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EFECTO DE CUBIERTAS DE QUITOSANO OBTENIDO POR FERMENTACIÓN

LÁCTICA DE CABEZAS DE CAMARÓN SOBRE EL COMPORTAMIENTO

POSTCOSECHA DE FRUTO MODELO

Cabanillas Bojorquez Luis Angel, Cristerna González José Luis, Cázares Pérez

Manuel Fernando, Castillo López Ramón Ignacio, Calderón Ayala Ignacio,

Guadalupe de Jesús Valdez Zazueta, Parra Inzunza Marco Antonio.

I. INTRODUCCION

El aumento en la distribución y consumo de mariscos en años recientes conlleva un

aumento en la cantidad de desechos producidos. La composición de estos

desechos varía con la especie pero en general contiene: quitina, proteínas, sales

minerales, pigmentos y lípidos (Franco, 2010). La quitina además de formar parte

de la estructura de crustáceos y artrópodos, está presente enla pared celular de

hongos y levaduras; es el segundo polímero más abundante en la naturaleza

después de la celulosa (Peniche, 2006; Juárez, 2010). En las cutículas de los

crustáceos, la quitina se encuentra fuertemente asociada con sales inorgánicas,

tales como carbonato de calcio, proteínas, pigmentos y lípidos. De ahí que el

proceso convencional utilizado en la industria para la obtención de quitina a partir

de esqueletos de crustáceos, consiste en una desproteinización con álcali, seguida

de una desmineralización con ácidos diluidos y finalmente, la eliminación de lípidos

con solventes orgánicos (Juárez, 2012).

Los métodos convencionales empleados para la obtención de la quitina requieren

el consumo de grandes cantidades de reactivos y agua, se producen grandes

2

volúmenes de efluentes, los cuales al ser tratados elevan los costos de producción

y causan daños ambientales (Hernández y col., 2009).

El quitosano es un polímero natural que se obtiene por desacetilación de la quitina,

y cuando se compara con otros polisacáridos, el quitosano tiene varias ventajas

tales como biocompatibilidad, biodegradabilidad y que no tóxico, mientras que

también presenta propiedades funcionales como bacteriostático y fungistático.

Como alternativa, se han investigado películas comestibles de origen biológico,

tomando como criterios la permeabilidad de agua por la matriz del alimento, la

penetración de oxígeno a los medios de transporte de material de alimentos, aromas

y pérdidas de soluto. Materiales a base de quitosano se pueden utilizar como

películas o recubrimientos comestibles debido a su propiedad única de aumento de

la viscosidad después de la hidratación. Por otra parte, las películas de quitosano

son resistentes, duraderas, flexibles, y difíciles de romper (Hosseini y col., 2013).

En la actualidad se han buscado alternativas para el tratamiento de los desechos y

de esta manera se ha empleado a la fermentación láctica para un aprovechamiento

integral del desecho, que además de purificar parcialmente a la quitina, permite la

recuperación de otros compuestos de alto valor agregado ahí presentes (Peniche,

2006). Con base en lo anterior, el presente trabajo está encaminado a establecer

las condiciones de fermentación óptimas para la obtención de quitina y quitosano a

partir de desechos de camarón, así como también evaluar la actividad del quitosano

como inhibidor del crecimiento de microorganismos, en un fruto modelo.

3

II. REVISIÓN DE LITERATURA

El advenimiento de la biotecnología moderna ha transformado radicalmente la

opinión de los científicos acerca de los organismos y de los materiales que producen

mediante el aprovechamiento de las enzimas en la naturaleza o de la materia prima

marina y agrícola para la transformación de una nueva clase de materiales

biodegradables, biocompatibles y renovables (Juárez, 2010).

Las razones que conducen en la actualidad a la sociedad a volver a utilizar los

polímeros naturales que se venían usando desde hace cientos de años, son el

creciente interés por compatibilizar la fabricación de productos manufacturados con

la sostenibilidad del medio ambiente y el alto coste de algunos materiales sintéticos.

Además, el problema de una alta acumulación de residuos en los últimos tiempos

ha promovido el uso de estos reciclándolos como materia prima.

(López, 2012).

La quitina fue aislada por primera vez por Braconnot en 1811, a partir de hongos

superiores, y por su origen se denominó fungina. El nombre de quitina del griego

xitwuy, y por su origen se debe a Odier, que en 1923 la aisló a partir de escarabajos

en soluciones alcalinas (Peniche, 2006).

La quitina es un polisacárido muy abundante en la naturaleza, se encuentra

principalmente en crustáceos, insectos y hongos. En los animales aparece asociada

a otros constituyentes, tales como lípidos, pigmentos, carbonato de calcio y

proteínas. Posee una estructura lineal de alto peso molecular constituida por

unidades de N-acetil-glucosamina unidas por enlaces -D. Es altamente insoluble y

presenta baja reactividad (Figura 1) (Mármol y col., 2011).

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Figura. 1 Estructura de Quitina (De Alvarenga, 2011).

La quitina es un polisacárido cristalino que cuenta con tres diferentes formas

cristalográficas: y quitinas. La quitina es la isoforma más abundante,

se encuentra compactada dando una estructura cristalina donde sus cadenas se

encuentran antiparalelas, favoreciendo los enlaces de hidrógeno. La quitina tiene

un arreglo paralelo con una fuerza intermolecular más débil, dando una molécula

menos estable de quitina y la quitina es una mezcla de las dos anteriores

(Ramírez y col., 2006).

Comparando la abundancia natural de las formas polifórmicas, encontramos que la

quitina es la más abundante y estable mientras que las otras dos se presentan

en pequeñas proporciones y tienden a ser transformadas en quitina (Hirano,

1999). En general, la quitina es obtenida por métodos químicos a partir de conchas

de crustáceos que incluyen tratamientos con álcalis y ácidos, con modificación de

condiciones como la temperatura, tiempo de reacción, concentración de álcalis y

ácidos, entre otros (Zulay Mármol y col., 2011).

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El esqueleto de camarón y cangrejo son las principales fuentes para la producción

de la quitina a nivel comercial asociada con proteínas, minerales, lípidos y

pigmentos, estos tienen que ser removidos para alcanzar un grado de pureza para

diferentes aplicaciones biológicas necesarias (Percot y col., 2003). Diversos

procesos de obtención de quitina se han empleado, destacando los métodos

químicos y los biológicos. Dentro de los biológicos tenemos el ensilado, que se

define como un proceso de conservación en el cual los ácidos adicionados o

producidos inhiben el crecimiento de patógenos, presenta ciertas ventajas respecto

a los otros, como el permitir la recuperación de productos con valor agregado. Dos

tipos de ensilado son los más frecuentes: el ensilado químico, que se basa en la

adición de ácidos inorgánicos u orgánicos y posteriormente es neutralizado y el

ensilado obtenido por fermentación láctica, en el que el ácido es producido in situ

por la fermentación bacteriana de una fuente de hidratos de carbono (Shirai y col.,

2001; Cira y col., 2002).

El quitosano fue descubierto en 1859 por Rouget al hervir quitina con KOH,

convirtiéndose en una sustancia soluble en ácidos orgánicos. Le llamó quitina

modificada. El quitosano es obtenido comercialmente mediante una desacetilación

alcalina de la quitina. Se han propuesto muchos métodos, pero el más reportado es

cuando la quitina es sometida a la acción del NaOH al 50% a temperatura de

ebullición por un periodo de 3 horas. La calidad del quitosano es determinada por

las condiciones de desacetilación empleadas (Muzzarelli, 1978).

Cuando la desacetilación del material de partida es incompleta se crea una mezcla

de cadenas que tienen distintas proporciones de unidades β(1-4)-2-acetamido-2-

desoxi-D-glucosa y β(1-4)-2-amino-2-desoxi-D-glucosa, cuya relación depende de

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las condiciones de reacción y que, obviamente, genera materiales con distintas

propiedades denominados quitosanos (Figura 2). La diferencia en las propiedades

de estos materiales puede llegar a ser notable, como por ejemplo la distinta

solubilidad en medio acuoso que pueden llegar a tener (Lárez, 2003).

Figura 2. Estructura de Quitosano (De Alvarenga S., 2011).

El quitosano es un biopolímero natural con importantes propiedades funcionales y

a este hecho se suma el valor añadido de obtenerse a partir de la quitina, que se

extrae principalmente de las cáscaras de crustáceos y que constituye un

subproducto importante procedente de la industria pesquera. El estudio de este

polímero a lo largo de todos estos años ha generado su empleo en múltiples

aplicaciones (Cuadro 1). Entre las numerosas propiedades funcionales que se le

han atribuido están: biodegradabilidad, biocompatibilidad, capacidad filmogénica,

actividad antimicrobiana, actividad antifúngica, actividad hipocolesterolémica,

actividad antioxidante, mucoadhesión, hemostático y promotor de absorción

(Caprile, 2005)

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Cuadro 1. Aplicaciones de Quitosano.

APLICACIONES USOS

Tratamiento de aguas y efluentes

industriales

Remoción de iones metálicos y pesticidas: remoción de fenoles,

radioisótopos, PCBs y colorantes, recuperación de materiales sólidos de

la industria alimenticia (proteínas,polisacáridos,etc.).

Fabricación de papel Tratamiento de superficies, papel fotográfico.

Medicina

Gasas, algodón, contenedor artificial de sangre, control de colesterol, inhibidor tumoral, membranas, inhibición de placas dentarias,

cicatrización de heridas, piel artificial, tratamientos de enfermedades óseas,

lentes de contacto, membranas de diálisis, bolsas desangre,

anticoagulante.

Cosmética Maquillaje, esmalte de uñas, loción de baño,cremas, dentífrico.

Biotecnología Inmovilización de enzimas y células,

separación de proteínas, cromatografía, recuperacióncelular.

Agricultura Recubrimientos de semillas y frutas

(film), fertilizante, fungicida, antivirósico.

Alimenticia

Remoción de colorantes, conservantes, estabilizante de color,

exaltador del sabornatural, preservante, antioxidante,

emulsionante, aditivo de alimentos para animales.

Fuente: Caprile, 2005

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Estas propiedades funcionales han promovido su utilización a lo largo de los años

en varios campos distintos como son la agricultura, la industria alimentaria y

farmacéutica y la medicina (Rinaudo, 2006).

Quitosano es particularmente atractivo para aplicaciones biológicas y clínicas

debido a su no toxicidad, biodegradabilidad, fisiológica, y propiedades

antibacterianas (Rinaudo, 2006; Geng y col., 2012).

La carga positiva que inducen los grupos amino da al quitosano la capacidad de

atrapar sustancias como macromoléculas, proteínas, lípidos, metales, etc.,

cargados negativamente, esta propiedad junto con las anteriores hace que el

quitosano tenga un gran potencial para diferentes aplicaciones (Juárez, 2012).

En cuanto a la industria alimentaria, el quitosano ofrece un amplio espectro de

aplicaciones únicas. La mayoría se relacionan con su actividad antimicrobiana

como, por ejemplo, su uso como conservante en el empaquetamiento y en películas

comestibles que recubren alimentos, y su empleo también como conservante en

emulsiones. La capacidad de unirse a grasas permite su utilización como agente

hipocolesterolémico en productos dietéticos. Por otro lado, se han estudiado las

propiedades tecnológicas como espesante, gelificante y emulgente. En su uso como

agente emulgente es capaz deformar emulsiones y en la formación de emulsiones

con proteínas del suero lácteo se havisto que mejora su estabilidad. Además se

emplea como agente quelante y floculante para tratamiento de aguas residuales

resultantes del procesado de alimentos y para clarificación de bebidas (López.,

2012).

9

El quitosano es eficaz en la inhibición del desarrollo de hongos y levaduras,

seguidos de bacterias gram-positivas y finalmente gram-negativas. Los

mecanismos de actividad antimicrobiana no han sido explicados completamente. El

carácter antimicrobiano del quitosano se atribuye a la presencia de grupos amino

con carga positiva (NH3+) que interaccionan con las cargas negativas de los

fosfolípidos formadores de membrana celular de bacterias y hongos; al adherirse el

quitosano a la membrana, provoca alteraciones en proteínas y diversos compuestos

y causa una filtración a través de ella hasta llegar al citosol; el quitosano utiliza

energía para atravesar la membrana, sin embargo, este proceso no involucra al

proceso de endocitosis. Las bacterias y hongos normalmente mantienen en su

citosol niveles muy bajos de Ca2+, esto es gracias a la barrera que forma la

membrana plasmática, la cual posee reguladores herméticos que impiden el paso

libre de gradientes de Ca2+, este proceso en el que también se involucra al

mecanismo homeostático, donde dentro del citosol se regula la concentración de

Ca2+, enviando fuera de la célula al exceso de Ca2+, o los almacena en organelos

de la propia célula. Por lo tanto, al introducirse el quitosano al interior del citosol se

transforma drásticamente el mecanismo homeostático, ya que al formar canales en

la membrana permite el paso libre de gradientes de calcio, además de causar la

fuga de otros componentes intracelulares, ocasionando una inestabilidad en la

célula hasta su muerte (Ramos-García y col., 2010). Además, la actividad

antimicrobiana también se relaciona con la interacción selectiva de trazas de

metales necesarios para el desarrollo de los microorganismos (Rodríguez-Núñez y

col., 2010).

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III. JUSTIFICACION

La producción de crustáceos, apoyada fuertemente por el crecimiento de la

acuicultura, es cada vez mayor en los países en desarrollo. Sin embargo, en la

actualidad no se aplica un manejo efectivo de los desechos sólidos que genera esta

industria, calculados en alrededor del 50% de la producción total. En los últimos

años, ha existido un gran interés en la búsqueda de nuevos métodos para la

obtención de quitina y su principal producto que es el quitosano a partir del

desperdicio de camarón, ya que estos polímeros tienen una amplia área de

aplicaciones debido a sus características.

Comercialmente, los desechos de crustáceos son tratados esencialmente para la

extracción y aislamiento de quitina y su derivado el quitosano, por el método

tradicional ácido-alcalino. Por estos motivos, se ha propuesto a la fermentación

acido láctica como una alternativa para la recuperación de quitina, debido a que este

proceso puede ser llevado a cabo a bajos costos de inversión y en lugares en donde

no se cuenta con infraestructura sofisticada.

Además, el producto obtenido tiene una gran aplicabilidad en la industria

alimentaria, entre otros, como inhibidor de crecimiento de microorganismos.

IV. HIPOTESIS

Quitosano, obtenido mediante la utilización de la fermentación láctica, usando

productos de desecho como suero y melaza, sobre desechos de camarón, puede

producir un biopolímero con características similares a los comerciales, el cual

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puede utilizarse como inhibidor del crecimiento de ciertos microorganismos que son

los principales causantes de pérdidas de calidad en alimentos de la región.

V. OBJETIVOS

a. GENERAL

Obtener quitina y quitosano por medio de la fermentación láctica de desechos de

camarón, optimizar las condiciones de procesamiento y evaluar su actividad como

antimicrobiano.

b. ESPECÍFICOS

Los objetivos específicos de este estudio se basan en:

a) Evaluación de las condiciones de procesamiento de fermentación láctica

para la obtención de quitina y quitosano.

b) Obtener quitina y quitosano en las mejores condiciones de

procesamiento.

c) Caracterización de quitina y quitosano obtenidos en las mejores

condiciones de procesamiento.

d) Evaluar la actividad antimicrobiana del quitosano obtenido con las

mejores condiciones de procesamiento.

e)

VI. MATERIALES Y MÉTODOS

7.1 MATERIALES

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Se utilizarán cabezas de camarón de desecho (Litopenaeus vannamei) obtenidas

en el mercado, restaurantes y pescaderías localizadas en Culiacán Sinaloa, las

cabezas de camarón se congelarán hasta su uso.

Suero de leche se obtendrá de una empresa quesera de la localidad, la melaza se

adquirirá de un ingenio azucarero aledaño a la comunidad.

Las cabezas serán lavadas con abundante agua y trituradas para reducir su tamaño,

y lograr mayor contacto entre las fases.

7.2 MÉTODOS

7.2.1 Fermentación

Cabezas de camarón trituradas se pondrán en contacto con suero de leche en un

reactor por lotes, se le añadirá melaza como sustrato para las bacterias, se dejaran

fermentar por un determinado tiempo, se variarán la concentración de melaza y los

tiempos de fermentación.

7.2.2 Síntesis de quitina

Después del periodo de fermentación, las cabezas de camarón se pasarán por un

colador y se lavarán con abundante agua fría para remover todos los residuos que

hayan quedado.

7.2.2.1 Desproteinizacion

Se procederá a poner en contacto los residuos de las cabezas de camarón extraídas

en una solución de hidróxido de sodio 1 M, en relación de 1/10 de (p/v) durante un

13

periodo de 1 hora. Al finalizar este periodo la materia sólida se lavará con abundante

agua hasta que alcance un pH de 7.0.

7.2.2.2 Desmineralización

Este proceso tiene como objetivo eliminar los minerales que aún permanezcan en

la muestra, esto se hace con una solución de Ácido Clorhídrico 1N, en relación de

1/10 de (p/v) durante un periodo de 1 hora. Al finalizar dicho periodo la materia sólida

se lavará con abundante agua hasta que alcance un pH de 7.0.

7.2.2.3 Despigmentación

Esta etapa tiene el propósito de eliminar los pigmentos que aún acompañan la

muestra, colocando las cabezas de camarón en una solución de Hipoclorito de

Sodio al 10% en relación 1/10 de (p/v) durante un periodo de 1 hora. Al finalizar este

periodo la materia sólida se lavará con abundante agua.

7.2.3 Síntesis de quitosano

La desacetilación de la quitina se llevará a cabo por método heterogéneo en un

reactor tipo Batch, con una solución acuosa de NaOH a una concentración de 50%

a 110°C, con un tiempo de reacción de 3.5 horas a una relación de 1:15(p/v). El

producto será enjuagado con agua corriente hasta neutralidad, secado a 35ºC

durante 24 h para su posterior análisis y caracterización (Juárez, 2010).

14

7.2.4 Caracterización de quitosano

El primer paso en la caracterización de quitosano será purificar la muestra: se

disolverá en un exceso de ácido y se filtrará en membranas porosas (con diferentes

diámetros de poro hasta 0.45 mm). Ajustará el pH de la solución a 7.5 mediante la

adición de NaOH o NH4OH, la cual provocará la floculación debido a la

desprotonación y la insolubilidad del polímero a pH neutro. El polímero se lavará a

continuación con agua y se secará (Rinaudo, 2006).

7.2.4.1 Grado de N-acetilación

7.2.4.1.1 Caracterización mediante espectroscopia

infrarrojo

Espectroscopía de absorción infrarroja se puede emplear en análisis cuantitativos y

determinación de la estructura de los compuestos. El hecho de ciertos grupos de

átomos que presentan bandas en o cerca de la misma frecuencia y la huella digital

única de moléculas de IR permite conocer la estructura química de un compuesto.

El grado de acetilación (DA) se calculará por la siguiente fórmula, donde A1655 y

A3450 son la absorbencia de bandas a 1655 y 3450 cm-1, respectivamente.

1655

3450

( )*115A

DAA

Esta relación es válida para las muestras con DA de hasta 55%. La cantidad de

muestra en el haz debe ser lo suficientemente pequeña para asegurar que la banda

de 3450 cm-1 tenga una transmisión de al menos 10% (De Alvarenga., 2011).

15

7.2.4.1.2 Caracterización mediante Resonancia

Magnética nuclear

El área integral del pico CH3 se comparará con el área de los carbonos glucósido

en 13C NMR de estado sólido para determinar la DD (grado de desacetilación) de

las muestras de quitosano. El DD podría calcularse también por las áreas integradas

de carbonilo de etilo en relación con el carbono C1 del anillo de glucósido.

DD obtenida por RMN de 13C en estado sólido para la baja acetilación de quitosano

no es coincidente con los resultados de otras técnicas. Sin embargo, RMN de estado

sólido es el método recomendado para muestras de alta DA, ya que éstas muestras

son insolubles en disolventes más comunes (De Alvarenga., 2011).

7.2.4.1.3 Determinación Potenciométrica

Para la determinación del contenido de grupos amino de las distintas muestras de

quitosano se procederá a la disolución de 0.5 g de cada uno de ellos por separado

en 20 mL de HCl 0.3 M. A continuación se titulará con una solución de NaOH 0.1 M.

La valoración se llevará a cabo midiendo el cambio de pH cada 2 mL de base

añadida, la adición se realizará de forma lenta y con agitación continua para

homogenizar la solución y evitar errores debidos a la posible precipitación del

biopolímero. Las medidas se realizarán tres veces para cada muestra.

El gráfico de la variación del pH frente al volumen añadido de base tiene dos puntos

de inflexión: el primero corresponde a la neutralización de HCl, y la segunda a la

neutralización de los iones de amonio de quitosano. La diferencia entre los dos

16

puntos de inflexión dará la cantidad de grupos amino en quitosano (grado de

desacetilación, DD). El grado de acetilación (DA) se obtendrán de la fórmula:

% 100 %DA DD

2 1[ ]( )161%

base V VDD

m

Donde V2 es el punto de inflexión mayor, V1 corresponde al punto de inflexión

menor, ambos expresados como volúmenes (ml), [base] es la molaridad de la

solución de NaOH (mol L-1), m el peso de la muestra (mg) y 161 es la masa molar

del monómero (C6H11O4N).

Este método presenta algunas dificultades, tales como: Las muestras de quitosano

tienen que ser purificadadas y secadas antes de las mediciones. Los contenidos de

humedad y cenizas tienen que ser determinados. Muestras de bajo grado de

acetilación no se miden adecuadamente por valoración Potenciométrica (De

Alvarenga, 2011).

7.2.4.2 Determinación del contenido de Cenizas (%C)

El porcentaje de cenizas será determinado después de la combustión de

aproximadamente 2g de muestra en crisoles a peso constante, en una mufla a

550ºC, durante 4 h (hasta llegar a peso constante), obteniendo así la diferencia de

pesos (AOAC, 1990).

)

(% *100

Peso crisol con cenizas Peso crisol

Peso muestraC

El proceso final de enfriado se llevará a cabo con un desecador.

17

7.2.4.3 Determinación del contenido de humedad (%H)

El porcentaje de humedad se determinará después de secar aproximadamente 2g

de muestra en charolas de aluminio durante 24h a 105ºC hasta alcanzar peso

constante en una estufa con temperatura controlada, calculando el porcentaje por

diferencia de pesos (AOAC, 1990).

( %

– )* 0

1 0

Peso charola con muestra sin humedad Peso charola

Peso mue raH

st

7.2.4.4 Determinación Viscosidad intrínseca y Masa

Molecular

La viscosidad intrínseca de quitosano se determinará usando un viscosímetro

capilar que tiene un tamaño capilar de 0.38 mm en un baño de agua a 25°C.

Viscosidad media MM se calculará a partir de la viscosidad intrínseca medido de

acuerdo con la ecuaciónde Mark-Houwink-Sakurada (MHS). Para cada muestra, se

emplearán cuatro diferentes concentraciones de quitosano en un intervalo de 0,33

a 1% para medir la viscosidad de las muestras. La viscosidad intrínseca fue

determinada por la intersección entre la viscosidad relativa Huggins y Kraemer. La

18

viscosidad relativa, viscosidad reducida, y la viscosidad intrínseca se determinará

como:

0rel

t

t

1sp rel

sp

rel C

ln[ ] /ln[ ]

sp relC

C C

Donde t es el tiempo de flujo medido para la solución de la muestra en un t (s) tiempo

determinado; t0 (s) es el tiempo de flujo de la solución (0.1 M HOAc) sin muestra de

quitosano; C es la concentración de la muestra de quitosano en solución diluida (g

/ ml); y [η] era viscosidad intrínseca (ml / g) (Zhang y col., 2013). La masa molecular

promedio en viscosidad (MM) de quitosano se calculará por la ecuación de MHS:

[ ] ( )aK MM

Donde K y a fueron las constantes, K = 1,81 × 103, a = 0,93, [η] será la viscosidad

intrínseca obtenida a partir de los gráficos de Huggins y Kraemer (Zhang y col.,

2012).

7.2.5 ANALISIS ESTADÍSTICOS

Se utilizará la metodología de superficie respuesta (MSR) para optimizar las mejores

condiciones de procesamiento (concentración de melaza, y tiempo de fermentación)

19

para la obtención de Quitina y Quitosano, teniendo como variables de respuesta

grado de desacetilación, masa molecular, porcentaje de ceniza, porcentaje de

humedad (Cuadro 2).

Cuadro 2. Diseño experimental

X1,

Codificada

X2,

Codificada

°Brix

Tiempo de

fermentación

Grado de

desacetilación

Masa

Molecular

% H % C

-1 -1 8 48

1 -1 10 48

-1 1 8 72

1 1 10 72

-1.4142 0 7.59 60

1.4142 0 10.41 60

0 -1.4142 9 43.03

0 1.4142 9 76.97

20

0 0 9 60

0 0 9 60

0 0 9 60

0 0 9 60

0 0 9 60

7.2.6 APLICACIÓN EN UN FRUTO MODELO

7.2.6.1 Preparación de las muestras

La fruta modelo se seleccionará en base a uniformidad, tamaño, color, forma, y

ausencia de daño y microorganismos. Después serán sumergidas en una solución

de Quitosano, será dispersado en 900 mL de agua destilada y se le agregará 50 ml

de acido acético glacial para disolver el Quitosano, para preparar las soluciones de

1 L de Quitosano. El pH de las soluciones se ajustará a pH 5.0 con 0.1 M NaOH y

la solución se llevará hasta 1 L. Una solución de ácido a un pH de 5.0, sin quitosano

se utilizará como control. Después será removido el exceso de humedad con aire

seco a 25°C por 30 min (Chien y Col., 2005).

7.2.6.2 Determinación de la pérdida de peso y contenido

de humedad

21

El porcentaje de humedad se determinará después de secar aproximadamente 2 g

de muestra en charolas de aluminio durante 24h a 105ºC hasta alcanzar peso

constante en una estufa con temperatura controlada, calculando el porcentaje por

diferencia de pesos (AOAC, 1990).

(

% – )

* 0

1 0Peso charola con muestra sin humedad Peso charola

Peso mue raH

st

7.2.6.3 Determinación del Color

La determinación de color se realizará de acuerdo a la metodología reportada por

Ayón y col (2015) utilizando un colorímetro Minolta CR 200 (Minolta Chromameter,

Japón), registrando los parámetros L*, a* y b* de la escala de color CIELAB, en el

cual L* define la luminosidad y a* y b* son dos componentes cromáticos y son de

verde a rojo, y de azul a amarillo, respectivamente.

7.2.6.4 Determinación de Sólidos Solubles Totales

El contenido de sólidos solubles totales se determinará de acuerdo al método oficial

22.014 de la AOAC (1999) utilizando un refractómetro manual (Fisher Cientific

S66366). Se reportará como porcentaje de azúcar (ºBrix).

7.2.6.5 Determinación de pH

Se determinará utilizando el método 981.12 de la AOAC (1999); que consiste en

homogenizar 20 g de muestra con agua destilada neutra, posteriormente se filtrará

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en tela de organza y se aforará a 100 mL. El pH se evaluará mediante la inmersión

directa del electrodo de vidrio de un potenciómetro Orion (Orion research Inc,

Boston, MA USA) en la solución aforada. Las determinaciones se realizarán por

triplicado, expresándose los resultados como iones hidrógeno.

7.2.6.6 Acidez Titulable

La acidez titulable se determinará de acuerdo al método oficial 942.15 de la AOAC

(1999). A partir de la solución aforada para la determinación del pH, se tomaran

alícuotas de 20 mL y se titularán con NaOH 0.1 N hasta un pH de 8.1±0.2. Se

reportará como porcentaje de ácido cítrico (Ayón y Col., 2015).

7.2.6.7 Análisis Microbiológico

La muestra a analizar fue preparada de acuerdo a la metodología reportada por

Ayón y Col. (2015) cincuenta gramos de fruto modelo se mezclarán con 450 mL de

agua peptonada (1 %) y se homogeneizaran por 1 minuto en una licuadora

(Osterizer M4108 10 VEL) bajo condiciones estériles, obteniéndose una dilución

1:10. A partir de esta dilución se preparó la dilución 1:100, mezclando 1 mL de la

dilución con 9 mL del medio BHI (Infusión Cerebro Corazón, BD Bioxon) en un tubo

falcon de 15 mL estéril.

7.2.6.7.1 Mesófilos y psicrófilos

Para el recuento de mesófilos y psicrófilos aerobios se tomarán 100 μL de las

diluciones preparadas (10-1 y 10-2) por duplicado y se pipetearán asépticamente

en placas con agar para cuenta estándar (PCA, por sus siglas en inglés). Se

utilizarán asas de plástico estériles para distribuir uniformemente el inóculo en las

placas. Para el caso de mesófilos las placas se incubaran por 24-48 h a 37°C y para

23

psicrófilos se incubaron por 13-15 días a 5°C (Ruiz-Cruz y col., 2010; NOM-092). El

conteo microbiológico de mesófilos y psicrófilos serán reportados como UFC/g

(unidades formadoras de colonia por gramo de muestra).

7.2.6.7.2 Hongos y levaduras

Para la determinación de hongos y levaduras se tomarán 100 μL de las diluciones

preparadas (10-1 y 10-2) y se inocularán en placas con agar Sabouraud.

Las placas se incubarán por 3-5 días a 25°C, el conteo de hongos y levaduras será

expresado en UFC/g de tejido (NOM-111).

7.2.6.8 Análisis Estadístico

La comparación de medias entre quitosano comercial y quitosano obtenido por

medio de fermentación láctica, aplicados como cubiertas en el alimento modelo, se

realizará mediante la prueba de Tukey con un nivel de significancia del 5% (P≤0.05).

VII. BIBLIOGRAFIA

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