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REPORTE FINAL DE SERVICIO SOCIAL
. L U S PRADO GOMEZ
Matr!c&a 87347691
pgemie r . 18 de los Alimentos
DIV. C.B.S. ,r
/’
México, D.F a, 9 de diciembre de 1994.
W. en C. Rosaura Grether G. Directora de la Divisi6n de CBS P R E S E N T E .
El presente trabajo es el resultado del Servicio Social realizado por el alumno Jesús Prado G6mez de la Carrera de Ingenieria de los Alhent08 con matricula 87347691, en el laboratorio de Ecologia de Zonas Aridas de la UAM-I.
Originalmente se tenia contemplada la fecha de terminacidn el dia 13 de mayo de 1994.
Sin embargo, el estallamiento de huelga llevado a cabo en la UAM en los primeros meses de este año, trajo como consecuencia que algunos experimentos ya avanzados se perdieran y que a falta de resultados concluyentes, se tuvieran que volver a realizar dichas actividades. Con el subsecuente retraso en la entrega del reporte final.
W. en C. Dolores Garcia Sudrez Profesor Asociado "DW T.C. Depto. de Biología
H f ~ P R O P ~ C I O M EXWISIVA Y UULISIS BúMIusoLoGICO DE B.
platiacanthus Link et Otto.
Obtener la determinación bromatol6gica de la pulpa
Behinocactus platyacanthus.
Lograr la propagación masiva de E . platyacanthus por
medio de la técnica de cultivo de meristem0 apical.
oBmTIms EspgcIPIcos.
Encontrar la concentración 6ptima de fitorreguladores
para realizar la micropropagación extensiva.
Resaltar la importancia de esta especie y su
explotacidn en la economía de las comunidades cercanas a su
hábitat y sus perspectivas de exportación.
Atraer la atención hacia la micropropagación como una
industria prometedora ante la apertura económica.
o m m Y =As iwxxa-. I
Se cumplieron satisfactoriamente todos los objetivos y
metas propuestas en un principio; y más aún, durante la
realización de presente proyecto, se realizaron aportaciones
en cuanto a modificaci6n de metodología que facilitarán y
optimizarán la producci6n.
JUSTIFICACION
Echinocactus platyacanthus es una especie en peligro de
extinción, de lento crecimiento, que ha formado parte de la
economía regional de las comunidades indígenas y posee una
demanda muy alta en el mercado como planta de ornato.
CONSIDERANDO QUE:
Algunas medidas como el restrigir la colecta aún para
actividades artesanales como la producción de dulces
cristalizados, impactaria negativamente en la economía de
las comunidades ya que en muchas ocasiones ésta representa
la principal (aunque raquítica) fuente de ingresos.
Además de que existen algunos autores (Davis 1970 y
Mendoza 1987) que promueven el consumo de cactáceas como
forraje, siendo que el pastoreo disminuye considerablemente
las poblaciones de cactáceas.
Y que la mayor depredación se dá con fines de venderlas
3
y exportarlas como plantas de ornato.
Consideramos de gran utilidad realizar un estudio
bromatológico que sustente el argumento de que Echinocactus
platyacanthus es un alimento de baja calidad, a la vez de
tratar de eficientizar la técnica de cultivo de tejidos
vegetales para su micropropagaci6n, impulsando así una nueva
forma de explotaci6n de los recursos que disminuya la
depredación de especies silvestres.
Lo que indirectamente evitaría los impactos a futuro
sobre la economía de las comunidades indígenas que no verían
mermada la materia prima de una de sus principales fuentes
de ingresos.
Si pudiéramos hablar de alguna aportación de América, y
más aún, de México para el mundo, sin duda nos podríamos
remitir a las cactáceas.
,
4
Hasta antes del descubrimiento de América no se conocía
en Europa ningún ejemplar de cactáceas. Parece ser que las
primeras fueron llevadas a España por los marineros de las
expediciones de Cristóbal col6n en el siglo XV o XVI: en
esas fechas el cultivo de cactáceas se hizo popular en
Inglaterra y fue ganando terreno rllpidamente.
Los Anales de Cuauhtitlán hablan ya del consumo o
utilización de las cactáceas por los Otomíes y Berna1 Díaz
del Castillo en sus nCrónicas sobre la Conquista de la Nueva
España" comenta del asombro provocado por estas plantas al
ser vistas y conocer su aplicación alimenticia, ceremonial y
medicinal.
Las subsecuentes expediciones a México contribuyeron
en mucho en acrecentar la atraccián de las cactáceas. Según
Milliken (1987) se introdujeron al Japón hace 300 años y en
1986 efectuó la primera importación a gran escala desde
México. En Francia, a principios del siglo XIX, estas
plantas fueron cada vez más buscadas hasta convertirse en
moda.
En el siglo XX, continuó el comercio de cactáceas
incrementando los efectos negativos en las poblaciones
silvestres.
Las cactáceas son mundialmente conocidas gracias a que
5
han sido plasmados por numerosos paisajistas, son elemento
caracterlstico de nuestro escudo nacional, y por si fuera
poco, han sido parte fundamental en la dieta del mexicano.
Según sea la especie, se aprovecharán distintas partes
de la planta.
Asl, dentro de la inmensa gama de alimentos en los que
son utilizadas las cactáceas podemos mencionar los nopales
navegantes, el curado de tuna, la mermelada de garambullo o
el tradicional dulce de acitrón.
El dulce de acitr6n es recordado por muchos mexicanos
ya que (como anteriormente se mencioinó) forma parte
fundamental de diversos platillos tradicionales. Por
ejemplo, está presente en las roscas de reyes y para
algunos de nosotros fue una de las primeras golosinas que
compramos.
Quien no haya probado unos trocitos de este dulce como
parte del relleno de unos chiles en nogada, no ha
experimentado el sublime placer de degustar uno de los
platillos que han dado fama internacional a la gastronomla
mexicana.
Precisamente, en la biznaga de acitr6n ( Bchinocactus
platyacanthus) es que basamos nuestro estudio; ya que además
de ser una especie en peligro de extinci6n, en ésta se basa
gran parte de la economía de algunas comunidades indígenas y
forma parte de la tradición dulcera mexicana que se ve
amenazada ante la entrada de productos importados.
Echimcactus platyacanthus es una especie endémica de
México, se encuentra distribuida desde el centro hacia el
norte del país en zonas semiáridas, su tallo es globoso. Es
una especie carnosa, espinosa de aproximadamente 1.5m de
ancho por 1.5m de alto, la parte superior es lanosa, sus
espinas tienen de 2 a 3 cm., sus flores son amarillas y sus
frutos miden 5cm. (Bravo Hollis, 1991)
\
El proceso de elaboración del dulce es simple. Los
pedazos se 'tajean' del tamafio deseado y se ponen en agua
por tres horas, después se sancochan por 15 minutos, y luego
se colocan en agua fría por poco tiempo. De ahí se ponen a
hervir con azúcar refinada hasta que el almíbar se aclare, y
se dejan reposar toda la noche. Al día siguiente se les
añade más azúcar y se ponen a hervir hasta que la mezcla
esté espumosa, después se hace el npamizn, que consiste en
raspar con una cuchara el interior del recipiente, para que
no se les haga costra y no queden pegajosos. Por último
éstos se colocan en un bastidor.
En la actualidad un trozo de acitrón de unos 100 gramos
no cuesta más allá de ti$ 0.80 (precio de mayoreo), pero en
‘ 1 . .
7
tiendas especializadas en dulces mexicanos y cuyo mercado
son principalmente turistas extranjeros, una porción de este
tamaño alcanza precios hasta de N$ 5.00.
Podemos observar que el precio al que lo vende el
productor es muy bajo, y solo puede ser una actividad mas o
menos redituable si se dedica a elaborar una gran cantidad.
Por esta razón en las comunidades donde se elabora este
tipo de dulce, se realizan colectas de plantas que tarde o
temprano impactarán negativamente en la vegetación del
lugar.
A d d s debemos de considerar que otra actividad
económica de muchas de estas comunidades es la ganadería
extensiva que se realiza a libre pastoreo y que en épocas de
sequia, las cactáceas, y en especial las biznagas por sus
características de tamaño y consistencia, constituyen la
única reserva de agua y de alimento para los animales. Por
lo que también son depredadores para este tipo de especies.
Pero sin duda, el principal móvil depredador de
cactáceas, es la atracción como plantas de ornato y su gran
cotizacion en el extranjero por coleccionistas.
Algunos artículos editados en EUA en la década de los
treinta y posteriores a la segunda guerra mundial, a traves
de los que se difundió el interés de los coleccionistas de
cactáceas por su cultivo, publicaron también algunos
artículos acerca de la pérdida de las plantas suculentas en
sus hábitats nativos. (Rawley 1978)
A principios de los setentas, periódicos y revistas en
otros países reportaron un continuo comercio ilegal de
cactáceas en los desiertos del sur de los Estados Unidos y
norte de México.
Gibson (1981), asegura que muchas cactáceas comerciadas
durante este periodo fueron colectas silvestres, estima
también que EüA importó al rededor de un millón de
especímenes en 1979. El mismo autor señala que probablemente
el comercio mundial de cactáceas para 1982 era casi todo de
origen mexicano.
En la actualidad los principales países importadores de
cactáceas mexicanas son Estados Unidos, Japón y varios
países de Europa como Alemania, Inglaterra, Bélgica y
Holanda.
. I.
9
No sólo las plantas que se comercian son silvestres, la
demanda ha podido ser satisfecha a través de la venta de
plantas propagadas en viveros. Los esfuerzos es este sentido
han contribuido en forma importante a disminuir, a partir de
los setentas, la colecta de algunas especies silvestres.
Si se pudiera lograr una producción a gran escala ( que
en algunas especies ya es posible) con especies amenazadas,
de lento crecimiento, que tienen un mercado asegurado que
pagaría buenos precios por ellas como Echinocactus
platyacanthus; sin duda ayudarfa enormemente a evitar su
extinción.
Pero antes de que abordemos la propagación de estas
especies como algo viable en nuestro pais, es conveniente
analizar el panorama actual.
De los programas de ajuste aplicados en América Latina
es común escuchar que el caso mexicano ha sido el más
exitoso. Sobra decir que dichos programas son totalmente
indiferentes a los "costos sociales" (el deterioro en el
nivel de vida de la mayoría de la población) necesarios para
aumentar la inversión y reactivar la economía.
Según el proyecto neoliberal, el libre mercado entraña
la apertura total del comercio exterior, lo cual exije la
derogación de toda clase de impuestos, cuotas y aranceles.
Esta política se ha aplicado rigurosamente a las naciones
subdesarrolladas y no ha encontrado una correspondencia en
los países centrales, donde siguen levantando fuertes
barreras proteccionistas.
El actual gobierno de México prescribe la apertura de
fronteras como una de las principales estrategias para
revitalizar la economía: de esa manera espera obtener
divisas y estimular la inversión extranjera. Es en ese marco
donde nos interesa analizar las reparcusiones del Tratado de
Libre Comercio (TLC) en la producción agropecuaria del país,
especialmente en la floricultura y producción de plantas de
ornato.(Chauvet 1992)
Hay argumentos que ponen en tela de juicio los
pron6sticos referentes al TLC y consideran que la capacidad
exportadora de México sigue siendo débil frente a sus
necesidades de importación. Un punto especialmente delicado
del debate es la producción agropecuaria. De sobra es
conocida la debilidad de México en la producción de ciertos
bienes, en particular en la producción de granos básicos,
frente a la alta productividad de la agricultura
estadounidense, debida en buena medida a los generosos
subsidios con que se le beneficia. (Chauvet 1992)
11
Es paradójico que al tiempo que crecen las
importaciones de alintentos básicos se otorguen estímulos a
los productos que encuentran un mercado rentable en el
exterior, como las tradicionales frutas y hortalizas y, más
recientemente, las flores y las plantas de ornato entre las
cuales las cactáceas son las exportaciones más signifiativas
en los últimos años (CITES 1990). Es decir, la producción
agropecuaria mexicana se perfila como exportadora de
productos de lujo e importadora de alimentos, lo que
seguramente se agudizar& con la puesta en vigor del TLC, ya
que en un periodo aproximado de cinco años después de la
puesta en marcha, se desaparecerá cualquier tipo de barrera
arancelaria, incluyendo alimentos básicos como maíz y
frijol. (SECOFI 1993)
Los productos exportables registran los avances más
significativos en la aplicación comercial de la
biotecnología. Entre las flores y plantas de horanto
encontramos que ya es una realidad la producción de material
genético clonado y la reproducción por cultivo de tejidos.
(Chauvet 1992)
Hace apenas unos años la propagación in vitro de
especies vegetales era considerada por muchos como un tema
más de ciencia ficción. Muchos incrédulos comentaban, más
por ignorancia que por otra cosa, que ésta técnica estaba
muy lejos de utilizarse en países como México. Apenas unos
12
ycuantos técnicos y científicos mexicanos son los que, con
una gran visión han impulsado e iniciado el desarrollo de
esta técnica. (Hurtado 1987)
El futuro de la micropropagación es sumamente
promisorio aún para países como €léxico. El desarrollo de
esta tecnología ha dado grandes frutos en países
industrializados. La producción en gran voli9mien de material
libre de virus, de gran vigor y de homogeneidad genética ha
permitido no sólo incrementar la productividad de numerosos
cultivos hortofrutícolas, sino la calidad de muchas plantas
de ornato de gran valor estético y comercial. En esta área
es en donde tal vez pueda surgir el mayor entusiasmo para
explorar el potencial de la propagación in vitro , sin olvidar la prioridad que tienen los alimentos en un país en
vías de desarrollo como el nuestro.
13
A C T M W E C REALIzu>As
A)RecolecciOn de frutos y pulpa de E. platyacanthus.
B)Deterninación bromatológica
B.l.-Materia seca
B.2.-Humedad
B.3.- Cenizas
B.4.-Grasa cruda
B.5.-Fibra cruda
B.b.-Aziícares totales
B.7.- Aziicares reductores
B.8.-Determinación de proteína
C) Escarificacion
D)Desinfestación
E)Germinación
F)Produccibn y mantenimiento de callos
G)Diferenciación
Se colectaron muestras de pulpa y semillas de
Bchinocactus platyacanthus en la locaclidad de Zapotitlán de
las Salinas, Puebla.
La pulpa fue sometida a una serie de determinaciones
bromatológicas y las semillas fueron utilizadas para
germinar y posteriormente realizar la técnica de cultivo de
tejidos.
En la misma localidad se platic6 con productores de
acitrón.
La metodología de las determinaciones bromatológicas se
describe a continuación:
A.DETERMINACION BROMATOUXICA
DETERMINACION DE HUMEDAD:
1.-Poner a peso constante unos platillos de alumino.
2.-Pesar exactamente 10 g. de alimento, colocarlo en uno de
los platillos del horno y conservar una temperatura de 100 a
110 c
3.-Dejar secar la muestra hasta que llegue a peso constante
4.-Sacar la diferencia de pesos inicial y final.
5.-Dividir la diferencia entre el peso total inicial para
sacar el % de humedad.
Para sacar el porcentaje de materia seca, el
procedimiento es análogo: Tomamos de base el peso final y lo
dividimos entre el peso inicial; o bien se saca por
diferencia del total con el % i3e hunedad.
DETERMINAC~ON DE CENIZAS (Sales minerales)
1.-Pesar un gramo de materia seca molida.
2.-Ponerlo en un crisol de porcelana tarado, numerado y a
peso constante: se calcina la muestra a llama directa; se
enfría en la campana de desecación.
3.-Calcinar en la mufla a 600 C .
4.-Pesar y destarar el peso del crisol, el resultado será el
equivalente de cenizas en un gramo.
5.-Cálculo:l4ultiplicar el peso de las cenizas encontradas en
un gramo de materia seca por el porcentaje de materia seca
de la muestra, el resultado será el porcentaje de cenizas.
DETERMINACION DE EXTRACTO ETEREO (Grasa cruda)
1.-Pesar de 5 a 10 g. de materia seca.
2.-Colocarlos en un cartucho tarado de papel filtro, en el
que se anota el nombre de la muestra y la cantidad pesada:
el cartucho de tamaño apropiado para que quepa en el
extractor de Soxhlet y de una altura poco inferior a la del
sifón del aparato, se coloca a su vez en la cámara de
extracción.
3.-Conectar el extractor al condensador y al matraz.
4.-Cargar con éter por el extremo superior del condensador,
con una cantidad suficiente para que se vacle tres veces el
extractor por medio de sifón.
5.-Calentar el matraz a una temperatura que permita contar
las gotas de éter que caen del condensador al Soxhlet y que
no deje escapar por la parte superior del mismo, un chorro
de vapores de éter que se difunden en la atmósfera y son
fácilmente perceptibles por el olfato.
6.-üuración de la extracción: hasta que el éter que sale por
el sifón sea incoloro, o bien después de cuatro horas por lo
menos.
7.-Suspender el calentamiento y desconectar las diversas
partes del dispositivo.
8.-Sacar el cartucho del extractor.
9.-Desecar el cartucho, primero a baja temperatura
(evaporación del éter); después en el horno a 100 o 110 C
(evaporación del agua): colocar en el desecador: pesar:
repetir la desecación en el horno y las pesadas hasta
obtener peso constante.
10.-Cálculos: Extracto etéreo es igual a la diferencia de
pesos, dividida entre 5 O 10 segíin la cantidad de materia
seca tomada y multiplicada por el porcentaje de materia
seca.
El cartucho con el residuo se utiliza para la determinación
de fibra cruda.
DETERMINACION DE FIBRA CRUDA.
Soluciones:
NaOH al 1.25%
H2S04 al 1.25%
1.-Pesar dos gramos de materia seca sin grasa.
2.-Ponerlos en un matraz Erlenmeyer de 500 ml.
3.-Agregar 200 ml. de soln. de ácido sulfúrico al 1.25% y
agitar la mezcla.
4.-Adaptar al matraz un condensador de reflujo.
18
5.-Calentar el contenido del matraz hasta la ebullición;
dejar hervir por 30 min.
6.-Apagar la parrilla, desconectar el matraz del condensador
y dejarlo enfriar.
7.-Filtrar (rodaja de papel filtro sobre embudo Buchner
adaptado a un matraz de filtració, conectado a un aparato de
vacío), lavando finalmente con agua destilada hasta la
reaccibn neutra (papel tornasol) del residuo.
8.-Colocar el papel con el residuo en la pared de un embudo
amplio, dispuesto sobre un matraz Erlenmeyer de 500 ml. y
arrastrar la mayor parte del residuo por medio de una
espátula.
9.-Uedir 200ml. de la soln. caliente a 60 C de NaOH al 1.25%
y colocarlos en un frasco lavador; arrastrar con chorro las
partículas de alimento adheridas al papel filtro.
10.-Desprender cuiüadosamente la rodaja de papel filtro y
colocarla en una cápsula de porcelana, desecarla en el horno
a 100 o 110 C y dejarla enfriar colocándola en el desecador
a la temperatura del laboratorio.
11.-Pesar la rodaja con el residuo y destarar el peso del
. .. . ..,, ~ ..... . , -. ... -.-.d..kd. -_l.,..+.l-_p_
19
12.-Cálculo: Dividir la cantidad restante entre dos y
multiplicar por el porciento de materia seca, menos el tanto
porciento de grasas y cenizas.
% de Fibra cruda= [R/2 ( % de M.s.)]- [ % de Grasas + %
cenizas]
DETERMINACION DE AZUCARES:
1.-Pesar 10 g. de pulpa de Echinocactus platyacanthus y
licuarlos con 100 ml de agua destilada.
2.-Filtrar para eliminar el bagazo
Para la determinación de azúcares totales:
3.-En un tubo de ensaye vertir 1 ml. de muestra mas 1 ml. de
ácido clorhldrico 1N y poner a ebullición en baño maria 1
hora.
4.-Enfriar y agregar 1 ml de Hidróxido de sodio 1N. Agitar.
5.-Tomar 1 ml. de esta solución y continuar la determinación
siguiendo la metodología para cuantificar azúcares
reductores.
Determinación de Azúcares eductores.:
- - . I -*+-&“---- L.__I_I___”-I>~.__ -
20
6.- Preparar la curva path de la siguiente manera:
Pesar 0.01 g de dextrosa (previamente desecada en estufa) y
diluir en 100ml. de agua destilada. De esta solución,
realizar las diluciones suficientes para lograr las
siguientes concentraciones: 0.0, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08 y
0.1 gramos de dextrosa por litro de agua.
7.-De cada dilución, tomar 1 ml y vertirlo en un tubo de
ensaye. También, en otro tubo, poner 1 ml. de la solución
problema.
8.-Agregar a los tubos 1 ml. de reactivo DNS y poner a
ebullición por 5 minutos. ( Tapar los tubos con canicas).
9.-Retirar los tubos y enfriar en hielo.
10.-Aforar a 10 ml. con agua destilada. Agitar.
11.-Leer en el espectrofot6metro a 540 nm. después de 15
min.
12.-Construir una gráfica de Concentración vs. Absorbancia y
sacar la concentración problema por intarpolación.
DETERMINACION DE PROTEINA.
Reactivos:
Soln. A: 2% Carbonato de sodio
1% BCA (Acido Biciconlnico)
0.16 % Tartrato de Sodio
0.04% Na OH
0.95% NaHC03
(ajustar el pH a 11.25 con NaOH o NaHC03 si es necesario)
, . . .,. *. .. ,_.., *,...*~, -- 4,u-- --,I _ < "< __^_,." ,________.. I __-._ I
21
Soln. B: 4% CuS04 * 5H20 Mezclar 50 partes del reactivo A con una parte de reactivo B
(15 ml. de A + 300 microlitros de B).
De la muestra de B.p:latyacanthus, licuar log. con 500,
filtrar con un cedazo y posteriormente filtrar
aproximadamente 5ml. en micropore de 0.45 micr6metros.
-Centrifugar a 400 rpm por 10 minutos
-Preparar
manera :
TUBO
1
2
3
4
5
MUESTRAS
1
2
la curva patr6n por duplicado de l a siguiente
CBSAI VOL. ( IL) H20 BCA
O O 50 1 ml.
10 10 4 0 1 ml.
20 20 30 1 ml.
30 30 20 1 ml.
50 50 0 1 ml.
Normal 50 I1 O 1 m1.
1:2 25 y1 25 I1 1 ml.
-Una vez preparadas las muestras se calientan junto con la
curva estándar por 20 segundos a 700 Joules ( Full power)
-Leer a 562 nm.
& I ---t. ., . ,.. _ _ , l.<,"l_l_l_l
22
B.SELECCION DE FUENTE DE EXPLANTE PARA EL CULTIVO DE TEJIDOS
PRUEBAS DE GERMIPIACION
a)ESCARIFICACION:
El tiempo sugerido inicialmente para escarificar las
semillas de Bchinocactus platyacanthus fue de 2 minutos.
Sobre esta base de tiempo decidimos realizar pruebas de
escarificación a los 1, 2, 3 y 4 minutos a fin de encontrar
un tiempo óptimo de escarificación y acelerar el proceso de
germinación.
La escarificación se hizo mediante la adición directa
de ácido sulfúrico fumante a las semillas, que fueron
lavadas posteriormente con agua destilada.
Una vez lavadas las semillas se procedió a las pruebas
de germinación.
b)DESINFESTACION
Antes de sembrar las semillas, éstas fueron
desinfestadas con una solución de cloro al lo%, fueron
lavadas con agua bidestilada y con una solución fungicida
(amfostat 0.1%) y con un bactericida (gentamicina 0.024%)
preparada en condiciones asépticas.
23
C)MEDIOS DE SIEMBRA
Las semillas fueron sembradas también en condiciones
asépticas en un medio con la siguiente composición:
Murasige & Skoog 2.2 g/1
Sacarosa 15 g/1
Agargel 4 g/1
Acido cítrico
Anfotericina ZOO Ii/i
Tetraciclina
pH: 3.5
El medio se vació en frascos de boca ancha (aprox. 15ml
de medio por frasco), se taparon con papel aluminio o tapas
gerber ( marca sigma) y se esterilizaron en autoclave por 15
minutos a 15 libras de presión.
Una vez realizada la siembra, las semillas fueron
expuestas a un fotoperiodo de 8 horas oscuridad y 16 horas
luz a temperatura ambiente.
También se probó una serie de experimentos agregando al
medio carbón activado.
La iiltima prueba de germinación fue hecha en el medio
original, pero con la adición de agua de coco en una
concentración de 1 ml/l.
,.,, ~ , , . . ,.,__-._ .
, .
24
Se probó otro antibiótico (natamicina) de la siguiente
manera: Se agregó al medio en concentraciones de 0.02, 0.04
y 0.1 g/1; y se sometió a las siguientes pruebas: rociado
sobre el medio sin esterilizar e incorporado al medio para
su posterior esterilización.
d)PRUEBAS DE FITOLECTINAS
Las siguientes pruebas de genninación fueron realizadas
sustituyendo los antibióticos originales por natamicina en
una concentración de . O 4 g/1.
Una vez concluidas las pruebas de germinación y de
desinfestación se procedió al corte de meristemos y
producción de callos.
OBTENCION DE LOS EXPLANTES:
De las plántulas desarrolladas se cortaron los
meristemos apicales con un bisturí esterilizadso a la
flama, se lavaron con cloro al lo%, después se lavaron con
agua destilada y por último se sumergieron por
aproximadamente 10 minutos en una solución de natamicina con
una concentración de 0.1 g/1.
Los meristemos fueron cortados y sembrados en
condiciones asépticas
25
PRODUCCION Y MANTENIMIENTO DE CALLOS
Para la producción de callos se probaron 12 medios
diferentes que se distinguían entre si por una determinada
concentración de fitorreguladores.
Los fitorreguladores empleados fueron Becilaminopurina
(BAP) y Acido Naftalenacético ( N M ) y la composición base
del medio fue la siguiente:.
Murashige 5 Skoog 2.2 g/1
Sacarosa 15 g/1
Agargel 4 g/1
Ac. cítrico
Nataaicina 0.04 g/1.
26
La micropropagación se llevó a cabo probando doce
tratamientos ( 3x4 ):
NAA
(mq/l)
1.0
0.5
0.1
BAP/NM 1.0
5.0 5/1 M1
3.0 3/1 M4
2.0 2/1 M7
1.0 1/1 M10
Después de obtener
diferenciación.
B m
(-/I)
5.0
3.0
1.0
0.5
5/0.5 M2
3/0.5 M5
2/0.5 M7
1/0.5 M11
los callos se
INWCCION A LA DIFERWCIACION:
0.1
5/0.1 M3
3/0.1 M6
2/0.1 I48
1/0.1 M12
procedió a la
El corte y la desinfestacidn de los callos se realizó
de manera similar a la obtención de meristemos.
Para la siembra de callos y diferenciación se
utilizaron dos medios: uno era el medio base sin ninguna
concentración de fitorreguladores y el otro medio era el
medio base mas la adici6n de agua de coco en una
concentración de 1 ml/l.
La interpretación de resultados se realizó mediante
criterios cualitativos ( vitrificación aparente, desarrollo
de raíz, desarrollo de espinas, etc.) y cuantitativos
(ganancia de peso y talla).
REsuLTMos
A. DETERMINACION BROHATOLOGICA
Materia Seca 32.78%
Humedad 67.22%
Cenizas 2.75%
Grasa Cruda 1.183%
Fibra Cruda 0.863%
Azúcares Tofales 38.1 g/g
Azúcares Re&&torea 5.16 g/g
Proteína 0.36 %
.. . . , . . , ... , , . , *...---ec-..+-." -
28
B. SELECCION DE FUENTE DE EXPLANTE PARA EL CULTIVO DE
TEJIDOS
PRUEBAS DE GERMINACION
a) ESCARIFICACION:
Los resultados de la escarificación fueron los
siguientes:
1 minuto: Empezaron a germinar después de 6 semanas
(aproximadamente 30% del total)
2 minutos: A los 12 días empiezan a germinar empiezan a
germinar (aproximadamente 40% del total) y a los 17 dlas ha
germinado la mayoría (90%).
3 minutos: A los 8 dlas habían germinado aproximadamente el
50% de las semillas sembradas y a los 12 días al rededor del
80% ya habla germinado.
4 minutos: La mayoría presenta la testa rota al tercer día
de s@mbrarse, pero el crecimiento fue muy lento y sólo un
20% aproximadamente del total alcanzó un tamaño comparable a
los mejores ejemplares de los otros tres tratamientos pero
en un tiempo mayor a las seis semanas (10 a 15 mm de
longitud)
- _-.. -_1-- -cl.-.”i -
29
b)DESINFESTACION:
Antes de nuestra investigación, los antibióticos
utilizados (nfotericina y tetraciclina) se esterilizaban por
separado al medio mediante microfiltración. Nosotros
esterilizamos los antibióticos una vez incorporados al medio
sin observarse alteraciones en el poder bactericida y
fungicida, ya que si bien hubo frascos contaminados, éstos
se debieron a un mal manejo de material, pues una vez
dominada la técnica de sembrado, las contaminaciones se
redujeron considerablemente.
PRUEBAS DE FITOLECTINAS
Las pruebas realizadas con natamicina presentaron los
siguientes resultados:
A concentraciones de 0.02 g/1, los frascos que no se
esterilizaron y sólamente se rociaron, presentaron
contaminación. Aquellos en que el antibiótico fue
incorporado para su posterior esterilización, mostraron en
algunos frascos una ligera contaminación, pero ésta avanzaba
muy lentamente.
A concentraciones de 0.04 g/1 se observó que los que se
rociaron presentaron escasa contaminación (bacterias
solamente) que avanzaba muy lentamente y en los que se
autoclavearon no se observó contaminacidn.
En concentraciones de 0.1 g/i no se observó
c&v4zarnh~ación en ninguno de los tratamientos.
30
c) GERMINACION:
Las semillas sembradas en el medio original germinaron
y alcanzaron una talla promedio de 1 cm en un tiempo
apriximado de 21 días.
En el medio adicionado con carbón activado se observó
que en la totalidad de las plántulas hubo desarrollo de raiz
sin alterar el tamaño de las plantas.
Se tenía la idea de continuar con este medio base dura
te toda la serie de experimentos; pero en una ocasión que
algunas plántulas no fueron utilizadas para obtención de
meristemos, se pasaron a un medio de cultivo (medio 12) con
fitorreguladores adicionados, observbndose un crecimiento
mayor en menor tiempo. En tres semanas tuvieron un
incremento en peso de 0.2 a 3.5 g. sin que se presentaran
problemas de vitrificación. En contraste, aquellas plántulas
que permanecieron en su medio original no cambiaron mucho
después de varios meses. Esto sugirió la utilización de un
medio enriquecido con agua de coco (ya que ésta contiene
fitorreguladores) con la idea de poder aplicar estos
resultados a una futura producción comercial, dando como
resultado w e a los seis días de sembrar, las plántulas
desarrollades e9pezaron a presentar raiz y el tamaíio de los
tallos era similar al alcanzado en condiciones normales a
los 17 días.
31
PRODUCCION Y MANTENIMIENTO DE CAUOS
I Esta corrida de experimentos no pudo ser observada
detenidamente, ya que se cruz6 la huelga en la Universidad y
no se pudo precisar el tiempo de crecimiento, puesto que
cuando regresamos a las actividades, los callos estaban ya
muy grandes.
Solo se contaminaron 2 tubos de 36 que se sembraron:
1114 y 12\23.
NOTA: El numerador, es el nilmero de tratamiento, y el
denominador es el nilmero de tubo dentro del tratamiento.
TAWdOS :
1: Hasta 2 mm
2:De 2 a 5 mm
3:De 5 a 10 mm
4:De 15 a 25 mm
5:De 15 a 25 mm
TUBOS TAMhSO
114 3 Y 4
1/5 5 Y 3
1/6 3 Y 3
2/4 4 Y 2
2/14 2 Y 2
2/19 2 Y 4
3/4 2 Y 4
3/5 3 Y 4
3/6 3 Y 4
4/6 5 Y 2
4/14 2 ~ 5
4/16 l Y 4
5/4 3 Y 2
5/5 3 Y 5
5/9 4 Y 3
6/7 2
6/12 5 Y 4
6/17 4 Y 2
OBSERVACIONES
E1 primero ralz y ápices
rosados, lpuy definido.
El primero con vitrificnci6n
El primero esclorotizado
El primero empieza a
diferenciarse.
Los dos diferenciados
El segundo empieza a
diferenciarse
El segundo casi de 30 IOP.
El segundo esclorotizado.
7/5 5 Y 5
7/12 2 Y 2
7/14 2 Y 4
8/7 2 ~ 3
8/17 2 Y 2
8/20 4 ~ 2
9/13 2 ~ 4
9/14 4 Y 3
9/16 4 Y 4
10/4 4 Y 3
El primero ya estaba
diferenciado y con raíz.
Los dos esclorozados
El segundo ya estaba
diferenciado
El segundo diferenciado y con
raíz
Esclorozados
El primero diferenciado y con
raf z
El primero reclorozado
El primero definido, pero con
una porcidn vitrificada.
Totalmente vitrificados
10/12 2 Y 5
10/15 4 Y 4
11/4
11/20 l Y 5
11/15 4 Y 5
12/8
12/16 2 Y 5
12/18
El primero esclorozado, el
segundo totalmente
vitrificado.
Totalmente vitrificados
Contaminado
El segundo totalmente
vitrificado
Totalmente vitrificados
Contaminados
El segundo totalmente
vitrificado
5 Y 5 Totalmente vitrificado con
ligera coloración rosada
Posteriores experimenfos realizados en frascos de boca
ancha muestran los siguientes resultados:
En un tiempo promedio de treinta dias los merieteaorr
aeilbrados que originalmente tenian un peso de
aproximadamente 0.1 g. alcanzaron un peso de aproximadamente
0.99 y un mes despuis los callos formados pesaban entre 3.8
y 4.2g. en aquellos midios que presentaron mejores
condiciones de crecimiento.
La tabla de resultados promedio se muestra a
continuación:
MEDIO Pi Pf
1
4
5
OBSERVACIONES
Se oxidaron las muestras, en
la única disponible no se
observ6 creaimiento
0.12 0.11
0.13 2.9 Bastante desarrollados, pero
cie 10 frascos, 4 no se
desarrollaron, 2 crecieron
normal y 4 se vitrificaron
0.09 3.9 De 10 frascos uno se oxidd, 6
presentaron buen crecimiento y
3 vitrificaron ligeramente
0.12 1.2 De 10 frascos, 3 se oxidaron,
2 se contaminaron y 5 no
mostraron crecimiento
6
7 Y 8
9
10
0.1 4.3 En general se desarrollaron
bastante, pero tuvieron
problemas de vitrificaci6n.
0.9 4.5 Bastante desarrollado
pero con problemas de
vitrificación evidentes.
Aquí se ObSCiNS
desarrollo de ralz.
No hubo crecimiento
aparente, y los que
crecieron presentaron
vitrificacibn.
0.12 4.8 Bastante vitrificado.
Una posterior corrida de experimentos realizada el 8 de
agosto arrojó los siguientes resultados después de treinta
días de ObseNaCi6n.
I ”
HEDIO Pi Pf OBSERVACIOETES
3 0.1 0.09 No hubo Crecimiento
4 0.1 3.0 Buen crecimiento, sin vitrificación
pero sin desarrollo de raíz.
5
6
7
8
9
10
0.13 3.4 Ganancia considerable de peso pero
con problemas de vitrificación.
0.09 1.5 nuestras &e crecimiento pero con
problemas de vitrificación
0.8 0.6 Crecimiento bastante desarrollado
con raíz pero con problems de
vitrificación.
0.12 3.3 Similar a 7.
0.11 3 .0 Hay vitrificación.
0.11 3.5 Totalmente vitrificado.
En todos los caso8 se intentó s e a r la parte
vitrificada de los callos sin que se desarrollara nunca
tejido adicional.
.. ,
\
DIFERENCIACION
Para hacer la diferenciacion de callos se cortaron
pedazos de aproximadamente 0.19 de peso y fueron colocados
en parejas en frascos con medio de cultivo totalmente
carente de reguladores de crecimiento; a los 20 dlas se pudo
observar el desarrollo de plantas con caracterlsticas
perfectamente visibles de E . platyacanthus, a los 30 dlas se
empiezan a notar las primeras espinas y el desarrollo de
ralz se da por estress hldrico a los 15 dlas de ausencia de
medio.
Se intent6 hacer la diferenciaci6n en un medio con agua de
coco (lml/l), pero a pesar de que la ganancia de peso fue
mayor ( de 0.1 a 3 - 2 9 ) que en el medio original, el problema
de vitrificación fue muy marcado.
DISCUSION
Las determinaciones bromatológicas fueron realizadas
sobre muestras de pulpa que provenían de ejemplares de E.
platyacanthus de una talla determinada (aprox. 50cm. de
altura por 60cm. de diámetro) por lo que es necesario
resaltar que si se hubieran tomado ejemplares de otra talla,
seguramente el perfil bromatológico hubiese variado
principalmente en la relación de azúcares totales con
azúcares reductores, ya que esta cambia a medida que la
planta crece. La razón del que se hayan seleccionado
muestras de este tamaño de cactus, es que es la talla más
empleada para preparar el duce de acitrón, ya que mas
grandes, dan como resultado dulces copn características de
palatabilidad arenosa. Debido a que E. platyacanthus crece
sobre suelos calizos , es probable que las "arenitas"
encontradas en su parénquima sean cristales insolubles de
oxalato y carbonato de calcio (Salisbury 1978) además de
cristales de sacarosa. Por otro lado, también se escogió
este tamaño de biznaga porque son las más suceptibles al
ataque de chivos principalmente, ya que la planta queda a
una altura accesible para que el animal cocee derribando las
espinas y pueda ingerir la pulpa directamente.
Del análisis bromatolbgico, podemos decir que estas
plantas son identificadas m8s por sus propiedades
energéticas que por su contenido proteico. Aunado a su alto
contenido de agua, este alimento lo Caracterizaríamos como
un alimeto de subsistencia más que como un alimento de buena
calidad.
Las pruebas de escarificación muestran que el tiempo
óptimo es de 3 minutos. A menores tiempos, la testa no ha
sido afectada considerablemente, pero a tiempos mayores la
germinación se retarda o se inhibe por completo: es decir,
que aunque la testa es rota más rápidamente, la germinacián
se detiene de inmediato, lo que sugiere que algunas enzimas
que intervienen en la germinación pudieron ser afectadas por
la exposición excesiva a un medio ácido.
La dureza de la testa, impide que las semillas de las
cactáceas no sean aprovechadas como alimento salvo cuando
son trituradas, lo que trae como consecuencia que éstas sean
eliminadas íntegramente. Este hecho constituye un factor
importante en la dispersión de las especies, máxime que el
contacto con la testa con los jugos gástricos de los
animales sirve para romper la latencia de la semilla
facilitando su germinación.(Bravo, 1991)
La razón por la cual las plántulas crecieron más rápido
en un medio con una concentración determinada de hormonas
que en el medio basal, fue que los reguladores de
crecimiento estimulan los procesos fisiológicos de las
plantas. Actualmente se reconoce que la mayor parte (si no
la totalidad) de la actividad fisiológica de las plantas
está mediada por los reguladores de crecimfento.(Delvin
1980)
Tomando en consideración lo anterior empleamos el medio
con agua de coco para germinar ya que contiene estos
reguladores (Hurtado 1987), proyectando su aplicación a
nivel comercial donde no siempre sea posible disponer de
reactivos definidos y sí nos interese la producción rápida.
Aunado a lo anterior, la adición de carb6n activado,
ademgis de adsorber algunas sustancias que se forman como
desecho en algunos medios de cultivo (Hurtado 1987),
oscurece el medio propiciando el desarrollo de raíz.
En cuanto a desinfestación y meaidas asepticas, a pesar
de no hacer la metodologia recomendada por otros autores
como Evans (1990) que especifica el uso de la campana de
flujo laminar y reaiarca la ineficiencia de emplear
antibióticos. Nosotros tuvimos resultados muy aceptables, ya
que las condiciones asépticas que procuramos junto con las
pruebas de fitolectinas realizadas aieron un nlímero muy bajo
de frascos contaminados, siendo mucho más efectivas que los
antibióticos originalmente empleados (anfotericina y
tetraciclina). Lo que adapta la metodología para ser
aplicada por productores con el mínimo de recursos.
Se aplicaron concentraciones de O.O4g/l ya que todos
los medios se autoclavearon.
El tamaiio de los meristemos apicales que posee E.
platyacanthus es de los más grandes que se conocen(Boke
1980). Cuando se realizó la produccidn y el mantenimiento de
callos, se observó que del madio 1 al 3 no hay crecimiento.
Pensamos que aquf lo que influye es la concentración de
Bencilaminopurina (Citocinina) con respecto a la de ácido
naftalenacético (Auxina), ya que segh Barba (1987), si la
citocinina estápresente en condiciones elevadas puede
volverse limitante, por lo menos en uno de los tres pasos
necesarios para la división celular; aunque, como el mismo
autor lo reconoce, hasta ahora se desconoce el mecanismo
exacto de la inducción citocinfnica de la división celular.
Como vimos que la producción de callos no se favorecfa
a estas concentraciones de fitorreguladores, decidimos
realizar las siguientes corridas de experimentos en aquellas
concentraciones que mostraban mejores caracterfsticas de
crecimiento.
En concentraciones de 3/lmg/l BAP/NM, se observaron
callos de buen tamaiio, que incluso empezaban a
diferenciarse. En los medios 5 y 6 se observó crecimiento
similar y en algunos casos induciendo, incluso, más
claramente a la diferenciación, pero empezaron a presentarse
problemas de vitrificaciOn en los tejidos.
Con una relación de 2/1 y 2/0.5 de BAP/NAA se orservó
desarrollo de raíz; Algunos autores como George y
Sherrington (1984) consideran que concentraciones medias de
los dos fitorreguladores estimulan la formación de raíces
adventicias en callos.
En cuanto a la diferenciacion, se observó que es mejor
un medio carente de fitorreguladores, ya que de lo contrario
el tejido sigue elongándose sin inducir a la diferenciación
celular.
Echinocactus platyacanthus es una especie que
tiene una demanda muy fuerte como alimento forrajero, es
sustento económico para algunas comunidades y es muy
apreciada por sus características estéticas.
E. platyacanthus como alimento forrajero no es de buena
calidad, pero constituye una reserva de agua y azúcares en
regiones áridas.
El tiempo óptimo para escarificar las semillas de E.
platyacanthus.
El utilizar compuestos enriquecedores de composición
indefinida como agua de coco, acelera la germinación y
reduce el costo de materiales empleados para tal propósito.
El agregar pequeñas cantidades de carbon activado
favorece el desarrollo de raiz.
Las fitolectinas fueron más eficientes que los
antibibticos anfotericina y tetraciclina.
La relación de BAP/NAA más favorable para la inducción
a formación de callo es de 3/1.
Para la difernciación es mejor utilizar medio basal sin
fitorreguladores.
-1-
Para evitar recurrir a la biznaga como 6nica fuente de
alimentation para el ganado en esas regiones, es
recomendable difundir la propagación de cactáceas del género
Opuntia (nopales, choyas, etc.) en áreas de pastoreo, ya que
según anteriores estuüios,(Davis 1970) podemos darnos cuenta
que tiene un perfil bromatol6gico similar a B.platyacanthus;
pero es de crecimiento mucho más rápido, invade mayores
extensiones de terreno y tendría el ganado, alimento
suficiente por un tiempo ilimitado. Además de que
disminuiría la competencia por la materia prima que es
sustento económico de algunas comunidades.
Esta especie, se exporta con más o menos regularidad a
Estados Unidos y Europa, pues se usan en la decoración de
interiores y hay un interés bastante extendido por el
cultivo de las mismas. Estas exportaciones no constituyen
una fuente grande de ingresos para la región, pero desde
luego son suceptibles de aumentarse considerablemente
mediante un esfuerzo dirigido en forma adecuada. Seria
aconsejable para éste proposito la creación de más jardines
botánicos de plantas de zonas áridas, unidos a expandios
comerciales, que podrían encontrar buena clientela en los
turistas y aumentar el atractivo regional para los mismos.
La micropropagación de plantas tendrla un mercado
inmediato en proyectos como el anteriormente mencionado.
Un atractivo adicional para el cultivo de esta especie
es que contiene uno de los esteroles más conocidos y
abundantes de las angiospermas: B-sitosterol(Dornínguez
1970), que es empleado para la slntesis qulmica de ciertas
homonas animales, tal como la progesterona (Salisbury
1978). Por lo tanto esta especie podrla merecer m8s atención
cono materia prima para la slntesis de dichas hormonas.
Es necesario buscar metodologías adaptadas a las
posibilidades de pequeños y medianos productores para evitar
que la micropropagación por cultivo de tejidos se convierta
en monopolio de los grandes laboratorios. Es posible.
BIBLIODRAFIA
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