Edición genómica

Técnica para introducir cambios específicos en el ADN genómico de

una célula o de un organismo

Evolución de la tecnología de edición de ADN

Frecuencia de recombinación homóloga en células de mamíferos: 1 cada 30.000 células

La introducción de cortes en las dos hebras de ADN en el genoma aumenta la

frecuencia de recombinación

Cre-lox: Tecnología usada para controlar la expresión de genes temporal y

espacialmente a través del knock-out de genes blanco por recombinación

de sitios loxP. (fago P1)

Nucleasas “dedos de Zn”: Zn finger nucleases

Los dedos de cinc son pequeños motivos estructurales de proteínas

que pueden coordinar uno o más iones de cinc para ayudar a

estabilizar sus pliegues. Normalmente funcionan como módulos de

interacción que unen el ADN, ARN, proteínas y moléculas pequeñas

Los dedos de zinc pueden ser modificados para reconocer secuencias

de ADN específicas.

TALENS: transcription activator-like effector nucleases

Generadas por la fusión de efectores TAL (proteínas de la bacteria Xanthomonas que se unen a

secuencias específicas de ADN) con una endonucleasa (FokI). Se hace ingeniería de TAL para que se

una a distintas secuencias de ADN.

Integración dirigida

Meganucleasa:

Endonucleasa que

reconoce sitios de

reconocimiento grandes

(12-30 pb)

Por ingeniería de proteína

se puede cambiar su

secuencia de

reconocimiento

Locus transcripcionalmente

activo

Gen de timidina quinasa para eliminar integraciones no deseadas con ganciclovir

Sistema CRISPR/Cas

Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats

Repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas

Mecanismo de inmunidad mediada por CRISPR en bacterias

GenScript

Cas9

+

ARN guía: generado

por la fusión de los

transcriptos crRNA

con tracrRNA

Especificidad: 20 nuc de

extremo 5´del gRNA

SIGMA

PAM: protospacer –adjacent motif

5'-NGG-3: PAM canónico que se asocia con la nucleasa Cas9 de Streptococcus

pyogenes (SpCas9) . Está cada 8-12 nuc en humanos

Ubicación: 3´del sitio de corte

Función: -permite a Cas 9 discriminar ADN propio de ajeno

-su reconocimiento está involucrado en la transición de Cas 9 entre

conformación de unión (binding) a corte (cleavage)

El único requerimiento para la selección de un

sitio blanco de Cas9 es la presencia de un sitio

PAM inmediatamente después del sitio de corte

Generación de Cas9 mutantes que reconozcan

otros PAM

Uso de alternativas de Cas9: nucleasa de

Francisella Cpf1 (PAM: TTN)

Mutagénesis inespecífica causada por Cas9

(off-target activity):

Alta concentración de Cas9

Duración de la expresión

Diseño de gRNA

Mejoramiento de la fidelidad del reconocimiento de

la secuencia blanco de Cas9

Los cortes en una sóla hebra (SSB) son reparados preferentemente por

HDR en vez de por NHEJ, lo que reduce la posibilidad de mutaciones

Generación de animales transgénicos.

La transcripción y la traducción están suprimidas en el

cigoto de ratón, la actividad de Cas9 se demora hasta

después de la primera división lo que llevaría a

mosaicismo.

Generación de modelos celulares

Modificación de células somáticas

A

P

L

I

C

A

C

I

O

N

E

S

Screening genómico funcional

Mapping a functional cancer genome atlas of tumor

suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–

mediated direct in vivo screening

Guangchuan Wang et . SCIENCE ADVANCES. 2018

Cancer genomics consortia have charted the landscapes of numerous human cancers. Whereas

some mutations were found in classical oncogenes and tumor suppressors, others have not yet

been functionally studied in vivo. To date, a comprehensive assessment of how these genes

influence oncogenesis is lacking. We performed direct high-throughput in vivo mapping of functional

variants in an autochthonous mouse model of cancerviruses (AAVs) carrying a single-guide RNA

(sgRNA) library targeting putative tumor suppressor genes significantly mutated in human cancers,

we directly pool-mutagenized the livers of Cre-inducible CRI. Using adeno-associated SPR

(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)–associated protein 9 (Cas9) mice. All

mice that received the AAV-mTSG library developed liver cancer and died within 4 months. We

used molecular inversion probe sequencing of the sgRNA target sites to chart the mutational

landscape of these tumors, revealing the functional consequence of multiple variants in driving liver

tumorigenesis in immunocompetent mice. AAV-mediated autochthonous CRISPR screens provide

a powerful means for mapping a provisional functional cancer genome atlas of tumor suppressors

in vivo.

Cas9

Biblioteca de

sgRNAs de

genes

supresores

tumorales

putativos

humanos

Todos los ratones desarrollaron cáncer de hígado y murieron en cuatro

meses

Secuenciación del genoma de los tumores por “molecular inversion probe

sequencing” para determinar las mutaciones ocasionadas (indels)

I.V.

Rosa-LSL-Cas9-EGFP knock-in mice

Ratones inmunocompetentes

MIP: Molecular Inversion Probe

Es una de las técnicas moleculares de captura por

circularización para realizar partición genómica,

proceso a través del cual se capturan y

enriquecen regiones específicas del genoma

Probe: ADN simple cadena con secuencias

complementarias al genoma

Modulación transcripcional y

control epigenéticoUnión de Cas9 a represores o activadores

transcripcionales y a enzimas “modificadoras

epigenéticas”

Visualización del ADN en células

vivasEstudio de la arquitectura de cromosomas y

organización nuclear

Edición de bases

(GRAPHIC) C. BICKEL/SCIENCE; (DATA) D. B. T. COX ET AL., SCIENCE 358, 6362, 2017 © SCIENCE; J.

DOUDNA AND E. CHARPENTIER, SCIENCE 346, 6213, 2014 © SCIENCE; GAUDELLI ET AL., NATURE

551, 7677, 2017

Regulación inducible de Cas9

A través de la heterodimerización por inducción química u

óptica

Uso terapéutico

Para corregir enfermedades monogénicas recesivas causadas por

mutaciones que llevan a la pérdida de una función :

Fibrosis quística

Anemia falciforme

Distrofia muscular de Duchenne

Para corregir desórdenes dominantes–negativos en los que el gen

afectado es haplosuficiente, como la forma dominante de retinitis

pigmentosa: inactivación del alelo mutado por NHEJ

Diferencia con otras posibles terapias génicas tradicionales:

El nuevo gen funcional se expresa

en su contexto natural

“A new technology for ‘editing’ defective genes has raised hopes for

a future generation of medicines” – The Wall Street JournalCRISPR Therapeutics is focused on the development of transformative medicines using its proprietary CRISPR/Cas9 gene-editing platform. CRISPR/Cas9 is a revolutionary

technology that allows for precise, directed changes to genomic DNA. We have licensed the foundational CRISPR/Cas9 patent estate for human therapeutic use from our

scientific founder, Dr. Emmanuelle Charpentier, who co-invented the application of CRISPR/Cas9 for gene editing.

Translating a revolutionary platform into medicines targeted toward

hemoglobinopathies, cancer, liver and neuromuscular diseasesOur multi-disciplinary team of world-class researchers and drug developers is working to translate CRISPR/Cas9 technology into breakthrough human therapeutics. Our lead

program in the blood diseases β-thalassemia and sickle cell disease will soon enter clinical testing. In addition, our immuno-oncology franchise, focused on CRISPR-based

allogeneic CAR-T cell therapies to treat cancers, offers potential therapeutic advantages over the current generation of therapies.

Building a great company with a focus on science, innovation,

collaboration and entrepreneurshipThe revolutionary CRISPR platform provides the foundation for building a sustainable innovation engine and a place to foster entrepreneurship across all fronts. We are

looking for talented and experienced individuals across various functions. Our company is headquartered in Zug, Switzerland with R&D operations in Cambridge,

Massachusetts, USA and select business operations in London, United Kingdom. Please visit the careers page to see available positions.

Reactivación de hemoglobina fetal anulando el gen BCL11A

Infobae 3 de octubre de 2017

Edición genética: investigadores corrigieron una

anomalía en embriones para impedir una enfermedad

Un equipo de científicos chinos realizó una técnica que permitió corregir

una anomalía genética en embriones humanos portadores de una grave

enfermedad llamada talasemia

Correction of β-thalassemia mutant by base editor in

human embryos

Puping Liang et al. Protein Cell 2017

Usaron el sistema “Editor de bases”: CRISPR Cas9 + citidina

deaminasa, cambio de C por T

.

Infobae 4 de diciembre de 2017

Avance científico mundial: investigadores argentinos lograron generar

clones equinos con genomas mejorados

Utilizando la técnica CRISPR-Cas9 o llamada "tijera genética", lograron alterar el

ADN de un caballo de polo para mejorar su potencial y destreza.

Se bloqueó el gen de miostatina, proteína que inhibe el aumento de masa

muscular

El pasado mes de julio tuvo

lugar el Gotteborg (Suecia), el

congreso sobre New Breeding

techniques (Nuevas técnicas de

mejora genética). En este

congreso los representantes

locales dejaron claro a los

científicos asistentes que la

postura de Suecia es apoyar

que las variedades obtenidas

por CRISPR sin incluir ningún

ADN foráneo no sean

consideradas OGM y por tanto

no deban superar un largo

proceso de aprobación ni ir

etiquetadas

Menú de la

cena de gala

Julio 2017

http://jmmulet.naukas.com/2017/10/24/crispr-de-primero/

El INTA logró modificar el gen que hace

que la papa se ponga negraLa Nación, Viernes, 04 de Mayo de 2018 18:55

- Después de siete años de estudio con la técnica de

edición génica, investigadores del INTA Balcarce

lograron modificar el gen de polifenol oxidasa,

presente en el cultivo de papa (Solanum tuberosum

L.), cuya enzima provoca el pardeamiento enzimático

en tubérculos, es decir, que se pongan negros o que

se oxiden cuando se los corta y se los expone al aire.

La técnica utilizada fue edición génica", dijo Sergio

Feingold, director del Laboratorio de

Agrobiotecnología del INTA. La tecnología, también

conocida como CRISPR/Cas9, permite realizar

cambios "dirigidos en el material genético de plantas

y animales de consumo, con el objetivo de mejorar su

producción y calidad"

“Si no hay enzima,

no hay pardeamiento”