1

SECRETARÍA DE EDUCACIÓN PÚBLICA

SISTEMA NACIONAL DE EDUCACIÓN SUPERIOR TECNOLÓGICA

DIRECCIÓN GENERAL DE EDUCACIÓN SUPERIOR TECNOLÓGICA

SUBSECRETARÍA DE EDUCACIÓN SUPERIOR

INSTITUTO TECNOLÓGICO DEL VALLE DE MORELIA

EFECTO DE NH4 NO3, KNO3 y Ca (NO3)2 EN LA CALIDAD DE BROTES DE

STEVIA rebaudiana BERTONI PROPAGADA in vitro.

PROTOCOLO DE TALLER INVESTIGACIÓN 2

QUE PRESENTA:

SALAS GARCIA MARBELLA

71

INGENIERÍA EN AGRONOMIA

Dr. Santana Huicochea Gerardo Edmundo

MORELIA, MICHOACÁN,15 DE MAYO DE 2014

2

ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................................... 4

2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................................................... 6

3. OBJETIVOS ................................................................................................................................................ 7

3.1. Objetivo general ............................................................................................................................. 7

3.1.1. Objetivo específico ..................................................................................................................... 7

4. HIPÓTESIS ................................................................................................................................................. 8

4.1. Hipótesis nula .................................................................................................................................. 8

5. JUSTIFICACIÓN........................................................................................................................................ 9

5.1. Social ................................................................................................................................................... 9

5.1.1. Justificación económica ........................................................................................................... 9

5.1.2. Justificación ecológica .............................................................................................................. 9

5.1.3. Justificación tecnológica .......................................................................................................... 9

6. MARCO TEÓRICO Y ANTECEDENTES ........................................................................................ 10

6.1. Clasificación taxonómica de S. rebaudiana ....................................................................... 10

6.2. Descripción botánica de la Stevia rebaudiana Bertoni ................................................. 11

6.3. Contenido nutricional ............................................................................................................... 11

6.4. Requerimientos edafoclimaticos .......................................................................................... 11

6.5 Requerimientos nutricionales ................................................................................................ 12

6.7. Producción in vitro de S. rebaudiana .................................................................................. 13

7. METODOLOGÍA .................................................................................................................................... 15

7.1. Preparación del medio de cultivo ......................................................................................... 15

7.2. Obtención de los explantes y establecimiento del cultivo aséptico. ....................... 16

7.2.1. Protocolo de desinfección ................................................................................................... 16

7.3Tratamientos a evaluar ............................................................................................................... 17

8. RESULTADOS ESPERADOS .............................................................................................................. 19

9. CRONOGRAMA ..................................................................................................................................... 20

10. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................................... 21

10.1 Bibliografía en línea ................................................................................................................. 22

3

ÍNDICE DE CUADROS

Cuadro 1. Composición del medio de cultivo propuesto por Murashige y Skoog

(1962)…………………………………………………………………….………………………………..14

Cuadro 2. Soluciones empleadas en el medio de cultivo según. (Villegas

1993)……………………………………………………………………………………………………….15

4

RESUMEN

La S. rebaudiana es una especie perteneciente a la familia de las Asteraceae; su

importancia incide en el sabor dulce característico debido a los esteviosidos y

rabaudiosidos que posee toda la planta en particular las hojas, es un azúcar

simple debido a esto no es perjudicial al organismo además que desde un punto

de vista medicinal regula la glucosa, es antidiurética, ayuda a combatir la caries.

Desde el punto de vista económico es un cultivo que ha tenido un gran impulso ya

que se ha estado buscando una nueva alternativa para poder sustituir el azúcar

obtenido de la caña de azúcar por edulcorantes naturales, S. rebaudiana es un

cultivo nuevo y muy bien aceptado por algunos países, la S. rebaudiana se

propaga principalmente por semilla pero no es viable ya que tarda mucho en

germinar, y por esquejes se pierde la homogeneidad de cultivo es por esto que se

han buscado nuevas alternativas de propagación y la propagación in vitro es una

muy buena alternativa ya que se obtiene mayor número de plantas en poco tiempo

y con condiciones asépticas muy buenas, pero para este cultivo no se cuenta con

la información nutrimental necesaria para el medio de cultivo es por esto que esté

trabajo se pretende definir las concentraciones adecuadas de NH4 NO3, NO3 Y Ca

(NO3)2 que la plata necesita para su crecimiento y desarrollo en condición in vitro.

El siguiente anteproyecto se realizará en el laboratorio de biotecnología del ITVM

en Morelia Michoacán, y tiene como finalidad conocer los requerimientos

nutricionales para una mayor producción de brotes y mayor área foliar, se

utilizarán segmentos del tallo de 2 cm de longitud aproximadamente, y se

sembrarán en un medio de cultivo modificado por Villegas. Se realizarán 3

experimentos sucesivos utilizando un diseño completamente al azar; el primer

experimento consistirá en evaluar niveles de NH4 NO3 a 0, 6, 12, 24 (mM) el

segundo experimento consistirá en evaluar niveles de KNO3 a 5, 10, 15,20 (mM) y

el tercer experimento consistirá en evaluar niveles de 0, 0.7, 1.4, 2.1, 2.8 (mM).

Los expantes se encubaran en la sala de incubación por un periodo de cuatro

semanas, donde recibirán una temperatura de 22-25°C y un foto periodo de 16

horas luz y 8 horas obscuridad. Las variables a estudiar: i) Conductividad eléctrica

(CE), ii) pH, iii) Longitud de brotes, iv) Número de brotes, v) contaminación, vi)

contenido de NO3, K y Ca en el medio de cultivo a los 15, 21 y 30 días después de

la siembra, vii) Contenido de NO3, K y Ca en los tejidos 30 días después de la

siembra, viii) área foliar y ix) clorofila total.

5

1. INTRODUCCIÓN

Debido al incremento en la utilización de la caña de azúcar como biocombustible,

se ha buscado la forma de encontrar sustitos directos del azúcar de caña, ya que

el tipo de azúcar “glucosa” provoca daños a la salud ante este problema se han

buscado alternativas como la S. rebaudiana (Jaramillo et al., 2014).

El problema ocasionado por los efectos secundarios de los edulcorantes químicos

ha ocasionado un aumento en la demanda de los edulcorantes naturales, entre los

que se encuentra la S. rebaudiana. Japón se ha optado por el uso de cristales de

S. rebaudiana en lugar del consumo de caña de azúcar, afectando ya el 50 % del

mercado en ese país. Esto también se debe a que los edulcorantes sintéticos

están prohibidos desde 1970. En la mayor parte del mundo se comienza con este

cambio, siguiendo los pasos de Japón, sobre todo en los países primermundistas

(INIFAP 2012).

La S. rebaudiana tiene propiedades edulcorantes con un contenido ínfimo de

calorías. Los glucósidos que se extraen de esta planta, esteviósidos,

rebaudiósidos y dulcósidos, endulzan hasta 300 veces más que el azúcar refinado,

mientras que la planta en su forma natural es 15 veces más dulce que el azúcar

de mesa o sacarosa. Las hojas secas son entre 20 y 35 veces más dulces que el

azúcar (Brandle, 2005).

Por lo tanto, el cultivo de la S. rebaudiana es innovador y muy rentable, pues

presenta condiciones promisorias en los mercados nacionales y mundiales. Es

interesante observar cómo el consumo de esta planta, ya sea como hierba o como

productos industrializados derivados de esta especie vegetal, está destinado a

sustituir el mercado del uso de edulcorantes sintéticos tales como el aspartame,

las sacarinas y los ciclamatos (SAGARPA 2011).

La alta demanda de esta planta hizo que se buscaran nuevas alternativas de

poderla propagar en poco tiempo, ya que su propagación tradicional es por semilla

o esqueje pero tardo mucho en tener plantas en producción, El cultivo de tejidos

es otro método de propagación vegetativa que permite plantaciones más

uniformes, además, se obtiene una rápida multiplicación clona, pero la poca

información que hay sobre el medio de cultivo es una limitante para la propagación

in vitro. Es por esto que el presente trabajo se da a conocer la importancia que

tiene la nutrición para los medios de cultivo in vitro, y se pretende generar

información sobre el adecuado medio de cultivo para la S. rebaudiana.

6

2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En los últimos años las agroindustrias ha introducido en el mercado internacional

los edulcorantes artificiales bajos en calorías a base de componentes químicos los

cuales surgieron para satisfacer las necesidades de personas con limitaciones

respecto al consumo de azúcar y calorías en su dieta. Asimismo, se han explorado

otras alternativas como son los edulcorantes naturales cuyos beneficios son

similares a los de los edulcorantes artificiales pero con el valor agregado de no

causar efectos nocivos en la salud.

El rápido desarrollo de la industria de edulcorantes y la búsqueda de alternativas

menos riesgosas que los edulcorantes sintéticos tradicionales, ha hecho que la

S. rebaudiana prospere en países como Brasil, China, Japón, Corea, Tailandia,

Israel. Por eso en este proyecto se expresa la importancia que tiene la S.

rebaudiana como un posible sustituto del azúcar, sin causar daños al organismo.

Una alternativa para producir planta de calidad y se pueda abastecer la demanda

nacional e internacional de esta especie es la técnica de cultivo de tejidos

vegetales, sin embargo para el medio de cultivo en el laboratorio de Biotecnología

del ITVM no se cuenta con un medio de cultivo específico para multiplicar plantas

de calidad. Ante este problema se pretende definir tres de los macro nutrimentos

que la planta necesita para su crecimiento y desarrollo en el medio de cultivo

como es el caso de N- nitrato de amonio, N-K nitrato de potasio N-Ca nitrato de

calcio, los cuales influyen en los diferentes procesos metabólicos de la planta y

que a altas o bajas concentraciones puede provocar trastornos fisiológicos en las

platas lo que afecta a esta especie en campo.

7

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo general

Conocer el efecto de nitrato de amonio (NH4 NO3), nitrato de potasio (KNO3),

nitrato de calcio (Ca (NO3)2) en el medio de cultivo in vitro de S. rebaudiana, para

una mayor producción de brotes en el laboratorio de Biotecnología del Instituto

Tecnológico del Valle de Morelia.

3.1.1. Objetivo específico

Determinar la concentración óptima para la generación de brotes axilares

de S. rebaudiana.

Establecer las condiciones nutricionales del cultivo in vitro para la

propagación de la S. redaudiana.

Generar información científica en el esquema de propagación in vitro de

platas de calidad de S. rebaudiana en el laboratorio de Biotecnología del

Instituto Tecnológico del Valle de Morelia.

8

4. HIPÓTESIS

4.1. Hipótesis nula

Con diferentes concentraciones de NH4 NO3, KNO3, Ca (NO3)2 en los medios de

cultivo in vitro para la S. rebaudiana no influyen en la longitud de brotes ni en el

área foliar.

4.1.1. Hipótesis alterna

Con diferentes concentraciones de NH4 NO3, KNO3, Ca (NO3)2 en los medios de

cultivo in vitro para la S. rebaudiana tendrá una mayor proporción en la longitud

de brotes y una mayor el área foliar.

9

5. JUSTIFICACIÓN

5.1. Social

En la actualidad, los edulcorantes naturales constituyen una excelente alternativa

en la industria alimenticia. Si bien, ésta industria emplea desde hace varios años

productos químicos como el aspartamo, acelsufame-K, sacarina o ciclamato, la

inocuidad de estas sustancias ha estado siempre como tema de discusión en los

principales foros académicos alimenticios, generando desconcierto entre los

consumidores de productos bajos en calorías, e incluso múltiples dudas entre las

propias autoridades reguladoras, en especial cuando se habla del largo plazo de

ingesta de éstas sustancias. En los últimos años se ha investigado en plantas

medicinales alternativas de edulcorantes mucho más seguras y que a la vez

mantengan el índice de dulzor en niveles adecuados para el consumo humano;

destacan entre las sustancias más estudiadas Taumatina, Monellina y Steviósidos,

las cuales ya forman parte de muchos productos alimenticios

En las últimas décadas el cultivo de la S. rebaudiana se ha convertido en el centro

de atención de muchos sectores agrícolas del mundo, iniciando su trayectoria

desde los campos de Paraguay y Brasil donde se ha dado origen a esta especie

de edulcorante natural.

5.1.1. Justificación económica

Es un cultivo de gran potencial económico, sabiendo que el esteviosido puede ser

usado como edulcorante natural no calórico, ya que no es asimilado por el

organismo humano, puede ser utilizado como azúcar dietético.

5.1.2. Justificación ecológica

Es una planta silvestre debido a esto se puede adaptar a suelos pobres, podemos

utilizar suelos degradados para poder establecer el cultivo.

5.1.3. Justificación tecnológica

La técnica de propagación de tejidos vegetales es una buena técnica para

propagar la S. rebaudiana ya que se obtienen explantes libres de patógenos y con

una nutrición adecuada para cuando se lleve a campo tenga buena adaptabilidad

y alta producción.

10

6. MARCO TEÓRICO Y ANTECEDENTES

La S. rebaudiana es originaria de Paraguay y descubierta en 1887: fue descrita y

clasificada en 1889 por el botánico suizo Moisés Santiago Bertoni (1857-1929),

momento a partir del cual recibió el nombre científico de Stevia rebaudiana Bertoni

(Ministerio de Agricultura y Ganadería, 1996).

Es una planta herbácea con propiedades extremadamente favorables para la

salud humana, es utilizada como endulzante natural pues sus hojas molidas son

300 veces más dulces que el azúcar de caña y si secáramos la hoja entera es 15

veces más dulce que el azúcar común (INIFAP 2012).

La S. rebaudiana, es una especie de la familia de las asteráceas nativa de la

región tropical de Sudamérica; se encuentra aún en estado silvestre en el

Paraguay, especialmente en el departamento de Amambay, pero desde hace

varias décadas se cultiva por sus propiedades edulcorantes y su bajo contenido

calórico (Cortes 2012).

6.1. Clasificación taxonómica de S. rebaudiana

Según Salgado (2007) menciona lo siguiente:

Subreino: Eukaryota Reino: Plantae Subreino: Tracheobionta Subdivisión: Spermatophyta División: Magnoliophyta Clase: Magnoliopsida Subclase: Asteridae Orden: Asterales Familia: Asteraceae Subfamilia: Asteroideae Género: Stevia Especie: rebaudiana Nombre binomial: Stevia rebaudiana Bertoni

11

6.2. Descripción botánica de la Stevia rebaudiana Bertoni

La S. rebaudiana, es un arbusto que alcanza los 90 cm de altura, durante su

desarrollo inicial no posee ramificaciones, llegando a producir hasta 20 tallos en

tres a cuatro años, es una planta subfruticosa, con tallo anual, subleñosa,

ramificada formando múltiples brotes con tendencia a inclinarse Álvarez (2004).

La raíz es perenne, fibrosa, filiforme, abundante, formando cepa. Las hojas son

pequeñas, lanceoladas, muy dulces, festoneadas, opuestas en verticilos

alternados, sésiles. La parte más ancha de la hoja se encuentra en la mitad de la

parte superior (Bonilla et al., 2007).

La flor es hermafrodita, pequeña y blanquecina; su corola es tubular,

pentalobulada, en capítulos pequeños terminales o axilares, agrupados en

panículas corimbosas, agrupados en panículas corimbosas, de lóbulos blancos. El

fruto es un aquenio delgado y plumoso (Flores et al., 2011).

6.3. Contenido nutricional

Más del 50 %: carbohidratos de fácil asimilación.

Más del 10 %: fibras, polipéptidos (proteínas vegetales).

Más del 1 %: lípidos, potasio.

Entre el 0.3 y 1 %: calcio, magnesio y fósforo.

Menos del 0.01 %: cromo, cobalto, hierro, manganeso, selenio, silicio, zinc

(INIFAP 2012).

6.4. Requerimientos edafoclimaticos

Zuabieta (2007) menciona lo siguiente:

Temperatura: 15 a 30 °C.

Humedad relativa: 75 a 85 %.

Precipitación: 1000 -2000 mm.

Altitud: 300-1800 msnm.

Topografía: Plana.

pH: 6,5 a 7.

Suelos: De textura franco arenosa a franco, buena permeabilidad y

drenaje.

Requiere una alta luminosidad, 13 horas de luz día.

Vientos: Moderados.

12

6.5 Requerimientos nutricionales

Los fertilizantes químicos aportan nutrientes esenciales a las plantas; Existen

formulaciones y /o combinaciones que pueden ser utilizadas en el momento de la

fertilización química del cultivado de la S. rebaudiana Bertoni y una de las más

recomendadas debido a su abundancia en el mercado, lo cual facilita su

obtención, es:

60 Kg de N

60 Kg de óxido de potasio (K20)

120 Kg de anhídrido fosfórico (P202)

Una de las recomendaciones más importantes, especialmente para el nitrógeno,

es la de no aplicar en una sola oportunidad toda la dosis de fertilizante

recomendada; esto se realiza atendiendo al comportamiento nutricional de la

planta en sus diferentes etapas de su desarrollo; es decir que la planta presente

una exigencia nutricional variada en cada etapa de su desarrollo.

En una investigación desarrollada en 2002, se cuantificó el efecto de la aplicación

de dosis combinadas de los elementos N, P y K sobre variables morfológicas y

fisiológicas de ‘Morita 2’ y se determinaron los contenidos de estos elementos en

la planta en diferentes estados de desarrollo. Se utilizó un diseño completamente

aleatorio con tres repeticiones.

Respuestas observadas en la acumulación de biomasa de las hojas por planta

mostraron que, ante la ausencia de P, los niveles altos de K pueden incidir de

manera negativa sobre esta biomasa, pero que a niveles medios y altos de P el

aumento del peso seco de las hojas es directamente proporcional al incremento en

los niveles de K, lo que sin duda sugiere la importancia de mantener niveles

adecuados de los dos elementos en el plan de nutrición. Asimismo, se pueden

analizar los resultados en el sentido que no hay respuesta importante al P cuando

la aplicación de K es cero, pero es alta y positiva cuando los niveles de K

disponible son altos (Jarma 2014).

Por la rápida aceptación de este nuevo edulcorante natural, la producción se ha

visto forzar para cumplir con la demanda que se tenía, se buscaron nuevas

alternativas de propagación, ya que tradicionalmente se hacía por semilla o

esqueje pero el tiempo que tardan en tener plántulas para poder establecer un

cultivo en determinada superficie se prolongaba bastante tiempo, se buscaron

nuevas alternativas de propagación como es la propagación in vitro.

13

6.6. Propagación in vitro

La propagación in vitro o micropropagación se define como cualquier

procedimiento aséptico que comprenda la manipulación en las plantas de órganos,

tejidos o células que produzcan poblaciones de plántulas “limpias”, Las ventajas

de la micropropagación, en comparación con sistemas convencionales, son el

incremento acelerado del número de plantas, la disminución del tiempo de

multiplicación, un mayor número de plantas por superficie utilizada, el mayor

control de la sanidad, el fácil transporte para intercambio internacional de

materiales y la posibilidad de multiplicar rápidamente especies en peligro de

extinción( Landázur et al., 2014).

La propagación in vitro, es un método alternativo para producir mayor cantidad de

plantines en menor tiempo. Reporta una tasa de multiplicación de 3 a 4 en cada

subcultivo, utilizando ápices meristemáticos. El número de subcultivos promedio

que se reporta es de 5, para un total aproximado de 3200 plantines por explante

en un periodo de 8 meses, considerando un 75 % de sobrevivencia. Además, La

clonación in vitro es la técnica más factible a la hora de realizar mejoramiento

genético, ya sea para la obtención de plantas uniformes y con alto contenido de

steviosido y rebaudiosido (glucósidos de mayor poder edulcorante), así como para

lograr plantas con mayor rendimiento en hojas (Delvalle 2001).

6.7. Producción in vitro de S. rebaudiana

Según CIAT (1990) la mayoría de las plantas cultivadas in vitro pasan por las

siguientes etapas en el proceso de micorpropagación:

1) La selección del mejor explante es muy importante ya que de esto dependerá la

futura propagación. Los explantes pueden tener un origen diverso como secciones

de hojas, micro-estacas, raíces, meristemos.

El mejor procedimiento para la selección del material vegetal, es recolectando

ramas de brotación joven de unos 10 a 12 cm de longitud. Se recomienda cortar

los tallos en horas de la mañana para evitar la deshidratación y con tijeras de

podar bien desinfectadas con alcohol al 70%.

2) Establecimiento, que consiste en la desinfección de los explantos

(generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al medio artificial

de modo de inducir callo, brote, raíz o embrión somático según se desee.

14

3) Multiplicación, para generar una masa vegetal suficiente para la regeneración

del número de plantas necesarias.

5.8. Medio de cultivo

El medio de cultivo tiene dos funciones principales, la primera es proporcionar los

nutrientes básicos para el crecimiento continuo de los explantes aislados y los

propagulos subsiguientes y la segunda, es dirigir el crecimiento y desarrollo

mediante el control hormonal, el éxito que del cultivo de tejidos depende del medio

de cultivo adecuado, así también del empleo de los tejidos viables, incubación,

calidad de reactivos (Vázquez 2012).

Los medios de cultivo se preparan a partir de soluciones concentradas 10 o

100 veces soluciones madre (Murashige y Skoog. 1962), como se menciona en el

cuadro 1 .En la solución madre se pueden mezclar varias sales minerales siempre

que no se produzcan problemas de precipitación. Algunos elementos, como el Fe,

se utilizan en forma de quelatos para mantener su disponibilidad durante el cultivo.

Cuadro 1. Solución madre para medios de cultivo in vitro

(Murashige y Skoog.1962)

Los medios de cultivo se pueden utilizar de forma líquida o con un agente

gelificante como el agar.

Para el cultivo de la S. rebaudiana se ha tenido mejor resultado en medio líquido,

producen mucho más rápido raíces en comparación con el medio gelificado.

15

7. METODOLOGÍA

El presente proyecto de investigación se establecerá en el laboratorio de

Biotecnología del Instituto Tecnológico del Valle de Morelia ubicado en el Km. 6.5

Carretera Morelia-Salamanca fraccionamiento Los Ángeles, Morelia Michoacán.

6.1 Medio de cultivo

Soluciones empleadas según (Villegas 1993).

Cuadro 2.

NH4 NO3 12ml

KNO3 10ml

CA (NO3)2 15ml

Mg SO4 15ml

KH2PO4 12ml

QUELATOS 10ml

MICRONUTRIENTES 10ml

MIO- INOSITOL 10ml

TIAMINA 10ml

BA 10ml

CISTEINA 50mg

SACAROSA 30g

pH 5.70

7.1. Preparación del medio de cultivo

1. Se mide en una probeta de 25 ml la dosis indicada de la solución madre, y

se coloca en un vaso de precipitado de 50 ml.

2. Se pesa 30 gramos de sacarosa en una báscula granataria.

3. Se pesa 50 mg de cisteína en una balanza analítica.

4. En un vaso de precipitado de 1ltr. Se coloca 700ml de agua destilada.

5. Se coloca en vaso de precipitado con los 700 ml de agua en un agitador

magnético, se coloca dentro del vaso las soluciones madre ya medidas,

sacarosa y posterior mente la cisteína.

6. Se afora a un litro.

7. Se ajusta el pH a 5.70 con la ayuda de un pH-metro se agrega KaOH al

10% para subir el pH y HCI al 10% para bajarlo.

16

8. Se coloca 10 ml del medio en tubos de ensaye, se coloca papel filtro dentro

del tubo, posteriormente se tapan.

9. Se agrupan 20 tubos con ayuda de una liga para poder manejarlos de una

manera más segura.

10. Se colocan en la autoclave los tubos de ensaye con el medio para ser

esterilizados.

11. Se prende en autoclave, se abre la válvula para que esta pueda ser

purgada, posteriormente se sierra y se deja que la temperatura llegue a

50°C, después se deja 15 minutos y se apaga.

12. Se deja que la presión baje y posteriormente se abre y se sacan los tubos

con el medio ya esterilizado, este se coloca en la salas de siembra.

7.2. Obtención de los explantes y establecimiento del cultivo aséptico.

1. Se obtiene una plata de S. rebaudiana, de preferencia joven y sana para que

sus brotes sean tiernos y no haya problemas al momento de la siembra.

7.2.1. Protocolo de desinfección

1. Posteriormente se colocan las varetas en un recipiente y se lavan con agua

y jabón de 2 a 3 veces

2. Se eliminan las hojas dejando una pequeña porción de peciolo, y se cortan

las varetas de aproximadamente 2 cm.

3. Sumergir las varetas en una solución de 250 ml de alcohol al 70% durante

un minuto manteniéndolas en agitación.

4. Pasar las varetas a una solución de hipoclorito de sodio al 12% por 10

minutos manteniéndolas en agitación.

5. Limpiar y esterilizar la sala de siembra.

6. Llevar las varetas en la solución de hipoclorito de sodio a la sala de

siembra, ya dentro de la campana de flujo laminar eliminar los residuos de

la solución de hipoclorito de sodio.

7. Colocar dentro de la campana de flujo laminar un mechero de alcohol,

pinzas, bisturí, algodón y un aspersor con alcohol.

8. Se esterilizan las pinzas y el bisturí por cada vareta que se siembra.

9. Se procede a realizar la siembra, se coloca en cada tubo de ensaye una

vareta, con la ayuda de las pinzas se empuja el papel filtro para que esté en

contento con el medio y la plata pueda alimentarse, procurando siempre

trabajar cerca del fuego para que la siembra sea lo más aséptica posible.

10. Se sellan todos los tubos con plastipack.

11. Posteriormente se llevan los tubos a las sala de incubación

Los explantes permanecerán en la sala de incubación durante 30 días

17

7.3Tratamientos a evaluar

El primer experimento consistirá en evaluar el NH4NO3, los tratamientos a evaluar

son los siguientes:

Tratamiento 1) 0 mM L-1.

Tratamiento 2) 6 mM L-1

Tratamiento 3) 12 mM L-1

Tratamiento 4) 18 mM L-1

Tratamiento 5) 24 mM L-1

El segundo experimento consistirá en evaluar el KNO3, los tratamientos a evaluar

son los siguientes:

Tratamiento 1) 0 mM L-1

Tratamiento 2) 5 mM L-1

Tratamiento 3) 10 mM L-1

Tratamiento 4) 15 mM L-1

Tratamiento 5) 20 mM L-1

El tercer experimento consistirá en evaluar el Ca (NO3)2, los tratamientos a

evaluar son los siguientes:

Tratamiento 1) 0 mM L-1

Tratamiento 2) 0.7 mM L-1

Tratamiento 3) 1.4 mM L-1

Tratamiento 4) 2.1 mM L-1

Tratamiento 5) 2.8 mM L-1

Las variables a evaluar

Conductividad eléctrica (CE).

pH.

18

Longitud de brotes.

Número de brotes.

Contaminación.

contenido de NO3, K y Ca en el medio de cultivo a los 15, 21 y 30 días

después de la siembra.

área foliar.

clorofila total.

Por cada una de las variables a evaluar se tomaron datos cada semana durante

un mes.

Para este experimento se utilizara un diseño experimental completamente al azar

son 3 tratamientos con 5 diferentes dosis y 20 repeticiones cada uno.

𝑌𝑖𝑗 = 𝜇 + 𝑇𝑖 + 𝛽𝑗 ∓ 𝐸𝑖𝑗

Dónde: Yij= Respuesta de la variable bajo estudio en relación con el tratamiento i

y el bloque j

μ= Media general del experimento

T= efecto del tratamiento i

β= Efecto del bloque j

E= error experimenta

19

8. RESULTADOS ESPERADOS

Se espera que con las modificaciones que se le harán al medio de cultivo

modificado por (Villegas 1993), la S. rebaudiana responda de una manera

favorable viéndose los resultados con un 60% en mayor de área foliar, número

de brotes y longitud de brotes.

20

9. CRONOGRAMA

Actividades Meses

Enero Febrero

S1 S2 S3 S4 S1 S2

1 2 3 4 5

Elaboración del medio de cultivo x

Esterilización del medio de cultivo en el autoclave

X

Establecimiento in vitro de los explantes de la S. rebaudiana

x

Trasladar a la sala de siembra x

toma de datos x X x x

Análisis anova x

Conclusiones del experimento x

21

10. BIBLIOGRAFÍA

Álvarez, J. (2004). Stevia revaudiana Bert. Universidad EAFIT 5 p.

Brandle, J., A. Richman., A. Swanson y B. Chapman. (2002). Leaf ESTs from

Stevia rebaudiana: a resource for gene discovery in diterpene synthesis. Plant Mol.

Biol. 50, 613-622.

Bonilla C., Carmen R., Sánchez O., Manuel S., y Perlaza., D. (2007). Evaluación

de métodos de propagación, fertilización nitrogenada y fenología de estevia en

condiciones del Valle del Cauca. Acta Agronómica vol. 56 (3): 131-134.

CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical). (1993). Cultivo de Tejidos en

la Agricultura; Fundamentos y Aplicaciones. Ed. Roca, W. M., Mroginski, L.A.

Cali, Colombia, Editorial XYZ. 969 p

Ministerio de Agricultura y Ganadería. (1996). Producción de Ka´a He´e. Tercera

edición. República de Paraguay, Asunción. 35 p.

Jaramillo, V. A. (2009). Stevia: Producción y Procesamiento de un Endulzante

Alternativo. Tesis de Grado. Escuela Superior Politécnica del Litoral, Guayaquil,

Ecuador.

Jarma, O., Combbatt, E., Cleves, L. (2010). Aspectos nutricionales y metabolismo

de Stevia rebaudiana (Bertoni). Una revisión Agronomía Colombiana, vol.

Universidad Nacional de Colombia Colombia 38.pp 199-208.

Landázuri P., Tigrero, S. (2009). Stevia rebaudiana BERTONI, una Planta

Medicinal. Sangolquí – Ecuador. Escuela politécnica del ejército departamento de

ciencias de la vida carrera de ingeniería en ciencias agropecuarias. p9

Salgado D. (2007). Estudio de pre-factibilidad para la industrialización y

comercialización de la stevia. Lima Perú: Pontificia Universidad Católica del Perú,

Facultad de Ciencias e Ingeniería. Mención: Ingeniería Industrial.

Villegas, M., Aguilar, C. (1993) Enraizamiento in vitro y establecimiento en suelo

de porta injertos tolerantes a la tristeza de los cítricos. Sociedad Mexicana de

Ciencias Hortícolas A.C. Veracruz, Ver.

SAGARPA. (2011). Paquete tecnológico Stevia (Stevia rebaudiana)

Establecimiento y mantenimiento.

22

INIFAP. (2012). El cultivo de Stevia (Stevia rebaudiana) Bertoni en condiciones

agroambientales de Nayarit, México. Folleto técnico número 19.

Delvalle, W. (2001). Propagación in vitro de Stevia rebaudiana B. a partir de

segmentos nodales. Escuela Agrícola Panamericana. Santo Domingo, Ecuador.

Vázquez, L. (2012). Cultivo in vitro de Stevia rebaudiana Bertoni. Colegio de

Posgraduados. Motecillo Texcoco, Estado de México.

Flores, J., Lita, E. (2011). Efecto de tres niveles de n, p, k y cuatro promotores de

crecimiento en el rendimiento de Stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) en selva

alegre, Imbabura. Universidad Técnica del Norte. Ibarra-Ecuador

Murashige, T., And Skoog. (1962). A revised medium of rapid growth and

bioassays with tobacco tissue. Physiol.Plantarum. PP. 473-497.

Cortes, J. (2012). Análisis de crecimiento del cultivo de Stevia (Stevia rebaudiana)

con proyección agroindustrial en el valle del cauca. Universidad de San

Buenaventura Cali. Santiago de Cali.

10.1 Bibliografía en línea

Zuabieta, F. (2007, 14 de febrero) Manual del Cultivo de la Stevia (Yerba Dulce)

de: http://www.engormix.com/MA-agricultura/cultivos-tropicales/articulos/manual-

cultivo-stevia-yerba-t1337/078-p0.htm