NU

RA

N A

YSU

L (SE

LE

K)

İSTA

NB

UL

ÜNİV

ER

SİTE

Sİ SAĞ

. BİL

. EN

ST.

D

OK

TOR

A T

EZİ

İST

AN

BU

L-2006

DOKTORA TEZİ

NURAN AYSUL (SELEK)

2006

T.C. İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ

SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

DANIŞMAN PROF. DR. AYŞEN GARGILI

PARAZİTOLOJİ ANABİLİM DALI

İSTANBUL-2006

NURAN AYSUL (SELEK)

İSTANBUL İLİ KÖPEKLERİNDE BULUNAN BABESİA

TÜRLERİNİN TEŞHİSİNDE MİKROSKOBİK VE PCR-RLB

BULGULARININ KARŞILAŞTIRILMASI

DOKTORA TEZİ

ii

TEZ ONAYI

Aşağıda tanıtımı yapılan tez, jüri tarafından başarılı bulunarak Yüksek lisans / Doktora. Tezi olarak kabul edilmiştir.

/ / Prof.Dr.Emine Kökoğlu Enstitü Müdürü

Kurum : İstanbul Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Program Adı : Programın seviyesi: Yüksek Lisans ( ) Doktora (X ) Anabilim Dalı : Parazitoloji ABD Tez Sahibi : Nuran AYSUL (Selek) Tez Başlığı : İstanbul İli Köpeklerinde Bulunan Babesia Türlerinin Teşhisinde

Mikroskobik ve PCR-RLB Bulgularının Karşılaştırılması.

Sınav Yeri : Veteriner Fakültesi Parazitoloji ABD. Sınav Tarihi :

Tez Sınav Jürisi 1."Ünvanı Adı Soyadı" 2."Ünvanı Adı Soyadı" 3."Ünvanı Adı Soyadı" 4."Ünvanı Adı Soyadı" 5."Ünvanı Adı Soyadı"

iii

BEYAN

Bu tez çalışmasının kendi çalışmam olduğunu, tezin planlanmasından yazımına

kadar bütün safhalarda etik dışı davranışımın olmadığını, bu tezdeki bütün bilgileri

akademik ve etik kurallar içinde elde ettiğimi, bu tez çalışmayla elde edilmeyen bütün

bilgi ve yorumlara kaynak gösterdiğimi ve bu kaynakları da kaynaklar listesine

aldığımı, yine bu tezin çalışılması ve yazımı sırasında patent ve telif haklarını ihlal edici

bir davranışımın olmadığı beyan ederim.

NURAN AYSUL (Selek)

iv

İTHAF

Anneme, Babama ve Eşime sevgi ve teşekkürlerimle……

v

TEŞEKKÜR

Doktora eğitimim süresince evinin kapılarını açarak huzurlu bir çalışma ortamı sağladığı, bu tezin her kelimesinde emeği olduğu için, içinden çıkamadığım her sorumu pratik zekası ve sevgisiyle çözdüğü için, en zor anımda, her ‘artık bitti bu tez olmaz’ dediğimde yanımda olduğu için, beni her zaman yüreklendirdiği için, doktora eğitiminin sadece bilimsel çalışma etiğini değil aynı zamanda hayatta karşılaşılan zorluklarla mücadelenin yollarını da öğrettiğini gösterdiği için, öğrenmenin ve bilmenin yarın için en büyük birikim olduğunu öğrettiği için ve hepsinden önemlisi hem gerçek bir abla hem de profesyonel bir hoca olup bana katlandığı için yaşamsal ve bilimsel anlamda bana öğrettikleri için Doktora Danışmanım Prof. Dr. Ayşen GARGILI’ya hocam ve ablam olduğu için teşekkür ederim.

Bu tezin yapılmasında moleküler biyoloji çalışmanın zevkini öğrettiği, bunu uygulama fırsatı verdiği, bilimsel yardımları, imkansızlıklar içinde A.D.Ü Veteriner Fakültesi Parazitoloji A.B.D’da kurduğu Moleküler Biyoloji laboratuarında çalışmama izin verdiği için, paylaşılan başarının önemini öğrettiği için ve dostluğu için sevgili arkadaşım ve II. Tez Danışmanım Doç. Dr. Tülin KARAGENÇ’ e,

Tezimin proje olarak desteklenmesinde ve laboratuar çalışmalarımı yapmamda beni desteklediği için, laboratuar cihaz ve malzemelerini kullanmama izin verdiği için, İstanbul Üniversitesi’nde Doktora yapma ayrıcalığını yaşattığı için Sayın Prof. Dr. Hasan EREN’e

Tez çalışmam süresince bilgi ve tecrübelerini benimle paylaşan laboratuar aşamasını yerinde izleyerek beni onurlandıran Sayın Prof.Dr. Müfit TOPARLAK’a,

Tez izleme komitemde yer alıp, önerileriyle beni yönlendiren Doç.Dr.Mustafa HASÖKSÜZ’e,

Tez çalışmalarım sırasında sıklıkla yapmak zorunda kaldığım şehirlerarası yolculuklarda, izin taleplerimde bana destek olan, iyi niyeti, anlayışlılığı ve alçakgönüllülüğü ile her zaman işlerimi kolaylaştıran İ.Ü. Veteriner Fakültesi Dekanı Sayın Prof.Dr. Muammer Uğur’a,

Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji A.B.D laboratuarlarında çalışma fırsatı verdiği ve bana güvendiği için Sayın Prof.Dr.Kemal ALTAŞ’a,

Değişen ve gelişen dünyayı bir yerinden yakalamam için beni yönlendiren ve moleküler parazitoloji konusunda çalışmam için yüreklendiren Sayın Prof.Dr. Erkut TÜZER’e,

Tezimin istatiksel analizlerinin yapılmasındaki yardımları için Prof. Dr. Halil GÜNEŞ’e,

Tez çalışmalarım süresince rutin laboratuar işlerimdeki yardımları için Dr. Handan ÇETİNKAYA’ya, saha çalışmalarım sırasındaki yardımları için Doç. Dr. Cem VURUŞANER’e ve İ.Ü. Veteriner Fakültesi Parazitoloji A.B.D öğretim elemanlarına,

Materyal topladığım barınaklarda görevli meslektaşlarıma,

Laboratuar çalışmalarımda ve bu tezin oluşmasında verdikleri destek için ADÜ Veteriner Fakültesi Parazitoloji A.B.D elemanları, sevgili arkadaşlarım Serkan BAKIRCI, Murat HOŞGÖR, Hüseyin Bilgin BİLGİÇ, Gülcan KIRLI ve Hakkı ÜNLÜ’ye,

İstanbul’daki Doktora eğitimim boyunca beni evinde ağırlayan, kendi çocuklarından ayırmayarak beni koşulsuz ve karşılıksız seven çok özel insan ve en iyi arkadaşım, kızkardeşim Şule ERGEN’e,

Tez çalışmam süresince fedakarlık yapıp benimle çalışan, ümit ve cesaretiyle beni yüreklendiren sevgili eşim Tbp.Yzb. Dr.Cüneyt AYSUL’a teşekkür ederim.

Bu çalışma Adnan Menderes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından VTF-05016 no’lu proje olarak desteklenmiştir

vi

İÇİNDEKİLER

TEZ ONAYI .................................................................................................................... İİ

BEYAN...........................................................................................................................İİİ

İTHAF............................................................................................................................ İV

TEŞEKKÜR.....................................................................................................................V

İÇİNDEKİLER .............................................................................................................. Vİ

TABLOLAR LİSTESİ................................................................................................... İX

ŞEKİLLER LİSTESİ .......................................................................................................X

SEMBOLLER / KISALTMALAR LİSTESİ ................................................................ Xİ

ÖZET ............................................................................................................................ Xİİ

ABSTRACT.................................................................................................................Xİİİ

1.GİRİŞ VE AMAÇ..........................................................................................................1

2.GENEL BİLGİLER .......................................................................................................4

2.1.Tanım ........................................................................................................................4

2.2.Etyoloji......................................................................................................................4

2.3.Sınıflandırma.............................................................................................................7

2.4.Morfoloji ...................................................................................................................7

2.5.Tarihçe ......................................................................................................................8

2.6.Yaşam Çemberi.........................................................................................................9

2.7.Epizootiyoloj:..........................................................................................................12

2.8.Klinik ve Laboratuar Bulguları ...............................................................................13

2.9.Patogenez ................................................................................................................16

2.9.1.Köpek Babesiosisinin Komplikasyonları...........................................................17

2.9.1.1.Cerebral Babesiosis.......................................................................................17

2.9.1.2.Pıhtılaşma Bozuklukları ................................................................................17

2.9.1.3.Sarılık ve Karaciğer bozuklukları .................................................................18

2.9.1.4.Bağışıklığa bağlı Hemolitik Anemi (IMHA) ................................................18

2.9.1.5.Perakut Babesiosis ........................................................................................18

2.9.1.6.Pulmoner Ödem ............................................................................................18

2.9.1.7.Hemokonsantrasyon (Kırmızı Safra) ............................................................18

2.9.1.8.Şok.................................................................................................................19

vii

2.9.1.9.Organ Yetmezlikleri......................................................................................19

2.10.Bağışıklık ..............................................................................................................19

2.11.Tanı .......................................................................................................................20

2.11.1.Mikroskobik Tanı.............................................................................................21

2.11.2.Serolojik Testler...............................................................................................22

2.11.3.Moleküler Tanı Yöntemleri .............................................................................23

2.11.3.1.Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)...........................................................23

2.11.3.2.Hydroethidine-Flow Cytometry (HE-FC)...................................................24

2.11.3.3.PCR-RFLP ..................................................................................................24

2.11.3.4.RLB.............................................................................................................24

2.12.Tedavi ...................................................................................................................28

2.13.Korunma ...............................................................................................................29

3.GEREÇ VE YÖNTEM................................................................................................30

3.1.Saha Çalışması ........................................................................................................30

3.2.Laboratuar Çalışmaları............................................................................................31

3.2.1.Mikroskobik inceleme........................................................................................31

3.2.2.Kan örneklerinin PCR-RLB için hazırlanması ve saklanması...........................31

3.2.3.DNA Ekstraksiyonu ...........................................................................................31

3.2.4.PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu)..................................................................32

3.2.5.PCR Ürünlerinin Görüntülenmesi......................................................................34

3.2.6.Reverse Line Blot Hibridizasyonu:....................................................................35

3.2.6.1.Membranın Hazırlanması ve Sentetik Oligonükleotidlerin Membrana Bağlanması:...............................................................................................................35

3.2.6.2.PCR Ürünlerinin Membrandaki Oligonükleotidlerle Hibridizasyonu: .........36

3.3. Gereç ve Yöntemde kullanılan malzemelerin listesi .............................................39

3.4. İstatistik Analiz ......................................................................................................43

4.BULGULAR................................................................................................................44

4.1.Mikroskobik Bulgular:............................................................................................44

4.2.Theileria / Babesia cinsleri PCR bulguları .............................................................45

4.3.Reverse Line Blot hibridizasyonunundan elde edilen bulgular ..............................47

4.3.1.Laboratuvarda hazırlanan membranın sonucu ...................................................47

4.3.2.TBD-RLB Kit hazır membranından elde edilen sonuçlar: ................................49

5.TARTIŞMA .................................................................................................................53

viii

KAYNAKLAR ...............................................................................................................58

ETİK KURUL KARARI ................................................................................................70

ÖZGEÇMİŞ ....................................................................................................................71

ix

TABLOLAR LİSTESİ

Tablo 3-1. ………………………………………………………………………30

Tablo 3-2. ………………………………………………………………………34

Tablo 3-3. ………………………………………………………………………36

Tablo 3-4. ………………………………………………………………………37

Tablo 4-1………………………………………………………………………..44

Tablo 4-2. ………………………………………………………………………45

Tablo 4-3. ………………………………………………………………………47

Tablo 4-4. ………………………………………………………………………50

Tablo 4-5. ………………………………………………………………………51

Tablo 4-6. ………………………………………………………………………51

x

ŞEKİLLER LİSTESİ

Şekil 2-1. ……………………………………………………………………… ..6

Şekil 2-2. ……………………………………………………………………….11

Şekil 2-6………………………………………………………………………...25

Şekil 2-7………………………………………………………………………...26

Şekil 2-8………………………………………………………………………...27

Şekil 3-3. ……………………………………………………………………….35

Şekil 3-4. ………………………………………….............................................38

Şekil 3-5. ……………………………………………………………………….39

Şekil 4-1. ……………………………………………………………………….45

Şekil 4-2………………………………………………………………………...46

Şekil 4-3. …………………………………………………………….…………46

Şekil 4-4A. ……………………………………………………………………..48

Şekil 4-4B. ……………………………………………………………………..48

Şekil 4-5. ……………………………………………………………………….49

xi

SEMBOLLER / KISALTMALAR LİSTESİ

ALT : Alaninamino Transferaz

ARF : Akut Renal Failure

DIC : Dissemine Intravascular Koagulapathie

DNA : Deoksiribonucleic Acid

dNTP : Deoksinucleotidtrifosphat

ECL : Chemileluminecent, Detection Agent.

ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay

HE-FC: Hydroethidine-Flow Cytometry

IFAT : Indirect Floresan Antibody Test

IMHA : Immun Mediated Hemolitic Anemia

ITS : Internal Transcribed Spacers

PCR : Polymerase Chain Reaction

rDNA : Ribozomal Deoksiribonucleic Acid

RNA : Ribonucleic Acid

RLB : Reverse Line Blotting

RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism

SDS : Sodium Dodecyl Sulphate

SPA : Soluble Parasite Antigen

SSPE : Standard Sodiumfosfat EDTA

ssrRNA: Small Subunit Ribosomal RNA

TAE : Tris-acetate\EDTA

UV : Ultraviolet

xii

ÖZET

Aysul N. İstanbul İli Köpeklerinde Bulunan Babesia Türlerinin Teşhisinde

Mikroskobik ve PCR-RLB Bulgularının Karşılaştırılması. İstanbul Üniversitesi Sağlık

Bilimleri Enstitüsü, Parasitoloji ABD. Doktora Tezi. İstanbul. 2006.

Bu çalışma, İstanbul İli köpeklerinde bulunan Babesia etkenlerinin tür ve alt

türlerinin tespit edilmesi amacıyla yapılmıştır. Bu amaçla 11 farklı barınaktaki ve

Veteriner Fakültesi Kliniklerine getirilen toplam 493 köpekten, Aralık 2004-Haziran

2005 tarihleri arasında kan örnekleri toplandı. Örnekler mikroskobik bakı ve PCR-RLB

yöntemleri ile incelendi.

Mikroskobik inceleme amacıyla her bir hayvandan sürme preparatlar hazırlandı,

Giemsa yöntemi ile boyandı ve x1000 büyütmede incelendi. Mikroskobik inceleme

sonucu 493 örnekten 2 (% 0,4)’ si pozitif bulundu. PCR-RLB yöntemi için kan

örneklerinden DNA izolasyonu yapıldı ve Theileria ve Babesia cinslerinde spesifik olan

bir bölgeyi çoğaltan primerler ile PCR yapıldı. Bu aşama sonucunda 493 örnekten 11

(% 2,2) tanesi pozitif bulundu. RLB aşamasında iki farklı membran kullanıldı. İlk

membran Babesia canis canis, Babesia canis vogeli, Babesia canis rossi ve Babesia

gibsoni spesifik oligonükleotidleri kullanılarak Adnan Menderes Üniversitesi Veteriner

Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı laboratuarında hazırlandı. Hazırlanan membranla

493 örneğin PCR ürünleri hibridize edildi ve 19 adet (% 3,9) pozitif örnek saptandı.

İkinci olarak, hazır blotlu olan ve ek olarak B.equi olgonükleotidi olan ticari membran

hibridizasyon için kullanıldı ve örnekler tekrar konfirme edildi. Her iki membranla da

yapılan RLB sonucunda 19 adet (% 3,9) pozitif örnek saptandı ve etkenlerin B.canis

vogeli olduğu saptandı. Ek olarak, PCR sonucuna göre negatif olan 8 örnek de RLB ile

pozitif bulundu etkenlerin B. canis vogeli olduğu saptandı.

Sonuç olarak, İstanbul’da kan örneği alınan 493 köpekte % 3,9 oranında B. canis

bulunduğu, alt türünün B. canis vogeli olduğu bulundu. İstanbul’da ilk kez köpeklerde

Babesia taraması yapıldı. Mikroskobik bakı, PCR ve RLB yöntemleri içinde ise

RLB’nin en duyarlı yöntem olduğu saptandı.

Anahtar Kelimeler : Babesia, Köpek, İstanbul, PCR, RLB

Bu çalışma Adnan Menderes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından VTF-05016 no’lu proje olarak desteklenmiştir.

xiii

ABSTRACT

Aysul N. Comparison of microscobic and PCR-RLB findings in detection of

Babesia species of dogs in Istanbul. Istanbul University, Institute of Health Science,

Parasitology Department. PhD Thesis. Istanbul. 2006.

This study was carried out to detect Babesia species and subspecies in Istanbul

dogs. For this aim, a total of 493 blood samples were collected between December

2004-June 2005 from 11 dog shelters and Clinics of Veterinary Faculty. Blood samples

were examined microscopically and with PCR-RLB (Polimerase Chain Reaction,

Reverse Line Blot) assays. For microscobic evaluation thin blood slides prepared from

each dog, stained with Giemsa and examined with x1000 magnification. Two out of the

493 (0.4 %) samples were found to be positive in microscobic evaluation. For PCR-

RLB assay, DNA was extracted from individual samples and initially PCR performed

with the Theileria/Babesia specific primers. According the results of this step, 11

(2.2 %) samples were found to be positive out of 493 samples. For the evaluation of the

samples with RLB, 2 different membranes were used. First membrane was prepared in

Adnan Menderes University Veterinary Faculty Department of Parasitology laboratory

and blotted with Babesia canis canis, Babesia canis vogeli, Babesia canis rossi and

Babesia gibsoni specific oligonucleotides. As a result of hibridization of this membrane

with the PCR products of 493 samples, 19 (3.8 %) of them were found to be positive.

Secondly a commercial membrane, which has already been blotted and have additional

B.equi oligonucleotide, was used for the hybridization and the samples were confirmed.

According to the results of both RLB, 19 (3.8 %) of them were found to be positive for

B.canis vogeli subspecies. Additionally, 8 samples which have been detected as

negative according to the PCR results were found to infected with B.canis vogeli.

Consequently, in this study, Babesia species were screened in İstanbul dogs, out

of 493 samples collected from dogs 19 (3.8 %) were infected with B.canis vogeli.

Among the Microscobic, PCR, RLB techniques RLB was found to be the most

sensitive.

Key Words: Babesia, Dog, Istanbul, PCR, RLB

This study was supported by The Research Support Unit of Adnan Menderes University as the project no VTF-05016.

1. GİRİŞ VE AMAÇ

Evcil hayvanlar içinde insanla ilişkisi en yakın canlılar olan köpeklerin kan

parazitleri, bu hayvanların önemli protozoonlarındandır. Babesia cinsinde bulunan

parazitler, Apikompleksa şubesinde yer ve İxodidae ailesine bağlı keneler tarafından

nakledilirler. Bu cinse bağlı bilinen 100’den fazla Babesia türü vardır. Bunlardan

Babesia canis (büyük Babesia) ve Babesia gibsoni (küçük Babesia) köpeklerde

enfeksiyon oluşturmaktadır (63). Babesia canis’in, B. canis canis, B. canis rossi ve

B. canis vogeli olmak üzere üç alt türü bulunmaktadır (90, 109). Köpeklerde

babesiosisin özellikle tropik, subtropik ve ılıman iklim kuşağında yer alan bölgelerde

yaygın olduğu bilinmektedir. Yapılan literatür taramalarında (40, 45, 57, 87, 110)

Türkiye’de köpeklerde babesiosisin bulunduğu saptanmış, ancak yaygınlığı ile ilgili

kapsamlı bir çalışma bilinmemektedir. Fakat vektörlüğünü yapan kenelerin (özellikle

Rhipicephalus sanguineus) Türkiye’de yaygın olarak bulunması (80), ülkemiz

köpeklerinde babesiosisin özellikle kenelerle karşılaşma riski daha yüksek olan kırsal

alanlarda ve kontrolsüz, sahipsiz köpeklerde yaygın olabileceğini düşündürmektedir.

İstanbul İlinde de babesiosisin köpeklerde yaygınlığı konusunda herhangi bir çalışmaya

rastlanmamıştır.

Babesiosis köpeklerde ateş, hemolitik anemi, hemoglobinuri, trombositopeni,

ikterus ve organlarda fonksiyon bozuklukları ile seyreder (7, 70, 92). Ancak çoğu

zaman kliniklere anemi, ateş ve ikterus belirtileri ile getirilen köpeklerde babesiosis

etkenlerinin kan frotilerinde görülme oranının düşük olması nedeniyle hastaya tanı

koymak mümkün olmamaktadır (3). Köpeklerde farklı Babesia türlerinin oluşturduğu

enfeksiyonların şiddeti, prognozu ve antibabesial ilaçlara verilen cevapların farklı

olmasından dolayı türlerin ve alt türlerinin identifikasyonu önemlidir (9, 74). Alt

türlerin tespit edilmesi gelecekte köpek babesiosisine karşı yapılacak aşı çalışmalarının

geliştirilmesi için de önem arz etmektedir ( 21, 100).

Köpeklerde babesiosisin mikroskobik tanısı, etkenlerin kan frotilerinde görülme

oranının az olması nedeniyle duyarlılığı düşük bir yöntemdir (3). Serolojik tanıda ise

etkenlerin çapraz reaksiyon vermesi ya da yanlış negatif ve pozitif sonuçların alınması

olasılığından dolayı, serolojik yöntemin duyarlılık ve özgünlüğüne göre sonuçlar farklı

2

olabilmektedir (35, 115). Son yıllarda dünyada köpeklerde babesiosis ile ilgili yapılan

çalışmalarda, parazitin DNA’sını bulmayı hedefleyen moleküler tekniklerin kullanımı

artmaktadır (10, 74). Böylece mikroskobik tanıda gözden kaçan olgular ve serolojik

yöntemlerdeki karışıklıkların önüne geçilebilmektedir. Bu amaçla en yaygın kullanılan

tanı yöntemi Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) dur. Ancak miks enfeksiyonlarda, her

etkenin DNA’sı için spesifik primerlerle tekrarlı deneyler yapmak gerekmektedir (41 ).

Bilinen klasik PCR yöntemlerinden sonra araştırıcılar özellikle kene kökenli

hastalıkların hepsini birden aynı anda tespit etmeye yönelmişlerdir (31). Keneler, diğer

artropod vektörler ile kıyaslandığında hastalık etkenlerinin naklinde önemli bir yer

tutmakta ve vektörlüğünü yaptıkları hastalıklar çok geniş bir yelpaze oluşturmaktadır.

Kene kökenli protozoal hastalıklar (babesiosis ve theileriosis) dünya üzerindeki evcil

hayvanlar, insanlar ve diğer yabani hayvanları etkilemektedir. PCR uygulamaları

sayesinde kene kökenli birçok patojenin tespiti yapılabilmesine karşın, birden fazla

patojenin aynı kene tarafından nakledilebilmesi ve bu etkenlerin de aynı anda tek bir

konakta bulunması, hastalık oluşturan tüm bu protozoal etkenlerinin aynı anda teşhisini

ve ayrımını yapabilen yeni ve üniversal bir teste ihtiyaç doğurmuştur. Reverse Line

Blotting (RLB) çok sayıda örneği eş zamanlı olarak birçok oligonükleotid kullanarak

tespit edebilmektedir. RLB ile, farklı türler (Theileria/Babesia sp.’lerin) eş zamanlı

olarak PCR ile amplifiye edilir ve daha sonra da her bir tür için spesifik

oligonükleotidler kullanılarak line-blotterda ayırt edilirler. Bu sebeple RLB, PCR ile

amplifikasyonu takip eden hibridizasyon basamağından oluşmakta ve PCR’ın tek başına

kullanılmasından elde edilen sonuçlarla karşılaştırıldığında 1000 kat daha fazla

sensitiviteye sahiptir. Diğer yandan sonuçların görüntülenmesi için radyoaktif maddeler

yerine kemilüminesans kullanılması da testi yapan insanlar için herhangi bir zararlı etki

oluşturmadığından bu yöntemi daha cazip hale getirmektedir. Aynı zamanda

oligonükleotidleri içeren blotun en az 20 kez tekrar kullanılabilir olması da

kullanıcılarına ekonomik olarak katkıda bulunmaktadır (41, 43).

RLB, ilk defa Streptococci serotiplerinin identifikasyonu için 1994 yılında

Kaufhold ve ark. (55) tarafından uygulanmıştır. RLB ile kenelerle nakledilen Borrelia

spiroketlerinin tanısı ve identifikasyonu ise Rijpkema ve ark. (95) tarafından 1995

yılında yapılmıştır. Bu metot, sığırlarda bilinen bütün Theileria ve Babesia türlerinin

tespiti ve identifikasyonunda, Gubbels ve ark. (43) tarafından 1999 yılında başarılı bir

3

şekilde uygulanmıştır. Daha sonraki yıllarda Ehrlichia/Anaplasma ve Theileria/Babesia

cinsine bağlı 36 adet türün tespit ve ayırımını yapabilen kitler geliştirilmiştir. Georges

ve ark. (41) 2001 yılında aynı anda çok sayıda kan parazitinin sığır kanında varlığını

göstermek amacıyla RLB tekniğini kullanmışlardır.

Theileria/Babesia soyuna bağlı “catchall” PCR aşamasında pozitif olup, tür ve

alt türlere ait spesifik oligolarla hibridize olmayan etkenlerin analizleri ile yeni bir tür ya

da aynı türe ait farklı bir alt türün tespiti açısından öneme sahiptir (43).

RLB, pek çok laboratuarda tanı ve epidemiyolojik çalışmalarda kullanılan

standart bir test halini almıştır. Centeno-Lima ve ark. (21), RLB ile insandaki bir

Babesia divergens vakasınının tespitini yapmış, Nijhof ve ark. (85) RLB ile farklı

Theileria ve Babesia türlerini bulmuştur.

RLB’nin köpeklerde Babesia canis’in alt türlerini ayırt etmede kullanılması ise

ilk kez Matjila ve ark. (75) tarafından 2004 yılında olmuştur.

Bu çalışma ile İstanbul ili köpeklerinde Babesia cinsine ait parazitlerin

varlığının saptanması, tür ve alt türlerinin ayırt edilerek enfekte köpeklerde yayılışının

ortaya konması amaçlanmıştır. Ayrıca çalışmada mikroskobik tanı ile PCR-RLB

testinin hastalığın teşhisindeki duyarlılıkları karşılaştırılacak ve halen dünyada

tartışmaları devam eden (24, 118) köpeklerde diğer küçük piroplazmların (B. equi ve

T. annae) varlığı RLB yönteminin sağladığı avantajla araştırılacaktır.

4

2. GENEL BİLGİLER

2.1.Tanım

Babesiosis, etkeni Babesia cinsindeki protozoonlar olan, evcil ve yabani

omurgalı hayvanlarda görülen, yüksek ateş, intravasküler hemoliz, anemi,

hemoglobinuri ve hemoglobinemi ile karakterize protozoal bir hastalıktır. Bulaşmasında

İxodidae ailesine bağlı keneler rol oynar (12). Köpeklerde babesiosis, Babesia cinsine

ait kan prootozoonlarının neden olduğu kenelerle bulaşan bir hastalıktır (15).

Vektörlerinin yayılışına bağlı olarak tüm dünyada yaygın olarak görülmektedir (92).

Evcil ve yabani köpekgillerde de Babesia cinsine ait türler, bu hayvanların önemli kan

protozoonlarıdır (52).

2.2.Etyoloji

Babesia cinsindeki protozoonlar Apikompleksa şubesinde bulunur. Omurgalı

konaklarında eritrositlerin içine yerleşirler. Morfolojik yapıları ve büyüklükleri diğer

kan parazitlerinden ayrımlarını kolaylaştırır (63). Evcil ve yabani hayvanlarda bilinen

100’den fazla Babesia türünden, B. canis ve B. gibsoni köpeklerde enfeksiyon

oluşturmaktadır (11, 50, 90). Bazı yazarlar B. canis vogeli’yi B. vogeli olarak

köpeklerde babesiosis’e neden olan üçüncü bir tür olarak ele almışlardır (102). Babesia

türleri ışık mikroskobunda görülen yapılarının büyüklüğüne göre sınıflandırılırlar.

Büyüklüğü 1,0µm ile 2,5µm arasında olanlar küçük Babesia’lar, 2,5 µm ile 5,0 µm

arasında olanlar ise büyük Babesia’lar olarak isimlendirilirler (17, 62). Buna göre,

mikroskopta eritrosit içinde görülen 3,0 µm-5,0 µm büyüklüğündeki piroplasmlar son

yıllara kadar B. canis tanısı için yeterli görülmüştür (10). Ancak B. canis’in morfolojik

yapıları aynı olmasına rağmen coğrafik, patojenite, antijenik ve vektör farklılıkları

B. canis canis, B. canis vogeli ve B. canis rossi olmak üzere üç alt türünün olduğunu

göstermiştir (70, 108, 109). Daha sonra moleküler düzeyde yapılan çalışmalar (17, 19,

25, 117), B. canis’in genetik olarak farklı üç alt türü olduğunu göstermiştir.

Patojenitelerinin de farklı olmasının ötesinde B. canis canis ve B. canis rossi’nin in vivo

ve in vitro şartlarda da farklı davrandıkları görülmüştür (101, 109). Yakın zamanda

yapılan bir çalışmada, bir köpekte yeni bir büyük Babesia etkeni bulunmuştur. Bu tür

hem mikroskopta büyük Babesia etkenlerine benzemekte hem de genotip olarak büyük

Babesia’lar grubunda yer almaktadır. Bu veriden sonra araştırmacılar yeni bir

5

sınıflandırma gereğini ortaya atmışlardır (şekil 2-1) (10). Moleküler biyolojideki

ilerlemeler özellikle PCR ile morfolojik olarak ayrımları yapılamayan parazitlerin

genetik olarak ayrılabileceğini göstermiştir. Örneğin yapılan morfolojik ve filogenetik

çalışmalar (59, 60, 117) B. gibsoni’nin köpeklerin tek küçük piroplasmı olmadığını

ortaya koymuştur. Bu çalışmaların sonunda köpeklerin küçük piroplasmlarının da

yeniden sınıflandırılması gereği ortaya çıkmıştır. Sonuç olarak, Asya, İspanya ve

ABD-Kaliforniya eyaleti orijinli köpeklerden elde edilen küçük piroplasmlar ile yapılan

moleküler filogenetik analizlerde (9, 59, 83, 117) küçük Babesia türlerinin genetik

olarak en az üç farklı formunun olduğu, bunların ise üç farklı taksonomik grup içinde

yer aldığı tespit edilmiştir (Şekil 2-1). Bunlar içinde B. gibsoni’nin Asya genotipi ve

ABD-Kaliforniya genotipi Kuzey Amerika’da tespit edilmiştir. Küçük Babesia’lardan

biri de Avrupa’da ilk olarak rapor edilen ve Theileria annae olarak isimlendirilen

İspanya isolatıdır (9, 18, 117). İspanya ve Kaliforniya’da bulunan küçük piroplasmların

epidemiyolojik ve klinik bulgularının farklı olmasından dolayı bu parazitlerden

Kaliforniya’da bulunan tür B. conradae olarak isimlendirilmiştir (58, 59). Ayrıca

İspanya’da bir köpekte B. equi bulunmuştur (25) ancak; bu bulgunun laboratuardaki bir

kontaminasyondan kaynaklanmış olabileceği yazarlar tarafından da ifade edildiği için

varlığı tartışmalıdır.

6

Şekil 2-1: Moleküler filogenetik analiz sonuçlarına göre köpek piroplasmlarının, Theileria/Babesia cinslerindeki sınıflandırılması (10).

7

2.3.Sınıflandırma

Babesia cinsindeki parazitler günümüzde geçerli olan sınıflandırma şekliyle

Apikompleksa şubesinde yer almaktadır (61, 96, 102).

Alem: Animalia

Alt Alem: Protozoa

Şube: Apicomplexa

Sınıf: Sporozoa

Sınıf Altı: Piroplasmia

Takım: Piroplasmida

Aile: Babesiidae

Cins: Babesia

Tür: Babesia canis

Alt Tür: B.c.canis, B.c.vogeli, B.c.rossi

Tür: Babesia gibsoni

2.4.Morfoloji

Babesia cinsindeki protozoonlar büyük babesialar ve küçük babesialar olmak

üzere iki gruba ayrılmaktadır. Köpekleri enfekte eden babesialardan B. canis 4-5 µm

büyüklüğünde olup, büyük grup içerisinde yer alır (62, 63). Sitoplazması vakuollüdür,

tekli piriform (armut şekli) veya merozoitlerin ikiye bölünmesiyle oluşan, 4-5 µm

büyüklüğündeki ikili piriformları veya 2-4 µm büyüklüğündeki ameboid formları vardır

(17, 64, 75). İkili armut formunda parazitler arasında açı vardır. Ameboid formları veya

yüzük formları da görülebilir. Bir eritrosit içerisinde on altı kadar B. canis’e

rastlanabilir (17, 92). Babesia gibsoni ise 1,0 ile 2,5 µm büyüklüğünde olup küçük

Babesia’lardandır. Pleomorfik yapıda, trofozoitleri halka, oval, yüzük formlarda

görülebilir. Parazitin uzun formları da vardır. Bunlar bazen eritrositi baştan sona kuşatır

görüntüdedir (100). Ayrıca B. gibsoni’ de malta haçı formu görülür (60). Babesia

gibsoni’nin ikili armut formu görülmez ve eritrosit içinde genellikle tek olarak bulunur

(22, 64, 115). Trofozoitlerin çoğalması ikiye bölünme ile çiftlerin oluşması veya

şizogoni ile dörde bölünme şeklindedir (62). Yapı ve büyüklüklerindeki farklara dayalı

8

olarak B. canis ve B. gibsoni birbirinden morfolojik olarak ayrılabilirler (8, 22).

Parazitlere bazen akciğer ve karaciğer endotelial hücreleri ile makrofajlar içinde de

rastlanabilir. Bu durum parazitli eritrositlerin fagosite edilmeleri ile

ilişkilendirilmektedir (102). Babesia canis ve B. gibsoni arasındaki önemli farklılıklara

rağmen B. canis’in alt türleri morfolojik olarak birbirlerinden ayırt edilemezler, ayırıcı

tanıları moleküler metotlara dayandırılmak zorundadır. Babesia canis’in üç alt türü

tanımlanmıştır, bunlar, B. canis canis, B. canis vogeli ve B. canis rossi’dir. (8, 24, 59).

2.5.Tarihçe

Babesia cinsindeki protozoonlar ilk kez 1888 yılında Romanya’da Babes

tarafından sığır kanlarında görülmüştür. 1893 yılında Smith ve Kilborne tarafından

Amerika’da sığırlarda Texas Sığır Humması’nın etkeni olarak tanımlanmış ve

Pyrosoma bigenium ismi verilmiş, Boophylus annulatus ile taşındığı ortaya konmuştur.

Bu, aynı zamanda bir protozoonun bir artropod vektör tarafından bulaştırıldığına dair ilk

bulgudur (96, 107).

Dermacentor, Rhipicephalus veya Haemaphysalis keneleri ile bulaşan,

köpeklerin büyük Babesia’ları olan B. canis, ilk kez 1895 yılında İtalya’da Piana ve

Gali-Valerio tarafından Pyrosoma bigenium var. canis adı ile bildirilmiştir. Uilenberg

ve ark. (109)’na göre 1930’lu yıllarda çeşitli araştırıcılar tarafından Avrupa’da

Dermacentor, tropik ve subtropik bölgelerde Rhipicephalus sanguineus ve Afrika’da

Haemaphysalis keneleri ile bulaşan türler arasında çapraz bağışıklık bulunmadığı,

vektörlerinin ve patojenitelerinin farklı olduğu bildirilmiştir. Bunlara bağlı olarak,

R. sanguineus ile bulaşanlar Avrupa’da Dermacentor ile bulaşanlardan ayrı bir tür

olarak gruplandırılmış ve Rhipicephalus ile bulaşan türlerin biraz daha büyük olduğu

öne sürülmüştür (109). Büyük köpek Babesia’ ları B. major olarak adlandırılmış, daha

sonra B. vogeli olarak değiştirilmiştir. Ancak B. vogeli ismi zaman içinde unutulmuş ve

genel kullanıma dahil edilmemiştir (108). Uilenberg ve ark. (109)’na göre 1947 yılında

Neitz ve Steyn, B. canis ve B. rossi arasında belirgin bir farklılık olmadığını, aynı tür

veya alttürler altında bulunmaları gerektiğini bildirmişlerdir. Bu etkenlerin morfolojik

açıdan benzerlik göstermelerine rağmen aralarındaki genetik, antijenik, vektör ve

enzimatik farklılıklara, klinik semptomlarının farklı olmasına, patojenite ve lokalize

oldukları coğrafi dağılım farklılıklarına, kros reaksiyon vermelerine dayanarak,

taksonomik düzeyde B. canis’in trinominal sistemde üç alt türe ayrılması gerektiği

9

önerilmiştir (109). Günümüzde B. canis’in sınıflandırılmasında geçerli olan bu

sistemde, B. canis canis, B. canis rossi, B. canis vogeli alt türleri kullanılmaktadır.

Coğrafik yayılış, patojenite, antijenik yapıları, vektör spesifiteleri ile yapılan çalışmalar

da (46, 47, 67, 101) bu sınıflandırmayı desteklemektedir. Daha sonra yapılan moleküler

düzeydeki çalışmalarla da (17, 19, 24, 116), alt türlerin genetik yapılarının farklı olduğu

ortaya konmuştur. Babesia gibsoni ilk kez 1910 yılında Patton (11) tarafından

Hindistan’da önce tazılarda daha sonra çakallarda bulunmuştur. Son yıllardaki

moleküler çalışmalarda (9, 59, 83, 117) küçük Babesia türlerinin genetik olarak en az üç

farklı formunun olduğu bildirilmiştir Bu formlardan biri Avrupa’da ilk olarak rapor

edilen ve Theileria annae olarak isimlendirilen İspanya isolatıdır (9, 18, 117).

Kaliforniya’da bulunan küçük piroplasmların epidemiyolojik ve klinik bulgularının

farklı olmasının yanında genetik yapılarının da farklı olmasından dolayı bu

parazitlerden Kaliforniya’da bulunan küçük piroplasmlar B. conradae olarak

isimlendirilmiştir (58, 59).

2.6.Yaşam Çemberi

Babesia cinsindeki parazitlerin yaşam çemberi genel olarak birbirine benzer

(Şekil 2-2.). Vektörleri İxodidae ailesindeki kenelerdir. Omurgalı konaktan kan emen

keneler enfekte eritrositle birlikte parazitin merozoitlerini alır. Eritrositler kenenin

barsağında sindirilir ve merozoitler serbest kalır. Serbest kalan merozoitlerin çoğu

barsakta sindirilir ve kalan dayanıklı merozoitler barsak lümeninde uzantılı çıkıntıları

bulunan sert yapılı ray cisimciklerini oluştururlar (77). Bu yapılardan makro ve

mikrogametler oluşur (Babesia türlerinde makro ve mikrogametler birbirine benzer).

Kene kan emdikten sonra gömlek değiştirirken (14-18 gün sonra) gametlerin

birleşmesiyle zigot oluşur. Zigot hareketli olup barsak epitel hücrelerine girer ve kineti

oluşturur. Kinet çoklu bölünerek sporokinetleri oluşturur. Sporokinetler dağılarak

barsak lümenine dökülür. Sporokinetler tekrar epitel hücrelerine girip çoğalmaya devam

edebileceği gibi hemolenf yoluyla tükrük bezi, malpigi kanalları, kas hücreleri ve dişi

kenelerde ovaryumlara gelebilir. Hemolenf ile tükrük bezlerine gelen sporokinetler asini

hücrelerinin içine girer, polimorfik bir yapı alarak, hücrenin ve çekirdeğinin

büyümesine neden olurlar. Kenedeki gelişim çevre sıcaklığına bağlı olup, 28°C’de

gelişimi çok hızlıdır. Enfekte kene kan emerken tükrük bezi asini hücrelerinde bulunan

sporokinetler konağın vücut ısısının etkisiyle 2-3 gün içinde aktive olarak önce

10

sporoblastları daha sonra sporogoniyle ortalama 2µm büyüklüğündeki küresel veya oval

yapıdaki yaklaşık 100,000 adet sporozoiti oluştururlar. Omurgalı konak için enfektif

form sporozoitlerdir (78).

Sporokinetlerin kenenin vücudundaki yayılışı sırasında ovaryuma gelenler

yumurtaları da enfekte ederek yeni neslin enfekte olmasını sağlar. Buna transovarial

geçiş denir ve genellikle tek konaklı kenelerde görülür. İki veya üç konaklı kenelerde

ise transstadial geçiş görülür. Yani kene bir gelişme döneminde aldığı etkeni diğer

gelişme döneminde konağa verir. Örneğin iki konaklı kene larva aşamasında konağa

tutunduğunda, hayvan enfekte ise merozoitleri alarak kene de enfekte olur ve erişkin

safhada tutunduğu ikinci konağa sporozoitleri verir.

Omurgalı konakta sporozoitler direkt olarak eritrositlere giderler. Eritrosit

membranını apikal kompleks organellerinin salgıları ile delen sporozoitler hızla

eritrosite girer. Sporozoit eritrosite girdiğinde, eritrosite ait bir parça ile kaplanmıştır.

Eritrosit içinde önce parazitik vakuolden kurtulur ve sitoplazmada yuvarlak trofozoit

formuna dönüşür. Daha sonra ameboid forma dönüşür ve ikiye bölünerek merozoitleri

(piriform) oluşturur. Oluşan yeni merozoitler eritrositleri parçalayarak serbest kalır ve

yeni eritrositleri enfekte eder. Bu dönemde eritrosit içinde birden fazla merozoit

görülebilir. Bu formlara ikili piriform veya malta haçı denir. Bu durum eritrositin birden

fazla parazitle enfekte olmasından ziyade, arka arkaya oluşan ikiye bölünmenin

sonucudur.

Eritrositlerdeki bu döngü konak tedavi edilene kadar veya ölene kadar süresiz

olarak devam eder. Eritrositik dönemin sayısı dirençli hayvanlarda azalmıştır yada yeni

eritrositlerin enfeksiyonu şekillenmez. Enfeksiyonun bu döneminde parazitler kan nakli

ile başka konaklara geçebilir. Eritrositlerdeki bazı parazitler daha fazla çoğalmazlar ve

kene tarafından alındıklarında gametositleri oluşturmak üzere kalırlar (96, 102).

11

Şekil 2-2: Babesia canis’in yaşam çemberi (77) 1:Kenenin tükrük bezindeki sporozoitler, 2-5: Omurgalı konak eritrositlerindeki merozoitlerin aseksüel olarak çoğalması, (5.1): Kene kan emerken merozoitli eritrositleri de alır, (5.2): Merozoitli eritrositler kene barsağında sindirilir, 6: Eritrosit içinde oluşan gamontlar 7: Kene barsağında oluşan ray cisimcikleri, 8-14: Zigotun oluşumu, 15-18: Kinet (sporokinet) oluşumu, 19-21: Tükrük bezindeki sporokinetler . YS, ES: Çok çekirdekli sporont, SP: Küçük sporontlar, CY, DE: Sindirilmiş eritrositler, DK: Kinetin gelişimi, E: Eritrosit, ES: Sporontun büyümesi, GP: Parazitin büyümesi, HC, NH: Konak hücre çekirdeği, IV: İç vakuol, N: Çekirdek, R: Ray cisimcikleri, SP,T: Dikenimsi çıkıntı.

12

2.7.Epizootiyoloji

Köpeklerde babesiosis vektör kenelerin yayılışına bağlı olarak dünyada tropik,

subtropik ve ılıman iklim kuşağında yaygın olarak görülmektedir (70, 92). Bulundukları

bölgelere göre köpeklerde babesiosisin öneminin değişkenlik göstermesinin sebebi,

Babesia türlerinin ve çevrenin ekolojik durumunun farklı olmasındandır (91).

Babesia canis özellikle ılıman iklim bölgelerinde yaygın olup Avrupa, Amerika,

Asya, Afrika ve Avustralya’da görülmektedir. Babesia canis’in vektörü esas olarak

Rhipicephalus sanguineus’tur. Bu kene Hindistan, Almanya, Fransa, Güney Afrika,

Amerika ve Brezilya’da B. canis enfeksiyonlarını taşımaktadır. Fransa’da B. canis, ek

olarak Dermacentor marginatus, D. reticulatus ve D. venustus tarafından da

taşınmaktadır. Rusya’da ise B. canis, Dermacentor marginatus, D. reticulatus ve

Hyalomma plumbeum plumbeum tarafından taşınmaktadır (71, 102).

Babesia canis’in alt türlerinden B. canis canis Avrupa’da yayılış gösterir ve

Dermacentor reticulatus ile bulaşır (70, 92). Babesia canis vogeli tropik ve subtropik

bölgelerde, Kuzey Afrika, Kuzey Amerika’da ve Güney Afrika ve Avustralya’da

görülür ve R. sanguineus ile bulaşır (52, 75). Babesia canis rossi ise Güney Afrika’da

görülür ve Haemaphysalis leachii ile bulaşır (94, 104, 109).

Babesia gibsoni daha sınırlı bir coğrafik alanda yayılır ve Avrupa, Kuzey

Amerika, Asya ve Afrika’nın büyük bir alanında görülür (9, 20, 70, 92). Babesia

gibsoni’nin vektörü R. sanguineus ve Haemaphysalis bispinosa’dır (70, 92). Ancak

Haemaphysalis longicornis ile de bulaşabilir (22, 50, 51).

Son yıllarda köpek babesiosisi ile tür ve alt tür düzeyinde yapılan moleküler

çalışmalar artmaktadır. Japonya’da yapılan bir çalışmada 80 köpekten 5 tanesi (%6.3)

B. canis vogeli, 7 tanesi (%8.8) B. gibsoni ile enfekte bulunmuştur (51). Macaristan’da

44 köpekten 39’unda (%88.6) B. canis canis bulunmuştur (32). Hollanda’da 23

köpekten 18’inde (%78.2) B. canis canis (74), Avrupa’da B. canis canis ve B. canis

vogeli (17), Slovenya’da 238 köpekten 11’inde B. canis canis, 3 tanesinde B. canis

vogeli (27), Güney Afrika’da ise 326 köpekten 31’inde B. canis rossi (%9,5), 13’ünde

B. canis vogeli (%3,9) (75), Rusya’da 21 semptomlu köpekte B. canis canis (93),

Amerika’da 150 köpekten 144’ünde B. gibsoni (%96) (11), Almanya’da 5 semptomlu

köpekte B. canis (97), Japonya’da 115 köpekten 35 tanesinde (%30.4) B. gibsoni (82),

13

Sudan’da 78 köpekten 5 tanesinde B. canis rossi (%6.4), 2 tanesinde B. canis vogeli

(%2.5) (86), Avustralya’da 55 köpekten 22 tanesinde B. canis vogeli (%40) (72),

İspanya’da 62 semptomlu köpekte T. annae (39), Amerika’da yeni bir büyük piroplasm

(10), Brezilya’da 10 köpekte B. canis vogeli saptanmıştır (88). Ayrıca İspanya’da

yapılan bir çalışmada B. equi asemptomatik köpeklerde saptanmıştır (24). Aynı

çalışmada atlarda da B. canis canis bulunmuş, ancak araştırmada laboratuardan

kaynaklanan kontaminasyonlar göz önünde tutulması ve tekrarlanması gerektiği

belirtilmiştir.

Türkiye’de köpeklerde babesiosisle ilgili yapılan ilk çalışmada Merdivenci’ye

(40, kaynak:78 p.28) göre İç Anadolu Bölgesinde Ankara’da Piroplasma canis

bulunmuştur. Daha sonra Ankara’da bir köpekte Babesia canis’in varlığı mikroskobik

olarak bildirilmiştir (87). Aydın ilinde klinik olarak babesiosis semptomları bulunan 7

köpekte B. canis PCR ile saptanmıştır (110). Ege bölgesinde yapılan tarama

çalışmasında, 383 köpekten 40’ında (57) (%10.44) B. canis vogeli bulunmuştur.

İstanbul’ da 3 köpeğin kan preparatlarında mikroskobik olarak görülen Babesia türleri,

PCR-RFLP yöntemi ile B. canis vogeli alt türü olarak tanımlanmıştır (45).

Hastalığın yayılışı köpeklerde özellikle kene enfestasyonunun yaygın olduğu

yerlerde fazladır. Ancak hastalığın klinik olarak ortaya çıkması daha nadirdir ve klinik

tablonun şiddeti köpeğin yaşı, bağışıklık durumu ve parazitin türüne göre değişir (92).

Babesia canis köpek, kurt, tilki ve çakallarda, B. gibsoni ise ayrıca yaban gelinciği ve

porsuk gibi yabani karnivorlarda enfeksiyon oluşturur (70, 102). Kronik veya gizli

enfeksiyon taşıyan evcil ve yabani hayvanlar hastalığın rezervuarlığını yapar (70).

Yakın zamana kadar kabul gören vektör spesifikliğine göre etkenlerin bölgesel dağılımı

fikri artık geçerliliğini kaybetmiştir. Çünkü son yıllarda köpeklerde seyahat olguları

artmıştır ve bu durum da türlerin yayılışını etkilemektedir (17, 42).

2.8.Klinik ve Laboratuar Bulguları

Babesiosisin klinik bulguları hastalığın sporadik görüldüğü yerler ile endemik

olduğu bölgeler arasında farklılıklar göstermektedir. Endemik bölgelerde yetişen

köpeklerde hastalık kronik formda seyreder ve hastalığın şiddeti hafif ya da

semptomsuzdur. Ancak hastalığın nadir görüldüğü bölgelerdeki genç köpeklerde ve

parazitle ilk kez karşılaşan erişkin köpeklerde parazit çok patojendir. Prepatent süre 10-

14

21 gündür (102). Köpeklerde klinik bulguların şiddetini bireysel özellikler, parazitin

türü, hayvanın yaşı, bağışıklık durumu, enfeksiyona karşı oluşan cevap, enfeksiyonun

safhası, parasiteminin şiddeti, Ehlichiosis gibi diğer hastalıklarla eş zamanlı oluşması

gibi faktörler de etkiler (70). Çoğunlukla klinik bulguların şiddeti parazitin konak

eritrositleri içinde çoğalması sonucu oluşan hücre erimesine bağlıdır (94). Hastalığın

şiddeti multiorgan disfonksiyonu ile birlikte seyreden hemolitik anemi ya da hipotensif

şok gelişmesine bağlıdır (53).

Köpeklerde babesiosis hiperakut, akut ve kronik formda seyreder. Endemik

bölgelerde pek çok köpek hastalığı latent olarak bulundurur ve hayvan strese girdiğinde

ortaya çıkar. Subklinik enfeksiyonlarda hastalık belirgin olmayıp, klinik bulgu

görülmeyebilir (76). Hiperakut form çok yaygın görülmez, ani oluşan hipotansif şok ve

hızlı ölüm ile karakterizedir. Bu hayvanlarda hemoglobinuri görülür ve 24 saat içinde

koma hali gelişir. Ağır kene enfestasyonu da gözlenebilir. Hemoglobinuri eritrosit

yıkımlanmasındaki artışa bağlı olarak oluşur. Bu safhada köpeklerin çoğunda diğer

komplikasyonlar gelişir. Bu komplikasyonlar yavru köpeklerde daha sık görülür (70,

102). Akut formda eritrositlerin intravasküler hemolizi veya fagosite edilmeleri sonucu

hemolitik anemi, sarılık ve hemoglobinuri görülür. Aneminin şiddeti değişken olup,

hemoglobinemi ve bilirubinemi ile birliktedir. Dalak büyümesi, karaciğer loplarında yağ

dejenerasyonu, safra kanallarında genişleme ve nefritis şekillenir. Hasta köpeklerde

uyuşukluk, iştahsızlık ve ateş gibi klinik bulgular oluşur. Hastalık sıklıkla öldürücüdür

(48, 70, 92). Kronik formda ise iştah azalması, düzensiz ateş ve halsizlik görülür (70,

92).

Babesia canis, B. gibsoni’den daha akut ve hızlı hemolize neden olur (114).

Babesia gibsoni enfeksiyonlarında klinik bulgular daha azdır. Enfeksiyon daha kronik

seyirlidir. Hemoglobinuri ve sarılık seyrek olarak görülür. Babesia gibsoni daha çok 4

aylıktan büyük köpeklerde enfeksiyon oluşturur. Klinik olarak uyuşukluk, iştahsızlık ve

hemolitik anemi, düzensiz ateş ve trombositopeni görülür. Dalak ve karaciğer belirgin

olarak büyümüştür (30, 61, 102, 104, 113). Babesia gibsoni enfeksiyonlarında da

şiddetli parasitemi ve anemi görülebilir. Ancak bu devrede hayvanlar çok hasta

görünümde değildirler. Klinik bulgular her zaman parasitemi yoğunluğu ile paralel

olmayabilir (70). Babesia gibsoni enfeksiyonlarında şiddetli ateş gelişebilir ancak vücut

15

ısısı B. canis enfeksiyonundaki kadar yükselmez (49). Ölüm haftalar veya aylar sonra

gelişebilir ( 102).

Babesia canis’in alt türlerinin coğrafik yayılış, antjenik özellikleri ve

vektörlerinin farklı olmalarının yanında klinik belirtileri de farklıdır (46, 101, 109).

Babesia canis rossi, anemi ve trombositopeniye neden olarak, hasta köpeklerde

halsizlik, iştahsızlık, ateş, sarılık, gibi klinik semptomlara yol açar ve tedavi edildiği

durumlarda bile sıklıkla öldürücü enfeksiyonlar oluşturur. İmmuniteye bağlı hemolitik

anemi veya çok şiddetli akut yangısal reaksiyon oluşturması nedeniyle yüksek

patojeniteye sahiptir (94). Babesia canis vogeli klinik olarak semptom göstermeyen

hafif şiddette enfeksiyona yol açarken (17), Babesia canis canis anemi ve

trombositopeniye neden olup halsizlik, iştahsızlık, ateş ve sarılık gibi klinik

semptomlara yol açar. Ancak hastalık tablosu B. canis rossi’den daha hafiftir (10, 116).

Babesia canis canis enfeksiyonlarında parasitemi (enfekte eritrosit oranı) geçici ve

%1’in altındadır. İç organlarda kanamalar oluşabilir (101).

Köpek babesiosisinde anemi ve trombositopeni yaygın olarak görülen kan

tablosu bozukluklarıdır. Anemi başlangıçta hafif şiddette, normositic ve normokromik

iken daha sonra makrositik, hipokromik olur. Hastalığın devamında ise regeneratif hal

alır. Babesia canis canis ile oluşturulan deneysel enfeksiyonlarda trombositopeni

görüldüğü ancak çok şiddetli olmadığı bildirilmiştir (111). Babesia canis’in alt

türleriyle oluşan bütün enfeksiyonlarda şiddetli trombositopeninin ortak bulgu olduğu

bildirilmiştir (56).

Lökosit tablosunda bazen değişiklikler oluşabilir. Lökositozis, lökopeni,

nötrofili, nötropeni, lenfositozis ve eozinofili görülebilir (38, 111). Lökositozis

hastalığın her zaman oluşan ortak bir bulgusu değildir (44).

Babesia canis enfeksiyonlarında biyokimyasal değişiklikler hastalığın şiddeti ve

hipoksi ile bağlantılı olarak oluşur. Serumda Aspartate aminotransferase (AST), alanin

aminotransferase (ALT) artışı, hiperbilirubinemi, hiperalbubinemi, elektrolit ve asit-baz

değişiklikleri daha çok hipokalemi, hiperkloremi ve metabolik asidozis ile ilgili olarak

görülmektedir (70, 111).

Babesiosisde klinik bulgular direk anemi ile ilgili ise komplikasyonsuz olarak

isimlendirilir. Komplikasyonsuz babesiosisde anemi hafif veya orta şiddette ise hafif

babesiosis, anemi yaşamı tehdit edici derecede ise şiddetli babesiosis olarak

16

isimlendirilir. Komplikasyonlu olgular direk akut hemoliz ile ilgili değildir. Daha çok

akut böbrek yetmezliği, perakut babesiosis, pulmoner ödem, hemokonsantrasyon

(kırmızı safra) ve şok gibi organ yetmezliği tabloları gelişebilir (53).

Eğer hayvan enfeksiyonu atlatarak iyileşirse hastalığa karşı bağışıklık kazanır ve

preimmunisyondan dolayı daha sonraki enfeksiyonlara karşı korunur. Preimmunisyon;

parazit ile konak arasında klinik semptom oluşturmayacak kadar hassas bir dengenin

oluştuğu durum olarak kabul edilir (8). Kronik olarak enfekte köpekler hastalığın

taşıyıcılarıdır. Uzun süre antikor seviyeleri yüksek kalır (15). Klinik semptomlar genç

köpeklerde hastalığı atlatarak iyileşen ancak taşıyıcı olan hayvanlara göre daha

şiddetlidir (71, 83). Dalağı çıkarılmış köpekler daha şiddetli etkilenirler. Enfekte

annelerden doğan yavrularda yüksek parasitemi gözlemlendiği için transplesantal geçiş

olduğu bilinmektedir (16, 30, 61).

2.9.Patogenez

Babesiosis enfeksiyonlarında anemi ve organ komplikasyonları patogenezde

önemlidir. Anemi önemli bir klinik bulgu olmasına rağmen patogenezi tam olarak

anlaşılamamıştır. Hastalığın erken dönemleri hariç bütün dönemlerinde şiddetli

rejenerasyon olması, kemik iliğinin baskılanmaması aneminin eritrosit yıkımlanmasına

bağlı geliştiğini gösterir. Eritrositlerin parazitler tarafından fiziksel olarak parçalanması,

dalak ve karaciğerde fagosite edilmeleri eritrositlerin yeniden üretilmesinde önemli bir

faktördür. Intravasküler hemoliz ve eritrositlerin fagosite edilmesi sarılık,

hemoglobinuri ve böbreklerin koyu kahverengi renk almasına neden olur. Ancak yine

de intravasküler hemolizin nedeni tam olarak açıklanamamıştır (54). Hemoglobin

intratubuluslarda birikir. Böbrek yetmezliği ve dalak büyümesi oluşur. Şiddetli enfekte

olan bazı köpeklerde anemi oluşmadan ölüm görülebilir. Bu hayvanlarda serumda

bulunan kallikrein enzimi aktive olur. Bu aktivasyon kandaki şekilli elemanların

azalmasına yol açar ve akut dolaşım bozukluğuna bağlı olarak pulmoner ödem ve iç

organlarda kanama görülür. Nekroskobik olarak hemoraji ve yaygın intravaskuler

pıhtılaşma görülür (62). Babesia gibsoni enfeksiyonlarında hastalık tablosu veya

hemoglobinuri olmadan belirgin anemi ve parasitemi oluşur. Ayrıca eritrosit

yıkımlanması retikuloendoteliyal sistemde oluşur (92). Babesia canis enfeksiyonlarında

düşük parasitemiye rağmen şiddetli anemi olması olaya başka faktörlerin de karıştığını

göstermektedir. Babesia gibsoni enfeksiyonlarında serumda hemolitik aktivite tespit

17

edilmiş ve B. canis enfeksiyonlarında anemiye neden olan soluble antijenler

bulunmuştur (54). Parazitli eritrositlerin kapillar damarlarda birikmesi veya

parçalanması dolaşımdaki eritrosit sayısının azalmasına neden olabilir. Parazitli ve

parazitsiz eritrositlerin immunglobulin ve complemente bağlı yıkımlanması aneminin

oluşmasında önemlidir. Babesia gibsoni enfeksiyonunda anemi ve anti-eritrosit antikor

arasında ilişki olduğu bulunmuştur. Eritrosit yıkımlanmasındaki immun mekanizmanın

katkısı, sekonder immun aracılı hemolitik anemi ile karıştırılmamalıdır (54).

2.9.1.Köpek Babesiosisinin Komplikasyonları

Akut Böbrek Yetmezliği (ARF); Belirtileri yeterince su alınmasına rağmen

gelişen anuri ve oligüridir. ARF genellikle yaşlı köpeklerde oluşur. Genç ve poliürik

köpeklerde prognozu daha iyidir. ARF çok yaygın bir komplikasyon değildir.

Köpeklerde intravasküler hemoliz ARF’ye neden olabilir. Hemoglobinin ARF’deki

etkisi bilinmemektedir (54).

2.9.1.1.Cerebral Babesiosis

Köpeklerde serebral babesiosis beyindeki küçük damarlarda parazitli

eritrositlerin yığılması ve sinirsel bulguların ortak kombinasyonu olarak tanımlanmıştır.

Serebral babesiosis oluşan köpeklerde, hareketlerde uyumsuzluk, vücudun arka

kısmında felç, kaslarda kasılmalar, nistagmus, anizokori, aralıklı bilinç kaybı, nöbet,

sersemlik ve koma hali görülür. Akut serebral babesisois ani ölümle karakterizedir (54,

102). Patolojik olarak beyinde kanama, makroskobik ve mikroskobik hemoraji ve

histolojik kesitlerde kapillar damarlarda eritrosit yığınları görülür. Parazit içeren

eritrositlerin çoğu beyindeki damar endotellerine yapışarak tıkanmalara neden olur.

Ancak bu yapışmanın mekanizması tam olarak bilinmemektedir (54, 102).

2.9.1.2.Pıhtılaşma Bozuklukları

Babesiosisde sürekli ve belirgin şekilde oluşan, hem komplikasyonlu hem de

komplikasyonsuz vakalarda görülen anormallik trombositopenidir. Babesiosiste gelişen

hemoliz, damar endotelyumlarının hasarı, asidozis, hipoksi, dolaşımda durgunluk, şok

ve endotoksemi hasta hayvanlarda yaygın pıhtılaşma bozukluğu sendromunun (DIC)

gelişmesine yol açar. Yaygın pıhtılaşma bozukluğu, pıhtılaşma mekanizmalarının

18

bozulmasına bağlı oluşan sistemik bir reaksiyondur ve sekonder olarak ortaya çıkar

fakat oluşturduğu tablo babesisosisde baskın hale gelebilir (54).

2.9.1.3.Sarılık ve Karaciğer bozuklukları

Köpeklerde babesiosisin ilerlemesi durumunda sarılık oluşur. Sarılığın şiddeti

ölüm oranını artırır. Sarılık tek başına ölüm nedeni olmayıp, diğer komplikasyonlarla

birlikte görülür. Babesiosisde hemoliz tek başına sarılığa neden olmaz. Sarılığın

oluşmasında karaciğer yetersizliğinin önemli rolü olduğu düşünülmektedir (54).

2.9.1.4.Bağışıklığa bağlı Hemolitik Anemi (IMHA)

Bağışıklığa bağlı hemoliz, eritrosit membranı ile ilişkili antikorların eritrositleri

yıkılmaması sonucu oluşur. Parazitli eritrositlerin membranı hasar gördüğü için yabancı

olarak algılanır ve antikor- komplement aktivasyonu yoluyla yıkımlanır. IMHA’nın en

tehlikeli sonucu, tedaviye rağmen süren hemolize neden olabilmesidir. Babesiosisde

nadir görülen bir komplikasyondur (54).

2.9.1.5.Perakut Babesiosis

Perakut olgular, klinik bulguların 24 saatten kısa sürdüğü, hasta hayvanın

kollaps durumunda olduğu durumlarda görülür ve şiddetli intravasküler hemolize yol

açar. Özellikle genç köpeklerde yüksek parasitemi görülebilir. Perakut babesiosiste

diğer komplikasyonlar da gelişebilir. Özellikle serebral babesiosis ile perakut babesiosis

arasındaki fark belirsizdir. Bu komplikasyon genellikle hasta hayvanların ölümü ile

sonuçlanır (54).

2.9.1.6.Pulmoner Ödem

Babesiosisde pulmoner ödem (akciğer şoku) çoğunlukla ölümle sonuçlanan bir

komplikasyondur. Klinik bulgusu ani gelişen zor ve sık solunumdur. Solunum güçlüğü,

öksürük ve kanlı burun akıntısı ilerleyen ödemin belirtileridir. Pulmoner ödemin

mekanizması alveoler permeabilitenin artması veya hidrostatik basıncın artması ile

açıklansa da, babesiosisde nasıl geliştiği henüz tam olarak bilinmemektedir (54).

2.9.1.7.Hemokonsantrasyon (Kırmızı Safra)

Babesiosisde hemokonsantrasyon kan volümünün azalması sonucu oluşur. Bu

olaya plazmanın önemli bir miktarının damar dışına çıkması yol açar. Mekanizmasında

19

serebral babesiosis, yaygın damariçi pıhtılaşma bozukluğu, ARF ve pulmoner ödem gibi

diğer komplikasyonlar rol oynar (54).

2.9.1.8.Şok

Babesiosisli köpek koma durumunda olsa bile şokun klasik klinik belirtileri

görülmeyebilir. Babesiosisden ileri gelen şok, endotoksemik sok olgularındaki

hiperdinamik dönemle başlar, hipotensif şokla devam eder. Babesia canis

enfeksiyonlarında oluştuğu düşünülmektedir. Ancak bunu tanımlayan sadece bir yayın

vardır (33).

2.9.1.9.Organ Yetmezlikleri

Köpek babesiosis’inde diğer organlarda görülen bozukluklar hastalığa çok

spesifik olmayıp, diğer sistemik hastalıklarla karışabilir (54).

2.10.Bağışıklık

Köpeklerde babesiosise karşı bağışıklık gelişmesinde, konak özgüllüğü, yaş ve

spesifik olmayan bazı etkenler rol oynayabilir. Kazanılmış bağışıklığın gelişmesiyle,

tedavi edilen veya edilmeden hastalığın akut dönemini atlatan hayvanlar, parazitin

taşıyıcısı olurlar ve enfeksiyonun kaynağını oluştururlar. Ayrıca bu hayvanlarda

enfeksiyonun tekrarlama riski her zaman vardır (30, 62, 113). Babesia canis ile

B. gibsoni arasında çapraz bağışıklık gelişmez. Babesia canis enfeksiyonunu atlatan

köpeklerde endemik bölgelerde reenfeksiyonlar oluştuğu sürece klinik olarak

enfeksiyon görülmez. Ancak reenfeksiyon oluşmazsa parazitler bir yıl içinde kaybolur

(102). Hayvan klinik dönemi atlatır ve bağışık olursa parazitler kanda çok az görünür.

Klinik tablonun genç köpeklerde şiddetli olması immun sistemlerinin gelişmemiş

olmasından kaynaklanabilir (92). Klinik olarak kronik enfekte köpekler hastalığın

rezervuarlığını yaparlar ve antikor seviyeleri uzun süre yüksek kalır (15). Babesia canis

antikoru taşıyan hayvanlar bir yıl süre ile hastalığın klinik bulgularını göstermezler. Bu,

immun sistemin koruyucu etkisindendir. Ancak klinik olarak enfekte, ancak antikor

sentezlemeyen ya da tedavi ile enfeksiyonun temizlendiği durumlarda enfeksiyon

senede iki kere tekrarlanabilir (66, 73). Babesia canis enfeksiyonlarında parazitin

kandan tamamen yok edilmesi ile bağışıklık süresi kısalır. Antikor seviyesi

enfeksiyondan sonra 3-5 ayda yavaş yavaş azalır. Türe spesifik bağışıklık 5-8 aydan

20

daha uzun sürmez ve bu süre sonunda hayvan reenfeksiyonlara karşı duyarlı hale gelir

(13, 112). Enfeksiyondan sonra kanda kalan düşük seviyedeki antikor daha sonra

oluşacak enfeksiyonlara karşı hayvanın korunmasında uzun süreli bağışıklık sağlar (66,

89).

Köpeklerde babesiosisde cinsiyet ve ırk hastalığa karşı duyarlı olmayı etkilemez.

Beagle, fox terrier, porcelain, teckel ve bazı kırma ırklar daha dirençli, spaniel, cocker,

griffon, yorkshire terrier, doberman ve pekinese gibi bazı ırklar ise daha duyarlıdır.

Ancak hiçbir ırk tam olarak dirençli değildir. Endemik bölgede yaşayan köpekler

hastalığın klinik semptomu görülmeden de yüksek derecede antikor sentezleyebilir (73).

Evcil hayvanlarda Babesiosise karşı oluşan bağışıklık uzun sürelidir. Ancak Afrikada’ki

B. canis enfeksiyonlarında daha sonra oluşan şiddetli enfeksiyonlarda bağışıklık zayıftır

(103).

Babesia canis’in bir suşudan hazırlanan soluble parazit antijeni (SPA) ile

aşılanan köpeklerde, deneysel olarak farklı bir B. canis suşunun tekrar verilmesi ile

çapraz-korunma gözlenmemiştir (99). Bu da B. canis’in alt türleri arasındaki antijenik

varyasyonun olduğunu göstermektedir. Antijenik yapılarının farklı olması türler

arasında çapraz bağışıklık olmamasını açıklayabilir. Bu düşünceden yola çıkılarak

Avrupa suşuna ait SPA ile Afrika suşuna ait SPA’nın karıştırılarak kullanıldığında

B. canis enfeksiyonuna karşı korunma sağlandığı görülmüştür (99). Babesiosise karşı

oluşan immun yanıt, sadece parazitin trofozoitlerine karşı değil kenelere karşı da oluşur

(70).

2.11.Tanı

Babesiosiste tanı, hastanın geçmişi, klinik bulgular ve laboratuar sonuçlarına

dayanır. Hastanın endemik bir bölgede yaşaması, daha önce endemik bir bölgeye

seyahat öyküsü, kene enfestasyonu ve stres durumu tanıyı destekleyici bulgulardır.

Babesiosiste klinik bulgular spesifik olmadığı için, kesin tanıda yeterli değildir. Oysa

enfeksiyon etkenine tam olarak tanı konması tedavi ve hastalığın ilerleyişi açısından

önemlidir. Hemolitik anemi, hemoglobinuri ve sarılık önemli bulgular olmasına

rağmen, kesin tanı için parazitlerin tespit edilmesi gerekir (70, 94, 103). Bunun için

kanın mikroskobik olarak incelenmesi, serolojik testler, dalağı çıkarılmış köpeğe

şüpheli kan inokulasyonu ve son yıllarda gelişen PCR gibi moleküler yöntemler

kullanılır (61, 92, 102).

21

2.11.1.Mikroskobik Tanı

Mikroskobik tanı, kan preparatlarındaki eritrositlerin içindeki parazitlerin

morfolojik olarak belirlenmesi ile yapılır (115). Parazitlerin görülmesi ve tanınması için

Romanowsky, Giemsa, Wright’s, Field’s ve Diff-Quik gibi boyalar kullanılır. Babesia

trofozoitlerinin kan preparatlarında görülmesi, kronik ve hafif enfeksiyonlarda

paraziteminin değişken olması ve pek çok durumda parazitlerin dolaşım kanında az

miktarda bulunması nedeniyle zordur (37). Mikroskobik inceleme için kan, büyük

venalar yerine kapillar damarlardan alınmalıdır. Çünkü parazitli eritrositler kapillar

damarlarda toplanmaya eğilimlidir. Tırnak ucu veya kulak ucu, kapillar damarların

yoğunluğundan dolayı kan almak için uygundur (30). Mikroskobik tanıda parazitlerin

boya lekeleri ile karıştırılmaması için çok iyi boyanmış kan preparatları gereklidir.

İnceleme en az 20-30 dk. sürmeli ve daha çok preparatın uç kısımlarında parazitler

aranmalıdır çünkü parazitli eritrositler daha çok preparatın uç kısımlarında saçaklı

alanlarda bulunurlar. Parazit içeren eritrositler santrifüj edilen antikoagulanlı kan

örneklerinde buffy coat (kan santrüfüj edildiğinde plasma ile eritrosit birikintisi arasında

kalan kısım) tabakasının altında toplanır. Bu tabakanın alt kısmından hazırlanan

preparatların incelenmesi paraziti görme şansını artırır. Kemik iliği aspiratından

hazırlanan frotilerde de parazitlere rastlanabilir. Preparatlar incelenirken eritrosit

üzerindeki trombositlerin parazitlerle karıştırılmamasına dikkat edilmelidir. Ölüm

sonrası histolojik kesitlerde dalak, karaciğer, kemik iliği, akciğerler, böbrek, meningsler

ve sindirim kanalının kapillar damarlarından hazırlanan kan preparatları incelendiğinde

babesialara rastlanabilir (61, 92, 102). Kan preparatlarında, tecrübeli kimselerce 105

veya 106 eritrosit içindeki bir parazitin bile görülebildiği bildirilmiştir. Ancak bu

durum, klinik olarak babesiosis şüpheli hayvanların kan preparatlarının tecrübeli

kimselerce incelenmesi ile ancak mümkündür (14). Babesia gibsoni küçük olduğu ve

diğer küçük piroplasmalardan ayırt edilemediği için mikroskopik incelemede çok daha

dikkatli olmak gerekir (52, 91). Mikroskobik inceleme ile tür ve alt türlerin ayrımı

yapılamaz (9). Köpek babesiosisinin endemik olmadığı bölgelerde laboratuar bulguları

başka hastalıklarla karışabilir. Bu bölgelerde şüpheli hayvanlarda kan preparatları

babesiosis yönünden dikkatle incelenmelidir (22).

22

2.11.2.Serolojik Testler

Babesialar kanda az sayıda bulundukları için parazite karşı oluşan antikorlar

serolojik yöntemlerle aranabilir (30). Ancak serolojik tanıda, B. canis ve B. gibsoni

arasındaki çapraz reaksiyonlar nedeni ile kesin tanı için bu iki paraziti morfolojik

olarak ayırt etmek gerekir (92). Ticari olarak üretilen serolojik testler anti-Babesia

antikorlarını tespit etmede kullanılmaktadırlar. Ancak Babesia enfeksiyonlarında parazit

konaktan temizlendikten sonra da antikor miktarı belli bir seviyede kaldığı için,

enfeksiyonun devam eden veya geçirilmiş olduğu anlaşılamamaktadır. Ayrıca

enfeksiyonun erken safhalarında antikor titresi düşük olduğu için endemik bölgelerde

kullanıldığında negatif sonuç verir (7, 104). Ayrıca babesiosisin serolojik yöntemlerle

tanısında türler arasında olduğu gibi, parazit ile eritrositler arasında da çapraz

reaksiyonlar oluşabilir (1, 20). Serolojik testler kronik enfeksiyonların tanısında

kullanışlı değildir (19). Büyük babesiaların alt türleri antijenik farklılıklariçerir. Fakat

her alt türe özgü antijenik materyal bulunmadığı için serolojik testler alt tür ayrımında

geniş kullanım alanı bulamazlar (116). Standardize edilmiş serolojik testlerin yokluğu,

antikorlar arasındaki çapraz reaksiyonlar, son zamanlarda türlerin coğrafik

yayılışlarındaki değişiklikler, babesiaların tanısını zorlaştırmaktadır (9).

Çeşitli serolojik testler bulunmasına rağmen, bunlardan IFA (Indirect Floresan

Antibody) testi B. gibsoni ve B. canis’in tanısında yaygın olarak kullanılmaktadır. Genç

köpeklerde hastalığın erken dönemlerinde ve immunitesi baskılanmış hayvanlarda

yanlış negatif sonuçlar yaygındır (2, 65, 92). IFA testi kronik olarak enfekte hayvanların

kanında parazit olmadığı ya da çok az olduğu durumlarda kullanışlıdır. Genellikle bu

test Babesia etkenleri için yüksek duyarlılık gösterirken, türler arasındaki antijenik

yakınlıktan dolayı oluşan çapraz reaksiyonlar nedeni ile orta derecede özgünlük gösterir

(2, 68). IFA testi, köpeklerdeki Babesia türleri arasında çok fazla çapraz reaksiyon

oluştuğu için tür ayrımında kullanışlı değildir (5). Babesia gibsoni’nin tanısında IFA

testinin güvenilirliğini araştırmak için vektör kenelerin bulunmadığı bölgede sağlıklı ve

parazitsiz köpekler üzerinde yapılan çalışmada yanlış pozitif sonuçlar alınmıştır. Ayrıca

sığır ve köpek Babesiaları arasında çapraz reaksiyonlar bildirilmiştir (61, 115). Babesia

gibsoni ile doğal enfekte, klinik semptom gösteren ve parasitemili köpeklerde, homolog

antijenlere karşı gelişen antikor titrelerinin birbirinden farklı olabildiği görülmüştür.

IFA testinin uygulanmasında kullanılan cut-off değeri de sonuçlar arasında farklılık

23

oluşturmaktadır. Her laboratuarda, parazit izolatları, teknik ve kullanılan kimyasallar

farklı olabildiğinden, kendi testleri için geçerli cut-off değerlerinin saptanması gerekir

(115).

Serojik tanı amacıyla kullanılan bir diğer test ELISA (Enzim-Linked

Immunosorbent Assay)’dır. ELISA testi de IFA testi gibi yüksek duyarlılığa sahiptir.

Ancak Babesia türleri arasındaki çapraz reaksiyonlardan dolayı orta derecede özgünlük

gösterir (37, 115). Japonya’da yapılan bir çalışmada (82) Babesia gibsoni’nin

epidemiyolojisinin belirlenmesinde PCR ve ELISA testi kullanılmıştır. PCR için 18S

rRNA geninden seçilen spesifik primerler, ELISA için P50 immunodominant antijeni

kullanılmıştır. PCR ile 115 köpekten 29’u pozitif, bulunurken, ELISA ile 27 köpek

pozitif bulunmuştur.

2.11.3.Moleküler Tanı Yöntemleri

Mikroskobik ve serolojik tanıdaki yetersizlik ve dezavantajlar nedeni ile

Babesiaların kesin tanısı yapılamayabilir. Bu nedenle son yıllarda PCR’ında içinde

bulunduğu moleküler yöntemler ile yapılan tanı metotları tercih edilmektedir.

Mikroskobik tanı, akut babesiosis’in tanısında laboratuarda pratik olarak

uygulanmasından dolayı hala en iyi, ekonomik ve uygun metottur. Ancak, özellikle

parasiteminin düşük olduğu durumlarda preparatı inceleyen kişinin tecrübesi önemlidir

(14). Günümüzde PCR ve DNA’ ya dayalı diğer testler, Babesiaların tanısında yüksek

duyarlılık ve özgünlüklerinden dolayı geniş kullanım alanı bulmaktadır (9, 19, 22, 23).

Babesiaların farklı vektör spesifiteleri, antijenik yapıları ve patojeniteleri tür ve alt tür

ayrımlarının yapılmasında yeterli olmadığı için, moleküler teknikler tanı ve

sınıflandırmada güvenilir şekilde kullanılabilir (19, 117).

2.11.3.1. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)

PCR, Babesiaların tanısında, türlerin ve alt türlerin ayrımında özgün olarak

kullanılır. Mikroskobik bakı ve serolojik testlerden daha özgün bir tanı metotudur (9).

Bu metot son yıllarda köpeklerde Babesiaların tanı ve ayrımlarında yaygın olarak

kullanılmaktadır (32, 51). PCR ile yapılan bir çalışmada B. gibsoni 0,000002 %

parazitemili kanda belirlenmiştir. Aynı çalışmada incelenen 28 kan örneğinin 3’ü IFAT,

2’si mikroskobik incelemede negatif iken, bu örnekler PCR ile pozitif bulunmuştur (37).

24

Piroplasmların konak spesifikliğinin zannedilenden daha düşük olduğunu

bildirilmiştir (84). Bu düşünce daha sonra kedilerde PCR yöntemi ile köpeklere ait iki

piroplasmın (B. canis canis ve T. annae) saptanması ile doğrulanmıştır (26). İsrail’de

yapılan bir çalışmada (6), evcil kedilerde tespit edilen Babesiaların morfolojik ve klinik

açıdan incelenmesi ve genetik karakterizasyonunun yapılması amaçlanmıştır. Bu

çalışma sonucunda kedilerdeki etken, B. canis subspecies presentii olarak

isimlendirilmiştir.

2.11.3.2.Hydroethidine-Flow Cytometry (HE-FC)

HE-FC, B. gibsoni’nin tanısında deneysel olarak kullanılmıştır (34). Bu

yöntemin temeli, canlı hücre tarafından alınan ve hücredeki metabolizma sonucu

DNA’ya bağlanan bir boya olan ethidium bromide dönüşen hydroethidinin

kullanılmasına dayanır. Çok hızlı sonuç verir ve kısa zamanda çok sayıda örnek

incelenir. Ancak özel bir cihaz gerektiği için pahalı bir metottur (7).

2.11.3.3.PCR-RFLP

PCR-RFLP ile, Babesia tür ve alt türler arasındaki ayrım basit, hızlı ve duyarlı

şekilde belirlenebilir. RFLP, çabuk tanı sağlamasının yanında serolojik testlere göre

daha duyarlıdır. Parasiteminin % 0,01’e kadar düşük olduğu durumlarda bile

kullanışlıdır. Serolojik testlere göre eş zamanlı enfeksiyonların tanısında daha

duyarlıdır. Epidemiyolojik çalışmalarda köpeklerde Babesiaların belirlenmesinde

kolaylık sağlar (19). PCR-RFLP ile köpeklerin büyük Babesialarının antijenik ,coğrafik,

vektör ve patojeniteleri farklı olan alt türlerin ayrımları çabuk olarak yapılabilmektedir

(116).

2.11.3.4.RLB

Farklı cins ve türlere ait etkenlerin eş zamanlı olarak tanı ve ayrımları için

geliştirilen bir tekniktir. Köpeklerde bulunan Babesia cinsindeki parazitlerin tür ve alt

türlerin tanısında da duyarlı ve özgün bir metot olarak kullanılmıştır (74).

Kaufhold ve ark. (55) tarafından 1994 yılında ilk kez uygulanan teknik, bakteri

ve parazitlerin tanı ve identifikasyonunda giderek daha yaygın kullanılmaktadır.

Tekniğin avantajı çok sayıda etkenin eş zamanlı olarak yine çok sayıda örnekte

aranmasını sağlamasıdır. Bu tekniğin kullanımı özellikle keneler ile bulaşan

25

hastalıkların tanı ve identifikasyonunda yer bulmuştur. Keneler tarafından bulaştırılan

Borrelia türlerinin tanısı ve identifikasyonu amacıyla Rijpkema ve ark. (95) tarafından

1995 yılında uygulanmıştır. Gubbels ve ark. (43) tarafından 1999 yılında bilinen bütün

Theileria ve Babesia türlerinin tespiti ve identifikasyonunda başarılı bir şekilde

kullanılmıştır. Daha sonraki yıllarda Theileria/Babesia ve Ehrlichia/Anaplasma

cinslerine bağlı 36 adet türün tespit ve ayırımını yapabilen kitler geliştirilerek kullanım

alanı daha da genişlemiştir. Sığırlarda Theileria/Babesia tanısında (41, 43), insandaki

Babesia divergens olgusunun tanısında (21) kullanılmıştır. Tekniğin, sadece PCR

metoduna dayalı olanlardan önemli bir farkı da aynı grup içinde bulunabilecek yeni

türlere rastlama ve tanıma şansının olmasıdır. Tekniğin uygulanışı ve aşamaları şekil

2-6, şekil 2-7 ve şekil 2-8’de görülmektedir.

Köpeklerde RLB, ilk kez 2004 yılında Matjila ve ark. tarafından Babesia

canis’in alt türlerini ayırt etmede kullanılmıştır (75) .

Şekil 2-6: DNA ekstraksiyonu ve catchall PCR aşaması (105)

26

Şeki

l 2-7

: PC

R ü

rünl

erin

in g

örün

tüle

nmes

i ve

sent

etik

olig

onük

leot

idle

rin

mem

bran

a tu

ttur

ulm

ası (

105)

27

Şeki

l 2-8

: Örn

ekle

rin

yükl

enm

esi,

hibr

idiz

asyo

n ol

uşm

ası v

e si

nyal

leri

n gö

rünt

ülen

mes

i (10

5)

28

2.12.Tedavi

Düşük patojeniteli Babesia türleri ile enfekte olan hayvanlar genellikle tedavi

edilmeksizin iyileşir (92). Hastalığın tedavisinde; Diminazene aceturate, Phenamidine

isethionate, İmidocarb, Clindamycine, Trypan Blue, Acaprin tedavide en çok kullanılan

etken maddelerdir (15, 79, 113). Genel olarak babesial ilaçlar B. canis’e karşı daha

etkilidir. Babesia gibsoni enfeksiyonlarında tedavi sonrası relapslar görülebilir (78).

Diminazene aceturate’ın yan etkilerinden dolayı hiperakut babesiosisli köpeklerde bu

ilaç kullanılmamalıdır. Enfeksiyonu yok etmek için Diminazenden sonra İmidocarb

gerekebilir (61). Babesia gibsoni enfeksiyonlarında Diminazene aceturate tedavisi

klinik olarak etkili olsa bile enfeksiyonu temizlemez (92). Imidocarb diproprionate

Babesia gibsoni enfeksiyonun şiddetini azaltsa bile hastalığı yok edici spesifik bir

tedavi değildir (8). Trypan Blue Babesia canis enfeksiyonlarında etkili olup B. gibsoni

enfeksiyonlarında etkisi yoktur (70). Phenamidine isethionate Babesia canis ve

B. gibsoni enfeksiyonlarında etkilidir (92, 102, 114).

Semptomatik ve destekleyici olarak sıvı sağaltımı, kemoterapi ve asidozise karşı

sodyum bikarbonat uygulaması yapılır. Şiddetli enfekte hayvanlarda asidozis ve şok

gelişmiş ise sıvı tedavisi gerekebilir. Ayrıca şiddetli anemik hayvanlara kan

transfüzyonu yapılabilir (92). Tedavi süresince hayvan iyileşme durumu açısından

gözetim altında tutulmalıdır. (70) Babesiosisde tedavi ile veya kendiliğinden iyileşme

sonrası parazitler konaktan tamamen kaybolmazlar. Konak taşıyıcı olarak kalır ve

enfeksiyon daha sonra tekrarlayabilir Tedavide parazite karşı tedavi ile birlikte

destekleyici tedavi gerekebilir. Destekleyici tedavide hipoksiyi önlemek için kan veya

sentetik hemoglobin gerekebilir. Intravasküler volum artırılmalıdır. Bazı hastalarda

oksijen tedavisi gerekebilir (4, 11, 16). Steroidler, immuniteye bağlı anemi,

trombositopeni veya şok tedavisinde faydalı olsalar da enfeksiyondaki kullanımları

tartışmalıdır. Steroidlerin kullanılması durumunda, hayvan gözetim altıda tutulmalıdır.

Çünkü immuniteyi baskılamak parasitemiyi kötüleştirebilir (70). Tedavi gören hayvan

daha sonraki enfeksiyondan tamamen kurtulamaz, ancak yeniden enfekte olursa klinik

belirtiler daha hafif seyreder (111). Köpeğin bulunduğu bölgeye göre risk altında

bulunması göz önünde tutularak profilaktik tedavi uygun olabilir (61).

29

2.13.Korunma

Babesiosis enfeksiyonlarından sonra oluşan kronik, semptomsuz taşıyıcılık

durumu daha sonra oluşacak enfeksiyonlara karşı köpeği dirençli hale getirir (15).

Korunma, kenelerin kontrol altına alınması ve yok edilmesi ile taşıyıcıların

bilinmesi ve gözetim altında tutulmasını içerir (70, 104). Korunmada hem hayvanın

hem de çevrenin kontrol altında tutulması, vektör kene Rhipicephalus sanguineus’un

yaşam çemberinden dolayı önemlidir. Köpeğin kanında mikroskobik veya serolojik

olarak B. canis veya B. gibsoni’den herhangi biri bulunmuşsa, bu köpek kan verici

olarak kullanılmamalıdır. Kan verici olarak kullanılacak hayvan mutlaka splenoktomi

uygulanarak iki hafta gözetim altında tutularak durumu netleştirilmelidir. Korunmada

uygulanacak diğer bir yöntem aşılamadır. Doku kültüründen elde edilen, B. canis’in

avirulent suşundan hazırlanan Pirodox isimli bir ticari preparat vardır. Ancak bu aşı

yalnızca Fransa’da bulunmakta olup, yurdumuzda kullanılmamaktadır. Daha önce

yapılan çalışmalarda aşının hastalığı tamamen önleyemediği, ancak klinik semptomları

hafiflettiği ve ölüm oranını azalttığı bildirilmiştir (12, 100, 104). Ayrıca B. canis ve B.

gibsoni’de premunisyon sağlayarak akut ve şiddetli enfeksiyonları önler (61).

Köpekler küçük bir bölgede yaşıyorlarsa kene enfestasyonlarına karşı kontrol

edilmeleri daha kolay olabilir ve böylece Babesia enfeksiyonlarından korumak mümkün

olabilir (92). Bu amaçla; hayvana bir akarisit uygulanmalı, boynuna pire /kene tasması

takılmalı, yaşadıkları yerlere akarisit uygulanmalıdır. Hayvan enzootik bölgeye giderse,

hastalığın klinik semptomları yönünden dikkatlice incelenmeli ve enfeksiyon

durumunda tedavi edilmelidir. Enfeksiyonu geçiren hayvan daha sonra immunite

kazanır ve sonraki enfeksiyonlara karşı dirençli hale gelir (71). Kenenin hastalığı

nakletmesi için en az üç güne ihtiyaç olduğundan, alternatif olarak her gün kenelerin

hayvandan uzaklaştırılması korunmada etkili olabilir. Rhipicephalus sanguineus köpek

barınaklarında hatta insanların evlerinde bile bulunabildiği için, düzenli olarak kene

mücadelesi yapılmalıdır (102).

30

3. GEREÇ VE YÖNTEM

3.1.Saha Çalışması

Bu çalışmanın materyalini Aralık 2004-Haziran 2005 tarihleri arasında, % 95 CI

( Confident Interval- Güven Limiti) ve % 5 Absolute kesinlik sağlamak üzere (29)

İstanbul ili sınırları içinde bulunan 11 farklı barınaktaki 370 adet sokak köpeğinden ve

İstanbul Üniversitesi Veteriner Fakültesi Kliniklerine getirilen 123 adet sahipli köpekten

alınan toplam 493 kan örneği oluşturmuştur. Kan alınan merkezler ve köpek sayıları

Tablo 3-1’de verilmiştir. Kan, köpeklerin Vena cephalica’sından veya Vena

jugularis’inden alınmıştır. Kan örneği alınan köpeklerin genel durumları, klinik olarak

semptomlu olup olmadıkları, yaş ve cinsiyetleri kaydedilmiştir. Her bir köpekten

yaklaşık 4 ml kan steril vakumlu EDTA (di-sodium ethylenediaminetetra-acetic acid)

içeren hazır ticari tüplere (Greiner bio-one, Austria) alındı. Kanlar soğuk zincirde (buz

çantası) taşınarak İstanbul Üniversitesi Veteriner Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı

laboratuvarına getirildi.

Tablo 3-1: Kan alınan merkezler ve örnek sayıları

Merkez Hayvan sayısı

Küçükçekmece 30

Bahçelievler 40

Avcılar 16

Kağıthane 39

Büyükçekmece 35

Zeytinburnu 40

Altınşehir 40

Kemerburgaz 51

Kadıköy 40

Ümraniye 19

Beylikdüzü 20

İ.Ü. Vet.Fak.Klinikleri 123

Toplam 493

31

3.2.Laboratuar Çalışmaları

3.2.1.Mikroskobik inceleme

EDTA’lı tüp içinde bulunan kan örneklerinden İstanbul Üniversitesi Veteriner

Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı laboratuvarında her bir hayvana ait 2’şer adet

sürme preparat hazırlandı. Preparatlar havada kurutularak, metanolde (Merck,

Germany) 5 dakika tespit edildi. Adnan Menderes Üniversitesi Veteriner Fakültesi

Parazitoloji Anabilim Dalı laboratuvarında pH: 7.2 olan Giemsa’nın boya tamponu

(Gurr, buffer tablets pH: 7.2, BDH, England) ile hazırlanmış %5’lik Giemsa boya

solüsyonu (Merck, Germany) içinde 45 dk. süreyle boyandı. Daha sonra preparatlar

aynı tampon solüsyonu ile yıkanarak havada kurutuldu ve immersiyon yağı damlatılarak

x1000 büyütmede ışık mikroskobunda (Nikon, Japonya) incelendi. Her bir preparat

hakkında en az 50 saha gezilerek karar verildi. Pozitif bulunan preparatların

parazitemisi, 1000 eritrosit içindeki parazitli eritrosit oranına göre hesaplandı (76). Bu

aşamada kullanılan solüsyonların ad ve içerikleri 3.3’te verilmiştir.

3.2.2.Kan örneklerinin PCR-RLB için hazırlanması ve saklanması

Kan örnekleri EDTA’lı tüp içinde alt üst edilerek donma ve çözülmenin

etkilerinden korumak amacıyla çoklu kullanım gerekmesi olasılığına karşı 1.5 ml’lik

steril eppendorf tüplere bölünerek -20 oC’de saklandı. Soğuk zincir ile taşınarak ADÜ

Veteriner Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı laboratuvarına getirildi ve işlenene kadar

-80 oC’de saklandı.

3.2.3.DNA Ekstraksiyonu

DNA ekstraksiyonu ADÜ Veteriner Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı’nda

herhangi bir kontaminasyonu önlemek amacıyla, kan protozoonu çalışılmayan bir

laboratuvarda aseptik kurallara uyularak yapıldı (69).

DNA örnekleri, -80 oC’de saklanmış olan kanlardan izole edildi. Kan örneği

önce oda sıcaklığında çözdürülerek 10-15 sn. vorteksle karıştırıldı. Tam kandan

genomik DNA izolasyonu, Wizard® Genomic DNA Purifikasyon Kiti (Promega

Corporation,USA) kullanılarak firmanın bildirdiği prosedüre göre yapıldı. Kısaca, 200

µl kan örneği steril 1,5 ml’lik eppendorf tüplere (Axygen,USA) koyularak üzerlerine

32

600 µl cell lysis solüsyonu ilave edilip 5-6 kez alt üst edilerek karıştırıldı. Karışım oda

sıcaklığında 10 dk inkubasyona bırakıldı. İnkubasyon süresince tüpler 2-3 kez alt üst

edildi. İnkubasyon sonunda örnekler mikrosantrifüj cihazında (Eppendorf AG,

Germany) oda ısısında 14,500 x rpm’de 20 sn. santrifüj edildi. Santrifüj sonunda dipteki

çöküntüye dokunulmadan üstteki sıvı uzaklaştırıldı. Donmuş kandan DNA izole edildiği

için dipteki çöküntünün üzerine 600µl cell lysis solüsyonu eklenip 5-6 kez alt üst

edilerek karıştırıldı ve tekrar aynı şartlarda santrifüj edildi. Üstteki sıvı uzaklaştırılarak

dipte kalan çöküntü süspansiyon haline gelene kadar 10-15 sn vortekslendi. Üzerine 200

µl nuclei lysis solüsyonu eklenip 5-6 kez pipetle alt üst edildi. Daha sonra 37 oC’de bir

saat inkubasyona bırakıldı. İnkubasyon sonunda üzerlerine 1 µl RNase solüsyonu

eklenerek 2-3 kez pipetle alt üst edildi ve 37 oC’de 15 dk inkubasyona bırakıldı.

Örnekler oda ısısına getirilerek üzerlerine 70 µl protein presipitasyon solüsyonu

eklenerek 10-20 sn vortekslendi. Daha sonra oda sıcaklığında 14,500 x rpm’de 3 dk

santrifüj edildi. Dipte kalan çöküntüye dokunulmadan üst sıvı alınarak 1,5 ml vida

kapaklı tüplere (Axygen, USA) aktarıldı ve üzerine 200 µl isopropanol (Merck,

Germany) eklendi. Beyaz DNA yumağı oluşuncaya kadar tüp alt üst edildi ve 14,500 x

rpm’de 1 dk santrifüj edildi. Santrifüj sonunda dipte toplanan DNA’ya dikkat edilerek

üstteki kısım döküldü. Üzerine 200 µl %70’lik etanol (Merck, Germany) konarak DNA

yıkandı ve tekrar 14,500 x rpm’de 1 dk santrifüj edildi. Üstteki etanol pipetle dikkatlice

uzaklaştırılarak tüpler temiz kurutma kağıtları üzerine ters çevrilerek kurumaya

bırakıldı. Daha sonra tüplere 70 µl DNA rehidrasyon solüsyonu eklenip 65 oC’de bir

saat inkubasyona bırakıldı. İnkubasyon sonunda DNA, PCR da kullanılmak üzere + 4 oC’de saklandı. Bu aşamada kullanılan madde, kit ve solusyonların ad ve içerikleri

3.3’te verilmiştir.

3.2.4.PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu)

B. canis türüne ait pozitif kontroller ADÜ Veteriner Fakültesi Parazitoloji

Anabilim Dalı’ndan, B. gibsoni türünün pozitif kontrolleri ise Alcalá de Henares

Üniversitesi Mikrobiyoloji ve Parazitoloji Departmanından sağlanmıştır.

Kontaminasyonu önlemek için; stok primer solüsyonlarının sulandırılması,

deoksinükleotit trifosfat (dNTPs) karışımlarının hazırlanması ve PCR karışımının

hazırlanması, ultraviole sterilizasyonu olan laminar akım kabininde (Nüve, Turkey)

33

yapıldı. Bu aşamada kullanılan bütün araç ve gereç (otomatik pipet, taşıma kapları,

vorteks, spin santrifüj vs.) sadece PCR için kullanıldı.

İlk aşama PCR için Theileria ve Babesia soylarında parazitlerin 18S ssu rRNA

(Small Subunit Ribozomal RNA) geninin V4 değişken bölgesinden büyüklüğü 460-540

bp (base pairs= baz çifti) arasında değişen bir parçayı amplifiye eden genel primerler

(RLB- F2: 5'-GAC ACA GGG AGG TAG TGA CAA G-3' ve RLB -R2: biotin-5'-CTA

AGA ATT TCA CCT CTG ACG AT-3') kullanıldı (41). Primerler, özel

modifikasyonlarla sentez yapabilen Thermo Electron GmbH (Germany) firmasına

yaptırıldı. PCR reaksiyon karışımı toplam 40 µl reaksiyon sıvısında;1 x PCR buffer

(10x PCR buffer: 20mM Tris-HCl pH: 8.0, 100mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1mM DTT,

0,5 % Tween® 20, 0,5 % Nonidet P-40 ve 50 % Gliserol) (Promega, USA), 1,25 U

TaqBead Hot start polimeraz (Promega, USA), 2,0 mM MgCl2 (Promega, USA), 200

µM dNTP \ dUTP (200µM herbir dATP,dCTP, dGTP ile 100µM dTTP ve dUTP)

(Roche Diagnostics, Germany), 25 pmol forward ve reverse primerleri (Thermo

Electron GmbH, Germany) olacak şekilde, DNase-free ependorf tüplerinde (Axygen

,USA) hazırlandı. Bu reaksiyon karışımından deneye alınacak örnek sayısı kadar PCR

tüpüne (Axygen,USA) 35µl koyuldu ve üzerlerine karışımın buharlaşmasını engellemek

amacıyla bir damla steril mineral yağ (Sigma-Aldrich, Germany) damlatıldı.

Laboratuarın başka bir bölümünde PCR tüplerine pipetle mineral yağın altına inilmesine

özen gösterilerek 5µl DNA örneği eklendi. Tüpler thermal cycler cihazına (GeneAmp

PCR Sistem 2400, Perkin Elmer, UK) yerleştirilene kadar buz üzerinde bekletildi. PCR

siklusları, 2. siklustan itibaren her iki siklus sonunda bağlanma sıcaklığı 57 oC 'ye inene

dek 2 oC düşecek şekilde (Touchdown PCR) programlandı. PCR şartları Tablo3-2 de

verilmiştir. Her PCR reaksiyonunda bir pozitif kontrol (B. canis pozitif olan köpeğin

kanından elde edilen DNA ), negatif kontrol (Babesia negatif köpek kanından elde

edilen DNA) ve negatif DNA kontrol (5 µl bidistile su) kullanıldı.

34

Tablo 3-2: PCR şartları

3.2.5.PCR Ürünlerinin Görüntülenmesi

Elde edilen PCR ürünlerinin görüntülenmesi için 1x TAE (Tris-Asetat-EDTA)

tamponu ve agaroz ile %2’lik agaroz jel hazırlandı (98). Agaroz jelin soğuması

aşamasında 2µl Ethidium bromide solüsyonu eklenerek karıştırıldı. Jel hazırlandıktan

sonra, örneklerden 10 µl alınıp, 2,5 µl 6x yükleme tamponu (Fermentas, USA) ile

karıştırılarak yatay elektroforez tankına (Bio Rad 1000, USA) yerleştirilen jelin

kuyucuklarına yüklendi ve sabit akımda 90 Voltta (Bio Rad Power Pac 1000, USA) 25

dk yürütüldü. Her jelde ilk kuyucuğa bantların bp değerlerini belirlemek amacıyla 100

1 siklus 95 oC 5 dk.

2 siklus 94 oC 67 oC 72 oC

20 sn. 30 sn. 30 sn.

2 siklus 94 oC 65 oC 72 oC

20 sn. 30 sn. 30 sn.

2 siklus 94 oC 63 oC 72 oC

20 sn. 30 sn. 30 sn.

2 siklus 94 oC 61 oC 72 oC

20 sn. 30 sn. 30 sn.

2 siklus 94 oC 59 oC 72 oC

20 sn. 30 sn. 30 sn.

40 siklus 94 oC 57 oC 72 oC

20 sn. 30 sn. 30 sn.

1 siklus 72 oC 10 dk.

35

bp’lik DNA cetveli (GeneRuler 100bp DNA Ladder, Fermentas) yüklendi. Yine her

jelin birer kuyucuğuna pozitif ve negatif kontroller yüklendi. Jeller UV transilluminatör

üzerine koyularak bantlar görünür hale getirildi ve DNA cetveliyle karşılaştırılarak

beklenen bantlar saptandı. PCR ürünlerinden kalan 30 µl ise daha sonra RLB

hibridizasyonunda kullanılmak üzere +4 oC 'de saklandı. Bu aşamada kullanılan madde

ve solüsyonların ad ve içerikleri 3.3’te verilmiştir.

3.2.6.Reverse Line Blot Hibridizasyonu:

3.2.6.1 Membranın Hazırlanması ve Sentetik Oligonükleotidlerin Membrana Bağlanması:

Laboratuarda blotladığımız (PCR ürünü ile hibrid yapabilecek

oligonükleotidlerin membrana yerleştirilmesi) Biodyne-C membran (PALL Gelman

Laboratory, USA), Matjila ve ark. (75) ile Gubbels ve ark.(43)’nın bildirdiği şekilde

hazırlandı. Kısaca, oda ısısında 10ml, %16 EDAC (1-ethyl-3-(3-dimethylamino-

propyl)carbodiimide) (Sigma,USA) solusyonu ile 10dk membran aktive edildi. Distile

su ile yıkandı ve MN45 miniblottera (Isogen Life Sciences, The Netherlands)

yerleştirildi (Şekil 3-3).

Şekil 3-3: Membranın miniblottera yerleştirilmesi.

Bu aşamada kullanılan oligonükleotidlerin tamamı negatif yüklü Biodyne-C

membrana kovalent olarak bağlanabilmeleri amacıyla 5' terminallerinde amino grubu

[N-terminal N-trifluoracetamidohexyl-cyanoethyl,N,N-diisopropyl phosphoramidite

(TFA)-C6 amino linker] olacak şekilde Thermo Electron GmbH (Germany) firmasına

sentezlettirildi. Oligonükleotidler 500mM NaHCO3 (pH 8.4) içinde 50-900 pmol/150µl

konsantrasyonlarda sulandırıldı (Tablo 3-3). Membran üzerindeki yıkama sıvıları iyice

36

aspire edildikten sonra, her bir oligonükleotidden 150 µl miniblotterın ayrı kanallarına

döküldü ve oda ısısında 1 dk inkübe edildi (Şekil 3-4). Kanallarda bulunan

oligonükleotidlerin solüsyonları aspire edilerek membran miniblotterdan çıkarıldı ve

100mM NaOH içinde 10dk inkübe edilerek inaktive edildi. Son olarak membran 2x

SSPE (Sigma, USA) / %0.1 SDS (Sigma,USA) karışımı ile 60 °C’de 5 dk yıkanarak

kullanıma hazır hale getirildi. Membrana bağlanan oligonükleotidlerin ayrıntılı bilgileri

Tablo3-3’de verilmiştir.

Tablo 3-3: RLB hibridizasyon tekniğinde kullanılmak üzere Biodyne C membrana tutturulan aminolinkerli oligonükleotidlerin 5'-3' dizilişleri

Özgün tür Diziliş (5'-3')a (pmol)* Kaynak

Theileria/Babesia

(CatchAll) TAATGGTTAATAGGARCRGTTG 50 43

B.canis rossi CGGTTTGTTGCCTTTGTG 200 75

B.canis vogeli AGCGTGTTCGAGTTTGCC 400 75

B.canis canis TGCGTTGACGGTTTGAC 400 75

B.gibsoni TACTTGCCTTGTCTGGTTT 900 28

T.annulata CCTCTGGGGTCTGTGCA 100 43

B.bovis CAGGTTTCGCCTGTATAATTGAG 200 43

*Konsantrasyon, a T: thymine; A: adenine; C: cytosine; G: guanine; R: A veya G

3.2.6.2. PCR Ürünlerinin Membrandaki Oligonükleotidlerle Hibridizasyonu:

Bu aşamada iki farklı membran-blot kullanıldı. İlk membran-blot laboratuvarda

tarafımızca hazırlanan (3.2.6.1), ikinci olarak da Isogen tarafından ADÜ Veteriner

Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı’na deneme amaçlı gönderilen TBD-RLB Kit

(Isogen Life Science, Netherland) hazır membran-blotu kullanıldı. Böylece

hazırladığımız membrandaki pozitif örneklerin RLB sonuçları hazır blotla da konfirme

edildi ve pozitif bulunan örneklerde, kendi hazırladığımız membranda oligonükleotidi

37

bulunmayan diğer Babesia ve Theileria türlerinin (B. equi gibi) de bulunup bulunmadığı

kontrol edildi. Ticari membranda bulunan spesifik oligonükleotidler Tablo 3-4.’te

verilmiştir. Hibridizasyon Matjila ve ark. (75) ile Gubbels ve ark.(43)’na göre yapıldı.

Buna göre, önceden elde edilmiş olan PCR ürünlerinden 10'ar µl alınıp 2x SSPE / %0.1

SDS karışımı ile 150µl’ye tamamlanarak 100 °C’de 10 dk thermal cyclerda denatüre

edildi. Denatüre edilen ürünler buz üzerine alınarak kısaca santrifüj edildi (Eppendorf

Ag, Germany). Membran daha önceden uygulanan oligonükleotidlerin tersi yönünde 90

°C çevrilerek miniblottera yerleştirildi. Membran üzerinde kalan fazla sıvılar pipetle

aspire edildi. Denatüre edilen PCR ürünleri ayrı kanallara dökülerek, daha önce ayrı

sıralara dökülmüş oligonükleotidler ile 42 °C’de 1 saat boyunca (çalkalama olmaksızın)

inkübe edilerek hibridize olmaları sağlandı. RLB tekniğinde hibridizasyon prensibi

şematik olarak Şekil 3-4’de verilmiştir.

Tablo 3-4: Ticari membrana kovalent olarak bağlanmış oligonükleotidler

Sıra Türler Sıra Türler1 Ehrlichia/Anaplasma catch-all 19 Babesia canis rossi2 Anaplasma centrale 20 Babesia canis canis3 Anaplasma marginale 21 Babesia canis vogeli4 Anaplasma phagocytophilum 22 Babesia major 5 Anaplasma phagocytophilum 23 Babesia bicornis 6 Anaplasma phagocytophilum 24 Babesia caballi 7 Anaplasma phagocytophilum 25 Theileria sp Kudu8 Ehrlichia ruminantium 26 Theileria sp Sable9 Anaplasma bovis 27 Theileria bicornis10 Ehrlichia chaffeensis 28 Theileria annulata11 Ehrlichia sp (Omatjenne) 29 Theileria buffeli 12 Ehrlichia canis 30 Theileria sp Buffalo13 Theileria/Babesia catch-all 31 Theileria mutans 14 Babesia felis 32 Theileria parva 15 Babesia divergens 33 Theileria taurotragi16 Babesia microti 34 Theileria velifera 17 Babesia bigemina 35 Theileria equi 18 Babesia bovis 36 Theileria lestoquardi

38

Şekil 3-4: RLB hibridizasyonunun şematize prensibi (TBD-RLB Kit Manual, Isogen Life Sciences)

Bu sürenin sonunda kanallardaki solüsyonlar aspire edildi ve membran alınarak

50 °C’de 10 dk 2x SSPE / %0.5 SDS ile iki kez yıkandı. Ardından membran 42 °C’de

30 dk süreyle 10 ml peroksidaz ile işaretlenmiş streptavidin konjugatı (Roche,

Germany) (2x SSPE/ %0.05 SDS ile 1:4000 oranında sulandırılmış) içinde inkubasyona

bırakıldı. İnkübasyondan sonra membran 2x SSPE / %0.5 SDS ile 42 °C’de iki kez 10

dk daha sonra da 2x SSPE ile oda ısısında iki kez 5’er dk yıkandı. Son olarak membran

10 ml ECL tespit sıvısında (Amersham, UK) 1 dk bekletildi. Membran karanlık odada

Kodak Biomax Light Film (USA) altında 30 sn ile 10 dk. arasında tutuldu. Daha sonra

film banyo edildi. Filmler üzerinde oligonükleotidler ve PCR sıralarının kesiştiği

yerlerde oluşan siyah lekeler pozitif olarak kabul edildi (Şekil 3-5). Daha sonra

membran tekrar kullanıma hazır hale getirmek için 80 °C’de %1 SDS solüsyonu ile 30

dk. iki kez yıkandı ve oda sıcaklığında 15 dk 20mM EDTA ile muamele edildikten

sonra tekrar hibridizasyonlarda kullanılmak üzere, üzeri 20mM EDTA ile kaplanarak +4

°C’de saklandı. Bu aşamada kullanılan cihaz ve malzemelerin ad ve içerikleri başlık 3.3

altında verilmiştir.

39

Şekil 3-5: Oligonükleotidler ve PCR ürünlerinin membrana uygulanış şekli ve pozitifliğin oluşması

3.3. Gereç ve Yöntemde kullanılan cihaz ve malzemelerin listesi

Kullanılan Cihazlar

1. Işık mikroskop (Nikon, Japan)

2. Vorteks (Heidolph-Reax 2000, Germany)

3. Mikrosantrifüj (Eppendorf AG, Germany)

4. Su banyosu (Memmert, Germany)

5. Laminar akım kabini (Nüve, Turkey)

6. Thermal cycler (GeneAmp PCR sistem 2400 Perkin Elmer, UK)

7. Yatay elektroforez tankı (Bio Rad 1000 USA)

8. MN45 miniblotter (Isogen Life Sciences, The Netherlands)

9. Etüv (Memmert, Germany)

40

Mikroskopide kullanılan solüsyonlar: Metanol (Merck, Germany)

Giemsa stok solusyonu (Merck, Germany)

Giemsa’nın boya tamponu (BDH, England): 100 ml distile su içine 1 adet tablet

koyularak hazırlandı (pH: 7.2).

DNA ekstraksiyonunda kullanılan kit içeriği: Cell lysis solüsyonu

Nuclei lysis solüsyonu

RNase solüsyonu

Protein presipitasyon solüsyonu

DNA rehidrasyon solüsyonu

Ayrıca kitte bulunmayan isopropanol ve % 70 etanol kullanılmıştır.

PCR Ürünlerinin Görüntülenmesinde kullanılan kimyasal ve solüsyonlar X 50 TAE (Tris-acetate\EDTA Elektroforez) Solüsyonu

Tris 242 g

0,5 M EDTA 100 ml

Distile su ile 1 lt’ye tamamlanır

PH 57,1 ml glasiyel asetik asit ile 7,7- 8,0’a ayarlanır.

Bu stok solüsyondan 10 ml alınarak distile su ile 500 ml ye tamamlandı ve X10 TAE

kullanma solüsyonu hazırlandı.

%2 Agaroz Jel Hazırlanması

Agarose(Sigma) 1,041g

1X TAE Buffer 50 ml

Ethidium Bromide 2µl

41

Ethidium Bromide(10mg/ml) Hazırlanması

Ethidium Bromide 1 g

Distile su 100ml

RLB'de Kullanılan Solüsyonlar 500 mM NaHCO3 (pH 8.4) Hazırlanması

NaHCO3 42,005 g

Distile su ile 1 lt’e tamamlanır.

100 mM NaOH Hazırlanması

NaOH 40,0 g

Distile Su ile 1 lt’e tamamlanır.

20X SSPE Hazırlanması (Sodiumklorür-monosodyumfosfat-EDTA hibridizasyon

buffer)

NaCl 175,3 g

NaH2PO4 - H2O 27,6 g

EDTA 7,4 g

Distile Su 800 ml

Tamamı 1 litre distile suya tamamlanır. PH ~ 6,5 ml 10 N NaOH ile 7,4'e ayarlanır.

10X SDS (Sodyum dodesil sülfat) Hazırlanması

SDS 50,0 g

Distile su ile 500 ml’e tamamlanır.

HCl ile pH 7,2 ye ayarlanır.

42

0,5 M EDTA Hazırlanması (Disodium ethylenediaminetetraacetate.2H2O)

Disodium ethylenediaminetetraacetate.2H2O 186,1 g

Distile su 800 ml

~ 20 g NaOH tanesi ile pH 8.0’e ayarlanır.

% 16 EDAC (1-ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimide) (Sigma,USA):

*EDAC 1,6 g

Distile su ile 10 ml’ye tamamlanır

*Taze olarak hazırlanır.

43

3.4. İstatistik Analiz

Mikroskobik bakı, PCR ve RLB sonuçlarının değerlendirilmesi ki-kare testi ile,

merkezlerin, dişi ve erkek, genç ve yaşlı grupların değerlendirilmesi ‘one-way ANOVA

testi’ üzerine, Tukey’s çoklu karşılaştırması uygulanarak yapılmıştır.

44

4. BULGULAR

4.1.Mikroskobik Bulgular:

Köpeklerden alınan kan örneklerinden hazırlanan yayma preparatlar x1000

büyütmede ışık mikroskobunda incelenmiştir. 493 köpeğin 2 (% 0,4)’sinde Babesia

trofozoitleri görülmüştür (Şekil 4-1). Trofozoitlerin boyutları 4-5 µm arasında (ortalama

4,2 µm ) ölçülmüştür (Mikroskop:Nikon/Japan Program: Image-Pro Plus 5.1). Görülen

Babesia etkenleri morfolojik yapı ve büyüklüklerine göre Babesia canis olarak

tanımlanmıştır (64). Bu iki örnekteki parazitemi oranının % 0,1 ve % 0,32 olduğu tespit

edilmiştir. Mikroskopik bakı sonuçlarının odaklara göre dağılımı Tablo 4-1’de

verilmiştir.

Tablo 4-1: Mikroskopik bakı sonuçlarının odaklara dağılımı

Merkezler Hayvan sayısı Pozitif %

Küçükçekmece 30 - -

Bahçelievler 40 - -

Avcılar 16 - -

Kağıthane 39 - -

Büyükçekmece 35 - -

Zeytinburnu 40 - -

Altınşehir 40 - -

Kemerburgaz 51 - -

Kadıköy 40 - -

Ümraniye 19 - -

Beylikdüzü 20 - -

İ.Ü. 123 2 1,4

Toplam 493 2 0,4

45

Şekil 4-1: Babesia trofozoitlerinin sürme preparatta görünüşleri (x1000 büyütme)

4.2.PCR bulguları

Theileria/Babesia cinslerine spesifik primerler kullanılarak yapılan PCR

sonucunda, 493 kan örneğinin 11 (% 2,2)’inde pozitiflik saptanmıştır. PCR sonuçlarının

odaklara göre dağılımı Tablo 4-2’ de verilmiştir.

Tablo 4-2: PCR sonuçlarının odaklara dağılımı

Merkezler Hayvan sayısı Pozitif %

Küçükçekmece 30 2 6,6

Bahçelievler 40 - -

Avcılar 16 - -

Kağıthane 39 1 2,5

Büyükçekmece 35 1 2,8

Zeytinburnu 40 - -

Altınşehir 40 - -

Kemerburgaz 51 3 5,8

Kadıköy 40 - -

Ümraniye 19 - -

Beylikdüzü 20 - -

İ.Ü. 123 4 2,8

Toplam 493 11 2,2

46

Theileria/Babesia cinsine spesifik primerler ile pozitif bulunan örneklerin

agaroz jel elektroforez görüntüleri, saptanan bantlar, DNA cetveline göre büyüklükleri

Şekil 4-2 ve 4-3’de verilmiştir.

Şekil 4-2: Theileria/Babesia cinslerine spesifik PCR sonucunda pozitif bulunan örneklerin agaroz jel elektroforez görüntüleri. M; DNA cetveli (100 bp), 1-2; pozitif örnekler, 3; negatif örnek, 4; negatif kontrol (köpek DNA’sı), 5; pozitif kontrol, 6; negatif kontrol (su), ok: ∼ 500bp

Şekil 4-3: Theileria/Babesia cinslerine spesifik PCR sonucunda pozitif bulunan örneklerin agaroz jel elektroforez görüntüleri. M; DNA cetveli (100 bp), 1-8;pozitif örnekler,9; pozitif kontrol, 10; negatif kontrol (köpek DNA’sı), 11; DNA negatif kontrol (su),ok: ∼ 500 bp

M 8 9 10 11

M 1 2 3 4 5 6 7

M 1 2 3 4 5 6

47

4.3.RLB bulgular

4.3.1.Laboratuvarda hazırlanan membranın sonucu

Theileria/Babesia cinslerine ait catch-all, B. canis canis, B. canis vogeli,

B. canis rossi, B. gibsoni, T. annulata ve B. bovis kullanılarak yapılan RLB

hibridizasyon sonuçlarına göre, 493 kan örneğinin 19 (% 3,9)’unda B. canis vogeli

bulunmuştur (Şekil 4-4A, Şekil 4-4B, 4-5). RLB sonuçlarının odaklara dağılımı Tablo

4-3’de verilmiştir.

Tablo 4-3: RLB sonuçlarının odaklara dağılımı

Merkezler Hayvan sayısı Pozitif %

Küçükçekmece 30 2 6,6

Bahçelievler 40 - -

Avcılar 16 - -

Kağıthane 39 1 2,6

Büyükçekmece 35 1 2,9

Zeytinburnu 40 - -

Altınşehir 40 - -

Kemerburgaz 51 3 6,0

Kadıköy 40 - -

Ümraniye 19 - -

Beylikdüzü 20 - -

İ.Ü. 123 12 9,8

Toplam 493 19 3,9

48

Şekil 4-4A: Theileria/Babesia cinslerine ait catch-all, B. canis canis, B. canis vogeli, B. canis

rossi, B. gibsoni, T. annulata ve B. bovis oligonükleotidleri kullanılarak hazırlanan

membranda yapılan reverse line blot hibridizasyon sonuçlarının görüntüsü. (Banyo süresi

3 dk) (A); Theileria/Babesia catch-all, (B); Babesia canis canis, (C); Babesia canis vogeli, (D); Babesia canis

rossi, (E); Babesia gibsoni, (F); Theileria annulata, (G); Babesia bovis. 1; Babesia canis vogeli kontrol, 2; Babesia

gibsoni kontrol, 3-21; örnekler, 22; Theileria annulata kontrol, 23; Babesia bovis kontrol.

Şekil 4-4B: Theileria / Babesia cinslerine ait catch-all, B. canis canis, B. canis vogeli, B.

canis rossi, B. gibsoni, T. annulata ve B. bovis oligonükleotidleri kullanılarak hazırlanan

membranda yapılan reverse line blot hibridizasyon sonuçlarının görüntüsü. Banyo süresi

5 dk. (A); Theileria/Babesia catch-all, (B); Babesia canis canis, (C); Babesia canis vogeli, (D); Babesia canis rossi,

(E); Babesia gibsoni kontrol (F); Theileria annulata kontrol, (G); Babesia bovis kontrol.

1; Babesia canis vogeli kontrol, 2; Babesia gibsoni kontrol, 3-21; örnekler, 22; Theileria annulata kontrol, 23; Babesia bovis kontrol.

A B C D E F

G

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

A B C D E

F G

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

49

4.3.2.TBD-RLB Kit hazır membranından elde edilen sonuçlar:

Laboratuvarda hazırladığımız membranda pozitif olarak belirlenen örneklerin

yeniden TBD-RLB membranı ile test edilmesi sonucunda 19 örneğin B. canis vogeli

olduğu bir kez daha teyit edilmiştir. Bunun dışında diğer Theileria veya Babesia

etkenlerinin oligonükleotidleri ile reaksiyon oluşmamıştır.

Şekil 4-5: TBD-RLB (Isogen, Netherland) membranı kullanılarak yapılan RLB hibridizasyon sonuçlarının görüntüsü. (A); kontrol DNA’lar, 1-19; pozitif örnekler

RLB sonucu pozitif köpeklerin yaş ve cinsiyete göre dağılımı Tablo 4-4’te

verilmiştir.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

A

50

Tablo 4-4: RLB sonucu pozitif örneklerin yaş ve cinsiyete göre dağılımı

cinsiyet yaş dişi erkek < 1 > 1

Merkezler

pozitif pozitif pozitif pozitif Küçükçekmece

2 2

Bahçelievler

Avcılar

Kağıthane

1 1

Büyükçekmece

1 1

Zeytinburnu

Altınşehir

Kemerburgaz

3 3

Kadıköy

Ümraniye

Beylikdüzü

İ.Ü. Vet. Fak. Klinikleri

9 3 12

Toplam 12 7 19

51

B. canis vogeli saptanan örneklerin kullanılan tekniklere göre dağılımı

Tablo 4-5’te verilmiştir.

Tablo 4-5: İstanbul ilinde, mikroskopi, PCR ve RLB ile tanımlanan Babesia canis vogeli’nin dağılımı

Küçükçekmece 30 2 2 2/19(10.53)

Bahçelievler 40 - - -

Avcılar 16 - - -

Kağıthane 39 1 1 1/19 (5,26)

Büyükçekmece 35 1 1 1/19 (5,26)

Zeytinburnu 40 - - -

Altınşehir 40 - - -

Kemerburgaz 51 3 3 3/19 (15,79)

Kadıköy 40 - - -

Ümraniye 19 - - -

Beylikdüzü 20 - - -

İ.Ü.Vet.Fak.Kli* 123 2 4 12 12/19(63,16)

Toplam 493 2 11 19 19

* İşaretli merkez ve diğer merkezler arasındaki farklılık istatistiksel olarak anlamlıdır (P<0,01)

Çalışmada incelenen tüm örneklerdeki pozitiflik oranlarına göre mikroskopi,

PCR ve RLB sonuçlarının karşılaştırılması Tablo 4-6’da verilmiştir.

Merkez Hayvan Mikroskopi PCR RLB Toplam (%)

52

Tablo 4-6: B. canis vogeli’nin tanısında mikroskopi, PCR ve RLB bulgularının karşılaştırılması

RLBb TOPLAM

– +

MBa – ; PCRb– 474 8 482

MBa – ; PCRb + 0 9 9

MBa + ; PCRb – 0 0 0

MBa + ; PCRb + 0 2 2

TOPLAM 474 19 493

MB: Mikroskopik bakı

a,b üstsimgelerini taşıyan gruplar arasındaki farklılık istatistiksel olarak anlamlıdır (P<0,001)

53

5. TARTIŞMA

Türkiye’de köpek babesiosisi ile ilgili ilk çalışma, Merdivenci’ye (81) göre,

Ankara’da Piroplasma canis’in mikroskopik olarak bulunduğunu bildiren Gören ve

Yetkin (40, kaynak:78 p.28) tarafından yapılmıştır. Daha sonra, 1961 yılında Ankara’da

bir köpekte Babesia canis’in varlığı mikroskobik olarak bildirilmiştir (87). Aydın ilinde

klinik babesiosis semptomları bulunan 7 köpekte B. canis PCR ile saptanmıştır (110).

Ege bölgesinde yapılan tarama çalışmasında, 383 köpeğin 40 (%10.44) ’ında B. canis

vogeli bulunmuştur (57). İstanbul Üniversitesi Veteriner Fakültesi kliniklerine getirilen

3 köpeğin kan örnekleri, Montpelliere hücre biyolojisi ve moleküler biyoloji

laboratuarına gönderilmiş ve örneklerde görülen Babesia altürleri PCR-RFLP yöntemi

ile B. canis vogeli olarak tanımlanmıştır (45). İstanbul ilinde, kliniklere anemi, yüksek

ateş gibi semptomlarla getirilen köpeklerde kan frotilerinde Babesia etkenlerinin

görüldüğü bilinmektedir. Ancak köpeklerde babesiosisin yaygınlığı ile ilgili bir

çalışmaya rastlanmamıştır. Bu çalışma İstanbul ili köpeklerinde babesiosisin

yaygınlığının moleküler yöntemlerle taranması ve diğer Babesia/Theileria cinsindeki

türlerin araştırılması açısından ilk çalışmadır.

Son yıllarda çeşitli ülkelerde PCR yöntemi ile köpeklerdeki Babesia türlerinin

varlığı araştırılmıştır. Japonya’da 80 köpeğin 5 (% 6.3)’inin B. canis vogeli, 7

(% 8.8)’sinin B. gibsoni ile enfekte olduğu bildirilmiştir (51). Aynı ülkede yapılan diğer

bir araştırmada ise, 115 köpeğin 35 (% 30,4)’inde B. gibsoni enfeksiyonu tespit

edilmiştir (82). Slovenya’da 238 köpeğin 11 (% 4,6)’inde B. canis canis, 3 (% 1,3)’ünde

B. canis vogeli (27); Macaristan’da 44 köpeğin 39 (% 88.6)’unda B. canis canis

bulunmuştur (32); Sudan’da 78 köpeğin 5 (% 6.4)’inde B. canis rossi, 2 (% 2.5)’sinde

B. canis vogeli (86); Avustralya’da 55 köpeğin 22 (% 40)’sinde B. canis vogeli (72);

Brezilya’da ise 10 köpeğin hepsinde B. canis vogeli enfeksiyonu saptanmıştır (88).

Avrupanın değişik ülkelerinden temin edilen ve klinik semptom gösteren 11 köpeğin 10

(% 90)’unun B. canis canis, 1 (% 9)’inin B. canis vogeli ile enfekte olduğu

belirlenmiştir (17). Almanya’da klinik semptom gösteren 5 köpeğin B. canis,

İspanya’da ise 62 köpeğin T. annae ile enfekte olduğu bildirilmiştir (39, 97). Rusya’da

21 semptomlu köpekte B. canis canis (93), Amerika’da 150 köpekten 144’ünde

54

B. gibsoni (% 96) (8), Japonya’da 115 köpekten 35 tanesinde (% 30.4) B. gibsoni (82)

bulunduğu bildirilmiştir.

İstanbul ilinde yapılan bu çalışmada, klinik semptom gösteren 47 köpek

mikroskopik bakı, PCR ve RLB yöntemleri ile Babesia türleri yönünden incelenmiş ve

sırasıyla % 4,25, % 8,51 ve % 25,53 oranında B.canis vogeli saptanmıştır. Klinik belirti

göztermeyen köpeklerde mikroskopik bakı ile parazite rastlanmazken, PCR ve RLB ile

köpeklerin % 1,5’inde babesiosis tespit edilmiş ve enfeksiyona B. canis vogeli’nin

neden olduğu görülmüştür. Saptanan alt tür nadiren klinik semptom oluşturan ve hafif

şiddette enfeksiyona yol açan bir alt türdür (17). Diğer çalışmalarda da semptomsuz

köpeklerde görülme oranı % 1,3 ile % 6,3 arasında değişmektedir (39, 51). Bu

çalışmada rastlanan klinik şüpheli 2 köpeğin kan örnekleri her 3 yöntemle de pozitif

bulunmuştur. Semptomlu köpeklerden alınan kan örneklerinin incelendiği çalışmalarda

(8, 17, 93) % 90 ile % 90,6 arasında Babesia spp. pozitiflik oranı bildirilmiştir.

Köpeklerde piroplasmların RLB tekniği ile araştırılmasında Güney Afrika’da 326

köpekten 31’inde B. canis rossi (% 9,5), 13’ünde B. canis vogeli (% 3,9) (75),

Hollanda’da 23 köpekten 18’inde (% 78,2) B. canis canis bulunmuştur (74). Türkiye’de

ise Ege bölgesinde yapılan tarama çalışmasında B. canis spesifik primerleri kullanılarak

pozitif oldukları belirlenen 40 örneğin, RLB tekniği ile tekrar incelenmesi sonucunda

etkenin B. canis vogeli olduğu saptanmıştır (57).

Bu çalışmada ise toplam 493 köpek RLB ile Babesia türleri yönünden

incelenmiş ve 19 köpeğin B. canis vogeli ile enfekte olduğu bulunmuştur. Pozitif

örneklerin tamamının B. canis vogeli olması vektör kene Rhipicephalus sanguineus’un

Türkiye’de yaygın olarak bulunması (80) ile ilgili olabilir. Ancak aynı kene B.

gibsoni’nin de vektörü olmakla birlikte bu çalışmada B. gibsoni bulunamamıştır. Aynı

sonuç Ege Bölgesinde yapılan çalışmada da (57) gözlenmiştir ve yazar bu durumu,

sadece Babesia canis spesifik primerleri ile pozitif bulduğu örnekleri RLB ile incelediği

için B. gibsoni’ye rastlama şansının olmadığı şeklinde açıklamıştır. Ancak bu çalışmada

toplanan tüm kan örnekleri, RLB ile köpeklerdeki Babesia tür ve alt türleri yönünden

incelenmiş ve B. canis vogeli dışında diğer tür ve alt türlere rastlanmamıştır. Daha önce

Türkiye’de yapılan araştırmalarda da köpeklerde sadece B. canis vogeli’nin varlığı

bildirilmiştir (45, 57, 110).

55

Babesia türleri konak özgüllüğüne sahip oldukları için, ayırıcı tanı olarak

konaklarına göre tanıdan uzun süre yararlanılmıştır. Ancak son yıllarda B. microti’ ye

insanlarda ve primatlarda da rastlandığı, sığırlarda görülen B. divergens’in gerbil ve

insanlarda da görüldüğü bildirilmiştir (22, 106). Babesia gibsoni Kaliforniya izolatının

insan piroplasmlarına yakın genotipik ve antijenik yapıları olduğu, İspanya izolatının ise

B. microti’ye yakın olduğu bildirilmiştir (117). Babesia gibsoni ve B. microti

morfolojik benzerliklerinden dolayı mikroskobik tanıda ayırt edilemezler, serolojik

testlerde de çapraz reaksiyon verirler (22). Bu durum, moleküler yöntemlerin önemini

artırmaktadır. Ayrıca, moleküler teknikler ile son yıllarda köpeklerde T. annae ve

B. conradae gibi yeni etkenler tanımlanmıştır (58, 117). İstanbul ilinde yapılan bu

çalışmada, köpeklerde bulunabilecek Babesia ve Theileria türleri RLB ile araştırılmış

ve B. canis vogeli dışında diğer Babesia ve Theileria tür ve alt türlerine rastlanmamıştır.

Günümüzde moleküler tanı yöntemleri, bilinen klasik PCR yöntemlerinden,

DNA oligonükleotidleri memranda kullanılması gibi daha gelişmiş tekniklere kadar

çeşitlilik gösterir (43). Bu yöntemlerden kantitatif olanlar kullanılarak parazitler

hakkında sayısal anlamda da bilgi sağlanmasına karşın, sekans analizleri için

örneklerden bazıları seçildiği için kalitatif anlamda daha az bilgiye ulaşılır (24).

Moleküler tekniklerin tanıdaki bir özelliği de klinikte görülen parazitler üzerine

yoğunlaşmaları ve az görülen veya yeni bulunan parazitlerin tanısını

sağlayamamalarıdır (Atlarda B. equi, köpeklerde B. canis gibi). RLB tekniği ile farklı

cins ve türlerdeki piroplasmları aynı anda teşhis edebilmesi ve ayrımlarını yapabilmesi

özelliğinden dolayı bu güçlükler kısmen aşılmıştır (43). Bu teknikte de hibridizasyon

için belirli oligonükleotidler eklenmesi gerektiğinden yeni piroplasmların teşhis

edilemeyeceği belirtilmektedir (24). Ancak catch-all aşamasında pozitif bulunan

örneklerin membrandaki herhangi bir oligonükleotidle hibridize olmadığı ve sinyal

görülmediği durumlarda bu örnekler sekanslanarak yeni türlerin saptanabilme şansı

vardır. Çalışmamızda değerlendirilen 493 örnekten catch-all aşamasında pozitif bulunan

19 tanesi B.canis vogeli oligonükleotidiyle sinyal oluşturmuştur ve yeni bir türe

rastlanmamıştır.

İspanya’da seminested PCR ile yapılan çalışmada köpeklerde B. canis canis,

B. canis vogeli ve T. annae, 3 semptomsuz ve 1 adet semptomlu köpekte de ilk kez

B. equi bulunmuştur. Aynı çalışmada 1 atta da B. canis canis saptanmıştır. Bu örnekler

56

mikroskobik olarak incelendiğinde parazite rastlanmamıştır. Örneklerin karışmış olma

ihtimali tekrarlı yapılan PCR ile yok edilmiştir. Daha önce B. equi’nin köpeklerde

bildirilmemiş olması B. equi ile B. gibsoni’nin mikroskobik olarak ayrımlarının

yapılamamasından kaynaklanabilir (91, 118). Aynı şekilde daha önce atlarda B. canis

canis bulunamamasının da B. canis ile B. caballi’nin morfolojik olarak birbirinden

ayırt edilememesinden kaynaklandığı olabilir (91). Yeni parazitlerin, genotiplerin ya da

parazitlerin yeni konaklarının saptanması moleküler teknikler ile mümkün olmaktadır

(25). Köpeklerde babesiosisin tanısında kullanılan mikroskobik muayene ve serolojik

yöntemler tür ve alt tür ayrımlarında yeterli değildir. Mikroskobik muayene

piroplasmların genetik yapısını belirlemede kullanılamaz. Antikora dayalı tanı

yöntemleriyle ise çapraz reaksiyon nedeniyle Babesia tür ve alt türlerini kesin olarak

ayırt etmek mümkün değildir. Köpeklerde babesiosis etkenlerinin mikroskobik olarak

teşhis edilemeyeceğini ve ayrıca serolojik yöntemlerin de yanlış negatif sonuçlar

verdiğini gösteren yayınlar vardır (9, 11, 16). Dezavantajları olmakla birlikte PCR

yöntemleri değişik Babesia türleriyle oluşan enfeksiyonların tanı ve ayrımlarında pratik

bir yöntemdir. Aynı zamanda tedavi sonuçlarının belirlenmesinde de duyarlıdır (9).

PCR, mikroskobik muayene ve serolojik yöntemlere göre daha duyarlı bir tanı

yöntemidir (9, 14). Bu çalışmada incelenen 493 köpeğin mikroskobik olarak 2 tanesinde

(% 0,4) B. canis, PCR ile 11 tanesinde (% 2,2) Babesia/Theileria cins düzeyinde

pozitiflik, RLB ile 19 tanesinde (% 3,9) B. canis vogeli saptanmıştır. Kullanılan

yöntemler arasında, mikroskobi ile PCR ve RLB sonuçları arasındaki farklılık

istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (P<0, 001).

PCR yöntemleri ile yapılan çalışmalarda hem köpeklerdeki parasiteminin

dalgalanmaları hem de yöntemlerin standardize olmaması nedeniyle duyarlılık

karşılaştırması yapılamamaktadır. Babesia türlerinin PCR ile tanısı konusunda yapılan

çalışmaların büyük çoğunluğunda tanı alt limiti saptanmamıştır. Sadece Fukumoto ve

arkadaşları köpeklerde B. gibsoni’nin tanısında uyguladıkları PCR tanı alt limitini

bildirmişlerdir (36). PCR ile yapılan çalışmalarda en küçük saptanabilecek parasitemi

yüzdesini bildiren çalışmalar olmakla birlikte (9, 17, 19, 59, 60, 116) parasitemideki

dalgalanmalar ve teknik farklılıkları nedeniyle bu tip sonuçları birbiriyle karşılaştırmak

mümkün olmamaktadır. Ancak deneysel şartlarda oluşturulan enfeksiyonlardan alınan

standart örneklerin eş zamalı olarak farklı PCR tipleri ile değerlendirilmesi ile güvenilir

57

sonuçlar elde edilebilir. Çalışmamızda da tanı alt limiti ve yönteme dayalı olarak en

küçük saptanabilecek parasitemi yüzdesi belirlenmemiştir.

Köpeklerdeki piroplasmların yayılışı ile ilgili olarak, dişi ve erkek hayvanlar ya

da 1 yaşından genç ve yaşlı hayvanlar arasında enfeksiyon oranları arasında

karşılaştırma sonuçları bildirilen bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu çalışmada dişi ve

erkek hayvanlar arasında enfeksiyon oranı bakımından anlamlı bir fark bulunmamıştır.

Bir yaşından küçük hayvanlarda enfeksiyona rastlanmazken, bir yaşından büyük

hayvanlarda enfeksiyon oranının % 5,5 olması ise istatiksel olarak anlamlı bulunmuştur

(P<0,01). Babesia canis vogeli ile enfekte olan hayvanların % 63,16’sı İ.Ü. Veteriner

Fakültesi kliniklerinde, % 15,79’u Kemerburgazda, % 5,26’sı Büyükçekmecede,

% 5,26’sı Kağıthane’de ve % 10,53’ü Küçükçekmece’de saptanmıştır. En yüksek oranın

İ.Ü. Veteriner Fakültesi kliniklerinde saptanması, burada kan örneği alınan köpeklerin

klinik şüphe nedeniyle getirilmiş olmasını düşündürmektedir.

Son yıllarda yapılan çalışmalar köpekleri enfekte eden piroplasmların,

bilinenden daha fazla olduğu yönündedir (44). Bu çalışma ile moleküler teknikler içinde

PCR’a göre daha duyarlı ve özgül bir teknik olan RLB ile köpeklerin Babesiaları

araştırılmış ve sonuçlar mikroskobik tanı ve PCR ile edilen sonuçlar ile

karşılaştırılmıştır. Sonuçlara göre mikroskopide negatif olan 9 örnek PCR sonucunda

pozitif, PCR da negatif olan 8 örnek de RLB sonucunda pozitif bulunmuş ve RLB

tekniğinin en duyarlı yöntem olduğu görülmüştür. Bu çalışmada İstanbul ilindeki

köpeklerde ilk kez babesiosis etkenleri yönünden tarama yapılarak, Theileria ve Babesia

cinslerinde bulunan kan protozoonları spesifik oligonükleotidlerle araştırılmıştır.

Sonuç olarak, bu çalışmada İstanbul ili köpeklerinde babesiosisin % 3,9

oranında yaygın olduğu, enfeksiyonların B. canis vogeli’ den kaynaklandığı

görülmüştür.

58

KAYNAKLAR

1. Adachi, K., Tateishi, M., Horii Y., Nagatomo, H., Shimizu, T., Makimura,

S. Immunologic characteristics of antierythrocyte membrane antibody produced in dogs

during Babesia gibsoni infection. J Vet Med Sci. 1995; 57: 121-123.

2. Anderson, J.F., Magnarelli, L.A., Sulzer, A.J. Canine babesiosis: indirect

fluorescent antibody test for a North American isolate of Babesia gibsoni. Am J Vet Res.

1980; 41(12):2102-2105.

3. Ano, H., Makimura, S., Harasawa, R., Detection of babesia species from

infected dog blood by polymerase chain reaction. J Vet Med Sci. 2001; 63(1):111-113.

4. Arai, S., Tsuji, M., Kim, S.J., Nakade, T., Kanno, Y., Ishihara, C. Babesia

canis infection in canine-red blood cell-substituted SCID mice. Int J Parasitol. 1998;

28(9):1429-1435.

5. Baneth, G., Breitschwerdt, E.B., Hegarty, B.C., Pappalardo, B., Ryan, J. A

survey of tick-borne bacteria and protozoa in naturally exposed dogs from Israel. Vet

Parasitol. 1998; 74(2-4):133-142.

6. Baneth, G., Kenny, M.J., Tasker, S., Anug, Y., Shkap, V., Levy, A., Shaw,

E.S. Infection with a proposed new subspecies of Babesia canis, Babesia canis subsp.

presentii, in domestic cats. Journal of Clin Microbiol. 2004; 42(1):99-105.

7. Bicalho, K.A., Ribeiro, M.F.B., Martins-Filho, O.A., Molecular fluorescent

approach to assessing intraerythrocytic hemoprotozoan Babesia canis infection in dogs.

Vet Parasitol. 2004; 125(3-4):221-235.

8. Birkenheuer, A.J., Correa, M.T., Levy, M.G., Breitschwerdt, E.B.

Geographic distribution of babesiosis among dogs in the United States and association

with dog bites: 150 cases (2000-2003). J Am Vet Med Assoc. 2005; 15:227(6):942-947.

9. Birkenheuer, A.J., Levy, M.G., Breitschwerdt, E.B. Development and

evaluation of a seminested PCR for detection and differentiation of Babesia gibsoni

(Asian genotype) and B. canis DNA in canine blood samples. J Clin Microbiol. 2003;

41(9):4172-4177.

59

10. Birkenheuer, A.J., Neel, J., Ruslader, D., Levy M.G., Breitschwerdt, E.B.

Detection and molecular charecterization of a novel large Babesia Species in a dog. Vet

Parasitol. 2004; 124(3-4):151-160.

11. Birkenheuer, A.J., Levy, M.G., Savary, K.C., Gager, R.B., Breitschwerdt,

E.B. Babesia gibsoni infections in dogs from North Carolina. J Am Anim Hosp Assoc.

1999; 35(2):125-128.

12. Blood, D.C., Otto, M.R., Gay, C.C., Radostits, O.M., editorler. Veterinary

Medicine: A Textbook of the Diseases of Cattle, Sheep, Pigs, Goats and Horses. 7nd ed.

London: Bailliere Tindall; 1994.

13. Boozer, A.L., Macintire, D.K. Canine babesiosis. Vet Clin North Am Small

Anim Pract. 2003; 33(4):885-904.

14. Bose, R., Jorgensen, W.K., Dalgliesh, R.J., Friedhoff, K.T., de Vos, A.J.

Current state and future trends in the diagnosis of babesiosis. Vet Parasitol. 1995; 57(1-

3):61-74.

15. Brandao, L.P., Hagiwara, M.K., Myiashiro, S.I. Humoral immunity and

reinfection resistance in dogs experimentally inoculated with Babesia canis and either

treated or untreated with imidocarb dipropionate. Vet Parasitol. 2003; 114(4):253-265.

16. Breitschwerdt, E.B., Malone, J.B., MacWilliams, P., Levy, M.G., Qualls,

C.W., Jr, Prudich, M.J. Babesiosis in the Greyhound. J Am Vet Med Assoc. 1983;

182(9):978-982.

17. Caccio, S.M., Antunovic, B., Moretti, A., Mangili, V., Marinculic, A., Baric,

R.R., Slemenda, S.B., Pieniazek, N.J., Molecular characterisation of Babesia canis

canis and Babesia canis vogeli from naturally infected European dogs. Vet Parasitol.

2002; 106(4):285-292.

18. Camacho, A.T., Pallas, E., Gestal, J.J., Guitian, F.J., Olmeda, A.S., Goethert,

H.K., Telford, S.R. Infection of dogs in north-west Spain with a Babesia microti-like

agent. Vet Rec. 2001; 149(18):552-5.

19. Carret, C., Walas, F., Carcy, B., Grande, N., Precigout, E., Moubri, K.,

Schetters, P.T., Gorenflot, A., Babesia canis canis, Babesia canis vogeli, Babesia canis

rossi: differentiation of the three subspecies by a restriction fragment length

60

polymorphism analysis on amplified small subunit ribosomal RNA genes. J Eukaryot

Microbiol. 1999; 46(3):298-303.

20. Casapulla, R., Baldi, L., Avallone, V., Sannino, R. Pazzanese, L., Mizzoni,

V. Canine piroplasmosis due to Babesia gibsoni: clinical and morphological aspects.

Vet Rec. 1998; 142(7):168-169.

21. Centeno-Lima, S., do Rosario, V., Parreira, R., Maia, A.J., Freudenthal,

A.M., Nijhof, A.M., Jongejan, F. A fatal case of human babesiosis in Portugal:

molecular and phylogenetic analysis. Trop Med Int Health. 2003; 8(8):760-764.

22. Conrad, P., Thomford, J., Yamane, I., Whiting, J., Bomsa, L., Uno, T.,

Holshuh, H.J.,Shelly, S. Hemolytic anemia caused by Babesia gibsoni infection in dogs.

J Am Vet Med Assoc. 1991; 199(5):601-605.

23. Criado-Fornelio, A., Gonzalez-del-Rio, M.A., Buling-Sarana, A., Barba-

Carretero, J.C. Molecular characterization of a Babesia gibsoni isolate from a Spanish

dog. Vet Parasitol. 2003; 117(1-2):123-129.

24. Criado-Fornelio, A., Martinez-Marcos, A., Buling-Sarana, A. Barba-

Carretero, J.C., Molecular studies on Babesia, Theileria and Hepatozoon in southern

Europe. Part I. Epizootiological aspects. Vet Parasitol. 2003a; 113(3-4):189-201.

25. Criado-Fornelio, A., Martinez-Marcos, A., Buling-Sarana, A. Barba-

Carretero, J.C., Molecular studies on Babesia, Theileria and Hepatozoon in southern

Europe. Part II. Phylogenetic analysis and evolutionary history. Vet Parasitol. 2003b;

114(3):173-194.

26. Criado-Fornelio, A., Martinez-Marcos, A., Buling-Sarana, A. Barba-

Carretero, J.C., Presence of Mycoplasma haemofelis, Mycoplasma haemominutum and

Proplasmids in cats from Southern Europe: A molecular study. Vet Microbiol. 2003;

93:307-317.

27. Duh, D., Tozon, N., Petrovec, M., Strasek, K., Avsic-Zupanc, T. Canine

Babesiosis in Slovenia: Molecular evidence of Babesia canis canis and Babesia canis

vogeli. Vet Res. 2004; 35(3):363-8.

28. EMBO/ICTTD-2 Workshop kitapçığı, Güney Afrika 2003.

61

29. Erganiş O., Uçan U.S. Veteriner Epidemiyoloji. 2nd ed. Konya . Mimoza

yayınları; 2001.

30. Farwell, G.E., LeGrand, E.K., Cobb, C.C. Clinical observations on Babesia

gibsoni and Babesia canis infections in dogs. J Am Vet Med Assoc. 1982 ; 180(5):507-

511.

31. Figueroa, J.V., Chieves, L.P., Johnson, G.S., Buening, G.M. Multiplex

polymerase chain reaction based assay for the detection of Babesia bigemina, Babesia

bovis and Anaplasma marginale DNA in bovine blood. Vet Parasitol. 1993; 50(1-2):69-

81.

32. Foldvari, G., Hell, E., Farkas, R. Babesia canis canis in dogs from Hungary:

detection by PCR and sequencing. Vet Parasitol. 2005; 127(3-4):221-226.

33. Freeman, M.J., Kirby, B.M., Panciera, D.L., Henik, R.A., Rosin, E.,

Sullivan, L.J. Hypotensive shock syndrome associated with acute Babesia canis

infection in a dog. J Am Vet Med Assoc. 1994; 204(1):94-6.

34. Fukata, T., Ohnishi, T., Okuda, S., Sasai, K., Baba, E., Arakawa, A.

Detection of canine erythrocytes infected with Babesia gibsoni by flow cytometry. J

Parasitol. 1996; 82(4):641-642.

35. Fukumoto, S., Suzuki, H., Igarashi, I., Xuan, X. Fatal experimental

transplacental Babesia gibsoni infections in dogs. Int J Parasitol. 2005; 35(9):1031-

1035.

36. Fukumoto, S., Xuan, X., Kadota, K., Igarashi, I., Sugimoto, C., Fujisaki, K.,

Nagasawa, H., Mikami, T., Suzuki, H. High-level expression of truncated surface

antigen P50 of Babesia gibsoni in insect cells by baculovirus and evaluation of its

immunogenicity and antigenicity. Clin Diagn Lab Immunol. 2003; 10(4):596-601.

37. Fukumoto, S., Xuan, X., Shigeno, S., Kimbita, E., Igarashi, I., Nagasawa,

H., ve ark. Development of a polymerase chain reaction method for diagnosing Babesia

gibsoni infection in Dogs. J Vet Med Sci. 2001; 63(9):977-981.

38. Furlanello, T., Fiorio, F., Caldin, M., Lubas, G., Solano-Gallego, L.

Clinicopathological findings in naturally occurring cases of babesiosis caused by large

form Babesia from dogs of northeastern Italy. Vet Parasitol. 2005; 134(1-2):77-85.

62

39. Garcia, A.T. Piroplasma infection in dogs in northern Spain. Vet Parasitol.

2006; 31:138(1-2):97-102.

40. Gören, S., Yetkin, R. Tektırnaklıda, sığırda, koyunda, keçide ve köpekte

piroplasmoz. M.M.B. Bakt. Evi Yayını.Ulus Basımevi, 1935.Ankara.

41. Georges, K., Loria, G. R., Riili, S., Greco, A., Caracappa, S., Jongejan, F.,

Sparagano, O. Detection of haemoparasites in cattle by reverse line blot hybridisation

with a note on the distribution of ticks in Sicily. Vet Parasitol. 2001; 99(4):273-286.

42. Glaser, B., Gothe, R. Imported arthropod-borne parasites and parasitic

arthropods in dogs. Species spectrum and epidemiologic analysis of the cases diagnosed

in 1995/96. Tierarztl Prax Ausg K Klientiere Heimtiere. 1998; 26(1):40-46.

43. Gubbels, J.M., De Vos, A.P., Van Der Weide, M., Viseras, J., Schouls, L.M,

Jongejan, F. Simultaneous detection of bovine Theileria and Babesia species by

Reverse Line Blot Hybridization. Journal of Clin Microbiol. 1999; 37(6) 1782-1789.

44. Guitian, F.J., Camacho, A.T., Telford, S.R. Case-control study of canine

infection by a newly recognised Babesia microti-like piroplasm. Prev Vet Med. 2003;

61(2):137-145.

45. Gulanber, A., Gorenflot, A., Schetters, T.P., Carcy, B. First molecular

diagnosis of Babesia vogeli in domestic dogs from Turkey. Vet Parasitol. 2006 Baskıda.

46. Hauschild, S., Schein, E. The subspecies specificity of Babesia canis. Berl

Munch Tierarztl Wochenschr. 1996; 109(6-7):216-219.

47. Hauschild, S., Shayan, P., Schein, E. Characterization and comparison of

merozoite antigens of different Babesia canis isolates by serological and immunological

investigations. Parasitol Res. 1995; 81(8):638-642.

48. Hagan W.A., Burney D.W., editörler. The Infectious Diseases of Domestic

Animals. 2nd ed. New York. Cornell University Press.1951.

49. Hazıroğlu R., Hematopoietik Sistem İçinde Veteriner Patoloji Cilt 2: Milli

M., Hazıroğlu R. Medipress yayınları Ankara 2000.

50. Inokuma, H., Yoshizaki, Y., Shimada, Y., Sakata, Y., Okuda, M., Onishi, T.

Epidemiological survey of Babesia species in Japan performed with specimens from

63

ticks collected from dogs and detection of new Babesia DNA closely related to Babesia

odocoilei and Babesia divergens DNA. J Clin Microbiol. 2003; 41(8):3494-3498.

51. Inokuma, H., Yoshizaki, Y., Matsumoto, K., Matsumoto, K., Okuda, M,

Onishi, T., Nakagome, K., Kosugi, R., Hirakava, M. Molecular survey of Babesia

infection in dogs in Okinawa, Japan. Vet Parasitol. 2004; 121(3-4):341-346.

52. Irwin, P.J., Hutchinson, G.W. Clinical and pathological findings of Babesia

infection in dogs. Australian Vet Journal. 1991; 68(6) 204-209.

53. Jacobson, L.S. The South African form of severe and complicated canine

babesiosis: Clinical advances 1994-2004. Vet Parasitol. 2006; 138(1-2):126-139.

54. Jacobson, L.S., Clark, I.A. The pathophysiology of canine babesiosis: new

approaches to an old puzzle. J S Afr Vet Assoc. 1994; 65(3):134-145.

55. Kaufhold, A., Padbelski, A., Baumgarten, G., Blokpoel, M., Top, J.,

Schouls, L. Rapid typing of group A streptococci by the use of DNA amplification and

non-radioactive allele-specific oligonucleotide probes. FEMS Microbiol Lett. 1994;

119(1-2):19-25.

56. Kettner, F., Reyers, F., Miller, D. Thrombocytopaenia in canine babesiosis

and its clinical usefulness. J S Afr Vet Assoc. 2003; 74(3):63-8.

57. Kırlı, G., Ege Bölgesi’nde köpek Babesiosis’inin yaygınlığı. Yüksek Lisans

Tezi. 2006. Aydın.

58. Kjemtrup A.M., Conrad, A.P. A review of the small canine Piroplasms from

California: Babesia conradae in the literature. Vet Parasitol. 2006; Baskıda.

59. Kjemtrup, A.M., Kocan, A.A., Whitworth, L., Meinkoth, A.J., Birkenheuer,

A.J., Cummings, J., Boudreaux, M.K., Stockham, S.L., Irizarry-Rovira, A., Conrad, A.

There are at least three genetically distinct small piroplasms from dogs. Int J Parasitol.

2000; 30(14):1501-1505.

60. Kocan, A.A., A. Kjemtrup, J. Meınkoth, L.C. Whıtworth, G.L. Murphy, L.

Decker, M. Lorenz, A genotypically unique Babesia gibsoni-like parasite recovered

from a dog in Oklahoma. J Parasitol. 2001; 87(2):437-438.

61. Kraje, A.C., Canine Haemobartonellosis and Babesiosis. Small

Animal/Exotics. 2001; 23(4):310-318.

64

62. Kreier PJ editor. Parasitic Protozoa. New York: Academic Press; 1977.

63. Kuttler, K.L. World-wide impact of babesiosis.. İçinde, Ristic, M, editor.

Babesiosis of Domestic Animals and Man. CRC Press, 1988.

64. Levine N.D., editor. Protozoan Phylum Apicomplexa: v. 2. US, CRC Press

Inc., 1988.

65. Levy, M.G., Breitschwerdt, E.B., Moncol, D.J. Antibody activity to Babesia

canis in dogs in North Carolina. Am J Vet Res. 1987; 48(3):339-341.

66. Lewis, B.D., Penzhorn, B.L., Lopez Rebollar, L.M. Immune responses to

South African Babesia canis and the development of a preliminary vaccine. J S Afr Vet

Assoc. 1995; 66(2):61-5.

67. Lewis, B.D., Penzhorn, B.L., Lopez-Rebollar, L.M., De Waal, D.T. Isolation

of a South African vector-specific strain of Babesia canis. Vet Parasitol. 1996; 63(1-

2):9-16.

68. Ludford, C.G. Fluorescent antibody staining of four Babesia species. Exp

Parasitol. 1969; 24(3):327-35.

69. Lysby, G. Application of nucleic acid amplification in clinical microbiology.

İçinde: Meltzer, S., editor. Clinical method molecular biology: PCR in Bioanalysis.

Totowa, NJ: Human Press Inc; 1999. pp. 1-29.

70. Macwilliams, P.S., Erythrocytic Rickettsia and Protozoa of the dog and cat.

Vet Clin North Am Small Anim Pract. 1987; 17(6):1443-1461.

71. Marquart, W.C., Demaree, R.C, Grieve, B.R., editorler. Parasitology and

Vector Biology. 2nd ed. London. Harcourt Academic Press.

72. Martin, A.R., Dunstan, R.H., Roberts, T.K., Brown, G.K. Babesia canis

vogeli: a novel PCR for its detection in dogs in Australia. Exp Parasitol. 2006;

112(1):63-5.

73. Martinod, S., N. Laurent, Y. Moreau. Resistance And Immunity Of Dogs

Against Babesia canis İn An Endemic Area. Vet. Parasitol. 1986. 19 245-254.

65

74. Matjila, P.T., Nijhof, A.M., Taoufik, A., Houwers, D., Tekse, E., Penzhorn,

ve ark. Autochthonous canine babesiosis in The Netherlands. Vet Parasitol. 2005;

131(1-2):23-29.

75. Matjila, P.T., Penzhorn, B.L., Bekker, C.P.J., Nijhof, A.M., Jongejan, F.

Confirmation of occurrence of Babesia canis vogeli in domestic dogs in South Africa.

Vet Parasitol. 2004; 122(2):119-125.

76. Matsuu, A., Kawabe, A., Koshida, Y., Ikadai, H., Okano, S., Higuchi, S.

Incidence of canine Babesia gibsoni infection and subclinical infection among Tosa

dogs in Aomori Prefecture, Japan. J Vet Med Sci. 2004; 66(8):893-897.

77. Mehlhorn, H., Bunnag, D., E. Curio, J.F editörler. Parasitology in Focus,

Springer-Verlag. 1988 .

78. Mehlhorn, H., Shein, E. The piroplasms: life cycle and sexual stages. Adv

Parasitol. 1984; 23:37-103.

79. Melhorn H. 2001.Encylopedic reference of parasitology. Diseases,

Treatment,Therapy.2nd.ed,Heidelberg:Springer(http:parasitology.informatik.uni-

wuerzberg.de/login/frame.php Erişim:05.04.2006)

80. Merdivenci A., Türkiye Keneleri Üzerine Araştırmalar. 1969. Kutulmuş

Matbaası, İstanbul.

81. Merdivenci A. Türkiye parazitleri ve parazitolojik yayınları.1970. Kutulmuş

Matbaası, İstanbul.

82. Miyama, T., Sakata, Y., Shimada, Y., Ogino, S., Watanabe, M., Itamoto, K.,

Okuda, M., Verdida, R.A., Xuan, X., Nagasawa, H., Inokuma, H. Epidemiological

survey of Babesia gibsoni infection in dogs in eastern Japan. J Vet Med Sci. 2005;

67(5):467-471.

83. Muhlnickel, C.J., Jefferies, R., Morgan-Ryan, U.M., Irwin P.J. Babesia

gibsoni infection in three dogs in Victoria. Aust Vet J. 2002; 80(10):606-610.

84. Navarrete, I., Nieto, L., Babesiosis, hepatozoonosis, citauxzonoonosis felina.

İçinde Cordero-del-Campillo, M., Rojo-Vazquez, F.A., editorler. Parasitologia

Veterinaria. Madrid: McGraw-Hill/Interamericana; 1999. pp. 672-678.

66

85. Nijhof, A.M., Penzhorn, B.L., Lynen, G., Mollel, J.O., Morkel, P., Bekker,

C.P., Jongejan, F. Babesia bicornis sp. nov. and Theileria bicornis sp. nov.: tick-borne

parasites associated with mortality in the black rhinoceros (Diceros bicornis). J Clin

Microbiol. 2003; 41(5):2249-2254.

86. Oyamada, M., Davoust, B., Boni, M., Dereure, J., Bucheton, B., Hammad,

A., ve ark. Detection of Babesia canis rossi, B. canis vogeli, and Hepatozoon canis in

dogs in a village of eastern Sudan by using a screening PCR and sequencing

methodologies. Clin Diagn Lab Immunol. 2005; 12(11):1343-1346.

87. Özcan, C.H., Ankara ve civarında evcil hayvanlarda görülen Piroplasmose

vakaları ve tedavileri üzerinde araştırmalar. Ankara Üniversitesi Basımevi. 1961; 10-

106.

88. Passos, L.M., Geiger, S.M., Ribeiro, M.F., Pfister, K., Zahler-Rinder, M.

First molecular detection of Babesia vogeli in dogs from Brazil. Vet Parasitol. 2005;

127(1):81-85.

89. Penzhorn, B.L., Lewis, B.D., de Waal, D.T., Lopez Rebollar, L.M.

Sterilisation of Babesia canis infections by imidocarb alone or in combination with

diminazene. J S Afr Vet Assoc. 1995; 66(3):157-159.

90. Persing, D.H., Mathiesen D., Marshall W.F., Telford, R.S. Spielman, A.,

Thomford, W.J., Conrad, P.A. Detection of Babesia microti by PCR. J Clin Microbiol.

1992; 30(8):2097-2103.

91. Purnell, R.E., Babesiosis in various hosts. İçinde Ristic, M., Kreier, J.P.,

editörler. Babesiosis. New York: Academic Press; 1981. pp. 25-63.

92. Quinn, P.J., Donnely, W.J.C., Carter, M.E., Markey, B.K.J., Torgenson,

P.R., Breathnach, R.M.S., editorler. Microbial and parasitic diseases of the dog and cat.

London: Saunders. 1997.

93. Rar, V.A., Maksimova, T.G., Zakharenko, L.P., Bolykhina, S.A.,

Dobrotvorsky, A.K., Morozova, O.V. Babesia DNA detection in canine blood and

Dermacentor reticulatus ticks in southwestern Siberia, Russia. Vector Borne Zoonotic

Dis. 2005; 5(3):285-287.

67

94. Reyers, F., Leisewitz, A.L., Lobetti, R.G., Milner, R.J., Jacobson, L.S., van

Zyl, M. Canine babesiosis in South Africa: more than one disease. Does this serve as a

model for falciparum malaria? Ann Trop Med Parasitol. 1998; 92(4):503-511.

95. Rijpkema, S.G., Molkenboer, M.J., Schouls, L.M., Jongejan, F., Schellekens,

J.F. Simultaneous detection and genotyping of three genomic groups of Borrelia

burgdorferi sensu lato in Dutch Ixodes ricinus ticks by characterization of the amplified

intergenic spacer region between 5S and 23S rRNA genes. J Clin Microbiol. 1995;

33(12):3091-3095.

96. Roberts S.L., Janovy J.J., editor. Foundations of Parasitology. 7th ed. New

York: McGraw Hill: 2005.

97. Sager, H., Casati, S., Hartmeier, G., Sommer, B. Autochthonous cases of

canine babesiosis in the canton Solothurn. Schweiz Arch Tierheilkd. 2005; 147(6):259-

265.

98. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., editorler. Molecular Cloning: A

laboratuary manual 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratuary Press; 1989.

99. Schetters, T.P., Kleuskens, J.A., Scholtes, N.C., Gorenflot, A., Moubri, K.,

Vermeulen, A.N. Vaccination of dogs against heterologous Babesia canis infection

using antigens from culture supernatants. Vet Parasitol. 2001; 100(1-2):75-86.

100. Schetters, Th.P.M., Kleuskens, J.A., Scholtes, N.C., Pasman, J.W.,

Goovaerts, D. Vaccination of dogs against Babesia canis infection.Vet Parasitol. 1997;

73(1-2):35-41.

101. Schetters, T.P., Moubri, K., Precigout, E., Kleuskens, J., Scholtes, N.C.,

Gorenflot, A. Different Babesia canis isolates, different diseases. Parasitology. 1997;

115(Pt 5):485-493.

102. Soulsby, E.J.L., Helminths, Arthropods and Protozoa of Domesticated

Animals. 7 th ed London.. Bailliere Tindall, 1982.

103. Stewart, C.G. A comparison of the efficacy of isometamidium, amicarbalide

and diminazene against Babesia canis in dogs and the effect on subsequent immunity. J

S Afr Vet Assoc. 1983; 54(1):47-51.

68

104. Taboada, J., Merchant, S.R. Babesiosis of companion animals and man. Vet

Clin North Am Small Anim Pract. 1991; 21(1):103-123.

105. Toparlak M., Hazırlık aşamasındaki Parazitoloji ders notu. 2006.

106. Uguen, C., Girard, L., Brasseur, P., Leblay, R. Human Babesiosis in 1997.

Rev Med Interne. 1997; 18(12):945-951.

107. Uilenberg G. A historical overview. Vet Parasitol. 2006 Baskıda.

108. Uilenberg, G. Highlights in recent research on tick-borne diseases of

domestic animals. J Parasitol. 1986; 72(4):485-91.

109. Uilenberg, G., Franseen, F.F.J., Perie, N.M., Perie, M., Spanjer A.A.M.

Three groups of Babesia canis distinguished and a proposal for nomenclature. Vet Q.

1989; 11(1):33-40.

110. Ulutaş, B., Bayramlı, G., Ulutaş P.A., T. Karagenç. Serum concentration of

some acute phase proteins in naturally occuring canine Babesiosis: A preliminary study.

Vet Clin Pathol. 2005; 34(2):144-147.

111. Vercammen, F., De Deken, R., Maes, L. Duration of protective immunity in

experimental canine babesiosis after homologous and heterologous challenge. Vet

Parasitol. 1997; 68(1-2):51-55.

112. Vercammen, F., De Deken, R., Maes, L. Prophylactic treatment of

experimental canine babesiosis (Babesia canis) with doxycycline. Vet Parasitol. 1996;

66(3-4):251-255.

113. Wozniak, E.J., Barr, B.C., Thomford, J.W., Yamane, I., McDonough, S.P.,

Moore, P.F. ve ark. Clinical, anatomic, and immunopathologic characterization of

Babesia gibsoni infection in the domestic dog (Canis familiaris). J Parasitol. 1997;

83(4):692-699.

114. Wulansari, R., Wijaya, A., Ano, H., Horii, Y., Makimura, S. Lymphocyte

subsets and specific IgG antibody levels in clindamycin-treated and untreated dogs

experimentally infected with Babesia gibsoni. J Vet Med Sci. 2003; 65(5):579-584.

115. Yamane, I., Thomford, J.W., Gardner, I.A., Dubey, J.P., Levy, M., Conrad,

P.A. Evaluation of the indirect fluorescent antibody test for diagnosis of Babesia

gibsoni infection in dogs. Am J Vet Res.1993; 54(10):1579-1583.

69

116. Zahler, M., E. Scheın, H. Rınder, R. Gothe, Characteristic genotypes

discriminate between Babesia canis isolates of differing vector specificity and

pathogenicity to dogs. Parasitol Res. 1998; 84(7):544-548.

117. Zahler, M., Rinder, H., Schein, E., Gothe, R. Detection of a new pathogenic

Babesia microti-like species in dogs. Vet Parasitol. 2000a; 89(3):241-248.

118. Zahler, M., H. Rinder, E. Zweygarth, T. Fukata, Y. Maede, E. Schein, R.

Gothe,. ‘Babesia gibsoni’ of dogs form North America and Asia belong to different

species. Parasitology. 2000b; (120): 365-369.

70

ETİK KURUL KARARI

71

ÖZGEÇMİŞ

Kişisel Bilgiler Adı NURAN Soyadı AYSUL (Selek) Doğ.Yeri Ankara Doğ.Tar. 25.01.1973 Uyruğu T.C. TC Kim No 39253112994

Email seleknuran@hotmail.com Tel 0505 384 52 93

Eğitim Düzeyi Mezun Olduğu Kurumun Adı Mez. Yılı Doktora Yük.Lis. Lisans Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi 1996 Lise Aydın Lisesi 1990

İş Deneyimi (Sondan geçmişe doğru sıralayın) Görevi Kurum Süre (Yıl - Yıl)

1. Araş.Gör. Adnan Menderes Üniversitesi 2001-2002 2. Araş.Gör. İ.Ü.Sağlık Bilimleri Enstitüsü 2002- 3. -

Yabancı Dilleri

Okuduğunu Anlama* Konuşma* Yazma* KPDS/ÜDS

Puanı (Diğer)

Puanı İngilizce Çok iyi iyi orta 67 *Çok iyi, iyi, orta, zayıf olarak değerlendirin

Sayısal Eşit Ağırlık Sözel LES Puanı 49 51 53 (Diğer) Puanı

Bilgisayar Bilgisi Program Kullanma becerisi Microsoft; Word, Excel, Powerpoint, FrontPage, Paint, Photoshop İyi

Instat iyi

Yayınları/Tebligleri Sertifikaları/Ödülleri

72

Yayınlar:

Eren H., Aypak S., Selek N., İvermectin+Clorsulon Kombinasyonunun Doğal Enfekte Keçilerde Fasciola spp., Trichuris spp., Trichostrongylidae Türlerine etkileri. Bornova Vet. Kontr. ve Araşt. Enst.Md. Derg.,40,26,1-4,2001.

Eren H., Aypak S., Selek N., Aydın Yöresinde Deve (Camelus dromedurius)lerde Dışkı Bakılarına Göre Saptanan Parazitler. YYÜ Vet. Fak. Derg., 14(1) 59-60, 2003

Bildiriler:

Karagenç T., Selek N., Bakırcı S., Aypak S., Eren H., Aydın İli Sığırlarında Theileria annulata’nın Seroprevalansı: 18-25 Eylül 2005, İzmir.

Yaşar H., Gümüş D., Aşık L., Aysul N., Gargılı A., Altaş K., Kesmezacar F., Yıldırım M., İstanbul Valiliği Şehit Adem Yavuz İlköğretim Okulu Öğrencilerinde Bağırsak Parazitlerinin Yayılışı : 18-25 Eylül 2005, İzmir. Karagenç T., Bilgiç H.B., Hoşgör M., Selek N., Aypak S., Eren H., Aydın Yöresi Sığırlarında RLB Tekniği Kullanılarak Theileria, Babesia, Anaplasma, Ehrlichia Türlerinin Belirlenmesi. 18-25 Eylül 2005, İzmir. Sertifikalar : Molecular Biology of Leishmania 3-5 October Trieste, Italy. Proteom Analizi: Metodlar ve uygulamaları 4-11 Ağustos 2002. Görev Aldığı Projeler: Karagenç T., Eren H., Aypak N., Selek N., Development of Molecular Vaccines and Diagnostics for The Control Tropical Theileriosis, European Commision, 2001. Eren H., Aypak N., Selek N., Aydın Yöresi Develerinde Parazitlerin Yayılışı, ADÜ Araştırma Fonu, Aydın 2000. Karagenç T., Eren H., Aypak N., Selek N., Aydın Bölgesi Sığırlarında Bulunan Kan Parazitlerinden Theileria annulata, Babesia bovis, Babesia bigemina ve Anaplasma marginale’nin Teşhisinde Multiplex Polymerase Chain (PCR) Metodunun Geliştirilmesi, ADÜ Araştırma Fonu Aydın, 2002.

Özel İlgi Alanları (Hobileri):