Doctorado en Ciencias Naturales para el Desarrollo
151
Instituto Tecnológico de Costa Rica Universidad Nacional Universidad Estatal a Distancia Doctorado en Ciencias Naturales para el Desarrollo Énfasis en Sistemas de Producción Agrícola MECANISMO DE RESISTENCIA DE PASPALUM PANICULATUM L. (POACEAE) AL HERBICIDA GLIFOSATO Doctorante: Fernando Ramírez Muñoz Instituto Tecnológico de Costa Rica, Cartago Diciembre 2017
Transcript of Doctorado en Ciencias Naturales para el Desarrollo
Instituto Tecnológico de Costa Rica
Universidad Nacional
Universidad Estatal a Distancia
Doctorado en Ciencias Naturales para el Desarrollo
Énfasis en Sistemas de Producción Agrícola
MECANISMO DE RESISTENCIA DE PASPALUM PANICULATUM L.
(POACEAE) AL HERBICIDA GLIFOSATO
Doctorante:
Fernando Ramírez Muñoz
Instituto Tecnológico de Costa Rica, Cartago
Diciembre 2017
Instituto Tecnológico de Costa Rica
Universidad Nacional
Universidad Estatal a Distancia
Doctorado en Ciencias Naturales para el Desarrollo
Énfasis en Sistemas de Producción Agrícola
MECANISMO DE RESISTENCIA DE PASPALUM PANICULATUM L. (POACEAE) AL HERBICIDA GLIFOSATO
Tesis sometida a consideración del tribunal evaluador como requisito para optar al grado de Doctor en Ciencias Naturales para el Desarrollo,
con énfasis en Sistemas de Producción Agrícola
Sustentante: Fernando Ramírez Muñoz
Tutor: Dr. Bernal E. Valverde, Ph. D.
Asesores:
Dra. Martha Orozco A., Ph.D. Dr. Franklin Herrera M., Ph. D.
Instituto Tecnológico de Costa Rica, Cartago
Diciembre 2017
Instituto Tecnológico de Costa Rica Universidad Nacional
Universidad Estatal a Distancia
Tesis sometida a consideración del tribunal evaluador como requisito para optar al grado de Doctor en Ciencias Naturales para el Desarrollo,
con énfasis en Sistemas de Producción Agrícola
Fernando Ramírez Muñoz
Sustentante
Tribunal examinador:
Bernal E. Valverde, Ph. D. ____________________________ Director de Tesis Martha Orozco Aceves, Ph. D. ____________________________ Asesora de Tesis Franklin Herrera Murillo, Ph. D. ____________________________ Asesor de Tesis Carmen Madriz Quirós, Ph. D. ____________________________ Posgrados TEC
Freddy Araya Rodríguez, Ph. D. ____________________________ Coordinador DOCINADE
Diciembre 2017
i
DEDICATORIA
Dedico esta tesis a mi familia, a toda mi gran familia, que siempre me apoyó y me alentó a
seguir adelante. Especialmente a mi esposa Ivannia y mis hijas María Fernanda y Daniela,
que tuvieron que sacrificar las muchas horas, fines de semanas y periodos de vacaciones
que su papá le dedicó al doctorado.
ii
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a la Universidad Nacional, y especialmente al Instituto Regional de Estudios en
Sustancias Tóxicas, por el gran apoyo que me dio en tiempo, recursos y valores humanos,
para poder realizar mis estudios de pos grado.
Agradezco a mi mentor, amigo y director de tesis, Dr. Bernal Valverde, por su dedicación,
valiosísima contribución científica, su tiempo y recursos aportados por su empresa
IdeaTropical, desde que se gestó el tema de esta investigación.
A la Dra. Nilda R. Burgos y a su equipo de investigación del “Department of Soil, Crops &
Environmental Sciences” de la Universidad de Arkansas en Fayetteville y del Laboratorio
de Fisiología de Malezas: Dra. Reio Salas, Dr. Leopoldo Estorninos, Dr. Paul Tseng, Dr.
Vijay Sing, Dra. Gulab Rangani, M. Sc. Shilpa Sing, M. Sc. Sirichai Sathuwijarn, M. Sc.
Hussain Tahir, Dr. Muhammad Nadeen, M. Sc. Seth Bernard, por su gran amistad,
grandes enseñanzas no solo en el medio científico, sino en el trabajo en grupo, solidaridad
y convivencia desinteresada. Al Dr. Srinivas Jayanthi y Dr. Thallapuranam Krishnaswamy
Suresh Kumar, del Departamento de Química y Bioquímica de la Universidad de
Arkansas, por sus grandes aportes en algunos pasos de esta investigación.
A los señores Dra. Ana María Botero Coy, Dr. Félix Hernández y Dr. Neus Fabregat
Cabello, del Instituto Universitario de Plaguicidas y Aguas (IUPA) de la Universidad Jaume
I, Castellón, España, por sus aportes en la metodología y análisis de metabolitos de
glifosato.
A la Dra. Sayra Munguía por sus consejos, amistad y ayuda inclaudicable en todo este
proceso, le estaré eternamente agradecido.
Para el Ing. Alejandro Vargas por su gran ayuda y apoyo en algunos análisis de esta
investigación.
A mis asesores, Dra. Martha Orozco, compañera invaluable de muchas horas en la
academia; al Dr. Franklin Herrera, una gran persona y profesional, un agradecimiento muy
especial por su dedicación desinteresada.
A todas las personas, estudiantes, productores, colegas, amigos, familiares y compañeros
que de alguna u otra forma, me ayudaron en toda esta gran aventura que fue el doctorado.
Mi gratitud eterna.
iii
Indice General
Índice de cuadros ....................................................................................................................................... v
Índice de figuras ........................................................................................................................................ vi
Índice de anexos ....................................................................................................................................... vii
Lista de abreviaturas y siglas ................................................................................................................ viii
Resumen ...................................................................................................................................................... 1
Abstract ........................................................................................................................................................ 3
1. Introducción ............................................................................................................................................. 5
2. Objetivos .................................................................................................................................................. 7
2.1 Objetivo general ............................................................................................................................... 7
2.2 Objetivos específicos ...................................................................................................................... 7
3. Marco teórico .......................................................................................................................................... 7
3.1 La maleza Paspalum paniculatum L. ............................................................................................ 7
3.2 El herbicida glifosato ..................................................................................................................... 10
3.3 Modo de acción del glifosato ........................................................................................................ 15
3.3.1 Absorción ................................................................................................................................. 15
3.3.2 Transporte ............................................................................................................................... 16
3.3.3 Metabolismo ............................................................................................................................ 18
3.3.4 Exudación ................................................................................................................................ 19
3.3.5 Mecanismo de acción ............................................................................................................ 20
3.4 Resistencia a herbicidas ............................................................................................................... 22
3.5 Evolución de resistencia a herbicidas ........................................................................................ 24
3.6 Resistencia de malezas al glifosato ............................................................................................ 26
3.7 Mecanismos de resistencia al glifosato ...................................................................................... 32
3.7.1 Dependientes del sitio de acción ......................................................................................... 32
3.7.2 Independientes del sitio de acción ....................................................................................... 39
4. Materiales y Métodos ......................................................................................................................... 42
4.1 Diagnóstico del uso de glifosato ................................................................................................. 42
4.2 Respuesta de biotipos de P. paniculatum al glifosato ............................................................. 43
4.2.1Origen de la semilla ................................................................................................................. 43
4.2.2 Respuesta a dosis crecientes de glifosato ......................................................................... 45
4.3 Determinación de resistencia fuera de sitio activo ................................................................... 47
iv
4.3.1 Distribución del glifosato radio marcado en la planta ....................................................... 47
4.3.2 Metabolismo de glifosato ....................................................................................................... 52
4.4 Determinación de la posible resistencia en sitio activo ........................................................... 55
4.4.1 Medición in vivo de la acumulación de shikimato .............................................................. 55
4.4.2 Determinación de la concentración y actividad de la EPSPS ......................................... 57
4.4.3 Determinación de mutaciones en la EPSPS ...................................................................... 59
5. Resultados y Discusión ...................................................................................................................... 63
5.1 Diagnóstico del uso de glifosato .................................................................................................. 63
5.1.1 Uso de glifosato en el cultivo de pejibaye........................................................................... 63
5.1.2 Uso de glifosato en el cultivo de cítricos ............................................................................. 65
5.1.3 Uso de glifosato en el cultivo de palma africana ............................................................... 66
5.2 Respuesta de P. paniculatum al glifosato .................................................................................. 69
5.3 Distribución del glifosato radio marcado en P. paniculatum ................................................... 77
5.3.1 Absorción ................................................................................................................................. 77
5.3.2 Transporte de glifosato .......................................................................................................... 79
5.3.3 Exudación ................................................................................................................................ 84
5.4 Metabolización ............................................................................................................................... 86
5.5 Concentración de ácido shikímico .............................................................................................. 88
5.5.1 Concentración de shikimato en discos provenientes de plantas sin aplicar ................. 88
5.5.2 Concentración de shikimato en discos provenientes de plantas aplicadas .................. 91
5.6 Número de copias del gen de la EPSPS ................................................................................... 93
5.7 Actividad de la EPSPS .................................................................................................................. 96
5.8 Mutaciones ...................................................................................................................................... 96
6. Conclusiones ...................................................................................................................................... 101
7. Recomendaciones ............................................................................................................................. 103
8. Literatura citada .................................................................................................................................. 105
9. Anexos ................................................................................................................................................ 129
Índice de cuadros
Número Página
1 Especies de malezas resistentes a glifosato a diciembre 2017......................................................27
2 Dosis de glifosato para determinar la respuesta en biotipos selectos de P. paniculatum............................................................................................................................46
3 Herbicidas usados en el cultivo de pejibaye para palmito. 2011-12 ...............................................64
4 Herbicidas usados en el cultivo de cítricos. 2011-12 ......................................................................65
5 Herbicidas usados en el cultivo de palma africana. 2011-12 ..........................................................67
6 Caracterización del manejo de malezas en fincas con cultivos perennes......................................68
7 Parámetros que describen la respuesta al glifosato de biotipos R y S de P. paniculatum. Edad I. 21 dda ..................................................................................................70
8 Parámetros que describen la respuesta al glifosato de biotipos R y S de P. paniculatum. Edad II. 21 dda .................................................................................................71
9 Índice de Resistencia (IR) al glifosato de biotipos de P. paniculatum provenientes de varias localidades de Costa Rica. 2012-2014 ......................................................75
10 Glifosato radio marcado absorbido en diferentes tiempos por biotipos R y S. Edad I....................................................................................................................78
11 Absorción en diferentes tiempos de glifosato radio marcado por biotipo R y S. Edad II ................................................................................................................................78
12 Porcentaje del glifosato radio marcado absorbido presente en plantas de biotipos R y S ...........................................................................................................................79
13 Porcentaje de glifosato radio marcado exudado por las raíces en biotipos R y S en varios tiempos de medición. Edad I .........................................................................................85
14 Porcentaje de glifosato radio marcado exudado por las raíces en biotipos R y S en varios tiempos de medición. Edad II ........................................................................................86
15 Concentración de glifosato y AMPA en biotipos R aplicados y sin aplicar con glifosato y porcentajes de recuperación de las sustancias medidas......................................87
16 Valores de shikimato (μg mL-1) en tejido foliar de plantas R y S aplicadas con concentraciones crecientes de glifosato ................................................................................89
17 Cantidad de proteína extraída de 20 g de tejido de P. paniculatum (μg mL-1) de biotipos R y S al glifosato.........................................................................................................94
v
Índice de figuras
Número Página
1 Planta (A), lígula (B), panícula (C) y espiguillas (D) de P. paniculatum ............................................8
2 Estructura química de las sales del ácido glifosato ........................................................................13
3 Estructura química del glifosato (C3H8NO5P).................................................................................18
4 Sitio de inhibición del glifosato en la ruta metabólica del shikimato ...............................................21
5 Origen geográfico de biotipos de P. paniculatum............................................................................44
6 Plantas de P. paniculatum de edad I (A) y edad II (B) usadas en las pruebas con glifosato radiomarcado.............................................................................................................48
7 Aplicación de glifosato radiomarcado a plantas de P. paniculatum ................................................49
8 Partes de la planta usadas para determinar transporte de glifosato ..............................................51
9 Procedimiento para la extracción de glifosato y AMPA...................................................................53
10 Respuesta a dosis crecientes de glifosato de biotipos R y S para la edad I.................................72
11 Respuesta a dosis crecientes de glifosato de biotipos R y S para la edad II................................72
12 Respuesta de P. paniculatum a dosis crecientes de glifosato (kg e.a. ha-1).................................73
13 Porcentaje de daño visual de biotipos R (D, L, B) y S (H, T, C) 15 dda con dosis crecientes de glifosato. Edad I..........................................................................74
14 Plantas de P. paniculatum aplicadas con glifosato radio marcado antes (A) y después de revelarlas (B) como fosforimágen. Edad I ..............................................................83
15 Plantas de P. paniculatum aplicadas con glifosato radio marcado antes (A) y después de revelarlas (B) como fosforimágen. Edad II .............................................................84
16 Valores de absorbancia a determinadas concentraciones de shikimato ......................................88
17 Concentración de shikimato en biotipos R (A) y en biotipos S (B) en varios tiempos de medición .....................................................................................................................91
18 Imágenes de la electroforesis enzimática de la EPSPS de P. paniculatum en gel de sulfato poliacrilamida dodecil sodio..........................................................................................95
19 Secuencia de los aminoácidos en la 5´EPS 3´PS y alineamiento entre biotipos de P. paniculatum Resistentes y Susceptibles al glifosato.................................................................97
20 Modelos 3D de aminoácidos que se enlazan directamente con S3P. ..........................................99
vi
Índice de anexos Pág.
Anexo I: Guía de entrevista. Diagnóstico de uso de plaguicidas en cultivos perennes ......................129
Anexo II. Gradiente y condiciones para la extracción de metabolitos.................................................132
Cuadro A1. Gradiente utilizada para la cromatografía de metabolitos................................................132
Cuadro A2. Condiciones MS/MS para los analitos..............................................................................132
Anexo III. Condiciones del experimento para la extracción de EPSPS ..............................................132
Anexo IV. Valores de las DE50 de biotipos de P. paniculatum .............................................................134
Cuadro A3. Resumen DE50 (referida a daño medio) de glifosato en biotiposR y S de P. paniculatum de dos edades (+/- 95%) a los 21 dda .........................................................134
Anexo V: Transporte de glifosato en la planta.....................................................................................135
Cuadro A4. Cantidad porcentual de glifosato marcado presente en la parteapical de la hoja tratada (parte 1) de la planta a las 24, 48, 72 y 96 hda. Edad I ...............................135
Cuadro A5. Cantidad porcentual de glifosato marcado presente en la parteapical de la hoja tratada (parte 1) de la planta a las 24, 48 y 72 hda. Edad II ....................................135
Cuadro A6. Cantidad porcentual de glifosato marcado presente en la parteinferior de la hoja tratada (parte 2) en diferentes tiempos de medición. Edad I ..................................135
Cuadro A7. Cantidad porcentual de glifosato marcado presente en la parteinferior de la hoja tratada (parte 2) en diferentes tiepos de medición. Edad II ....................................136
Cuadro A8. Cantidad porcentual de glifosato marcado presente en la partesuperior de la planta (parte 3) a las 24, 48, 72 y 96 hda. Edad I ........................................................136
Cuadro A9. Cantidad porcentual de glifosato marcado presente en la partesuperior de la planta (parte 3) a las 24, 48 y 72 hda. Edad II .............................................................136
Cuadro A10. Cantidad porcentual de glifosato marcado presenteen el culmo de la planta (parte 4) a las 24, 48, 72 y 96 hda. Edad I ...................................................137
Cuadro A11. Cantidad porcentual de glifosato marcado presenteen el culmo de la planta (parte 4) a las 24, 48 y 72 hda. Edad II ........................................................137
Cuadro A12. Cantidad porcentual de glifosato marcado presenteen la raíz de la planta (parte 5) a las 24, 48, 72 y 96 hda. Edad I.......................................................137
Cuadro A13. Cantidad porcentual de glifosato marcado presenteen la raíz de la planta (parte 5) a las 24, 48 y 72 hda. Edad II............................................................138
Anexo VI. Cromatogramas de extracción de metabolitos ...................................................................139
Figura A1. Cromatogramas seleccionados de los biotipos B, D y L aplicados....................................139
Figura A2. Cromatogramas para los biotipos B, D y L no aplicados ...................................................140
vii
viii
Lista de abreviaturas y siglas AMPA ácido aminometilfosfónico dda días después de aplicado ddt días después del tratamiento DE50 = (ED50) dosis efectiva media DL50 dosis letal media e.a. equivalente ácido EPSPS 5´enolpiruvil shikimato 3´fosfato sintetasa Glifosato C
14 glifosato radiomarcado
hda horas después de aplicado i.a. ingrediente activo IC50 concentración inhibitoria media IR índice de resistencia Kg i.a. ha
-1 kilogramos de ingrediente activo por hectárea
LC-MS/MS Cromatografía Líquida con Detector Masas/Masas LSS Liquid Scintillation Spectrometer (Espectrómetro de Centelleo Líquido) p.c. producto comercial PEP fosfoenol piruvato ppEPSPS EPSPS de Paspalum paniculatum ppm partes por millón QC Quality Control (Prueba de Control de Calidad) R resistente S susceptible S3P shikimato-3-fosfato TIPS doble mutación T102I + P106S WSSA Weed Science Society of America
1
Resumen
Paspalum paniculatum es un pasto perenne originario de América del Sur. Como
maleza, es de importancia económica sobre todo en cultivos perennes donde se
utiliza glifosato para su control. El glifosato es un herbicida sistémico, de amplio
espectro y su actividad se debe a la inhibición de la enzima 5-enolpiruvilshikimato-
3-fosfato sintetasa (EPSPS), responsable de la síntesis de aminoácidos
aromáticos y otras sustancias importantes en plantas. A raíz de algunos reportes
de dificultades en el control de malezas con glifosato en el cultivo de pejibaye, se
determinó que había resistencia al herbicida pero sin conocer el mecanismo de
resistencia. Por lo tanto, el objetivo principal de este estudio fue caracterizar los
mecanismos de resistencia al glifosato en biotipos de P. paniculatum. Se realizó
un diagnóstico de uso de herbicidas en cultivos perennes, y mostró que el
glifosato es el plaguicida más utilizado en pejibaye para palmito (93% del total de
herbicidas y 91% del total de plaguicidas, con 2,74 kg i.a. ha-1), en cítricos (51% y
78% respectivamente con 2,68 kg i.a. ha-1) y en palma aceitera (64% y 66%
respectivamente con 4,24 kg i.a. ha-1). En algunos campos de cultivo de pejibaye
para palmito y banano de la región caribeña de Costa Rica, donde se aplicó
glifosato varias veces al año a su dosis recomendada (910 g e.a. ha-1) y por más
de una década, se observó un control deficiente de esta maleza. Entre los años
2012 y 2014 se realizaron bioensayos en invernadero de dosis respuesta que
confirmaron la resistencia al glifosato. Plantas de biotipos R de 5 hojas sin hijos
(edad I) eran de tres a ocho veces menos sensibles al glifosato que plantas de
biotipos susceptibles (S); plantas con uno a tres hijos (edad II) eran dos a cinco
veces menos sensibles que los biotipos S. La absorción, transporte (a diferentes
partes de la planta) y exudación, medida con glifosato C14 (radio marcado) y por
medio de fosforimágenes, fueron similares, para ambas edades, tanto en biotipos
resistentes (R) como S. El glifosato y el AMPA, su metabolito principal, se
determinaron por LC-MS/MS en plantas R aplicadas con 1,0 kg e.a. ha-1 y en
2
plantas sin tratar. No se detectó AMPA en ninguna muestra de tejidos de plantas
tratadas, pero sí se encontró glifosato en niveles altos (25 a 33 ppm), lo que indica
que el metabolismo diferencial del herbicida no confiere resistencia en estos
biotipos de P. paniculatum. Plantas de biotipos S y R se trataron con glifosato
(0,72 kg e.a. ha-1) y se midió acumulación de ácido shikímico a las 6, 24, 48, 72,
96 y 144 horas después de la aplicación (hda). Los biotipos S acumularon entre
cinco y ocho veces más ácido shikímico que los biotipos R a las 6 y 144 hda;
también se trataron discos con diferentes concentraciones de glifosato, se
midieron a las 24 hda y resultó que los biotipos S acumularon más shikimato que
los biotipos R a dosis bajas de 15,6 μM (7 veces), 31 μM (10 veces), 63 μM (5
veces), 125 μM (3 veces), que a dosis altas 250 y 500 μM (2 veces), lo que
sugiere que el mecanismo de resistencia se debe a una alteración en el sitio
enzimático. Tanto los biotipos R como S tenían valores bajos y similares de
EPSPS, por lo que se concluye que la amplificación genética no es el mecanismo
de resistencia en esta especie. Para determinar si además existía una
sobreproducción (número de copias del gen) o una sobreactividad de la enzima,
se midió la concentración de EPSPS y su actividad enzimática. Las cantidades de
proteína extraídas no fueron suficientes para completar los experimentos de
actividad de EPSPS. Por medio de la secuenciación del gen de la EPSPS se
encontró una sustitución de aminoácidos en dos posiciones. La sustitución P106L
dio lugar a cambios en la distancia entre aminoácidos y provocó que la enzima
adoptara una conformación condensada que le imposibilita la unión con el
glifosato y el PEP; la otra sustitución (V332A) restaura parcialmente la
conformación del sitio de unión del shikimato-3-fosfato, afectada por la mutación
P106L, lo que sugiere que la doble mutación en el gen EPSPS es la responsable de
la resistencia a glifosato en P. paniculatum. Se concluye que la resistencia a
glifosato en biotipos de P. paniculatum de Costa Rica se debe a una doble
mutación en el sitio activo.
3
Abstract
Paspalum paniculatum is a perennial herbaceous grass species originating from
South America. It is of economic importance as a weed in plantation crops where
glyphosate is widely used in its control. Glyphosate is a broad spectrum herbicide
and its activity is due to the inhibition of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-
phosphate synthase (EPSPS) responsible for aromatic amino acids and other
important substances synthesis in plants. A diagnosis of herbicides used in
perennial crops showed glyphosate is the most used pesticide in palm heart (91%
of total of pesticides and 93% of total herbicides with 2.74 kg a.i. ha-1), in citrus
(51% and 78% respectively with 2.68 kg a.i. ha-1) and in oil palm (64% and 66%
respectively 4.24 kg a.i. ha-1). Reduced control by glyphosate at its recommended
field rate (910 g a.e. ha-1) has been observed in palm (for hearts) and banana
crops in the Caribbean region of Costa Rica in fields exposed for more than a
decade to multiple applications per year. The main objective of the study was to
characterize glyphosate resistance mechanisms in resistant (R) biotypes.
Greenhouse dose–response bioassays carried out in 2012-2014 confirmed that
putative R plants with 5 leaves and no tillers (stage I) were indeed three to eight
fold less sensitive to glyphosate, and plants with one to three tillers (stage II) were
two to five fold less sensitive than known susceptible (S) biotypes. Glyphosate
absorption, translocation (to different parts of the plant) and exudation measured
with radio labeled C14 glyphosate and phosphor imaging were similar in both R and
S biotypes for both grown stage. Glyphosate and AMPA, its main metabolite, were
determined by LC-MS/MS in R plants sprayed with 1.0 kg a.e. ha-1 and in
untreated controls. AMPA were found in any sample, but glyphosate residues
were found at high levels (25 to 33 ppm) in tissues of treated plants, indicating that
differential metabolism of the herbicide does not confer resistance. Plants from
representative individual S and R biotypes were treated with glyphosate (0.72 kg
a.e. ha-1) and shikimic acid was extracted 6, 24, 48, 72, 96 and 144 h after
4
treatment (hat), The S biotypes accumulated between five and eight times more
shikimic acid than did the R biotypes at 6 and 144 hat; also discs plants were
treated with different glyphosate concentrations and measured 24 hat, S biotypes
accumulate more shikimato than R at low doses 15,6 µM (7 fold), 31 µM (10 fold),
63 µM (5 fold), 125 µM (3 fold) than at high doses 250 and 500 µM (2 fold),
suggesting that the resistance mechanism is an active site type. EPSPS was
extracted in order to measuring protein concentration (gene copy number) and
enzymatic activity. Both resistant and susceptible biotypes had low and similar
EPSPS copy, thus gene amplification is not the resistance mechanism. The protein
extraction quantities were not enough to complete the EPSPS activity experiments.
Sequencing of the EPSPS gene found a double single amino acid substitution at
position P106L that made the enzyme insensitive to glyphosate by assumed a
condensed conformation results in changes in the distance between amino acids,
and the substitution V332A that partially restores the conformation of the binding site
for Shikimate-3-phosphate that was affected by the P106L mutation, suggesting that
mutation on EPSPS gene is the responsible for P. paniculatum resistance to
glyphosate. The conclusion is: resistance in P. paniculatum biotypes of Costa Rica
is due a target site double mutation.
5
1. Introducción
La agricultura convencional intensiva depende de una gran variedad de
plaguicidas químicos sintéticos para controlar las plagas que afectan los cultivos.
Uno de los grupos de plaguicidas de mayor uso en estos sistemas de producción
lo constituyen los herbicidas, y dentro de este grupo, el glifosato representa el de
mayor uso, tanto en el mercado mundial como en el nacional. Su relativo bajo
precio, alta eficacia y disponibilidad en el mercado, amplio espectro de control de
malezas anuales, perennes, herbáceas y leñosas, tanto de hoja angosta como de
hoja ancha, inciden en el amplio uso de glifosato en una gran variedad de cultivos,
sistemas de mínima labranza y zonas no agrícolas. En años recientes, el aumento
en áreas de cultivos transgénicos con resistencia al glifosato, ha hecho que
globalmente su empleo se expanda aún más.
Estas ventajas comparativas del glifosato han estimulado su uso frecuente, lo que
provoca una exposición repetida de las poblaciones de malezas, generando una
presión de selección que conduce al aumento de la frecuencia de individuos
resistentes. Es así como poblaciones que usualmente se controlaban con la dosis
recomendada de glifosato, sobreviven y se reproducen aún siendo expuestas a
esa dosis letal, evolucionando en resistentes. A nivel mundial se han reportado 40
especies de malezas con resistencia comprobada al glifosato, desde que se
informó el primer caso en Australia en 1996 (Heap 2017). Esta rápida evolución de
resistencia al glifosato, es una prueba más de que todo herbicida es vulnerable a
enfrentarla (Shaner et al. 2012).
El glifosato controla las plantas susceptibles penetrando vía foliar y
transportándose hasta los cloroplastos, donde se encuentra su sitio de acción; es
el único herbicida comercial que inhibe una enzima específica dentro de la ruta
metabólica del shikimato, responsable de la síntesis de aminoácidos aromáticos y
la producción de otros importantes metabolitos (Jaworski 1982). Los mecanismos
6
responsables de la resistencia al glifosato en varias especies son diversos y
pueden estar o no relacionadas con su sitio de acción.
En Costa Rica, el glifosato se utiliza en muchos cultivos, incluidos café, banano y
plátano, cítricos, palma aceitera, palmito y en zonas no agrícolas. Es un herbicida
de toxicidad aguda baja para los humanos, sin restricciones de venta, y representa
una importante herramienta en el manejo de malezas en el país. Sin embargo, a
partir de observaciones y comunicaciones personales sobre problemas de control
de malezas con aplicaciones comerciales de glifosato en fincas productoras de
pejibaye para palmito, Valverde (2010), determinó que dos especies de poáceas,
Eleusine indica y Paspalum paniculatum, evolucionaron resistencia a este
herbicida.
En dichas fincas, los productores se han visto obligados a elevar las dosis de
glifosato o a utilizar otros herbicidas de mayor costo o de mayor impacto ambiental
y a la salud, lo cual conlleva un aumento en los costos de mantenimiento del
cultivo sin que se logre un control exitoso de ambas especies.
El conocer los mecanismos de resistencia a herbicidas es importante para
desarrollar estrategias de manejo de malezas en sistemas agrícolas, buscando su
sostenibilidad, tanto para reducir la evolución de resistencia como para manejar
las poblaciones resistentes ya existentes. El mecanismo específico de resistencia
al glifosato de los biotipos resistentes de E. indica y P. paniculatum encontrados
en Costa Rica no se ha dilucidado.
Este trabajo pretendió determinar el o los mecanismos de resistencia a glifosato
en biotipos de P. paniculatum, especie nativa de Suramérica, cuyas poblaciones
hasta la fecha solo han evolucionado resistencia en Costa Rica. Para lograr los
objetivos, primeramente se diagnosticó el manejo de malezas en cultivos perennes
para determinar los factores que propiciaron esa evolución de resistencia al
glifosato; se condujo experimentos con glifosato radio marcado para detectar el
destino de la molécula del herbicida en la planta después de ser tratada y para
7
determinar si la reducción en la absorción, exudación o transporte del herbicida
contribuyen a la resistencia. Además, se determinó la concentración de
metabolitos del glifosato, que permite inferir si la resistencia se debe a una
metabolización acelerada; y se hicieron evaluaciones moleculares para establecer
si existen diferencias genéticas entre los biotipos resistentes y susceptibles, que
involucren mutaciones, duplicaciones o mayor actividad de la enzima blanco,
como causales de la resistencia.
2. Objetivos
2.1 Objetivo general
Determinar el mecanismo de resistencia de P. paniculatum L. al herbicida
glifosato.
2.2 Objetivos específicos
Establecer si la resistencia de P. paniculatum al glifosato se debe a una alteración
en el sitio de acción del herbicida.
Evaluar si la resistencia de P. paniculatum al glifosato se debe a una modificación
en el transporte o metabolización del herbicida.
Identificar el tipo de manejo agronómico que favorece la evolución de resistencia
de P. paniculatum al herbicida glifosato en los sistemas agrícolas de Costa Rica.
3. Marco teórico
3.1 La maleza Paspalum paniculatum L.
Paspalum paniculatum tiene varios sinónimos botánicos como Panicum
paniculatum, Paspalum affine, P. compressicaule, P. cordovense, P. galmarra, P.
guineense, P. fluitans, P. hemisphericum, P. multispica, P. polystachium, P.
strictum, P. supinum y P. umbrosum (USDA 2016; TaiBIF 2016; ITIS 2016).
8
Es una monocotiledónea perenne, herbácea, cespitosa, erecta o decumbente, de
base densamente hirsuta, que en Costa Rica alcanza alturas de 0,75 a 1,5 m
(Pohl 1980), con tallos reproductivos que llegan a los 100 cm (Barea et al. 2006)
(Figura 1A).
Posee una raíz fibrosa con presencia de rizomas cortos (Barreto 1974), un tallo o
culmo erecto que se ramifica en los nudos basales y medios, con nudos
prominentes pardos y pubescentes y entrenudos glabros. Sus hojas son simples,
alternas, con envés glabro, haz pubescente y blanquecino, de 8 a 15 cm de largo,
1 a 2 cm de ancho y con el ápice acuminado. Las vainas se traslapan, son ciliadas
en la base con pelos irritantes; posee una lígula membranácea con anillo de cilios
de 0,5 a 1 mm (Figura 1B).
Figura 1. Planta (A), lígula (B), panícula (C) y espiguillas (D) de P. paniculatum. (Fotos por F. Ramírez).
Su inflorescencia consiste de una panícula terminal solitaria, de 5 a 30 cm de
largo, compuesta por 8 a 21 racimos de 3 a 4 cm de largo que son ciliados en el
punto de unión con el raquis (Hammel et al. 2003) (Figura 1C). Las espiguillas son
pareadas, dispuestas en 4 filas de un lado de la espiga (Figura 1D), de 1,2 a 1,5
mm (PIER 2014). Sus flores son púrpura a café, de 1 mm largo y planas de un
lado. El fruto es un cariópside oscuro, café a púrpura, circular, cerca de 0,8 mm de
9
largo y posee una semilla por fruto. Aunque en la especie existe una alta
frecuencia de poliploidía, Pozzobon et al. (sf), Fernandes et al. (1974) y Honfi et al.
(1990), encontraron biotipos brasileños y argentinos diploides (2n=2x=20), aunque
estos dos últimos autores también encontraron un biotipo tetraploide argentino.
Los biotipos de Costa Rica y Venezuela poseen un número cromosómico de n=10
(Pohl 1980) y los costarricenses son diploides (Pohl y Davidse 1971). Burson
(1979 y 1987) la describe como una planta autopolinizable, con muy baja
capacidad de cruzamiento, perteneciente a un género que usualmente contiene
especies autógamas o apomícticas, lo que impide su hibridación con otras
especies de Paspalum. Se reproduce principalmente por semillas, aunque también
lo hace vegetativamente por cepas o rizomas basales. Florece la mayor parte del
año, principalmente de enero a abril, de junio a agosto y de octubre a diciembre
(Hammel et al. 2003).
En Costa Rica se conoce popularmente como Zacate Cabezón. En estados
juveniles se le considera forraje, pero es tóxico para bovinos por acumular nitratos
y nitritos durante la transición de la época seca a la lluviosa. Es un pasto originario
de Suramérica y actualmente se encuentra distribuido desde el sur de Estados
Unidos (Mississippi) (USDA 2016) hasta Argentina, incluyendo las islas del Caribe,
y ha sido introducido en todos los trópicos mundiales (PIER 2014). Crece en
suelos arcillosos de buena fertilidad y especialmente en áreas perturbadas y bajo
sol o sombra parcial, cultivos perennes, potreros, jardines, terrenos baldíos,
bordes de caminos y zonas urbanas, en elevaciones que van de 0 a 1 500 metros
sobre el nivel del mar.
Es una planta muy rústica y agresiva, llega a dominar por completo la vegetación
por lo que es una de las especies de poacea más comunes en Costa Rica. Se le
encuentra en las zonas de vida de Bosque Seco, Bosque Húmedo, Bosque Muy
Húmedo y Bosque Pluvial, en las vertientes del Caribe y Pacífica, Valle Central,
norte del Valle del General y Golfo Dulce (Hammel et al. 2003; Pohl 1980). Es
frecuente en cultivos perennes como café, palmito, cítricos, banano, coco,
10
guanábana, papaya, palma africana, piña, y también se le encuentra en cultivos
anuales como yuca y tiquizque, bordes de caminos, pastizales y orillas de canales
(Ramírez 2016; Brenes y Agüero 2007).
3.2 El herbicida glifosato
El glifosato, (N-(fosfonometil) glicina), es un herbicida de aplicación foliar pos
emergente, sistémico, no selectivo, ampliamente usado para el control de plantas
herbáceas y leñosas, tanto anuales como perennes, de hoja angosta y ancha. Es
el herbicida de mayor uso en el mundo, tanto en términos de volumen como de
valor (Research and Markets 2016), y de igual forma en Costa Rica; actualmente
es el segundo plaguicida de mayor importación en el país, representando del año
2006 al 2010 el 10,5% del total de plaguicidas y el 33,6% del total de herbicidas
(Ramírez et al. 2013; Wakelin et al. 2004).
La molécula del glifosato fue inicialmente sintetizada en 1950 por el químico suizo
Dr. Henri Martin, quien trabajó para la pequeña compañía farmacéutica Cilag; el
producto no tuvo aplicaciones farmacéuticas y nunca fue reportado en la literatura
(Franz et al. 1997). En 1959, Cilag fue comprada por Johnson y Johnson, que
vendió sus muestras experimentales, incluyendo al glifosato, a la compañía Aldrich
Chemical, la cual vendió pequeñas cantidades del compuesto a muchas
compañías al año siguiente, para fines no revelados, pero nunca se le reportó
actividad biológica. Una de las compañías, Monsanto, en su división de
Inorgánicos, estuvo desarrollando compuestos acondicionadores de aguas y
sintetizó más de cien sustancias análogas del ácido aminometilfosfónico (AMPA),
un metabolito del glifosato; cuando esos compuestos fueron evaluados como
herbicidas por el Dr. Phil Hamm, dos de ellos mostraron cierta actividad sobre
malezas perennes, pero muy baja para considerarla como un herbicida comercial
(Dill et al. 2010).
11
Posteriormente, el Dr. John Franz continuó los trabajos con metabolitos; en mayo
de 1970, el glifosato fue sintetizado por Monsanto (Saint Louis, Missouri), probado
en invernadero en julio, avanzó en el proceso de pruebas de eficacia biológica en
campo, para finalmente ser presentado ese mismo año como el herbicida
comercial de marca Roundup (Baird et al. 1971).
La producción de glifosato en 2014 se estimó en 710 000 T, con un valor de 5,5
millardos de US dólares, y se proyecta que exceda 1,1 millones T en 2022, para
alcanzar valores de 9,5 millardos de US dólares (Research and Markets 2016;
Global Market Insights 2016). Algunos de los principales productores de glifosato
son las industrias BASF SE (Alemania), Bayer CropScience (Alemania), Monsanto
Company (EE.UU.), Nufarm Ltd. (Australia), Syngenta AG (Suiza), Dow
AgroSciences LLC (EE.UU.), DuPont (EE.UU.), Sino Harvest (China), Zhejiang
Xinan Chemical Industrial Group Company, Ltd. (China), Jiangsu Good Harvest-
Weien Agrochemical Co. Ltd, (China) y Nantong Jiangshan Agrochemical &
Chemicals Co. Ltd. (China) (Markets and Markets 2016); de estas, las industrias
localizadas en China sintetizan cerca del 80% de la producción mundial, en
aproximadamente 200 fábricas con capacidad para producir 720 000 T (Business
Wire 2016). Los principales consumidores de glifosato son Norteamérica, América
Latina y la región Asia-Pacífico (Global Market Insights 2016).
Debido a sus propiedades herbicidas no selectivas, inicialmente el glifosato fue
usado solamente para el control de malezas en zonas no agrícolas, industriales,
campos en barbecho y bordes de canales y carreteras. Su uso en campos
agrícolas fue limitado hasta el desarrollo de la práctica de mínima labranza, donde
se aplica glifosato antes de la siembra (Dill et al. 2010); pero su uso aumentó
considerablemente con la introducción de los cultivos transgénicos resistentes a
glifosato a mediados de los 90, ya que el daño al cultivo por el herbicida no era
relevante (Nandula 2010).
12
Se utiliza en aplicaciones en pre siembra, dirigidas, en zonas urbanas, no
agrícolas y en cultivos transgénicos resistentes; también se usa como madurador
en caña de azúcar. Se empezó a comercializar en 1974 con la marca Roundup
(Woodburn 2000). En Costa Rica se tienen registros de importaciones desde el
año 1982 con cerca de 50 T de ingrediente activo (i.a.) con un aumento en sus
importaciones, especialmente alto a partir de los 90, para llegar a 1 482 T i.a. en
2008 (Ramírez et al. 2009). Algunas formulaciones comercializadas en Costa Rica
que contienen glifosato son Roundup, Atila, Balazo, Batalla, Biokil, Estelar,
Evigras, Lince, Rambo, Rimaxato, Rival, Rodeo, Rondopaz y Skoba.
Estas formulaciones contienen el glifosato en forma de sal en solución acuosa.
Una de las primeras en comercializarse fue la sal de isopropilamina, la más
utilizada actualmente en Costa Rica (Figura 2). Otras son sales de sodio,
tetrametilsulfonio (glifosato trimesium), potasio, amonio, monoetanolamina y
dimetilamina (Dill et al. 2010). En Costa Rica están registradas, además de la sal
isopropilamina, formulaciones de glifosato en forma de sal potásica (Touchdown
Forte 50 SL) y sal de amonio (Roundup Max 68 WG). En el 2013 fue cancelado el
registro de una formulación de sal tetrametilsulfónica (Touchdown 33 SL), debido a
que el registrante no presentó la documentación relacionada a la reválida (SFE
2015).
Actualmente, debido a la expiración de la exclusividad de la patente de Monsanto
en el año 2000 (Duke y Powles 2008), se encuentran registradas para su
comercialización en el mercado nacional, 74 formulaciones que contienen
glifosato: 71 con un ingrediente único y 3 en mezcla con otros herbicidas (dos con
terbutilazina y una con metsulfuron metilo). Estas formulaciones comerciales
contienen glifosato en concentraciones que van desde 20,4% hasta 76% de i.a.,
principalmente al 35,6 y 68% y formulado en líquidos solubles (SL) y gránulos
dispersables (WG), respectivamente (SFE 2015). La mayoría de las formulaciones
comerciales poseen algún tipo de coadyuvante, ya que debido a su baja
13
liposolubilidad, el glifosato necesita de estas sustancias para mejorar su
penetración en las plantas.
Figura 2. Estructura química de las sales del ácido glifosato. Fuente: Kogan y Pérez (2001).
En Costa Rica las formulaciones de glifosato están autorizadas en 32 cultivos
agrícolas, además en pastos, plantaciones forestales y áreas no agrícolas (SFE
2015). Cultivos perennes como café, palma africana, banano, plátano, caña de
azúcar, cacao, cítricos, papaya, mango, macadamia, guanábana, piña, coco y
otros frutales, tienen registros para uso de glifosato; también cultivos anuales
como arroz, papa, melón, maní, frijol, algodón, soya y sorgo. Al contrario, existe
una variedad de cultivos donde no se encuentran registradas para su uso
formulaciones que contienen glifosato. Estos cultivos son hortalizas como apio,
berenjena, cebolla, chile, coliflor, culantro, espinaca, pepino, remolacha, repollo,
tomate y vainica; raíces y tubérculos como camote, jengibre, malanga, ñame,
ñampí, tiquizque y yuca; frutales como guayaba, granadilla, maracuyá, mora,
fresa, palmito, pejibaye y pimienta.
El glifosato posee muchos atributos positivos como herbicida, incluyendo su
efectividad en un amplio número de especies, baja toxicidad aguda para
mamíferos y ausencia de actividad herbicida en el suelo, lo que ha contribuido a
14
considerarlo clave en el manejo de malezas en la agricultura moderna (Jasieniuk
et al. 2008).
Es muy tóxico para organismos acuáticos como peces y algas; medianamente
tóxico para anfibios, crustáceos y lombrices de tierra (Folmar et al. 1979; Giesy et
al. 2000). Además, los coadyuvantes que se utilizan en sus formulaciones pueden
aumentar sus propiedades toxicológicas; un estudio hecho con la formulación
original de Roundup, mostró que el surfactante podría ser el agente tóxico primario
en el herbicida, especialmente para peces e invertebrados acuáticos (Folmar et al.
1979).
El glifosato es un herbicida altamente hidrosoluble, con la capacidad de
contaminar rápidamente aguas de escorrentía y superficiales como ríos y lagunas;
se adsorbe a las partículas del suelo (Tuffi Santos et al. 2008) y puede de esta
forma estar biodisponible para organismos que se alimentan por filtración de
sedimentos. Esta adsorción a partículas, ayuda en la mayoría de suelos, a que el
glifosato no alcance a contaminar las aguas subterráneas; aunque Piccolo et al.
(1996), determinaron que este herbicida puede ser transportado a través del perfil
por sustancias húmicas. Esta situación es atenuada por su valor bajo de vida
media en suelos, reportado de menos de una semana y hasta uno a dos meses
(Giesy et al. 2000; Roy et al. 1989).
A pesar de su inactivación en el suelo como herbicida, varios estudios demuestran
el impacto que tiene el glifosato en bacterias que participan en el ciclo del
nitrógeno, al interferir en los procesos de descomposición de la materia orgánica.
De hecho, inicialmente fue patentado como un agente antimicrobial (US Patent
number 7 771 736 B2. 2010) (Dill et al. 2010). El glifosato puede ser exudado por
raíces y retornar en forma disponible a la solución del suelo (Massenssini et al.
2008); y si permanece disponible por un tiempo suficientemente largo, de uno a
cinco días, puede causar cierto daño a las plantas que lo absorben (Salazar y
Appleby 1982). También puede disminuir drásticamente las poblaciones de
15
lombrices de tierra (Eisenia foetida) (Santadino et al. 2014) y aumentar el número
de actinomicetes y otros hongos (Araujo et al. 2003; Florida et al. 2012).
Otro efecto que puede causar el glifosato sobre las plantas, aún en condiciones de
deriva, es la disminución de las concentraciones de calcio, manganeso, magnesio
y hierro, tanto en hojas como en semillas, al inmovilizar fisiológicamente estos
nutrientes, especialmente en los tejidos meristemáticos, debido a que este
herbicida es un poderoso agente quelatante para cationes bivalentes (Cakmak et
al. 2009).
3.3 Modo de acción del glifosato
Las moléculas de glifosato, que poseen carga negativa (Franz 1985), se absorben
desde la superficie de las hojas, donde la primera barrera es la cutícula foliar,
compuesta de una capa de cera lipofílica (Kirkwood 1991), hasta las células de la
planta, desde donde son rápidamente transportadas por el sistema floemático
hacia los tejidos meristemáticos (Laerke 1995; Franz et al. 1997), para alcanzar el
sitio de acción en dosis letales. Así, cambios en la absorción del herbicida,
metabolismo y transporte pueden afectar la sensibilidad de la planta, al necesitar
alcanzar el sitio de acción en una concentración apropiada (Reddy et al. 2008). La
buena absorción y transporte hacia los puntos de crecimiento, la nula o limitada
degradación y un lento modo de acción, son las razones primarias que le dan una
excelente eficacia al glifosato (Duke y Powles 2008).
3.3.1 Absorción
Las sales de glifosato son moléculas altamente polares, solubles en agua con muy
baja liposolubilidad, que penetran la cutícula lipofílica de las hojas probablemente
por difusión, hacia la cutina hidratada y las bandas de pectina o vía hidrofílica, en
el apoplasto (Caseley y Coupland 1985; Franz et al. 1997; Hess 1985).
16
Es un proceso bifásico que comprende una penetración inicial rápida a través de
la cutícula, en unas 4 horas, seguido de una absorción lenta por el simplasto o las
células del mesófilo (Caseley y Coupland 1985; Brecke y Duke 1980). La duración
de este proceso depende de varios factores como la especie, edad de la planta y
concentración del herbicida (Monquero et al. 2004), y condiciones ambientales,
incluidas las que alteran el potencial hídrico de la planta o que influyen sobre la
tasa de transpiración (humedad relativa, humedad del suelo, temperatura,
absorción mineral) (Sharma y Singh 2001); o la mayor producción de cera en la
cutícula, como sucede a bajas intensidades de luz (Franz et al. 1997).
3.3.2 Transporte
La eficacia del glifosato depende estrictamente de la dosis del herbicida que es
transportada hacia el simplasto o a las porciones vivas de la planta (Nandula
2010). Después de penetrar por las hojas, el glifosato debe ser transportado hacia
los tejidos vasculares para alcanzar los sitios metabólicos activos, como los
meristemos radicales y apicales (Satchivi et al. 2000); esta habilidad de
transportarse en la planta hacia los meristemos y órganos subterráneos, le provee
una alta efectividad como herbicida (Shaner 2009).
Aunque no se sabe exactamente cómo ingresa el glifosato al floema, el herbicida
debe de entrar en el lumen floemático, presumiblemente a través de la membrana
plasmática, ya sea por difusión de masas seguido de ingreso al floema a través de
los plasmodesmos, o ser tomado activamente dentro del mesófilo o células
acompañantes por medio de transportadores de fosfatos dentro de la membrana
celular (Burton y Balke 2012; Franz et al. 1997; Sterling 1994; Caseley y Coupland
1985). Una vez que el glifosato entra a los elementos cribosos es atrapado y
transportado hacia los sumideros (Shaner 2009). Por este motivo, los órganos que
poseen altas tasas de metabolismo y crecimiento, representan importantes
destinos del glifosato (Cakmak et al. 2009).
17
La mayoría del herbicida se transporta siguiendo la ruta de los foto asimilados
hacia los meristemos (Shaner 2009; Preston y Wakelin 2008; Monquero et al.
2004); esto explica por qué la mayor acumulación del herbicida después de una
aplicación se da en los puntos de crecimiento, ubicados en los brotes y los ápices
de las raíces (Reddy et al. 2008). Pero los herbicidas que se mueven en este
patrón simplástico, cuando son aplicados a las hojas y tallos, inicialmente tienen
que ingresar y moverse a través del apoplasto vía acrópeta (Jachetta et al. 1986;
Dewey y Appleby 1983). Esto puede conducir a que el glifosato viaje con la
corriente de transpiración y quede atrapado en los ápices de las hojas, como
sucede en plantas resistentes de Lolium sp (Perez-Jones et al. 2007; Lorraine-
Colwill et al. 2003; Wakelin et al. 2004).
En plantas de Conyza bonariensis, Dinelli et al. (2008) comprobaron movimiento
del herbicida tanto por vía del floema como del xilema; en el transporte de glifosato
del tallo hacia las hojas se involucró tanto la parte simplástica como apoplástica,
pero el movimiento de tallo hacia raíz se dio exclusivamente por vía simplástica.
Este movimiento apoplástico del glifosato, es suficiente para considerarlo como un
compuesto ambimóvil (Franz et al. 1997).
En la mayoría de plantas, el transporte xilemático es relativamente expedito
(Pérez-Jones y Mallory-Smith 2010), hasta 20 a 50 veces más rápido que el
floemático (Kleier y Hsu 1996); y dentro de los herbicidas conocidos que poseen
movimiento simplástico, el glifosato es el que se transporta más eficientemente
(Bromilow et al. 1990). Esta eficiencia es afectada por factores como una alta
temperatura e intensidad lumínica, que aceleran el transporte del glifosato (Franz
et al. 1997; Sharma y Singh 2001).
El transporte floemático de compuestos iónicos, como el glifosato, se da por el
efecto trampa iónica, causado por la diferencia de pH entre el apoplasto
(normalmente ácido o subácido) y el simplasto (usualmente neutro o subalcalino)
(Raven 1975; Brigs et al. 1987). La funcionalidad ionizable del glifosato, el cual
18
contiene tres grupos ácidos y una fuerte base amina, es la que le confiere una
movilidad simplástica alta (Figura 3); la pérdida de uno o más de esos grupos
ácidos puede afectar sus propiedades zwiteriónicas y reducir su movimiento en el
floema (Bromilow y Chamberlain 2000).
Figura 3. Estructura química del glifosato (C3H8NO5P). Fuente: Dill et al. (2010).
3.3.3 Metabolismo
Una característica asociada a la alta actividad del glifosato es que la mayoría de
plantas son incapaces de degradarlo metabólicamente (Franz et al. 1997). La
enzima glifosato oxireductasa (GOX), que permite a algunos microorganismos del
suelo metabolizar el glifosato en ácido aminometilfosfónico o aminometilfosfonato
(AMPA) y glioxilato, no ha sido encontrada en plantas (Duke et al. 2003).
Algunas especies como Equisetum arvense y cultivos como maíz, canola, trigo,
arveja, centeno, lino y soya resistentes a glifosato, degradan lentamente el
herbicida produciendo AMPA y dióxido de carbono (Bozzo 2010; Coupland 1985;
Franz et al. 1997; Reddy et al. 2004; Marshall et al. 1987). Esto sugiere que una
GOX, u otro tipo de enzima similar, cataliza esa conversión (Reddy et al. 2008).
La degradación del glifosato sigue una vía similar a la propuesta para bacterias del
suelo, por medio de una escisión oxidativa del enlace carbono nitrógeno,
produciendo además otros metabolitos como glioxilato y sarcosina (Schuette
1998). Algunos cultivos puros de bacterias como Flavobacterium sp.,
19
Pseudomonas sp. y Arthrobacter atrocyneus son capaces de degradar el glifosato
en AMPA (Balthazor y Hallas 1986; Pipke y Amrheim 1988), en el proceso de la
extracción del fósforo presente en la molécula del herbicida (Hove-Jensen et al.
2014).
El AMPA es mucho menos fitotóxico para la mayoría de plantas (Franz 1985),
pues es considerado menos activo que el glifosato. El modo de acción del AMPA
es aparentemente diferente al del glifosato, ya que tanto la soya convencional
como la transgénica resistente a glifosato, son igualmente sensibles al AMPA
(Bozzo 2010).
3.3.4 Exudación
La movilidad del glifosato en el floema, puede favorecer su exudación por el
sistema radical de las plantas tratadas (Coupland y Caseley 1979; Rodrigues et al.
1982). El glifosato en contacto con el suelo es adsorbido por sus coloides,
principalmente por óxidos de hierro, calcio y por la materia orgánica, fijándose a la
solución del suelo y quedando no disponible para las plantas, especialmente en
suelos arcillosos (Tuffi Santos et al. 2008). A pesar de lo anterior, algunos autores
como Rodrigues et al. (1982), reportan en plantas de trigo tratadas, exudación de
glifosato hacia el suelo con la subsecuente absorción del herbicida por plantas
adyacentes de maíz. Tuffi Santos et al. (2008), también encontraron glifosato radio
marcado exudado de plantas tratadas del pasto Brachiaria decumbens, que
posteriormente fue absorbido vía raíz por plantas vecinas de eucalipto, en
concentraciones inferiores a las necesarias para causar daño visible al cultivo
(entre 0,5% y 0,9% del glifosato aplicado).
20
3.3.5 Mecanismo de acción
El glifosato tiene un mecanismo de acción exclusivo, la inhibición de la ruta
metabólica del shikimato, localizada en los cloroplastos, que no fue descubierta
sino hasta 8 años después de iniciada su comercialización (Steinrucken y Amrhein
1980). Es el único herbicida en el mercado derivado del aminoácido glicina, que
inhibe, de forma competitiva, la enzima 5-enolpiruvilshikimato-3 fosfato sintetasa
(EPSPS), sexta enzima en la vía de síntesis proteica del shikimato, en donde el
fosfoenolpiruvato (PEP) y la eritrosa-4-fosfato son convertidos a corismato,
precursor de los aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina y triptófano) y
muchos metabolitos aromáticos secundarios como auxinas, fitoalexinas,
antocianinas y lignina (Jaworski 1982; Herrmann y Weaver 1999). Además,
provoca un agotamiento de los intermediarios en la fijación de CO2 como bifosfato
de ribulosa, una reducción en la fotosíntesis y en la síntesis de almidones
(Steinrucken y Amrhein 1980). La ruta metabólica del shikimato consume cerca
del 20% del total de carbono fijado por las plantas durante la fotosíntesis
(Herrmann y Weaver 1999), y solo existe en plantas, bacterias y hongos (Kishore y
Shah 1988).
La enzima EPSPS cataliza la transferencia de una parte del enolpiruvil del PEP a
shikimato-3-fosfato (S3P) para producir 5-enolpiruvil shikimato-3-fosfato (EPSP) y
fosfato inorgánico (Geiger y Fuchs 2002). El glifosato actúa como un inhibidor
competitivo con el PEP (Schonbrunn et al. 2001), ocupa el lugar de unión del PEP
(Funke et al. 2006), e inhibe la EPSPS al formar el complejo ternario EPSPS-S3P-
Glifosato, uniéndose a la enzima solo después de la formación del complejo
binario EPSPS-S3P (Alibhai y Stalling 2001); siendo este mecanismo de inhibición
único (Franz et al. 1997).
21
Figura 4. Sitio de inhibición del glifosato en la ruta metabólica del shikimato. Fuente: Dill (2005).
Como ya se mencionó, la inhibición de la EPSPS por parte del glifosato, evita la
síntesis de aminoácidos aromáticos; sin embargo, un mayor y rápido efecto es la
inhibición de la retroalimentación del flujo de carbono a través de la vía del
shikimato, que resulta en un rápido aumento en la acumulación de ácido shikímico
y, en menor medida, de ácidos benzoicos derivados del shikimato (Duke et al.
2003).
También se ha propuesto que la interferencia del glifosato con la EPSPS conduce
a la reducción de niveles de arogenato, que incrementa el flujo de carbono en la
vía del shikimato al reactivar la actividad de la enzima 3-deoxi-D-arabino-
heptulosonato-7-fosfato sintetasa (DAHPS), que provoca una acumulación no
regulada de shikimato (Siehl 1997). Precisamente, el descubrimiento del modo de
acción del glifosato, se debió en gran medida a la alta y rápida acumulación de
shikimato, observada en plantas susceptibles después de una aplicación del
22
herbicida (Amrhein et al. 1980), lo que en la actualidad se utiliza rutinariamente
como una forma de medir toxicidad de glifosato (Singh y Shaner 1998).
Esta toxicidad se detecta inicialmente en los tejidos nuevos, ya que los genes que
codifican la EPSPS muestran su máxima expresión primeramente en los
meristemos, luego en flores y brotes; y son menos expresados en cotiledones y
hojas maduras (Weaver y Herrmann 1997). Por esta razón, una dosis de 0,2 mg
kg-1 (peso: peso tejido) de glifosato en la planta Abutilon theophrasti, fue suficiente
para matar las regiones meristemáticas de raíces y brotes, mientras que para
tallos se necesitó 8,4 mg kg-1 (Feng et al. 2003).
Todas estas etapas del modo de acción provocan los síntomas de fitotoxicidad del
glifosato: blanqueamiento y clorosis en los tejidos sumideros metabólicamente
activos (Franz et al. 1997); pigmentación, retraso en el crecimiento y reducción en
la dominancia apical (Ng et al. 2003), que avanzan a una necrosis de los tejidos
sobre la superficie del suelo y a un deterioro de las partes subterráneas de la
planta. Los efectos visibles iniciales de toxicidad por glifosato en la mayoría de
malezas anuales, se pueden presentar desde los 2 a 4 días, y en malezas
perennes hasta en 7 días; condiciones de bajas temperaturas o días nublados
después del tratamiento, atrasan el desarrollo de los síntomas visuales (Schuette
1998).
3.4 Resistencia a herbicidas
Determinadas especies de plantas, tanto cultivadas como malezas, son capaces
de vivir y crecer aun después de ser tratadas con un herbicida a su dosis
recomendada, aunque puedan ser controladas cuando la dosis se eleva
sustancialmente. Este tipo de respuesta se conoce como tolerancia natural y se
define como “la capacidad heredable de una especie vegetal para sobrevivir y
reproducirse después del tratamiento con un herbicida”, pudiendo considerarse
23
una característica propia de la especie (WSSA 1998). Este término se usa al
referirse a las bases fisiológicas y bioquímicas de la selectividad de herbicidas,
dada por reacciones primarias de detoxificación, que le dan a la planta la habilidad
de soportar ciertos tratamientos herbicidas (Devine et al. 1993).
Debido a la variabilidad genética de las malezas y como consecuencia de la
presión selectiva impuesta por la aplicación continua de herbicidas, que
caracteriza a los sistemas modernos de producción agrícola, es posible la
evolución de biotipos de malezas que dejan de ser controladas por un
determinado herbicida al que originalmente eran susceptibles. Tal respuesta se
conoce como resistencia, siendo una característica seleccionada en una población
específica (biotipo). El Comité de Acción en Resistencia a Herbicidas (HRAC, por
sus siglas en inglés) define resistencia como la capacidad evolucionada heredable
de una población o biotipo de maleza para sobrevivir y reproducirse después de la
aplicación de una dosis de herbicida que era letal para la población original.
Por décadas, las malezas resistentes a herbicidas han sido un problema para los
productores (Heap 1997). Los primeros casos de malezas resistente a herbicidas
fueron los de Commelina diffusa en cañales de Hawái, Estados Unidos y de
Daucus carota (zanahoria silvestre) en bordes de carreteras en Ontario, Canadá,
ambos para el 2,4-D y documentados en 1957 (Heap 2017). Durante la década de
1970, más de 30 especies de malezas fueron reportadas como resistentes a
herbicidas del grupo de las triazinas (Bandeen et al. 1982).
La mayoría de herbicidas inhiben enzimas específicas que son esenciales para el
metabolismo de las plantas (Powles y Yu 2010); lo que se conoce como efecto
sobre el sitio activo (Busi et al. 2013). Así, los herbicidas se clasifican de acuerdo
con las enzimas o procesos que inhiben (Heap 2017).
La resistencia a herbicidas puede ser conferida por cambios en el sitio activo o por
mecanismos fuera del sitio activo. La resistencia de sitio activo existe cuando el
herbicida alcanza el sitio de acción en dosis letales pero hay cambios en su sitio
24
de acople o en su cantidad, que limitan el impacto del herbicida; y la resistencia
fuera del sitio activo involucra mecanismos que minimizan o impiden al herbicida
alcanzar el sitio activo (Powles y Yu 2010).
Estos dos tipos de resistencia no son excluyentes el uno del otro, incluso en
biotipos de malezas resistentes se presentan acúmulos en el efecto de varios
genes, que producen cambios fenotípicos significativos debido a selección
recurrente, aún en pocas generaciones y en pequeñas poblaciones, lo que
Ffrench-Constant et al. (2004) definieron como resistencia poligénica, y que
algunos autores como Gressel (2009), llaman resistencia progresiva (creeping
resistance).
También es común que en una maleza se exprese un mecanismo de resistencia
que le confiere la habilidad de soportar herbicidas de la misma o diferente familia
química con un modo de acción similar, lo que se conoce como resistencia
cruzada; y casos en los que la expresión de más de un mecanismo de resistencia
proporciona la habilidad de resistir herbicidas de diferentes modos de acción, lo
que se define como resistencia múltiple (Hall et al. 1994).
3.5 Evolución de resistencia a herbicidas
La resistencia es esencialmente un fenómeno natural, un ejemplo de evolución
adaptativa de las malezas, que ocurre de forma espontánea en poblaciones; no es
inducida por la acción del herbicida, pero solo es notada cuando se ejerce presión
de selección sobre las malezas a través de la aplicación repetida de un herbicida
(Fisher 2012). Así, se hace una selección de mutaciones naturales o de individuos
resistentes preexistentes (Duke et al. 1991).
En virtud de su eficacia biológica, el herbicida ejerce presión de selección sobre
las poblaciones de malezas, de modo que los individuos que naturalmente poseen
un mecanismo que les permite soportar el efecto del producto, sobreviven y se
25
reproducen (Valverde y Heap 2009). A medida que se suceden las generaciones
expuestas al herbicida, se incrementa así el número de individuos resistentes que
no se controlan, hasta constituirse en la mayor proporción de la población,
haciéndose evidente la ineficacia del herbicida.
Diferentes factores, tanto propios de las malezas como de los herbicidas,
determinan la evolución de resistencia. La variabilidad genética de las malezas es
uno de los atributos más importantes que influyen en la evolución de resistencia
(Baucom y Mauricio 2004), la cual incluye la frecuencia de mutaciones. Cada
especie tiene una constitución genética particular y se considera que los genes de
resistencia están presentes en las poblaciones silvestres, aunque en una
proporción muy baja (Bradshaw et al. 1997); así, las mutaciones responsables de
la resistencia a herbicidas no son inducidas por el herbicida, sino que ocurren de
forma espontánea (Jasieniuk et al. 1996); aunque podrían provocarse de forma
indirecta, como lo ejemplifica Gressel (2011), al citar que después de una
aplicación de glifosato, aún a dosis bajas, habrían muchas más mutaciones
inducidas por rayos UV, al detenerse la síntesis de flavonoides (Keen et al. 1982;
Sharon et al. 1992), que son elementos protectores contra este tipo de radiación.
Estimaciones sobre genes de resistencia a glifosato en L. rigidum, hechas por
varios investigadores (Neve et al. 2003; Neve 2008; Werth et al. 2008), sugieren
que sus frecuencias iniciales están entre 1 x 10-8 y 1 x 10-6; además, el costo de
adaptación (fitness) contribuye a que la relativa baja frecuencia de genes de
resistencia al glifosato sea aún menor (Christoffers y Varanasi 2010). El tiempo
que pasó entre la introducción del glifosato en el mercado y la detección de
malezas resistentes, sugiere que la frecuencia de alelos resistentes funcionales en
poblaciones de malezas, debe ser extremadamente baja (Gressel 2011). La
frecuencia inicial de estas mutaciones determina el número de generaciones
requeridas para que la resistencia sea evidente y depende del número de genes
(monogénico, poligénico y nivel de ploidía), mecanismo de herencia, tipo de gen y
naturaleza de la modificación del gen (Warwick 1991).
26
De esta forma, la dinámica de la evolución de resistencia de poblaciones de
malezas a herbicidas depende de varios factores relacionados a: las
características de los genes de resistencia (frecuencia, cantidad, dominancia y
costo de adaptación); la biología de las especies de malezas (auto o polinización
cruzada, capacidad de producción de semillas, latencia y longevidad del banco de
semillas, capacidad de dispersión del polen y semillas); el herbicida (estructura
química, sitio activo, actividad y residualidad); y a los factores operativos que
ejercen presión de selección (dosis del herbicida, habilidad del aplicador en
manejo de maquinaria, tiempo y ambiente, factores del agro ecosistema como
rotación de cultivos, manejo preventivo y no químico de las malezas, entre otros)
(Powles y Yu 2010).
3.6 Resistencia de malezas al glifosato
Inicialmente se pensaba que la evolución de malezas resistentes a glifosato sería
muy lenta y que los niveles de resistencia serían muy bajos (Bradshaw et al.
1997); además, se consideraba al herbicida como de bajo riesgo para la selección
de resistencia (Beckie 2006). Esta suposición se basaba en la gran cantidad de
glifosato aplicado por muchos años, tomando en cuenta el volumen de uso, las
aplicaciones repetidas hechas en cultivos perennes, el alto nivel de actividad
herbicida que demostró tener, la excluyente actividad metabólica en plantas, la
ausencia de residualidad en el suelo, la escasa variabilidad (Bradshaw et al. 1997)
y la alta estabilidad de la EPSPS (CaJacob et al. 2003), particularmente en los
sitios que son críticos para la catálisis (Shaner 2010).
A pesar del dominio global del herbicida Roundup y de otras formulaciones de
glifosato, el primer caso de resistencia no fue documentado sino más de veinte
años después del inicio de su comercialización. Pratley et al. (1996), reportaron
una población de L. rigidum (ryegrass) en Australia resistente a glifosato, la cual
luego fue evaluada y confirmada por Powles et al. (1998). Actualmente en
promedio, un tercio del área cultivada con maíz, soya y algodón en Estados
27
Unidos, Brasil y Argentina, está infestada con malezas resistentes a glifosato
(Peters y Strek 2016).
El número de casos y especies resistentes ha aumentado hasta conformar un
amplio grupo de 293 biotipos pertenecientes a 40 especies de malezas, en 29
países: Estados Unidos, Canadá, Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Colombia,
Venezuela, Paraguay, México, Australia, Nueva Zelanda, Francia, España,
Hungría, Italia, Suiza, Portugal, Grecia, República Checa, Polonia, Israel, China,
Japón, Korea del Sur, Malasia, Indonesia, Sudáfrica y Costa Rica (Heap 2017).
Cuadro 1: Especies de malezas resistentes a glifosato a diciembre 2017.
Familia Especie
Asteraceae
Ambrosia artemisifolia, A. trifida, Bidens pilosa, Conyza canadensis, C. bonariensis, C. sumatrensis, Lactuca saligna, L. serriola, Parthenium hysterophorus, Sonchus oleraceus y Tridax procumbens.
Poaceae
Brachiaria eruciformis, Bromus diandrus, B. rubens, Chloris elata, C. truncata, C. virgata, Cynodon hirsutus, Digitaria insularis, Echinochloa colona, Eleusine indica, Hordeum murinum, Leptochloa virgata, Lolium multiflorum, L. rigidum, L. perenne, Urochloa panicoides, Paspalum paniculatum, Poa annua y Sorghum halepense
Amaranthaceae Amaranthus hybridus, A. palmeri, A. tuberculatus, A. spinosus y Kochia scoparia
Plantaginaceae Plantago lanceolata
Brassicaceae Raphanus raphanistrum
Chenopodiaceae Salsola tragus
Rubiaceae Hedyotis verticillata
Fuente: Heap 2017.
Gran parte de las malezas que han evolucionado resistencia al glifosato lo han
hecho en cultivos perennes, con la similitud de recibir aplicaciones con dosis
comerciales frecuentes y por varios años. Así, se han reportado varias especies
28
de poáceas (L. multiflorum, L. rigidum, E. indica y D. insularis) en campos de
frutales y viñedos luego de 8 a 20 años de uso (Pérez-Jones y Kogan 2003;
Perez-Jones et al. 2007; Powles et al. 1998; Jasieniuk et al. 2008; Perez-Jones et
al. 2005; Collavo et al. 2012; Ng et al. 2004a; de Carvalho 2011); y la Asteracea C.
bonariensis en campos de olivo después de 4 a 6 años de aplicaciones regulares
con glifosato (Dinelli et al. 2008).
Otros casos de evolución rápida de resistencia a glifosato han ocurrido por utilizar
el herbicida persistentemente a dosis bajas, como en el caso de Australia, donde
las dosis recomendadas son aproximadamente la mitad de las utilizadas para el
mismo propósito en otras partes del mundo (Pratley et al. 1996). Lo anterior fue
experimentalmente repetido durante una década por Busi y Powles (2009),
obteniendo resultados similares.
El mismo fenómeno se ha observado con otros herbicidas. Neve y Powles (2005),
indican que una población de L. rigidum aplicada con bajas dosis recurrentes del
herbicida diclofop-metil, evolucionó con altos niveles de resistencia debido a la
selección y al enriquecimiento de varios mecanismos menores. Ashworth et al.
(2016), reportan que el aplicar dosis subletales del herbicida 2,4-D, por cuatro
generaciones, a plantas susceptibles de Raphanus raphanistrus (rábano silvestre),
produjo evolución de resistencia al 2,4-D y resistencia múltiple a herbicidas
inhibidores de la acetolactato sintetasa (ALS).
Esta rápida evolución de resistencia al usar dosis subletales, se atribuye a la alta
tasa de sobrevivencia de las malezas (Neve y Powles 2005; Gressel y Levy 2006)
y no al estrés que el herbicida pueda generar (Gressel 2011). El estrés es un
factor que aumenta la tasa de mutaciones, así, los sobrevivientes podrían tener
más mutaciones de lo normal que podrían incluir aquellas que lleven a resistir
herbicidas (Gressel 2011).
Por el contrario, altas dosis de herbicida resultan en alta mortalidad de malezas,
pero en una selección de genes peculiares, capaces de proporcionar altos niveles
29
de resistencia; sin embargo, la selección con dosis bajas de herbicida, donde
algunas de las plantas sobreviven, permite el rápido acúmulo de muchos posibles
genes de resistencia, tanto débiles como fuertes, especialmente en especies de
polinización cruzada (Powles y Yu 2010); para P. paniculatum no se esperaría que
este fenómeno ocurriera muy fácilmente, ya que para su control no se usan dosis
bajas y es una especie mayormente autopolinizable (Burson 1987).
Costo de adaptación
Un principio básico en la evolución genética de los organismos es que, la
adaptación a nuevos ambientes a menudo tiene efectos pleiotrópicos negativos en
la capacidad adaptativa que se tenía en el ambiente original, lo que se llama
penalización por costo de adaptación o “fitness” (Purrington 2000; Strauss et al.
2002). La presión de selección que conlleva a la evolución de resistencia se podría
considerar como un nuevo ambiente. Este costo de adaptación contribuye con el
mantenimiento del polimorfismo genético dentro de las poblaciones (Antonovics y
Thrall 1994) y previene el establecimiento de los nuevos alelos recién adaptados
(Tian et al. 2003).
Por ejemplo, una sustitución simple de un aminoácido puede causar una
modificación estructural en la enzima blanco que limita el acople del herbicida,
pero también puede comprometer su funcionalidad (Tranel y Wright 2002; Powles
y Preston 2006; Powles y Yu 2010). Otro ejemplo de pérdida de fitness lo dan
Kishore et al. (1992) y Funke et al. (2009), en experimentos de laboratorio con la
bacteria E. coli, donde encontraron que la mutación T102I por sí sola provoca altos
niveles de resistencia, pero con una drástica disminución de la afinidad para el
segundo sustrato (PEP).
Autores como Yu et al. (2015), indican también un “costo por resistencia” a nivel
enzimático debido a la reducción en la eficiencia catalítica. Waters (1991),
30
Jasieniuk (1995) y Bradshaw et al. (1997), encontraron que mutaciones en el gen
de la EPSPS se asociaron con un alto grado de penalización por fitness.
Así mismo, plantas cuyo mecanismo de resistencia es la reducción en el
transporte de glifosato, han mostrado tener penalidades por adaptación. Estos
costos pueden ser debidos a un cambio en la habilidad de los biotipos resistentes
(R) de absorber o transportar importantes metabolitos o nutrientes, como los
fosfatos (Shaner 2009). Por ejemplo, biotipos R de L. rigidum producían semillas
más pequeñas comparadas con los biotipos susceptibles (S), lo que pudo deberse
a una menor eficiencia en el transporte de foto asimilados (Pedersen et al. 2007).
Esta penalización por costo de adaptación se expresa en algunas especies
únicamente en la ausencia del herbicida (sin presión de selección) (Beckie 2011),
lo que es una desventaja evolutiva de las poblaciones R ante las S.
Investigaciones hechas por Baucom y Mauricio (2004), demostraron que plantas
de Ipomoea purpurea tolerantes al glifosato produjeron 35% menos semillas que
plantas susceptibles de la misma población, cuando no eran aplicadas con el
herbicida.
De esta forma, cuando no existe presión de selección del herbicida, los individuos
con alelos resistentes a glifosato, reducen su frecuencia en la población. Preston y
Wakelin (2008), observaron que individuos resistentes a glifosato del pasto L.
rigidum, se volvían menos frecuentes, reduciéndose su frecuencia fenotípica de
45% a 11%, en el curso de tres años de haber dejado de aplicar glifosato. Estos
estudios pueden sugerir que la reducción del fitness asociada a la resistencia a
glifosato, se podría explotar en el manejo de ciertas malezas resistentes a este
herbicida (Preston et al. 2009).
Investigaciones recientes de Han et al. (2017), en E. indica con altísimos niveles
de resistencia a glifosato, producto de mutaciones en la EPSPS, encontraron que
en condiciones de competencia, plantas homozigóticas con la mutación simple
P106S no presentaron costo de adaptación; pero cuando la mutación doble se
31
presentaba de forma homocigótica, exhibían un costo significativo por fitness, y
sorprendentemente, no había costo cuando las plantas eran heterocigotas con
doble mutación.
A pesar de lo anterior, también se ha visto que algunos alelos mutantes que
confieren resistencia a herbicidas, no producen impactos observables en la
capacidad adaptativa de algunas plantas resistentes (Vila-Aiub et al. 2009). Por
ejemplo, individuos de L. rigidum cuyo mecanismo de resistencia es la reducción
del transporte del herbicida, no presentaban reducción del crecimiento vegetativo
bajo competencia con trigo, cuando se comparaban con individuos S, y las plantas
R producían semillas más grandes, pero en menor cantidad, bajo ausencia o muy
poca intensidad de competencia con el cultivo (Pedersen et al. 2007). En plantas
R y S del congénere L. multiflorum también se observó un potencial de adaptación
similar (Ruchel et al. 2016).
Muchos de los rasgos de resistencia tienen muy poco o ningún costo por
adaptación; sin embargo, la resistencia dada por amplificación del gen de la
EPSPS tiene un costo significativo; estudios en invernadero realizados por Wu et
al. (2016) indican que la frecuencia de estos individuos en una población, se
reduce de 40% a 15% después de 6 generaciones.
De forma contraria, plantas de A. palmeri cuyo mecanismo de resistencia al
glifosato se asocia con una amplificación de la EPSPS de 76 veces, bajo
condiciones de competencia, pero sin glifosato, tenían una altura similar y
asignaban la misma cantidad de biomasa a órganos reproductivos y vegetativos
que plantas de biotipos S sin la amplificación anterior, asegurándose de esta
forma su reproducción, al no penalizarse con un costo de adaptación (Vila-Aiub et
al. 2014). Así mismo, plantas R de A. palmeri creciendo bajo las mismas
condiciones que plantas S, eran más altas, poseían mayor biomasa, más ramas y
una mayor eficiencia en el uso del nitrógeno (Leon et al. 2016).
32
3.7 Mecanismos de resistencia al glifosato
Los mecanismos de resistencia al glifosato se han estudiado en varias especies:
L. rigidum, L. multiflorum, C. bonariensis, C. canadensis, E. indica, S. halepense,
E. colona, A. palmeri, A. tuberculatus y D. insularis, pero no en Paspalum
paniculatum. Básicamente, se han encontrado dos formas generales por las
cuales las plantas resisten al glifosato: las dependientes o basadas en el sitio de
acción, como mutaciones en la secuencia de aminoácidos que componen la
enzima blanco o una alta presencia (duplicación del gen del sitio activo o altos
niveles de transcripción) o actividad de esa enzima; y los no basados o
independientes del sitio de acción, como un limitado transporte o absorción,
aislamiento o secuestro vacuolar y una respuesta rápida de necrosis, que provoca
que el herbicida no alcance la enzima blanco.
A pesar de que, curiosamente, ahora los mecanismos de resistencia para glifosato
exceden los descritos para cualquier otro herbicida, estos involucran con menos
frecuencia al sitio activo y a mecanismos metabólicos, comparado con otros
herbicidas como los que inhiben la acetolactato sintetasa (ALS) y la acetil
coenzima A carboxilasa (ACCasa) (Heap 2017).
El conocimiento de los procesos biológicos, como los mecanismos responsables
de la resistencia a herbicidas en una determinada maleza, es fundamental para el
diseño de estrategias de control (Fisher 2008; Powles 2009), que busquen
minimizar el impacto que tienen las malezas sobre la producción agrícola.
3.7.1 Dependientes del sitio de acción
En general, las malezas susceptibles poseen una enzima específica con una
función importante para la sobrevivencia de la planta, que cuando es inhibida por
la molécula del herbicida, conduce a su muerte. Cuando las plantas susceptibles
se tratan con glifosato, el herbicida inhibe la EPSPS por lo que el sustrato no
puede continuar su vía metabólica normal y se convierte en shikimato, el sustrato
33
desfosforilado de la enzima, el cual se acumula en la planta al no poder ser
consumido en cantidad suficiente por otras vías metabólicas (Amrhein et al. 1980)
El shikimato es un buen marcador de la actividad del glifosato en las plantas; se
presenta en concentraciones suficientemente altas como para permitir su
detección analítica; por ser químicamente estable permite un procesamiento fácil
de las muestras, y es biológicamente relevante, dada la magnitud del flujo de
carbono a través de la vía del shikimato (Mueller et al. 2008). Dosis subletales de
glifosato causan un aumento transitorio de los niveles de shikimato endógeno, que
son bajos en la mayoría de plantas, alcanzando un pico entre 4 a 7 días después
de la aplicación (dda), para luego descender (Anderson et al. 2001; Henry et al.
2007).
El descubrimiento del mecanismo de acción del glifosato se debió, en gran
medida, a que la adición de varias combinaciones de tres aminoácidos aromáticos
(fenilalanina, tirosina y triptofano), a plantas después de ser tratadas con el
herbicida, revertía en parte el daño (Shaner y Lyon 1980); y a la muy rápida y alta
acumulación de ácido shikímico en los tejidos de plantas después de la aplicación
(Steinrucken y Amrhein 1980).
La resistencia al glifosato por una alteración en el sitio activo de la enzima blanco,
usualmente confiere niveles bajos de resistencia (de 2 a 4 veces), comparado con
la resistencia por transporte reducido (Dinelli et al. 2006; Kaundun et al. 2008;
Sammons y Gaines 2014). Esto contrasta con lo observado con otros herbicidas
(inhibidores de ALS o ACCasa), para los que las mutaciones en la enzima blanco,
generalmente confieren niveles de resistencia muy altos (Cruz-Hipólito et al. 2011;
Kaundun 2010; Warwick et al. 2008).
3.7.1.1 Mutaciones en la EPSPS
Las mutaciones en el gen de la enzima blanco, son uno de los principales
mecanismos que permiten la evolución de resistencia a glifosato (Gressel 2002;
34
Powles y Yu 2010); generalmente producen un nivel bajo de resistencia, ya que en
la competencia del glifosato con el sustrato PEP, se disminuye la capacidad
catalítica de la EPSPS (Yu et al. 2015; Schonbrunn et al. 2001).
Las mutaciones en el gen que codifica la enzima generalmente son sustituciones
de nucleótidos (Tranel y Wright 2002), aunque existe un reporte, para otro
herbicida (lactofen), donde se removió todo un codón de aminoácidos (Patzoldt et
al. 2006).
El primer caso de resistencia a glifosato en el sitio activo fue identificado en un
biotipo de E. indica, y se debió a una sustitución del aminoácido serina en la
posición Pro106 (Pro106Ser) en una región altamente conservada del gen de la
EPSPS (Baerson et al. 2002a). Esta misma mutación se había identificado en
estudios previos de laboratorio con Salmonella typhimurium y produjo altos niveles
de resistencia cuando se introdujo en E. coli (Comai et al. 1983), y niveles
moderados en Petunia (Padgette et al. 1991).
La mayoría de mutaciones que confieren resistencia al glifosato corresponden al
sitio Pro106, un aminoácido hidrofóbico de la EPSPS y se presentaron como un
simple cambio de pares de bases en un nucleótido, sustituyendo el aminoácido
prolina, por los hidrofílicos serina (Pro106Ser), o treonina (Pro106Thr), o por los
hidrofóbicos alanina (Pro106Ala) o leucina (Pro106Leu) (Yu et al. 2015). El codón
Pro106 (CCx) puede mutar a la sustitución por Ser, Ala o Tre, comúnmente
reportada, en la primera base del codón (TCx, GCx y ACx respectivamente); las
sustituciones en la segunda base del codón pueden producir Leu (CTx, muy
infrecuentemente reportada), Arg (CGx), glutamina (CAA/G) o histidina (CAC/T)
(Sammons y Gaines 2014). Las mutaciones Pro106Arg, Gln y His no han sido
reportadas a la fecha.
Las poblaciones de malezas que presentan mutaciones simples son seis, más
frecuentemente en el género Lolium sp., incluido L. rigidum y L. multiflorum
(Perez-Jones et al. 2007; Kaundun et al. 2011; Bostaman et al. 2012; Collavo y
35
Sattin 2012), además D. insularis (de Carvalho et al. 2012), E. indica (Baerson et
al. 2002a), E. colona (Alarcon-Reverte et al. 2013) y A. tuberculatus (Nandula et al.
2013; Bell et al. 2013), la primera dicotiledónea reportada con una mutación.
Los índices de resistencia (IR) de las poblaciones de malezas con mutaciones
individuales (un solo codón), cuando es el único mecanismo de resistencia
involucrado, son relativamente bajos. En E. indica son de 2 a 4 (Baerson et al.
2002a; Ng et al. 2003, 2004b; Kaundun et al. 2008), en L. multiflorum de 2 a 5
(Jasieniuk et al. 2008), en L. rigidum de 2 a 3 (Wakelin y Preston 2006), y en E.
colona son de orden moderada, de 4 a 9 (Alarcón-Reverte et al. 2014).
Estos bajos niveles de resistencia que confieren este tipo de mutaciones, se
explican debido a que el amino ácido Pro106 no está directamente involucrado en
el enlace del PEP o del glifosato en la EPSPS (Sammons et al. 2007; Arnaud et
al.1998); pero las sustituciones en este sitio, cambian la orientación de los otros
dos aminoácidos, se reduce la afinidad con el glifosato, sin alterar el sitio de unión
para el S3P o PEP y solo provocan un mínimo efecto en la eficiencia catalítica de
la enzima (Healy-Fried et al. 2007; Schonbrunn et al. 2001; Stallings et al. 1991;
Zhou et al. 2006).
Cuando estas mismas poblaciones evolucionan además con otro mecanismo de
resistencia, su IR aumenta. Por ejemplo, en L. rigidum la mutación P106T confiere
un IR de 2 a 3, pero en los individuos que además presentan una reducción del
transporte del herbicida, su IR se incrementa a valores entre 8 a 11 (Bostaman et
al. 2012).
Gaines et al. (2010) encontraron biotipos de A. palmeri de Georgia, Estados
Unidos, resistentes a glifosato con un cambio de aminoácidos en el codón 316 de
la EPSPS (arginina por lisina), pero esta mutación no fue considerada como la
causa de la resistencia, ya que la enzima era igualmente inhibida en plantas R y S.
36
Las mutaciones en la EPSPS también involucran el cambio en dos codones, lo
que se conoce como doble mutación. Antes de que se presentaran de forma
natural y en la búsqueda de cultivos tolerantes al glifosato, a nivel de laboratorio
se habían generado varias mutaciones dobles en la EPSPS expresadas en E. coli
y en plantas (Spencer et al. 2000; Howe et al. 2002; Lebrun et al. 2003; Kahrizi et
al. 2007; Alibhai et al. 2016). Incluso, la doble mutación fue usada para producir la
primera generación comercial exitosa de un maíz transgénico (GA21) resistente a
glifosato (Spencer et al. 2000) y para el mismo propósito Kahrizi et al. (2007),
patentaron tanto la T102I + P106T como la T102L + P106A.
También se ha identificado una doble sustitución de aminoácidos, T102I + P106S
(conocida como TIPS), en E. indica de China (Chen et al. 2015; Han et al. 2017) y
de Australia (Yu et al. 2015) que produjo altos niveles de resistencia al glifosato
con una aceptable afinidad por PEP, o sea sin presentar penalidades por
adaptación. Este tipo de mutaciones dobles tienen frecuencias más bajas que las
mutaciones simples en un solo nucleótido (10-18 en lugar de 10-9) (Gressel y Levy
2006).
Yu et al. (2015), encontraron que plantas de E. indica con mutación simple en el
sitio P106S, eran moderadamente resistentes a glifosato (IR de 5,6), mientras que
plantas con doble mutación eran altamente resistentes (más de 180 veces). Las
plantas TIPS podían resistir más de 20 veces la dosis recomendada de glifosato (1
080 g ha-1), pero presentaban problemas en su crecimiento (costo por fitness).
Un dato curioso referente a respuesta al herbicida, lo encontraron Han et al.
(2015), en plantas de E. colona, resistentes a glifosato por tener una o dos
mutaciones en el mismo sitio Pro106; estas eran controladas con la dosis comercial
(450 g e.a. ha-1) cuando se aplicaron bajo condiciones de temperatura de 20 a 25
ºC; sin embargo, cuando eran tratadas en condiciones más cálidas (30 a 35°C), la
mayoría (68%) pudieron sobrevivir y se encontró un incremento, tanto para
biotipos R y S, en la dosis letal media (DL50) de 2,5 veces.
37
3.7.1.2 Sobreexpresión de la EPSPS
Uno de los mecanismos de resistencia al glifosato descubierto recientemente en
malezas, específicamente en A. palmeri, una de las principales malezas en el Sur
de los Estados Unidos, es contar con numerosas copias del gen EPSPS en su
genoma; además, este mecanismo dentro de esta población, se correlacionó con
la transcripción, nivel proteico y actividad de la EPSPS (Gaines et al. 2010). El
mismo fenómeno de amplificación fue encontrado en poblaciones de A.
tuberculatus por Tranel et al. (2011).
La duplicación de genes se define como la replicación heredable de un segmento
de ADN, lo que resulta en una o más copias de genes dentro del genoma de un
organismo (Innan y Kondrashov 2010); es un evento vital para generar diversidad
genética y un proceso común en la historia evolutiva de las plantas (Flagel y
Wendel 2009).
Algunos biotipos de L. multiflorum de Arkansas, Estados Unidos, son resistentes a
glifosato gracias a una mayor actividad de la EPSPS debido a este fenómeno
(Salas et al. 2012). Otro resultado similar, pero en cultivos celulares, atribuía la
resistencia al incremento en la actividad enzimática, particularmente debido a una
amplificación de genes y no a una EPSPS menos sensible (Pline-Srnic 2006). Esto
permite a esas plantas superar los efectos inhibitorios del herbicida, posiblemente
al proveerles enzima en exceso para unir el sustrato fisiológico PEP, aún en
presencia de glifosato (Zmienko et al. 2014)
También hace varias décadas, Nafziger et al. (1984), encontraron en una línea de
zanahoria silvestre tolerante a glifosato, un incremento de 12 veces en su
actividad enzimática debido a un aumento entre 4 a 25 veces del número de
copias del gen de la EPSPS (Suh et al. 1993). De forma similar, petunias híbridas
con 20 veces más actividad enzimática, poseían 20 veces más copias de genes
de la EPSPS que el testigo (Steinrucken et al. 1986).
38
En plantas, el gen de la EPSPS normalmente tiene pocas copias.
Monocotiledóneas como el arroz, tienen una sola copia por genoma haploide (Xu
et al. 2002). Los cambios en el número de copias pueden ofrecer una vía para
alterar rápidamente la dosificación efectiva de un gen, que afecta directamente y
en grado variable, al fenotipo.
En el caso anterior, la distribución aleatoria de la copia de genes en el genoma de
la EPSPS, sugiere la participación de elementos de trasposición en la creación de
esas nuevas copias (Gaines et al. 2010). Dillon et al. (2016) sugieren que el
evento inicial de duplicación de genes de la EPSPS de A. tuberculatus pudo haber
ocurrido debido a la desigualdad de la recombinación mediada por el ADN
repetitivo; posteriormente, la amplificación génica se habría dado a través de otros
mecanismos, tales como reordenamientos cromosómicos, deleción o inserción,
dispersión mediada por transposón o posiblemente por hibridación interespecífica.
La amplificación génica en A. palmeri es un evento muy complejo, que incluye una
unidad de amplificación multigénica (EPSPS cassette) que entre otros elementos,
contiene genes de respuesta al estrés (Molin et al. 2017).
En biotipos R de L. rigidum se encontró un incremento de tres veces en los niveles
basales de la actividad enzimática, no debido a una amplificación del gen, sino por
un aumento del RNAm de la EPSPS (Baerson et al. 2002b). También Dinelli et al.
(2008) encontraron niveles altos de RNAm de la EPSPS en varios biotipos de C.
bonariensis R, que complementaban el principal mecanismo de resistencia, que
era la reducción del transporte de glifosato. Recientemente, Tani et al. (2015),
encontraron que el mecanismo de resistencia al glifosato en biotipos de C.
canadensis de Grecia, se debía a la sincronización de los genes de expresión de
la EPSPS con los genes transportadores ABC; este mecanismo se basó en el
tiempo de inducción y duración de la expresión génica y en la regulación por la
carga inicial de glifosato.
39
3.7.2 Independientes del sitio de acción
3.7.2.1 Detoxificación por metabolización
Aunque algunas malezas podrían tener la habilidad de metabolizar al glifosato
como su mecanismo de tolerancia (Duke 2011), a la fecha no existen reportes en
la literatura de malezas que hayan evolucionado resistencia a glifosato debido a
un aumento en la metabolización del herbicida (Roso y Vidal 2010). La
monocotiledónea Commelina benghalensis, puede convertir hasta el 41% del
glifosato en AMPA 72 horas después de aplicado (hda), lo que le confiere
tolerancia al herbicida (Monquero et al. 2004); sin embargo, luego de evaluar
metabolismo de glifosato en muchas especies, se encontró que no hay una
relación entre la conversión a AMPA y el nivel de resistencia a glifosato (Reddy et
al. 2004; Simarmata et al. 2003).
De Carvahlo et al. (2011), empleando electroforesis capilar de polaridad inversa,
afirman que biotipos resistentes de la planta D. insularis, eran capaces de
degradar más del 90% del glifosato aplicado en AMPA, glioxilato y sarcosina 168
hda, mientras que biotipos susceptibles lo hacían en proporciones menores (11%);
otro caso similar lo presentaron González-Torralva et al. (2012) en C. canadensis.
Conociendo el hecho de que esos compuestos, provenientes de la degradación
del glifosato, son fácilmente metabolizados en las plantas, Sammos y Gaines
(2014) expresan que esa detección requiere ser confirmada por otros medios;
además, basándose en lo citado por Spencer et al. (2000), no es claro si el
glifosato es metabolizado por la planta o por microorganismos presentes en la
superficie de la hoja donde fue aplicado el herbicida.
Sabiendo que algunas leguminosas pueden oxidar el glifosato en AMPA (Reddy et
al. 2008), sería estimulante investigar este mecanismo que ha sido ampliamente
obviado para determinar si la degradación del herbicida podría contribuir con la
resistencia (Sammons y Gaines 2014).
40
3.7.2.2 Absorción o transporte reducido
Para que un herbicida sea letal, debe alcanzar su sitio de acción en una
concentración suficiente. Los herbicidas sistémicos aplicados al follaje tienen que
moverse desde la superficie de las hojas hacia el floema, en cantidades
suficientes para ser transportados hacia otras partes de la planta; los herbicidas de
contacto deben al menos ingresar a las hojas (absorción) ( Currier y Dybing
1959). La falta de transporte de un herbicida posibilitará reducir su concentración
en el sitio de acción, lo que permitirá a la planta mantener su desarrollo (Busi et al.
2013). Estas bajas concentraciones pueden lograrse, ya sea mediante una
reducción en la penetración o en el transporte, o por la secuestración en organelas
celulares.
Se han propuesto varias hipótesis para explicar los mecanismos que reducen el
transporte del glifosato en la planta (Shaner 2009; Roso y Vidal 2010): a- cambio
en el transportador que traslada el glifosato dentro de la célula; b- incremento en la
acción del transportador que traslada el glifosato a la vacuola; c- aumento de las
bombas de flujo activo de glifosato; d- incremento en la acción del transportador
que traslada el glifosato fuera del cloroplasto; e- reducción del movimiento del
glifosato hacia el cloroplasto; f- inhabilidad del glifosato de reentrar al floema
desde el cloroplasto.
Roso y Vidal (2010), proponen que las anteriores hipótesis se pueden integrar en
una “Teoría de las Proteínas Transportadoras de Fosfato Modificadas”, ya que
debido a las fuertes propiedades adherentes de la parte fosfonada del glifosato, es
posible que cualquier transportador fosfato proteico pueda trasladar este herbicida
a través de la membrana. Así, uno o más de los muchos tipos de proteínas
transportadoras, pueden estar involucrados en la evolución de resistencia.
La reducción en el transporte interno del glifosato en la planta es un mecanismo
común de resistencia en C. canadensis y en L. rigidum, que provoca niveles de
resistencia generalmente altos (de 8 a 12 veces), comparados con otros
41
mecanismos como las mutaciones en la EPSPS, que ofrecen niveles bajos (2 a 3
veces) (Dinelli et al. 2006; Feng et al. 2004; Koger y Reddy 2005; Lorraine-Colwill
et al. 2003; Michitte et al. 2007; Preston y Wakelin 2008; Wakelin et al. 2004).
En biotipos R de C. bonariensis y C. canadensis se da este transporte
heterogéneo y reducido del herbicida hacia raíces, otras hojas y a tejidos
meristemáticos, con un incremento de la acumulación en las hojas tratadas (Dinelli
et al. 2008; Feng et al. 2004); de la misma forma en L. rigidum y L. multiflorum, el
glifosato parece quedar atrapado en la parte apical de las hojas tratadas (Perez-
Jones et al. 2007; Wakelin et al. 2004). En biotipos S de estas especies, el
glifosato absorbido, primero se mueve apicalmente con la corriente de
transpiración y luego es llevado al interior de las venas menores, moviéndose
fuera de la hoja tratada hacia el resto de la planta; en biotipos R, el glifosato
también se mueve apicalmente con la corriente de transpiración, pero no ingresa
tan rápido en las venas menores, por lo que menos cantidad de herbicida es
transportado fuera de la hoja tratada (Shaner 2009). Sin embargo, con el tiempo,
el glifosato entra al floema y es transportado, aunque en aproximadamente la
mitad de la cantidad que ingresa en los biotipos S. De esta forma, el herbicida
produce serios daños y muerte en los tejidos aplicados, pero no en los
meristemos, que parecieran estar protegidos de la dosis letal y rebrotan después
de unas semanas (Ge et al. 2010).
Otro fenómeno que afecta el transporte de glifosato en la planta, e involucra
transportadores, encontrado en estudios sobre selectividad de sustratos y
competencia (Sammons y Gaines 2014), es el rápido secuestro vacuolar del
herbicida; estos autores proponen que, así como los cloroplastos requieren de
transportadores para obtener metabolitos importantes, de forma inversa, los
transportadores asociados con las dos membranas plastídicas pueden muy
exitosamente, de forma conjunta o separada, bloquear la entrega del glifosato al
cloroplasto. En biotipos resistentes a glifosato de C. canadensis, el rápido
secuestro vacuolar ha sido propuesto como la causa de la reducción del
42
transporte, siendo su principal mecanismo de resistencia (Ge et al. 2010; Ge et al.
2011), y en estudios de herencia genética posteriores se encontró que el
secuestro vacuolar es un rasgo dominante importante (Zelaya et al. 2004).
La proporción de secuestro vacuolar del glifosato es alta en algunos biotipos R. Ge
et al. (2012), citan para L. rigidum, que una gran fracción del glifosato es retenido
en la vacuola (69% 14 hda y 90% 24 hda) y que una vez que ingresa a la célula,
no sale fácilmente de ésta; lo anterior también fue observado en C. canadensis
(Ge et al. 2010). Estudios recientes con la misma planta (Ge et al. 2014),
concluyen que la entrada del glifosato a la vacuola ocurre de forma activa, por
medio de transportadores de ATP (adenosin trifosfato) como sucede en las células
de mamíferos. Este secuestro anormal del glifosato podría ser debido a la
sobreexpresión de transportadores vacuolares, lo que apoya la hipótesis de que el
herbicida penetra en la corriente de asimilados, se mueve de célula a célula pero
no ingresa en el cloroplasto en cantidades suficientes o por un periodo extenso, no
llegando a inhibir suficiente cantidad de EPSPS (Kleinman y Rubin 2016).
La resistencia fuera del sitio activo es heredable y puede asociarse a mutaciones
en genes que no están directamente relacionados con el sitio de acción (Beckie y
Tardif 2012).
4. Materiales y Métodos
4.1 Diagnóstico del uso de glifosato
Durante el 2012 se visitaron fincas de producción comercial de cultivos perennes
de la zona Huetar Norte, Huetar Atlántica, Pacífico Central y Pacífico Sur,
principalmente, y se entrevistó a los encargados del manejo de malezas
(agrónomos, productores, aplicadores), para determinar las prácticas de manejo
químico de las malezas. Se aplicó una guía de entrevista por finca (Anexo 1)
43
validada previamente en varios proyectos de investigación sobre uso de
plaguicidas en cultivos agrícolas; se incluyeron preguntas sobre uso cronológico
de plaguicidas en el último ciclo de producción (un año), datos sobre
formulaciones, dosis, frecuencias, descargas y equipo de aplicación utilizado. Se
preguntó sobre problemas de control de malezas, especies involucradas,
presencia de P. paniculatum y, en caso positivo, historial de uso de métodos de
control de malezas y cambio en el uso ingredientes activos de herbicidas.
Las fincas visitadas son productoras de palma africana, cítricos y pejibaye para
palmito. Para el caso de palma africana, las entrevistas se realizaron en fincas
ubicadas en los cantones de Laurel, Palmar Sur, Corredores, Quepos y Parrita, de
la provincia de Puntarenas y una localidad de Siquirres, en la provincia de Limón,
para un total de 13 fincas que sumaron 36 246 ha (60% del área nacional cultivada
ese año). Las 4 fincas productoras de cítricos visitadas se ubicaron en cantones
de la zona norte del país: Santa Cecilia, Los Chiles y Guatuso de Alajuela y
abarcaron un área de 7 801 ha (36% del área nacional sembrada). Para el caso de
palmito se evaluaron 10 fincas ubicadas en Guápiles, Siquirres, Guácimo y Cariari,
cantones de la provincia de Limón, que en total sumaron 598 ha (8% del área
nacional sembrada).
4.2 Respuesta de biotipos de P. paniculatum al glifosato
4.2.1 Origen de la semilla
Para determinar la respuesta de biotipos de P. paniculatum al glifosato, se
realizaron bioanálisis de invernadero con plantas enteras, cultivadas a partir de
semillas recolectadas en fincas comerciales dedicadas a la producción de cultivos
perennes, particularmente de pejibaye para palmito (Bactris gasipaes Kunth) y
banano (Musa sp.), donde han tenido problemas de control de esta maleza y se
sospecha resistencia a glifosato (biotipos R). Estas fincas se ubican en la Región
Huetar Atlántica de Costa Rica, en el cantón de Pococí, provincia de Limón y los
44
biotipos evaluados se nombraron como B, D y L. La semilla de las plantas
susceptibles (biotipos S) se recolectó de lugares donde la población no ha sido
expuesta al glifosato: una finca dedicada al cultivo de banano orgánico en la
comunidad de Shiroles (biotipo H), cantón Talamanca, Limón, en la Reserva
Indígena Bribri, que nunca ha estado expuesta al herbicida; el Campus Omar
Dengo de la Universidad Nacional en Heredia (biotipo C) y un borde de camino en
San Juan de Santa Cruz, Guanacaste (biotipo T). En estos últimos dos lugares el
glifosato se había aplicado no más de una vez al año, en años no consecutivos y
se había alternado con controles mecánicos y manuales.
Figura 5. Origen geográfico de biotipos de P. paniculatum. B, D y L son biotipos resistentes a glifosato y T, C y H biotipos susceptibles.
Las semillas se recolectaron manualmente de plantas con inflorescencias maduras
en proceso de desprendimiento de sus semillas, se colocaron en bolsas de papel,
se identificaron y se llevaron al laboratorio para su secado, limpieza y almacenado
en cámara fría a 4°C. Posteriormente, las semillas se colocaron en platos petri con
45
papel de filtro de grado para germinación (Advantec No. 131, Tokio Roshi Kaisha,
Japón) humedecido con una solución de nitrato de potasio (0,2% p/v) en una
cámara de germinación bajo luz fluorescente continua a 30ºC. Cuando las
plántulas alcanzaron una altura de aproximadamente 1 cm se trasplantaron a
bandejas con una mezcla comercial de sustrato de crecimiento (Pindstrup,
Dinamarca) y suelo (50/50) y se colocaron en el invernadero (Investigación y
Desarrollo en Agricultura Tropical S.A., Tambor, Alajuela) donde se mantuvieron
por tres semanas antes de su trasplante definitivo a macetas para ser tratadas de
una a tres semanas después con el herbicida.
Las macetas, con un volumen de 100 dm3, se llenaron con medio de crecimiento
(el mismo usado anteriormente en las bandejas) y suelo suplementado con 2 g de
fertilizante químico granulado (10-30-10). En cada maceta se trasplantó una
plántula de P. paniculatum que creció en un invernadero protegido por malla
antiáfidos, con techo plástico transparente y con riego aplicado dos veces al día.
4.2.2 Respuesta a dosis crecientes de glifosato
Se determinó la respuesta de los seis biotipos a dosis crecientes de glifosato en
dos estados de crecimiento: edad I (plantas de hasta 5 hojas y sin hijos) y edad II
(plantas con 1 a 3 hijos) (Figura 6). Las plantas se asperjaron una sola vez con
una dilución de la formulación comercial de glifosato (Roundup, Monsanto) que
contiene 360 g de equivalente ácido (e.a.) de glifosato por litro, con un equipo
portátil accionado por CO2 y calibrado para descargar 200 L ha-1 a través de una
boquilla de abanico plano 8002 (Spraying Systems) sostenida a una altura de 50
cm. Una vez que el follaje tratado se secó, las macetas se transfirieron de nuevo al
invernadero. Cada bioanálisis consistió de un biotipo asperjado con ocho dosis y
dos testigos sin tratar, para un total de 10 plantas por repetición (Cuadro 2),
dispuestas en un diseño experimental de bloques completos al azar con 5
repeticiones. Cada experimento se repitió al menos una vez en el tiempo.
46
Cuadro 2. Dosis de glifosato para determinar la respuesta en biotipos selectos de P. paniculatum.
Tratamiento Biotipos S Biotipos R
Dosis
g e.a.ha-1 L p.c.ha-1 * g e.a.ha-1 L p.c.ha-1
Testigos 0 0 0 0
1 5,62 0,016 22,5 0,063
2 11,2 0,031 45 0,125
3 22,5 0,063 90 0,25
4 45 0,125 180 0,5
5 90 0,25 360 1
6 180 0,5 720 2
7 360 1 1.440 4
8 720 2 2.160 6
*p.c.: producto comercial; se utilizó la formulación Roundup (Monsanto) en solución acuosa que contiene 360 g e.a. L-1.
La respuesta de las plantas al glifosato se evaluó mediante la estimación visual del
porcentaje de daño foliar a los 21 dda. La escala porcentual de daño varió entre 0,
que representa la ausencia de daño (crecimiento y condiciones de la planta
idénticas a las del testigo sin tratar) y 100, que corresponde a la muerte de la
planta (sin presentar tejido vivo).
Después de la evaluación visual, las plantas se cortaron a 0,5 cm del suelo y se
determinó su peso fresco; el peso fresco puede ser más válido que el peso seco
porque las plantas que se han necrosado o muerto recientemente, pueden tener el
mismo peso seco que las plantas que se notan verdes y saludables (Santelman
1977).
Para cuantificar el efecto del glifosato en cada biotipo se determinó el valor de la
DE50, que corresponde a la dosis de herbicida que reduce el crecimiento (peso
fresco) de la planta a la mitad del logrado por las plantas testigo. Los valores de
DE50 se calcularon basados en la curva de respuesta a dosis crecientes, usando el
modelo logístico descrito por Seefeldt et al. (1995). Este modelo usa la siguiente
47
ecuación para expresar la biomasa (peso fresco) en relación al testigo y la dosis x
del herbicida:
Donde U ij denota la respuesta a la dosis j del herbicida i; D representa el límite
superior del crecimiento de las plantas a la concentración cero (testigo); Ci es el
límite inferior a la dosis más alta del herbicida i, y b i es la pendiente de la curva de
respuesta cerca de la DE50 (i). Los valores están expresados en gramos de e.a. de
glifosato.
El índice de resistencia (IR) se calculó como la razón de los valores de DE50 del
biotipo R y del biotipo S. Se consideró que el biotipo evaluado era efectivamente
resistente cuando su valor de IR fue superior (estadísticamente, con base en su
intervalo de confianza) a 2,0 (Heap 2017).
4.3 Determinación de resistencia fuera de sitio activo
4.3.1 Distribución del glifosato radio marcado en la planta
Para evaluar la distribución del glifosato en la planta (absorción, transporte y
exudación) se utilizaron los tres biotipos R y los tres S de P. paniculatum
evaluados en los experimentos de dosis respuesta a glifosato.
Se obtuvieron plantas a partir de semilla, usando el mismo procedimiento antes
mencionado, y se mantuvieron en un invernadero del Departamento de Ciencias
Ambientales, Suelos y Cultivos de la Universidad de Arkansas en Fayetteville, a
una temperatura promedio de 34/24 ±3 °C (diurna/nocturna) y un fotoperiodo de
12 horas. Se utilizaron plantas de las mismas edades que para los experimentos
de dosis respuesta: edad I (5 hojas) y edad II (1 a 3 hijos) (Figura 6).
48
Figura 6. Plantas de P. paniculatum de edad I (A) y edad II (B) usadas en las
pruebas con glifosato radio marcado (Fotos por F. Ramírez).
De 8 a 10 días antes de la aplicación, las plantas se trasplantaron en potes
individuales de 2 × 2 × 3 cm que contenían una mezcla de 80% de arena lavada y
20% de suelo cernido con un tamiz número 8 (2,36 mm apertura). Se tomó la parte
media (1,5 cm) de la segunda hoja totalmente abierta para la edad I y la misma
hoja del hijo principal para la edad II, se marcó con un marcador permanente y se
cubrió con papel aluminio. Las plantas se asperjaron con glifosato a razón de 720
g e.a. ha-1 en una cámara de aspersión utilizando un aguilón con dos boquillas de
abanico plano 800067, calibradas para descargar 168 L ha-1 a una presión de 2,5
kg por cm cuadrado (36 libras por pulgada cuadrada (psi)). Como fuente de
glifosato se usó la formulación comercial Roundup Power Max (Monsanto Co., 660
g de glifosato como sal potásica por litro) diluida en agua deionizada.
Después que la aplicación del herbicida se secara (15 minutos), las plantas se
trasladaron al Laboratorio de Carbono 14 (Universidad de Arkansas, Altheimer,
Fayetteville), se removió el papel aluminio y se procedió a aplicar en la zona
previamente cubierta, cuatro gotas de 1 µL de una solución marcada (Figura 7). La
solución se preparó añadiendo glifosato C14 (ácido fosfonometil radio marcado,
American Radiolabeled Chemicals, ARC 1313, Inc. 2,0 GBq mmol-1) a un volumen
de la dilución asperjada suficiente para obtener una solución con una actividad
específica de 0,37 kBq µl-1.
A B
49
Figura 7. Aplicación de glifosato radio marcado a plantas de P. paniculatum (Fotos
por F. Ramírez).
La aplicación de la solución marcada se realizó con una micro jeringa de 50 µL
(Hamilton Co.), equipada con un dispensador repetitivo. Una vez que las gotas
aplicadas sobre las hojas se secaron, las plantas se retornaron al invernadero
para hacer las evaluaciones a las 24, 48, 72 y 96 hda para la edad I y a las 24, 48
y 72 hda para la edad II.
Los resultados se analizaron mediante Análisis de Varianza Permutacional
(Permanova) (Anderson 2001), seguido de la comparación de medias por medio
de t de Student, en los casos en que el análisis principal detectó diferencias
significativas (P ≤ 0,05) entre tratamientos.
Para realizar el Permanova se utilizó el método de permutación de datos crudos
sin restricción (Unrestricted permutation of raw data), se aplicó la suma de
cuadrados parcial (Tipo III), y se utilizó la distancia euclidiana para construir las
matrices de datos. A diferencia de los programas estadísticos tradicionales,
Permanova calcula los valores de P mediante permutaciones y no mediante
tablas. A pesar de que es un método multivariado, puede ser utilizado para
análisis univariado y, aplicado a una variable de respuesta y usando la distancia
euclidiana, produce la tradicional distribución univariada de Fisher (F de Fisher)
(Anderson 2010).
50
El uso de Permanova resulta conveniente en el análisis univariado ya que
proporciona cierta flexibilidad en cuanto a los supuestos que el set de datos debe
cumplir, por ejemplo no es necesario que los datos se distribuyan normalmente
para poder aplicarlo. El programa estadístico PRIMER v6 + PERMANOVA
(PRIMER-E Ltd.) fue utilizado para realizar los análisis estadísticos.
4.3.1.1 Absorción
Para la medición de la absorción, se procedió a lavar el área aplicada con glifosato
radio marcado usando 2 ml de metanol + 10 ml de líquido centellante. La solución
de lavado resultante se recolectó en un vial de centelleo de 20 ml para su posterior
lectura de radioactividad en un Espectrómetro de Centelleo Líquido (LSS)
(Packard Tri-Carb 2100TR Liquid Scintillation Spectrometer, Packard Instrument
Co.). El valor de esa medición se considera como la parte del glifosato que no fue
absorbida por la planta para ese tiempo de evaluación. Se tuvieron dos testigos
por biotipo y por experimento para determinar el valor basal de radioactividad sin
aplicación de glifosato radio marcado. Cada experimento contó con 5 repeticiones
por biotipo y fue repetido dos veces.
4.3.1.2 Transporte
Los patrones de transporte de glifosato C14 se determinaron siguiendo el método
usado por Riar et al. (2011) y Vila-Aiub et al. (2012).
Luego de hacer el lavado para medir absorción, las plantas se dividieron
cortándolas en 5 partes: la parte apical de la hoja tratada, incluyendo la zona
tratada (parte 1); la base de la hoja tratada (parte 2); el follaje por encima de la
hoja tratada (parte 3); el follaje por debajo de la hoja tratada o culmo (incluyendo
los hijos para la edad II) (parte 4); y las raíces (parte 5) (Figura 8).
51
Figura 8. Partes de la planta usadas para determinar el transporte de glifosato. Edad I. 1: ápice de hoja aplicada; 2: base de la hoja aplicada; 3: follaje por encima de la hoja tratada; 4: follaje por debajo de la hoja tratada; 5: raíces.
Cada parte de la planta se cortó y se envolvió individualmente con cinta comercial
adhesiva transparente (Scotch Magic tape), se colocó en un sobre identificado y
se secó por 72 horas en un horno a 50°C. Posteriormente, los tejidos secos se
incineraron en una oxidadora biológica (OX500, R.J. Harvey Instrument
Corporation), y el CO2 producido se atrapó en 15 ml de líquido centellante para
luego medir su radioactividad por LSS. Cada tratamiento se repitió 5 veces y el
experimento se repitió en el tiempo. La distribución del C14 en la planta se expresó
como el porcentaje de la radioactividad absorbida.
4.3.1.3 Exudación
Para determinar si el glifosato fue exudado por la raíz, después de obtener la
solución de lavado del glifosato no absorbido, se extrajo la planta del pote, se lavó
la raíz y el medio con 4 mL de metanol, el líquido se decantó y colocó en un vial de
52
20 mL para centelleo al cual se adicionaron 10 mL de líquido centellante para su
posterior lectura de radioactividad por LSS. Se designaron dos testigos (sin
glifosato radio marcado) por biotipo y por experimento para determinar el valor
basal de radioactividad que presentaba la arena y el sustrato de la raíz. Cada
experimento contó con 5 repeticiones por biotipo y fue repetido.
4.3.2 Metabolismo de glifosato
Para determinar si la resistencia era debida a una metabolización del herbicida, no
esperada en biotipos S, se tomaron únicamente plantas de los tres biotipos R y de
la misma forma que para los experimentos de invernadero, se asperjaron con una
solución de glifosato a una dosis de 360 g e.a. ha-1. Después de la aplicación, las
plantas se trasladaron al invernadero y 7 dda se cosecharon las hojas más
jóvenes de 60 plantas por biotipo, 30 aplicadas y 30 sin aplicar (testigos), las
cuales se lavaron con agua potable y luego con agua destilada para eliminar el
glifosato superficial que no fue absorbido.
Una vez secas, cada grupo de 30 hojas se dividió en tres submuestras, se
introdujeron en bolsas de papel y se congelaron a -18°C. Posteriormente se
enviaron al Laboratorio de Análisis de Residuos de Plaguicidas (LARP) del
Instituto Universitario de Plaguicidas y Aguas (IUPA) de la Universidad Jaume I
(Castellón, España), para el análisis de residuos del herbicida glifosato y de su
principal metabolito, AMPA.
Tras su recepción, las muestras foliares se homogenizaron con un triturador tipo
molino (Minimoka GR 020) y se conservaron a -18ºC hasta su análisis. Tras
varias experiencias para ajustar la metodología analítica, sobre la base de trabajos
previos sobre glifosato en suelos (Botero et al. 2013), finalmente el procedimiento
aplicado fue el que se indica en la figura 9.
53
Figura 9. Procedimiento para la extracción de glifosato y AMPA.
0,5 g de muestra homogenizada
Agitación mecánica (1 hora)
20 mL agua calidad MQ
Centrifugación (10 min /4500 rpm)
Dilución x 10 con agua MQ
Cartuchos OASIS HLB (60 mg) Acondicionamiento: 2 mL MeOH+ 2 mL H2O
1.5 mL de extracto diluído x10
Derivatización con FMOC
Se recoge el extracto no retenido
5 µL de HCl hasta pH 1.5
UHPLC-MS/MS (QqQ)
1 mL de extracto
Reacción durante toda la noche
Paso del extracto a través de un filtro de 0,45 µm con jeringa
60 µL de tampón borato 5%
60 µL de FMOC-Cl 12000 ppm
PROCEDIMIENTO PARA LA DERIVATIZACIÓN
25 µL de Patrón Interno 12.1 µg/mL
CLEAN-UP
54
Determinación de AMPA mediante LC-MS/MS
El análisis de las muestras se llevó a cabo mediante cromatografía líquida (LC) de
fase inversa acoplada a espectrometría de masas en tándem (MS/MS) usando
interfase electrospray (ESI) (Espectrómetro de masas TQD (quadrupolo-hexapolo-
quadrupolo) con interfase ortogonal Z-spray-electrospray (Waters, Milford, MA,
USA), previa derivación de los compuestos analizados con FMO, utilizando las
siguientes condiciones cromatográficas:
Columna: Discovery C18, 5 µm, 5 2,1 mm (Supelco)
Fase móvil: gradiente acetonitrilo / agua (ambos con una concentración de 0,5 mM de tampón NH4Ac/HAc) *HAc= Ácido acético, HCH2COOH
Volumen de inyección: 20 µL
Flujo: 300 µL/min
Tiempo de análisis cromatográfico: 8 minutos
Las características de la gradiente utilizada para la cromatografía de metabolitos se
encuentran en Anexo II, cuadro A1.
Condiciones para la determinación de metabolitos por espectrometría de masas
Interfase electrospray en modo positivo (ES+)
Voltaje capilar: +3,5 kV (ES+)
Gas desolvatación: nitrógeno seco, aproximadamente 600 L hora-1 a 350ºC
Gas colisión: argón C-45 a 3,0 x 10-3 mbar
Temperatura de la fuente: 120oC
Las condiciones MS/MS utilizadas para determinar los analitos, se encuentran en
Anexo II, cuadro A2.
Análisis de muestras
Después de varias pruebas para ajustar la metodología analítica aplicada, la
cuantificación se llevó a cabo mediante calibrado en solvente, entre 25 y 500 ng
mL-1, utilizando el 13C215N-glifosato a modo de patrón interno, que se encontraba a
55
una concentración constante de unos 250 ng mL-1. Se hicieron dos repeticiones
para cada muestra y cada una de ellas se inyectó por duplicado.
Se realizó un análisis de control de calidad (QC) con muestras blanco fortificadas
con glifosato y AMPA a un nivel de 100 mg kg-1 en los tres biotipos no aplicados.
La adquisición de tres transiciones MS/MS, una para cuantificación (392,4>170) y
las otras para confirmación, junto con el tiempo de retención, permitieron confirmar
la identidad del analito en las muestras positivas o aplicadas (biotipos B, D y L).
Como transición de cuantificación, se utilizó la menos interferida por otros
componentes de la matriz, en vez de usar el criterio habitual basado en
seleccionar la que proporciona una mayor señal.
4.4 Determinación de la posible resistencia en sitio activo
4.4.1 Medición in vivo de la acumulación de shikimato
La medición de la acumulación de ácido shikímico en respuesta a la inhibición de
la EPSPS causada por el glifosato, es una forma rápida y precisa para cuantificar
el daño causado por el herbicida en plantas sensibles (Mueller et al. 2003).
La acumulación de shikimato después de la aplicación de glifosato se midió de dos
formas, en plantas de la edad II de todos los biotipos R y S de P. paniculatum. En
la primera se tomaron discos (tejido) de las láminas de hojas en crecimiento activo
de plantas sin tratar, se colocaron en tubos con varias dosis conocidas de glifosato
y se midió la concentración de shikimato 24 hda. Para la segunda forma se
tomaron discos de hojas en crecimiento activo de plantas que fueron previamente
tratadas con glifosato a una dosis de 720 g e.a. ha-1 y se midió concentración de
shikimato en varios tiempos (Sección 4.4.1.2). Los resultados de ambos
experimentos se analizaron mediante Análisis de Varianza Permutacional
(Permanova) (Anderson 2001), seguido de la comparación de medias por medio
56
de t de Student, en los casos en que el análisis principal detectó diferencias
significativas (P ≤ 0,05) entre tratamientos.
4.4.1.1 Tejido proveniente de plantas sin aplicar
Para la determinación de la concentración de ácido shikímico, se utilizó el método
sugerido por Shaner et al. (2005). A partir de plantas de biotipos R y S crecidas en
el invernadero, se tomaron, por medio de un sacabocados, discos de 4 mm de
diámetro de las hojas más nuevas de la planta, parcialmente extendidas; ya que la
mayor concentración de shikimato después de una aplicación de glifosato se
produce en las hojas más jóvenes. Experimentos como los conducidos por
Cakmak et al. (2009), concluyen que al comparar la concentración de shikimato en
plantas tratadas con glifosato y en plantas sin tratar, esta fue dos y 16 veces
mayor en hojas viejas y jóvenes, respectivamente.
Cada disco se colocó en un tubo con capacidad para 1 mL. Los tubos del
tratamiento testigo (sin glifosato) contenían 100 µL de fosfato de amonio 10 mM
(pH 4,4) más 0,1% (v/v) del surfactante Tween 80. Los tratamientos con glifosato
se distribuyeron en tubos que contenían 100 µL de fosfato de amonio 10 mM (pH
4,4), más 0,1% (v/v) del surfactante Tween 80 más las diferentes concentraciones
del herbicida en un rango entre 15,63 y 1 000 uM de glifosato.
Los tubos tapados se incubaron bajo luz fluorescente (150 mM m-2s-1) a 26°C por
18 a 22 horas. Después del periodo de incubación, los tubos se colocaron en un
congelador a -20°C hasta que la solución contenida se congelara y luego se
descongelaron en un baño maría a 60°C por 30 minutos. Seguidamente se le
adicionó a cada uno 25 µL de HCl 1,25 N, para llegar a una concentración final de
0,25 N de HCl en cada tubo. Luego se procedió a incubarlos de nuevo a 60°C por
15 minutos. Al final de esta incubación, el contenido de los tubos se tornó
uniformemente de un color verde grisáceo, indicando una completa penetración
del ácido en los tejidos. A partir de esta solución, se tomaron alícuotas de 25 µL y
se transfirieron a tubos nuevos añadiendo 100 µL de una solución de ácido
57
peryódico 0,25% (p/v) y m-peryodato 0,25% (p/v) y se incubaron a temperatura
ambiente (25°C) durante 90 minutos. Posteriormente se añadieron 100 µL de una
solución de hidróxido de sodio 6 N y sulfito de sodio 0,22 M. Dentro de los 30
minutos posteriores, se midió la densidad óptica de la solución resultante de cada
tubo en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 380 nm.
El valor basal de shikimato, medido en los tubos con discos sin glifosato, fue
restado del obtenido en cada tratamiento en que se usó el herbicida. Previamente
se desarrolló una curva estándar, añadiendo cantidades conocidas de shikimato
(Ácido Shikímico, Sigma Chemical Co., P.O. Box 14508, St. Louis, MO 63178) a
los tubos que contenían discos sin exponerlos al herbicida. Los niveles de
shikimato se expresan como miligramos de shikimato por mililitro de la solución de
HCl. El experimento completo se repitió tres veces.
4.4.1.2 Tejido proveniente de plantas aplicadas
Se realizó una variante del experimento anterior. Plantas de P. paniculatum
crecidas en el invernadero en iguales condiciones, se asperjaron con glifosato a
razón de 720 g e.a. ha-1 en una cámara de aspersión utilizando un aguilón con dos
boquillas de abanico plano 800067, calibradas para descargar 168 L ha-1 a una
presión de 2,5 kg cm2 -1. Luego, se retornaron al invernadero y se obtuvieron
discos de las hojas más jóvenes en tiempos de 6, 24, 48, 72, 96 y 144 hda. A los
discos se les aplicó el mismo procedimiento de extracción y medición de las
concentraciones de shikimato que a los obtenidos de plantas sin tratar (punto
4.4.1.1). El experimento completo se repitió tres veces.
4.4.2 Determinación de la concentración y actividad de la EPSPS
La extracción y determinación de la actividad de la EPSPS se llevó a cabo
siguiendo los procedimientos dados por Sammons et al. (2014) y Salas et al.
(2012). En un mortero se molieron, bajo nitrógeno líquido, 20 g (en cuatro grupos
de 5 g cada uno) de tejido foliar joven de plantas de biotipos R (L y D) y S (H y C)
58
y se colocaron a -80°C por unos minutos (min) hasta que se congelaran. Luego
cada grupo de 5 g se transfirió a tubos falcon que contenían 25 ml de buffer de
extracción en frío (100 mM MOPS, 5 mM EDTA, 10% glicerol, 50 mM KCl y 0,5
mM benzamidina) más 1% de polivinilpolipirrolidona (PVPP) y 70 µL de β-
mercaptoetanol preparado fresco. Las muestras se homogenizaron bajo agitación
continua por 5 minutos para evitar espuma y luego se centrifugaron por 40 min a
18 000 gravedades (g) a 4°C. En un beaker frío se decantó el sobrenadante y se
le añadió lentamente sulfato de amonio en polvo para obtener una concentración
de 45% p/v, agitando continuamente por 30 min y luego se centrifugaron a 30 000
g por 30 min a 4°C. Los extractos proteicos se precipitaron de la solución al
agregar gradualmente sulfato de amonio 80% p/v con una agitación constante;
luego se centrifugaron a 30 000 g por 30 min y a 4°C. Los perdigones obtenidos se
disolvieron en menos de 3 mL de buffer de extracción y se sometieron a diálisis
durante toda la noche en 2 L de buffer de diálisis (10 mM MOPS, 0,5 mM EDTA,
pH 7,0, 10% glicerol, 5 mM β–mercaptoetanol) por medio de un tubo de diálisis 10
000 MWC de 30 mm a 4°C. Las concentraciones proteicas se determinaron
usando el kit de análisis Bradford (Bio-Rad protein assay system; Life Science
Research, Hercules, CA) y la calidad enzimática se evaluó usando SDS-PAGE.
Los niveles de actividad de los extractos de EPSPS se determinaron usando el
ensayo radiométrico basado en HPLC como lo describe Padgette et al. (1987,
1988). Los ensayos se realizaron utilizando 10 μL de extracto incubado a 25 °C
durante 5 a 15 minutos (50 μL de reacciones incluyeron 50 mM de HEPES, 5 mM
de fluoruro de potasio, 1 mM de shikimato-3-fosfato, 0,5 mM de [1-14C] PEP y
1,073 GBq mmol-1 de sal de ciclohexilamonio (CFQ10004, Amersham Life
Science, Inc., Arlington Heights, IL) y 0,1 mM de molibdato de amonio, pH 7,0).
Las reacciones se detuvieron luego mediante la adición de 50 μL de una mezcla
de etanol:ácido acético 0,1 N, pH 4,5 (9:1, v/v) antes de la carga. Se inyectaron 30
μL de las reacciones apagadas en una columna de intercambio aniónico
Synchropak AX100 (No. 942804, PJ Cobert Associates, Inc., St. Louis)
59
equilibrada con tampón de fosfato de potasio 0,235 M, pH 6,5, y se eluyó
isocráticamente con el mismo tampón. Se usó un detector de flujo radiactivo
modelo D525 (Packard Instrument Co., Downer Grove, IL) para monitorear la
producción de [14C] EPSP en las reacciones.
Para las determinaciones de IC50 (concentración de glifosato que inhibe un 50% la
actividad de la EPSPS), los ensayos se realizaron en presencia de glifosato a
concentraciones que oscilaron entre 0,1 y 100 μM, a continuación se generaron
valores de curvas de inhibición y valores de IC50 (punto de inflexión) a partir de los
datos, mediante análisis de regresión no lineal, utilizando el paquete de software
GraFit (Leatherbarrow 1998).
4.4.3 Determinación de mutaciones en la EPSPS
4.4.3.1 Extracción de ARN mensajero y síntesis de ADN complementario
Para la extracción de ARN mensajero (ARNm) y síntesis de ADN complementario
(ADNc) se tomaron hojas nuevas de 20 plantas de dos biotipos R (L y D) y dos
biotipos S (H y C) de P. paniculatum y se almacenaron inmediatamente a -80°C
para su posterior análisis. Para la extracción de ARNm se tomó una muestra de
este tejido, se maceró en nitrógeno líquido usando un mortero y se aplicó el Mini
Kit RAN Pure Link (Ambion) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Para la síntesis del primer filamento de ADNc se utilizó el Oligo (dT) 20
suministrado en el kit de síntesis Improm-II Reverse Transcription System
(Promega, Madison, WI, USA). Las cadenas iniciales de oligos (dT) de ADNc
fueron producidas a partir de ARN tratado con 500 ng de DNAsa, utilizando
transcriptasa inversa SuperScript III e imprimadores (primers) aleatorios
(Invitrogen) como es indicado por el fabricante.
Los primers para la secuenciación de EPSPS1 fueron desarrollados mediante
alineación de las secuencias de codificación para EPSPS1 de S. halepense, Zea
60
mays, Triticum aestivum, L. rigidum, L. multiflorum y A. palmeri, disponibles en
GenBank. Se seleccionaron las regiones altamente conservadas de las diferentes
especies y se procesaron mediante la herramienta en línea “Primer 3”, utilizada
para el diseño de primers. El conjunto de primers diseñados fue utilizado para
generar fragmentos superpuestos abarcando las regiones central, 5′ y 3′ del gen
EPSPS1. Los siguientes primers se utilizaron para amplificar y secuenciar el gen
EPSPS1 de genotipos resistentes y susceptibles a glifosato: 1FPp- 5’
TGAACAGTGAGGATGTCCACT 3’ y 1RPp- 5’ CTCATTCTTGGTACTCCATCA 3’;
2FPp- 5’ GGAGTACCAAGAATGAGGGA 3’ y 2RPp- 5’
AGCACCAGCCAAGAAATAGC 3’; 3FPp- 5’ TGCCTATGTTGAAGGTGATG 3’ y
3RPp- 5’ CGCCGTCACGTTCAGCTTCT 3’; 4FPp- 5’
AGTTTGCAGGGTGATGTGA 3’ y 4RPp- 5’ GAAGTAGTCGGGGAAGGTC 3’.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue hecha en una mezcla reactiva
de 25 µL que contenía 1 μL de ADNc, 0,4 µM de ambos primers (0,2 mM de cada
uno de los dos primers directos e inversos), 0,2 mM de cada uno de los siguientes
nucleótidos: dATP, dCTP, dGTP, y dTTP; 1,5 mM de MgCl2, 1,25 U de DNA
polimerasa GoTaq con flexi buffer Go Taq 1X (New England Biolabs Inc., Ipswich,
MA, USA) y agua libre de nucleasa, en un volumen final de 50 μL. La amplificación
fue desarrollada bajo las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 94°C
por 4 minutos, 39 ciclos de 94°C por 30 segundos; calentamiento a 57,5°C por 30
segundos, elongación a 72°C por 90 segundos y una extensión final a 72°C por 10
minutos.
Los fragmentos amplificados fueron secuenciados en gel purificado utilizando
primers directos e inversos en ambas direcciones. Los restos de los extremos 5’ y
3’ de la región de codificación EPSPS fueron generados mediante el kit SMARter
RACE (Clontech Laboratories, Inc.). Se utilizaron los primers específicos de los
genes 1RPp y 3FPp para 5’RACE y 3’RACE respectivamente, de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Los productos RACE resultantes fueron purificados
antes de la secuenciación usando el gel Wizard SV y el PCR Clean-Up System
61
(Promega, Madison, WI, USA). Las secuencias de nucleótidos generados por
PCR, 5’ y 3’RACE fueron ensambladas en una secuencia continua (1314pb) que
contenía un marco de lectura abierta para la proteína EPSPS1, usando el
programa informático ClustalX (Larkin et al. 2007). Las secuencias de los genes
EPSPS1 de genotipos R fueron alineadas y comparadas con genotipos S para
determinar mutaciones subyacentes.
4.4.3.2 Construcción de modelos por homología
Para construir el modelo por homología, se utilizaron las plantillas 3D apropiadas
que estaban disponibles. Para esto, se utilizó la secuencia de aminoácidos de la
EPSPS de un biotipo S como interrogante y un BLAST (Basic Local Alignment
Search Tool) (Altschul et al. 1997) para realizar la búsqueda en el Banco de Datos
de Proteína (Protein Data Bank; PDB). Con base en los resultados obtenidos del
BLAST se seleccionó la EPSPS de E. coli (PDB: 1G6S). Los criterios de selección
fueron la secuencia de identidad más alta y la máxima longitud de cobertura de
secuencia. Como esta estructura se co cristaliza con el sustrato y con el inhibidor
de glifosato, se consideró como una opción apta para el proceso de modelado por
homología. La plantilla para conseguir la secuencia para estructurar la alineación
fue realizada mediante el programa Clustal X (Larkin et al. 2007).
Se encontró que la EPSPS de P. paniculatum (ppEPSPS) presenta una identidad
de secuencia de 54% con una cobertura de interrogante de 98% para una
secuencia de aminoácidos 1G6S. Mediante el programa de modelado por
homología MODELLER v. 9.14, se construyeron varios modelos estructurales 3D,
tanto para la ppEPSPS de biotipos S como de R. Para los análisis posteriores se
seleccionó la estructura con la función de densidad molecular menos probable
(mol pdf). La estructura homóloga modelada fue sometida a cuatro pasos de
minimización de etapas en la SYBYL-X suite (Tripos International, MO, USA) para
generar la energía mínima de conformación. Estos pasos son los siguientes (i) los
hidrógenos fueron adicionados y la(s) posición(es) fueron refinadas utilizando un
proceso de 1000 pasos, (ii) 1000 pasos para las cadenas de átomos laterales, (iii)
62
minimización de la proteína total menos átomos de Cα, (iv) optimización
geométrica de la proteína en su totalidad sin confinamiento de ninguna porción de
la molécula.
Validación y refinamiento del modelo
La estructura de la ppEPSPS, modelada por homología y minimizada
energéticamente, fue sometida al programa PSVS v 1.5. Este programa analiza la
calidad estereoquímica de estructuras 3D utilizando el servidor PROCHECK
(Laskowski et al., 1993), el cual se basa en los gráficos estadísticos de
Ramachandran (Ramachandran y Sasisekharan 1968) para verificar la distribución
de los ángulos phi y psi de los aminoácidos. El programa también verifica
parámetros físicos como la longitud y ángulo de los enlaces, la planaridad de los
enlaces y la geometría de los átomos de hidrógeno y de los aminoácidos de las
cadenas de átomos laterales. Usando el programa de visualización PyMol
(Schrödinger 2010), se superpuso la plantilla para construir estructuras 3D y así
identificar las diferencias mediante el cálculo de la raíz cuadrada de los valores
medios de la desviación (RMSD). En caso de observarse alguna discrepancia, el
proceso de minimización de etapas fue repetido con un mayor número de
interacciones para corregir los contactos erróneos en la estructura del modelo de
homología 3D. Para el análisis de acoplamiento molecular se utilizó el modelo por
homología refinado y optimizado de ppEPSPS de biotipos S y R.
Acoplamiento de sustrato e inhibidor
Los ligandos para el acoplamiento fueron preparados utilizando herramientas MGL
(Scipps, LaJolla, CA). Para ambos, el receptor (ppEPSPS) y ligandos (Shikimato-
3-fosfato, fosfoenolpiruvato y glifosato), se adicionaron hidrógenos polares y se
combinaron los hidrógenos no polares. Todos los enlaces en las fracciones del
ligando fueron establecidos como rotativos para un acoplamiento de proteína de
63
ligando flexible y de ligando rígido. Se estableció un tamaño de malla para
ppEPSPS de 73,5 Å * 13,7 Å * 15,3 Å en las coordenadas X, Y y Z,
respectivamente, para propiciar una rotación libre del ligando y realizar de esta
manera un acoplamiento global. Mediante el uso del algoritmo genético
Lamarckiano, el programa Autodock Vina buscó la mejor orientación posible del
ligando en el sitio activo del receptor. Las 20 conformaciones obtenidas se
examinaron con base en la energía de afinidad de enlace. Diversas poses ligando-
receptor fueron analizadas utilizando el software PyMol.
5. Resultados y Discusión
5.1 Diagnóstico del uso de glifosato
Se diagnosticó el uso de glifosato en tres cultivos perennes, pejibaye para palmito,
cítricos y palma africana, caracterizados por ser explotaciones extensivas de
monocultivos y manejados de forma intensiva con el uso de herbicidas como su
principal forma de controlar malezas. Se encontró que en general, el glifosato es el
herbicida más utilizado en los tres cultivos y su uso depende de su estado
fenológico; en plantaciones jóvenes se usa menos que en plantaciones ya
establecidas. P. paniculatum era conocida solamente en fincas con problemas de
resistencia.
5.1.1 Uso de glifosato en el cultivo de pejibaye
En general, se usa una menor variedad de herbicidas para el control de malezas
en pejibaye para palmito que en otros cultivos. Se diagnosticaron y visitaron 10
fincas productoras de palmito, abarcando 600 ha que representan cerca de un
10% del área cultivada en el 2012. Para la zona de Cariari y Pococí, se tiene un
promedio de uso ponderado de 3,0 kg i.a. ha-1 año-1, siendo para el glifosato 2,7
(93% del total de plaguicidas). Otros herbicidas que se utilizan son paraquat, 2,4-
64
D, metsulfuron y haloxifop (Cuadro 3). El itinerario común de control de malezas
en palmito se basa en la utilización de un herbicida sistémico (glifosato) y de un
herbicida que controle hojas anchas (2,4-D o metsulfuron), con aplicaciones
regulares que van de 3 a 8 veces por año, tanto en plantaciones jóvenes como
adultas, ya que la aplicación se realiza solamente en la entrecalle.
La arquitectura de la planta de palmito no permite el uso intensivo de métodos de
control mecánico de malezas, como en el caso de palma y cítricos. El uso
exclusivo del control químico, particularmente del glifosato en forma intensiva,
poca labranza del suelo, carencia de rotación de cultivos y la ausencia de otros
métodos de manejo, ha resultado en problemas para controlar algunas malezas,
como es el caso de P. paniculatum. Las fincas donde se encontró el problema de
resistencia tienen en común un historial de 5 a 8 aplicaciones anuales de glifosato
por más de 15 años (Cuadro 6). Desde el año 2011 y 2012, a raíz de los
problemas observados, se inició con la aplicación de otros herbicidas (haloxifop y
fluazifop) y de otras formas de control de malezas (chapias).
Cuadro 3. Herbicidas usados en el cultivo de pejibaye para palmito. 2011-12
Ingrediente activo Kg i.a. ha-1 año-1 Porcentaje
de usuarios Promedio Mínimo Máximo
Glifosato 2,74 0,36 3,03 100
2,4-D 0,07 0,201 2,016 70
Metsulfuron 0,026 0,006 0,03 20
Haloxifop 0,1 0,12 0,12 10
Paraquat 0,026 1,1 1,1 10
Total herbicidas 2,96 1,79 6,30 100
TOTAL Plaguicidas 3,01 0,57 3,81 100
65
5.1.2 Uso de glifosato en el cultivo de cítricos
En el cultivo comercial de cítricos, principalmente naranja para jugo, el control de
malezas se realiza básicamente de dos formas: aplicaciones de herbicidas en la
zona radical de los árboles (ronda o calle) y de forma mecánica en la entrecalle.
Se diagnosticaron 7 801 ha de 4 fincas que representan un 35% del total del área
nacional de cítricos. Se visitaron varios lotes en cada finca para comprobar la
presencia de P. paniculatum, ya que los entrevistados dijeron no conocerla o no
saber de la presencia de la maleza en el cultivo; en ninguno de ellos se encontró.
En plantaciones jóvenes (menores de 5 años de sembradas), con árboles de
menor porte, se prefiere el control mecánico al uso de herbicidas, por el riesgo de
fitotoxicidad asociado con dichos productos químicos. La aplicación de glifosato en
plantaciones adultas se realiza, dependiendo de la finca, de 2 a 4 veces por año, a
razón de 913 g e.a. ha-1 por aplicación. Otros herbicidas utilizados son paraquat,
diuron, oxifluorfen, diquat, 2,4-D y picloram (Cuadro 4).
Cuadro 4. Herbicidas usados en el cultivo de cítricos. 2011-12
Ingrediente activo Kg i.a. ha-1 año-1 Porcentaje
de usuarios Promedio Mínimo Máximo
Glifosato 2,68 1,31 4,40 100
Diuron 0,34 0,14 2,14 75
Oxifluorfen 0,26 0,10 0,96 75
2,4-D 0,12 0,002 1,20 75
Paraquat 0,055 0,53 0,53 25
Diquat 0,0001 0,01 0,01 50
Picloram 0,000002 0,0006 0,0006 50
Total herbicidas 3,46 2,09 9,24 100
TOTAL Plaguicidas 5,24 4,07 10,91 100
66
En plantaciones adultas, la aplicación de glifosato se alterna con herbicidas de
diferentes modos de acción y con control mecánico de malezas, lo que reduce la
presión de selección de resistencia al glifosato.
Como promedio ponderado de uso de glifosato en cítricos, se tiene un valor de
2,68 kg i.a. ha-1 año-1, y el glifosato representa cerca del 78% del uso total de
herbicidas, tanto en plantaciones jóvenes, donde su uso es cercano al 72%, como
en plantaciones adultas (84%).
Los herbicidas constituyen el 66% del total de plaguicidas usados en cítricos (3,46
kg i.a. ha-1 año-1) y el glifosato representa el 77,5% de los herbicidas usados. Las
otras acciones biocidas tienen porcentajes de uso del 26,9% para los fungicidas y
7,2% para los insecticidas. De los plaguicidas usados, los insecticidas están
representados por 8 ingredientes activos, los herbicidas por 7 y los fungicidas por
5. En la totalidad de las fincas se utiliza glifosato; otros herbicidas como 2,4-D,
oxifluorfen y diuron se usan en el 75%, picloram y diquat en el 50% y paraquat en
el 25% de las fincas (Cuadro 4). Hay variedad en el uso de herbicidas (pre
emergentes y pos emergentes, de contacto y sistémicos) con diferentes
mecanismos de acción.
5.1.3 Uso de glifosato en el cultivo de palma africana
El manejo de malezas en plantaciones de palma africana, se puede dividir en dos
fases; plantaciones jóvenes (menores de 5 años) y plantaciones adultas (mayores
de 5 años). Se diagnosticó el uso de plaguicidas en 3 500 ha de palma joven y en
29 000 ha de palma adulta, cercano a un 60% del área nacional para el 2011. En
ambos casos se utiliza glifosato, pero en plantaciones jóvenes su uso es muy
inferior, con 0,58 kg i.a. ha-1 año-1, representando el 19% del total de herbicidas, y
en plantaciones adultas su uso es de 4,67 kg i.a. ha-1 año-1, con un 72% del uso
total de herbicidas. Otros herbicidas utilizados en palma africana son paraquat
67
(mayormente en plantaciones jóvenes), haloxifop, diuron, glufosinato de amonio,
oxifluorfen, fluazifop, triclopir, metsulfuron metilo y 2,4-D.
El control de malezas se realiza usualmente cada 2 a 3 meses, alternando
herbicidas y control mecánico o chapias manuales, lo que aunado al uso de
coberturas vivas, disminuye la presión de selección de resistencia de malezas a
herbicidas. El uso ponderado total de glifosato en plantaciones de palma africana
(jóvenes y adultas) es de 4,24 kg ha-1 año-1, representa el 66% del total de
herbicidas y el 64% de los plaguicidas usados. La diversidad en los métodos de
manejo de malezas es la causante de que, a pesar del alto uso de glifosato en
palma africana, especialmente en plantaciones adultas, no se hayan presentado
casos de poblaciones resistentes a este herbicida.
Cuadro 5. Herbicidas usados en el cultivo de palma africana. 2011-12
Ingrediente activo Kg i.a. ha-1 año-1 Porcentaje
de usuarios Promedio Mínimo Máximo
Glifosato 4,240 0,18 5,65 85
Paraquat 1,040 0,43 5,3 92
2,4-D 0,400 0,01 0,8 50
Triclopir 0,390 0,72 0,72 23
Diuron 0,114 0,22 0,8 44
Haloxifop 0,090 0,08 0,18 54
Fluazifop 0,063 0,13 0,18 22
Oxifluorfen 0,016 0,72 0,72 11
MSMA 0,010 0,0004 0,02 50
Glufosinato de amonio 0,006 0,1 0,1 11
Metsulfuron metilo 0,003 0,01 0,01 25
Total herbicidas 6,41 1,50 7,78 100
TOTAL Plaguicidas 6,67 1,58 7,86 100
Además del diagnóstico de uso de plaguicidas en los tres cultivos anteriores, se
diagnosticó en el 2013, el uso de herbicidas en una finca bananera con problemas
de control de E. indica y P. paniculatum. En esta finca, el control de malezas se
68
realiza de forma muy similar al de fincas de palmito donde se confirmó la
resistencia a glifosato. Para controlar malezas se usa únicamente el herbicida
glifosato, en dosis comerciales (900 a 1 080 g e.a. ha-1) y con 7 a 8 ciclos de
aplicación anual. Este itinerario se repitió en los últimos 12 años antes de
detectarse los problemas de control de malezas; además, la finca tiene un historial
de uso de glifosato de más de 20 años. De forma similar a las fincas de palmito, se
ha implementado el control manual de malezas sobrevivientes, después de las
aplicaciones de glifosato.
Como se observa en el cuadro 6, en las fincas donde se corroboró la resistencia
de P. paniculatum, las aplicaciones de herbicidas y de glifosato fueron más
frecuentes (5 a 8) que en fincas sin ese problema (3 a 5). Así mismo, en las
primeras, el glifosato representa el 80% de la cantidad de herbicidas usados,
mientras que en las fincas problema es del 93%. Además, en las fincas sin
problema se utilizan otros métodos de control de malezas (mecánico o físico), y en
las fincas con problemas solamente se utiliza el método de control químico.
Cuadro 6. Caracterización del manejo de malezas en fincas con cultivos perennes.
Cítricos Palma Africana Pejibaye para palmito
Fincas sin problemas de resistencia
Fincas con P. paniculatum resistente
Ciclos herbicida por año
2 a 4 2 a 4 3 a 5 5 a 8
% uso de glifosato 72 y 84%* 19 y 72%* 80% 93%
Otro tipo de control de malezas
Mecánico Coberturas Manual Ninguno
Otros herbicidas usados para control de poáceas
Paraquat, diuron, oxifluorfen, diquat
Paraquat, glufosinato, oxifluorfen, fluazifop y haloxifop
Paraquat Ninguno
Presencia de P. paniculatum
No No No Sí
*Valores para plantaciones jóvenes y adultas, respectivamente.
69
Este tipo de manejo, que aumenta la selección de resistencia, concuerda con lo
expuesto por Beckie (2011) y Mortensen et al. (2000), quienes indican que en los
sistemas agrícolas donde las malezas han evolucionado resistencia, el común
denominador es un uso recurrente del herbicida, con poca o nula diversidad en las
prácticas de manejo de malezas. La combinación de un uso intensivo de
herbicidas con el mismo modo de acción y un limitado uso de tácticas culturales y
ausencia de diversidad en las prácticas de manejo de malezas, resultan en una
intensa presión para seleccionar malezas resistentes (Dinelli et al. 2008; Gressel y
Segel 1978). No es sorprendente que la mayoría de casos de biotipos de malezas
resistentes a glifosato hayan ocurrido en cultivos resistentes a glifosato o en
cultivos perennes (Heap 2017).
5.2 Respuesta de P. paniculatum al glifosato
La respuesta biológica de biotipos R y S de P. paniculatum se expresa mediante
los valores de DE50 para ambas edades. Para los biotipos R y S la DE50 promedio
de plantas de hasta 4 hojas sin hijos (edad I) es de 257,59 g e.a. ha-1 y 56,15 g
e.a. ha-1, respectivamente. Lo anterior significa que es necesario 4,6 veces más
herbicida en los biotipos R que en los S para causar una reducción del 50% en el
peso fresco. Para plantas de 1 a 3 hijos (edad II), la DE50 promedio para biotipos R
es 332,66 g e.a. ha-1 y 93,01 g e.a. ha-1 para los biotipos S.
A continuación se presentan los parámetros de respuesta a dosis crecientes de
glifosato de biotipos R y S de P. paniculatum, incluyendo los valores de DE50, para
la edad I (Cuadro 7) y para la edad II (Cuadro 8).
70
Cuadro 7. Parámetros que describen la respuesta al glifosato de biotipos R y S de P. paniculatum. Edad I. 21 dda.
Biotipo R o S Corrida D C b DE50 (g e.a. ha-1
)
B R
1 24,74 ± 1,05 0,70 ± 1,73 1,62 ± 0,46 251,77 ± 40,15
2 13,81 ± 0,71 1,30 ± 1,02 2,29 ± 0,97 250,67 ± 44,64
3 15,83 ± 0,70 0,96 ± 1,03 2,13 ± 0,60 235,11 ± 39,77
1+2+3 18,09 ± 2,06 0,86 ± 3,28 1,90 ± 1,57 251,04±105,30
D R
1 6,38 ± 1,00 1,00 ± 0,39 3,87 ± 1,66 266,19 ± 40,13
2 47,58 ± 3,37 2,47 ± 6,18 1,61 ± 0,67 224,49 ± 80,95
3 10,67 ± 1,08 0,52 ± 1,51 2,50 ± 1,90 298,23±118,36
1+2+3 33,48 ± 1,71 1,40 ± 2,90 1,60 ± 0,44 210,23 ± 53,55
L R
1 5,91 ± 0,50 0,78 ± 0,57 4,44 ± 4,69 288,84 ± 65,18
2 31,44 ± 1,35 0,25 ± 1,67 3,32 ± 1,01 355,76 ± 34,75
3 51,79 ± 2,38 4,39 ± 4,38 3,55 ± 2,08 342,76 ± 55,60
4 43,74 ± 2,14 1,59 ± 2,75 5,21 ± 3,50 308,16 ± 40,78
1+2+3+4 35,35 ± 1,42 1,42 ± 1,98 3,18 ± 1,18 309,91 ± 33,39
H S
1 37,69 ± 1,60 3,08 ± 1,60 5,66 ± 1,80 31,46 ± 3,76
2 30,38 ± 1,04 0,01 ± 1,25 5,44 ± 3,66 46,34 ± 2,90
1+2 34,01 ± 1,92 0,69 ± 2,00 4,65 ± 2,65 38,88 ± 4,90
C S
1 30,98 ± 0,89 2,01 ± 1,18 4,86 ± 1,21 63,44 ± 5,40
2 47,66 ± 1,87 1,85 ± 3,39 1,69 ± 0,44 74,72 ± 12,51
1+2 39,46 ± 1,90 3,08 ± 2,89 2,55 ± 1,15 68,17 ± 10,89
T S
1 14,52 ± 1,28 0,34 ± 1,69 5,92 ± 1,69 64,18 ± 18,09
2 18,06 ± 1,01 0,04 ± 1,33 5,92 ± 3,34 58,14 ± 10,50
1+2 16,05 ± 1,83 0,10 ± 2,43 6,04 ± 6,11 62,03 ± 24,21
Los datos están descritos de acuerdo a la ecuación y= C + D-C/1 + exp [b(log x – log DE50)], donde
y corresponde a la respuesta en crecimiento a la dosis x de glifosato, C es el límite inferior del peso
fresco a la dosis más alta, D es el límite superior del peso fresco a la dosis cero (testigo) y b es la
pendiente de la curva cerca del valor de ED50. Cada valor está seguido de su respectivo intervalo
de confianza.
71
Cuadro 8. Parámetros que describen la respuesta al glifosato de biotipos R y S de P. paniculatum. Edad II. 21 dda.
Biotipo R o S Corrida D C b DE50 (g e.a. ha-1
)
B R
1 23,89 ± 1,02 1,36 ± 1,80 1,53 ± 0,37 219,11 ± 46,45
2 17,17 ± 0,68 1,64 ± 1,22 2,05 ± 0,54 314,51 ± 56,36
1+2 20,61 ± 2,40 1,39 ± 3,63 1,66 ± 1,02 258,99 ± 121,95
D R
1 41,17 ± 1,45 1,65 ± 2,19 3,70 ± 1,46 360,12 ± 33,75
2 40,77 ± 1,35 1,39 ± 2,01 3,35 ± 1,06 347,26 ± 32,77
1+2 41,36 ± 1,65 1,46 ± 2,19 3,38 ± 1,19 350,81 ± 35,43
L R
1 72,70 ± 3,51 11,53 ± 9,26 1,83 ± 0,89 373,04 ±107,64
2 75,97 ± 3,44 10,81 ± 8,32 1,89 ± 0,81 394,84 ± 93,40
3 41,54 ± 2,03 2,38 ± 3,75 2,88 ± 1,42 384,28 ± 64,70
1+2+3 62,27 ± 1,79 8,96 ± 3,41 2,20 ± 0,54 387,68 ± 46,47
H S
1 74,79 ± 3,51 -3,76 ± 0,03 0,90 ± 0,23 55,45 ± 18,77
2 63,14 ± 2,58 4,46 ± 4,72 1,86 ± 0,52 71,38 ± 13,59
3 35,55 ± 2,41 5,43 ± 4,60 2,96 ± 2,78 92,57 ± 23,72
4 44,54 ± 1,02 2,31 ± 1,35 4,06 ± 0,73 62,98 ± 4,17
1+2+3+4 53,11 ± 2,26 5,21 ± 3,76 1,71 ± 0,52 76,46 ± 12,43
C S
1 52,91 ± 3,59 12,51 ± 9,76 2,24 ± 1,69 109,74 ± 55,11
2 33,18 ± 1,35 5,57 ± 2,56 3,88 ± 1,58 143,21 ± 21,81
3 34,02 ± 0,82 2,84 ± 1,49 18,15 ±19,85 144,30 ± 40,71
1+2+3 38,99 ± 1,42 7,33 ± 2,41 4,27 ± 1,45 131,71 ± 17,04
T S
1 51,00 ± 1,95 3,20 ± 2,97 2,89 ± 0,75 73,25 ± 9,91
2 20,49 ± 1,02 2,61 ± 1,95 1,84 ± 0,56 80,97 ± 21,8
1+2 51,39 ± 1,65 3,18 ± 2,22 2,86 ± 0,56 72,76 ± 7,38
Los datos están descritos de acuerdo a la ecuación y= C + D-C/1 + exp [b(log x – log DE50)], donde
y corresponde a la respuesta en crecimiento a la dosis x de glifosato, C es el límite inferior del peso
fresco a la dosis más alta, D es el límite superior del peso fresco a la dosis cero (testigo) y b es la
pendiente de la curva cerca del valor de ED50. Cada valor está seguido de su respectivo intervalo
de confianza.
72
En las figuras 10 y 11 se muestran las curvas de respuesta (DE50) a los 21 dda
con los valores promedios de peso fresco por biotipo de varios experimentos.
Figura 10. Respuesta a dosis crecientes de glifosato de biotipos R y S para la
edad I.
Figura 11. Respuesta a dosis crecientes de glifosato de biotipos R y S para la
edad II.
Peso
fresco
(g)
Peso
fresco
(g)
g e.a. ha-1
73
Las plantas del biotipo H, el más susceptible de los evaluados, provienen de una
plantación de banano orgánico de más de 12 años de establecida, donde nunca
se ha aplicado glifosato; los biotipos C y T, de bordes de caminos donde la presión
de selección ha sido muy baja, lo cual se manifiesta en sus menores DE50.
En la figura 12 se nota la respuesta a dosis crecientes de glifosato en plantas de
biotipos R (L) y S (H). A los 21 dda, 0,09 kg e.a. ha-1 provoca la muerte de plantas
del biotipo S, mientras en el biotipo R se requieren 2,19 kg e.a. ha-1 para lograr el
mismo efecto. La dosis comercial de aplicación de glifosato en las fincas con
problemas es cercana a 0,91 kg e.a. ha-1, insuficiente para controlar las plantas R,
las cuales mantienen un crecimiento aceptable y la capacidad para desarrollarse y
producir semilla viable. La DE50 del biotipo R es de 0,31 kg e.a. ha-1, mientras que
para el biotipo S de 0,04 kg e.a. ha-1, indicando que en plantas de P. paniculatum
de 0 a 3 hijos, se requiere cerca de 8 veces más herbicida en el biotipo R que en
el S para causar una reducción en el crecimiento del 50%.
Figura 12: Respuesta de P. paniculatum a dosis crecientes de glifosato (kg e.a. ha-
1). Biotipo Resistente L (arriba) y biotipo Susceptible H (abajo). 21 dda. Edad I.
2012.
0,00 0,05 0,09 0,18 0,37 0,73
L
H
0,00 0,09 0,18 0,37 0,73 1,46 2,19
25
74
Plantas de los biotipos S de edad I evaluadas 15 dda necesitan cerca de 100 g
e.a. ha-1 para alcanzar un 50% de daño visual con respecto al testigo, mientras
que plantas del biotipo R, en la misma fecha de evaluación, requieren entre 200 y
600 g e.a. ha-1 para alcanzar el mismo nivel de daño (Figura 13).
Figura 13. Porcentaje de daño visual de biotipos R (D, L, B) y S (H, T, C) 15 dda con dosis crecientes de glifosato. Edad I.
Los datos, promedio de bioanálisis, están descritos de acuerdo a la ecuación y= C + D-C/1 + exp
[b(log x – log ED50)], donde y corresponde al daño visual a la dosis x de glifosato, C es el límite inferior del daño visual a la dosis más alta, D es el límite superior del daño visual a la dosis cero
(testigo) y b es la pendiente de la curva cerca del valor de ED50.
Plantas de P. paniculatum sobrevivientes a la dosis de 2,19 kg e.a. ha-1, al ser
cosechada al ras del suelo 21 dda, presentaron un promedio de 0,46 rebrotes por
planta, los cuales emergieron con una coloración albina, pero paulatinamente
recuperaron sus capacidades fotosintéticas hasta producir plantas totalmente
normales con capacidad de producir semilla viable. Plantas de biotipos S
75
cosechadas en las mismas condiciones, no fueron capaces de producir rebrotes
después de ser tratadas con dosis de 0,36 kg e.a. ha-1 o superiores.
Resultados similares de recuperación de plantas fueron encontrados con biotipos
R de C. canadensis después de una aplicación de glifosato (3,8 kg e.a. ha-1), letal
para plantas S, donde además de la reducción en el crecimiento, se dio un
amarillamiento transitorio en los meristemos apicales del tallo (Mueller et al. 2003).
En el cuadro 9 se observan los IR entre biotipos R y S. Para la edad I los IR se
mantuvieron entre valores de 3 a 8 y para la edad II entre 2 a 5. Las DE50 son
menores en plantas de edad I que en plantas de mayor edad, lo que indica que en
estas últimas se necesita mayor cantidad de glifosato para lograr un daño similar
que en plantas más jóvenes. De acuerdo con los parámetros planteados por Heap
(2016), sobre poblaciones resistentes, los biotipos L, D y B, tanto para la edad I
como para la edad II, presentan un IR <10, lo que indica que poseen una
resistencia al glifosato de orden moderada, con IRs que van desde 2 a 8.
Cuadro 9. Índice de Resistencia (IR)* al glifosato de biotipos de P. paniculatum provenientes de varias localidades de Costa Rica. 2012-2014
Biotipos Susceptibles
H T C Edad
Bio
tip
os
Res
iste
nte
s
L 7,97 5,00 4,55 I
D 5,41 3,39 3,08 I
B 6,46 4,05 3,68 I
L 5,07 5,33 2,94 II
D 4,59 4,82 2,66 II
B 3,39 3,56 1,97 II
*IR: (DE50 R/DE50 S)
76
A pesar de que los niveles de resistencia son moderados, son suficientes para que
las plantas sobrevivan a las dosis de aplicación de campo, y por lo tanto,
propensos a la presión de selección por el uso repetido de glifosato. Los valores
de DE50 obtenidos de los bioanálisis entre plantas de edad I y II, sugieren que en
P. paniculatum el nivel de resistencia podría depender de su estado de
crecimiento. A mayor edad de las plantas, se requiere de mayor cantidad de
herbicida para controlarlas.
Para otro tipo de malezas se han reportado IR moderados. Plantas de R.
raphanistrum que sobrevivieron a 1 080 g ha-1 (IR de 2,3 y 3,2) se cruzaron y se
obtuvieron individuos con un IR de 3,5 y 4,5 respectivamente (Ashworth et al.
2014), comparable con los niveles reportados para A. tuberculatus (Zelaya y Owen
2005); A. palmeri (Culpepper et al., 2006); Ambrosia trifida (Norsworthy et al.
2010); C. bonariensis (Van Gessel 2001); Parthenium histerophorus (Socorro y
Fuentes 2005); L. rigidum (Powles et al. 1998); L. multiflorum (Perez y Kogan
2003); S. halepense (Vila-Aiub et al. 2007) y E. colona (Gaines et al. 2012).
Los biotipos resistentes a glifosato de P. paniculatum identificados en Costa Rica
se encontraron en la región del Caribe, donde la época de crecimiento, debido a
una menor estacionalidad de las lluvias, se da durante casi todo el año, haciendo
necesario el control frecuente de malezas. Esta alta frecuencia de aplicación de un
mismo herbicida sobre la población de malezas provocó la selección de individuos
de P. paniculatum que resisten hasta 8 veces la dosis con la cual se controlan
individuos susceptibles de la misma especie, los cuales han ido dominando la flora
de malezas en cultivos como pejibaye y banano.
Los bioanálisis de dosis respuesta al herbicida, confirmaron los niveles de
resistencia de los tres biotipos analizados y fueron congruentes con la información
aportada en las encuestas y en la presencia y sintomatología observada en el
campo. De la misma forma, las evaluaciones visuales a los 21 dda, muestran
resultados muy parecidos a los valores de ED50, también medidos a los 21 dda; los
77
biotipos R necesitan entre 4 y 6,5 veces más dosis que los biotipos S para tener el
50% del daño con respecto al testigo.
5.3 Distribución del glifosato radio marcado en P. paniculatum
El porcentaje de recuperación del glifosato radio marcado fue del 80,1%, tanto
para los biotipos R como los S y para ambas edades. Riar et al. (2011) reportan un
porcentaje de recuperación en experimentos similares con S. halepense del 90%
tanto para biotipos R como S, y Singh et al. (2011) del 94%.
5.3.1 Absorción de glifosato
Tanto los biotipos R como S, independientemente de la edad de la planta
evaluada, absorbieron el glifosato de manera similar. Al completarse el periodo de
evaluación, las plantas más jóvenes (edad I) de ambos biotipos (R y S)
absorbieron en promedio un 85,5% del glifosato aplicado, mientras que las S y R
de mayor edad (edad II) absorbieron 86,4% y 83,0% del herbicida aplicado, sin
que la diferencia fuera significativa (p< 0,05).
Estos valores de absorción son similares a los hallados en otras especies de
malezas. Singh et al. (2011) reportan que el porcentaje de absorción del glifosato
72 hda en I. hederacea fue 79% del aplicado, en Desmodium tortuosum 88%, en
Bidens bipinnata y en S. halepense 83%; valores muy cercanos a los obtenidos
para P. paniculatum al mismo tiempo de medición: 82 a 92% para la edad I y de
77 a 87% para la edad II (Cuadros 10 y 11). Para la poacea L. multiflorum, Salas
et al. (2012) y Nandula et al. (2008), reportan porcentajes menores de absorción
de glifosato radio marcado a las 48 hda: 43 a 63% y 43 a 56%, respectivamente.
78
Cuadro 10. Glifosato radio marcado absorbido en diferentes tiempos por biotipos R y S. Edad I.
Biotipo –
condición
Tiempo (hda)
24 48 72 96
Glifosato absorbido como porcentaje del aplicado
B – R 88,02 ±2,78 - 81,91 ±1,39 -
D – R 78,16 ±2,38 91,28 ±1,81 85,74 ±1,91 85,23 ±2,58
L – R 82,81 ±3,52 85,14 ±1,61 86,44 ±3,47 90,88 ±2,10
Promedio R 81,99 ±4,69 88,36 ±1,41 85,23 ±1,66 88,31 ±1,61
C – S 81,45 ±0,99 84,73 ±3,13 81,52 ±2,20 83,59 ±1,54
H – S 85,30 ±1,69 88,61 ±1,66 87,10 ±1,11 88,25 ±1,81
T – S 81,78 ±4,27 86,58 ±1,40 92,03 ±1,49 88,11 ±2,24
Promedio S 82,94 ±0,99 86,71 ±1,24 86,88 ±1,31 86,60 ±1,13
La absorción de glifosato en plantas de edad I aumentó levemente conforme
transcurrió el tiempo desde el momento de la aplicación. Brecke y Duke (1980)
demostraron que el glifosato ya en 4 horas ha penetrado la cutícula de las plantas,
pero es lentamente absorbido por las células del mesófilo.
Cuadro 11. Absorción en diferentes tiempos de glifosato radio marcado* por biotipos R y S. Edad II.
Biotipo –
condición
Tiempo (hda)
24 48 72
D – R 86,02±7,26 85,21±7,41 82,09±1,51
L – R 84,27±3,04 83,57±2,39 76,80±3,02
Promedio R 85,14±3,72 84,39±3,68 79,45±1,82
C – S 87,18±1,60 83,78±3,73 83,35 ±2,55
H – S 81,42±2,31 90,15±0,79 83,07±2,03
T – S 93,16±0,44 87,87±2,46 87,35±2,57
Promedio S 87,25±1,55 87,27 ±1,57 84,59±1,38
*Porcentaje del glifosato aplicado.
79
La absorción de glifosato radio marcado en las plantas de mayor edad siempre fue
mayor en los biotipos S que en los R, pero la diferencia solo fue significativa
(p<0,05) a las 72 hda. Las magnitudes de esta diferencia en absorción (5%), no
explican ni contribuyen con el mecanismo de resistencia de P. paniculatum al
herbicida.
5.3.2 Transporte de glifosato
Si se toma en cuenta la presencia de glifosato radio marcado como un indicador
de transporte del herbicida en la planta, se nota que la mayoría del glifosato
absorbido se mantiene en la hoja aplicada y se moviliza sobre todo hacia su ápice,
tanto en biotipos R como S. De esta forma, la mayoría del glifosato absorbido
(56,1% a 61,0%) se mantuvo en la parte apical de la hoja aplicada de manera
similar (p < 0,5) en todos los biotipos, sin importar su edad al momento de la
aplicación (Cuadro 12). La mayor presencia en la parte apical de la hoja aplicada
se dio a las 24 hda (71,3% a 75,5% en edad I y 62,9% a 74,9% en edad II, en
biotipos R y S, respectivamente) y el porcentaje fue disminuyendo con el tiempo
hasta llegar a representar cerca del 50% del glifosato absorbido a las 72 o 96 hda
(Cuadros A3 y A8 en anexos).
Cuadro 12. Porcentaje del glifosato radio marcado absorbido presente en partes de plantas de biotipos R y S. *
Partes de la planta Edad I Edad II
R S R S
1- Ápice hoja aplicada 58,69 58,57 61,04 56,13
2- Base hoja aplicada 6,41 6,45 23,95 29,31
3- Follaje sobre hoja aplicada 2,75 4,05** 2,88 2,94
4- Culmo 20,62 20,25 4,83 4,68
5- Raíces 11,30 10,29 7,19 6,76
*Promedios de las mediciones de 24 a 96 hda (edad I) y de 24 a 72 hda (edad II). **Diferencias significativas (p<0,05) entre valores de la misma edad.
80
Biotipos de C. canadensis y C. bonariensis resistentes a glifosato acumulan el
herbicida en la hoja tratada, lo que sugiere que el glifosato es retenido ahí o no se
transporta, por lo que no puede alcanzar su sitio de acción (Feng et al. 2004;
Koger y Reddy 2005; Dinelli et al. 2008; Ferreira et al. 2008). El mecanismo de
resistencia a glifosato en la poacea C. elata se asocia con la absorción limitada del
herbicida (51% en biotipos R y 74% en S) y su posterior retención diferencial (51%
en biotipos R y 40% en S) en la hoja tratada (Brunharo et al. 2016).
Las plantas jóvenes en promedio transportaron menos glifosato hacia la base de la
hoja tratada (6,4%, tanto los biotipos S como los R) que las más desarrolladas
(23,9% las R y 29,3% las S, p> 0,05), lo que se podría explicar por la teoría fuente
sumidero. El transporte de glifosato hacia diferentes tejidos, así como los foto
asimilados, cambia durante el ciclo de vida de la planta (Monquero et al. 2004).
El total de glifosato que se mantuvo en la hoja aplicada, en todos los biotipos, fue
65% y 85% para la edad I y II, respectivamente. Para ambas edades la presencia
del herbicida en el ápice de la hoja tratada fue de 59%, sin existir diferencias entre
biotipos R y S. Esto indica que en plantas de P. paniculatum, independientemente
de la condición de resistencia, hay un gran transporte de glifosato vía corriente de
transpiración, pero sin aportar al mecanismo de resistencia a la acción del
herbicida.
Los valores anteriores son similares a los encontrados en otras especies cuyo
mecanismo de resistencia estuvo relacionado con transporte disfuncional y
mayores niveles de EPSPS. En C. bonariensis el 63% y 84% del glifosato
permaneció en la hoja tratada de los biotipos S y R, respectivamente (Dinelli et al.
2008). En C. canadensis, el porcentaje del herbicida encontrado 48 hda en
biotipos S y R fue 70% y 80%, respectivamente (Koger y Reddy 2005) y en L.
multiflorum a las 72 hda, 54% en biotipos S y 72% en biotipos R (Perez-Jones et
al. 2007).
81
Un caso muy similar al encontrado en P. paniculatum, lo reportan Han et al. (2015)
en E. colona; a pesar de que el glifosato absorbido se mantuvo entre 60% a 70%
en la hoja aplicada para biotipos R y S, respectivamente, el mecanismo de
resistencia en esa especie se debió a una mutación en la EPSPS.
En biotipos R y S de S. halepense más del 50% del glifosato radio marcado
absorbido se mantuvo en la hoja tratada en todos los tiempos de evaluación (2, 8,
24 y 72 hda); los biotipos R retuvieron 27% y 28% más glifosato a las 24 y 72 hda,
respectivamente, que los biotipos S (Riar et al. 2011). Esto hizo pensar
inicialmente que el mecanismo de resistencia podría deberse a una acumulación
de glifosato en el ápice de las hojas, vía xilema o corriente de transpiración, como
lo reportaron varios autores en Lolium sp (Lorraine-Colwill et al. 2003; Perez-Jones
et al. 2007; Wakelin et al. 2004); pero al conocer que los biotipos R transportaban
de forma diferente menos glifosato hacia el culmo y hacia la raíz que los biotipos
S, se concluyó que el mecanismo de resistencia se debía a una reducción en el
transporte hacia meristemos; situación similar fue observada por Dinelli et al.
(2006) en poblaciones resistentes de Conyza spp.
La presencia de glifosato en el follaje por encima de la hoja tratada (parte 3) fue
similar para ambas edades y se mantuvo entre el 3% y 4% del glifosato absorbido
como promedio durante todo el experimento (Cuadro 12). La tendencia fue de
aumentar conforme pasaba el tiempo y fue menor a las 24 hda que al último
tiempo de medición (Cuadros A7 y A8 en anexos). Para la edad I el transporte de
glifosato hacia esta zona fue mayor en biotipos S que en biotipos R, tanto a las 72
hda (5,4% y 2,9% respectivamente) como a las 96 hda (6,2% y 3,9%
respectivamente). Para la edad II no se observaron diferencias entre biotipos
(Cuadro A10 en anexos).
La cantidad de glifosato transportado hacia el culmo (parte 4) tiende a aumentar
con el tiempo. En plántulas jóvenes (edad I) el herbicida encontrado a las 96 hda
fue el doble que a las 24 hda. La proporción de glifosato encontrado fue similar (p
82
< 0,5) entre biotipos R y S, sin importar su edad al momento de la aplicación, sin
embargo, la cantidad de glifosato en el culmo fue mayor para la edad I (25% de
promedio durante todo el experimento) que para la edad II (5%).
El transporte hacia este segmento es muy importante, ya que es en el culmo
donde se encuentra el punto de crecimiento (meristemo) de las poaceas. En E.
colona este porcentaje fue mucho mayor, estuvo entre 30% y 37% de 24 a 72 hda
(Han et al. 2015), lo que indica que mucho más glifosato fue transportado hacia los
tejidos meristemáticos.
Los valores encontrados de glifosato radio marcado en raíces de P. paniculatum,
fueron, para la edad I 11,3% y 10,3% en biotipos S y R respectivamente, y para la
edad II 7,2% en biotipos S y 6,7% para biotipos R, sin existir diferencias
significativas entre ellos. Valores similares en raíces fueron encontrados en L.
multiflorum cuyo mecanismo de resistencia a glifosato se debe a un transporte
diferencial y a una mutación en la EPSPS: 12% y 9% en biotipos S y R,
respectivamente (Perez-Jones et al. 2007). Asimismo, en biotipos R y S de C.
bonariensis un 17% y 7% respectivamente, se encontró en la raíz (Dinelli et al.
2008); y en C. canadensis el glifosato transportado hacia ese órgano fue de 13%
en biotipos R y 20% en biotipos S (Koger y Reddy 2005).
El porcentaje de glifosato radio marcado encontrado en las raíces no fue diferente
entre biotipos R o S, pero sí entre tiempos después de la aplicación: 6,8% a las 24
hda, 11,35% a las 48 y 96 hda y 14,2% a las 72 hda. Esto indica que en P.
paniculatum, el glifosato sigue transportándose hacia los tejidos sumideros con el
tiempo; a las 72 hda es el doble de la cantidad encontrada a la 24 hda, pero a las
96 hda ya la cantidad empieza a disminuir. Relativamente estos valores de
transporte hacia raíces son bajos; por ejemplo, en E. colona el porcentaje de
glifosato radio marcado encontrado en las raíces oscilaba entre 30 a 40% de 24 a
72 hda, tanto para biotipos R como S (Han et al. 2015), indicando que mucho más
glifosato fue transportado hacia los tejidos meristemáticos de las raíces.
83
Al visualizar fosforimágenes de las plantas utilizadas en los experimentos con
glifosato radio marcado, se confirma que el herbicida se transporta de forma
similar tanto en biotipos R como S de ambas edades. Se nota que el glifosato
radio marcado se transporta de forma similar hacia órganos sumideros como
culmo y raíces, y la mayoría permanece en la hoja tratada (Figura 14 y 15), por lo
tanto, se concluye que el transporte diferencial no es el mecanismo que confiere
resistencia en los biotipos de P. paniculatum estudiados.
Figura 14: Plantas de P. paniculatum aplicadas con glifosato radio marcado antes (A) y después de revelarlas (B) como fosforimágen. Biotipos Susceptibles arriba (C y H), biotipos Resistentes abajo (L, B y D). 72 hda. Edad I (Fotos por F. Ramírez).
A B
84
Figura15: Plantas S de P. paniculatum S aplicadas con glifosato radio marcado antes (A) y después de revelarlas (B) como fosforimágen. C: Biotipo R (L) 96 hda. Edad II (Fotos por F. Ramírez).
Estos valores de transporte de glifosato hacia tejidos de órganos sumideros como
raíz y culmo, parecieran ser relativamente bajos en comparación con lo acumulado
en la hoja tratada, pero son suficientes para causar fitotoxicidad en la planta. En
una aplicación comercial, la distribución de glifosato es a nivel micro molar, con
una fracción absorbida y una pequeña parte de esa cantidad transportada hacia
los cloroplastos de los tejidos sumideros (Powles et al. 1998); y aun así, estas
concentraciones de glifosato a niveles sub micro molares, son suficientemente
efectivas para inhibir las funciones de la EPSPS (Funke et al. 2006; Healy-Fried et
al. 2007).
5.3.3 Exudación de glifosato
La cantidad de glifosato radio marcado que fue exudado a través de raíces fue
muy baja, menor al 0,3% del total de glifosato absorbido por la planta,
independientemente del biotipo tratado, y la misma no se diferencia del valor basal
encontrado en el sustrato usado para crecer las plantas. Dinelli et al. (2007)
B C A
85
consideraron como despreciable la exudación de 2% de diclofop-metil y 4% de
triasulfuron, ya que no observaron efectos negativos en la planta debido al
herbicida reabsorbido.
Durante el desarrollo del experimento (0 a 96 hda) para la edad I, los biotipos R
exudaron cantidades significativamente mayores (p=0,003) que los biotipos S
(0,28 % y 0,20% respectivamente), mientras que para la edad II (0 a 72 hda) las
cantidades exudadas por raíces fueron similares, 0,12% en biotipos R y 0,17% en
biotipos S (Cuadros 13 y 14).
A pesar de esta diferencia entre biotipos R y S, la baja proporción de glifosato
exudado por las raíces sugiere que la exudación no tiene un aporte en el
mecanismo de resistencia.
Cuadro 13. Porcentaje* de glifosato radio marcado exudado por las raíces en biotipos R y S en varios tiempos de medición. Edad I.
Biotipo –
condición
Tiempo (hda)
24 48 72 96
B – R 0,31 ±0,15 - 0,24 ±0,05 -
D – R 0,07 ±0,02 0,29 ±0,05 0,23 ±0,05 0,40 ±0,07
L – R 0,12 ±0,02 0,35 ±0,08 0,40 ±0,07 0,40 ±0,14
Promedio R 0,14 ±0,17 0,32 ±0,04 0,31 ±0,04 0,40 ±0,08
C – S 0,08 ±0,01 0,20 ±0,03 0,13 ±0,02 0,27 ±0,04
H – S 0,09 ±0,02 0,15 ±0,03 0,27 ±0,05 0,20 ±0,03
T – S 0,07 ±0,01 0,13 ±0,03 0,58 ±0,08 0,23 ±0,06
Promedio S 0,08 ±0,02 0,16 ±0,02 0,33 ±0,05 0,23 ±0,02
* relativo al glifosato absorbido. +/-: error estándar.
86
Cuadro 14. Porcentaje* de glifosato radio marcado exudado por las raíces en biotipos R y S en varios tiempos de medición. Edad II.
Biotipo –condición
Tiempo (hda)
24 48 72
D – R 0,04±0,004 0,12 ±0,03 0,20±0,04
L – R 0,05±0,01 0,12±0,02 0,18 ±0,03
Promedio R 0,04 ±0,005 0,12±0,02 0,19±0,02
C – S 0,07±0,02 0,14±0,02 0,73±0,34
H – S 0,04 ±0,01 0,09±0,01 0,16±0,03
T – S 0,06 ±0,004 0,12±0,03 0,14±0,04
Promedio S 0,06±0,01 0,12 ±0,01 0,34±0,13
* relativo al glifosato absorbido.
+/-: error estándar.
5.4 Metabolización
En ninguna de las muestras de tejido foliar analizadas se detectó el principal
metabolito del glifosato, AMPA. Sin embargo, las tres muestras correspondientes a
los biotipos aplicados fueron positivas para glifosato, el cual se detectó en
concentraciones muy elevadas, entre 25 y 33 ppm (Cuadro 15). En cuanto a las
QC analizadas, se puede observar que las recuperaciones fueron satisfactorias,
con valores entre 92 y 112% para glifosato, y entre 86 y 125% para AMPA, los
cuales resultan aceptables para el análisis de residuos de plaguicidas de acuerdo
con la guía SANCO/12571/2013 (EC 2013). En Anexos (Figura A1 y A2), se
encuentran los cromatogramas seleccionados de las distintas muestras
analizadas.
87
Cuadro 15. Concentración de glifosato y AMPA en biotipos R aplicados y sin aplicar con glifosato y porcentajes de recuperación de las sustancias analizadas.
Concentración en muestra (mg kg-1) Recuperación QC* (%)
Biotipos sin aplicar Biotipos aplicados Biotipos sin aplicar
B D L B D L B D L
Glifosato n.d. n.d. n.d. 25 ± 4 33 ± 4 26 ± 3 104 ± 18 92 ± 10 112 ± 12
AMPA n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 107 ± 13 86 ± 10 125 ± 12
*muestras de control de calidad
n.d = no detectado; la incertidumbre se expresa como la desviación estándar.
Estos resultados evidencian que no hubo degradación metabólica del glifosato
aplicado y por lo tanto no se produjo el metabolito AMPA.
La ausencia de metabolización del glifosato en los biotipos R de P. paniculatum
estudiados no es sorpresiva puesto que está claramente establecido que el
metabolismo del herbicida no contribuye con la resistencia a glifosato en otras
poáceas como L. rigidum (Lorraine-Colwill et al. 2003), E. indica (Tran et al. 1999)
y en especies de Conyza (Feng et al. 2004; Dinelli et al. 2008). Sin embargo, de
Carvalho et al. (2011) y Gonzalez-Torralva et al. (2012a), sugieren que existe
metabolismo de glifosato en especies R de D. insularis y C. canadensis,
respectivamente, aunque no queda claro, como lo cita Spencer et al. (2000), si el
glifosato fue metabolizado dentro de la planta o por microorganismos de la
superficie de la hoja aplicada.
Para el presente estudio, se concluye que la metabolización del glifosato no es el
mecanismo de resistencia en P. paniculatum; esto es congruente con
investigaciones recientes hechas por Sammons y Gaines (2014) quienes expresan
que la metabolización no se considera hasta ahora un mecanismo que contribuya
a la resistencia a glifosato.
88
5.5 Concentración de ácido shikímico
Curva de calibración de shikimato:
Se construyó una curva de calibración de concentraciones conocidas de shikimato
versus los valores de absorbancia medidos en un espectrómetro. La curva
muestra un R2 alto (95,2 %), lo que indica una relación directamente proporcional
entre concentración y absorbancia (Figura 16).
Figura 16. Valores de absorbancia a determinadas concentraciones de shikimato.
5.5.1 Concentración de shikimato en discos provenientes de plantas sin aplicar
En el cuadro 16 se presentan los resultados de la medición de la concentración de
shikimato de discos tomados de hojas de plantas sin aplicarse con el herbicida,
expuestos posteriormente a diferentes concentraciones de glifosato y medida 24
hda.
Ab
sorb
anci
a
ug ml-1
ácido shikímico
89
Cuadro 16. Valores de shikimato (µg mL-1) en tejido foliar de plantas R y S aplicadas con concentraciones crecientes de glifosato.
Biotipo -condición
Concentración de glifosato aplicado (µM)
0 15,6 31,3 62,5 125 250 500 1000
B – R 4,68
±1,55
13,50
±4,90
6,04
±1,19
14,34
±3,71
24,12
±3,60
28,83
±3,63
42,99
±4,51
41,03
±3,87
D - R 2,24
±1,48
2,32
±1,18
6,33
±3,41
7,36
±2,90
11,88
±4,13
23,53
±6,17
31,93
±5,58
33,84
±4,66
L – R 0,33
±0,33
0,45
±0,45
2,56
±1,34
8,77
±3,72
18,40
±8,33
20,54
±6,12
26,48
±4,51
30,42
±4,49
Promedio R
2, 41
±0,76
5,42
±2,01
4,97
±1,28
10,16
±2,01
18,13
±3,34
24,30
±3,10
33,80
±2,98
35,09
±2,55
C – S 7,68
±1,12
62,00
±3,50
69,22
±4,35
70,82
±4,25
71,59
±4,74
72,37
±5,87
69,85
±3,07
58,00
±6,52
H – S 0,04
±0,04
22,96
±4,86
40,49
±7,97
40,13
±5,35
44,32
±5,26
47,55
±4,92
57,21
±4,49
33,59
±6,29
T – S 0,11
±0,11
28,07
±3,18
35,40
±3,90
42,22
±5,25
47,89
±7,43
42,17
±5,09
41,61
±5,89
30,27
±2,97
Promedio S
2,61
±0,71
37,68
±3,66
48,37
±4,07
51,06
±3,66
54,60
±3,90
54,03
±3,72
56,22
±3,25
40,62
±4,71
Los valores de shikimato en plantas sin exposición a glifosato son variables entre
los biotipos, van desde 0,04 µg mL-1 a 4,68 µg mL-1, con promedios similares, 2,41
µg mL-1 en biotipos R y 2,61 µg mL-1 en biotipos S. Esta disparidad en los valores
de shikimato, aún tomando en cuenta múltiples variables en su medición, ha sido
reportada por muchos investigadores que lo han medido en varias especies
(Henry et al. 2007). Así mismo, el espectrómetro hace una medición relativa entre
tejido tratado y no tratado; para medir valores absolutos de shikimato es preferible
usar el método de Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (Shaner 2010).
Plantas de biotipos S de P. paniculatum expuestas a dosis entre 15,6 y 500 µM de
glifosato acumularon mayor cantidad de shikimato 24 hda que plantas de biotipos
R, sobre todo cuando se expusieron a dosis bajas. Cuando los discos se
expusieron a dosis de 15,6 y 31,3 µM de glifosato, plantas de biotipos S
90
acumularon 7 y 10 veces más shikimato que biotipos R, respectivamente (Cuadro
16); sin embargo, cuando las dosis crecieron, este índice fue disminuyendo hasta
casi igualarse a la dosis de 1 000 µM de glifosato. A estas altas dosis las plantas S
podrían perder la capacidad funcional, incluida la síntesis de ácido shikímico en
etapas previas a la ruta metabólica del shikimato, por lo que la acumulación va en
descenso.
Para la dosis de 7,82 µM, evaluada solamente en biotipos S, estos acumularon
24,63 µg mL-1 de shikimato, valor similar al de los biotipos R cuando eran
expuestos a 250 µM de glifosato (una dosis 5 veces mayor). Estos resultados
indican que la acumulación de shikimato en plantas de P. paniculatum, expuestas
a dosis bajas de glifosato, solo se da en biotipos S y no en R.
Los resultados anteriores concuerdan con los encontrados por Shaner (2009), en
C. canadensis y L. rigidum; tanto en biotipos R como S de estas especies,
expuestos a altas dosis de glifosato, se produjo acumulación de shikimato, pero a
bajas dosis la acumulación ocurrió solamente en biotipos S. De la misma forma,
Hanson et al. (2009), encontraron en discos de hojas de C. canadensis, que los
biotipos S acumularon la cantidad máxima de shikimato a concentraciones de 16
µM glifosato, mientras que las plantas R alcanzaron ese nivel con concentraciones
de 125 µM de glifosato.
Después de una aplicación de glifosato, tanto biotipos R como S acumulan
shikimato, solo que en tiempo y cantidad diferente, dependiendo de la
concentración a que estuvieron expuestos y al grado de sensibilidad de la EPSPS.
Si hubiera una insensibilidad total de la enzima, no habría acumulación de
shikimato en plantas R. Esta acumulación de shikimato claramente indica que el
mecanismo de resistencia al glifosato en P. paniculatum se debe a una alteración
en el sitio activo.
91
5.5.2 Concentración de shikimato en discos provenientes de plantas aplicadas
Cuando se midió la concentración de shikimato en discos obtenidos de plantas
previamente aplicadas con 720 g e.a. ha-1 de glifosato en diferentes tiempos de
evaluación, se obtuvieron resultados similares a los del experimento con discos
tratados directamente. La acumulación de shikimato se dio en mayor proporción
en los biotipos S que en los R desde las 6 hda hasta las 144 hda (Figura 17).
Algunas pequeñas variaciones en la concentración de shikimato se pueden
presentar dependiendo de factores como luminosidad, la fuente externa de
carbono, la edad del tejido muestreado y la especie (Shaner et al. 2005); esto
podría explicar lo observado en la figura 17A: después de la aplicación del
glifosato, la acumulación de shikimato en plantas de biotipos R se dio
principalmente en las primeras 72 hda, sin sobrepasar los 55 µg mL-1, luego tiende
a reducirse y mantenerse constante.
Figura 17. Concentración de shikimato en biotipos R (A) y en biotipos S (B) en
varios tiempos de medición.
Contrariamente, en plantas de biotipos S, la acumulación aumenta conforme
pasan las horas de evaluación, llegando a ser a las 72 hda de 140 µg mL-1 y más
92
de 160 µg mL-1 a las 144 hda (Figura 17B). Resultados similares los encontraron
Reinhardt et al. (2016) en biotipos de C. bonariensis, que incrementaron los
niveles de shikimato 2 a 6 dda en todas las poblaciones, pero a los 8 dda,
continuaron aumentando en biotipos S y se redujeron en biotipos R. Esto también
concuerda con estudios hechos por Baerson et al. (2002) y Perez-Jones et al.
(2007), en plantas cuyo mecanismo de resistencia se debía a una alteración en la
EPSPS, que al aplicarlas con glifosato resultaba en un incremento en la
concentración de shikimato en biotipos R, pero a niveles mucho menores que los
medidos en biotipos S.
La acumulación de shikimato en plantas de maíz y soya tratadas con glifosato
llega a su pico usualmente entre 4 a 7 dda y luego declina (Henry et al. 2005). En
poblaciones R de C. canadensis, la concentración de shikimato se redujo cerca del
40% de 2 a 4 dda, mientras que en biotipos S se incrementó cerca del 35% en el
mismo periodo de medición (Mueller et al. 2003). Plantas R de Ambrosia trifida con
un IR de 5,3, acumularon entre 3,3 a 9,8 veces menos shikimato que las S de 1 a
7 dda (Norsworthy et al. 2010).
El nivel de shikimato endógeno en la mayoría de las plantas es muy bajo, aunque
existe variabilidad en las mediciones entre especies (Henry et al. 2007). Yoshida
et al. (1975), reportan valores entre 40 a 60 µg g-1 de peso fresco; Mueller et al.
(2008) menores de 100 µg g-1, con especies (Urochloa platyphylla, Poaceae) que
incluso alcanzan 600 µg g-1 en plantas sin tratar.
En especies de Lolium, Michitte et al. (2007) y Wakelin y Preston (2006) reportan
que de 2 a 4 dda, tanto biotipos S como R, acumulan shikimato en niveles
similares, pero luego el incremento continúa solamente en biotipos S. Aún en los
casos en que el mecanismo es debido a una alteración de la EPSPS, como en P.
paniculatum, después de la aplicación de glifosato los niveles de shikimato se
incrementan en biotipos R, pero a niveles mucho más bajos que en biotipos S
(Baerson et al. 2002b; Perez-Jones et al. 2007).
93
Plantas R de C. canadensis, cuyo mecanismo de resistencia es una mutación en
la EPSPS, deben de mantener algunas isoformas susceptibles de la enzima
blanco que son responsables por variar los niveles de inhibición del herbicida
(Mueller et al. 2003). Lo anterior podría explicar parcialmente que plantas de P.
paniculatum resistentes a glifosato, aplicadas con dosis altas, sufren síntomas
propios del herbicida, pero se recuperan al pasar el tiempo. Aunque también el
herbicida podría ser luego trasladado a la vacuola o la planta tener otro tipo de
mecanismo de resistencia no dilucidado en esta investigación.
5.6 Número de copias del gen de la EPSPS
Para determinar si la resistencia al glifosato en P. paniculatum se debía a una
sobreproducción de la EPSPS, se debe hacer una extracción de proteína,
polimerizarla para luego hacer las comparaciones respectivas entre biotipos R y S.
Siguiendo la metodología, los resultados obtenidos con el procedimiento utilizado
no fueron los esperados en cuanto a cantidad de proteína extraída. Por lo tanto, se
procedió a variar el método, utilizando tejido fresco, tejido congelado, aumentando
la cantidad de tejido inicial, utilizando sustancias que previenen la degradación
proteica, entre otras, pero siempre resultó en cantidades muy bajas de proteína
extraída.
Así mismo, se modificó el procedimiento utilizando actina como referencia de gen
de mantenimiento; también se probó con el gen ALS de Paspalum y un gen de
sorgo, el cual se suponía presentaba un número bajo de copias, y en todos los
casos los primers no funcionaron. Se procedió con RT-qPCR utilizando actina
como gen de referencia, pero los resultados siempre fueron los mismos,
cantidades insuficientes de proteína para continuar con el proceso.
El procedimiento debe ser repetido utilizando un segundo gen de referencia que
sea único o que presente un número bajo de copias ya que las cantidades de
94
proteína extraída de plantas de P. paniculatum, tanto de muestras en estado
fresco como congeladas, fueron muy bajas en todos los biotipos, tanto R como S
(Cuadro 17).
Cuadro 17. Cantidad de proteína extraída de 20 g de tejido de P. paniculatum (µg mL-1) de biotipos R y S al glifosato.
Biotipo Condición Proteína (µg mL-1)
D R 713,00
L R 766,25
H S 688,52
C S 504,63
El procedimiento de extracción (Salas et al. 2012), exige que la concentración de
proteína debe de medirse en un espectrofotómetro a 360 nm durante 10 minutos,
para determinar el cambio en la absorbancia en ese periodo. Por esta razón se
midió la concentración de proteína después de la homogenización y de la
purificación, resultando en cantidades insuficientes, muy bajas o degradadas,
incluso utilizando previamente inhibidores de proteasa y carbón activado para
deshacerse de sustancias degradadoras de proteínas.
Después del proceso de diálisis, se cuantificaron las concentraciones de proteína,
y se encontraron valores de solamente ~500-700 µg mL-1 (0,5 a 0,7 mg mL-1) de
proteína cruda (Figura 18). En trabajos similares con L. perenne, en este paso se
extraían 15 mg mL-1 de proteína cruda y el mínimo para poder proseguir con el
análisis debe de ser 1,5 mg mL-1 (Salas et al. 2012).
95
Figura 18. Imágenes de la electroforesis enzimática de la EPSPS de P. paniculatum en gel de sulfato poliacrilamida dodecil sodio (SDS-PAGE). 1: Pellets después de la homogenización. 2: Pellets después 40% fraccionamiento. 3: Sobrenadante después del 40% fraccionamiento (2 ml TCA prep.) 4: P. paniculatum después diálisis (2 ml TCA prep.) 5: P. paniculatum después de diálisis (6 ml TCA prep.)
El tamaño proteico de la enzima EPSPS es 47,6 kDa. Las 4 muestras aquí
ejemplificadas proporcionan un tamaño de banda apenas apreciable, lo que indica
que la concentración de la proteína es sumamente baja.
Se podría hipotetizar que P. paniculatum contiene una gran cantidad de fenoles o
de otras sustancias degradadoras de proteína que hace muy difícil la extracción
enzimática, que son necesarios más de 20 gramos de tejido para lograr una buena
extracción o que se deben de modificar los procedimientos para la extracción y
purificación de la proteína.
96
Tomando en cuenta el hecho de que se logró extraer una cantidad muy baja y
similar de proteína (EPSPS) tanto de plantas R como S de P. paniculatum (Cuadro
17), y al ser esta una especie diploide, existen menos posibilidades de que
biotipos R presenten copias extras del gen de la EPSPS, por lo tanto la
amplificación de genes no se considera que pueda contribuir con el mecanismo de
resistencia.
5.7 Actividad de la EPSPS
Las cantidades extraídas de enzima no fueron suficientes para proseguir con el
análisis de la actividad de la EPSPS (Cuadro 17).
5.8 Mutaciones
En el presente estudio se identificó, en los individuos de P. paniculatum
resistentes a glifosato, una doble sustitución de aminoácidos en los sitios
Pro106Leu y Val332Ala de la EPSPS, correspondientes a P99L y V325A en
Agrobacterium sp. CP4. Esta doble sustitución de aminoácidos es el mecanismo
molecular que determina la resistencia al glifosato en P. paniculatum (Figura 19).
La mutación Pro106Leu, la cual está fuera del sitio de unión, alteró la orientación
espacial de varios aminoácidos: K17, R22, y K35, lo cual fue revelado por las
distancias estimadas desde el sustrato S3P. Por otro lado, la mutación Val332Ala, y
específicamente el residuo D324, no mostró ningún cambio en términos de la
distancia de enlace con respecto al sustrato S3P.
Estudios efectuados por Funke et al. (2006), revelaron que en el sitio 106, la
simple sustitución de glicina por alanina, hizo que la enzima asumiera una
conformación diferente (más condensada), al reducir el espacio entre el oxígeno
97
fosfonado del glifosato, que fue suficiente para evitar su acople, causando la
insensibilidad de la EPSPS.
Resistente:
LQPIREISGTVKLPGSKSLSNRILLLAALSEGTTVVDNLLNSEDVHYMLGALKTLGLSVE
Susceptible:
LQPIREISGTVKLPGSKSLSNRILLLAALSEGTTVVDNLLNSEDVHYMLGALKTLGLSVE
************************************************************
Resistente:
ADKAAKRAVVVGCGGKFPEKDDKEEVQLFLGNAGTAMRLLTAAVTAAGGNTTYVLDGVPR
Susceptible:
ADKAAKRAVVVGCGGKFPEKDDKEEVQLFLGNAGTAMRPLTAAVTAAGGNTTYVLDGVPR
************************************** *********************
Resistente:
MRERPIGDLVVGLKQLGADVDCFLGTDCPPVRVKGIGGLPGGKVKLSGSISSQYLSALLM
Susceptible:
MRERPIGDLVVGLKQLGADVDCFLGTDCPPVRVKGIGGLPGGKVKLSGSISSQYLSALLM
************************************************************
Resistente:
AAPLALGDVEIEIIDKLISIPYVEMTLRLMERFGVKAEHSDSWDRFYIKGGQKYKSPQNA
Susceptible:
AAPLALGDVEIEIIDKLISIPYVEMTLRLMERFGVKAEHSDSWDRFYIKGGQKYKSPQNA
************************************************************
Resistente:
YVEGDASSASYFLAGAAITGGTVTVEGCGTTSLQGDVKFAEVLEMMGAKVTWTETSVTVT
Susceptible:
YVEGDASSASYFLAGAAITGGTVTVEGCGTTSLQGDVKFAEVLEMMGAKVTWTETSVTVT
************************************************************
Resistente:
GPPREPFGRKHLKAIDVNMNKMPDAAMTLAVVALFADGPTAIRDVASWRVKETERMVAIR
Susceptible:
GPPREPFGRKHLKAIDVNMNKMPDVAMTLAVVALFADGPTAIRDVASWRVKETERMVAIR
************************ ***********************************
Resistente:
TELTKLGASVEEGPDYCIITPPEKLNVTAIDTYDDHRMAMAFSLAACAEVPVTIRDPGCT
Susceptible:
TELTKLGASVEEGPDYCIITPPEKLNVTAIDTYDDHRMAMAFSLAACAEVPVTIRDPGCT
***********************************************************
Resistente: RKTFPDYFDVLSTFVKNSTOP
Susceptible: RKTFPDYFDVLSTFVKNSTOP
*********************
Figura 19. Secuencia de los aminoácidos en la 5´EPS 3´PS y alineamiento entre biotipos de P. paniculatum Resistentes y Susceptibles al glifosato.
98
La comparación de las distancias de enlace entre aminoácidos y el inhibidor de
glifosato reveló aspectos interesantes. Ninguno de los residuos en la vecindad de
Val332Ala mostró cambios en términos de formación de enlaces con los átomos de
glifosato similar al sustrato S3P. Pero Pro106Leu modificó el sitio de unión
significativamente, donde la incorporación de un residuo de leucina produjo una
distorsión en la orientación de las cadenas laterales de los aminoácidos vecinos
R22, R98 y Q173, los cuales al ser críticos para enlazar el inhibidor, pudieron haber
producido un debilitamiento de la interacción con glifosato.
El otro cambio, una mutación en la posición Val332Ala, pareció no producir ningún
efecto importante en la unión de EPSPS al sustrato S3P o al glifosato. Sin
embargo, la presencia de esta segunda mutación, aparentemente devuelve de
forma parcial, al restablecer las distancias normales con el PEP, la conformación
del sitio de acople del S3P, que fue afectado por la mutación Pro106Leu, ya que al
compararlo con la enzima sensible, se nota que algunos desplazamientos
espaciales se mantienen (Figura 20). Sin embargo, la mutación V332A + P106L
muestra un desplazamiento espacial diferente en este sitio (Figura 20C y 20D), en
relación con la EPSPS no mutante de E. coli.
99
Figura 20. Modelos 3D de aminoácidos que se enlazan directamente con S3P.
A: Ser23 y Arg27; B: Lys340 y Asp313; C: Lys22 y Asp313; D: Lys22 y Asp313. Código
de colores: verde: V332A; amarillo: P106L; azul: V332 + P106L; rosa: glifosato.
De las dos mutaciones, la Pro106Leu parece jugar un papel más importante en
comparación con Val332Ala. El sitio Pro106 no está directamente involucrado en las
interacciones moleculares ni con glifosato ni con el sustrato PEP, pero la
sustitución de Pro106 por otro aminoácido, produce cambios estructurales en el sitio
activo y desplaza a otros aminoácidos hacia el inhibidor, reduciendo el espacio
disponible (Healy-Fried et al. 2007). Esto concuerda con resultados de
investigaciones especializadas en la estructura cristalina EPSPS-S3P-glifosato y
en las sustituciones Pro106 en la EPSPS, las cuales revelaron que las mutaciones
en ese sitio causan un ligero estrechamiento del espacio de acople de glifosato-
PEP, que provoca resistencia al glifosato, pero preserva la funcionalidad de la
enzima (Healy-Fried et al. 2007).
Lys340
Agr27
Ser23
Lys22
Asp313
Lys22
A B
C D
S3P
S3P
S3P
Glifosato
Glifosato
100
Así mismo, como lo reporta Padgette et al. (1991), el sitio activo de la EPSPS es
altamente conservado; por consiguiente, solo cambios menores en la estructura
de la cavidad del sitio de unión glifosato-PEP, como en Pro106, podrían producir
resistencia a glifosato sin una pérdida significativa de la funcionalidad enzimática
(Funke et al. 2009; Powles y Yu 2010).
La resistencia por mutaciones en Pro106 se relaciona con el nivel de ploidía o
número de copias del gen de la enzima que posee la especie, lo que aumenta
tanto el número de unidades enzimáticas mutantes como el de sensibles. Por
ejemplo, en la especie diploide E. indica, la mutación homocigótica Pro106Ser le
confiere solamente un moderado nivel de resistencia (2,8 veces), aun así es
suficiente para soportar las aplicaciones a dosis comerciales de glifosato
(Kaundun et al. 2008); pero en especies poliploides, como la hexaploide E. colona,
la misma mutación no es suficiente para permitir sobrevivir a las plantas. En el
caso de P. paniculatum, al ser una especie diploide y presentar doble mutación, el
índice de resistencia es consecuente con su número de copias del gen, de bajo a
moderado.
Otros casos de dos sustituciones separadas de aminoácidos en la EPSPS, se
obtuvieron de forma artificial en el primer maíz transgénico resistente a glifosato
(Thr102Ile y Pro106Ser) (Lebrun et al. 2003) y en E. coli y canola transgénica
(Gly96Ala y Ala183Thr) (Kahrizi et al. 2007), pero la doble mutación encontrada en
P. paniculatum no ha sido observada en ninguna otra especie.
En E. indica, Yu et al. (2015) demostraron que la doble mutación (T102I + P106S) se
presentó de forma natural, y parece ser un evento secuencial donde primeramente
se enriqueció la población de plantas con la mutación P106S y luego con la
mutación T102I, seleccionando individuos con una EPSPS doble mutante de alta
resistencia al glifosato; individuos con solo la mutación P106S tenían un IR mayor a
32 (comparado con los susceptibles), mientras que individuos con la doble
mutación poseían un IR mayor a 180. Para estos autores, el alto índice de
101
resistencia que aporta la evolución secuencial de la doble mutación, es un
importante mecanismo por el cual las plantas se adaptan a una intensa selección
del herbicida y es un ejemplo tangible de la evolución en acción.
Un caso similar al de P. paniculatum fue reportado por Alarcón-Reverte et al.
(2013) en la poacea E. colona, la cual poseía un IR de 4 a 9; los individuos S
acumularon más shikimato que los R; no habían diferencias de absorción o
transporte entre biotipos S y R, sin embargo, plantas R poseían una mutación en
el sitio Pro106 y además poseían una actividad enzimática mayor.
6. Conclusiones
La aplicación de glifosato en altas frecuencias y dosis, su uso repetido como único
método de control de malezas por varios ciclos de producción, la ausencia de
rotación de cultivos, los sistemas de mínima o cero labranza, contribuyen a
explicar el aumento en la presión de selección para que plantas de P. paniculatum
evolucionaran resistencia al herbicida. En muchos sistemas agrícolas,
especialmente en cultivos perennes, la evolución de casos de resistencia a
glifosato es una indicación de un exceso de dependencia de este herbicida para el
manejo de malezas.
Debido a que la absorción, transporte y exudación de glifosato entre biotipos R y S
no fue diferente, se considera que ninguna de las características relacionadas con
el movimiento del herbicida dentro de la planta contribuyen al mecanismo de
resistencia al glifosato en las poblaciones evaluadas de P. paniculatum, aunque
este sea un mecanismo común de resistencia en otras especies de malezas.
Así mismo, como sucede en muchos otros tipos de malezas y cultivos, los biotipos
de P. paniculatum estudiados hasta el momento, tanto R como S, son incapaces
de metabolizar el glifosato; por consiguiente se descarta que este proceso sea
parte del mecanismo de resistencia al herbicida.
102
El hecho de que haya un aumento en la acumulación de shikimato solamente en
biotipos S de P. paniculatum y no en los biotipos R, sugiere que el mecanismo de
resistencia al glifosato en esta maleza, es propio del sitio activo y se debe a una
alteración de la funcionalidad o cantidad de la enzima EPSPS.
La caracterización molecular de la ppEPSPS demostró que hay diferencias en la
composición de aminoácidos entre las enzimas de biotipos S y R, más
precisamente una doble mutación, que resulta en una baja afinidad de la EPSPS
de biotipos R con el glifosato, pero que mantienen la funcionalidad de la enzima.
La doble mutación encontrada en el gen de ppEPSPS, a pesar de no situarse en
el espacio de unión del glifosato o del S3P, provoca que se dé una conformación
espacial proteica diferente, al reducir el espacio en el punto de acople del
herbicida, evitando que el glifosato pueda unirse a la enzima, pero permitiendo
cierto ligamiento del PEP, con lo cual la planta puede continuar con su proceso de
síntesis a través de la ruta del shikimato y continuar con su desarrollo.
El glifosato alcanza el sitio activo en cantidades suficientes para causar daño, pero
la mutación limita el impacto del herbicida. Este parece ser el mecanismo por el
cual esta maleza soporta las aplicaciones de glifosato en dosis comerciales.
Tomando en cuenta que los biotipos R estudiados de P. paniculatum presentaron
la misma mutación, y que es una especie mayoritariamente autopolinizable, se
podría concluir que pertenecen a una misma población inicial, y que se han ido
desplazando en territorio a través de la diseminación de sus semillas por diversos
medios, incluido la actividad agrícola, de transporte y clima.
Para malezas que evolucionaron resistencia al glifosato en Costa Rica, este es el
primer caso documentado de la determinación de su mecanismo de resistencia.
103
7. Recomendaciones
Tanto los resultados de la presente investigación como los citados en la literatura
reciente, indican que los sistemas de producción agrícola donde malezas han
evolucionado resistencia, se caracterizan por aplcar prácticas de control muy poco
diversas. Para prevenir o retrasar esta evolución, que se manifiesta en pobres
controles, es necesario que los entes involucrados en la actividad agrícola
(agricultores, cámaras de productores, industria agroquímica, sector académico y
gubernamental, entre otros) promuevan la aplicación de prácticas y estrategias
diversas, técnica y económicamente sustentables, basadas en la integración de
múltiples mejoras en el manejo de malezas y del cultivo en general.
Algunas de estas prácticas y estrategias que busquen aumentar la diversidad en el
manejo y control de malezas y disminuir la presión de selección son: utilizar
prácticas preventivas y culturales de manejo de malezas; alternar métodos físicos,
mecánicos y biológicos de control de malezas con el control químico con
herbicidas; utilizar rotaciones y mezclas de herbicidas de diferentes familias
químicas o con diferentes mecanismos de acción.
Una tarea a corto plazo, debe ser el registro y diseminación de información sobre
eventos de fallos en el control de malezas, que se pueda cotejar con registros de
uso de herbicidas, de prácticas agrícolas y de manejo de cultivos en general. En
muchos casos, los productores confunden los casos de resistencia con tolerancia,
con una mala aplicación o mala calidad del herbicida, y las casas comerciales son
muy cautas en aceptar que existe resistencia de malezas a sus propios herbicidas.
Se debe de crear una red para diseminar información sobre sospechas de
resistencia, especialmente en cultivos de alto uso de herbicidas, y para el caso de
glifosato, en cultivos perennes.
Se debe de incluir en futuras investigaciones de resistencia con esta maleza,
estudios sobre el costo de adaptación que genera las mutaciones encontradas en
P. paniculatum y que le confieren niveles moderados de resistencia. Es necesario
104
estudiar la adaptabilidad fenotípica de esta maleza cuando crece en competencia
directa con cultivos, con otras malezas o con coberturas nativas, para tomar en
cuenta en programas de manejo con coberturas vivas o con diferentes densidades
del cultivo u otras situaciones que le generen competencia.
Dentro de las prácticas para reducir la presión de selección se encuentra la
rotación de herbicidas con diferentes mecanismos de acción. Para el caso de P.
paniculatum, no se conoce si existe resistencia múltiple en los biotipos que
evolucionaron resistencia a glifosato, y a pesar de que Ramírez y Valverde (2017),
sostienen que este fenómeno no se presenta con los graminicidas fluazifop-p
butilo y haloxifop metilo en esta misma especie, se hace necesario conocer la
respuesta de esta maleza a otros herbicidas utilizados o a utilizar en su control, en
los cultivos donde aparecieron los casos de resistencia.
Ya que la diseminación de individuos de P. paniculatum resistentes se podría dar
por dispersión de semillas a través de transporte de materiales como suelo,
almácigos y sustratos de lugares con presencia maleza R hacia otras zonas, se
deben de tomar medidas más estrictas para evitar una dispersión mayor.
Debido a las dificultades en los procedimientos de extracción y purificación de
proteína en P. paniculatum, los cuales fueron efectivos en otras especies de
malezas, especialmente por la posible presencia de sustancias degradadoras de
proteínas, en próximas investigaciones sobre concentración y actividad enzimática
en esta especie, es necesario modificar el método de extracción para obtener
cantidades adecuadas de proteína para continuar con los análisis.
En futuras investigaciones moleculares con P. paniculatum, se podría determinar
si debido a una extrema presión de selección, la mutación V332A se presentó de
forma posterior en individuos que ya se habían seleccionado al poseer la mutación
P106L. Es probable que a nivel de campo, los productores hayan percibido el
problema de resistencia únicamente hasta que se presentaran plantas con la
doble mutación.
105
8. Literatura citada
Alarcón-Reverte, R., García, A., Urzúa, J. & Fischer, A. J. (2013). Resistance to
glyphosate in jungle rice (Echinochloa colona) from California. Weed Science, 61(1), 48-54.
Alibhai, M. F., CaJacob, C., Feng, P. C. C., Heck, G. R., Qi, Y., Flasinski, S. & Stalling, W. C. (12 de enero de 2016). Glyphosate resistant Class I 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS). Monsanto Technology LLC: US Patent 7,723,575 B2. 1-49. Recuperado de https://www.google.si/patents/US7723575?hl=sl
Alibhai, M. F. & Stalling, W. C. (2001). Closing down on glyphosate inhibition-with a new
structure of a drug discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 98(6), 2944-2946. doi:10.1073/pnas.061025898
Altschul, S. F., Madden, T. L., Schäffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman,
D. J. (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res, 25(17), 3389–3402.
Amrhein, N., Deus, B., Gerhke, P. & Steinrucken, H. C. (1980). The site of the inhibition
of the shikimate pathway by glyphosate. II. Interference of glyphosate with chorismate formation in vivo and in vitro. Plant Physiology, 66(5), 830-834.
Anderson, M. J. (2010). Detecting multivariate changes in biological assemblages:
experimental design and data analysis. Multivariate analysis of complex experimental designs using PERMANOVA+ for PRIMER. Institute of Information and Mathematical Sciences (IIMS) Massey University, Auckland, Australia.
Anderson, M. J. (2001). A new method for non-parametric multivariate analysis of
variance. Austral Ecology, 26, 32–46. doi: 10.1111/j.1442-9993.2001.01070.pp.x Anderson, K. A., Cobb, W. T.& Loper, B. R. (2001). Analytical method for determination
of shikimic acid: shikimic acid proportional o glyphosate application rates. Communications in Soil Science and Plant Analysis, 32(17-18), 2831-2840.
Antonovics, J. & Thrall, P. H. (1994). The cost of resistance and the maintenance of
genetic polymorphism in host-pathogen systems. Proceedings: Biological Sciences, 257(1349), 105-110.
Araujo, A., Monteiro, R. & Abarkeli, R. (2003). Effect of glyphosate on the microbial
activity of two Brazilian soils. Chemosphere, 52(5), 799-804. Recuperado de https://doi.org/10.1016/S0045-6535(03)00266-2
106
Arnaud, L., Sailland, A., Lebrun, M., Pallett, K., Ravanel, P., Nurit, F. & Tissut, M. (1998). Physiological behavior of two tobacco lines expressing EPSP synthase resistant to glyphosate. Pesticide Biochemistry and Physiology, 62(1), 27–39. Recuperado de https://doi.org/10.1006/pest.1998.2363
Ashworth, M. B., Walsh, M. J., Flower, K. C., & Powles, S. B. (2016). Recurrent selection with reduced 2,4-D amine doses results in the rapid evolution of 2,4-D herbicide resistance in wild radish (Raphanus raphanistrum L.). Pest Manag Sci, 72(11), 2091-2098.doi: 10.1002/ps.4364
Ashworth, M. B., Walsh, M. J., Flower, K. C., & Powles, S. B. (2014). Identification of the
first glyphosate-resistant wild radish (Raphanus raphanistrum L.) populations. Pest Manag Sci, 70(11), 1432–1436. doi: 10.1002/ps.3815
Baerson, S. R., Rodríguez, D. J., Tran, M., Feng, Y. M., Biest, N. A., & Dill, G. M.
(2002a). Glyphosate-Resistant Goosegrass. Identification of a mutation in the target enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase. Plant Physiology, 129(3), 1265–1275. doi: http://dx.doi.org/10.1104/pp.001560
Baerson, S. R., Rodríguez, D. J., Biest, N. A., Tran, M., You, J., Kreuger, R. W.,…Gruys,
K. J. (2002b). Investigating the mechanism of glyphosate resistance in rigid ryegrass (Lolium rigidum). Weed Sci, 50(6), 721–730. doi: http://dx.doi.org/10.1614/0043-1745(2002)050[0721:ITMOGR]2.0.CO;2
Baird, D. D., Upchurch, R. P., Homesley, W. B. & Franz, J. E. (1971). Introduction of a
new broad spectrum post emergence herbicide class with utility for herbaceous perennial weed control. Proceedings of the North Central Weed Science Society, 26, 64-68.
Balthazor, T. M. & Hallas, L. E. (1986). Glyphosate-degrading microorganisms from
industrial activated sludge. Appl. Environ. Microbiol, 51(2), 432-434. Bandeen, J. D., Stephenson, G. R. & Cowett, E. R. (1982). Discovery and distribution of
herbicide resistant weeds in North America. In Lebaron HM y Gressel J (Eds.). Herbicide Resistance in Plants. (pp. 9-30). John Wiley and Sons, Inc. New York
Barea, K., Scheffer-Basso, A. M., & Favero, D. (2006). Desenvolvimiento morfológico de
Paspalum paniculatum L. (Poaceae). Biotemas, 19(4), 33-39. Barreto, I. (1974). O genero Paspalum (Gramineae) no Rio Grande do Sul. (Tese de
Livre Docencia) Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brasil (pp. 258).
107
Baucom, R. S. & Mauricio, R. (2004). Fitness costs and benefits of novel herbicide tolerance in a noxious weed. PNAS, 101(36), 13386–13390. doi: 10.1073/pnas.0404306101
Beckie, H. J. & Tardif, F. J. (2012). Herbicide cross resistance in weeds. Crop
Protection, 35, 15-28. Recuperado de https://doi.org/10.1016/j.cropro.2011.12.018 Beckie, H. J. (2011). Herbicide-resistant weed management: focus on glyphosate. Pest
Management Science, 67(9), 1037-1048. doi: 10.1002/ps.2195 Beckie, H. J. (2006). Herbicide-resistant weeds: management tactics and practices.
Weed Technology, 20, 793–814. Bell, M. S., Hager, A. G. & Tranel, P. J. (2013). Multiple resistance to herbicides from
four site-of-action groups in waterhemp (Amaranthus tuberculatus). Weed Science, 61(3), 460-468. doi: http://dx.doi.org/10.1614/WS-D-12-00166.1
Bostamam, Y., Malone, J. M., Dolman, F. C., Boutsalis, P. & Preston, C. (2012). Rigid ryegrass (Lolium rigidum) populations containing a target site mutation in EPSPS and reduced glyphosate translocation are more resistant to glyphosate. Weed Science, 60(3), 474-479.
Botero-Coy, A. M., Ibáñez, M., Sancho, J. V. & Hernández, F. (2013). Improvements in the analytical methodology for the residue determination of the herbicide glyphosate in soils by liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1292, 132-141. Recuperado de https://doi.org/10.1016/j.chroma.2012.12.007
Bozzo de Brum, M. A. (2010). Persistencia del glifosato y efecto de sucesivas
aplicaciones en el cultivo de soja en agricultura continua en siembra directa sobre parámetros biológicos del suelo (tesis de magister). Universidad de la República, Montevideo, Uruguay. Recuperado de http://ambiente.fcien.edu.uy/tesis/Tesis_Alexandra_Bozzo.pdf
Bradshaw, L. D., Padgette, S. R., Kimball, S. L. & Wells, B. H. (1997). Perspectives on glyphosate resistance. Weed Technology, 11(1), 189-198.
Brecke, B. J. & Duke, W. B. (1980). Effect of glyphosate on intact bean plants. Plant Physiology, 66(6), 656-659. doi: http://dx.doi.org/10.1104/pp.66.4.656
Brenes-Prendas, S. & Aguero-Alvarado, R. (2007). Reconocimiento taxonómico de arvenses y descripción de su manejo, en cuatro fincas productoras de piña (Ananas comosus L.) en Costa Rica. Agronomía Mesoamericana, 18(2), 239-246.
108
Brigs, G. G., Rigitano, R. L. O. & Bromilow, R. H. (1987). Physio-chemical factors affecting uptake by roots and translocation to shoots of weak acid in barley. Pest. Sci, 19(2), 101-112. doi: 10.1002/ps.2780190203
Bromilow, R. H. & Chamberlain, K. (2000). The herbicide glyphosate and related
molecules: physiochemical and structural factors determining their mobility in the phloem. Pest Management Science, 56(4), 368-373. doi: 10.1002/(SICI)1526-4998(200004)56:4<368::AID-PS153>3.0.CO;2-V
Bromilow, R. H., Chamberlain, K., & Patil, S. G. (1990). A rapid method using Ricinus communis for the estimation of phloem traslocation of xenobiotics. Pest. Sci, 30(1),1-12. doi: 10.1002/ps.2780300102
Brunharo, C. A. C. G., Patterson, E. L., Carrijo, D. R., de Melo, M. S. C., Nicolai, M., Gaines, T. A., Nissen, S. J. & Christoffoleti, P. J. (19-25, junio, 2016). Confirmation and mechanism of glyphosate resistance in tall windmill grass (Chloris elata) from Brazil. In Proceedings 7th International Weed Science Congress. Prague, Czech Republic. p 286
Burton, J. D. & Balke, N. E. (2012). Glyphosate uptake by suspension-cultured potato
(Solanum tuberosum and S. brevidens) cells. Weed Science, 36(2), 146–153.
Burson, B. L. (1987). Pollen germination, pollen tube growth and fertilization following self and interespecific pollination of Paspalum species. Euphytyca, 36(2), 641-650. doi: 10.1007/BF00041514
Burson, B.L. (1979). Cytogenetics of P. urivelli X P. intermedium and P. dilatatum X P. paniculatum Hybrids. Crop Science, 19, 534-538
Busi, R., Vila-Aiub, M. M., Beckie, H. J., Gaines, T. A., Goggin, D. E., Kaundun, S. S.,... Powles, S. B. (2013). Herbicide-resistant weeds: from research and knowledge to future needs. Evolutionary Applications, 6(8), 1218–1221. doi: 10.1111/eva.12098
Busi, R. & Powles, S. B. (2009). Evolution of glyphosate resistance in a Lolium rigidum population by glyphosate selection at sub-lethal doses. Heredity, 103, 318–325. doi: 10.1038/hdy.2009.64
Business Wire. (2016). Glyphosate Market 2015-2022 - Global Strategic Business Report 2016 - Research and Markets. Recuperado de http://www.businesswire.com/news/home/20160728005938/en/Glyphosate-Market-2015-2022---Global-Strategic-Business
Cakmak, I., Yazici, A., Tutus, Y. & Ozturk, L. (2009). Glyphosate reduced seed and leaf concentrations of calcium, manganese, magnesium, and iron in non-glyphosate resistant soybean. European Journal of Agronomy, 31, 114-119.
109
CaJacob, C. A., Feng, P. C. C., Heck, G. R., Murtaza, F. A., Sammons, R. D. & Padgett, S. R. (2003). Engineering resistance to herbicides. In P. Christou y H. Klee (Eds). Handbook of Biotechnology, V1 (pp. 353-372). Chichester: John Wiley and Sons, Ltd.
Calabrese, E. J. (2008). Hormesis: why it is important to toxicology and toxicologists.
Environ Toxicol Chem, 27(7), 145-1474. doi: 10.1897/07-541 Caseley, J. C. & Coupland, D. (1985). Environmental and plant factors affecting
glyphosate uptake, movement and activity. In E. Grossbard y D. Atkinson (Eds). The Herbicide Glyphosate (pp. 92-123). London: Butterworths y Co.
Chen, J., Huang, H., Zhang, C., Wei, S., Huang, Z., Chen, J. & Wang, X.
(2015). Mutations and amplification of EPSPS gene confer resistance to glyphosate in goosegrass (Eleusine indica). Planta, 242: 859–868. doi: 10.1007/s00425-015-2324-2
Christoffers, M. J. & Varanasi, A. V. (2010). Glyphosate resistance: genetic basis in
weeds. In Nandula VK (Ed). Glyphosate resistance in crops and weeds: History, development and management (pp 119-140). Hoboken, New Jersey: John Wiley and Sons, Inc.
Collavo, A. & Sattin, M. (2012). Resistance to glyphosate in Lolium rigidum selected in
Italian perennial crops: bioevaluation, management and molecular bases of target-site resistance. Weed Research, 52(1), 16–24. doi: 10.1111/j.1365-3180.2011.00883.x
Comai, L., Sen, L. C. & Stalker, D. M. (1983). An Altered aroA Gene Product Confers Resistance to the Herbicide Glyphosate. Science, 221(4608), 370-371. doi: 10.1126/science.221.4608.370
Coupland, D. (1985). Metabolism of glyphosate in plants. In Grossbard, E. y Atkinson, D (Eds). The Herbicide Glyphosate. (pp 25-34). London: Butterworths
Coupland, D. & Caseley, J. C. (1979). Presence of 14C activity in root exudates and guttation fluid from Agropyron repens treated with 14C-labelled glyphosate. New Phytol, 38(1), 17-22.
Cruz-Hipólito, H., Osuna, M. D., Dominguez-Valenzuela, J. A., Espinoza, N. & De Prado,
R. (2011). Mechanism of resistance to ACCase-inhibiting herbicides in wild oat (Avena fatua) from Latin America. J Agric Food Chem, 59(13), 7261-7267. doi: 10.1021/jf201074k
Culpepper, A. S., Grey, T. L., Vencill, W. K., Kichler, J. M., Webster, T. M., Brown, S.
M.,… Hanna, W. W. (2006). Glyphosate-resistant Palmer amaranth (Amaranthus
110
palmeri) confirmed in Georgia. Weed Sci, 54(4), 620–626. doi: http://dx.doi.org/10.1614/WS-06-001R.1
Currier, H.B., & Dybing, C.D. 1959. Foliar penetration of herbicides – Review and present status. Weeds, 7(2), 195-213. doi:10.2307/4040221
De Carvalho, L. B., Cruz-Hipolito, H., Gonzalez-Torralva, F., da Costa Aguiar Alves, P.
L., Christoffoleti, P. J. & De Prado, R. (2011). Detection of Sourgrass (Digitaria insularis) Biotypes Resistant to Glyphosate in Brazil. Weed Science, 59(2), 171-176. doi: http://dx.doi.org/10.1614/WS-D-10-00113.1
Devine, M. D., Duke, S. O. & Fedtke, C. (1993). Physiology of herbicide action. Englewood Cliffs, NJ:PTR Prentice-Hall, p96.
Dewey, S. A. & Appleby, A. P. (1983). A comparison between glyphosate and assimilate
translocation patterns in Tall Morninglory (Ipomoea purpurea). Weed Science, 31(3), 308-314.
Dill, G., Sammons, D., Feng, P., Kohn, F., Kretzmer, K., Mehrsheikh, A.,… Haupfear, E.
(2010). Glyphosate: Discovery, development, applications, and properties. In Nandula, VK (Ed). Glyphosate Resistance in Crops and Weeds, History, Development and Management. (pp 1-34) Hoboken, New Jersey: John Wiley and Sons, Inc.
Dill, G. M. (2005). Glyphosate resistant crops: history, status and future. Pest
Management Science, 61(3), 219-224. doi: 10.1002/ps.1008 Dillon, A., Varanasi, V. K., Danilova, T. V., Koo, D.H., Nakka, S., Peterson, D. A.,
Tranel, P. J…. Jugulam, M. (2016). Physical Mapping of Amplified Copies of the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase Gene in Glyphosate-Resistant Amaranthus tuberculatus. Plant Physiology (Preview).DOI:10.1104/pp.16.01427 http://www.plantphysiol.org/content/plantphysiol/early/2016/12/12/pp.16.01427.full.pdf
Dinelli, G., Marotti, I., Bonetti, A., Catizone, P., Urbano, J. M. & Barnes, J. (2008).
Physiological and molecular bases of glyphosate resistance in Conyza bonariensis biotypes from Spain. Weed Research, 48(3), 257-265. doi: 10.1111/j.1365-3180.2008.00623.x
Dinelli, G., Bonetti, A., Marotti, I., Minelli, S., Busi, S. & Catizone, P. (2007). Root
exudation of diclofop-methyl and triasulfuron from foliar-treated durum wheat and ryegrass. Weed Research,47, 25–33
Dinelli, G., Marotti, I., Bonetti, A., Minelli, M., Catizone, P. & Barnes, J. (2006). Physiological and molecular insight on the mechanism of resistance to glyphosate
111
in Conyza canadensis (L.) Cronq. biotypes. Pest. Bioch. Physiol., 86(1), 30-41. doi: 10.1016/j.pestbp.2006.01.004
Duke, S. O., Baerson, S. R. & Rimando, A. M. (2003). Glyphosate. En D. W. Gammon &
N. R. Ragsdale (Eds.), Encyclopedia of Agrochemicals On line. John Wiley e hijos. Recuperado de http://www.interscience.wiley.com/emrw/9780471263630/home/
Duke, S. O., Silva, F. M. L., Dayan, F. E. & Velini, E. D. (19-25, junio, 2016). Low doses
of glyphosate change the responses of soybean to subsequent glyphosate treatments. In Proceedings 7th International Weed Science Congress. Prague, Czech Republic. p 26.
Duke, S. O. (2011). Glyphosate degradation in glyphosate-resistant and susceptible
crops and weeds. J. Agric. Food. Chem., 59(11), 5835-5841. doi: 10.1021/jf102704x
Duke, S. O. & Powles, S. B. (2008). Glyphosate: a once-in-a-century herbicide. Pest
Management Science, 64(4), 319-325. doi: 10.1002/ps.1518 Duke, S. O., Christy, A. L., Hess, F. D., Holt, Z. S. &Ames, I. A. (1991). Herbicide-
resistant crops: Comments from CAST 1991-1. Council of Agric. Sci. and Technol. EC (European Commission). (2013). SANCO/12571/2013. Guidance document on
analytical quality control and validation procedures for pesticide residues analysis in food and feed. Recuperado de http://www.eurl- pesticides.eu/library/docs/allcrl/AqcGuidance_Sanco_2013_12571.pdf
Feng, P. C. C., Tran, M., Chiu, T., Sammons, R. D., Heck, G. R. & Cajacob, C. A.
(2004). Investigations into glyphosate-resistant horseweed (Conyza canadensis): retention, uptake, translocation, and metabolism. Weed Science, 52(4), 498-505. doi: https://doi.org/10.1614/WS-03-137R
Feng, P. C. C., Chiu, T. &Sammons, R. D. (2003).Glyphosate efficacy is contributed by
its tissue concentration and sensitivity in velvetleaf (Abutilon theophrasti). Pestic. Biochem. Physiol, 77(3), 83-91. doi: https://doi.org/10.1016/j.pestbp.2003.08.005
Fernandes, M. I. B. M., Barreto, I. L., Salzano, F. M., & Sacchet, A. M. O. F. (1974). Cytological and evolutionary relationships in Brazilian forms of Paspalum (Gramineae). Caryologia, 27, 455-465.
Ferreira, E. A., Galon, L., Aspiazú, I., Silva, A. A., Concenço, G., Silva, A. F., Oliveira, J. A., & Vargas, L. (2008). Glyphosate translocation in hairy fleabane (Conyza bonariensis) biotypes. Planta Daninha, 26(3), 637-643. doi: http://dx.doi.org/10.1590/S0100-83582008000300020
112
Ffrench-Constant, R. H., Daborn, P. J., & Le Goff, G. (2004).The genetics and genomics of insecticide resistance. Trends in Genetics, 20(3), 163–170. doi: https://doi.org/10.1016/j.tig.2004.01.003
Flagel, L. E., & Wendel, J. F. (2009). Gene duplication and evolutionary novelty in
plants. New Phytologist, 183(3), 557–564. doi:10.1111/j.1469-8137.2009.02923.x Florida, N., Lopez, C., & Pocomucha, V. (2012). Efecto del herbicida paraquat y
glifosato en propiedades del suelo que condicionan el desarrollo de bacterias y fungi. Investigación y Amazonía, 2(1-2), 35-43.
Fisher, A. (2012). Resistencia a herbicidas: mecanismos y mitigación. Revista Especial Maleza. Aapresid, 13-19. Recuperado de: http://www.aapresid.org.ar/articulos/revistas/REMSD12_002.pdf
Fisher, A. J. (2008). Mecanismos de Resistencia: las bases para definir estrategias. Seminario Internacional “Viabilidad del Glifosato en Sistemas Productivos Sustentables”. INIA. Colonia, Uruguay, 27-44.
Folmar, L. C., Sanders, H. O., & Julin, A. M. (1979). Toxicity of the herbicide glyphosate
and several of its formulations to fish and aquatic invertebrates. Arch. Environm. Contam. Toxicol,. 8(3), 269-278. doi: 10.1007/BF01056243
Franz, J. E., Mao, M. K. & Sikorski, J. A. (1997). Glyphosate: a unique global herbicide.
ACS Monograph 189 (1a ed.). Washington, DC: American Chemical Society Franz, J. E. (1985). Chemistry of glyphosate. In E. Grossbard, y D. Atkinson (Eds.), The
Herbicide Glyphosate(pp.3-17). Butterworths, London. Funke, T., Yang, Y., Han, H., Healy-Fried, M., Olesen, S., Becker, A. & Schönbrunn, E.
(2009). Structural basis of glyphosate resistance resulting from the double mutation Thr97-Ile and Pro101-Ser in 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli. J. Biol. Chem, 284(15), 9854–9860. doi: 10.1074/jbc.M809771200
Funke, T., Han, H., Healy-Fried, M. L., Fisher, M. & Schönbrunn, E. (2006). Molecular
basis for the herbicide resistance of Roundup Ready crops. Proceedings of the National Academy of Science USA, 103(35), 13010–13015. doi: 10.1073/pnas.0603638103
Gaines, T. A., Cripps, A. & Powles, S. B. (2012). Evolved resistance to glyphosate in
junglerice (Echinochloa colona) from the tropical Ord River region in Australia. Weed Technol, 26(3), 480–484. doi: http://dx.doi.org/10.1614/WT-D-12-00029.1
Gaines, T. A., Zhang, W., Wang, D., Bukum, B., Chisholm S. T., Shaner, D. L.,...
Westra, P. (2010). Gene amplification confers glyphosate resistance in
113
Amaranthus palmeri. Proceedings of the National Academy of Science of the USA, 107(3), 1029-1034.doi: 10.1073/pnas.0906649107
Ge, X., d ’Avignon, D. A., Ackerman, J. J. & Sammons, R. D. (2014). In Vivo 31P-
Nuclear Magnetic Resonance Studies of Glyphosate Uptake, Vacuolar Sequestration, and Tonoplast Pump Activity in Glyphosate Resistant Horseweed. Plant Physiology, 166(3), 1255–1268. doi: 10.1104/pp.114.247197
Ge, X., d’Avignon, D. A., Ackerman, J. J., Collavo, A., Sattin, M., Ostrander, EL., Hall,
E.L., Sammons, R.D. & Preston, C. (2012). Vacuolar glyphosate-sequestration correlates with glyphosate resistance in ryegrass (Lolium spp.) from Australia, South America, and Europe: a 31P NMR investigation. J. Agric. Food Chem, 60(5), 1243–1250. doi: 10.1021/jf203472s
Ge, X., d’Avignon, D. A., Ackerman, J. J. H., Duncan, B., Spaur, M. B. & Sammons, R.
D. (2011). Glyphosate-resistant horseweed made sensitive to glyphosate: low-temperature suppression of glyphosate vacuolar sequestration revealed by 31P NMR. Pest Manag Sci, 67(10), 1215–1221. doi: 10.1002/ps.2169
Ge, X., d’ Avignon, D. A., Ackerman, J. J. H. & Sammons, R. D. (2010). Rapid vacuolar
sequestration: the horseweed glyphosate resistant mechanism. Pest. Manag. Sci., 66(4), 345-348. doi: 10.1002/ps.1911
Geiger, D. R. & Fuchs, M. A. (2002). Inhibitors of aromatic amino acid biosynthesis
(glyphosate). In P. Böger, K. Wakabayashi & K. Hirai (Eds.), Herbicide classes in development (pp. 59–85). Springer, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg. doi: 10.1007/978-3-642-59416-8_3
Giesy, J. P., Dobson, S. & Solomon, K. R. (2000). Ecotoxicological risk assessment for
Roundup® Herbicide. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology, 167, 35-120.
Global Market Insights. (2016). Glyphosate Market Size, Industry Analysis Report,
Regional Outlook, Application Potential, Price Trends, Competitive Market Share & Forecast, 2016 – 2023. Recuperado de https://www.gminsights.com/industry-analysis/glyphosate-market-
González-Torralva, F., Rojano-Delgado, A. M., Luque de Castro, M. D., Muelleder, N., &
De Prado, R. (2012). Two non-target mechanisms are involved in glyphosate-resistant horseweed (Conyza canadensis L. Cronq.) biotypes. J. Plant. Phys, 169, 1673–1679.
Gressel, J. (2011). Low pesticide rates may hasten the evolution of resistance by
increasing mutation frequencies. Pest. Manag. Sci., 67(3), 253-257. doi: 10.1002/ps.2071
114
Gressel, J. (2009). Evolving understanding of the evolution of herbicide resistance. Pest. Manag. Sci., 65(11), 1164-1173. doi: 10.1002/ps.1842
Gressel, J. & Levy, A. A. (2006). Agriculture: The selector of improbable mutations. PNAS, 103(33), 12215–12216. Recuperado de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1832258/pdf/zpq12215.pdf
Gressel, J. (Ed). (2002). Evolution of resistance to herbicides. In Molecular Biology of Weed Control (pp. 78–121). Taylor y Francis, London, UK.
Gressel, J. & Segel, L. A. (1978). The paucity of plants evolving genetic resistance to herbicides: possible reasons and implications. Journal of Theoretical Biology, 75, 349-371.
Hall, L. M., Holtum, J. A. M. & Powles, S. B. (1994). Mechanisms responsible for cross resistance and multiple resistance. In J. A. M, Holtum & Powles, S. B (Eds.). Herbicide Resistance in Plants: Biology and Biochemistry, (pp. 243-261). Boca Raton, FL: Lewis Publishers.
Hammel, B. E., Grayum, M. H., Herrera, C. & Zamora, N. (2003). Manual de Plantas de
Costa Rica. Volumen III Monocotiledóneas (Orchidaceae-Zingiberaceae) (pp. 884). Missouri Botanical Garden, Instituto Nacional de Biodiversidad, Museo Nacional de Costa Rica. Missouri, EE.UU.
Han, H., Vila-Aiub, M., Jalaludin, A., Yu, Q., & Powles, S. (2017). A double EPSPS gene
mutation endowing glyphosate resistance shows a remarkably high resistance cost. Plant Cell Environ., 1-12. doi: 10.1111/pce.13067
Han, H., Yu, Q., Widderick, M. J. & Powles, S. B. (2015). Target-site EPSPS Pro-106
mutations: sufficient to endow glyphosate resistance in polyploidy Echinochloa colona?. Pest Manag Sci, 72(2), 264-271. doi: 10.1002/ps.4038
Hanson, B. D., Shrestha, A. & Shaner, D. L. (2009). Distribution of Glyphosate-Resistant
Horseweed (Conyza canadensis) and Relationship to Cropping Systems in the Central Valley of California. Weed Science, 57(1), 48-53. doi: https://doi.org/10.1614/WS-08-103.1
Healy-Fried, M. L., Funke, T., Priestman, M. A., Han, H. & Schönbrunn, E. (2007).
Structural basis of glyphosate tolerance resulting from mutations of Pro101 in Escherichia coli 5-enolpiruvilshikimate-3-phosphate synthase. Journal of Biological Chemistry, 282, 32949-32955. doi: 10.1074/jbc.M705624200
Heap, I. (02, diciembre, 2017). International Survey of Herbicides Resistant Weeds.
Recuperado de www.weedscience.or
115
Heap, I. M. (1997). The Occurrence of Herbicide-Resistant Weeds Worldwide. Pesticide Management Science, 51(3), 235-243. doi: 10.1002/(SICI)1096-9063(199711)51:3<235::AID-PS649>3.0.CO;2-N
Henry, W. B., Shaner, D. L. & West, M. W. (2007). Shikimate accumulation in sunflower,
wheat and proso millet after glyphosate application. Weed Science, 55(1), 1-5. Henry, W. B., Koger, C. H., & Shaner, D. L. (2005). Accumulation of shikimate in corn
and soybean exposed to various rates of glyphosate. Recuperado de http://www.ars.usda.gov/SP2UserFiles/Place/30100000/2005Documents/2005/429%202005%20Henry%20Crop%20Manage.pdf
Herrmann, K. M. & Weaver, L. M. (1999). The shikimate pathway. Annu. Rev. Plant
Physiol. Plant Mol. Biol., 50(1), 473-503. doi: 10.1146/annurev.arplant.50.1.473 Hess, F. D. (1985). Herbicide absorption and translocation and their relationship to plant
tolerance and susceptibility. In S. Duke (Ed.). Weed Physiology. Vol II. Herbicide Physiology, (pp. 191-214). Boca Raton, Florida: CRC Press.
Honfi, A. I., Quarín, C. L. & Valls, J. F. M. (1990). Estudios cariológicos en gramíneas sudamericanas. Darwiniana, 30, 87-94.
Hove-Jensen, B., Zeche, D. & Jochimsem, B. (2014). Utilization of Glyphosate as
Phosphate Source: Biochemistry and Genetics of Bacterial Carbon-Phosphorus Lyase. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 78(1), 176-197.
Howe, A. R., Gasser, C. S., Brown, S. M., Padgette, S. R., Hart, J., Parker, G. B.,…
Armstrong, C. L. (2002). Glyphosate as a selective agent for the production of fertile transgenic maize (Zea mays L.) plants. Mol. Breed., 10, 153–164.
Innan, H. & Kondrashov, F. (2010). The evolution of gene duplications: classifying and
distinguishing between models. Nat Rev Genet., 11(2), 97–108. doi: 10.1038/nrg2689
ITIS (Integrated Taxonomic Information System). (2016). Paspalum paniculatum L. (en
línea). Recuperado de http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=41052.
Jachetta, J. J., Appleby, A. P., & Boersma, L., (1986). Apoplastic and Symplastic
Pathways of Atrazine and Glyphosate Transport in Shoots of Sedlings Sunflower. Plant Physiol. 82, 1000-1007
Jasieniuk, M., Ahmad, R., Sherwood, A., Firestone, J., Perez-Jones, A., Lanini,
T.,…Stednick, Z. (2008). Glyphosate-Resistant Italian Ryegrass (Lolium
116
multiflorum) in California: Distribution, Response to Glyphosate, and Molecular Evidence for an Altered Target Enzyme. Weed Science, 56(4), 496-502. doi: https://doi.org/10.1614/WS-08-020.1
Jasieniuk, M., Brulebabel, A. L., & Morrison, I. N. (1996). The Evolution and Genetics of
Herbicide Resistance in Weeds. Weed Science, 44, 176-193. Jasieniuk, M. (1995). Constraints on the evolution of glyphosate resistance in weeds.
Resistant Pest Manag. Newsletter, 7(2), 31-32. Jaworski, E. G. (1982). Mode of action of N-phosphonomethyl glycine: inhibition of
aromatic amino acid biosynthesis. J. Agric. Food Chem., 20, 176-193. Kahrizi, D., Salmanian, A. H., Afshari, A., Moieni, A. & Mousavi, A. (2007). Simultaneous
substitution of Gly96 to Ala and Ala183 to Thr in 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene of E. coli (k12) and transformation of rapeseed (Brassica napus L.) in order to make tolerance to glyphosate. Plant Cell. Rep., 26, 95–104.
Kaundun, S. S., Dale, R. P., Zelaya, I. A., Dinelli, G., Marotti, I., McIndoe, E. & Cairns, A.
(2011). A novel P106L mutation in EPSPS and an unknown mechanism(s) act additively to confer resistance to glyphosate in a South African Lolium rigidum population. J Agric Food Chem., 59, 3227–3233.
Kaundun, S. S. (2010). An aspartate to glycine change in the carboxyl transferase domain of acetyl CoA carboxylase and non-target-site mechanism(s) confer resistance to ACCase inhibitor herbicides in a Lolium multiflorum population. Pest Manag. Sci., 66, 1249–1256.
Kaundun, S. S., Zelaya, I. A., Dale, R. P., Lycett, A. J., Carter, P., Sharpies, K. R., &
McIndoe, E. (2008). Importance of the P106S target-site mutation in conferring resistance to glyphosate in a goosegrass (Eleusine indica) population from the Philippines. Weed Science, 56, 637-646.
Keen, N. T., Holliday, M. J., & Yoshikawa, M. (1982). Effects of glyphosate on glyceollin production and expression of resistance in Phytophthora megasperma f. sp. glycinea in soybeans. Phytopathology, 72, 1467–1469.
Kirkwood, R. C. (1991). Pathways and mechanisms of absorption of foliage applied
herbicides with particular reference to the role of surfactants. In R. C. Kirkwood (Ed.). Target sites for herbicide action (pp. 219-243). Plenum Press, London.
Kishore, G. M., Padgette, S. R., & Fraley, R. T. (1992). History of herbicide-tolerant
crops, methods of development and current state of the art – emphasis on glyphosate tolerance. Weed Technology, 6, 626–634.
117
Kishore, G. M., & Shah, D. M. (1988). Amino acid biosynthesis inhibitors as herbicides. Annual Review of Biochemistry, 57, 627-663.
Kleier, D. A., & Hsu, F. C. (1996). Phloem mobility of xenobiotics. VII The design of
phloem systemic pesticides. Weed Science, 44, 749-756. Kleinman, Z., & Rubin, B. (19-25, junio, 2016). Expression profile of selected genes in
GR Conyza bonariensis following glyphosate application. In Proceedings 7th International Weed Science Congress, (pp. 476). Prague, Czech Republic.
Kogan, M., & Pérez, A. 2001. Herbicidas; fundamentos fisiológicos y bioquímicos del
modo de acción. Chile, Universidad Católica de Chile, Facultad de Agronomía e Ingeniería Forestal. 307 p.
Koger, C. H. & Reddy, K. N. (2005). Role of absorption and traslocation in the
mechanism of glyphosate resistance in horseweed (Conyza canadensis). Weed Science, 53, 84-89.
Laerke, P. E. (1995). Foliar absorption of some glyphosate formulation and their efficacy
on plants. Pesticide Science, 44, 107-116. Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P. A., McWilliam,
H.,… Higgins, D. G. (2007). Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23, 2947-2948.
Laskowski, R. A., Mac Arthur, M. W., Moss, D. S. & Thornton, J. M. (1993).
PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. J. Appl. Cryst., 26, 283-291.
Leatherbarrow, R. J. (1988). GraFit Version 4.0. Staines, UK: Erithacus Software Ltd. Lebrun, M., Sailland, A., Freyssinet, G. & Degryse, E. (2003). Mutated 5-
enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase, gene coding for said protein and transformed plants containing said gene. Bayer Crop Science S.A. US Patent 6,566,587 (pp. 1-17). Recuperado de http://www.google.com/patents/US6566587
Leon, R. G., Bravo-Hoyos, W., Mulvaney, M. J. & Ferrell, J. A. (19-25, junio, 2016).
Beyond glyphosate resistance: adaptation of Amaranthus palmeri populations to cropping systems. In Proceedings 7th International Weed Science Congress. Prague, Czech Republic.
Lorraine-Colwill, D. F., Powles, S. B., Hawkes, R. M., Hollinshead, P. H., Warner, S. A.
J. & Preston, C. (2003). Investigations into the mechanism of glyphosate resistance in Lolium rigidum. Pest. Biochem. Physiol., 74(1), 62-72.
118
Markets and Markets. (2016). Herbicides Market by Type (Glyphosate, Atrazine, Acetochlor, 2,4-D), by Crop Type (Cereals & Grains, Oilseeds & Pulses, Fruits & Vegetables), by Mode of Action (Selective & Non-Selective) & Geography - Trends and Forecasts to 2019. Recuperado de: http://www.marketsandmarkets.com/Market-Reports/herbicides-357.html
Marshall, G., Kirkwood, R. C., & Martin, D. J. (1987). Studies on the mode of action of
asulam, aminotriazole and glyphosate in Equisetum arvense L. (field horsetail). II. The metabolism of carbon-14 asulam, carbon-14 aminotriazole and carbon-14 glyphosate. Pestic. Sci., 18, 65–78.
Massenssini, A.M., Costa, M. D., Reis, M. R. & Silva, A. A. (2008). Activity of phosphate
solubilising bacterial isolates in the presence of commercial glyphosate formulations. Planta Daninha, 26(4), 815-823.
Michite, P., De Prado, R., Espinoza, N., Ruiz-Santanella, J. P. & Gauvrit, C. (2007).
Mechanisms of resistance to glyphosate in a ryegrass (Lolium multiflorum) biotype from Chile. Weed Science, 55, 435-440.
Molin, W. T., Wright, A. A., Lawton-Rauh, A., Saski, C. A. (2017). The Unique Genomic
Landscape Surrounding the EPSPS Gene in Glyphosate Resistant Amaranthus Palmeri: A Repetitive Path to Resistance. BMC Genomics, 18 (1), 91. DOI: 10.1186/s12864-016-3336-4
Monquero, P. A., Christoffoleti, P. J., Osuna, M. D. & De Prado, R. A. (2004). Absorção,
translocação e metabolismo do glyphosate por plantas tolerantes e suscetíveis a este herbicida. Planta Daninha, 22, 445–451.
Mortensen, D. A., Bastiaans, L. & Sattin, M. (2000). The role of ecology in the
development of weed management systems: an outlook. Weed Research, 40, 49–62.
Mueller, T., Ellis, A., Beeler, J., Sharma, S. & Singh, M. (2008). Shikimate accumulation
in nine weedy species following glyphosate application. Weed Research, 48, 455-460.
Mueller, T. C., Massey, J. H., Hayes, R. M., Main, C. L. & Stewart, N. J. (2003).
Shikimate Accumulates in Both Glyphosate-Sensitive and Glyphosate-Resistant Horseweed (Conyza canadensis L. Cronq.). J. Agric. Food Chem., 51, 680−684.
Nafziger, E. D., Widholm, J. M., Steinrucken, H. C. & Killmer, J. L. (1984). Selection and
characterization of a carrot cell line tolerant to glyphosate. Plant Physiol., 76, 571–574.
119
Nandula, V. K. (2010). Herbicide Resistance: Definitions and Concepts. In V. K. Nandula (Eds). Glyphosate Resistance in Crops and Weeds, History, Development and Management (pp. 35-43). Hoboken, New Jersey: John Wiley and Sons, Inc.
Nandula, V. K., Ray, J. D., Ribeiro, D. N., Pan, Z. & Reddy, K. N. (2013). Glyphosate
resistance in tall waterhemp (Amaranthus tuberculatus) from Mississippi is due to both altered target-site and nontarget-site mechanisms. Weed Sci., 61, 374–383.
Nandula, V. K., Reddy, K. N., Poston, D. H., Rimando, AM., & Duke, S. O. (2008).
Glyphosate tolerance mechanism in Italian ryegrass (Lolium multiflorum) from Mississippi. Weed Sci, 56, 344–349.
Neve, P. (2008). Simulation modeling to understand the evolution and management of
glyphosate resistant in weeds. Pest Management Science, 64, 392-401. Neve, P. & Powles, S. B. (2005). Recurrent selection with suboptimal rates of the
herbicide diclofop-methyl result in a rapid increase in population level resistance in Lolium rigidum. Theor. Appl. Genet., 110, 1154–1166.
Neve, P., Diggle, A. J., Smith, F. P. & Powles, S. B. (2003). Simulating evolution of
glyphosate resistance in Lolium rigidum. I: population biology of a rare resistance trait. Weed Research, 43, 404-417.
Ng, C. H., Wickneswary, R., Salmijah, S., Teng, Y. T. & Ismail, B. S. (2004a).
Glyphosate resistance in Eleusine indica (L.) Gaertn. from different origins and polymerase chain reaction amplification of specific alleles. Aust J Agric Res, 55, 407–414.
Ng, C. H., Ratnam, W., Surif, S. & Ismail, B. S. (2004b). Inheritance of glyphosate
resistance in goosegrass (Eleusine indica). Weed Science, 52, 564-570. Ng, C. H., Wickneswari, R., Salmijah, S., Teng, Y. T. & Ismail, B. S. (2003). Gene
polymorphisms in glyphosate-resistant and –susceptible biotypes of Eleusine indica from Malaysia. Weed Research, 43, 108–115.
Norsworthy, J. K., Jha, P., Steckel, L. E. & Scott, R. C. (2010). Confirmation and control
of glyphosate-resistant giant ragweed (Ambrosia trifida) in Tennessee. Weed Technol, 24(1), 64–70.
Padgette, S. R., Re, D. B., Gasser, C. S., Eichholtz, D. A., Frazier, R. B., Hironaka, C.
M.,… Kishore, G. M. (1991). Site-directed mutagenesis of a conserved region of the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase active site. J. Biol. Chem., 266, 22364–22369.
120
Padgette, S.R., Huynh, Q.K., Aykent, S., Sammons, R.D., Sikorski, J.A. & Kishore, G.M. (1988). Identification of the reactive cysteines of Escherichia coli 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase and their nonessentiality for enzymatic catalysis. J Biol Chem, 263, 1798–1802.
Padgette, S.R., Huynh, Q.K., Borgmeyer, J., Shah, D.M., Brand, L.A., Re, D.B., Bishop,
B.F.,... Kishore, G.M. (1987). Bacterial expression and isolation of Petunia hybrida 5-enol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthase. Arch Biochem Biophys. 258, 564–573.
Patzoldt, W. L., Hager, A. G., McCormick, J. S. & Tranel, P. J. (2006). A codon deletion
confers resistance to herbicides inhibiting protoporphyrinogen oxidase. PNAS, 103(33), 12329-12334. Recuperado de http://www.pnas.org/content/103/33/12329.full.pdf
Pedersen, B. P., Neve, P., Andreasen, C., & Powles, S. B. (2007). Ecological fitness of
a glyphosate resistant Lolium rigidum population: growth and seed production along a competition gradient. Basic. Appl. Ecol., 8, 258–268.
Perez-Jones, A. & Mallory-Smith, C. (2010). Biochemical mechanisms and molecular
basis of evolved glyphosate resistance in weed species. In V. K. Nandula (Ed.), 2010. Glyphosate Resistance in Crops and Weeds: History, Development and Management (pp. 119-148). Hoboken, New Jersey: John Wiley and Sons, Inc.
Perez-Jones, A., Park, K. W., Polge, N., Colquhoun, J. & Mallory-Smith, C. (2007).
Investigating the Mechanisms of Glyphosate Resistance in Lolium multiflorum. Planta, 226, 395-404.
Perez-Jones, A., Park, K. W., Colquhoun, J., Mallory-Smith, C. & Shaner, D. (2005).
Identification of glyphosate-resistant Italian ryegrass (Lolium multiflorum) in Oregon. Weed Science, 53, 775-779.
Perez-Jones, A. & Kogan, M. (2003). Glyphosate-resistant Lolium multiflorum in Chilean orchards. Weed Res, 43(1), 12–19.
Peters, B. & Strek, H. J. (19-25, junio, 2016). The global status of weed resistance and consequences for agricultural practices. In Proceedings 7th International Weed Science Congress. Prague, Czech Republic.
Piccolo, A., Celano, G. & Conte, D. (1996). Adsorption of Glyphosate by Humic Substances. Agric. Food Chem., 44, 2442−2446.
PIER (Pacific Island Ecosystems at Risk). (02, mayo, 2014). Paspalum paniculatum (en línea). Recuperado de: http://www.hear.org/pier/species/paspalum_paniculatum.htm
121
Pipke, R. & Amrhein, N. (1988). Degradation of the phosphonate herbicide glyphosate by Arthrobacter atrocyaneus ATCC 13752. Appl. Environ. Microbiol., 54, 1293-1296.
Pline-Srnic, W. (2006). Physiological mechanisms of glyphosate-resistance. Weed Technol., 20, 290–300.
Pohl, R. (1980). Flora Costaricensis. Family 15 Gramineae. FIELDIANA. New Series Nº 4. Field Museum of Natural History (pp. 608). Iowa, USA.
Pohl, R.W. & Davidse, G. (1971). Chromosome numbers of Costa Rican grasses.
Brtittonia, 23(3) 293-324 Powles, S. B. (september, 2009). Evolution in action: plant resistant to herbicides:
AFPP-XIIIth International Conference on Weed Biology. Dijon, France. Powles, S. B. & Preston, C. (2006). Evolved glyphosate resistance in plants:
biochemical and genetic basis of resistance. Weed Technology, 20, 282-289. Powles, S. B., Lorraine-Colwill, D. F., Dellow, J. J. & Preston, C. (1998). Evolved
resistance to glyphosate in rigid ryegrass (Lolium rigidum) in Australia. Weed Science, 46, 604-607.
Powles, S. B. & Yu, Q. (2010). Evolution in Action: Plants Resistant to Herbicides. Annu.
Rev. Plant Biol., 61, 317-347. Pozzobon, M. T., Valls, J. F. M., Peñaloza, A. P. S. & Santos, S. (s. f.). Further Meiotic
Studies in Brazilian and Paraguayan Germplasm Accessions of Paspalum L. (Gramineae). 27-37. In Avances de Investigación en Recursos Genéticos en el Cono Sur. Recuperado de http://repiica.iica.int/docs/B0515e/B0515e.pdf
Pratley, J., Baines, P., Eberbach, R., Incerti, M., & Broster, J. (1996). Glyphosate
resistance in annual ryegrass. In Proc. 11th Annual Conf. Grasslands Soc. of New South Wales (pp. 126). Wagga Wagga, Australia.
Preston, C., Wakelin, A. M., Dolman, F. C., Bostaman, Y. & Boutsalis, P. (2009). A
decade of glyphosate-resistant Lolium around the world: Mechanisms, genes, fitness and agronomic management. Weed Science, 57, 435-441.
Preston, C. & Wakelin, A. M. (2008). Resistance to glyphosate from altered herbicide
translocation patterns. Pest. Manag. Sci., 64, 372-376. Purrington, C. B. (2000). Costs of Resistance. Current Opinion. Plant Biology, 3, 305-
308.
122
Ramachandran, G. N. & Sasisekharan, V. (1968). Conformation of Polypeptides and
Proteins. Adv. Protein Chem., 23, 283–438. Ramírez, F. & Valverde, B.E. (26-30, junio, 2017). Respuesta de biotipos resistentes a
glifosato de Paspalum paniculatum a los graminicidas fluazifop-p-butilo y haloxifop metilo. In Memorias XIV Congreso Internacional sobre Azúcar y Derivados, XXIII Congreso Latinoamericano de Malezas, III Congreso Iberoamericano de Malezas. (pp 315-317). La Habana, Cuba.
Ramírez, Fernando. (2016). Resistencia al glifosato en biotipos de zacate cabezón
(Paspalum paniculatum L.) de la Región del Caribe de Costa Rica. Uniciencia. 30(2):75-85
Ramírez, F., Berrocal, S. & Bravo, V. (2013). Importación de plaguicidas en Costa Rica:
Periodo 2007-2009. En V. Bravo., E. de la Cruz., A. M. Mora. & L. E. Castillo (Eds.). 15 Años de Academia. (pp. 25). Heredia, Costa Rica: Instituto Regional de Estudios en Sustancias Tóxicas, Universidad Nacional. Serie de Informes Técnicos IRET N° 9.
Ramírez, F., Chaverri, F., de la Cruz, E., Wesseling, C., Castillo, L. & Bravo, V. (2009).
Importación de Plaguicidas en Costa Rica Periodo 1977 – 2006 (pp. 58). In Serie Informes Técnicos. Instituto Regional de Estudios en Sustancias Tóxicas, Universidad Nacional de Costa Rica. N°6.
Raven, J. A. (1975). Transport of indolacetic acid (IAA) in plant cells in relation to pH
and electrical potential gradient, and its significance for polar IAA transport. New Phytol., 74, 163-172.
Reddy, K., Rimando, A., Duke, S. & Nandula, V. (2008). Aminomethylphosphonic Acid
Accumulation in Plant Species Treated with Glyphosate. J. Agric. Food Chem., 56, 2125-2130.
Reddy, K. N., Rimando, A. M. & Duke, S. O. (2004). Aminomethylphosphonic acid, a
metabolite of glyphosate, causes injury in glyphosate-treated, glyphosate-resistant soybean. J Agric Food Chem., 52, 5139–5143.
Research and Markets. (2016). Glyphosate-Global Strategic Business Report 2016.
Recuperado de http://www.researchandmarkets.com/publication/m42zb7t/1946781
Reinhardt, C. F., Vorster, J. J. & Okumu, N. M. (19-25, junio, 2016). Resistance of
Conyza bonariensis to glyphosate: Situation in South Africa. In Proceedings 7th International Weed Science Congress (pp. 80). Prague, Czech Republic.
123
Riar, D., Norsworthy, J., Johnson, D., Scott, R. & Bagavathiannan, M. (2011). Glyphosate resistance in a Johnsongrass (Sorghum halepense) biotype from Arkansas. Weed Science, 59, 299-304.
Rodrigues, B. N., Worsham, A. D. & Corbin, F. T. (1982). Exudation of glyphosate from
wheat (Triticum aestivum) plants and its effects on interplanted corn (Zea mays) and soybeans (Glycine max). Weed Sci., 3, 316-320.
Roso, A. C. & Vidal, R. A. (2010). A modified phosphate-carrier protein theory is
proposed as a non-target site mechanism for glyphosate resistance in weeds. Planta Daninha, 28, 1175-1185.
Roy, D., Koner, S., Banerjee, S., Charles, D., Thompson, D. & Prassad, R. (1989).
Persistence, movement and degradation of glyphosate in selected Canadian boreal forest soils. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 37, 551-559.
Ruchel, Q., Vargas, L., Agostinetto, D. & Silva, B. M. (19-25, junio, 2016). Adaptive
value biotypes of Lolium multiflorum L. susceptible and resistant to herbicide glyphosate. In Proceedings 7th International Weed Science Congress (pp. 598). Prague, Czech Republic.
Salas, R. A., Dayan, F. E., Pan, Z., Watson, S. B., Dickson, J. W., Scott, R. C. & Burgos, N. R. (2012). EPSPS gene amplification in glyphosate-resistant Italian ryegrass (Lolium perenne spp. multiflorum) from Arkansas. Pest. Manag. Sci., 68, 1223–1230.
Salazar, L. & Appleby, Z. (1982). Herbicidal activity of glyphosate in soil. Weed Science, 30, 463-466.
Santadino, M., Coviella, C. & Momo, F. (2014). Glyphosate sublethal effects on the population dynamics of the earthworm Eisenia fetida (Savigny, 1826). Water, Air & Soil Pollution, December 225:2207.doi: 10.1007/s11270-014-2207-3
Santelmann, P. W. (1977). Herbicide Bioassay. In N. D. Truelove (Ed.). Research
Methods in Weed Science (pp. 79-87). Auburn: Southern Weed Science Society. Sammons, R. D. & Gaines, T. (2014). Glyphosate resistance: state of knowledge. Pest.
Manag. Sci., 70(9), 1367–1377.
Sammons, R. D., Meyer, J., Hall, E., Ostrander, E. & Schrader, S. (2014). A Simple Continuous Assay for EPSP Synthase from Plant Tissue. Recuperado de http://www.cottoninc.com/fiber/AgriculturalDisciplines/Weed-Management/Managing-glyphosate-Resistant-Palmer-Amaranth/Research-Programs/Monsanto/11a-Industry-Sammons-NCWSS07-poster.pdf
124
Sammons, R., Heering, D. C., Dinicola, N., Glick, H. & Elmore, G. A. (2007). Sustainability and stewardship of glyphosate and glyphosate-resistant crops. Weed Technology, 21, 347-354.
Satchivi, N. M., Wax, L. M., Stoller, E. W. & Briskin, D. P. (2000). Absorption and translocation of glyphosate isopropylamine and trimethylsulfonium salts in Abutilon theophrasti and Setaria faberi. Weed Science, 48(6), 675-679.
Schonbrunn, E., Eschenburg, S., Shuttleworth, W. A., Schloss, J. V., Amrheim, N.,
Evans, J. N. S. & Kabsch, W. (2001). Interaction of the herbicide glyphosate with its target enzyme 5-enolpyruvyl-shikimate 3-phosphate synthase en atomic detail. PNAS, 98, 1376-1380.
Schrödinger, L. L. C. (2010). The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schuette, J. (1998). Environmental Fate of Glyphosate. Environmental Monitoring &
Pest Management, Department of Pesticide Regulation. Sacramento, California. pp 13.
Seefeldt, S. S., Jensen, J. E. & Fuerst, E. P. (1995). Log-Logistic analysis of herbicide
dose response relationships. Weed Technology, 9 (2), 218-227.
SFE (Servicio Fitosanitario del Estado, CR). (04, mayo, 2015). Centro de Consulta de Insumos. Recuperado de https://www.sfe.go.cr/insumosys/Principal.htm
Shaner, D. L., Lindenmeyerb, R. B. & Ostlie, M. H. (2012). What have the mechanisms
of resistance to glyphosate taught us? Pest. Manag. Sci., 68, 3–9. Shaner, D. L. (2010). Testing methods for glyphosate resistance. In V. K. Nandula (Ed.).
2010. Glyphosate Resistance in Crops and Weeds: History, Development, and Management, (pp. 93-118). Hoboken, New Jersey: John Wiley and Sons, Inc.
Shaner, D. L. (2009). Role of translocation as a mechanism of resistance to glyphosate.
Weed Sci., 57(1), 118-123. Shaner, D. L., Nadler-Hassar, T., Henry, W. B. & Koger, C. H. (2005). A rapid in vivo
shikimate accumulation assay with excised leaf discs. Weed Science, 53, 769-774. Shaner, D. L. & Lyon, J. (1980). Interaction of Glyphosate with Aromatic Amino Acids on
Transpiration in Phaseolus vulgaris. Weed Science, 28(1), 31-35. Sharma, S. D. & Singh, M. (2001). Environmental factors affecting absorption and bio-
efficacy of glyphosate in Florida beggarweed (Desmodium tortuosum). Crop Protection, 20, 511-516.
125
Sharon, A., Amsellem, Z. & Gressel, J. (1992). Glyphosate suppression of an elicited defense response. Plant Physiol, 98, 654–659.
Siehl, D. L. (1997). Inhibitors of EPSP synthase, glutamine synthetase and histidine
synthesis, in Herbicide Activity: Toxicology, Biochemistry and Molecular Biology. In R. M. Roe., J. D. Burton. & R. J. Kuhr (Eds.). IOS Press, Amsterdam, The Netherlands, pp. 37-67.
Simarmata, M., Kaufmann, J. E. & Penner, D. (2003). Potential basis of glyphosate
resistance in California rigid ryegrass (Lolium rigidum). Weed Sci., 51, 678–682. Singh, B. K. & Shaner, D. L. (1998). Rapid determination of glyphosate injury to plants
and identification to glyphosate-resistant plants. Weed Technology, 12, 527-530. Singh, M., Sharma, S. D., Ramirez, A. H. M. & Jhala, A. (2011). Glyphosate efficacy,
absorption, and translocation in selected four weed species common to Florida citrus. Citrus Research and Education Center, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida. p. 7.
Smith, L., Wasshan, D. C. & Klein, R. B. (1982). Gramineas. In R. Reitz (Ed.). Flora
Ilustrada de Santa Catarina, Parte I, Fascículo As Plantas Gramineas (pp. 1060-1064). Herbário Barbosa Rodrigues, Itajaí, Brasil.
Socorro, J. & Fuentes, C. (2005). Resistencia de Parthenium hysterophorus L. al
herbicida glifosato: un nuevo caso de resistencia a herbicidas en Colombia. In 2do Congreso Bianual SODIAF (Sociedad Dominicana de Investigadores Agropecuarios y Forestales), Santo Domingo, República Dominicana, p.9.
Spencer M., Mumm, R. & Gwyn, J. (2000). Glyphosate resistant maize lines. Dekalb
Genetics Corporation: US Patent 6,040,497 (pp. 1-59). Recuperado de http://www.google.com/patents/US6040497
Stallings, W. C., Abdel-Meguid, S. S., Lim, L. W., Shieh, H. S., Dayringer, H. E.,
Leimgruber, N. K.,… Kishore, G. M. (1991). Structure and topological symmetry of the glyphosate target 5-enol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthase: a distinctive protein fold. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 88, 5046-5050.
Steinrucken, H. C. & Amrhein, N. (1980). The herbicide glyphosate is a potent inhibitor
of 5-enolpiruvil-shikimic-acid 3-phpsphate synthase. Biochem. Biophis. Res. Commun., 94, 1207-1212.
Steinrucken, H. C., Schultz, A., Amrhein N., Porter, C. A. & Fraley, R. T. (1986).
Overproduction of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase in glyphosate-tolerant Petunia hybrida cell line. Arch. Biochem. Biophys., 244, 169–178.
126
Sterling, T. M. (1994). Mechanisms of herbicide absorption across plant membranes and
accumulation in plant cells. Weed Sci., 42, 263-276. Strauss, S. Y., Rudgers, J. A., Lau, J. A. & Irwin, R. E. (2002). Direct and ecological
costs of resistance to herbivory. Trends in Ecology and Evolution, 17, 278-285. Suh, H., Hepburn, A. G., Kriz, A. L. & Widholm, J. M. (1983). Structure of the amplified
5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene in glyphosate-resistant carrot cells. Plant Mol. Biol., 22, 195–205.
TaiBIF (Taiwan Biodiversity Information Facility). (11, enero, 2016). Paspalum
paniculatum. Recuperado de http://taibif.tw/zh/namecode/201623
Tani, E., Chachalis, D. & Travlos, I. S. (2015). A glyphosate resistance mechanism in
Conyza canadensis involves synchronization of EPSPS and ABC-transporters genes. Plant Mol. Biol., 33(6), 1721-1730.
Tian, D., Traw, M. B., Chen, J. Q., Kreitman, M. & Bergelson, J. (2003). Fitness costs of
R-gene-mediated resistance in Arabidopsis thaliana. Nature, 423, 74-77. Tran, M., Baerson, S., Brinker, R., Casagrande, L., Faletti, M., Feng, Y., Nemeth, M..….,
Schafer, D. (1999). Characterization of glyphosate resistant Eleusine indica biotypes from Malaysia. Proceedings of the 17th Asian-Pacific Weed Science Society Conference I (B), pp: 527-536.
Tranel, P. J., Riggins, C. W., Bell, M. S. & Hager, A. G. (2011). Herbicide resistances in
Amaranthus tuberculatus: a call for new options. J. Agric. Food. Chem., 59, 5808–5812.
Tranel, P. J. & Wright, T. R. (2002). Resistance of weeds to ALS-inhibiting herbicides:
what have we learned? Weed Science, 50, 700-712. Tuffi Santos, L. D., Santos, J. B., Ferreira, F. A., Oliveira, J. A., Bentivenha, S. &
Machado, A. F. L. (abril/junio, 2008). Exsudacao radicular de glyphosate por Brachiaria decumbens e seus efeitos em plantas de eucalipto. Planta Daninha, 26(2). Recuperado de http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-83582008000200013
USDA (United States Department of Agriculture). (11, enero, 2016). Natural Resources
Conservation Services. Plants Data Base. Paspalum paniculatum L (en línea). United States. Recuperado de http://plants.usda.gov/core/profile?symbol=PAPA11
Valverde, B. E. (2010). Status and management of glyphosate-resistant weeds in Latin
America. In V. K. Nandula (Ed.). 2010. Glyphosate Resistance in Crops and
127
Weeds: History, Development, and Management (pp. 249-280). Hoboken, New Jersey: John Wiley and Sons, Inc.
Valverde, B. & Heap, I.M. (2009). El estado actual de la resistencia a herbicidas en el
mundo. Recuperado de http://www2.inia.cl/medios/biblioteca/serieactas/NR36351.pdf
VanGessel, M. J. (2001). Glyphosate-resistant horseweed from Delaware. Weed
Science, 49, 703-705. Vila-Aiub, M. M., Goh, S. S., Gaines, T. A., Han, H., Busi, R., Yu, Q. & Powles, S. B.
(2014). No fitness cost of glyphosate resistance endowed by massive EPSPS gene amplification in Amaranthus palmeri. Planta, 239(4), 793-801.
Vila-Aiub, M. M., Balbi, M. C., Distéfano, A. J., Fernandez, L., Hopp, E., Yu, Q.& Powles,
S. B. (2012). Glyphosate resistance in perennial Sorghum halepense (Johnsongrass) endowed by reduced glyphosate translocation and leaf uptake. Pest. Manag. Sci., 68, 430–436.
Vila-Aiub, M. M., Neve, P. & Powles, S. (2009). Fitness costs associated with evolved
herbicide resistance alleles in plants. New Phytologist, 184, 751-767. Vila-Aiub, M. M., Balbi, M. C., Gundel, P. E., Ghersa, C. M. & Powles, SB. (2007).
Evolution of glyphosate-resistant Johnson grass (Sorghum halepense) in glyphosate-resistant soybean. Weed Science, 55, 566–571.
Wakelin, A. M. & Preston, C. (2006). A target-site mutation is present in a glyphosate
Lolium rigidum population. Weed Research, 46, 432-440. Wakelin, A. M., Lorraine-Colwill, D. F. & Preston, C. (2004). Glyphosate resistance in
four different populations of Lolium rigidum is associated with reduced translocation of glyphosate to meristematic zones. Weed Research, 44, 453-45.
Warwick, S. I., Xu, R., Sauder, C. & Beckie, H. J. (2008). Acetolactate synthase target-
site mutations and single nucleotide polymorphism genotyping in ALS-resistant Kochia (Kochia scoparia). Weed Science, 56, 797-806.
Warwick, S. I. (1991). Herbicide Resistance in Weedy Plants – Physiology and
Population Biology. Annual Review of Ecology and Systematics, 22, 95-114. Waters, S. (1991). Glyphosate tolerant crops for the future: development, risks, and
benefits. In Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference: Weeds. Farnham, UK, British Crop Protection Council. pp. 165-170.
128
Weaver, L. M. & Herrmann, K. (1997). Dynamics of the shikimate pathway in plants. Trends Plant Sci., 2, 346–351.
Wearth, J. A., Preston, C., Taylor, I. N., Charles, G. W., Roberts, G. N. & Baker, J.
(2008). Managing the risk of glyphosate resistance in Australian glyphosate-resistance cotton production systems. Pest Management Science, 64, 417-421.
Woodburn, A. (2000). Glyphosate production, pricing and use worldwide. Pest Manag.
Sci., 56, 309-312. Wu, C., Tranel, P. J. & Davis, A. S. (19-25, junio, 2016). Evolution of herbicide
resistance: Is there a fitness cost? In Proceedings 7th International Weed Science Congress. Prague, Czech Republic. p. 52.
Xu, J. W., Wei, X. L., Li, X. G., Chen, L., Feng, D. J. & Zhu, Z. (2002). Isolation of rice
EPSP synthase cDNA and its sequence analysis and copy number determination. Acta Bot. Sinica, 44 (2), 188–192.
Yoshida, S., Tazaki, K. & Minamikawa, T. (1975). Occurrence of shikimic and quinic
acids in angiosperms. Phytochemistry 14, 195-197 Yu, Q., Janaludin, A., Han, H., Chen, M., Sammons, D. & Powles, S. B. (2015).
Evolution of a double amino acid substitution in the EPSP synthase in Eleusine indica conferring high level glyphosate resistance. Plant Physiology, 167, 1440–1447.
Zelaya, I. A. & Owen, M. D. K. (2005). Differential response of Amaranthus tuberculatus
to glyphosate. Pest. Manag. Sci., 61(10), 936–950. Zelaya, I. A., Owen, M. D. & VanGessel, M. J. (2004). Inheritance of evolved glyphosate
resistance in Conyza canadensis (L.) Cronq. Theor. Appl. Genet., 110, 58-70. Zhou, M., Xu, H., Wei, X., Ye, Z., Wei, L., Gong, W., Wang, Y. & Zhu, Z. (2006).
Identification of a glyphosate-resistant mutant of rice 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase using a directed evolution strategy. Plant Physiology, 140, 184-195.
Zmienko, A., Samelak, A., Kozlowski, P. & Figlerowicz, M. (2014).Copy number
polymorphism in plant genomes. Theor. Appl. Genet., 127(1), 1-18.
129
9. Anexos
Anexo I: GUIA DE ENTREVISTA. DIAGNÓSTICO DE USO DE PLAGUICIDAS EN CULTIVOS
PERENNES
Cultivo:______________________________
Código de encuesta __________ Punto de ubicación de la finca (GPS) _______________
Fecha ________________ Hora inicio _________________ Hora final _______________
Nombre del encuestador _____________________________
I. Información general
Nombre de encuestado: _________________________________ Número de teléfono: ____________________
2. Puesto:
A. Propietario B. Gerente/ Administrador C. Capataz D. Agrónomo
E. Aplicador F. Otro _______________ G. Alquila ____
3. Provincia: ______________ 4. Cantón: ___________ 5. Distrito: _________________
Nombre de la finca:______________________________ Otras señas: ________________________________________________________________________________
6. Área total de la finca: _________________ (has)
II. Características del cultivo Cultivo:_______________________ Época: _____________
7. Variedad_________________ Área:__________________
8. Densidad de siembra: ______________ (árboles/ha)
9. Duración de ciclo de producción: _________ (meses)
10. Área en producción 1ª cosecha (invierno): ___________ (has) Fechas ciclo:______________________
11. Área en producción 2ª cosecha (verano): ___________ (has) Fechas ciclo:_______________________
12. Área en descanso: ______ (ha)
13. Producción 1ª cosecha: _____________ (kg/ha/año)
14. Producción 2ª cosecha: ____________ (kg/ha/año)
15. Cultivo anterior ____________; cultivo futuro____________. Mezcla cultivos :______.
130
III. Uso de Plaguicidas y Prácticas de Manejo
Nombre del cultivo __________ Área del cultivo______
Uso cronológico en un ciclo de cultivo:
Vivero Nombre plaguicida y formulación
Dosis/ha o dosis/bomba
Litros/ha o bombas/ha
Veces/ciclo Equipo aplicación
Preparación Terreno
Aradas, chapeas, etc
Siembra
Mantenimiento del Cultivo
Cosecha
Post-cosecha(antes de
empacar)
Fumiga las cajas en almacenaje?
Transporte:Fumiga los camiones o contenedores?
131
16. Tiempo entre la última aplicación y cosecha: __________________________________
17. Uso en bordes, rodenticidas, molusquicidas, herbicidas, otros?
18. Compra de plaguicidas: Cuánto compró en el último año o ciclo, de los plaguicidas que usó: (si no respondió bien la parte de uso cronológico)
Plaguicida Kg. o litros Valor Donde lo compra, otro. Observaciones.
19. Utiliza alternativas no químicas para control de plagas?
20. Manejo de Malezas:
A.Coberturas vivas ( ) B. Coberturas muertas ( ) C. Control mecánico ( ) D. Control biológico ( )
E. Control manual ( ) F.Otros ( ) Explique: 21. Ha tenido en este año problemas de control de malezas?
Si es afirmativo, con cuál especie:
Cómo la ha manejado?:
22. Ha variado el manejo de malezas en los últimos años? Explique:
23. Manejo de otras plagas:
Trampas ( ) Plantas nectaríferas ( ) Ferhomonas ( ) Otros: Explique:
24. Otros:
Observaciones_______________________________________________________________________
132
Anexo II. Gradiente y condiciones para la extracción de metabolitos Cuadro A1. Gradiente utilizada para la cromatografía de metabolitos.
tiempo (min) % agua % acetonitrilo
0 90 10
2,5 90 10
2,6 50 50
4,6 50 50
4,7 0 100
5,7 0 100
8 90 10
Cuadro A2. Condiciones MS/MS para los analitos
Nombre del compuesto
ion precursor (m/z)
dwell time (s)
cono (V)
energía colisión (eV)
ion producto (m/z)
Glifosato
392.4 0.08 20 15 170.0 Q
392.4 0.08 20 15 88 q1
392.4 0.08 20 45 60 q3
AMPA 334.1 0.08 20 15 112.1 Q
334.1 0.08 20 10 156 q1
13C2
15N-glifosato 395.4 0.08 20 15 91
Patrón Interno
Q: transición cuantificación q: transición confirmación
Anexo III. Condiciones del experimento para la extracción de EPSPS. Inicialmente se preparan los buffers necesarios para el ensayo de la EPSPS:
Buffer para extracción: 1 litro 100 mM MOPS 20,92 gramos MOPS 5 mM EDTA 10 ml 0,5M EDTA 10% glicerol 100 ml glicerol 50 mM KCl 3,73 gramos KCl 0,5 mM Benzamidina 78 mg Benzamidina
Llevar la solución a un pH de 7,0 a 4o C. Solamente antes de usarse, adicione 1 g de PVPP y 70ul de β-
mercaptoethanol (10 mM) a 100 ml de buffer.
Buffer para diálisis: 1 litro de 10X 100 mM MOPS 20,92 gramos MOPS 5 mM EDTA 10 ml de 0,5 mM EDTA
Llevar la solución a un pH de 7,0 @ 4oC. Diluir 200 ml de 10X, 200 ml de glicerol (10%), y 699 µl de β-
mercaptoethanol (5 mM) para completar 2 litros para la diálisis.
133
Buffer para el ensayo: 100 ml de 2X 100 mM MOPS 2 gramos MOPS 1mM MgCl2 33 µl 3M MgCl2 10% glicerol 10 ml glicerol 2 mM molibdato de sodio 48 mg Na2MoO4 200 mM NaF 840 mg NaF Llevar la solución a un pH de 7,0 @ 25
oC, almacenar @ 4
oC.
Extracción de la EPSPS:
Se adicionaron los siguientes reactivos en una cubeta de 1,5 ml:
600 µl 2X Assay Buffer
300 µl agua ultrapura (libre de fosfatos)
200 µl 1 mM MESG**
10 µl 100 unidades/ml PNP**
25 µl PEP 50 mM
25 µl extract de EPSPS
+/- 10 ul glifosato ** Incluidos en el EnzChek Phosphate Assay kit (Invitrogen E6646).
Preparación 50 mM PEP (Fosfoenovilpiruvato): 10 mg/ml (disuelto en buffer del ensayo); es necesario
prepararlo fresco cada día.
Preparación del 10 mM S3P (Shikimato-3-fosfato): 2,54 mg/ml; vial de 1 mg=394ul (disueltos en el buffer del
ensayo).
Una vez adicionados los reactivos en ese orden, la cubeta se invierte en su posición para permitir una
mezcla de los mismos. Se deja reposar la cubeta por 20 minutos para permitir la reacción y evitar la
contaminación por fosfatos. Luego se lee la absorbancia a 360nm para tener un valor basal antes de iniciar
la reacción de la EPSPS.
En este momento se adicionan 50 µL de S3P 10mM, nuevamente se invierte la cubeta para mezclar y se lee
la absorbancia a 360nm por 10 minutos.
134
Anexo IV.Valores de las DE50 de biotipos de P. paniculatum.
Cuadro A3. Resumen DE50 (referida a daño medio) de glifosato en biotipos R y S de P. paniculatum de dos edades (+/- 95%) a los 15 dda.
Biotipo R o S Edad D C b DE50 (g e.a. ha-1
)
B R I 18,09 ± 2,06 0,86 ± 3,28 1,90 ± 1,57 251,04 ± 105,30
II 20,61 ± 2,40 1,39 ± 3,63 1,66 ± 1,02 258,99 ± 121,95
D R
I 33,48 ± 1,71 1,40 ± 2,90 1,60 ± 0,44 210,23 ± 53,55
II 41,36 ± 1,65 1,46 ± 2,19 3,38 ± 1,19 350,81 ± 35,43
L R I 35,35 ± 1,42 1,42 ± 1,98 3,18 ± 1,18 309,91 ± 33,39
II 62,27 ± 1,79 8,96 ± 3,41 2,20 ± 0,54 387,68 ± 46,47
H S I 34,01 ± 1,92 0,69 ± 2,00 4,65 ± 2,65 38,88 ± 4,90
II 53,11 ± 2,26 5,21 ± 3,76 1,71 ± 0,52 76,46 ± 12,43
C S
I 39,46 ± 1,90 3,08 ± 2,89 2,55 ± 1,15 68,17 ± 10,89
II 38,99 ± 1,42 7,33 ± 2,41 4,27 ± 1,45 131,71 ± 17,04
T S I 16,05 ± 1,83 0,10 ± 2,43 6,04 ± 6,11 62,03 ± 24,21
II 51,39 ± 1,65 3,18 ± 2,22 2,86 ± 0,56 72,76 ± 7,38
Los datos, promedio de bioanálisis, están descritos de acuerdo a la ecuación y= C + D-C/1 + exp[b(log x – log DE50)], donde y corresponde al daño visual a la dosis x de glifosato, C es el límite inferior del daño visual a la dosis más alta, D es el límite superior del daño visual a la dosis cero (testigo) y b es la pendiente de la curva cerca del valor de DE50.
135
Anexo V: Transporte de glifosato en la planta.
Cuadro A4. Cantidad porcentual de glifosato marcado presente en la parte apical de la hoja tratada (parte 1) de la planta a las 24, 48, 72 y 96 hda. Edad I.
Tiempo (hdt)
Biotipos 24 48 72 96
B – R 79,24 ±4,73 - 49,91 ±2,45 -
D - R 73,31 ±3,25 54,96 ±4,26 71,34 ±3,82 52,85 ±4,56
L – R 65,35 ±4,16 60,04 ±2,60 40,10 ±4,79 48,90 ±4,49
Promedio R 71,31 ±2,47 57,50 ±2,5 53,86 ±3,80 50,69 ±3,01
C – S 82,81 ±1,47 49,10 ±6,34 59,62 ±3,56 57,41 ±3,09
H – S 75,53 ±2,55 58,26 ±2,39 44,19 ±5,76 42,51 ±4,24
T - S 69,68 ±3,19 63,58 ±3,94 40,22 ±8,17 59,35 ±3,32
Promedio S 75,52 ±3,32 57,25 ±2,68 48,72 ±3,71 52,88 ±2,46
± error estándar
Cuadro A5. Cantidad porcentual de glifosato marcado presente en la parte apical de la hoja tratada (parte 1) de la planta a las 24, 48 y 72 hda. Edad II.
Tiempo (hdt)
Biotipos 24 48 72
D - R 77,10 ±3,57 55,57 ±7,72 50,33 ±5,71
L -R 72,63 ±1,70 64,80 ±5,15 45,81 ±4,42
Promedio R 74,86 ±2,01 60,18 ±4,63 48,07 ±3,49
C – S 65,24 ±3,02 45,16 ±5,65 43,72 ±9,29
H- S 77,71 ±3,13 57,51 ±2,23 41,84 ±2,92
T - S 71,22 ±2,43 46,05 ±2,58 56,71 ±9,03
Promedio S 62,93 ±2,05 49,57 ±3,90 47,42 ±4,46
± error estándar
Cuadro A6. Cantidad porcentual de glifosato marcado presente en la parte inferior de la hoja tratada (parte 2) en diferentes tiempos de medición. Edad I.
Tiempo (hdt)
Biotipos 24 48 72 96
B - R 8,11 ±3,24 - 3,69 ±1,21 -
D - R 8,20 ±3,10 7,97 ±1,28 6,22 ±3,25 5,45 ±1,70
L - R 4,94 ±1,31 6,46 ±1,32 9,52 ±2,89 3,52 ±0,81
Promedio R 6,88 ±1,47 7,22 ±0,91 7,07 ±1,74 4,48 ±3,94
C - S 3,86 ±0,44 10,65 ±3,20 3,96 ±0,80 3,55 ±0,79
H - S 4,95 ±1,37 2,65 ±0,28 11,43 ±4,69 11,83 ±2,41
T - S 5,29 ±1,24 8,86 ±2,15 6,33 ±1,55 5,09 ±0,71
Promedio S 4,76 ±0,66 7,27 ±1,40 7,08 ±1,65 6,88 ±1,11
± error estándar
136
Cuadro A7. Cantidad porcentual de glifosato marcado presente en la parte inferior de la hoja tratada (parte 2) en diferentes tiempos de medición. Edad II.
Tiempo (hdt)
Biotipos 24 48 72
D - R 15,20 ±2,87 29,47 ±5,35 28,86 ±5,54
L -R 16,71 ±1,86 17,68 ±2,98 35,76 ±3,39
Promedio R 15,95 ±1,63 23,57 ±3,49* 32,31 ±3,27
C - S 27,95 ±2,92 30,45 ±1,72 39,15 ±7,78
H- S 17,22 ±3,20 33,12 ±1,85 39,09 ±1,58
T - S 21,36 ±2,75 31,97 ±2,03 23,48 ±5,32
Promedio S 22,18 ±1,98 31,85 ±1,04 33,91 ±3,55
*diferencias significativas entre medias R y S (p<5%). Cuadro A8. Cantidad porcentual de glifosato marcado presente en la parte superior de la planta (parte 3) a las 24, 48, 72 y 96 hda. Edad I.
Tiempo (hdt)
Biotipos 24 48 72 96
B - R 0,84 ±0,37 - 5,62 ±0,80 -
D - R 0,93 ±0,18 2,59 ±0,44 1,17 ±0,27 3,38 ±0,64
L - R 2,31 ±0,43 3,24 ±0,63 3,07 ±0,33 4,36 ±0,92
Promedio R 1,47 ±0,24 2,91 ±0,38 2,89 ±0,41* 3,92 ±0,54*
C - S 0,69 ±0,18 5,28 ±1,82 3,17 ±0,65 3,38 ±0,45
H - S 2,49 ±1,59 2,74 ±0,29 7,72 ±2,09 9,20 ±1,68
T - S 1,19 ±0,16 1,56 ±0,30 5,55 ±1,62 5,99 ±0,48
Promedio S 1,51 ±0,57 3,12 ±0,63 5,39 ±0,92 6,20 ±0,79
*diferencias significativas entre medias R y S (p<5%). Cuadro A9. Cantidad porcentual de glifosato marcado presente en la parte superior de la planta (parte 3) a las 24, 48 y 72 hda. Edad II.
Tiempo (hdt)
Biotipos 24 48 72
D - R 1,36 ±0,19 2,44 ±0,38 4,99 ±1,06
L -R 2,54 ±1,33 2,33 ±0,72 3,58 ±0,49
Promedio R 1,95 ±0,66 2,39 ±0,39 4,28 ±0,60
C - S 1,13 ±0,14 2,85 ±0,21 3,89 ±1,93
H- S 1,06 ±0,14 2,04 ±0,26 5,89 ±1,10
T - S 0,80 ±0,16 3,40 ±0,33 5,41 ±0,95
Promedio S 1,61 ±0,09 2,77 ±0,21 5,06 ±0,78
137
Cuadro A10. Cantidad porcentual de glifosato marcado presente en el culmo de la planta (parte 4) a las 24, 48, 72 y 96 hda. Edad I.
Tiempo (hdt)
Biotipos 24 48 72 96
B - R 7,31 ±2,14 30,68 ±2,05
D - R 10,98 ±2,29 21,87 ±2,85 10,13 ±0,93 22,98 ±2,64
L - R 20,22 ±2,57 19,77 ±2,05 28,70 ±4,06 29,21 ±3,74
Promedio R 13,94 ±1,76 20,82 ±1,72 22,15 ±2,60 26,88 ±2,41
C - S 8,05 ±0,86 21,30 ±2,06 22,18 ±1,83 25,40 ±1,55
H - S 10,12 ±1,45 24,10 ±1,22 23,15 ±2,79 25,91 ±2,30
T - S 14,75 ±2,46 17,33 ±2,18 29,40 ±4,57 20,70 ±3,21
Promedio S 11,18 ±1,15 20,90 ±1,16 24,98 ±1,98 24,12 ±1,40
Cuadro A11. Cantidad porcentual de glifosato marcado presente en el culmo de la planta (parte 4) a las 24, 48, y 72 hda. Edad II.
Tiempo (hdt)
Biotipos 24 48 72
D - R 2,92 ±0,06 3,05 ±1,65 6,19 ±2,07
L - R 4,31 ±0,69 7,33 ±1,93 5,19 ±0,35
Promedio R 3,62 ±0,40 5,19 ±1,39 5,69 ±1,00
C - S 1,70 ±0,27 9,38 ±3,89 5,11 ±1,76
H- S 1,07 ±0,21 1,99 ±0,26 5,22 ±0,77
T - S 3,80 ±0,76 8,41 ±2,50 5,49 ±1,43
Promedio S 2,19 ±0,40 6,59 ±1,68 5,27 ±0,74
Cuadro A12. Cantidad porcentual de glifosato marcado presente en la raíz de la planta (parte 5) a las 24, 48, 72 y 96 hda. Edad I.
Tiempo (hdt)
Biotipos 24 48 72 96
B - R 4,19 ±0,37 - 9,86 ±1,30 -
D - R 6,53 ±1,10 12,35 ±2,03 11,00 ±0,78 15,20 ±2,06
L - R 7,09 ±1,53 10,14 ±0,99 18,31 ±1,70 13,61 ±1,01
Promedio R 6,28 ±0,76 11,25 ±1,13 13,81 ±1,12 14,33 ±1,07
C - S 4,53 ±0,64 13,48 ±2,09 10,94 ±1,53 9,99 ±1,05
H - S 6,83 ±1,45 12,10 ±1,22 13,10 ±2,79 8,91 ±2,30
T - S 9,02 ±0,80 8,55 ±1,16 17,81 ±1,96 8,63 ±1,46
Promedio S 6,95 ±0,59 11,30 ±0,88 13,98 ±1,13 9,20 ±0,61*
*diferencias significativas entre medias R y S (p<5%).
138
Cuadro A13. Cantidad porcentual de glifosato marcado presente en la raíz de la planta (parte 5) a las 24, 48 y 72 hda. Edad II.
Tiempo (hdt)
Biotipos 24 48 72
D - R 3,38 ±0,71 9,35 ±1,52 9,43 ±3,19
L -R 3,76 ±0,48 7,74 ±0,96 9,49 ±1,55
Promedio R 3,57 ±0,41 8,54 ±0,89 9,46 ±1,67
C - S 3,91 ±0,17 12,02 ±1,47 7,41 ±1,20
H - S 2,90 ±0,31 5,25 ±0,40 7,81 ±1,78
T - S 2,77 ±0,26 10,04 ±1,27 8,78 ±2,08
Promedio S 3,19 ±0,19 9,11 ±0,97 8,00 ±0,94
139
Figura A1. Cromatogramas seleccionados de los biotipos B (1), D (1) y L (1) aplicados.
Biotipo B(1)_2
Time1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00
%
0
100
CROMA_539 MRM of 18 Channels ES+ 392.4 > 170 (GLY )
2.63e3Area
3.57199
CROMA_539 MRM of 18 Channels ES+ 392.4 > 88 (GLY (Q))
7.33e3Area
3.62531
CROMA_539 MRM of 18 Channels ES+ 392.4 > 60 (GLY (q1))
1.32e3Area
3.6298
Biotipo L(1)_2
Time1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00
%
0
100
CROMA_555 MRM of 18 Channels ES+ 392.4 > 170 (GLY )
1.78e3Area
3.57110
CROMA_555 MRM of 18 Channels ES+ 392.4 > 88 (GLY (Q))
3.04e3Area
3.62241
CROMA_555 MRM of 18 Channels ES+ 392.4 > 60 (GLY (q1))
691Area
3.5743
Biotipo D(1)_1
Time1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00
%
0
100
CROMA_543 MRM of 18 Channels ES+ 392.4 > 170 (GLY )
2.72e3Area
3.60136
CROMA_543 MRM of 18 Channels ES+ 392.4 > 88 (GLY (Q))
4.31e3Area
3.57309
CROMA_543 MRM of 18 Channels ES+ 392.4 > 60 (GLY (q1))
1.54e3Area
3.6080
Q
q1
q2
Anexo VI. Cromatogramas de extracción de metabolitos
140
Figura A2. Cromatogramas para los biotipos B (0), D (0) y L (0) no aplicados.
Biotipo B(0)
Time1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00
%
0
100
CROMA_513 MRM of 18 Channels ES+ 392.4 > 170 (GLY )
881
4.42
3.70
3.60
2.070.031.601.14
2.53 2.85
3.83
4.50
4.58
4.99 5.64 6.856.597.63
CROMA_513 MRM of 18 Channels ES+ 392.4 > 88 (GLY (Q))
557
3.57
0.161.27
0.542.411.91 2.97
3.67
3.75
3.85
6.055.594.733.96
4.225.04 6.34 7.03 7.63 7.76
CROMA_513 MRM of 18 Channels ES+ 392.4 > 60 (GLY (q1))
343
3.60
2.740.80
0.49
1.142.15 3.23
3.75
5.20
4.944.68 5.30
7.095.95
7.68 7.84
Biotipo D(0)
Time1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00
%
0
100
CROMA_517 MRM of 18 Channels ES+ 392.4 > 170 (GLY )
591
3.70
3.261.090.67 2.282.04
4.48
3.78
3.86
4.53
4.996.08
5.237.196.26 7.79
7.89
CROMA_517 MRM of 18 Channels ES+ 392.4 > 88 (GLY (Q))
248
3.62
2.922.511.601.04
0.21
5.77
3.80
4.864.48
4.17
4.97
5.98
6.65
6.837.94
CROMA_517 MRM of 18 Channels ES+ 392.4 > 60 (GLY (q1))
194
3.75
3.08
3.001.240.21
2.672.512.02
3.57
3.83
4.92
4.01
4.68
5.674.99
5.41
6.11 7.14
6.787.30
Biotipo L(0)
Time1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00
%
0
100
CROMA_521 MRM of 18 Channels ES+ 392.4 > 170 (GLY )
734
4.45
3.703.59
0.362.10
1.810.49 3.03
4.19
4.60
4.76
4.94
5.535.64 6.54 7.55
CROMA_521 MRM of 18 Channels ES+ 392.4 > 88 (GLY (Q))
312
3.65
0.08
3.052.640.28
0.80 1.66
3.72
3.78
5.904.81
3.83
4.63 4.945.25
6.476.57 7.29
7.84
CROMA_521 MRM of 18 Channels ES+ 392.4 > 60 (GLY (q1))
157
4.71
4.241.60
1.420.912.462.56 3.54
5.12
5.20 7.226.285.59 7.34
7.84
Q
q1
q2
