Efecto de iones en la Pirazinamidasa recombinante de la cepa H37Rv de Mycobaterium tuberculosis...
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Efecto de iones en la Pirazinamidasa recombinante de la cepa H37Rv de
Mycobaterium tuberculosis
Patricia Ferrer
H37Rv
Pirazinamida PirazinamidasaModo de acción
Clonación, expresión y purificación
Quelación
Reactivación enzimática con
iones solosReactivación enzimática en
combinación iónica
Parámetros cinéticos
Marco general
¿Qué es la pirazinamida?
nicotinamidapirazinamida≈
Reducción del tratamiento de la TB de 9 a 6 meses
Marco general
Modo de acción de la Pirazinamida
* No tiene un blanco específico intracelular
*Pseudo-NAD (vía de reciclaje)
*Inhibición/feedback en síntesis de NAD
Disrupción de la fuerza protón motriz y
depleción de energía
Función de transporte de
membrana
Marco general
Pirazinamidasa de Mycobacterium tuberculosis
• Nicotinamidasa
• 37% de identidad de seq con Pzase de Pyrococcus horikoshii 999
• 6 hojas beta
• 4 alfa hélices
• Sitio activo: D8, A134, C138
• Sitio de coordinación: H51, H71, D49
Marco general
Diagrama del sitio activo unido al Zn+2 (en PH999)
Marco general
Mecanismo de hidrólisis de PZA por la PZAsa de Mycobacterium tuberculosis
Hipótesis
La enzima H37Rv de Mycobaterium tuberculosis quelada, podría reactivarse e incluso llegar a aumentar su actividad en presencia del Zn+2 o de algún metal de transición gracias a su unión en el sitio de coordinación.
Objetivos
• Encontrar el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima H37Rv de Mycobaterium tuberculosis quelada.
• Evaluar las consecuencias sobre la actividad enzimática frente a una interacción iónica en una misma reacción
• Determinar los parámetros cinéticos de la enzima H37Rv sin quelar (dejada a temperatura ambiente por 6 horas)
• Comparar los parámetros cinéticos de la enzima H37Rv quelada junto con los iones vs la enzima sin quelar
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Clonación y expresión
pET28a:: His6-PncA (se adicionan 6 His al extremo COO- de la enzima)
Escherichia coli Novablue cells
BL21(DE3)pLysS cells
expresión
Caldo LB + KanamicinaIPTGCentrifugar
Pellet en binding buffer (buffer fosfato 20mM. 0.5 NaCl, imidazol 20mM)
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Purificación de la enzima
Células a -70ºC
Sonicación
Centrifugación
Recuperación del sobrenadante
Obtención del extracto crudo
Cromatografía de afinidad
Fracción soluble
Columna His-Trap
Lavados con buffer 40 mM imidazol
Salida de la Pzasa con buffer 60 mM imidazol
Análisis de fracciones por SDS-PAGE
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Purificación de la enzima
SDS-PAGE Gel de las fracciones de la cromatografía
Prueba de Bradford
T10 T11 T12 T13 T14 M T15 T16
Concentración de fracciones
Nuevo SDS-PAGE
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Quelación Pzase H37Rv
Control Muestra quelada (qx)
* 50mM Buffer fosfato pH 6.45
* Agua MQ
* 50mM Buffer fosfato pH 6.45
* Agua MQ
* EDTA 80 mM
En incubación por 6 horas
a T amb
Lavar con buffer fosfato pH 6.45 (filtración, Amicon - membrana de ultrafiltración de 10 Kda) x 3 veces
Prueba de Bradford
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Prueba de actividad cualitativa (método de Wayne)
Enzima control y quelada (qx)
50 mM Buffer fosfato pH 6.45
Pirazinamida 20 mM
Agua MQ
Incubación por 3 min a 37ºC
Añadir sulfato de amonio ferroso 20%
Inmediatamente añadir 0.1M Buffer glicina pH 3.4
Diferencia en intensidad de color
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Reactivación de la Pzasa usando metales
Control Muestra Quelada
Enzima 3uM Enzima 3uM
50mM Buffer fosfato pH6.4 50mM Buffer fosfato pH6.4
Agua MQ Agua MQ
20mM PZA 20mM PZA
---- Con o sin ión (0.1-1.5mM) **
** según el metal
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Reactivación de la Pzasa usando metales
Iones
Fe2(SO4)3.H2O
FeSO4.7H2O
CuCl2.2H2O
Cd(NO3)2.4H2O
MgSO4.7H2O
CoSO4.7H2O
MnSO4.H2O
CaCl2
Zn (NO3) 2 .6H2O
Concentración óptima de cada
metal
Titulación
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Reactivación de la Pzasa usando metales
blanco controlqx sin
iónqx- Cd qx- Ca qx- Co qx- Cu qx-F e+2 qx- Fe+3 qx-Mg qx-Mn qx-Zn
----- x x x x x x x x x x x
X x x x x x x x x x x x
X x x x x x x x x x x x
----- ----- ----- x x x x x x x x x
x x x x x x x x x x x x
Pzasa
Buf.PO4
Agua MQ
ión
Pza
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Reactivación de la Pzasa usando metales
blanco controlqx sin
iónqx- Cd qx- Ca qx- Co qx- Cu qx-F e+2 qx- Fe+3 qx-Mg qx-Mn qx-Zn
2. Incubar las muestras por 30 minutos a 37ºC
1. Añadir sólo enzima, agua, buffer e ión (según el caso)
3. Añadir la Pza e incubar las muestras por 3 minutos a 37ºC
4. Agregar sulfato de amonio ferroso e inmediatamente buffer glicina pH 3.4
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Reactivación de la Pzasa usando metales
blanco controlqx sin
iónqx- Cd qx- Ca qx- Co qx- Cu qx-F e+2 qx- Fe+3 qx-Mg qx-Mn qx-Zn
T = 0 T = 1 T = 2 T = 3 T = 4 T = 5 T = 6 T = 7 T = 8 T = 9 T = 10 T = 11
T = 3 T = 4 T = 5 T = 6 T = 7 T = 8 T = 9 T = 10 T = 11 T = 12 T = 13 T = 14
3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
Tiempo Pza
Tiempo de
detener la rxn
Tiempo de rxn /tubo
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Reactivación de la Pzasa usando metales
4. Agregar sulfato de amonio ferroso e inmediatamente buffer glicina pH 3.4
5. Centrifugar las muestras por 10 minutos a 13 000 RPM
6. Colocar por duplicado un volumen de cada muestra en un placa (espectrofotómetro a 450nm)
Prueba de actividad cuantitativa (método de Wayne)
7. Realizar prueba de Bradford de cada una de las muestras/rxn
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Reactivación de la Pzasa usando metales
Actividad Pzasa
0.0004
0.0143
0.0032
0.00060.0004
0.0105
0.0004 0.00030.0007
0.0097
0.0041
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
0.014
0.016
0.018
no qx qx sin ion Ca Cd Co Cu Fe2+ Fe3+ Mg Mn Zn
Ac
tiv
ida
d (
OD
/uM
*min
)
1er experimento2do experimento3er experimentopromedio
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Reactivación de la Pzasa usando metales
% de Recuperación de actividad enzimática
2.40
27.24
137.43
0.08 0.00 -0.28 3.32
92.39
37.17
-10.00
0.00
10.00
20.00
30.00
40.00
50.00
60.00
70.00
80.00
90.00
100.00
110.00
120.00
130.00
140.00
150.00
Ca Cd Co Cu Fe2+ Fe3+ Mg Mn Zn
%
1er experimento 2do experimento3er experimento promedio
% recuperación = (Act con metal - actividad qx sin ión) / ( actividad de no qx – actividad qx sin ión) x 100
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Reactivación de la Pzasa usando metales
% de Recuperación de actividad enzimática
2.40
27.24
137.43
0.08 0.00 -0.28 3.32
92.39
37.17
-10.00
0.00
10.00
20.00
30.00
40.00
50.00
60.00
70.00
80.00
90.00
100.00
110.00
120.00
130.00
140.00
150.00
Ca Cd Co Cu Fe2+ Fe3+ Mg Mn Zn
%
1er experimento 2do experimento3er experimento promedio
Los metales que reactivan más a la enzima: Co > Mn > Zn > Cd
¿Cuál será el efecto en una interacción iónica?
Reactivación de la Pzasa con 6 combinaciones posibles a partir de 4 iones
blanco control qx sin
iónQx
Cd+MnQx
Co+ZnQx
Co+CdQx
Mn+ZnQx
Mn+Cdqx
Zn+CdQx-Co Qx-Mn Qx-Zn Qx-Cd
Pirazinamidasa
Agua MQ
Pirazinamida
---- ---- ---- [óptima de ión] / 2 **
** [óptima] de ión
Co, Mn, Cd = 1mM
Zn = 1.5 mM
** [ión] en el experimento
Co, Mn, Cd = 0.5mM
Zn = 0.75 mM
¿Cuál será el efecto en una interacción iónica?
Reactivación de la Pzasa con 6 combinaciones posibles a partir de 4 iones
Actividad Pzasa
0.0039
0.0050
0.0092
0.0154
0.0011
0.0073
0.0123
0.0004
0.0087
0.0161
0.0099
0.0041
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
0.014
0.016
0.018
0.020
noqx qx sin ion Co + Cd Co + Mn Co + Zn Mn + Cd Mn + Zn Zn + Cd Co Mn Zn Cd
Act
ivid
ad (
OD
/uM
*min
)
1er experimento2do experimento3er experiementopromedio
¿Cuál será el efecto en una interacción iónica?
Reactivación de la Pzasa con 6 combinaciones posibles a partir de 4 iones
Por lo tanto:
• No habría sinergismo en ningún caso
• La interacción produciría en cambio una disminución de la actividad o se manifestaría como si se tratara del ión sólo
¿Cuál será el efecto en una interacción iónica?
De los 4 metales que dan lugar a una mayor reactivación enzimática: Co+2 >>>Mn, Zn, Cd ???
ENZYME - The Enzyme Data Bank
¿Cuál será el efecto en una interacción iónica?
De los 4 metales que dan lugar a una mayor reactivación enzimática: Co+2 >>> Mn, Zn, Cd???
¿Cuál será el efecto en una interacción iónica?
De los 4 metales que dan lugar a una mayor reactivación enzimática: Co+2 >>> Mn, Zn, Cd ???
¿Cuál será el efecto en una interacción iónica?
De los 4 metales que dan lugar a una mayor reactivación enzimática: Co+2 >>> Mn, Zn, Cd ???
¿Cuál será el efecto en una interacción iónica?
Habrá alguna relación entre la homeostasis iónica y el parasitismo intracelular?
X+2 = Fe+2, Cu+2, Mn+2, Zn+2
Nramp2 homólogo de rata
Simporter potones/cationes divalentes de amplia
especificidad
Fe+2 >> Zn+2, Mn+2, Cu+2, Co+2, Ni+2, Cd+2, Pb+2
¿Cuáles serán los parámetros cinéticos de la H37Rv?
Cinética enzimática
Kcat = nº de recambio
¿Cuáles serán los parámetros cinéticos de la H37Rv?
Cinética enzimática
¿Cuáles serán los parámetros cinéticos de la H37Rv?
Cinética enzimática de la H37Rv control
0 0.05 0.10 0.15 0.25 0.50 1 2 5 10 15 20
Pirazinamidasa
Buffer fosfato pH 6,4
Agua MQ
[Pza] mM
Incubación por 2 min a 37ºC
Intervalo de adición de la droga 1 min
Tiempo de reacción con la droga 1 minuto a 37ºC
¿Cuáles serán los parámetros cinéticos de la H37Rv?
Cinética enzimática de la H37Rv control
Velocidad vs [sustrato]
0.000
0.020
0.040
0.060
0.080
0.100
0.120
0.140
0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500
[sustrato uM]
Vel
oci
dad
(u
mo
l/min
)
Velocidad vs [sustrato]
-0.020
0.000
0.020
0.040
0.060
0.080
0.100
0.120
0.140
0.160
0.180
0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500
[sustrato uM]
Vel
oci
dad
(um
ol/m
in)
1er experimento
2do experimento
¿Cuáles serán los parámetros cinéticos de la H37Rv?
Cinética enzimática de la H37Rv control
1er experimento
Lineweaver-Burke y = 0.8186x + 5.8342R2 = 0.9985
0.000
20.000
40.000
60.000
80.000
100.000
120.000
140.000
160.000
180.000
-2.000 48.000 98.000 148.000 198.000 248.000
1/PZA (1/umol)
1/V
elo
cid
ad (
min
/um
ol)
¿Cuáles serán los parámetros cinéticos de la H37Rv?
Cinética enzimática de la H37Rv control
2do experimento
Lineweaver-Burke y = 1.2098x + 6.1112
R2 = 0.9935
0.000
10.000
20.000
30.000
40.000
50.000
60.000
70.000
80.000
90.000
100.000
-2.000 48.000 98.000
1/PZA (1/umol)
1/V
elo
cid
ad (
min
/um
ol)
Marco general
Acción de la pirazinamidasa
Metabolismo de NAD
NAD -glycohydrolase
Nicotinamide-nucleotide adenylyltransferase NAD(+) synthase
Nicotinamidase
phosphorilase
Marco general
Método de Wayne
Sulfato de amonio ferroso
Buffer glicina pH 3.4
¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
¿Cuál será el íon capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Reactivación de la Pzasa usando metales
Titulación: ej del Fe+2, del Mn+2 y del Zn+2
Titulación Fe+2
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
0.014
0.016
noquelada
qxsinion 0.01 0.05 0.1 0.25 0.5 0.75 1
Act
ivid
ad (O
D/u
M*m
in)
1er experimento
2do experimento
¿Cuál será el íon capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Reactivación de la Pzasa usando metales
Titulación: ej del Fe+2, del Mn+2 y del Zn+2
Titulación Manganeso
0.0000.0020.0040.0060.0080.0100.0120.0140.0160.0180.020
no qx qx sinion
0.01 0.05 0.1 0.25 0.5 0.75 1 1.5 2
Act
ivid
ad (
OD
/uM
*min
)
1er experimento
2do experimento
Titulación Zinc
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
no qx qx sinion
0.01 0.05 0.1 1 1.5 2
Act
ivid
ad (O
D/u
M*m
in)
1er experimento
2do experimento
¿Cuál será el íon capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Reactivación de la Pzasa usando metales
Titulación: ej del Fe+2, del Mn+2 y del Zn+2
¿Cuál será el íon capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Reactivación de la Pzasa usando metales
Iones [final en la rxn] mM
Fe2(SO4)3.H2O 0.1
FeSO4.7H2O 0.1
CuCl2.2H2O 0.1
Cd(NO3)2.4H2O 1
MgSO4.7H2O 1
CoSO4.7H2O 1
MnSO4.H2O 1
CaCl2 1
Zn (NO3) 2 .6H2O 1.5
% rec = d / x 100
¿Cuál será el íon capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?
Reactivación de la Pzasa usando metales
Actividad
Enz qx + iones
No qx
Qx sin ión
Ión1 Ión2 Ión3
d