Efecto de la savia liofilizada de Musa acumínata Colla plátano de...

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ucv - SClentia 3(1),.4ql1~ ._ o',,;'" Saravia V, LUJán M, Chávez M, Becerra L, Jimenez M, Cabeza J. . , Efecto de la savia liofilizada de Musa acumínata Colla "plátano de seda" sobre la respuesta inmune de Mus musculus BA~B/c frente a Escheríchía coli 0157:H7 Effect of Iyophilized sap from Musa acuminata Colla on activation of peritoneal macrophages and antibody production in BALB/c mice infected with Escherichia coli 0157:H7. SARAVIA CUEVA, Verónica1; LUJÁN VELÁSQUEZ, Manuela2; CHÁVEZ CASTILLO, Milciades3, BECERRA GUTIÉRREZ, Lizzie4; JIMÉNEZ CORONADO, Marianelas.CABEZA RODRIGUEZ Julio. No fueron encontrados conflictos de interés en este artículo. RESUMEN Se determinó el efecto de la savia liofilizada de Musa acuminata Colla "plátano de seda" sobre la activación "in vitro" de macrófagos peritoneales y la producción de anticuerpos en Mus musculus BALBjcinfectados experimentalmente con Escherichia coli 0157:H7. Para la activación "in vitro", los macrófagos fueron distribuidos en 03 sistemas: experimentales A y B estimulados con diferentes concentraciones de savia liofilizada de Musa acuminata Colla (SLM)y control estimulado con Medio Mínimo Esencial. Posteriormente, se adicionó E. coli 0157:H7, teniendo una concentración de savia de 16,3 ugjmL en el experimental Ay 8,75 ugjmL en el B. Luego se tomaron muestras para determinar el índice fagocítico y la actividad microbicida. Para la producción de anticuerpos, se utilizaron 03 grupos, dosificando a los experimentales A y Bcon SLMen concentraciones de 20 mgjkg y 10 mgjkg de peso respectivamente y al control con solución salina fisiológica, luego fueron infectados con E. coli 0157: H7 y se les extrajo muestras de 'sangre para la titulación de anticuerpos. Los resultados en la activación de macrófagos indicaron que los estimulados con 8,75 ugjmL de SLM presentaron un mayor índice fagocítico que los otros. El índice mkrobicida y el título de anticuerpos en los grupos con SLMen ambas concentraciones fueron mayores que el control. Concluyéndose, que la savia liofilizada de Musa acuminata Colla favorece el aumento del índice fagocítico, la actividad microbicida y el título de anticuerpos en Mus musculus BALBjcinfectados experimentalmente con E. coIi0157:H7. Palabras clave: Musa acuminata, Escherichia coli, Mus musculus, respuesta inmune. ABSTRACT This study attempted to determine the effect of Iyophilized sap from Musa acuminata Colla on "in vitro" activation of peritoneal macrophages and antibody production in BALBjcmice infected with Escherichia coli 0157:H7. Macrophage activation was determined by phagocytic index and microbicidal activity of murine peritoneal macrophages which were distributed in three groups: experimental A and experimental B, both had different concentrations of Iyophilized sap (SLM), while control group had minimal essential medium. After that, we added E. coli 0157:H7, so the concentration of SLMwas 16,3 ugjmL in experimental A and 8,75 ugjmL in experimental B. Then we took samples in order to determine the phagocytic index and microbicidal activity. Antibody production was studied in BALBjcmice randomly allocated in three groups: experimental A, experimental B and control. Experimental A and B were orally administered with SLMat 20 mgjkg and 10 mgjkg respectively, control group was administered with sterile normal saline. They were infected with E. coli 0157:H7 and then blood samples were collected in order to determine the antibody titer. Results showed that macrophages stimulated with SLMat 8,75 ugjmL had an increasing phagocytic index compared with the others. Besides microbicidal activity and antibody titer obtained in both experimental A and B were higher than control group. As a conclusion, Iyophilized sap from Musa acuminata Colla increases phagocytic index, microbicidal activity and antibody production in BALBjcmice infected with Escherichia coli 0157: H7. Key words: Musa acuminata, Escherichia coli, Mus musculus, immune response. 'Biólogo Microbiólogo. Universidad Nacional de Trujillo. [email protected] 'Doctor en Ciencias Biológicas. Biólogo Microbiólogo. UNT. [email protected] 'Doctor en Ciencias Biológicas. Biólogo Microbiólogo. Univ.Nacional [email protected] 'Ms. C. Microbiología Clínica. Biólogo Microbiólogo. Univ. Nacional de Trujillo. [email protected] 'Biólogo Microbiólogo. Universidad Nacional de Trujillo. [email protected]

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Efecto de la savia liofilizada de Musa acumínata Colla"plátano de seda" sobre la respuesta inmune de Musmusculus BA~B/c frente a Escheríchía coli 0157:H7

Effect of Iyophilized sap from Musa acuminata Colla on activation of peritonealmacrophages and antibody production in BALB/c mice infected with Escherichia

coli 0157:H7.

SARAVIA CUEVA, Verónica1; LUJÁN VELÁSQUEZ, Manuela2; CHÁVEZ CASTILLO, Milciades3,BECERRA GUTIÉRREZ, Lizzie4; JIMÉNEZ CORONADO, Marianelas.CABEZA RODRIGUEZ Julio.

No fueron encontrados conflictos de interés en este artículo.

RESUMEN

Se determinó el efecto de la savia liofilizada de Musa acuminata Colla "plátano de seda" sobre la activación"in vitro" de macrófagos peritoneales y la producción de anticuerpos en Mus musculus BALBjcinfectadosexperimentalmente con Escherichia coli 0157:H7. Para la activación "in vitro", los macrófagos fuerondistribuidos en 03 sistemas: experimentales A y B estimulados con diferentes concentraciones de savialiofilizada de Musa acuminata Colla (SLM)y control estimulado con Medio Mínimo Esencial. Posteriormente,se adicionó E. coli 0157:H7, teniendo una concentración de savia de 16,3 ugjmL en el experimental A y8,75 ugjmL en el B. Luego se tomaron muestras para determinar el índice fagocítico y la actividadmicrobicida. Para la producción de anticuerpos, se utilizaron 03 grupos, dosificando a los experimentales Ay Bcon SLMen concentraciones de 20 mgjkg y 10 mgjkg de peso respectivamente y al control con soluciónsalina fisiológica, luego fueron infectados con E. coli 0157: H7 y se les extrajo muestras de 'sangre para latitulación de anticuerpos. Los resultados en la activación de macrófagos indicaron que los estimuladoscon 8,75 ugjmL de SLM presentaron un mayor índice fagocítico que los otros. El índice mkrobicida y eltítulo de anticuerpos en los grupos con SLMen ambas concentraciones fueron mayores que el control.Concluyéndose, que la savia liofilizada de Musa acuminata Colla favorece el aumento del índice fagocítico,la actividad microbicida y el título de anticuerpos en Mus musculus BALBjcinfectados experimentalmentecon E. coIi0157:H7.

Palabras clave: Musa acuminata, Escherichia coli, Mus musculus, respuesta inmune.

ABSTRACT

This study attempted to determine the effect of Iyophilized sap from Musa acuminata Colla on "in vitro"activation of peritoneal macrophages and antibody production in BALBjcmice infected with Escherichia coli0157:H7. Macrophage activation was determined by phagocytic index and microbicidal activity of murineperitoneal macrophages which were distributed in three groups: experimental A and experimental B, bothhad different concentrations of Iyophilized sap (SLM), while control group had minimal essential medium.After that, we added E. coli 0157:H7, so the concentration of SLMwas 16,3 ugjmL in experimental A and8,75 ugjmL in experimental B. Then we took samples in order to determine the phagocytic index andmicrobicidal activity. Antibody production was studied in BALBjcmice randomly allocated in three groups:experimental A, experimental Band control. Experimental Aand Bwere orally administered with SLMat 20mgjkg and 10 mgjkg respectively, control group was administered with sterile normal saline. They wereinfected with E. coli 0157:H7 and then blood samples were collected in order to determine the antibodytiter. Results showed that macrophages stimulated with SLMat 8,75 ugjmL had an increasing phagocyticindex compared with the others. Besides microbicidal activity and antibody titer obtained in bothexperimental A and B were higher than control group. As a conclusion, Iyophilized sap from Musaacuminata Colla increases phagocytic index, microbicidal activity and antibody production in BALBjcmiceinfected with Escherichia coli 0157: H7.

Key words: Musa acuminata, Escherichia coli, Mus musculus, immune response.

'Biólogo Microbiólogo. Universidad Nacional de Trujillo. [email protected]'Doctor en Ciencias Biológicas. Biólogo Microbiólogo. UNT. [email protected]'Doctor en Ciencias Biológicas. Biólogo Microbiólogo. Univ.Nacional [email protected]'Ms. C. Microbiología Clínica. Biólogo Microbiólogo. Univ. Nacional de Trujillo. [email protected]'Biólogo Microbiólogo. Universidad Nacional de Trujillo. [email protected]

Efecto de la savia liofilizada de Musa acuminata Colla "plátano de seda",.,

INTRODUCCIÓN

E. coli enterohemorrágica se caracterizapor producir diarrea y colitis hemorrágicadesarrollando graves complicaciones comosíndrome urémico hemolítico y púrpuratrombocitopénica, a través de la producción de unaShiga toxina (Stx) 1.Dentro de este grupo tenemosa E. coli 0157:H7 cuya secuencia del procesopatogénico es la siguiente: la adherencia laxa alenterocito, seguida de la adherencia íntima, ladesorganización de las microvellosidades con laproducción de la lesión y la posterior liberación dela verotoxina 2,

Si bien E. coli es sensible a muchosantibióticos, no es aconsejable emplearlos demanera preventiva ya que pueden estimular laproducción de la toxina 3, por tal motivo surge labúsqueda de formas de prevención y tratamientocomo es la fitoterapia. Entre las diferentes plantasmedicinales se encuentra Musa acuminata Colla"plátano de seda" perteneciente a la familia de lasmusáceas 4.

M.acuminata Collapresenta un látex quees de consistencia lechosa en cuyo estudiofitoquímico se ha determin~do los componentesmás característicos, encontrándose proteínas,gomas, mucilagos, saponinas, almidón, resinas,taninos, compuestos reductores, coumarinas,flavonoides, esteroides y triterpenoides, algunosde los cuales tienen importancia desde el punto devista farmacológico 5.

Se han realizado estudios sobre el efectodel látex del plátano en el tratamiento de diversas

enfermedades, así tenemos que tiene propiedadesanalgésicas y utilidad terapéutica en el tratamientode enfermedades respiratorias crónicas como elasma bronquial, así como también en la úlcerapéptica 6,7.

Otros trabajos empleando la savia acuosade M. acuminata Colla mostraron una eficaz acciónbactericida contra Mycobacterium tuberculosis enCavia porcellus, y la acción de la savia liofilizada deMusa paradisiaca contra Trypanosoma cruzi, lo cualresulta efectivo al disminuir el riesgo de sufrir elataque de microorganismos y que esta mantengasus propiedades medicinales 8.9.

También se realizaron estudios con la savialiofilizada de M. acuminata Colla en donde se

demostró que tiene mayor acción sobre lafagocitosis de T. cruzi en comparación con la formaacuosa 10. Así mismo, se demostró que inhibe elcrecimiento de Staphylococcus aureus yPseudomonas aeruginosa, observándose que loshalos de inhibición dependen de los volúmenes dela savia 11.

Teniendo en cuenta que la respuestainmune tanto innata como adaptativa son lasbarreras que tienen que superar las bacterias, esque la presente investigación estuvo orientada aevaluar el efecto de la savia liofilizada de Musaacuminata Colla "plátano de seda" sobre laactivación "in vitro" de macrófagos peritoneales yla producción de anticuerpos en Mus musculusBALB/c infectados experimentalmente conEscherichia coli 0157: H7.

MATERIAL Y MÉTODOS

1. Material Biológico8 gramos de savia liofilizada de Musaacuminata Colla "plátano de seda"recolectada a partir del pseudotallocosechado en el distrito de Chocope,provincia de Ascope, La Libertad - Perú.

Cultivo de Escherichia coli 0157: H7proporcionado por la ColecciónPeruanadeCultivos Tipo de la UniversidadNacionaldeTrujillo - Perú.

22 especímenesde MusmusculusBALB/cde25 gramos de peso adquiridos del bioteriodel Instituto NacionaldeSalud, Lima- Perú.

2. Método2.1. Obtención de la savia liofilizada de M.

acuminata Colla "plátano de seda"Para la obtención de la savia, se realizó

un orificio en la parte central delpseudotallo para extraer la muestra.Luego, se centrifugó, se extrajo el

sobrenadante y se filtró al vacíoobteniéndose la savia en su forma acuosa

". De esta se separó 250 mL para sertratados mediante liofilización y finalmentese realizó una suspensión del liofilizado ensolución salina fisiológica estéril (SSFE) auna concentración de 250 ug/ml.2.2. Preparación del Inóculo de E. coli

0157:H7:El cultivo de E. coli 0157:H7 se

sembró en Agar: McConkey, Triple AzúcarHierro, Lisina Hierro, Citrato y Úrea. Paradiferenciarlo de otras E. coli se sembró enAgar McConkey Sorbitol, observándosecolonias no fermentadoras de sorbitol. Laconfirmación serológica se realizó conantisueros monoclonales para el antígeno0157.Luego, se realizó el cultivo puro y lasuspensión en SSFE, estandarizándose auna concentración de 1,5 x 108células/mL.

ucv - Scientia 3( 1), 2011.

2.3. Evaluación del efecto de la savialiofilizada de M. acuminata Colla sobrela activación "in vitro" de macrófagosperitoneales de M. musculus BALB/cenfrentados a E. coli O.157:H7:

2.3.1. Aislamiento y estandarización demacrófagos peritoneales:

Para ello se utilizaron 10ejemplares deM.musculusBALB/c,inoculándoles por vía intraperitonealMedio Mínimo Esencial (MEM).Posteriormente se les abrió elabdom~n y se extrajo el exudadoperitoneal, realizándose laestandarización de macrófagos auna concentración de 4x106células/mL 10.

2.3.2. Evaluación de la activación "invitro" de macrófagosperitoneales:

Se trabajó con 3 sistemas deevaluación de la siguiente manera:

Sistema Experimental A: 1 mLde macrófagos + 150 uL de savia.Sistema Experimental B: 1 mLde macrófagos + 75 uL de savia.Sistema Control: 1 mL demacrófagos + 150 uLde MEM.

Posteriormente, los sistemas seincubaron a 37°C por 1 hora.Después, se agregó 1 mL de E. coli0157:H7, obteniéndose unaconcentración final de savia de16,3 ug/mL en el experimental A yde 8,75 ug/mL en el B y se incubaronnuevamente a 37°C durante 1 hora.

2.3.2.1. Determinación del índicefagocítico:

A los 60 minutos, setomaron muestras y serealizaron frotises que fueroncoloreados con Giemsa. Lasláminas luego fueronobservadas hasta contar 100macrófagos. El índicefagocítico se expresó enporcentaje (%), indicando elnúmero de macrófagos quehabían fagocitado 10.

Saravia v, Luján M, Chávez M, Becerra L, Jimenez M, Cabeza J.

2.3.2.2. Determinación de laactividad microbicida:

Se tomaron muestras de0,5 mL a los O, 30 Y 60minutos, luego se les agregó1,5 mL de SSFE y secentrifugó a 3500 rpm.Posteriormente, se realizarondiluciones del sobrenadante Ysedimento, y se sembraron enplacas con TSA 12. Seincubaron a 370C durante 24horas y se realizó el recuentode UFC/mL.

2.4. Evaluación del efecto de la savialiofilizada de M. acuminata Collasobre la producción de anticuerposen M. musculus BALB/c infectadosexperimentalmente con E. coli0157:H7:

2.4.1. Dosificación de savia liofilizadade M. acuminata Colla:

La dosificación se realizó víaoral diariamente durante unasemana, de la siguiente manera:

Grupo Experimental A: 2 mL desavia (20 mg/kg de peso).

Grupo Experimental B: 1 mL desavia (10 mg/kg de peso).

Grupo Control: dosificados con 2mL de SSFE.

2.4.2. Infección con E. coIiOI57:H7:Al 80 día, fueron infectados por

vía oral con 0,2 mL de E. coli0157:H7 a una concentración de3x108 células/mL.

2.4.3. Determinación del título deanticuerpos:

Para ello, se les extrajo sangre alos 7,14,21 Y28 días post:-infección,se obtuvo el suero y se realizó lamicrotitulación de anticuerpos 13.

2.5. Análisis estadístico:Los datos obtenidos fueron

sometidos a pruebas de Análisis deVarianza y Fisher LSD, empleando elpaquete estadístico Biostat v.2009.

"

Efecto de la savia liofilizada de Musa acuminata Colla "plátano de seda",..

RESULTADOS

Figura 1. Índice fagocítico de macrófagos peritoneales de Mus musculus BALB/c inoculadoscon Escherichia coli 0157:H7 en los sistemas experimentales tratados con diferentes

concentraciones de savia liofilizada de Musa acuminata Colla: A (16,3 ug/mL) y B (8,75ug/mL.) y sistema control con medio mínimo esencial.

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Control

Sistemas de evaluación in vitro

* p < 0,05. d.f =2Experimental A- Control; P = 0,0002Experimental B -Control; P = 0,0001Experimental A- Experimental B; P = 0,0004

Figura 2. Índice microbicida "in vitro" de macrófagos peritoneales en (2a) sobrenadante y(2b) sedimento de los sistemas experimentales tratados con diferentes concentr~ciones de

savia liofilizada de Musa acuminata Colla: A (16,3 ug/mL) y B (8,75 ug/mL) y sistemacontrol con medio mínimo esencial inoculados con Escherichia coli 0157:H7 y evaluados

durante 60 minutos.

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o 30 60'Tiempo de evaluación (minutos)

o 30 60.

Tiempo de evaluación (minutos)

-Control -Experimental A _Experimental B_Control -Experimental A _Experimental B

(2b) Sedimento(2a) Sobrenadante

(2a) * P< 0,05. d.f =2 Experimental A - Control: P = 0,0002; Experimental B - Control: P = 0,0001;Experimental A - Experimental B: P = 0,1004.

(2b) * P< 0,05. d.f =2 Experimental A - Control: P = 0,0013; ExperimentalB - Control: P = 0,0003;Experimental A - Experimental B: P = 0,2988.

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ucv - Scientia 3(1), 2011 Saravia V, Luján M, Chávez M, Becerra L, Jimenez M, Cabeza J,

Figura 3. Título de anticuerpos producidos en Mus musculus BALBjc de los gruposexperimentales tratados con diferentes concentraciones de savia liofilizada de Musaacuminata Colla: A (20 mgjkg) y B (10 mgjkg) y grupo control con solución salina

fisiológica a los 28 días post-infección con Escherichia coli 0157:H7.

c:'ouu~c:

1200

1000

800

600

400

200

o

Experimental A

* p < 0,05. d.f=2

Experimental A - Control; P = 0,0001Experimental B- Control; P = 0,0001

Experimental B Control

Grupos de evaluación

DISCUSIÓN

El efecto de la savia liofilizada de M.acuminata Colla sobre la activación "in vitro" demacrófagos peritoneales se determinó en base alíndice fagocítico, observándose que el sistemaexperimental B que contenía macrófagosestimulados con 8,75 ug/mL de savia tuvo unmayor índice fagocítico (45,2%), en comparacióncon el experimental A estimulado con 16,3 ug/mL(36,8%) y el control (21,2%) (Figura 1).

Al comparar los sistemas experimentalescon el control se encontró diferencia significativa(P<0,05), por lo que podemos decir que la saviatiene efecto inmunopotenciador; esto podríaexplicarse ya que incrementa la adherencia através de mecanismos similares a los que ejercenlas proteínas séricas que se unen a receptorespresentes en las membranas celulares; así mismo,se considera de que ciertas moléculas de la saviapromueven la síntesis de proteínas de membranade los fagocitos lo que se traduciría a la superficiede la matriz extracelular 14,15.

Al comparar los sistemas experimental A yexperimental B se encontró diferencia significativa

(P<O,05). El hecho de que este efecto inductor seamayor (45,2%) a menor concentración de la savia,sugiere de que a mayor concentración existaimpedimento estérico entre las moléculascomponentes de lasavia 15.

Un estímulo activador no siempre concluyecon una destrucción antigénica efectiva, ya que unamisma sustancia puede ejercer efectosestimuladores y supresores sobre diferentesaspectos de la activación de macrófagos 15, es porello que se evaluó la actividad microbicida de lasavia de M. acuminata Colla, observándose que losrecuentos de E. coli 0157: H7 en los sistemasexperimentales A y B fueron menores que en elsistema control, existiendo diferencia significativa(P<O,05), lo que indica que la savia establece unestado de activación metabólica que permiteduplicar la efectividad funcional de las célulascontrol, a través de la acción directa de loscompuestos musáceos sobre los fagocitosperitoneales 10,11,16.

Los resultados obtenidos evidencian que lasavia produce un incremento en la capacidad de la

Efecto de la savia liofilizada de Musa acuminata Colla "plátano de seda"...

maquinaria celular para destruir bacterias, estaacción posiblemente se base: primero, en elestablecimiento de interacciones ligando-receptorentre las moléculas de la savia y los receptores dela célula; y segundo, en que ~as moléculas de lasavia son ingeridas rápidamente; por lo que larespuesta dependerá del número de receptoresocupadosy lavelocidad deasociación15.16.

Al comparar los recuentos de E. coli0157:H7 en el sistema experimental A se observóque eran mayores que en el experimental S (Figura02a y 02b), indicándonos que la acción bactericidaes inversa a la concentración de la savia de M.acuminata Colla. Esta efectividad de losmacrófagos coincide con otras investigaciones endonde evaluaron la acción de la savia de M.paradisiaca sobre Mycobacterium tuberculosis,observándose que al disminuir la concentración, eldesarrollo bacteriano decrecía 17.

Así mismo, se observó que los títulos deanticuerpos a los 28 días en los grupos

experimentales A Y S (640) dosificados con la saviafueron mayores que los del grupo control (160)(Figura 3), existiendo diferencia significativa(P<O,05). Esto podría explicarse ya que la saviatiene la capacidad de incrementar la expresiónantigénica en la superficie celular del macrófagocomo consecuencia de la liberación de interferón y

que permite la mayor expresión del complejomayor de histocompatibilidad 12.

Al no encontrarse diferencia entre lostítulos de anticuerpo de los grupos experimentalesA y S, se sugiere realizar investigacionesincorporando periodos de dosificaciónprolongados, para reforzar la existencia de tiemposefectivos en los que se verifique una máximaactividad; así mismo emplear diferentesconcentraciones de savia, ya que se comprobó quelas concentraciones más altas no son sinónimo demayor actividad, con dosis elevadas del productovegetal, los receptores celulares se saturan y laactividad se dificulta.

CONCLUSIONES

La savia liofilizada de Musa acuminata Colla"plátano de seda" a la concentración de 8,75 ugl.mLpresenta una mayor efectividad en el aumento '.delíndice fagocítico de macrófagos peritoneales 'deMus musculus SALS/c infectados con Escherichiacoli0157:H7.

La savia liofilizada de M. acuminata Colla

"plátano de seda" aumenta la actividad microbicidade macrófagos peritoneales de M. musculus SALS/cinfectados conE.coli0157:H7.

La savia liofilizada de M. acuminata Colla"plátano de seda" incrementa el título deanticuerpos en M. musculus SALS/c infectadosexperimentalmente con E. coli0157:H7.

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17.

Recibido: 17 marzo 2011 I Aceptado: 01 julio 2011