente, la circunscripción del trabajo de investigación en un proyecto único no
se contrapone con la libertad de cátedra y de investigación de los académicos, ya
que, la magnitud de las instituciones y la prioridad e importancia nacional de los
proyectos elegidos, siempre será de mayor trascendencia y se ubicará por encima
de los intereses, aptitudes y vocación individuales (RE1).
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111
BBiibblliiooggrraaffííaa
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112
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