UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR

DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO COORDINACION DE POSTGRADO EN CIENCIA DE LOS ALIMENTOS Y NUTRICIÓN

MAESTRÍA EN CIENCIA DE LOS ALIMENTOS

EFECTO DE PROCESAMIENTOS CASEROS SOBRE ALGUNOS

CONSTITUYENTES FUNCIONALES DE LA LINAZA (Linum usitatissimum L.)

Trabajo de Grado presentado a la Universidad Simón Bolívar por:

Zoitza Bethzabé Ostojich Cuevas

Como requisito parcial para optar al grado académico de:

Magíster en Ciencia de los Alimentos

Realizado con la asesoría de la Profesora

Elba Sangronis

Abril, 2010

ii

iii

iv

DEDICATORIA

A mi papá, a mi abuelita Flor y a mi abuelo, quienes no pudieron acompañarme físicamente

en la culminación de esta meta.

A mi mamá por estar siempre a mi lado y apoyarme a pesar de todo.

A la Prof. Elba porque sin su paciencia y ayuda no habría logrado culminar este trabajo.

A mis sobrinas Arantxa, Isabella y Sofía por llenar mi vida de cariño y esperanza.

v

AGRADECIMIENTOS

A Dios Todopoderoso y a la Santísima Virgen por darme vida y salud para lograr mis metas.

A mi mamá por todo su amor, comprensión y tolerancia.

A mis tíos y tías por apoyarnos siempre, y muy en especial a Antonio, Dexis, Douglas y Vilmary por acogerme en sus hogares y por todos sus consejos.

A mis primos, en especial a Alfonso, Douglitas y Tamar por tener confianza en mi.

A la Familia Riesco Flores por adoptarme como un miembro mas de su familia.

A la Profesora Elba por toda su ayuda, paciencia y confianza.

A las Profesoras Alexia y Marisa por sus oraciones, consejos y atenciones.

A la Prof. Aleida por permitirme culminar esta etapa.

A la Sra. Lithz por ayudarme y apoyarme en todo lo que necesitaba.

A Gregoria, Olga y Yetzury por toda su ayuda.

A mis amigos Ericka, Gabriela, José, Rosalyn y Victoria por todo lo que hemos compartido juntos. A Claudia, Cristina y Dennar por su apoyo permanente.

A Eduardo, Jhoana, María Virginia, Rosaura y Yolmar por todas las alegrías y tristezas que hemos compartido juntos y por estar siempre pendientes.

A Lidia y Neida por su amistad y toda su ayuda, espero que algún día podamos volver a compartir como antes.

vi

A la Lic. Ericka Scherer y a la Ing. Paula Guerra por toda su ayuda y colaboración. A la Dra. Lisette Álvarez y al Sr. Jorge Rosso por su apoyo constante. Al Laboratorio de Soporte Científico de las Empresas Polar y al Laboratorio de Desechos Tóxicos de la USB por la colaboración prestada durante la realización de los análisis. A la Biblioteca Virtual de Biotecnología para las Américas de la UNAM por toda la ayuda prestada durante el desarrollo del trabajo.

A todos muchas gracias y Dios los bendiga!

vii

UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR

DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO COORDINACION DE POSTGRADO EN CIENCIA DE LOS ALIMENTOS Y NUTRICIÓN

MAESTRÍA EN CIENCIA DE LOS ALIMENTOS

EFECTO DE PROCESAMIENTOS CASEROS SOBRE ALGUNOS CONSTITUYENTES FUNCIONALES DE LA LINAZA (Linum usitatissimum L.)

Por: Ostojich Cuevas Zoitza Bethzabé

Carnet No.: 02-82886 Tutor: Prof. Elba Sangronis

Abril 2010

RESUMEN

En los últimos años se ha promovido el consumo de linaza (Linum usitatissimum L.) como alimento funcional debido a sus propiedades benéficas a la salud, atribuibles principalmente a su contenido de ácidos grasos omega-3, lignanos, y fibra dietaria. El objetivo principal de la presente investigación fue evaluar los efectos de los procesamientos caseros mas comunes aplicados a la linaza en Venezuela (remojo, cocción, tostado) sobre algunos de sus constituyentes. Para ello se caracterizaron 2 variedades de linaza, una canadiense y otra nacional cosechada en el estado Mérida. Se determinó su calidad microbiológica, análisis proximal y perfil de ácidos grasos, color, aw, concentración de HCN, polifenoles y capacidad antioxidante. Existen diferencias significativas entre la composición de las semillas, resaltando en ambas variedades su elevado contenido de grasa (40%), fibra dietaria (30%) y de ácido α-linolénico (60g/100g aceite). La linaza nacional contiene mayor contenido de polifenoles que la importada (1655 y 1435 mg/100g, respectivamente). La eficiencia antiradical de la linaza fue calificada como media y con un tiempo de reacción lento (TEC50>30 min). La concentración de HCN presente en la linaza es baja (40 mg/100g) y se remueve mayoritariamente durante el remojo de la semilla entera o molida. Los polifenoles y la capacidad antioxidante de la variedad importada resultaron significativamente afectados por el remojo en agua caliente, la cocción, y el tostado, mientras que en la variedad nacional no se observó un efecto significativo de los procesamientos sobre la eficiencia antiradical. Los extractos acuosos de linaza poseen pocas propiedades funcionales en comparación con la semilla completa. Se recomienda que el índice a considerar para evaluar la mejor forma de consumo de linaza sea el contenido de HCN equivalente. Se recomienda continuar la investigación sobre las semillas y los extractos para comprender mejor sus propiedades antiradicales.

Palabras Claves: linaza, HCN, polifenoles, antioxidantes.

viii

ÍNDICE GENERAL

Página

ÍNDICE DE TABLAS xi

ÍNDICE DE FIGURAS xiii

ÍNDICE DE ANEXOS xiv

INTRODUCCIÓN 1

CAPÍTULO I. MARCO TEÓRICO 4

1.1. Linaza: descripción, morfología y cultivo. 4

1.2. Composición de la linaza. 8

1.2.1. Grasa: cantidad y calidad. 9

1.2.2. Proteínas: cantidad y calidad. 14

1.2.3. Fibra dietaria. 17

1.2.4. Carbohidratos. 18

1.2.5. Minerales y vitaminas. 18

1.2.6. Compuestos fitoquímicos. 19

1.2.6.1. Compuestos polifenólicos. 20

1.2.6.2. Lignanos. 22

1.2.7. Compuestos antinutricionales. 23

1.2.7.1. Glucósidos cianógenos 25

1.3. Principales usos de la linaza. 28

1.4. La linaza como alimento funcional. 32

1.5. La linaza en Venezuela. 34

1.6. Procesamientos caseros aplicados a la linaza. 35

1.7. Consideraciones generales sobre los análisis químicos aplicados a la

linaza.

37

CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS 40

2.1. Materiales. 40

2.1.1. Materia prima. 40

ix

2.1.2. Equipos y reactivos. 40

2.2. Procedimientos experimentales. 41

2.2.1. Muestreo de las semillas. 41

2.2.2. Análisis microbiológico. 41

2.2.2.1. Preparación de la muestra. 42

2.2.2.2. Coliformes totales y fecales 43

2.2.2.3. Mohos y levaduras. 43

2.2.2.4. Staphylococcus aureus 43

2.2.2.5. Microorganismos esporulados aerobios. 44

2.2.2.6. Recuento presuntivo de Bacillus cereus. 44

2.2.2.7. Microorganismos esporulados anaerobios. 45

2.2.2.8. Pruebas bioquímicas para C. perfringens. 45

2.2.2.8.1. Nitrato-motilidad. 45

2.2.2.8.2. Licuefacción de la gelatina/fermentación de lactosa. 45

2.2.3. Limpieza de la muestra. 46

2.2.4. Análisis proximal. 46

2.2.4.1. Humedad. 46

2.2.4.2. Grasa. 46

2.2.4.3. Proteínas. 46

2.2.4.4. Proteínas solubles. 47

2.2.4.5. Cenizas. 47

2.2.4.6. Minerales. 47

2.2.4.7. Fibra dietaria. 48

2.2.5. Propiedades físicas. 51

2.2.5.1. Actividad de agua (aw). 51

2.2.5.2. Color. 51

2.2.6. Análisis químicos. 52

2.2.6.1. Perfil de ácidos grasos. 52

2.2.6.2. Mucílago. 53

2.2.6.3. Polifenoles totales. 53

2.2.6.4. Capacidad antioxidante. 54

x

2.2.6.5. Ácido cianhídrico (HCN). 55

2.2.7. Procesamientos caseros aplicados a la linaza. 57

2.2.7.1. Tostado. 57

2.2.7.2. Cocción. 57

2.2.7.3. Remojo. 58

2.2.8. Diseño experimental aplicado a los procesamientos. 58

2.2.9. Análisis estadístico de los resultados. 59

2.2.9.1. Prueba t de dos muestras independientes. 59

2.2.9.2. ANOVA Multifactorial. 59

CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 61

3.1. Análisis microbiológico. 61

3.2. Propiedades físicas de la linaza: aw y color instrumental. 64

3.3. Composición de la semilla. 66

3.4. Efectos de los procesamientos sobre la composición de la semilla. 79

CAPÍTULO IV. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 92

4.1. Conclusiones 92

4.2. Recomendaciones 93

REFERENCIAS 95

ANEXOS 105

xi

ÍNDICE DE TABLAS

Página

Tabla 1.1. Composición proximal de la linaza 9

Tabla 1.2. Composición porcentual de ácidos grasos de los aceites de linaza

tradicional, linaza “Solin”, girasol y cártamo. 13

Tabla 1.3. Composición de aminoácidos de la linaza (var. Norman) 15

Tabla 1.4. Calidad de las proteínas de linaza. 16

Tabla 1.5. Contenido de minerales y vitaminas de la linaza canadiense (var.

Norman). 19

Tabla 2.1. Longitudes de onda utilizadas en la determinación de minerales por ICP. 48

Tabla 2.2. Preparación de la curva patrón de cianuro de potasio (KCN). 56

Tabla 3.1. Resultado del análisis microbiológico para la materia prima criolla e

importada. 61

Tabla 3.2. Actividad de agua de las semillas de linaza nacional e importada. 65

Tabla 3.3. Color instrumental de la linaza nacional e importada. 66

Tabla 3.4. Composición proximal de las semillas de linaza nacional e importada 67

Tabla 3.5. Fibra dietaria de las semillas de linaza importada y nacional. 69

Tabla 3.6. Contenido de minerales de la linaza importada y nacional 70

Tabla 3.7. Perfil de ácidos grasos de las semillas de linaza importada y nacional. 71

Tabla 3.8. Contenido de ácido cianhídrico (HCN) equivalente y polifenoles en

linaza importada y nacional.

74

Tabla 3.9. Capacidad Antioxidante en linaza importada y nacional. 76

Tabla 3.10. Contenido remanente de mucílago en linaza procesada de origen

importado y nacional (g/100 g SS).

80

Tabla 3.11. Contenido de grasa en la torta de linaza remanente de la molienda y

remojo (g/100 g SS).

80

xii

Tabla 3.12. Contenido de proteínas solubles en los extractos de remojo y cocción de

las semillas de linaza (mg/100 ml de extracto).

81

Tabla 3.13. Contenido de ácido cianhídrico (HCN) equivalente en las semillas de

linaza importada y nacional procesadas (mg /100 g SS).

83

Tabla 3.14. Contenido de ácido cianhídrico en los extractos de remojo/cocción de

las semillas de linaza (mg/ L de extracto).

84

Tabla 3.15. Contenido de polifenoles en las semillas de linaza nacional e importada

procesada (mg*/100g).

86

Tabla 3.16. Contenido de polifenoles en los extractos de remojo y cocción de las

semillas de linaza (mg*/ L de extracto).

87

Tabla 3.17. Capacidad antioxidante de las semillas de linaza procesadas. 88

Tabla 3.18. Capacidad antioxidante de los extractos de remojo/cocción de las

semillas de linaza.

91

xiii

ÍNDICE DE FIGURAS Página

Figura 1.1. Variedades de flores de la planta de lino 4

Figura 1.2. Etapas en el crecimiento de la planta de lino. 5

Figura 1.3. Crecimiento de la planta de lino cultivada en el estado Mérida. 6

Figura 1.4. Cápsulas y Semillas de la planta de lino. 7

Figura 1.5. Factores que afectan la vida útil de un alimento en función de la

actividad de agua. 11

Figura 1.6. Comparación del perfil de ácidos grasos de la linaza y otros

aceites/grasas comerciales de origen vegetal. 12

Figura 1.7. Estructura de los ácidos fenólicos. 21

Figura 1.8. Estructura química de los lignanos de mamíferos, y de los principales

lignanos vegetales contenidos en la linaza, y metabolismo del SDG. 23

Figura 1.9. Proceso de transformación del glucósido cianógeno linustatina en HCN. 26

Figura 1.10. Metabolismo normal del cianuro. 26

Figura 1.11. Planta de lino local y sus flores. Linaza cultivada en el Estado Mérida. 34

Figura 1.12. Reacción de König para la determinación de HCN. 38

Figura 1.13. Esquema de la reacción de reducción del radical DPPH•. 39

Figura 2.1. Esquema de muestreo de las semillas de linaza. 42

Figura 2.2. Escala de color Hunter L, a, b. 51

Figura 2.3. Procesamientos caseros aplicados a las semillas de linaza. 57

Figura 3.1. Colonias de microorganismos formadores de esporas en Agar Dextrosa

Peptona de Caseína.

62

Figura 3.2. Cromatograma de ácidos grasos de la linaza importada. 72

Figura 3.3. Cromatograma de ácidos grasos de la linaza nacional 73

Figura 3.4. Comportamiento cinético del radical DPPH* para las semillas de linaza

(a) Importada (b) Nacional, a diferentes concentraciones 79

xiv

ÍNDICE DE ANEXOS

Página

Anexo 1. Hoja de diseño experimental. 106

Anexo 2. Resultados de los análisis estadísticos aplicados: Prueba t de dos

muestras independientes.

107

Anexo 3. Resultados de los análisis estadísticos aplicados: ANOVA

multifactorial para mucílago y grasa en semillas procesadas.

122

Anexo 4. Resultados de los análisis estadísticos aplicados para la evaluación de

polifenoles en semillas procesadas.

123

Anexo 5. Resultados de los análisis estadísticos aplicados para la evaluación de

HCN en semillas procesadas.

125

Anexo 6. Resultados de los análisis estadísticos aplicados para la evaluación de

la Capacidad Antioxidante en semillas procesadas.

127

Anexo 7. Resultados de los análisis estadísticos aplicados para la evaluación

del contenido de Polifenoles en los extractos de los procesamientos.

133

Anexo 8. Resultados de los análisis estadísticos aplicados para la evaluación

del contenido de HCN en los extractos de los procesamientos.

134

Anexo 9. Resultados de los análisis estadísticos aplicados para la evaluación de

la Capacidad Antioxidante en los extractos de los procesamientos.

136

INTRODUCCIÓN

La semilla de lino, mejor conocida como linaza, es una oleaginosa de origen mediterráneo,

considerada hasta hace poco como una “oleaginosa industrial” ya que a partir de ella se

producen aceites no comestibles destinados a otras aplicaciones industriales diferentes a la

alimenticia. Sin embargo, recientes estudios y descubrimientos sobre su amplio valor nutritivo

han despertado el interés del consumidor y de la industria de alimentos (Primo-Yúfera 1998;

Morris y Vaisey-Genser 2003), debido principalmente a su elevado contenido de grasa, fibra,

y proteínas, así como por la calidad de su aceite, rico en ácidos grasos omega 3. Su

considerable contenido de fitoestrógenos como los lignanos, también ha contribuido a captar

la atención de los consumidores, pues sus efectos beneficiosos sobre la regulación hormonal

humana han sido ampliamente reconocidos, y su influencia en la prevención de enfermedades

como el cáncer y la diabetes se encuentra actualmente en estudio (Hutchins y Slavin 2003;

Saarinen et al. 2003; Thompson 2003). Además de sus constituyentes principales, la linaza

también contiene otros compuestos como los polifenoles, que le confieren capacidad

antioxidante, y de los que no existen mayores estudios pues estos han sido relegados a sus

compuestos mayoritarios (Daun et al. 2003).

La linaza ha sido poco estudiada en Venezuela, debido a que es una materia prima importada,

costosa, y hasta hace poco, escasamente utilizada, relegada principalmente a la preparación de

remedios caseros. Sin embargo, a partir de la publicación y divulgación de artículos en

diferentes medios de comunicación, en los que se resaltan sus múltiples propiedades benéficas

a la salud, tanto preventivas como curativas, así como sus atributos cosméticos y estéticos, el

consumo de linaza se ha elevado considerablemente, e incluso se han comenzado a producir

localmente, tanto a nivel artesanal como industrial, alimentos como panes, barras energéticas,

cereales para desayuno y galletas con linaza como ingrediente. La información divulgada en el

país sobre la linaza, proviene de investigaciones realizadas en otros países sobre variedades

2

canadienses y/o estadounidenses. Sin embargo, es ampliamente conocido en los países

productores de linaza que su composición varía significativamente con el ambiente, suelo y

condiciones de cultivo, por lo cual es importante conocer la composición de las variedades de

linaza que se están importando, para así poder aprovechar al máximo sus propiedades

funcionales y explotar su potencial como ingrediente en la industria de alimentos (Daun et al.

2003).

El cultivo de linaza es climáticamente viable en el país. En el estado Mérida existen pequeños

cultivos de linaza con una producción actual aproximada de 150 kg de semillas/año. La poca

demanda de la semilla en años anteriores provocó la disminución de su cultivo, pues la mayor

parte de los agricultores decidió sustituirla por otros que fueran más rentables como la papa o

el ajo. La escasa presencia de esta variedad en el mercado local ha sido la principal causa de la

falta de estudios sobre sus constituyentes. Conocer su composición es primordial para acaparar

el interés de los investigadores, fomentar su cultivo local y disminuir así la dependencia de la

importación y su precio. Localmente, los pocos estudios realizados hasta ahora con linaza se

orientan hacia su inclusión en el desarrollo de alimentos especiales como panes y galletas,

dirigidas a la población de la tercera edad con el objetivo de aumentar su ingesta de fibra

(Palacios et al. 2004). De allí se deriva la necesidad de obtener información adicional sobre la

composición proximal de la linaza importada de Canadá que es consumida en el país, y

conocer la composición de la linaza cultivada en el Edo. Mérida, lo cual puede aprovecharse

para el incentivo y promoción de su cultivo local.

Algunas publicaciones han contemplado la posibilidad de que durante el procesamiento de la

linaza se generen compuestos tóxicos atribuibles a su contenido de glucósidos cianógenos

(Potter y Hotchkiss 1999; Daun et al. 2003). Se sabe que durante el procesamiento industrial

de la linaza, las enzimas responsables de la formación de ácido cianhídrico (HCN), son

inactivadas por las altas temperaturas y/o los solventes utilizados, pero en el caso de los

procesamientos caseros se desconoce el comportamiento de estas enzimas y la posible

toxicidad generada por el HCN.

3

La determinación de la calidad microbiológica de las semillas también es un factor importante

a estudiar, considerando que en el país estas son procesadas y consumidas crudas, y que

generalmente no se aplican procedimientos para inactivar los microorganismos patógenos que

pudieran estar presentes como resultado de la cosecha y de la manipulación post-cosecha

inadecuada de la semilla. Adicionalmente, conocer la flora microbiana asociada a las semillas

permitiría elaborar recomendaciones bien fundamentadas sobre su cosecha, recolección,

almacenamiento y manipulación.

En Venezuela los tratamientos previos al consumo de linaza son sencillos procesamientos

caseros como molienda, tostado, cocción y remojo. Por esta razón, el objetivo general de la

presente investigación fue evaluar los efectos de los procesamientos caseros mas comunes

aplicados a la linaza (Linum usitatissimum L.) sobre algunos de sus constituyentes a los cuales

se le atribuyen propiedades funcionales, previa caracterización química y microbiológica de

dos variedades de semilla, importada y nacional.

Objetivos específicos: 1. Analizar la calidad microbiológica de las semillas de linaza importada (de Canadá) y

nacional (cultivada en Mérida).

2. Determinar la composición proximal de las semillas nacionales e importadas, y la

composición del aceite extraído de ambos tipos de semillas.

3. Evaluar el efecto del tostado, molienda, cocción y remojo sobre el contenido de mucílago,

grasa, glucósidos cianógenos, polifenoles y capacidad antioxidante de la semilla nacional e

importada.

4. Cuantificar la concentración de glucósidos cianógenos, proteínas, polifenoles y la

capacidad antioxidante de los extractos obtenidos durante el remojo o cocción de las

semillas nacional e importada.

CAPÍTULO I

MARCO TEORICO

1.1. Linaza: descripción, morfología y cultivo. La semilla de lino, mejor conocida como linaza (Linum usitatissimum L.) es una oleaginosa de

la familia Linaceae, originaria de la región mediterránea de Europa, siendo los Romanos

quienes se encargaron de extender su cultivo a lo largo de todo su imperio y al resto de Europa

y África, donde se utilizó con fines medicinales, y para fabricar las envolturas de lino

empleadas durante las momificaciones en el Antiguo Egipto. En el siglo XVII, durante la

colonización, la semilla fue trasladada a América y las primeras siembras de linaza en Canadá

datan del año 1617 (Oplinger et al. 1992; Flax Council of Canada 2008). Morfológicamente,

la planta de lino es pequeña, de tallo único y a partir de cuya base o parte media-superior

(dependiendo de la variedad), se desprenden múltiples ramas que finalizan en inflorescencias

y posteriormente en cápsulas dentro de las cuales se encuentra la linaza. El color de la flor

también es dependiente de la variedad y puede ser blanca, violeta o azul (Fig. 1.1.).

Figura 1.1. Variedades de flores de la planta de lino. Fuente: Flax Council of Canada (2006).

La altura máxima de la planta de lino es 1 m, pero su raíz puede llegar a penetrar hasta 1,2 m.

debajo del suelo. Crece favorablemente en suelos arcillosos o que tengan una buena retención

de agua, climas fríos y/o frescos (temperaturas promedio menores a 35ºC), y precipitaciones

5

moderadas. El periodo vegetativo de la planta es de 45-60 días y botánicamente puede

dividirse en 12 etapas (Fig. 1.2.), pero en términos generales se agrupa en 2, los primeros 15-

25 días que constituyen la fase de florecimiento y los últimos 30-40 días que dura la fase de

maduración de la cápsula (Oplinger et al. 1992; Flax Council of Canada 2002b).

Figura 1.2. Etapas en el crecimiento de la planta de lino: 1 y 2, cotiledón y punto emergente; 3 y 4, primeras hojas verdaderas; 5 extensión del tallo e inicio del multiramado; 6 a 8, aparición de las ramas múltiples, capullos y florecimiento; 9 a 11, caída de las flores, comienzo de la maduración de la semilla; 12, semilla madura. Final a la derecha: corte transversal de la cápsula con semillas en su interior. Fuente: Turner (1996).

6

En la Fig. 1.3. se presenta, en forma resumida, el crecimiento de la planta de lino cultivada en

el edo. Mérida, el cual se inicia con la salida del cotiledón, la aparición de los primeros pares

de las denominadas hojas verdaderas e inicio de la forma espiral de las hojas superiores (Fig.

1.3a.), posteriormente ocurre el crecimiento y multiramado del tallo (Fig. 1.3b.),

florecimiento, que en esta especie es de color violeta (Fig. 1.3c.), y finalmente, la aparición de

las cápsulas que contienen en su interior las semillas, en el extremo superior de los tallos (Fig.

1.3d.). La maduración de las cápsulas viene acompañada del deshojado parcial o total del tallo

(Fig. 1.3e.).

Figura 1.3. Crecimiento de la planta de lino cultivada en el estado Mérida.

Las cápsulas generalmente contienen en su interior entre 6 y 10 semillas (Fig. 1.4a.). Durante

el periodo de maduración, las cápsulas y las semillas pasan de color verde claro a marrón (Fig.

1.4b. y 1.4c.). Las semillas son planas, ovales y puntiagudas en uno de sus extremos (Fig.

1.4d.). Se componen de una cubierta o cáscara formada por cinco capas, dos cotiledones

achatados y amplios, un hipocótilo corto y una radícula; el cotiledón constituye

aproximadamente el 55% del peso total de la semilla y, la cubierta y el endospermo el 36%.

Las semillas de lino miden alrededor de 2,5 mm de ancho, 4-6 mm de largo y 1,5 mm de

espesor, con un peso de aproximadamente 7 ± 1 mg, su aspecto es liso y brillante, y su color,

según la especie, varía desde el amarillo y dorado, hasta el marrón rojizo (Fig. 1.4e., 1.4f., y

1.4g.). El color de la semilla está determinado por la cantidad de pigmentos concentrados en la

capa externa. Existen al menos 22 variedades certificadas de linaza, clasificadas de acuerdo al

a b c d e

7

color de la flor, de la semilla y de su contenido de grasa. Sin embargo, las más estudiadas han

sido las variedades “NorMan” y “NorLin” (Canadienses, de color pardo-rojizo), las variedades

“Foster” y “Dakota Gold” (Estadounidenses, de color dorado), y la variedad “Omega”

(Estadounidense, de color amarillo). En términos generales, las variedades de linaza pueden

agruparse en 3 clases: las semillas ricas en grasa, las destinadas a la producción de fibra (que

no poseen la misma cantidad ni la misma calidad de aceite que las antes mencionadas), y las

denominadas “Solin”, que son variedades híbridas con bajo contenido de ácidos grasos

poliinsaturados (Oplinger et al. 1992; Oomah y Mazza 1998; Daun et al. 2003; Morris 2007;

Flax Council of Canada 2002b, 2008).

Figura 1.4. Cápsulas y Semillas de la planta de lino. Arriba: a) Vista del interior de las cápsulas maduras. b) Cápsulas con semillas de linaza en su etapa de maduración; c) Cápsula madura; d) Vista ampliada de la semilla de linaza canadiense. Abajo: e) Semillas de variedad Solin. f) Semillas de color dorado. g) Semillas de variedad pardo-rojiza.

La cosecha de linaza se realiza cuando las semillas han alcanzado la madurez suficiente, lo

cual se evidencia por el cambio de color de la cápsula. En este punto la humedad de la semilla

es de aproximadamente 12%. La cosecha es difícil debido al pequeño tamaño de la semilla y a

la fragilidad de la cápsula que las contiene. La linaza verde no puede utilizarse para

alimentación (ni animal ni humana), pues contiene una gran cantidad de glucósidos

cianógenos, que durante la digestión se hidrolizan en ácido prúsico, mejor conocido como

8

ácido cianhídrico (HCN), cuyo efecto tóxico se discutirá mas adelante. En países productores

de linaza, como Canadá y Estados Unidos, la cosecha se realiza mecánicamente, con la ventaja

de que las semillas son separadas automáticamente de la cápsula por una serie de cilindros

concéntricos con diferentes aperturas y velocidades, evitando así la manipulación excesiva de

las semillas que conlleva a su contaminación. Una vez recolectadas, las semillas son tamizadas

repetidas veces (con aperturas entre 1/16” y 3/16”), para obtener lotes uniformes de semillas

con menos de 0,01% de impurezas (ramas, hojas, restos de cápsulas, etc.), y luego son

enfriadas con ayuda de un secador neumático, para evitar que liberen el calor absorbido en el

campo dentro de los silos de almacenamiento, lo cual, junto a una humedad relativa igual o

superior al 70% favorecería el crecimiento de mohos. Luego de su recolección, las semillas de

lino mantienen una alta tasa de respiración hasta por 6 semanas antes de pasar a estado latente

(Oplinger et al. 1992; Flax Council of Canada 2002b).

Según la Dirección de Estadística de la Organización para la Alimentación y Agricultura de

las Naciones Unidas (FAO), los principales países productores de linaza en el año 2007

(últimos datos disponibles), fueron Canadá (633.500 Toneladas Métricas), China (480 mil

TM), India (168 mil TM), Estados Unidos (149 mil TM), y Etiopía (108 mil TM). En

Latinoamérica, Argentina, Brasil y México tienen una producción pequeña comparada a los

países antes mencionados, siendo apenas de 34 mil TM, 14.700 TM y 7.200 TM,

respectivamente (FAO-Statistics 2007).

1.2. Composición de la linaza. La linaza es rica en grasa, fibra dietética y proteínas, sin embargo, su composición proximal

varía apreciablemente según la variedad, el clima (temperatura y pluviosidad), y tipo de suelo

donde crece. Por ejemplo, se conoce que los climas fríos tienden a disminuir el contenido de

proteína y aumentar el de grasa, los climas con noches frías mejoran la calidad de la grasa, las

variedades doradas poseen menos fibra soluble que las variedades marrón-rojizas, pero mayor

contenido de lignanos, y los suelos nitrogenados y arcillosos proporcionan semillas con mayor

contenido de proteínas, al contrario de los suelos arenosos. Análogamente, el contenido y

variedad de minerales presentes en la semilla es proporcional a la riqueza mineral del suelo

9

donde se cultive (Oomah 2001; Flax Council of Canada 2002b; Daun et al. 2003; Morris

2007).

Los rangos de la composición proximal de la linaza que se presentan en la Tabla 1.1., fueron

obtenidos a partir de reportes de diversas variedades de linaza cultivadas en Estados Unidos y

Canadá. La amplitud de los rangos demuestra la variación existente en la composición según

la variedad y las condiciones de cultivo; por esta razón, cuando se reportan dichos datos suelen

especificarse la variedad, o zona y mes de cultivo de la semilla, además del método de análisis

utilizado.

Tabla 1.1. Composición proximal de la linaza

g/100g de semilla

Humedad 6-9

Grasa 34-53

Proteína 19-36

Fibra dietética 10-28

Cenizas 3-5

Carbohidratos totales 1-6

Energía (Kcal/100 g) 450

Fuente: Oomah (2001); Flax Council of Canada (2002b); Daun et al. (2003); Morris (2007).

1.2.1. Grasa: cantidad y calidad. La linaza es ampliamente valorada por su elevado contenido de grasa, y la mayoría de sus

efectos beneficiosos a la salud se atribuyen a la calidad de su aceite y a su elevado contenido

de ácidos grasos poliinsaturados (mas del 70%), en su mayoría ácido α-linolénico (ALA). El

ALA es un ácido graso esencial (AGE) para la alimentación humana, junto con el ácido

linoleico. Los AGE son necesarios, entre otras cosas, para la estructura de la membrana

celular, ya que contribuyen a su permeabilidad y fluidez. Adicionalmente, el ALA es precursor

de los ácidos grasos de cadena larga: eicosapentanoico (EPA) y docosahexanoico (DHA),

10

C20:5 y C22:6, respectivamente, necesarios para el correcto desarrollo del sistema nervioso

central y la visión, y coadyuvantes en la prevención de enfermedades coronarias y cardiacas.

El DHA es de gran importancia para el organismo, pues forma parte de los fosfolípidos de las

membranas celulares y de la estructura cerebral (Oomah y Mazza 1998; Morris 2007).

Aproximadamente el 40-60% del contenido de aceite de la linaza es ALA, lo cual la hace la

fuente vegetal mas rica en este tipo de ácidos omega 3, seguida del aceite de canola (11%) y el

de soya (8%). Media cucharadita de aceite de linaza aporta aproximadamente 1,3 g de ALA, lo

cual cubre completamente el consumo diario recomendado para las mujeres por el U.S.

Institute of Medicine (1,1g ALA/día), y está muy cercano a lo recomendado para hombres

(1,6g ALA/día). Sin embargo, el alto contenido de ALA limita la vida útil de la linaza,

particularmente de la semilla molida, ya que los tres dobles enlaces de su cadena son muy

propensos a la peroxidación lipídica, y los compuestos volátiles secundarios de esta reacción

le imparten a la semilla un olor y sabor a pintura (Belitz y Grosch 1997; Flax Council of

Canada 1999; Morris y Vaisey-Genser 2003; Morris 2007).

.

En las condiciones en que usualmente se almacena la linaza, los acíl-lípidos insaturados que

contiene (oleico, linoleico y ALA), no son estables. La cinética de las reacciones de oxidación

lipídica frecuentemente tiene una fase lag o periodo de inducción, en el que la rancidez no es

detectada y por tanto se mantiene la calidad del alimento, hasta que se alcanza la fase

exponencial en la cual la oxidación y por tanto la aparición de los “off-flavors” ocurre

rápidamente. Como es bien conocido, la longitud de la fase lag depende además de la

composición de los ácidos grasos presentes, de las condiciones en las que se almacena el

alimento (presencia de O2, luz, temperatura) y de su actividad de agua (aw). La velocidad de la

autooxidación lipídica se incrementa tanto en los alimentos secos (aw < 0,1) como en aquellos

con aw > 0,5 (Fig. 1.5.). El efecto del aw sobre algunos procesos importantes en la vida útil de

los alimentos también se aprecia en la Fig. 1.5. La disminución del aw frena primeramente el

crecimiento de bacterias, levaduras y mohos, posteriormente las reacciones enzimáticas y por

último el pardeamiento no enzimático (Belitz y Grosch 1997; Damodaran et al. 2008).

11

Figura 1.5. Factores que afectan la vida útil de un alimento en función de la actividad de agua

según Labuza et al. (1971). Fuente: Belitz y Grosch (1997).

Algunos estudios afirman que la semilla molida es estable hasta por 4 meses, siempre y

cuando sea almacenada a temperaturas inferiores a los 25ºC y en empaques trilaminados que

la resguarden de la luz y el oxígeno, mientras que otros autores afirman que bajo las mismas

condiciones de almacenamiento, la semilla molida puede mantenerse hasta por 11 meses sin

disminución significativa de su contenido de ALA, aún cuando la cantidad de ácidos grasos

libres aumenta en comparación con la muestra fresca. La semilla entera ha demostrado ser mas

estable (hasta 9½ meses), a la oxidación lipídica almacenada a estas mismas condiciones

(temperaturas < 25ºC, en empaques trilaminados a resguardo de la luz y el oxígeno) (Flax

Council of Canada 1999; Morris y Vaisey-Genser 2003; Morris 2007).

En la Fig. 1.6. se muestran, a modo comparativo, los perfiles de ácidos grasos de varios aceites

y grasas comestibles en contraste con el aceite de linaza canadiense. Se evidencia la riqueza

del aceite de linaza en ALA, mientras que en otros aceites y grasas el contenido de dicho ácido

graso no es mayor al 10% (Belitz y Grosch 1997; Morris y Vaisey-Genser 2003).

12

Figura 1.6. Comparación del perfil de ácidos grasos de la linaza y otros aceites/grasas comerciales de origen vegetal. Fuente: Belitz y Grosch (1997);Vaisey-Genser y Morris (1997).

El aceite de linaza es considerado no comestible en muchos países y no posee la

denominación GRAS (Generally recomendad as safe), debido a su rápida oxidación y

polimerización por la gran cantidad de ácidos grasos poliinsaturados que posee. Por esta

razón, en 1993 se inició el desarrollo de las variedades “Solin”, un trabajo conjunto entre la

Universidad de Wisconsin (Estados Unidos), el United Grain Growers Ltd. (Canadá), y el

Commonwealth Scientific & Industrial Research Organization (Australia). Las semillas de

estas variedades híbridas Solin son de color amarillo claro, y poseen mas de 50% de grasa,

pero menos de 5% de ácido α-linolénico (ALA), lo cual lo hace más estable al calor y la luz, y

por ende es apto para la cocción y la fritura siempre y cuando la temperatura del aceite se

mantenga por debajo de los 150ºC (Morris y Vaisey-Genser 2003; Flax Council of Canada

2008).

En la Tabla 1.2., se presenta la composición de ácidos grasos del aceite de las variedades Solin

con la del aceite tradicional de linaza y los aceites de girasol y cártamo. Al comparar estos

perfiles, se observa que el aceite de linaza tradicional posee un alto contenido de ALA,

mientras que los aceites de Solin, girasol y cártamo son ricos en ácido linoleico a expensas de

9

12

7

13

15

15

51

62

68

18

16

61

29

75

23

39

34

28

16

71

21

57

9

54

10

3

3

57

1

11

1

1

8

1

0% 20% 40% 60% 80% 100%

Linaza

Girasol

Canola

Maiz

Oliva

Soya

Palma

M. de Cacao

Mantequilla

% Saturada % Monoinsaturada % Linoleico % α-linolénico

13

un poco o nulo contenido de α-linolénico. Actualmente existen 3 variedades certificadas Solin,

comúnmente llamadas “Linola™” y diferenciadas entre si por códigos seguidos del nombre

(Oplinger et al. 1992; Vaisey-Genser y Morris 1997; Oomah y Mazza 1998; Flax Council of

Canada 1999, 2002b).

Tabla 1.2. Composición (g de ácido/100g de aceite) de ácidos grasos de los aceites de linaza tradicional, linaza “Solin”, girasol y cártamo.

Ácido graso Variedad de Linaza

Girasol Cártamo Tradicional “Solin” Palmítico (C16:0) 5 6 8 8

Esteárico (C18:0) 3 3 5 3

Oleico (C18:1 ω-9) 17-19 17 16 13

Linoleico (C18:2 ω-6) 14-16 72 71 75

α-linolénico (C18:3 ω-3) 55-59 2-3 - 1

Fuente: Oomah y Mazza (1998); Potter y Hotchkiss (1999); Daun et al. (2003).

Además de los ácidos grasos, los acilgliceroles figuran como componentes mayoritarios en la

fracción lipídica de la linaza. Por el contrario, los ésteres esteroles, glicolípidos y fosfolípidos

no suman mas del 5% de los lípidos totales, y han sido poco estudiados ya que el interés de los

investigadores se ha centrado en los ácidos grasos. La concentración y calidad del aceite de

linaza dependen de las características de las semillas que dieron origen a la cosecha, aún

cuando la temperatura ambiente, las condiciones del suelo y la presencia de plagas también

influyen. El 75% de la grasa de la semilla se encuentra en el cotiledón; el resto se encuentra

distribuido entre el germen (3%) y la cáscara (22%) (Oomah y Mazza 1998; Daun et al. 2003;

Morris 2007).

El aceite de linaza tiene múltiples usos y de ello depende su procesamiento. Para consumo

humano se recomienda en aplicaciones “frías” como aderezos, salsas, vinagretas, y para

enriquecer bebidas caseras como merengadas y batidos de fruta. También se comercializa en

forma de cápsulas como suplemento dietético. En ambos casos, el aceite se extrae en frío con

14

temperaturas controladas inferiores a los 35ºC en todas las etapas (limpieza, trituración y

prensado), para posteriormente ser encapsulado y/o envasado en contenedores ámbar o

laminados que eviten la foto-oxidación, y previa inyección de nitrógeno para remover el

oxígeno presente en el espacio de cabeza del envase. Estos aceites y suplementos deben

almacenarse en ambientes frescos para evitar la auto-oxidación y refrigerarse una vez abiertos.

Cuando el aceite no va a ser utilizado para consumo, la extracción se realiza con solventes

(Morris y Vaisey-Genser 2003).

1.2.2. Proteínas: cantidad y calidad. Las proteínas de la linaza son en su mayoría globulinas del tipo 11-12S (58-66%), mientras

que las albúminas (2S) están contenidas en menor proporción (20-42%). Las globulinas son

poco solubles y de mayor peso molecular, contrario a las albúminas de menor peso molecular

y mayor solubilidad, y en consiguiente las proteínas de linaza son más lipofílicas que las de

soya; por lo tanto, la actividad emulsificante de las proteínas de linaza es mayor que la de las

proteínas de soya. La linaza, al igual que otras oleaginosas, no contiene gluten y por lo tanto

puede ser ingerida por consumidores con sensibilidad a esta proteína. En comparación con

otras oleaginosas, la linaza contiene elevados niveles de nitrógeno no proteico, por lo cual

muchos autores consideran importante utilizar el término “proteína verdadera” (N x 4,9) y

diferenciarlo del término “proteína cruda” (N x 6,25) al momento de interpretar los datos de

proteínas (Oomah y Mazza 1998; Daun et al. 2003).

El perfil de aminoácidos de la linaza (Tabla 1.3.) es similar al de la proteína de soya, a la cual

pudiera sustituir como ingrediente en ciertos alimentos gracias a su funcionalidad y a la

ventaja de tener menores efectos alérgenos y aterógenos, este último debido a que tiene un

menor radio lisina:arginina que la soya. La fracción de aminoácidos de la linaza contiene

niveles relativamente altos de ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína y arginina.

Nutricionalmente hablando, los aminoácidos limitantes de la proteína de linaza son la lisina y

metionina, aunque en este sentido existen muchas divergencias, ya que algunos autores

incluyen también como limitantes a la isoleucina, la tirosina y la treonina, excluyendo a la

metionina. Sin embargo, diversos estudios coinciden en que el perfil de aminoácidos de la

15

linaza muestra cierta variación en algunos de sus componentes (arginina, ácido glutámico,

metionina, serina, tirosina, y ácido aspártico), con respecto a la variedad y ambiente donde se

cultiva (Oomah y Mazza 1998; Daun et al. 2003; Wanasundara y Shahidi 2003).

Tabla 1.3. Composición de aminoácidos de la linaza (var. Norman)

Aminoácido g/100 g de proteína g/100 g de semilla

Alanina 4,4 1,047

Arginina 9,3 2,033

Acido aspártico 9,2 1,924

Cisteína 1,1 0,408

Acido Glutámico 19,6 4,104

Glicina 5,8 1,244

Histidina* 2,2 0,442

Isoleucina* 4,0 0,921

Leucina* 5,8 1,299

Lisina* 4,0 0,806

Metionina* 1,5 0,415

Fenilalanina* 4,6 1,017

Prolina 3,5 0,813

Serina 4,5 1,054

Treonina* 3,6 0,813

Triptófano* 1,8 0,330

Tirosina 2,3 0,578

Valina 4,6 1,153

* Aminoácidos esenciales. Fuente: FAO (1970); Vaisey-Genser y Morris (1997).

Los estudios sobre la fracción proteica de la linaza y su valor nutricional son escasos y

dispersos. En la Tabla 1.4. se presentan los rangos de los valores reportados encontrados. Se

aprecia gran variabilidad entre los resultados del PER (Relación de Eficiencia Proteica, por sus

siglas en inglés), atribuidas principalmente a las diversas condiciones y técnicas de análisis

16

empleados en la determinación, aún cuando es posible que la variedad de semilla utilizada sea

también un factor de variación considerable (FAO 1970; Vaisey-Genser y Morris 1997;

Oomah y Mazza 1998).

Tabla 1.4. Calidad de las proteínas de linaza.

Valor biológico (BV) 61,6 – 77,4

Digestibilidad 72,9 – 91,6

PER 0,79 – 1,76

Utilización proteica neta (NPU) 45 - 60

Índice de aminoácidos esenciales 69

Fuente: FAO (1970); Oomah y Mazza (1998).

El estudio de las proteínas de linaza se ha visto relativamente desplazado por otros de sus

constituyentes como los lignanos y la grasa, pues a pesar de ser rica en proteínas, las

investigaciones sugieren que sus beneficios están mas asociados a su perfil de ácidos grasos y

de fibra. Adicionalmente, la completa extracción de las proteínas de linaza para su

identificación, aislamiento y caracterización ha constituido un reto para los científicos debido

a que la viscosidad propia de las proteínas se ve incrementada por la presencia de mucílago en

la corteza de la semilla, lo cual también ha implicado un reto para la producción industrial de

aislados y concentrados de proteínas de linaza; Sin embargo, a nivel experimental se han

obtenido aislados proteicos de linaza con aproximadamente 86% de proteínas, y concentrados

con aprox. 65% de proteínas, pero con bajas propiedades estabilizantes y gelificantes (Vaisey-

Genser y Morris 1997; Oomah y Mazza 1998; Oomah 2001; Daun et al. 2003; Wanasundara y

Shahidi 2003).

Como en otras oleaginosas, existe una correlación negativa entre el contenido de grasa y de

proteína de las semillas, es decir, a mayor contenido de proteínas menor contenido de grasa.

Se ha observado que al incrementar la utilización de fertilizantes nitrogenados y fosforados

durante la cosecha, se obtienen mayores niveles de proteínas en la semilla (Oomah y Mazza

1998).

17

1.2.3. Fibra dietaria. El concepto de fibra dietaria total abarca aquellos polisacáridos, y los no polisacáridos como la

inulina, que forman la estructura de la pared celular de las plantas, exceptuando el almidón,

que no son digeridos por las enzimas del tracto gastrointestinal humano, pero si están sujetas a

cierta degradación en el intestino grueso por fermentación bacteriana como la lignina,

celulosas y hemicelulosas, β-glucanos, pectinas, gomas, mucílago, oligofructosa y almidón

resistente (Higdon y Lupton 2005).

La semilla de lino contiene aproximadamente el 28% de su peso seco de fibra dietaria total,

siendo una excelente fuente de ambos tipos de fibra, soluble e insoluble. La proporción de

fibra soluble:insoluble reportada en diversos estudios es variable y va desde 20:80 a 40:60,

dependiendo del método de extracción y análisis utilizado (Batthy 1993; Vaisey-Genser y

Morris 1997; Daun et al. 2003).

La información que existe sobre la variación del contenido de fibra dependiendo del tipo de

semilla y sus condiciones de cultivo es limitada, ya que la determinación de fibra total es

costosa, larga y tediosa por lo que no resulta práctico analizar un número grande de muestras.

En consecuencia, generalmente se utiliza la cantidad de mucílago como un estimado de la

cantidad de fibra soluble que contiene la semilla, ya que el procedimiento de extracción de

mucílago es más sencillo y económico. El mucílago (goma hidrocoloidal), es el principal

polisacárido soluble presente en la linaza, constituye aproximadamente el 7-10% del peso de

la semilla y se encuentra formando parte de la estructura externa de la cáscara. Esta compuesto

principalmente por ramnosa y xilosa en un ratio aproximado de 0,5-1,5. Recientemente se ha

venido estudiando su uso como ingrediente en la industria de alimentos por sus propiedades

estabilizantes y espesantes. La fibra insoluble presente en la linaza (principalmente lignina y

celulosa), ha sido poco estudiada en comparación con la fibra soluble, debido a que a esta

última se le atribuyen mayores beneficios y propiedades funcionales (Vaisey-Genser y Morris

1997; Oomah y Mazza 1998; Daun et al. 2003; Higdon y Lupton 2005).

18

1.2.4. Carbohidratos. La linaza contiene pocas cantidades (1-2%) de carbohidratos digeribles como azúcares simples

y almidones. Al igual que sucede con otros componentes minoritarios de la semilla, se

requieren estudios adicionales para conocer los compuestos que integran este grupo (Daun et

al. 2003).

1.2.5. Minerales y vitaminas. La linaza es fuente de magnesio, potasio y fósforo (Tabla 1.5.). Una cucharada de linaza

aporta igual cantidad de magnesio que un cambur o una taza de leche descremada. Su aporte

de potasio es análogo al de un cambur, un huevo cocido o al de una rebanada de pan, y el de

fósforo es un poco mayor al de una sardina enlatada. Por el contrario, la linaza es baja en

sodio, cobre, hierro y zinc (Vaisey-Genser y Morris 1997; Daun et al. 2003).

Entre las vitaminas, la E es la que está en mayor cantidad en la linaza, mayoritariamente como

γ-tocoferol (9-40 mg/100g de semilla). El contenido máximo de α-tocoferol es de apenas 1,2

mg/100g de semilla. Aproximadamente el 26% del contenido total de tocoferoles están

contenidos en la cáscara de la semilla. La linaza también contiene aproximadamente

12mg/100g de tocotrienoles, compuestos que han probado ser mas eficientes en la reducción

de la oxidación lipídica que el α-tocoferol, y pequeñas cantidades de carotenos (1,8 mg/ kg de

semilla ≈ 100 equivalentes de retinol / kg de semilla) (Daun et al. 2003).

Los estudios indican que la linaza tiene bajo contenido de vitamina C, al igual que de

complejo vitamínico B (Tabla 1.5.). Se piensa que las condiciones climáticas del lugar de

cultivo tienen gran influencia sobre el contenido de vitaminas; sin embargo, se hacen

necesarios estudios adicionales, empleando un método de determinación adecuado, ya que se

han reportado variaciones significativas entre estudios, dependiendo del método analítico

utilizado (Vaisey-Genser y Morris 1997; Daun et al. 2003).

19

Tabla 1.5. Contenido de minerales y vitaminas de la linaza canadiense (var. Norman).

Mineral mg/100 g de semilla

Mineral mg/100g de semilla

Potasio

Fósforo

Magnesio

Calcio

550-1060

440-760

320-410

200-440

Hierro

Zinc

Manganeso

Cobre

3,6-16,4

3,8-9,4

1,3-4,3

0,8-1,7

Azufre 230-250 Aluminio 0,2-1,0

Sodio 20-60 Selenio ≈0,06

Vitaminas mg/100g de semilla

Vitaminas mg/100g de semilla

Vitamina C 0,5 – 1,3 Piridoxina (Vit. B6) 0,4 – 10,0

Tiamina (Vit. B1) 0,1 – 0,6 Cianocobalamina (Vit. B12) 0,0 – 0,5

Riboflavina (Vit. B2) 0,1 – 0,3 µg/ 100g de semilla

Niacina (Vit. B3) 1,4 – 5,5 Acido Fólico 112

Ácido Pantoténico (Vit. B5)

0,6 – 7,0 Biotina 6

Fuente: Vaisey-Genser y Morris (1997); Daun et al. (2003).

1.2.6. Compuestos fitoquímicos. Son aquellos compuestos químicos de origen vegetal que pudieran tener influencia positiva

sobre la salud pero que no son nutrientes esenciales. Entre los compuestos fitoquímicos

conocidos se encuentran los carotenoides, ácidos fenólicos, flavonoides, isotiocianatos,

fitoestrógenos como los lignanos y las isoflavonas, fitoesteroles, y resveratrol; algunos autores

incluyen también en este grupo de compuestos a la fibra. De los compuestos antes

mencionados se sabe, hasta ahora, que la linaza contiene ácidos fenólicos y lignanos, siendo

estos últimos los más estudiados (Daun et al. 2003; Johnsson 2004; Frankel y German 2006).

20

En la última década ha aumentado considerablemente la atención en los compuestos

fitoquímicos debido, entre otras cosas, a su potencial efecto protector e inhibidor de los daños

ocasionados por la oxidación biológica o efecto de los radicales libres sobre el organismo, que

ocasionan daños a lípidos, proteínas y ácidos nucleicos, dando inicio a enfermedades

degenerativas. La biodisponibilidad, absorción y metabolismo de estos compuestos durante la

digestión, su mecanismo (in vivo) de protección e intervención contra las enfermedades son

objeto de estudios actualmente, ya que el mecanismo de acción aún no está totalmente claro a

pesar de los numerosos estudios realizados hasta ahora (Frankel y German 2006). La falta de

consenso en los resultados se debe principalmente a 2 causas, en primer lugar se ha observado

que los diferentes métodos analíticos utilizados influyen notablemente en los resultados, por lo

cual se hace necesario mejorar y estandarizar los métodos actualmente utilizados. En segundo

lugar, la evidencia sugiere que la cantidad de estos compuestos que es absorbida en el

organismo así como su biodisponibilidad varían considerablemente con la matriz del alimento

fuente y las mezclas complejas de compuestos polifenólicos que posee (Vaisey-Genser y

Morris 1997; Frankel y German 2006).

1.2.6.1. Compuestos polifenólicos. Los polifenoles son compuestos estructuralmente relacionados, con propiedades antioxidantes

que muestran un gran efecto atrapador de radicales. En la naturaleza, dichos compuestos

desempeñan funciones de defensa y protección de las plantas durante el cultivo contra los

ataques depredadores de animales herbívoros, insectos, hongos y hierbas parasitarias. Los

polifenoles se encuentran asociados a la fibra en las paredes celulares de las plantas,

contribuyen con el color, sabor amargo y sensación astringente característica de algunas

oleaginosas, y poseen una actividad antioxidante importante, gracias a su capacidad de donar

átomos de hidrógeno. Los compuestos fenólicos vegetales abarcan los ácidos fenólicos de 7 a

9 átomos de carbono, tales como los ácidos gálico y p-cumárico, los flavanos o flavonoides de

15 átomos de carbono, y las ligninas, entre otros. Como característica común, los compuestos

polifenólicos poseen un grupo hidroxilo en posiciones orto y para, que los hace susceptibles a

participar en reacciones tipo redox, las cuales les permiten actuar como agentes reductores,

donadores de hidrógeno y agentes atrapadores de oxígeno. Diversos estudios han reportado

que la actividad antioxidante se encuentra relacionada con cierta ubicación de los grupos

21

hidroxilo en el anillo, que lo hacen más reactivo ante la acción de radicales libres; En

consiguiente, puede decirse que la actividad antioxidante es dependiente del número y la

posición de grupos hidroxilos, así como de su conjugación. Los ácidos fenólicos como el

cafeico, clorogénico, ferúlico, sinápico y p-cumárico tienen mayor poder antioxidante que los

derivados del ácido benzoico como los ácidos p-hidroxibenzoico, vainilico y siríngico (FAO

1995; Velioglu et al. 1998; Kähkönen et al. 1999; Rimac et al. 2005; Salta et al. 2005).

La linaza contiene de 8 a 10 g/kg de harina de polifenoles totales. Los principales ácidos

fenólicos encontrados en la linaza desgrasada son el trans-ferúlico (46% del total de ácidos

fenólicos), trans-sinapico (36%), p-cumárico (7,5%) y trans-cafeico (6,5%), en rangos que

van desde los 7,9 hasta los 10,3 mg/g de linaza desgrasada; También contiene

aproximadamente 2,8 mg de ácido gálico /g de linaza desgrasada. La estructura básica de estos

ácidos se muestra en la Fig. 1.7. Se ha encontrado que las estaciones en las que se realiza el

cultivo tienen mayor efecto sobre la variación del contenido de estos ácidos que la variedad de

semilla. A los ácidos fenólicos se le atribuyen, entre otras funciones bioactivas, propiedades

antioxidantes, antimicrobianas y anticancerosas (Vaisey-Genser y Morris 1997; Oomah y

Mazza 1998; Daun et al. 2003; Johnson 2004).

Figura 1.7. Estructura de los ácidos fenólicos. 4-O-β-d-glucopiranosil-p-acido cumárico (si R = OH), y 4-O-β-d-glucopiranosil ácido ferúlico (si R = OCH3). Fuente: Higdon y Lampe (2005).

Son pocos los estudios sobre los flavonoides contenidos en la linaza; sin embargo, se ha

encontrado que los principales son las flavonas C- y O-glicosidos, en un rango que varía entre

31 y 87 mg/100g de semillas. Los flavonoides reportan efectos antibacteriales, antivirales,

22

anti-inflamatorios, antialérgicos y vasodilatadores, además de antioxidantes, al inhibir la

peroxidación lipídica (Oomah y Mazza 1998; Johnson 2004).

1.2.6.2. Lignanos. Son compuestos fenólicos secundarios presentes en las plantas, cuya estructura básica es un

2,3-dibenzilbutano. Son considerados fitoestrógenos ya que al ser consumidos cumplen una

actividad similar a las de los estrógenos en los humanos. Aún cuando no se conoce

completamente su función, las propiedades antifúngicas e insecticidas de los lignanos

vegetales (también conocidos como “precursores de lignanos”) indican que podrían ayudar a

la protección de la planta, así como también se le atribuyen efectos reguladores en su

crecimiento (Johnsson 2004).

Los lignanos vegetales conocidos son el secoisolariciresinol diglucosido (SDG), el

matairesinol (MAT), el pinoresinol y el lariciresinol. El contenido de lignanos de las plantas

varía con las condiciones climáticas y el lugar de cultivo, la madurez de la semilla y las

condiciones de almacenamiento. Una vez ingerido el alimento, los lignanos vegetales son

transformados por las bacterias intestinales durante la digestión, en los lignanos de mamíferos,

enterodiol (ED) y enterolactona (EL) (Fig. 1.8c. y 1.8d.), para luego ser absorbidos por el

intestino (se cree que en el colon), y transportados al hígado para ser secretados por la bilis;

estos últimos poseen propiedades antimitóticas (inhiben la mitosis celular), reguladoras y

antioxidantes, a las que se le atribuyen, entre otros, efectos anticancerosos. La linaza es el

alimento de origen vegetal con mayor contenido de lignanos conocido hasta ahora (1 cda.

aporta 85,5 mg de lignanos), siendo los principales el SDG (Fig. 1.8a.), en cantidades entre

13,6-23,1 mg/g de linaza desgrasada y en menor cantidad el MAT (Fig. 1.8e.). El contenido de

lignanos en la linaza es dependiente de la variedad, lugar del cultivo y época del año. Los

lignanos no están asociados a la fracción lipídica de los alimentos, en consecuencia, el aceite

de linaza no contiene lignanos, a menos que haya sido enriquecido (Oomah y Mazza 1998;

Meagher y Beecher 2000; Morris y Vaisey-Genser 2003; Johnsson 2004; Higdon y Lampe

2005).

23

(e)

Figura 1.8. Estructura química de los lignanos de mamíferos, y de los principales lignanos vegetales contenidos en la linaza, y metabolismo del SDG. a) 2,3-bis[(4-hidroxi-.)metil]-1,4-butano-diglucosido (SDG). b) 2,3-bis[(4-hidroxi-3-metoxifenil)metil]-1,4-Butanediol (SECO). c) 2,3-bis[(3-hidroxifenil)metil]-1,4-Butanediol (ED). d) trans-dihidro-3,4-bis[(3-hidroxifenil) metil]-2(3H)-Furanona (EL). e) Dihidro-3R,4R-bis[(4-hidroxi-3-metoxifenil) metil]-2(3H)-furanona (MAT). Fuente: Higdon y Lampe (2005); Hu et al. (2007)

1.2.7. Compuestos antinutricionales. Este término abarca aquellos compuestos que interfieren en la absorción o en el metabolismo

de los nutrientes, como por ejemplo los fitatos y los oxalatos, presentes en la soya y las

Hidrólisis (Tracto

GastroIntestinal)

(a) Secoisolaricirresinol diglucosido

(b) (c) (ED)

(d) Enterolactona (EL)

Dehidroxilación, demetilación (Tracto GI)

Oxidación (Tracto GI)

24

espinacas, respectivamente, y que son responsables de atrapar minerales como el calcio,

hierro, magnesio y zinc, formando complejos insolubles que reducen su absorción en el

intestino. Otros compuestos antinutricionales comúnmente estudiados son los inhibidores de

proteasas, como los inhibidores de tripsina, presentes en la soya y otros granos, y los

inhibidores de amilasas presentes en leguminosas como las caraotas (P. vulgaris) y cereales.

Entre los compuestos antinutricionales que han sido identificados en la linaza se encuentran

los glucósidos cianógenos, la linatina (inhibe el metabolismo de la vitamina B6), y en ciertos

casos, subproductos de la oxidación lipídica. No se han detectado inhibidores de amilasa, pero

si pequeñas cantidades de inhibidores de tripsina (20-30 unidades AIT/g de semillas), mucho

menos que la soya y la canola (FAO 1995; Daun et al. 2003), mientras que en la sémola de

linaza la actividad inhibidora de tripsina (AIT) es de 42-51 unidades AIT/g de sémola (Oomah

y Mazza 1998).

La linatina es un compuesto polar localizado en el cotiledón de la linaza que se hidroliza en el

intestino y reacciona con la piridoxina formando un compuesto estable e inhibiendo su

absorción. Estudios realizados con una ingesta de 45 g de linaza/día por 5 semanas

concluyeron que la linatina se encuentra en muy baja concentración (aproximadamente 10

ppm), por lo que no ocasiona inhibición significativa en la absorción de micronutrientes en

humanos. En animales, el efecto de la linatina si es considerable debido a que el tamaño de

ración es mucho mayor; sin embargo es fácilmente contrarrestable con la adición de

suplementos vitamínicos (Daun et al. 2003).

Igualmente, los subproductos de la oxidación de los lípidos de la linaza han demostrado tener

influencia desfavorable sobre los niveles de vitamina E y causar estrés oxidativo en los tejidos

corporales, solo si se ingieren grandes cantidades de linaza (40% de la ingesta calórica diaria ≈

110g de semillas), y por periodos de tiempo prolongados (mas de un mes). De los compuestos

antinutricionales, los glucósidos cianógenos son los que han sido mayormente estudiados y

que se encuentran en mayor cantidad (Vaisey-Genser y Morris 1997; Daun et al. 2003).

25

1.2.7.1. Glucósidos cianógenos. Son químicos nocivos producidos por ciertas plantas como medio de defensa de los

depredadores, y que pueden transformarse, por hidrólisis ácida o por acción enzimática, en

ácido cianhídrico (HCN), compuesto tóxico para humanos y animales. Su concentración en las

plantas depende, entre otros factores, de la composición del suelo donde se realiza el cultivo,

específicamente de su contenido en hierro y nitrógeno, del pH y la aridez del clima. Entre

otros alimentos que poseen glucósidos cianógenos se encuentran las almendras, yuca, sorgo,

albaricoque, durazno, cereza y ciruelas. Los diglucósidos linustatina (R=CH3) y neolinustatina

(R=C2H5), son los principales glucósidos cianógenos que contiene la semilla de lino, seguidos

del monoglucósido linamarina que se encuentra en menor concentración, e inclusive en ciertos

cultivares no ha sido detectado. La linaza también contiene las 2 β -glucosidasas encargadas de

hidrolizar a los glucósidos cianógenos. La cantidad de glucósidos cianógenos presentes en la

semilla disminuye considerablemente con su madurez; mientras la semilla verde contiene

aproximadamente 5% (en base seca), la semilla madura contiene alrededor del 0,1% (en base

seca), razón por la cual se recomienda que las semillas destinadas al consumo humano y

animal estén completamente maduras (Kobaisy et al. 1996; Fokunang et al. 2001; Daun et al.

2003).

El daño a la estructura de la semilla da inicio a la degradación de los cianógenos, al permitir

que las enzimas tengan acceso al sustrato cianogénico y reaccionen. El metabolismo de los

glucósidos cianógenos comienza cuando la enzima β-bis-Glucosidasa, también llamada

linustatinasa, hidroliza la linustatina y la neolinustatina, transformándolas en el glucósido

monocianogéno linamarina (Ec. 1, Fig. 1.9.), que posteriormente es hidrolizada por la β-

monoglucosidasa o linamarasa para formar las denominadas “agliconas” o compuestos

cetocianhídricos (Ec. 2, Fig. 1.9.). Finalmente, se produce HCN (Ec. 3, Fig. 1.9.) cuando la α-

Hidroxinitril liasa descompone la acetocianohidrina (Bhatty 1993; Fokunang et al. 2001; Daun

et al. 2003).

26

Figura 1.9. Proceso de transformación del glucósido cianógeno linustatina en HCN.

Fuente: Bhatty (1993).

Posteriormente, el HCN es convertido en tiocianato por la enzima Rhodanasa (Fig. 1.10.), o se

combina con la cisteína para formar β -cianoalanina. En condiciones normales, la mayor parte

del tiocianato es excretado a través de la orina y sólo una pequeña parte se acumula en el

organismo. El efecto tóxico del cianuro se produce después de la inhibición de la enzima

citocromoxidasa, cuya ausencia altera la utilización celular del oxígeno, ocasionando una

hipoxia citotóxica, disfunción y muerte celular (Fokunang et al. 2001).

Figura 1.10. Metabolismo normal del cianuro. Fuente: Fokunang et al. (2001).

… (Ec. 1)

… (Ec. 2)

… (Ec. 3)

S2O2 2- SO3 2

- CN-

Tiosulfato sulfur-transferrasa (Rhodanasa)

SCN -

Excreción (Orina)

Pool de CN-

HCO2- Incorporación

a las células

27

La dosis mínima letal de HCN se estima entre 0,5 y 3,5 mg/kg de peso corporal; sin embargo,

la magnitud del efecto del HCN sobre el metabolismo no solo depende de la cantidad de

glucósidos ingeridos y de la frecuencia de consumo, sino también de la salud y estado

nutricional del consumidor, en especial, si existe deficiencia de proteínas en la dieta. Las

personas sanas y con un régimen de alimentación balanceada son capaces de detoxificar y

eliminar del organismo estos compuestos potencialmente peligrosos. Un adulto saludable

puede llegar a detoxificar entre 30 y 100 mg/día de cianuro, sin embargo cuando se combina el

consumo de glucósidos con uno o mas de los aspectos nutricionales previamente

mencionados, la habilidad del organismo de eliminar el cianuro se ve considerablemente

comprometida. Por ejemplo, las personas con deficiencia de yodo que ingieren frecuentemente

alimentos con glucósidos cianógenos, tienden a mantener niveles elevados de tiocianato en

sangre lo cual eventualmente desencadena en intoxicación por HCN y/o en deficiencias

crónicas de yodo ya que el tiocianato inhibe el metabolismo de este elemento. Entre los

síntomas característicos de la intoxicación con HCN se encuentran la asfixia, halitosis, nauseas

y/o vómitos, mareo y aumento del ritmo cardíaco; en casos de intoxicación aguda puede haber

parálisis muscular, confusión mental, paro respiratorio y muerte (Fokunang et al. 2001; Daun

et al. 2003).

La presencia de glucósidos cianógenos ciertamente es la mayor limitación para el consumo de

linaza, aun cuando diversos estudios coinciden en que se necesitarían ingerir cantidades

superiores a 1 kg/día para ocasionar una intoxicación aguda (Daun et al. 2003). Bhatty (1993),

determinó que la cantidad de glucósidos liberados de la semilla entera no es suficiente para

resultar tóxica, sin embargo, en esta investigación no se estudió la semilla molida, sino entera,

y por lo tanto recomienda, ante la ausencia de otras investigaciones, evitar la ingestión de

cantidades mayores a 50 g de semillas enteras/día (≈ 4 cdas. grandes), en especial por personas

que padezcan insuficiencia renal o hepática, cuya capacidad de detoxificacion es limitada. En

enero del 2009, la Food and Drug Adminisration (FDA) consideró que habían suficientes

estudios clínicos y toxicológicos para asignar el status GRAS a la linaza tanto entera como

molida. Este estatus le proporciona a la linaza la seguridad que algunas compañías requerían

para incluirla en sus formulaciones. Aún se encuentran en estudio para asignar status GRAS el

28

aceite, los lignanos y los suplementos de fibra dietaria de linaza. (Flax Council of Canada

2009).

Se sospecha que el calor leve y la molienda exacerban la acción enzimática, razón por la cual

se aconseja realizar infusiones en frío para evitar que la enzima actúe, no calentarlas sino

hervirlas por 10 minutos como mínimo para inactivar la enzima, o comer las semillas enteras,

pero de esta forma se limita el aprovechamiento de los constituyentes que están contenidos en

el interior de la semilla. En animales se han producido intoxicaciones cuando se utilizan tortas

de linaza (residuo de la extracción del aceite) que no han sido sometidas previamente a

tratamientos de calor que destruyan las enzimas o a extracciones con disolventes adecuados (la

máxima extracción se obtiene mediante 3 etapas con mezclas metanol-amonio-agua/hexano).

Por otro lado, durante el proceso de extracción del aceite de linaza también puede haber

producción de HCN por lo que las semillas deben tratarse previamente para inhibir la acción

enzimática (Bhatty 1993; Oomah y Mazza 1998; Fokunang et al. 2001; Flax Council of

Canada 2009).

1.3. Principales usos de la linaza. La planta de lino se ha cultivado desde la antigüedad para la extracción de las fibras y aceite.

De las fibras del tallo se obtiene un hilo con el cual se fabrican telas. Su cultivo para este fin,

adquirió gran relevancia dentro del imperio Egipcio ya que las telas de lino se utilizaban para

vestir a los faraones, y también durante el proceso de momificación. En el año 1753 se

comenzó la producción industrial de fibra de lino. Durante la revolución industrial tuvo

múltiples usos y por ende mucha demanda, pero posteriormente, el descubrimiento de las

fibras sintéticas y el predomino del cultivo del algodón (comienzos del siglo XIX), relegó la

producción de la fibra de lino y el cultivo de la planta a un segundo término. El proceso de

obtención de telas puede realizarse industrial o manualmente, en el último caso, se permite que

la planta cortada quede expuesta a las condiciones ambientales para que la fermentación

natural la descomponga y permita separar la fibra vegetal de otras partes no deseadas para

elaborar un hilo natural que se utiliza en la fabricación de una tela similar al algodón, pero más

fuerte, más lisa al tacto e igual de fresca y absorbente. El tallo y las semillas pueden ser

29

utilizados en la fabricación de pulpa papelera (Vaisey-Genser y Morris 1997; Flax Council of

Canada 2005).

El aceite de linaza se utiliza fundamentalmente en la industria de pinturas, tintas y barnices por

sus propiedades como agente de secado rápido; además, los polímeros formados durante las

reacciones de oxidación del aceite de linaza le confieren a la madera, hierro y otras superficies,

protección contra los factores ambientales. Por otra parte, el aceite de linaza es el componente

principal en la fabricación del linóleo, un producto impermeable, altamente resistente y de

baja necesidad de mantenimiento utilizado para cubrir suelos, y también es utilizado como

agente antidesgarrante en la fabricación del concreto, pues evita que los cambios climáticos,

especialmente el frío del invierno, cause grietas en las estructuras hechas de este material

(Vaisey-Genser y Morris 1997; McKinnon 2008).

El mucílago de linaza tiene usos cosméticos ya que posee propiedades demulcentes

(suavizantes y protectoras de la piel irritada), y emolientes (suavizan la piel, formando una

capa sobre ella que impide la evaporación del agua), que son aprovechadas en preparaciones

con harina de las semillas, para ser usadas en el tratamiento de afecciones de la piel, como

eccemas, hinchazón, quemaduras, etc. También se utiliza el extracto de mucílago para

productos del cabello pues posee efecto fijador, alisante, y fortalecedor. Adicionalmente, el

mucílago de linaza posee propiedades estabilizantes y emulsificantes por lo cual puede ser

utilizado como aditivo en la industria de alimentos en lugar de otras gomas como la arábiga y

la xanthan, y como sustituto del huevo en la elaboración de diversos productos horneados y

fritos como ponques y panquecas. Las proteínas de linaza también poseen buenas propiedades

emulsionantes, espesantes y espumantes que pueden ser aprovechadas en la fabricación de

helados, derivados cárnicos y salsas; igualmente, han demostrado tener efectos antifúngicos en

alimentos con pH neutro o alcalino, lo cual pudiera promover su uso como aditivo alimentario

(Oomah 2001; Daun et al. 2003; Morris 2007; Xu et al. 2008).

La linaza es muy utilizada en la alimentación animal, principalmente la torta remanente de la

extracción del aceite, pues es una excelente fuente de proteínas (aproximadamente 35%), de

30

ahí que la harina de linaza se emplea para fabricar alimentos y “snacks” para perros, gatos y

caballos. Sin embargo en las últimas décadas, mas que las proteínas, ha sido la calidad de los

lípidos que contiene la linaza lo que ha incentivado su uso en la alimentación animal, pues se

ha observado que al incrementarse el consumo de ácido α-linolénico (ALA), el perfil de

ácidos grasos de la carne, leche y huevos se modifica aumentando el porcentaje de ácidos

omega 3 que aportan. La leche enriquecida con aceite de linaza aporta aproximadamente 90mg

de ALA por vaso (250 ml); esta leche presenta la desventaja de ser mas susceptible a la

oxidación por lo cual requiere un manejo y condiciones de procesamiento especiales Al

adicionar aceite de linaza al alimento tradicional del ganado vacuno, diversos estudios

observaron que solo una pequeña parte del ALA suplementado a los animales era incorporado

a la leche, ya que durante la digestión, este se transforma en ácidos grasos saturados,

concluyendo que para obtener un incremento hasta del 20% de omega 3 en la leche era

necesario proteger física o químicamente al ALA para que no se hidrolice en el rumen del

animal. Al fabricar mantequilla con leche enriquecida en ALA se observan cambios

importantes en su suavidad y untabilidad a temperatura ambiente, respecto a una mantequilla

control (Vaisey-Genser y Morris 1997; Primo Yùfera 1998; Flax Council of Canada 2002a).

En Canadá se ha suplementado el alimento para gallinas ponedoras con 10-20% de linaza, lo

cual ha modificado, entre otras cosas, la composición de ácidos grasos de la yema de huevo, al

aumentar considerablemente su contenido de ácidos omega-3, desde 0,4% hasta un 9,0%, sin

afectar perceptiblemente su color o sabor. Otros beneficios observados al incluir linaza en la

alimentación de aves han sido incremento en el peso del animal, disminución de la grasa de la

carcasa y los órganos, y un incremento en los niveles de ácidos omega-3 en los tejidos. La

suplementación con linaza debe complementarse con vitamina E para evitar la oxidación de

ácidos grasos, ya que esto ocasiona que los productos tengan un leve sabor a pescado y sean

mas propensos a la oxidación (Oplinger et al. 1992; Vaisey-Genser y Morris 1997; Flax

Council of Canada 2003, 2004).

Existen pocos estudios sobre la suplementación de alimentos para pescados y ganado porcino

con linaza. Hasta ahora se sabe que en el caso de los pescados esta dieta no afecta su

crecimiento, y que el contenido de omega-3 de su carne aumenta a expensas de los omega-6,

31

principalmente del ácido araquidónico (de Souza et al. 2008). A las semillas utilizadas para

este fin se les debe extraer primero la fibra soluble, ya que se ha observado que los pescados

no la toleran. La adición máxima de linaza a la alimentación del ganado porcino es del 5%

pues se ha observado que niveles superiores afectan desfavorablemente el sabor de productos

como la tocineta y chuleta (Vaisey-Genser y Morris 1997; Flax Council of Canada 2003).

Las propiedades medicinales de la linaza eran bien conocidas en la antigua China, en donde la

utilizaban con diferentes fines en su medicina tradicional. Actualmente, la linaza sigue siendo

utilizada mundialmente en la preparación de medicinas caseras para tratar inflamaciones,

estreñimiento y mala digestión, entre otros. En países como Canadá y Estados Unidos, se

comercializan desde hace varios años diversos productos nutracéuticos a base de linaza para

tratar y/o prevenir diversas afecciones, como por ejemplo, extractos purificados de lignanos,

que son utilizados por el consumidor para el tratamiento y/o prevención de enfermedades

como la diabetes, lupus, hipertensión y desordenes hormonales, incluyendo los relacionados

con la menopausia. También se comercializan cápsulas de aceite de linaza que afirman tener

múltiples beneficios contra enfermedades cardiovasculares y trastornos hormonales; sin

embargo, el aceite de linaza no posee lignanos por lo cual tampoco posee sus propiedades

fitoestrógenas (Flax Council of Canada 2002a; Crosby 2005). Muchos de estos productos ya

pueden adquirirse localmente.

A partir de los años 70 se profundizaron los estudios sobre la composición de la linaza,

conociéndose sus propiedades benéficas a la salud, con efectos tanto preventivos como

curativos. Ello ha incentivado en países productores como Estados Unidos y Canadá, el

consumo de linaza como parte de la dieta diaria, y por ende su uso y/o el de sus subproductos

como ingrediente en una variedad de alimentos disponibles al consumidor como por ejemplo

harinas, panes, galletas, pastas, tortas, donas, bebidas y barras energéticas, snacks, cereales

para desayuno y toppings entre otros. En Latinoamérica, México es el país que mas reseña el

uso de linaza en la fabricación industrial de alimentos como cereales, panes y barras

energéticas, resaltando su contenido de fibra. Hasta un 40% de sustitución con linaza entera o

molida ha sido utilizada exitosamente en la fabricación de productos horneados. Su adición

modifica el perfil de textura de estos alimentos proporcionando suavidad (debido a la grasa

32

que aporta), y crujencia (aportado por la cáscara); adicionalmente, la contribución de aceite de

la semilla permite disminuir la cantidad de grasa añadida (Vaisey-Genser y Morris 1997;

Oomah y Mazza 1998; Flax Council of Canada 2005).

1.4. La linaza como alimento funcional. Los alimentos funcionales son aquellos que contienen componentes que poseen actividad

biológica capaz de promover la salud. Cuando se demuestra que un alimento afecta

beneficiosamente y de manera relevante alguna función corporal, mas allá de sus propiedades

nutricionales básicas, éste se considera un “alimento funcional”. Estos alimentos están

relacionados con mejoras significativas en la salud y bienestar físico en general, y/o con la

reducción del riego de enfermedades crónicas (Erbas y Tetik 2005; Salta et al. 2005).

A la linaza se le atribuyen actualmente múltiples beneficios a la salud, con efectos tanto

preventivos como curativos, entre los cuales destacan:

Su alto contenido de fibra y ácidos grasos insaturados ayuda a prevenir enfermedades

cardiovasculares y la arteriosclerosis, ya que disminuye los niveles de colesterol LDL y

triglicéridos en sangre (Bhatty 1993; Oomah y Mazza 1998).

La fibra soluble de la linaza también es coadyuvante, en asociación con las proteínas, en la

reducción de la incidencia de diabetes y en el tratamiento de la obesidad, ya que retrasa la

digestión y absorción de los carbohidratos, lo cual favorece la respuesta glicémica del

organismo beneficiando la regulación de los niveles de azúcar en sangre. Sin embargo se

sabe que el consumo excesivo de semillas inhibe también la absorción de otros nutrientes y

de medicamentos debido a la formación de una barrera mucilaginosa sobre el intestino

(Bhatty 1993; Oomah y Mazza 1998; Fitzpatrick 2008).

Su contenido de tocoferoles, además del efecto antioxidante, favorece la excreción de

sodio, lo cual contribuye a disminuir la presión sanguínea; adicionalmente, ayuda a

mantener el selenio en estado reducido, contribuyendo a su acción antioxidante, y

disminuye la formación de nitrosaminas, responsables de la aparición de cáncer de

estómago (Oomah y Mazza 1998; Morris 2007).

33

Mejora el estreñimiento gracias a sus propiedades laxantes al ser consumidas enteras o en

infusiones frías. Este beneficio es atribuido a los mucílagos, que además poseen efecto

protector sobre el intestino, evitando las irritaciones que otros laxantes suelen producir.

También se le atribuyen efectos preventivos del cáncer de colon y recto (Batthy 1993; Flax

Council of Canada 2005).

Efecto anti inflamatorio, reparador y protector del aparato digestivo y del sistema urinario,

por lo que se utilizan para combatir las irritaciones estomacales, diverticulitis y la cistitis.

Asimismo, estas propiedades también pueden aprovecharse para el tratamiento de ciertos

trastornos ginecológicos como la endometriosis, en el tratamiento de cataratas, inflamación

de garganta, alivio de dolores musculares, etc. (Oomah y Mazza 1998).

La administración diaria de aceite de linaza o de linaza molida (15g), disminuye la

inflamación de los riñones y mejora la función renal en pacientes con lupus eritematoso

(Morris 2007).

Ayuda a prevenir la aparición de cáncer de mama, próstata y tumores en la piel, e

interviene en la regulación de los niveles de las hormonas sexuales en plasma,

principalmente de los estrógenos, gracias a su contenido de fitoestrógenos de lignano a los

cuales se le atribuyen propiedades antioxidantes, antiestrogénicas y antitumorales (Flax

Council of Canada 2002a; Daun et al. 2003; Crosby 2005).

Sus propiedades mucolíticas ayudan a eliminar las secreciones bronquiales remanentes de

resfriados y otras enfermedades respiratorias (Oplinger et al. 1992).

El aceite de linaza posee propiedades antimaláricas, antiparásitos y antitumorales, debidas

a la toxicidad de los productos secundarios de la peroxidación de los ácidos grasos

insaturados, que son capaces de inhibir el crecimiento de microorganismos y de células

malignas. También se ha relacionado con el alivio de ciertas condiciones neurológicas

como el entumecimiento y la visión borrosa, así como con potenciales efectos

antitrombogénicos y antiarrítmicos (Vaisey-Genser y Morris 1997; Oomah y Mazza 1998).

Los flavonoides y los polifenoles pudieran tener efecto antioxidante y protector en el tracto

gastrointestinal antes de ser absorbidos. Esta hipótesis está fundamentada en el hecho de

que en algunos estudios se ha encontrado mayor concentración de compuestos fenólicos en

el estomago y el intestino que en la sangre. Los polifenoles pudieran disminuir la

susceptibilidad de oxidación de las lipoproteínas de baja densidad (LDL), que es

34

ocasionada por el estrés oxidativo de las grasas y azucares postprandiales oxidadas.

Proteger las LDL de la oxidación tiene un efecto preventivo y atenuante de la

ateroesclerosis (Frankel y German 2006).

Se cree que el ácido fítico colabora con los efectos hipocolesterolémicos e hipolipidémicos

de los componentes mayoritarios de la linaza, así como en la reducción del riesgo de

cáncer de mama y colon. Aun cuando este ácido es considerado en algunos casos como un

compuesto antinutricional, se ha demostrado que se encuentra en muy bajas

concentraciones para ocasionar una inhibición significativa de nutrientes. El contenido de

ácido fítico de la linaza varía entre 23-33 g/kg de semillas (Oomah y Mazza 1998; Daun et

al. 2003).

1.5. La linaza en Venezuela. La semilla de lino consumida en Venezuela es importada desde Canadá, ya que los cultivos

locales, aunque viables, son escasos, al punto de no existir información oficial sobre

producción de linaza en el país (FAO 2007). En el estado Mérida existen pequeños cultivos de

linaza, con una producción anual que no llega a cubrir las necesidades locales. La linaza

criolla, a diferencia de la rojiza canadiense, es de variedad dorada (Fig. 1.11.). El color de la

flor de la planta de lino criolla, que también pudiera contribuir a la futura identificación

taxonómica de la variedad local, es violeta (Fig. 1.11.).

Figura 1.11. Planta de lino local y sus flores. Linaza cultivada en el Estado Mérida.

35

1.6. Procesamientos caseros aplicados a la linaza. En Venezuela, la linaza es comúnmente utilizada y consumida a nivel casero o artesanal,

principalmente en forma de infusiones frías o calientes, adicionada a los cereales de desayuno

o jugos de fruta, y tostada para hacer barras tipo turrón. Recientemente ha sido incluida a nivel

industrial por empresas como la Kellogg’s y Panes Bimbo en la fabricación de cereales de

desayuno, barras dietéticas y panes.

Entre los procesamientos mas comunes aplicados en el país a la linaza están el remojo, la

cocción, la molienda y el tostado. Las condiciones particulares de tiempo y temperatura

recomendadas en cada caso varían según la fuente (Anónimo 2007).

Existen recomendaciones variadas y opiniones encontradas sobre la forma de consumir la

linaza, en particular sobre si deben consumirse enteras o molidas. La mayoría de las

recomendaciones están orientadas hacia el consumo de las semillas enteras para aprovechar al

máximo su contenido de fibra, pero dejando de lado el resto de sus componentes. La cáscara

de la linaza resiste la acción de las enzimas digestivas, por lo cual las semillas pasan a través

del tracto gastrointestinal sin ser digeridas. En este caso, si se desean aprovechar los nutrientes

que se encuentran en el interior de la semilla, esta debe ser completamente masticada antes de

su deglución (Morris 2007).

La molturación o molienda de la semilla es otra operación que se recomienda para que el

organismo aproveche los constituyentes contenidos en el interior de la semilla. Sin embargo,

la molienda tiene sus detractores que se basan en el hecho de que esto promueve la oxidación

de las grasas poliinsaturadas, y además permite que las enzimas y el sustrato cianógeno entren

en contacto, formándose el HCN. Diversos estudios de estabilidad aseguran que desde el

punto de vista de los ácidos grasos, la linaza molida se mantiene fresca a temperatura ambiente

(≈ 23ºC) hasta por 4 meses, gracias a la acción sinérgica de los lignanos y el tocoferol

presentes en la semilla. Sin embargo, y ante la ausencia de estudios de estabilidad donde se

considere la formación de HCN, la recomendación general es moler las semillas, si se desea

36

aprovechar mas que la fibra, al momento en que se van a consumir, y no guardar semilla

molida para ser consumida luego (Morris 2007).

El remojo de las semillas enteras en agua por varias horas es quizás la práctica más común. La

finalidad de este proceso es extraer el mucílago o fibra soluble que se encuentra recubriendo la

semilla. Con el remojo, esta capa mucilaginosa se hidrata y se separa de la corteza de la

semilla. Sin embargo, si no hay agitación, la separación del mucílago es solo parcial y la

mayor parte de la fibra soluble quedará hidratada pero adherida a la semilla. El remojo puede

realizarse con agua fría o caliente, siendo este ultimo más efectivo si lo que se desea es extraer

el mucílago. El tiempo de remojo puede variar desde 30 min hasta 12 h.

La cocción de la semilla por varios minutos, previo remojo o no, para realizar infusiones, tiene

por finalidad aumentar la extracción de fibra de la semilla. Adicionalmente, el calor

prolongado puede producir cierto daño en la estructura de la semilla, ocasionando que parte de

los compuestos, como por ejemplo las proteínas solubles, pasen al agua de cocción. Este

procesamiento es recomendado para inactivar las enzimas responsables de la producción de

HCN y disminuir el riesgo de intoxicación en personas con ciertas patologías que no tienen la

capacidad de detoxificación del HCN de una persona sana, o cuando se ingiere linaza varias

veces al día. El tiempo de cocción recomendado varía desde 2 hasta 10 min.

Para prolongar el tiempo de vida útil de la semilla y mejorar sus propiedades organolépticas se

recomienda el tostado de la semilla a temperaturas superiores a los 180ºC por varios minutos.

Durante el proceso de tostado de linaza se generan compuestos aromáticos que le confieren a

la semilla sabor y olor similar al de nueces o almendras tostadas, además de una textura

crocante más agradable al paladar de ciertos consumidores. También ocurren reacciones de

Maillard que pudieran aumentar su actividad antioxidante. Posterior al tostado, la semilla

puede consumirse entera o molida (Morris 2007). Esta práctica es por el contrario la menos

utilizada en el país a nivel casero, ya que a nivel industrial es la más usada.

37

1.7. Consideraciones generales sobre los análisis químicos aplicados a la linaza. La fibra dietaria total se determina de acuerdo al método AOAC 985.29 (1997), también

conocido como Método de Prosky, que combina procedimientos enzimáticos y gravimétricos.

Las muestras son inicialmente gelatinizadas con α-amilasa termoestable y posteriormente

digeridas enzimáticamente con proteasa y amiloglucosidasa, con la finalidad de remover las

proteínas y el almidón, respectivamente. Etapas sucesivas de filtración, lavados con etanol

(C2H6) y acetona, precipitación de la fibra soluble por adición de C2H6, determinación de

proteínas y de cenizas, completan esta metodología.

Para la cuantificación de los polifenoles totales extraíbles se utilizó el método

espectrofotométrico de Folin-Ciocalteu (Sánchez-Moreno et al. 1998, 1999; Singleton et al.

1999), empleando el reactivo del mismo nombre, que es capaz de reaccionar con las sustancias

fenólicas y no fenólicas reductoras presentes en un medio con pH básico, formando

cromógenos de color azul (Bray y Thorpe 1954).

Para la determinación de ácido cianhídrico (HCN) se utilizó el método propuesto por

Bradbury et al. (1994) en el cual la determinación se realiza en tres etapas: (1) Extracción de

los compuestos cianógenos de la muestra utilizando un medio ácido para inactivar a la enzima

linamarasa, (2) La hidrólisis de los glucósidos cianógenos a cianohidrinas por hidrólisis ácida,

y luego a cianuro por adición de un álcali y, (3) La cuantificación del cianuro, basado en la

reacción de König en la cual el ion CN- es oxidado por la adición de Cloramina-T (Ec.1,

Fig.1.12.), luego reacciona con la piridina para producir un compuesto intermediario (Ec.2,

Fig.1.12.), que posteriormente se hidroliza a un dialdehído conjugado denominado aldehído

glutacónico (Ec.3, Fig.1.12.); este dialdehido, al acoplarse a un grupo metileno activo (Ec.4,

Fig.1.12.), que aporta el ácido barbitúrico, forma el complejo coloreado rosa que es detectado

por el espectrofotómetro a una longitud de onda de 583 nm (Lambert et al. 1975; Bradbury et

al. 1994).

38

Figura 1.12. Reacción de König para la determinación de HCN. Fuente: Lambert et al. (1975). Para la determinación de la capacidad antioxidante de la linaza se utilizó el método del DPPH,

que mide la capacidad de secuestro de los radicales libres (Sánchez-Moreno et al. 1998); este

método se basa en la generación de radicales libres a partir de una solución metanólica de 2,2-

difenil-1-picrilhidrazil, mejor conocida como DPPH, que en forma de radical absorbe a una

longitud de onda de 515 nm. La absorbancia decrece como consecuencia de la reducción por

la presencia de un agente oxidante o de especies radicales, es decir, disminuye a medida que

los radicales libres del reactivo son atrapados (Fig.1.13.). Los antioxidantes interfieren con el

proceso de oxidación al reaccionar con los radicales libres, al quelar los metales catalizadores

y/o al atrapar oxígeno. Los compuestos que son capaces de disminuir rápidamente la

absorbancia del DPPH al donar átomos de hidrógeno son considerados como buenos

antioxidantes. Mientras más átomos de hidrógeno estén disponibles en el medio de reacción,

más radicales libres son reducidos, por lo que la tonalidad del medio cambia gradualmente

desde un violeta intenso a un color amarillo traslúcido (Sánchez-Moreno et al. 1999a; Espín et

al. 2000; Ozcelik et al. 2003).

CN ¯ + → CN + ... (Ec. 1) Cloramina-T

... (Ec. 2) Piridina

… (Ec. 3)

Complejo Coloreado

… (Ec. 4)

39

Figura 13. Esquema de la reacción de reducción del radical DPPH·. Fuente: Espín et al. (2000)

CAPÍTULO II

MATERIALES Y METODOS

2.1. Materiales. 2.1.1. Materia prima.

La linaza importada de Canadá fue adquirida en el comercio local. Para ello se seleccionaron

semillas empacadas y distribuidas por “Empacadora Pico Bolívar, C.A.” en Ejido edo.,

Mérida. Lote: DM010904. El empaque de origen eran bolsas de plástico transparentes,

termoselladas, conteniendo 450 gramos de peso neto en cada una.

La linaza nacional fue adquirida directamente de su productor. Se trabajó con 2 cosechas de

esta linaza, ya que debido al resultado obtenido en los análisis preliminares realizados a la

primera cosecha, se decidió descartar su utilización dentro del diseño experimental. El cultivo

se realizó en el sector “El Morro” de la ciudad de Mérida (Edo. Mérida). Normalmente la

cosecha se realiza durante los meses de abril y mayo, y posteriormente son empacadas

artesanalmente en bolsas de lona con capacidad máxima de 15 kg.

2.1.2. Equipos y reactivos. Los análisis microbiológicos y fisicoquímicos se llevaron a cabo en los laboratorios de

Microbiología de Alimentos, Análisis de Alimentos, y Desarrollo de Productos de la

Universidad Simón Bolívar sede Sartenejas, Caracas. El perfil de ácidos grasos se realizó en el

Laboratorio de Biotecnología (Laboratorio de Soporte Científico) de Cervecería Polar, Centro

Tecnológico Polar, Caracas. La determinación de minerales se realizó en el Laboratorio de

41

Desechos Tóxicos de la Universidad Simón Bolívar. Los reactivos utilizados serán descritos

en cada una de las metodologías correspondientes.

2.2. Procedimientos experimentales. 2.2.1. Muestreo de las semillas. Se siguió la norma Venezolana para el muestreo de cereales, leguminosas, oleaginosas y

productos derivados (COVENIN 1982). El tamaño inicial del sublote para ambos tipos de

semilla fue de aproximadamente 12 kg, y el de la muestra final fue de 3 kg. Se conservó una

muestra testigo de 1 kg. para cada tipo de semilla. El procedimiento de muestreo se realizó en

condiciones asépticas como requerimiento para su posterior análisis microbiológico. Las

muestras se almacenaron en recipientes de plástico, con cierre hermético, previamente

esterilizados (COVENIN 1982, 1989a), y de color oscuro para evitar posibles cambios en la

composición de los ácidos grasos de la semilla a consecuencia de la luz. Las submuestras se

almacenaron en refrigeración hasta su análisis (Oomah y Mazza 1998; Flax Council of Canada

1999). En la Fig. 2.1. se presenta un esquema simplificado del proceso de muestreo de las

semillas.

2.2.2. Análisis microbiológico. Para la selección de los análisis microbiológicos a realizar se tomaron en consideración las

características intrínsecas de la linaza, sus condiciones de transporte, almacenamiento y

manipulación, y la ausencia de estudios previos y/o antecedentes microbiológicos (Adams y

Moss 2000). De acuerdo a lo anterior, se determinaron coliformes totales, mohos y levaduras,

Staphylococcus aureus, y microorganismos productores de esporas de los géneros Bacillus

(aerobios) y Clostridium (anaerobios). Todos los análisis se realizaron por triplicado. Para la

expresión de los resultados se utilizaron las reglas para el contaje de colonias de la American

Public Health Association (APHA 1992), y las Normas COVENIN 1292-89 y 1644-93

(COVENIN 1989b, 1993a).

42

Figura 2.1. Esquema de muestreo de las semillas de linaza.

2.2.2.1. Preparación de la muestra.

Para las determinaciones de coliformes totales, mohos y levaduras, y Staphylococcus

aureus se pesaron 11 g de cada variedad de semillas en bolsas de polietileno tipo ziplock y

se adicionaron 99 ml de solución de agua peptonada al 0,1% (HiMedia). Para su

homogeneización se empleó el stomacher (LAB-BLENDER 400) por 30 seg. Esta mezcla

se consideró como la dilución 10-1, a partir de la cual se prepararon las diluciones

posteriores correspondientes a cada análisis, utilizando también solución de agua

peptonada al 0,1%.

Para la determinación de esporas aerobias y anaerobias, se siguió el procedimiento

indicado en la Norma COVENIN 2499 (1988), que establece una cocción de la dilución

madre de muestra (Dilución 10-1 preparada como se indicó anteriormente), a 94ºC por 15

↓

↓ De cada bolsa se tomaron

aproximadamente 160 g Muestras primarias

Se tomaron semillas de

diferentes partes del saco

↓ ↓

Muestra total: 3 kg Muestras de laboratorio

Muestra total: 3 kg

↓ ↓

Análisis Microbiológico

↓

↓ Remoción de impurezas

↓

Metodología Experimental

Linaza Nacional

Saco de 12 kg

Linaza Importada

26 Bolsas de 450 g

43

min, con la finalidad de eliminar posibles células vegetativas. Se disminuyó la cantidad de

muestra pesada que indica la norma (50g), hasta 11g por razones operacionales debidas a

la naturaleza mucilaginosa de la linaza. Se pesó una muestra adicional que se utilizó para

conocer y controlar la temperatura de la dilución durante el proceso de cocción, el cual se

realizó en un baño térmico. Posteriormente se continuó con la metodología específica de

acuerdo a cada género a estudiar.

2.2.2.2. Coliformes totales y fecales. Se utilizó la técnica de determinación del numero mas probable (NMP) (COVENIN 1996) con

baterías de 3 tubos por cada dilución (10-1, 10-2, 10-3). Para los coliformes totales se utilizaron

los caldos Lauril Sulfato (Hi-Media) y Bilis Verde Brillante (Merck). Para los coliformes

fecales se empleó el Caldo EC (Merck). Los tubos se incubaron a 35ºC (totales) y a 44,5ºC

(fecales) por 24-48 h. La aparición de gas en el tubo de Durham indicó la presencia de los

microorganismos investigados.

2.2.2.3. Mohos y levaduras. Se empleó Agar Papa Dextrosa o PDA (Merck), previa adición de ácido tartárico (14ml/lt), y

utilizando la técnica de siembra en profundidad para las diluciones 10-1 y 10-2. El periodo de

incubación fue de 5 días a 28ºC (Merck 1994).

2.2.2.4. Staphylococcus aureus. Se utilizó agar Baird Parker BP (BBL™), adicionado de solución de yema de huevo al 40% y

telurito de potasio al 3,5%, con siembra en superficie o por agotamiento con las diluciones

10-1 y 10-2. El periodo de incubación fue de 24-48 h, a 35ºC. Las colonias negras, redondas,

brillantes, rodeadas de un halo claro se consideraron colonias presuntivas. Para confirmarlas se

tomaron dichas colonias presuntivas y se inocularon por separado en caldo cerebro corazón

(Merck) a 35ºC por 24 h para su enriquecimiento. Posteriormente se tomó 0,1 ml de este caldo

y se colocó en tubos que contienen 0,3 ml de solución plasma de conejo (Merck) con la

finalidad de determinar la capacidad coagulasa positiva característica del S. aureus; los tubos

44

se incubaron a 35ºC por 4-6 h, o hasta por un máximo de 24 h. La observación de coágulos se

consideró como confirmación de la presencia de S. aureus (COVENIN 1989b; Merck 1994;

Adams y Moss 2000).

2.2.2.5. Microorganismos esporulados aerobios. Se utilizó Agar Dextrosa Peptona de Caseína (Merck), el cual contiene indicador púrpura de

bromocresol que permite observar fácilmente las colonias que tienen la propiedad de

metabolizar la dextrosa, provocando que el medio cambie a color amarillo. Aun cuando la

técnica de siembra recomendada para esta metodología es la de agotamiento, se utilizó la

técnica de siembra en profundidad en placas, ya que la consistencia mucilaginosa de la linaza

dificultaba la aplicación de la siembra en superficie. El periodo de incubación fue de 24-72 h a

35ºC. Se sembraron las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3. Se consideraron colonias típicas aquellas

con borde liso, 2-3 mm de diámetro, centro opaco, y rodeadas por un halo amarillo (Merck

1994). A dichas colonias se les realizó un frotis para su observación en el microscopio,

además de tinción Gram para observar sus características morfológicas.

2.2.2.6. Recuento presuntivo de Bacillus cereus. Se utilizó agar Yema de huevo Polimixina Rojo Fenol, y la siembra por agotamiento de las

diluciones 10-1 y 10-2 en dos fracciones de 0,3 y una de 0,4 ml, con un periodo de incubación

de 24 h a 37ºC. Las colonias presuntivas de B. cereus en este agar son grandes, secas y

rugosas, sobre un fondo nítido de color rosado intenso a púrpura, rodeadas por un halo de

precipitado blanco y denso formado por la degradación de la lecitina del medio, característica

de este microorganismo. La flora de acompañamiento que suele estar presente junto a este

microorganismo, y que no es inhibida por la polimixina, produce el viraje del indicador de

color rojo a amarillo. La presencia de B. cereus se confirmó posteriormente con una tinción

Gram para observar sus características morfológicas, y con las siguientes pruebas bioquímicas:

degradación anaeróbica de la D(+)glucosa (utilizando caldo VP modificado para B. cereus),

licuefacción de la gelatina (gelatina nutritiva), reducción de nitratos a nitritos (caldo nitrato),

hidrólisis del almidón (agar almidón), y peptonización del medio leche tornasol (COVENIN

1993a; Merck 1994).

45

2.2.2.7. Microorganismos esporulados anaerobios. Se utilizaron los medios Reinforced Clostridial Agar RCA (BBL™) con polimixina B

(0,02g/lt), para la enumeración del contenido total de microorganismos anaerobios y

facultativos, y el agar Triptona Sulfito Neomicina TSN (Merck), especifico para la detección y

enumeración de Clostridium perfringens. La siembra y cultivo de ambos medios se realizó en

tubos planos o de Miller-Pricket y bajo condiciones anaerobias, para lo cual se utilizó una jarra

de anaerobiosis tipo Gas-Pack. Para la siembra en agar RCA se utilizaron las diluciones 10-1 y

10-3 con incubación de 7 días a 35ºC. Se enumeraron las colonias con coloración crema o

amarillo pálido. El agar TSN con las diluciones 10-1 y 10-2, fue incubado por 24-48 h a 35ºC,

siendo las colonias presuntivas de C. perfringens de color negro. Posteriormente para

confirmar o descartar su presencia, se realizaron pruebas bioquímicas, previa recuperación de

las colonias presuntivas tomadas del agar TSN en caldo tioglicolato (Merck) por 24 h a 37ºC

(COVENIN 1993b; Merck 1994). A las colonias obtenidas en ambos medios, se les realizó un

frotis y tinción Gram.

2.2.2.8. Pruebas bioquímicas para C. perfringens. 2.2.2.8.1. Nitrato-motilidad. Se utilizó agar del mismo nombre, con técnica de siembra por punción y fue incubado por 24 h

a 35ºC. El cambio de color del medio a naranja o rojo se consideró indicador de la reducción

de nitratos a nitritos (COVENIN 1993b; Adams y Moss 2000).

2.2.2.8.2. Licuefacción de la gelatina/fermentación de lactosa. Se utilizó agar lactosa-gelatina y se incubó a 35ºC por 24-48 h. El cambio del medio a color

amarillo se consideró indicador de la fermentación de la lactosa (COVENIN 1993b; Adams y

Moss 2000).

46

2.2.3. Limpieza de la muestra. Una vez concluido el análisis microbiológico se procedió a la limpieza manual de la muestra

de linaza nacional la cual contenía gran cantidad de impurezas como ramas, hojas, restos de

cápsulas y pequeñas piedras, para evitar posibles interferencias en los análisis fisicoquímicos.

Las impurezas presentes se originan como resultado de la cosecha manual y el secado solar

artesanal, a diferencia de la muestra importada, cuya cosecha y secado son mecánicos. La

linaza canadiense no presentaba impurezas visibles por lo que se omitió este paso de limpieza.

2.2.4. Análisis proximal. 2.2.4.1. Humedad.

Se utilizó el método AOAC 925.40 (1990) para la determinación de humedad en oleaginosas y

productos de oleaginosas, que consiste en secar 2g de muestra a peso constante a 95-100ºC a

una presión ≤ 100 mmHg, para lo cual se utilizó una estufa de vacío NAPCO modelo 5B.

2.2.4.2. Grasa. Se utilizó el método de extracción semicontinua en equipo Soxhlet (COVENIN 1981a),

empleando hexano grado técnico como solvente, con un tiempo de extracción de 6 h. Una vez

desgrasada la muestra en el extractor Soxhlet, se dejó a temperatura ambiente hasta la

completa evaporación del solvente para su posterior análisis (Guerra et al. 2005).

2.2.4.3. Proteínas. Se determinó el porcentaje de nitrógeno (N) por el método de Kjeldahl, según la norma

venezolana COVENIN (1980) y el método oficial AOCS Ba 4e-93 (AOCS 1998a), empleando

un aparato de digestión y destilación Macro-Kjeldahl marca Labconco. Se utilizó la linaza

previamente desgrasada (ver 2.2.4.2.). Para convertir el porcentaje de nitrógeno (N) en

porcentaje de proteínas se utilizó el factor 6,25xN (AOCS 1998a; Daun et al. 2003; Morris

2007).

47

2.2.4.4. Proteínas solubles. Se utilizó el método de Biuret (Chang 1998; Guerra et al. 2005). En un tubo de ensayo se

añadió 1 ml del agua de remojo de las semillas y 4 ml del reactivo de Biuret (se disolvieron

1,5 g de CuSO4.5H2O y 6 g de NaKC4H4O6.4H2O en 500 ml de agua, se mezclaron con 300

ml de NaOH al 10% y se enrasó a 1000 ml con agua destilada), se agitó con el vortex y se dejó

en reposo por 30 min, para luego leer la absorbancia a 540 nm, contra un blanco de reactivo (4

ml del reactivo de Biuret, 1 ml de agua destilada). La curva patrón de proteínas se preparó a

partir de una solución madre de albúmina de suero bovino (BSA) 10 mg/ml. La concentración

de proteínas en la muestra se obtuvo por regresión lineal de la curva concentración vs

absorbancia del patrón.

2.2.4.5. Cenizas. Las cenizas, o fracción mineral, se obtuvieron mediante la incineración completa del material

orgánico de la muestra a 500ºC (COVENIN 1981b). La muestra se carbonizó primero en

planchas de calentamiento, por un periodo de aproximadamente 8h, incrementando

gradualmente la temperatura. Se completó la incineración de la muestra utilizando un mechero

Bunsen para completar la carbonización, finalizando el proceso en la mufla Memmert, donde

permaneció toda la noche a la temperatura antes mencionada (Guerra et al. 2005).

2.2.4.6. Minerales. A partir del residuo de la determinación de cenizas se preparó una solución ácida según la

metodología propuesta por Guerra et al. (2005). Todo el material utilizado para la preparación

de las soluciones fue previamente lavado y remojado en HNO3 al 5% (12 h). En la solución de

cenizas se determinó el contenido de sodio, potasio, magnesio, calcio, cromo, cinc, hierro,

cobre, manganeso, fósforo y selenio utilizando el método de emisión atómica con plasma

acoplado inducido (ICP), en un equipo marca GBC modelo Integra XL 2001. Las condiciones

de trabajo del equipo fueron: Flujo de argón: 0,5 lt/min; altura de la fuente: 6mm; plasma: 12,0

lt/min; gas auxiliar: 0,5 lt/min. Las longitudes de onda, variaron según el elemento a

determinar, como se indica a continuación en la Tabla 2.1.

48

Tabla 2.1. Longitudes de onda utilizadas en la determinación de minerales por ICP.

Elemento Longitud de Onda (nm) Elemento Longitud de Onda (nm)

Ca 422, 7 Mn 260,6

Cr

Cu

267,7

327,4

Na

P

589,6

213,6

Fe 372,0 Se 196,0

K 766,5 Zn 213,9

Mg 285,2

2.2.4.7. Fibra dietaria. Se determinó de acuerdo al método AOAC 985.29 (1997), utilizando el kit de fibra TDF-100A

(Sigma). La muestra previamente desgrasada (ver 2.2.4.2.) y deshidratada en condiciones de

vacío (70ºC, sobre la noche), se molturó y tamizó hasta un tamaño de partícula de 0,3-0,5 mm

(35-50 msh ASTM), y se mantuvo en un desecador hasta su análisis. En cada crisol filtrante,

previamente lavado y tarado, se pesaron 0,5g de de celite (Sigma) y se colocaron en la estufa a

130ºC hasta peso constante; este peso se denominó “W1” (peso del crisol + celite). Se

utilizaron dos crisoles por muestra, uno para filtrar la fibra insoluble y otro para la fibra

soluble. Por cuadriplicado se pesó 1 gramo de la muestra preparada en fiolas con tapa;

adicionalmente, se identificaron otras dos fiolas vacías como blancos I y II (blancos de

muestra). Se añadieron a todas las fiolas 50 ml de bufer fosfato 0,08M pH 6,0, y 100 µl de α-

amilasa termoestable; se agitaron suavemente, se taparon e incubaron en un baño de agua

hirviendo (T ≈ 98ºC), por 15 min contados a partir del momento en que el contenido de las

fiolas alcanzó esta temperatura, tomando la precaución de agitar suavemente cada 5 min.

Transcurrido el tiempo, las fiolas se enfriaron a temperatura ambiente (T ≈ 25ºC). Se ajustó el

pH de todas las fiolas a 7,5 ± 0,2 mediante la adición de NaOH 0,275N (≈ 10 ml), para luego

añadir 100 µl de solución de Proteasa (50 mg/ml en bufer fosfato) recién preparada, a cada

fiola; se taparon e incubaron en baño de agua a 60ºC, con agitación continua, por 30 min

contados a partir de que el interior de las fiolas alcanzó dicha temperatura. Una vez que las

fiolas alcanzaron de nuevo la temperatura ambiente se ajustó el pH de las soluciones hasta 4,0-

49

4,6 con HCl 0,325M (≈ 10 ml) . A cada fiola se le añadieron 100 µl de amiloglucosidasa, se

taparon e incubaron en baño de agua a 60ºC, con agitación continua, por 30 min, a partir de

que el interior de las fiolas alcanzó dicha temperatura. Transcurrido el tiempo se comenzó con

el proceso de separación de la fibra insoluble. Cuantitativamente se transfirió el contenido de

las fiolas a sus respectivos crisoles (previamente mojados con etanol al 78% e identificados

como fibra insoluble). Una vez finalizada la filtración se lavó el residuo con 2 porciones de 10

ml de agua destilada. Se separó el filtrado (incluyendo las aguas de lavado), y se le añadieron

4 volúmenes de etanol al 95%. Se dejó en reposo a temperatura ambiente durante la noche

para permitir la completa precipitación de la fibra soluble. Se lavaron nuevamente los crisoles

que contienen el residuo insoluble, pero esta vez con 2 porciones de 10ml de acetona (el

filtrado de este lavado se desechó sin mezclarlo con el filtrado anterior). Los crisoles se

secaron en estufa de convección (105ºC) durante la noche para ser pesados al día siguiente;

este peso (crisol + celite + residuo insoluble), se denominó W2I. Transcurrido el tiempo para

la formación del precipitado de fibra soluble, se transfirió cuantitativamente la suspensión a

sus respectivos crisoles, esta vez identificados como fibra soluble, realizando el paso previo de

redistribución de la capa de celite con etanol al 78% como en la filtración anterior. Se lavó el

residuo con 3 porciones de 20 ml de etanol al 78%, luego con 2 porciones de etanol al 95%, y

finalmente con 2 porciones de 10 ml de acetona. Los crisoles se secaron con el residuo soluble

en estufa de convección (105ºC), durante la noche y al día siguiente se pesaron (crisol + celite

+ residuo soluble), obteniéndose W2S. El filtrado resultante de estos lavados se desechó.

Se determinó el contenido de proteínas de los residuos del blanco I y dos de los crisoles de la

muestra: uno de la fibra soluble y el otro de la insoluble. Se utilizó el método de Kjeldahl

(equipo digestor marca Büchi), y el factor de conversión 6,25N para el cálculo del contenido

proteico. Los residuos de los crisoles restantes (blanco II, y los otros dos crisoles de la muestra

con residuo de la fibra soluble e insoluble), se incineraron en la mufla a 525ºC por un tiempo

mínimo de 5 horas; el peso (crisol + celite + cenizas) fue registrado como W3I ó W3S según

fuese el caso.

Para realizar los cálculos se utilizaron las siguientes ecuaciones:

12 WWR SS −= ; 12 WWR II −= 1.2.Ec

50

13 WWC SS −= ; 13 WWC II −= 2.2.Ec

BlancoBlancoBlanco APRB −−= 3.2.Ec

100% ×

−−−

=PM

BCPRFS SSS ; 100% ×

−−−

=PM

BCPRFI III 4.2.Ec

FIFSFDT %%% += 5.2.Ec

Donde:

RS = Peso del residuo de fibra soluble (mg); RI = Peso del residuo de fibra insoluble (mg)

C = Peso de las cenizas de los residuos (mg). El subíndice S o I se refiere a si proviene del

residuo de la fibra soluble o insoluble respectivamente.

B = Corrección del blanco de muestra (mg).

RBlanco = Peso promedio del residuo de los blancos I y II (mg).

P = Cantidad promedio de proteínas contenidas en el residuo (mg). El subíndice S, I o Blanco

se refiere al origen del residuo (de la fibra soluble, insoluble, o del blanco, respectivamente).

A = Peso promedio de las cenizas de los blancos I y II (mg).

% FS = Porcentaje de Fibra Soluble de la muestra; % FI = Porcentaje de Fibra Insoluble de la

muestra.

PM = peso promedio de muestra (mg); promedio de los pesos de muestras del cuadriplicado.

% FDT = Porcentaje de Fibra Dietaria Total de la muestra.

a) Se determinó el peso del residuo de la fibra soluble (Ec. 2.1). Los subíndices “S” (Soluble)

o “I” (Insoluble) determinaron cuales datos utilizar en las ecuaciones, según provengan del

residuo de la fibra soluble o de la fibra insoluble.

b) Se determinó el peso de las cenizas del residuo de la fibra soluble (Ec. 2.2).

c) Utilizando las Ecs. 2.1 y 2.2, se repitieron los cálculos a y b para los residuos de la fibra

insoluble.

d) Se determinó la corrección del blanco de muestra (Ec. 2.3), utilizando el promedio de los

datos obtenidos de los blancos I y II.

e) Se calcularon los porcentajes de fibra soluble e insoluble (Ec. 2.4).

51

f) Por último se calculó el porcentaje de fibra dietaria total de la muestra (Ec. 2.5)

2.2.5. Propiedades físicas. 2.2.5.1. Actividad de agua (aw). Se utilizó el equipo AquaLab modelo CX-2 de la Decagón Devices Inc., que utiliza la

tecnología de “medición del punto de rocío por espejo-enfriado”.

2.2.5.2. Color. Se empleó el colorímetro HunterLab modelo Miniscan D-65 45/0 LAV, que reporta valores

según la escala de Color Hunter L, a y b, que permiten caracterizar a la muestra, ubicándola

dentro de las coordenadas que ilustra la Fig. 2.2. El parámetro L mide el nivel de luminosidad

desde el cero (0) o negro, hasta el cien (100) o blanco; los parámetros a y b, miden la

intensidad de los colores rojo (+) o verde (-), y amarillo (+) o azul (-), respectivamente.

Figura 2.2. Escala de color Hunter L, a, b. Fuente: HunterLab (2007).

52

2.2.6. Análisis químicos. 2.2.6.1. Perfil de ácidos grasos. Para la determinación del perfil de ácidos grasos de la linaza por cromatografía de gases se

preparó un extracto lipídico y su derivatización. La fracción lipídica de la muestra se obtuvo

por extracción con una mezcla de solventes cloroformo/metanol (Bligh y Dyer 1959), a

temperatura ambiente y en oscuridad, utilizando linaza recién molida. Para evitar posibles

cambios en los ácidos grasos, la evaporación del cloroformo se efectuó en estufa de

convección forzada a 30ºC, protegiendo en todo momento al extracto de la luz. El aceite

obtenido se colocó en viales ámbar, con inyección de nitrógeno para remover el oxígeno

presente en el espacio de cabeza. Los viales fueron almacenados en refrigeración (T≈10ºC)

hasta el momento del análisis cromatográfico. Para derivatizar el extracto lipídico se utilizó el

método descrito por Blau y Halket (1993) con algunas modificaciones, se pesaron entre 10 y

15 mg del extracto en un vial ámbar de reacción; se agregó 1 ml de solución de HCl 3N en

metanol, 250 ml de 2,2-dimetoxi-propano y 1 ml de hexano. Se selló el vial utilizando una

tapa con tamiz molecular que actúa como agente desecante (SUPELCO), y se colocó en un

baño de agua con agitación a 70ºC por 1h. Finalizado el tiempo, se agitó el vial y se dejó en

reposo por 10 min a temperatura ambiente para permitir la completa separación de las fases

(Sanabria y Sangronis 2007). Para determinar el perfil de ácidos grasos se tomó una alícuota

de 0,1 µl del espacio de cabeza del vial con la muestra derivatizada, utilizando una inyectadora

graduada de vidrio silanizado para gases (Gastight). La alícuota se inyectó en un cromatógrafo

de gases (GC System) marca HP modelo 6890 Series, bajo las siguientes condiciones:

Columna: SP-2380 (SUPELCO), de 30m de largo x 0,25 mm de diámetro interno.

Fase estacionaria: 0,20 µm film de Poli(90% bis/ 10% cianopropilfenil) xiloxano.

Fase móvil (carrier): Helio, a un flujo de 20 cm/seg, y una temperatura de 150ºC.

Presión de operación: 9,6 Psi

Detector: Ionizador de llama (FID) 250ºC. Flujo de H2: 35 ml/min.; Flujo de aire: 350

ml/min.; Flujo de Makeup: 45 ml/min.

Inyector: On-column.

53

Modo: Track oven, que implica que la temperatura de la columna va subiendo con la

temperatura del horno.

Tasa de variación de la temperatura del horno: 4 ºC/min desde los 50ºC hasta 250ºC;

10ºC/min hasta 260ºC.

Analisis de datos: Software HP ChemStation Plus Rev. A.06.03 1999.

Estándar utilizado para la determinación: Grain fatty Acid methyl ester mix (FAMG) marca

SUPELCO.

2.2.6.2. Mucílago. Se utilizó el método propuesto por Bhatty (1993), según el cual la extracción se realiza

añadiendo a la muestra agua hirviendo (T ≈ 98ºC), en una proporción semilla:agua igual a

1:20, y aplicando agitación magnética durante toda la noche, sin calentamiento adicional, lo

que implica que la temperatura del agua decrece durante la agitación hasta alcanzar la

temperatura ambiente. La agitación no debe ser muy fuerte para evitar la ruptura de la semilla

y la consiguiente extracción de las proteínas solubles del interior de la semilla. Posteriormente

se filtró el extracto utilizando lana de vidrio, procurando ejercer una leve fricción entre las

semillas para ayudar a despegar el mucílago que aun pudiera encontrarse adherido a la semilla.

La cuantificación del mucílago se realizó por gravimetría, previa evaporación del extracto en

cápsulas previamente taradas. Se utilizó una estufa de vacío (NAPCO) a 60ºC para evitar la

carbonización del mucílago.

2.2.6.3. Polifenoles totales. Se utilizó el método de Folin-Ciocalteu (Sánchez-Moreno et al. 1998, 1999a; Singleton et al.

1999). Como estándar para la determinación se utilizó ácido tánico (Sigma), a partir de una

solución madre con concentración 1mg/ml, utilizando agua destilada como solvente. Para

preparar el extracto se pesó 1g de muestra desgrasada (ver 2.2.4.2.) y tamizada a 80 msh, en

una fiola con tapa y se añadieron 40 ml de metanol en HCl 2N al 0.8% (Reactivo “A”, se

preparó añadiendo 8 ml de HCl 2N/ 1000 ml de solución metanol-agua 50%). La mezcla se

colocó en plancha con agitación magnética por 1h a temperatura ambiente para luego

centrifugarse a 3000 rpm durante 10 min. Se separó el sobrenadante por succión con una

54

pipeta y se recolectó en un matraz aforado de 100 ml. El extracto se mantuvo en la nevera y

protegido de la luz. Al residuo de la primera extracción, se añadieron 40 ml de solución

acetona-agua 70:30 (Reactivo “B”), y al igual que en la primera extracción se agitó por 1 h y

se centrifugó, se separó el sobrenadante en el mismo matraz donde se encontraba el primer

extracto, se enrasó con una mezcla 50:50 de HCl 2N al 0.8% en metanol:solución acetona-

agua 70:30; es decir, una mezcla 50:50 de los reactivos A y B. Los extractos se prepararon el

mismo día del análisis para evitar posibles subestimaciones en los resultados ocasionadas por

la degradación de los compuestos durante el almacenamiento. Se preparó la curva patrón a

partir de la solución madre de estándar, en un rango de 0,0 a 0,6 mg/ml. Se añadieron 0,5 ml

del extracto preparado o de la muestra líquida, en matraces de 25 ml, identificados, se

adicionaron 0,5 ml del reactivo de Folin-Ciocalteu (Fluka), se agitó en vortex y se dejó reposar

por 3 min. Posteriormente se añadieron 10 ml de solución saturada de Carbonato de Sodio

(35g/100 ml), se enrasó con agua destilada, se agitó bien y se dejó reposar por 60 min,

agitando periódicamente. Este mismo procedimiento se aplicó a cada punto de la curva patrón.

Para las muestras líquidas, la determinación comenzó a partir de la adición del reactivo de

Folin, sin necesidad de adicionar los reactivos A y B. Se leyó la absorbancia a 750 nm,

utilizando un equipo Spectronic Milton Roy modelo 21D. La concentración de polifenoles

totales en la muestra se determinó mediante regresión lineal de la curva patrón realizada.

2.2.6.4. Capacidad antioxidante. Se utilizó el método del radical DPPH* (2,2-difenil-1-picril-hidracil) (Sanchez-Moreno et al.

1998). Los extractos de las semillas se prepararon siguiendo la metodología empleada en la

determinación de polifenoles totales (2.2.6.3.). Las muestras líquidas se utilizaron sin

modificaciones físicas o químicas previas. La solución de DPPH (Sigma) utilizada para el

análisis (0,025 g/lt en metanol de alta pureza) se mantuvo en la nevera y a resguardo de la luz

mientras se inició el análisis y debió prepararse fresca cada vez que se realizó la metodología.

En la cubeta del espectrofotómetro se colocaron 3,9 ml de la solución metanólica de DPPH y

0,1 ml del extracto o de muestra líquida, se homogeneizó e inmediatamente se comenzó la

lectura de la absorbancia (λ = 515 nm), anotando también la lectura obtenida para el tiempo

55

cero, y a intervalos de 5 min hasta que se alcanzó el equilibrio. El espectrofotómetro utilizado

fue el Spectronic Milton Roy modelo 21D. Este ensayo se realizó por triplicado. Se debe

analizar la muestra líquida o extracto de muestra 4 veces, a diferentes concentraciones; en este

caso se utilizó la muestra sin diluir, y con diluciones 1:5, 1:8, y 1:10 en metanol. El parámetro

Eficiencia Antirradical (AE) se determinó mediante la ecuación 2.6:

5050

1

ECTECAE

⋅= 6.2.Ec

Donde:

EC50: Concentración de antioxidante necesario para disminuir la concentración inicial en 50%.

TEC50: tiempo necesario para alcanzar la EC50.

Los cálculos de los parámetros EC50 y TEC50 se realizaron con los programas Excel XP

(Microsoft) y StatGraphics Centurión (Statpoint Technologies Inc. 2006), aplicando regresión

simple a las curvas obtenidas de absorbancia vs concentración de DPPH, % remanente de

DPPH vs concentración de muestra, y tiempo de reacción vs concentración de muestra.

2.2.6.5. Ácido cianhídrico (HCN). Se utilizó el método propuesto por Bradbury et al. (1994) con algunas modificaciones. Para la

extracción ácida a partir de la muestra sólida se pesaron 2 g de muestra, se añadieron 40 ml de

H2SO4 0,1M, se colocaron en el desintegrador de tejidos (Polytron modelo PT3100), por 2-3

min, para luego centrifugar a 3500 rpm por 15 min y separar el extracto para su análisis. Se

colocaron 2 ml del extracto preparado (o de la muestra líquida) en un tubo de ensayo con tapa,

y 2 ml de H2SO4 4M, y se llevaron a un baño en ebullición (T ≈ 98ºC) por 50 min . Luego, sin

destapar el tubo, se dejó enfriar hasta temperatura ambiente. Una vez frío el contenido del

tubo, se añadieron 5 ml de NaOH 3,6M, se agitó suavemente y se dejó en reposo por 5-10 min,

para luego filtrar esta solución en caso necesario. Se preparó la solución patrón de la curva de

calibración, disolviendo 37,5 mg de KCN (previamente deshidratado en estufa de convección

por 2 h a 100ºC), en NaOH 0,2M enrasando a 500 ml. Esta solución patrón es estable por 2

meses si se almacena a temperaturas de al menos 4ºC. Para la curva de calibración, se

diluyeron cantidades de solución stock hasta 10 ml con NaOH 0,2M (ver Tabla 2.2.).

56

Tabla 2.2. Preparación de la curva patrón de cianuro de potasio (KCN).

Tubo ml de solución Stock de KCN

µg KCN / 10 ml de solución coloreada

Blanco 0 0

1 0,2 1,5

2 0,4 3

3 0,8 6

4 1,2 9

5 1,6 12

En tubos de ensayo debidamente identificados se añadieron 7 ml de buffer citrato (pH 5,0), 1,0

ml del extracto hidrolizado-alcalinizado o de la curva de calibración, y 0,4 ml de solución de

Cloramina-T al 0,5% (solución 0,5% p/v en agua destilada), se dejaron reposar a temperatura

ambiente por 5 min, y se añadió 1,6 ml de reactivo de König (preparado mediante la adición

de 40 ml de piridina a 1,0 g de ácido barbitúrico disuelto en agua destilada, y enrasado a 200

ml con agua destilada). Se agitaron los tubos de ensayo con el vortex, y se dejaron reposar a

temperatura ambiente por 60 min para el desarrollo del color. Se leyó la absorbancia en un

espectrofotómetro (Spectronic Milton Roy modelo 21D) a 583 nm, utilizando el tubo que no

contiene muestra ni patrón como blanco. A partir de la gráfica obtenida con los datos de la

absorbancia vs concentración, se determinó la cantidad [µg] de KCN presente en los 10 ml de

solución coloreada analizados (Y). Para calcular la cantidad equivalente de HCN presente en

la muestra analizada se utilizó la siguiente ecuación:

[ ]muestradekgmg

WVYHCN =

×= 86615,1 7.2.Ec

Donde:

Y = µg KCN/ 10 ml de solución coloreada.

V = volumen [ml] de ácido en los que se desintegra la muestra (40 ml).

W = peso de muestra [g] analizada.

57

2.2.7. Procesamientos caseros aplicados a la linaza. Se aplicaron seis de los procesamientos caseros más comunes empleados en nuestro país:

tostado; remojo de la semilla entera en agua caliente o fría; cocción; o remojo de la semilla

molida en agua caliente y fría (Fig. 2.3.). Los parámetros de los procesamientos se fijaron de

acuerdo a las condiciones generalmente utilizadas durante su preparación casera. Para la

molienda se utilizó un ayudante de cocina (Oster).

Figura 2.3. Procesamientos caseros aplicados a las semillas de linaza.

2.2.7.1. Tostado.

Se extendió la semilla entera de manera uniforme sobre una bandeja de metal, formando una

capa delgada, y se colocó en una estufa de convección (Marca Memmert) precalentada a

180ºC, por un espacio de 25 min.

2.2.7.2. Cocción.

Se cocinaron las semillas enteras en agua destilada por 5 min, contados a partir del momento

en que se inició la ebullición. Se utilizó una proporción semilla/agua (p/v) = 1/8. Una vez

concluida la cocción, se procedió al filtrado de la mezcla (utilizando un colador casero), para

separar ambas partes para su posterior análisis.

Tostado Remojo Cocción

Remojo SSeemmiillllaa mmoolliiddaa

SSeemmiillllaa eenntteerraa

Agua Fría Agua Caliente

Agua Fría Agua Caliente

58

2.2.7.3. Remojo. Se realizaron en total 4 condiciones diferentes de remojo, para lo cual se combinaron los dos

factores considerados: la condición de las semillas (enteras o molidas), y la temperatura del

agua de remojo (en caliente, adicionando agua destilada en ebullición ≈ 98ºC, y en frío usando

agua destilada, a temperatura ambiente ≈ 25ºC). Se utilizó las misma proporción semilla/agua

que para la cocción (1/8 p/v). Las semillas de linaza se dejaron en remojo durante la noche (≈

12 h). Finalizado el tiempo de remojo, se filtraron las muestras a fin de separar el agua y las

semillas para su posterior análisis individual. Para la semilla entera se utilizó un colador

casero, mientras que en el caso de las semillas molidas, el filtrado se realizó utilizando un

colador tradicional de café (de tela).

2.2.8. Diseño experimental aplicado a los procesamientos. Con la finalidad de evaluar si existe o no, una influencia estadísticamente significativa del tipo

de linaza y de los procesamientos caseros utilizados sobre ciertos constituyentes, tanto en la

semilla como en el extracto, se aplicó un diseño experimental bifactorial (2 x 6)

completamente aleatorio (Box et al. 2006), formulando las siguientes hipótesis de trabajo:

H0: La media de los constituyentes analizados no varía significativamente con el tipo de

semilla ni con los tratamientos aplicados.

H1: Al menos uno de los tratamientos o de los tipos se semilla ocasiona variación

significativa en los constituyentes analizados.

El diseño experimental se analizó utilizando el paquete estadístico Statgraphics Plus 5.1

(StatPoint Technologies, Inc. 2001). La hoja de trabajo generada por este software se presenta

en el Anexo 1.

59

2.2.9. Análisis estadístico de los resultados. 2.2.9.1. Prueba t de dos muestras independientes. Para comparar los resultados experimentales obtenidos de ambas muestras de linaza

analizadas y determinar si existen diferencias estadísticamente significativas entre la

composición de la semilla nacional y la importada, se plantearon las siguientes hipótesis de

trabajo:

H0: La composición de la linaza nacional es igual a la de la linaza importada analizada

(µ1 = µ2).

H1: La composición de la linaza nacional difiere significativamente de la composición de

la linaza importada analizada (µ1 ≠ µ2).

El número de réplicas realizadas para cada uno de los análisis se fijó en 5, de tal manera que

en la curva característica de operación de la prueba t de dos lados, en un nivel de significación

α = 0,05 y utilizando un parámetro establecido para d = 2,0, el error tipo II (β o probabilidad

de aceptación de H0 siendo falsa) sea aproximadamente igual a 0,1 (Box et al. 2006). Se

analizaron los resultados individuales en base seca de los quintuplicados de cada uno de los

análisis, utilizando el paquete estadístico Minitab 15 (Minitab Inc. 2009), con α = 0,05,

previa determinación de la normalidad de los datos utilizando la prueba de Anderson-Darling

y la homogeneidad de varianza mediante el valor de F o del estadístico de Levene según sea el

caso determinado por la normalidad (Box et al. 2006).

2.2.9.2. ANOVA Multifactorial. Para analizar los resultados obtenidos en el diseño experimental realizado (ver 2.2.8.), se

aplicó un análisis de varianza ANOVA multifactorial (2 vías) utilizando el paquete estadístico

Statgraphics Centurión XV versión 15.1.02 (StatPoint, Inc. 2006), con α = 0,05 y utilizando

la prueba de rangos múltiples de Duncan como análisis Post-Hoc. La interacción significativa

entre los factores fue evaluada con un análisis unifactorial o ANOVA de una vía, previa

60

transformación de los datos y comprobación de la homogeneidad de varianza utilizando la

prueba de Barlett (Box et al. 2006).

CAPÍTULO III

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1. Análisis microbiológico. En la Tabla 3.1. se presentan los resultados del análisis microbiológico de las muestras de

linaza estudiadas. El análisis microbiológico de la linaza nacional (primera cosecha), reveló

una elevada carga microbiana, particularmente de microorganismos esporulados tanto aerobios

como anaerobios.

Tabla 3.1. Resultado del análisis microbiológico para la materia prima criolla e importada.

Microorganismo Linaza

Importada Linaza Nacional

Cosecha I Cosecha II

Coliformes Totales (NMP/g) < 3 150 43

Coliformes Fecales (NMP/g) < 3 < 3 < 3

Mohos (ufc/g) 3,0×10 Est.* 8,0×103 2,0×102

Levaduras (ufc/g) < 10 Est.** 3,0×102 3,0×10 Est.

S. aureus (ufc/g) < 10 < 10 < 10

Esporulados aerobios (ufc/g) < 10 Est. 6,0×105 < 102 Est.

B. cereus (ufc/g) < 10 < 10 < 10

Esporulados anaerobios totales (ufc/g)

< 10 Est. 6,0×104 2,0×102

C. perfringens (ufc/g) < 10 Est. < 10 Est. < 10 Est.

*Est.: “estimado”. **< 10 Est.: implica que no se detectaron colonias en la dilución más baja sembrada.

62

El análisis microscópico de las colonias encontradas permitió determinar que la muestra

analizada contenía 3 cepas morfológicamente diferenciadas de microorganismos esporulados

aerobios (Fig. 3.1.), una de ellas capaz de crecer también en condiciones anaerobias. Dos

cepas resultaron ser Gram positivas (incluyendo la cepa anaerobia facultativa), y la otra Gram

negativa.

Figura 3.1. Colonias de microorganismos formadores de esporas en Agar Dextrosa Peptona de

Caseína.

Morfológicamente, el B. cereus es un bacilo corto con extremos poco redondeados, Gram

positivo, formador de espora elipsoidal central o subterminal, no deformante, de paredes

delgadas, y puede encontrarse formando cadenas cortas o largas; por su parte, el C.

perfringens es un bacilo corto, grueso, Gram positivo, no motil, con esporas en posición

central o extracéntrica, nitrato reductor, capaz de fermentar la lactosa y producir licuefacción

de la gelatina (COVENIN 1993a, 1993b; Merck 1994; Adams y Moss 2000).

Las pruebas para C. perfringens y B. cereus resultaron ser negativas. Estos dos

microorganismos esporulados son comunes en el suelo, y sus esporas son altamente resistentes

al calor. La espora de B. cereus es capaz de tolerar condiciones de baja aw como la de los

alimentos deshidratados, por lo que puede permanecer en estado latente por largos periodos de

tiempo (Merck 1994; Adams y Moss 2000).

63

La cosecha manual de la linaza, las condiciones de secado solar rudimentario utilizadas, y el

pequeño tamaño de la planta pueden generar contactos con el suelo, lo cual justifica la elevada

carga microbiana de la primera cosecha de materia prima nacional. Asimismo, la carga de

mohos de esta cosecha sugiere un inadecuado proceso de secado, que aunado a malas

condiciones de almacenamiento permitieron la proliferación de hongos (Adams y Moss 2000).

La elevada carga de microorganismos esporulados de esta cosecha de materia prima nacional,

de los cuales se desconocen mayores características, así como el hecho de que los

procedimientos caseros a los cuales sería sometida la muestra no eran lo suficientemente

efectivos en disminuir la carga microbiana presente, y los tiempos de remojo podrían permitir

que estos esporulados salieran de su etapa de latencia, condujeron a la decisión de descartar

este lote y adquirir una muestra de una nueva cosecha para la siguiente etapa del estudio.

La segunda cosecha nacional adquirida presentó menor carga microbiana que la anterior,

particularmente de mohos, levaduras, y esporulados aerobios y anaerobios (Tabla 3.1.). En

este caso se encontró solo una cepa Gram positiva, en ambas condiciones de incubación

(aeróbica y anaeróbica), cuyas características morfológicas coinciden con la cepa facultativa

detectada en el primer lote evaluado, por lo que podría suponerse que se trata del mismo

esporulado. Para confirmar esta suposición se requieren estudios adicionales no previstos en el

presente trabajo. La disminución en la carga microbiana de esta cosecha fue resultado de la

mejora en las condiciones de recolección, secado y almacenamiento de la semilla,

recomendaciones dadas al productor en base a los resultados de la primera cosecha.

La calidad microbiológica obtenida para la linaza importada, al contrario de la nacional, esta

acorde con lo esperado para una oleaginosa que ha sido cosechada mecánicamente, sometida a

un correcto proceso de secado, correctamente manipulada, almacenada, y comercializada a

nivel mundial. Adicionalmente, su aw inhibe el crecimiento bacteriano y el de la mayoría de

las especies de mohos, lo cual ayuda a conservar su buena calidad microbiológica.

64

La microbiología de alimentos como cereales, leguminosas y oleaginosas esta dominada

principalmente por los mohos durante su cosecha y almacenamiento. Muchos de estos

alimentos, entre ellos la linaza, son usualmente sometidos a un proceso de secado luego de su

cosecha y antes del almacenamiento, con la finalidad de disminuir su aw y restringir así la

presencia microbiana a mohos xerofílicos y/o xerotolerantes. Cuando este proceso de secado

es inadecuado o ineficiente, y las condiciones de almacenamiento permiten un incremento de

la humedad de las semillas, además del grave problema que supone una posible generación de

metabolitos microbianos tóxicos como las aflatoxinas en oleaginosas contaminadas, se

favorece la acción de algunas especies de mohos como los Aspergillus níger y A. tamarii, los

Penicillium, Rhizopus y los Paecilomyces. Estos microorganismos poseen una fuerte actividad

lipolítica que conduce a la formación de ácidos grasos libres, contribuyendo con la oxidación

lipídica y produciendo rancidez. Varios autores señalan que la humedad y la presencia de

semillas rotas durante el almacenamiento favorecen considerablemente la producción de

ácidos grasos libres, reduciendo su vida útil (Potter y Hotchkiss 1999; Adams y Moss 2000).

El procesado de las leguminosas y oleaginosas mediante calor, cocción, extracción con

solventes, etc., elimina, o al menos disminuye en gran parte, su carga microbiana y reduce,

aunque no en todos los casos, los niveles de metabolitos tóxicos presentes (Potter y Hotchkiss

1999). A diferencia de otras semillas, la linaza es consumida principalmente cruda, sometida a

tratamientos con calor leve, o remojada en agua u otros líquidos por algunas horas, por lo cual

es importante controlar su calidad microbiológica para evitar la contaminación con

microorganismos patógenos esporulados, así como también la generación de micotoxinas, que

pudieran ocasionar enfermedades o malestar al consumidor.

3.2. Propiedades físicas de la linaza: aw y color instrumental. La actividad de agua (aw) de las semillas de linaza se muestra en la Tabla 3.2. Se observó que

la linaza nacional tiene mayor aw, lo cual en la semilla entera permite tanto el crecimiento de

algunas especies de hongos como la autooxidación lipídica, por lo tanto es necesario tomar

precauciones para evitar su contaminación durante la cosecha y el secado, así como su

exposición a factores prooxidantes y así garantizar su conservación durante el almacenamiento

65

(Reid y Fennema 2008). En términos generales, las oleaginosas tienen menor aw que los

cereales al mismo porcentaje de humedad, aproximadamente 0,65-0,70 a 25ºC y 7% de agua;

esto se debe en parte a las diferencias en la intensidad con la cual el agua está asociada a los

diferentes solutos que componen la matriz del alimento (Adams y Moss 2000; Reid y

Fennema 2008). En el Anexo 2 se presentan los resultados de los análisis estadísticos

realizados.

Tabla 3.2. Actividad de agua (aw) de las semillas de linaza nacional e importada.

Semilla Importada Semilla Nacional

aw ( T °C) aw ( T °C)

Entera 0,705 ± 0,003 (26,2 ± 0,4) 0,763 ± 0,015 (26,2 ± 0,1)

Molida 0,717 ± 0,002 (23,9 ± 0,2) 0,867 ± 0,003 (28,4 ± 0.3)

Tostada 0,311 ± 0,003 (28,4 ± 0,3) 0,387 ± 0,006 (27,3 ± 0,2)

Se reportan medias y desviación estándar de triplicados.

Se observó que la molienda incrementó la aw hasta en un 12%, lo que en el caso particular de

la semilla nacional, permite un mayor crecimiento microbiano; adicionalmente, este aumento

de la aw trae consigo un incremento en la tasa de autooxidación lipídica y de actividad

enzimática (Reid y Fennema 2008), ambas de gran importancia para la vida útil de la semilla

molida, pues se incrementa también la velocidad de oxidación de los ácidos grasos insaturados

y la producción de HCN por parte de enzimas β-glucosidasas. Por el contrario, el tostado

disminuyó la aw en mas del 55% en la semilla nacional y en un 49% en la semilla importada

(Tabla 3.2.), llevando en ambos casos la aw hasta la zona de mínima perooxidación lipídica

que ocurre para un aw entre 0,3 y 0,4 (Belitz y Grosch 1997), ello hace el tostado un método

factible para reducir la autooxidación de los lípidos durante el almacenamiento y prolongar así

la vida útil de la semilla. La actividad enzimática también se ve reducida a baja aw, lo cual

retarda la producción de HCN.

Los resultados obtenidos para el color instrumental de la linaza se muestran en la Tabla 3.3. Se

observan diferencias significativas entre los parámetros de las dos variedades de semillas; el

66

parámetro L es mayor en la semilla nacional, debido a que su color es mas claro que el de la

variedad importada. Para los parámetros a y b, se obtuvieron coordenadas positivas, lo que

indica la presencia de tonalidades rojas y amarillas, respectivamente, con mayor intensidad en

la semilla nacional.

Tabla 3.3. Color instrumental de la linaza nacional e importada.

Semilla L

Parámetro a

b

Importada 40,47 ± 0,09a 4,68 ± 0,03 a 4,83 ± 0,05 a

Nacional 52,20 ± 0,02b 5,35 ± 0,03 b 7,98 ± 0,03b

Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las variedades de linaza analizadas.

El color dorado/amarillo claro de la linaza esta dado por un gen recesivo asociado a una

cáscara de menor espesor en comparación con el de la semilla pardo-rojiza, cuyo color se debe

al gen dominante. No se han reportado estudios que correlacionen el color de la semilla con la

presencia de compuestos polifenólicos, como ocurre en otros alimentos de origen vegetal. El

color de la semilla ha sido mas relacionado con la presencia de mayor o menor cantidad de

ácido α-linolénico (ALA). Generalmente, las semillas de color amarillo/dorado contienen

menos de 5% de ALA, mientras que por el contrario, las semillas de color pardo-rojizo tienen

cantidades de ALA que superan el 20% (Daun et al. 2003). La semilla nacional analizada, aún

cuando es de variedad dorada, contiene un elevado porcentaje de ALA como se discutirá mas

adelante.

3.3. Composición de la semilla. En la Tabla 3.4. se presentan los resultados obtenidos para el análisis proximal de las

variedades de linaza nacional e importada. Los principales constituyentes de las semillas son

las grasas y la fibra dietaria, aun cuando también posee un considerable contenido de

proteínas. Los valores de ambas especies se encuentran dentro de los rangos reportados por

diferentes estudios previos para la variedad Norman (Oomah 2001; Flax Council of Canada

67

2002b; Daun et al. 2003; Morris 2007); Se observan diferencias significativas (p ≤ 0,05) entre

la composición de la semilla nacional y la importada, con excepción del contenido de fibra

dietaria total.

Tabla 3.4. Composición proximal de las semillas de linaza importada y nacional.

Componente* (g/100g SS)

Semilla Importada

Semilla Nacional

Proteínas (%N × 6,25)

21,47 ± 0.09a 22,31 ± 0,18b

Grasas 43,46 ± 0,33 a 40,66 ± 0,26 b

Cenizas 3,27 ± 0,01 a 3,22 ± 0,02 b

Fibra Dietaria Total 31,97 ± 0,83a 33,54 ± 0,92a

Humedad (g/100g) 5,37 ± 0,03 8,42 ± 0,10

*Se reportan medias y desviación estándar expresadas en base seca. SS: sólidos secos. Letras diferentes en el mismo componente indican diferencias estadísticamente significativas entre las variedades de linaza analizadas.

El contenido de grasas de la semilla importada es mayor que el de la semilla nacional, y esta a

su vez contiene más proteínas que la semilla importada. Daun et al. (2003) reseñan que en

diversos estudios se ha observado que mientras menor sea la temperatura del sitio donde se

cultiva la linaza, menor es el porcentaje de proteínas de la semilla y mayor es el porcentaje de

grasa. Esto indica lógicamente que la temperatura promedio a la que fue cultivada la semilla

canadiense es más baja que la temperatura de cultivo de la semilla nacional. Morris (2007) en

su comparación del análisis proximal de 2 variedades de semillas, una de color pardo-rojiza y

otra amarilla, reporta que esta última tiene mayor porcentaje de proteínas y menor contenido

de grasa que la primera, tal y como ocurre con la semilla nacional analizada. La variabilidad

en la concentración de proteínas en la linaza, ha sido atribuida a factores genéticos y

medioambientales, y no es superior al 6% (Oomah y Mazza 1998).

Los valores de grasa reportados por el Flax Council de Canadá (Daun et al. 2003; Morris

2007), provienen de la determinación por el método oficial AOCS Am 2-93, que consiste en

68

una modificación de la extracción tradicional para las oleaginosas en equipo Soxhlet con

solvente (COVENIN 1981a), en la cual el proceso de extracción se realiza en dos etapas

previo secado de la muestra a 130ºC (AOCS 1998b). Sin embargo, durante los análisis

preliminares se observó que la totalidad de la grasa se extrajo durante la primera etapa de 4h,

y adicionalmente, que la molienda de la muestra desgrasada entre las dos etapas supone una

pérdida considerable de la misma. El uso de muestra desgrasada para los análisis ha sido

reseñada como crucial por Johnson (2004), para obtener repetitividad en los resultados.

Daun et al. (2003) hace uso del término proteína verdadera (N x 4,9) que sustrae de la proteína

cruda el nitrógeno no proteico que contiene la linaza proveniente de los glucósidos

cianógenos, y de compuestos como la colina y la sinapina. La proteína verdadera es 17,80%

para la semilla importada y 17,39% para la semilla nacional. El contenido de cenizas es mayor

en la semilla importada que en la semilla nacional. Morris (2007) reporta un contenido de

cenizas de 3,4% en linaza canadiense.

No se encontraron diferencias significativas entre el contenido de fibra dietaria de ambas

variedades de linaza (Tabla 3.4.). Existe limitada información sobre la variación de la fibra

dietaria entre variedades y cultivos de linaza, ya que no es un componente tan estudiado como

la grasa o la proteína, debido principalmente a lo largo y tedioso que resulta su análisis; Los

valores reportados dan cuenta de hasta un 10% de variación entre cultivos. Oomah y Mazza

(1998) reportan una correlación negativa entre el contenido de fibra y de grasa de las semillas,

así como una relación entre el contenido de fibra y el color de la semilla, señalando que las

semillas de variedad dorada tienen menor contenido de fibra que las variedades pardo-rojizas.

En la Tabla 3.5. se presenta la composición de la fibra dietaria de la linaza analizada y su

contenido de mucílago. Para la fibra soluble e insoluble no se observaron diferencias

estadísticamente significativas entre la linaza nacional y la importada. Adicionalmente, se

observa que la relación fibra soluble/insoluble es cercana a 1, lo cual refleja un aporte de

cantidades similares de ambos tipos de fibra. Morris (2007) señala que los principales

constituyentes de la fibra en la linaza son la celulosa, el mucílago y la lignina. El contenido de

69

fibra insoluble de la linaza es comparable al reportado para cereales como el maíz blanco y

amarillo (17,1 g/100g), y para el acaí (E. oleracea Mart 18,0 g/100g) (INN, 1999; Sanabria

2006).

Tabla 3.5. Fibra dietaria de las semillas de linaza importada y nacional.

(g/100g SS) * Semilla

Importada Semilla

Nacional Fibra Insoluble 16,38 ± 0,89a 17,21 ± 0,14 a

Fibra Soluble 15,59 ± 0,18 a 16,27 ± 1,05 a

Mucílago 24,38 ± 0,65a 20,99 ± 0,72b *Se reportan medias y desviación estándar de triplicados expresados en base seca (SS) para la fibra, y de quintuplicados en base seca (SS) para el mucílago. Letras iguales indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre las variedades de linaza analizadas.

Se determinaron diferencias significativas entre el contenido de mucílago de ambos tipos de

semilla, siendo mayor el aporte en la semilla importada. El resultado se corresponde con lo

reseñado por Oomah y Mazza (1998) quienes señalan que las semillas doradas tienen un

menor contenido de mucílago que las semillas pardo-rojizas, pero con mejores propiedades

reológicas. Por otra parte, se observan diferencias entre los contenidos de mucílago y de fibra

soluble; la sobrestimación en el contenido de mucílago se debe posiblemente al método

utilizado para su determinación. Es posible que durante la agitación prolongada de las semillas

por varias horas como indica la metodología de obtención de mucílago, puedan ocurrir daños

en la estructura de la misma debido al roce y a la acción erosiva del agua, provocando la

solubilización de otros componentes que se cuantifican como mucílago.

En la Tabla 3.6. se presenta el contenido de minerales obtenido para la linaza importada y

nacional analizada; potasio, fósforo, magnesio y calcio son los principales componentes

minerales que aportan las semillas. Se observan diferencias significativas entre los contenidos

de hierro, fosforo, zinc, cobre y manganeso de ambas variedades de linaza. Con excepción del

cobre, el aporte de dichos minerales es menor en la semilla importada. Los valores se

corresponden con los reportados por Morris (2007) con excepción del potasio y fósforo, cuyos

valores reportados son 831 y 622 mg/100g, respectivamente. El aporte de magnesio de una

70

cucharada de linaza molida es similar al de una ración (250 ml) de yogurt descremado con

frutas o a la mitad de una pechuga de pollo (140g), mientras que el aporte de potasio es

análogo al de un huevo cocido (Morris 2007).

Tabla 3.6. Contenido de minerales de la linaza importada y nacional.

Minerales * (mg/ 100g SS)

Semilla Importada

Semilla Nacional

Sodio 56 ± 3 a 50 ± 9 a

Potasio 2222 ± 13 a 2227 ± 26 a

Magnesio 391 ± 7 a 384 ± 9 a

Calcio 239 ± 4 a 240 ± 2 a

Hierro 12,4 ± 1.6 a 15,8 ± 1.2 b

Fósforo 491 ± 1 a 524 ± 1 b

(mg/kg SS)

Zinc 72,9 ± 4,2 a 82,9 ± 3,7 b

Cromo 3,2 ± 0,9 a 2,3 ± 0,6 a

Cobre 12,5 ± 1,7 a 9,1 ± 0,8 b

Manganeso 31,6 ± 0,3 a 38,5 ± 0,8 b

Selenio 0,262 ± 0,004 a 0,258 ± 0,005 a *Se reportan medias y desviación estándar expresadas en base seca (SS). Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las variedades de linaza analizadas.

La Tabla 3.7. presenta el perfil de ácidos grasos de las semillas de linaza analizadas. No se

observan diferencias significativas entre el contenido de ácidos grasos de ambas variedades de

semillas, con excepción del acido palmítico cuyo aporte es mayor en la semilla importada. Es

notable el elevado aporte de ácido α-linolénico (ALA), que supera el 60% del total de ácidos

grasos de la semilla, haciendo de ella, una de las principales fuentes de este ácido graso

esencial omega-3 de origen vegetal. Los valores reportados en estudios previos para la linaza

canadiense dan cuenta de 57% de ALA, 18% de ácido oleico y 9% de ácidos grasos saturados

(Morris 2007). Choo et al. (2007) obtuvieron para el aceite de linaza cosechada en Nueva

Zelanda cantidades de 51,80 a 60,42% de ALA, hasta 22,21% de acido oleico y valores

71

superiores al 9% de ácidos grasos saturados. Se observa que las muestras analizadas poseen

una mayor cantidad de ALA y menor cantidad de acido oleico que las reportadas en los

mencionados estudios; un comportamiento similar fue obtenido por Choo et al. (2007) quienes

reportan que los incrementos del porcentaje de ALA en el aceite de linaza van en detrimento

del contenido de acido oleico. Los niveles de insaturación se ven afectados por la variedad de

la semilla y las condiciones climáticas del cultivo; en climas fríos los niveles de insaturación

son más altos (Daun et al. 2003).

Tabla 3.7. Perfil de ácidos grasos de las semillas de linaza importada y nacional.

Acido graso (g/100g aceite)

Semilla Importada

Semilla Nacional

Palmítico 16:0 5,04 a 4,65 b

Esteárico 18:0 2,86 a 2,75 a

Oleico 18:1 (9) 14,0 a 14,2 a

Linoleico 18:2 (9, 12) 16,5 a 16,5 a

α-linolénico 18:3 (9, 12, 15) 61,6 a 61,9 a

Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las variedades de linaza analizadas.

Las cantidades obtenidas de ácidos palmítico y esteárico se corresponden con los señalados

por Daun et al. (2003). En el perfil obtenido para ambas variedades de linaza se observa que el

aporte de ácidos grasos saturados es menor al 8%, siendo junto con el aceite de canola, los

aceites vegetales con menos aporte de estos ácidos grasos. En las Figuras 3.2. y 3.3. se

presentan los cromatogramas obtenidos para la semilla importada y nacional, respectivamente,

los cuales son comparables a lo reportado por Daun et al. (2003). Aún cuando el nivel de

insaturación de los ácidos grasos en el aceite de linaza es muy alto, lo cual es una limitante

para su vida útil, estudios demuestran que no hay cambios significativos en la concentración

de ALA de la semilla durante 44 semanas, almacenadas a 22°C, ni tampoco se afectan por el

tostado a 100°C ó 176°C hasta por una hora (Ratnayake et al. 1992). Mantener la semilla en

refrigeración y protegida de la luz y el aire prolonga su vida útil (Morris 2007).

72

Figura 3.2. Cromatograma de ácidos grasos de la linaza importada.

min20 25 30 35 40 45 50 55

pA

0

100

200

300

400

500

600

700

FID1 B, (LINAZA1.D)

27.

881

32.

810

- C

16:0

pal

míti

co

33.

882

- C

16:1

n9c

palm

itolé

ico

36.

465

- C

18:0

est

eáric

o

37.

378

- C

18:1

n9t e

laid

ico

37.

474

- C

18:1

n9c

olei

co

38.

466

38.

808

- C

18:2

n6c

linol

eico

39.

544

39.

924

- C

20:0

ara

quíd

ico

40.

562

- C

18:3

n3c

alfa

lino

léni

co

42.

858

- C

22:0

beh

énic

o 4

3.46

5 -

C22

:1n9

erú

cico

49.

980

50.

942

51.

378

73

Figura 3.3. Cromatograma de ácidos grasos de la linaza nacional.

min20 25 30 35 40 45 50 55

pA

0

100

200

300

400

500

600

700

FID1 B, (LINAZA4.D)

32.

821

- C

16:0

pal

míti

co

36.

473

- C

18:0

est

eáric

o

37.

384

- C

18:1

n9c

olei

co

38.

814

- C

18:2

n6c

linol

eico

39.

841

- C

20:1

cis

-11

eico

seno

ico

39.

940

- C

20:0

ara

quíd

ico

40.

554

- C

18:3

n3c

alfa

lino

léni

co

43.

487

- C

22:1

n9 e

rúci

co

50.

002

74

La Tabla 3.8. muestra los contenidos de acido cianhídrico (HCN) equivalente y de polifenoles

totales en la linaza importada y nacional. No se observaron diferencias significativas (p >

0,05) en el contenido equivalente de HCN de ambas variedades de semillas. La concentración

de HCN obtenida es comparable con el valor reportado en estudios previos por Yamashita et

al. (2007) para la linaza canadiense (40 mg/ 100g). Daun et al. (2003) indica que la cantidad

de HCN equivalente al contenido de glucósidos cianógenos en la semilla es de 19-100

mg/100g de linaza. Por su parte, Chadha (1995) reporta un rango de concentración entre 12,4

y 19,6 mg/100 g, pero en su estudio solo analizó el cianuro generado mediante autolisis

utilizando las enzimas endógenas del alimento lo cual, según Bradbury et al. (1994), no

garantiza la completa transformación de todos los glucósidos presentes en el alimento, por lo

que este valor de HCN pudiera considerarse subestimado. El contenido de glucósidos

cianógenos en la semilla es bajo y considerando el tamaño de ración de linaza usualmente

consumida en la alimentación humana, el HCN que puede metabolizarse a partir de ellos no es

suficiente para producir intoxicaciones en una persona sana. En el caso de la alimentación

animal, los tamaños de raciones son mucho mayores, por lo que debe revisarse la capacidad

máxima de detoxificación de tiocianatos de cada animal.

Tabla 3.8. Contenido de ácido cianhídrico (HCN) equivalente y polifenoles en linaza importada y nacional.

Semilla Importada Semilla Nacional

HCN

mg /100g SS 39,38 ± 2,14 a 37,62 ± 0,80 a

Polifenoles

mg*/100g SS 1435,01 ± 57,15 a 1655,00 ± 45,26 b

Se reportan medias y desviación estándar expresadas en base seca. *Expresados como mg equivalentes de ácido tánico. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las variedades de linaza analizadas.

El contenido de HCN ha sido denominado “equivalente” pues la linaza no posee naturalmente

este compuesto, sino que contiene glucósidos cianógenos, que son degradados a HCN por

hidrólisis ácida o enzimática. Mediante la metodología experimental, los glucósidos presentes

se transforman en su totalidad a HCN cuya concentración puede determinarse fácilmente

75

(Bradbury et al. 1994). El análisis de cianógenos normalmente involucra 3 etapas: (1) la

extracción de la matriz del alimento, (2) la hidrólisis a cianuros y, (3) el análisis del cianuro.

Antes de analizar las muestras de linaza, la metodología se estandarizó utilizando yuca

amarga, obteniéndose una concentración de 114,20 ± 3,27 mg de HCN/Kg de yuca. Barceloux

(2009) señala que la yuca generalmente contiene cantidades de HCN menores a los 100

mg/Kg, pero existen variedades amargas cuya concentración de HCN puede llegar hasta los

500 mg/Kg.

Se detectaron diferencias significativas (p ≤ 0,05) en el contenido de polifenoles totales de la

semilla (Tabla 3.8.), cuyo aporte es mayor en la semilla nacional. Valavanidis et al. (2009)

reporta que la concentración de compuestos polifenólicos en las plantas se ve

considerablemente influenciado por la variedad, el tipo de suelo, la etapa de crecimiento y las

condiciones ambientales, especialmente la incidencia de la luz. La semilla importada tiene un

contenido de polifenoles comparable al del pericarpio de mamón (M. bijugatus 1,40 g/100g), y

un poco mayor que el del repollo (B. oleracea 1,107 g/100g), mientras el de la semilla

nacional es similar al del Acaí (1,70 g/100g) y al del kiwi (A. chinensis 1,77 g/100g), y

ligeramente mayor que el de las semillas de girasol (1,601 g/100g) (Velioglu et al. 1998; Imeh

y Khokhar 2002; Ismail et al. 2004; Sanabria y Sangronis 2005; Padilla et al. 2008). Debido a

una variedad de metodologías, los reportes sobre el contenido de polifenoles de la linaza son

diversos. Velioglu et al. (1998) reportaron para la linaza variedad NorMan un contenido de

polifenoles de 509 mg/100g y de 473 mg/100g para una variedad solin (Linola 947). Johnsson

(2004) señala que utilizando la hidrólisis alcalina se liberan 730 mg de ácidos fenólicos/Kg de

linaza desgrasada, siendo los principales los ácidos trans-ferúlico y trans-sinápico; igualmente

dichos autores reportan que mediante la extracción con metanol se obtienen 320 mg de ácidos

fenólicos/Kg de linaza desgrasada. Por su parte Strandås et al. (2008) mediante hidrólisis

alcalina y HPLC determinaron niveles de secoisolariciresinol diglucósido (SDG) de 2,25

g/100g de linaza desgrasada, y también los ácidos p-coumárico y ferúlico glucósido en

cantidades de 0,54 y 0,28 g/100g de linaza desgrasada, respectivamente. Valavanidis et al.

(2009) señala que las concentraciones de polifenoles totales obtenidas por el método de Folin-

Ciocalteu son generalmente menores a las obtenidas por HPLC.

76

Con fines comparativos se utilizó el método propuesto por Singleton y Rossi (1965) cuyo

proceso de extracción de 3 etapas permite obtener 3 fracciones claramente diferenciadas de

polifenoles: (I) ácidos fenólicos y aldehídos, (II) esteres y polisacáridos, y (III) glicósidos

fenólicos y taninos. La linaza importada contiene cantidades similares de las fracciones I y II

(1172,06 y 1113,36 mg/100g de linaza desgrasada, respectivamente). Por su parte, la semilla

nacional aporta predominantemente polifenoles de la fracción II (1332,21 mg/100g de linaza

desgrasada). El aporte de glicósidos fenólicos y taninos es considerablemente menor para

ambos tipo de semilla, siendo de 252,79 mg/100g para la semilla importada y de 365,85

mg/100g para la semilla nacional. La proporción determinada coincide con las observaciones

de Johnsson (2004), quien reporta que la mayor proporción de ácidos fenólicos en la linaza y

otras oleaginosas son de tipo enlace ester. Oomah et al. (1995) reporta que la linaza posee un

contenido de ácidos fenólicos entre 0,8 y 1,3 g/100g de linaza, de los cuales 0,3-0,5 g/100g

están en sus forma eterificada y el resto en forma esterificada.

En la Tabla 3.9. se muestran los resultados obtenidos para la capacidad antioxidante de la

linaza importada y nacional, expresada mediante los parámetros EC50 (concentración de

muestra necesaria para disminuir la concentración inicial del sustrato al 50%), TEC50 (tiempo

necesario para alcanzar el estado estacionario a la EC50), y Eficiencia Antiradical (EA). Se

detectaron diferencias significativas entre la EC50 y la EA de ambas variedades de semillas.

Tabla 3.9. Capacidad antioxidante en linaza importada y nacional.

Semilla EC50 (g de SS / g de DPPH·)

TEC50 (min) EA (×10-3)

Importada 3,8790 ± 0,2763 a 115,21 ± 11,53 a 2,253 ± 0,165 a

Nacional 6,5714 ± 0,1203 b 112, 14 ± 0,55 a 1,357 ± 0,027 b

Se reportan medias y desviación estándar de triplicados, expresados en base seca. Letras diferentes indican que existen diferencias estadísticamente significativas entre las dos variedades de linaza analizadas.

La EC50 es un parámetro ampliamente utilizado para evaluar la capacidad antioxidante; a

menor EC50 mayor es el poder antioxidante de una muestra. Frecuentemente se utiliza también

el inverso de este parámetro para valorar la potencia antiradical. Sin embargo, Sánchez-

77

Moreno et al. (1998) consideraron la importancia del TEC50 al momento de definir la capacidad

antioxidante, y por tanto propusieron el nuevo parámetro Eficiencia Antiradical, que además

del EC50 involucra al TEC50; a menor EC50 y TEC50 mayor es la eficiencia antiradical. Los

valores obtenidos muestran que la semilla importada tiene mayor poder antioxidante que la

semilla nacional, y ambas variedades tienen una EA considerada como media de acuerdo a la

clasificación previa con estándares realizada por Sánchez-Moreno et al. (1998, 1999b).

Velioglu et al. (1998) reportan, utilizando el método del β -caroteno, que la linaza tiene un

valor relativamente bajo de actividad antioxidante y la cuantificaron en 60,6%, teniendo como

un control al α-tocoferol con 97,3%.

Las propiedades antiradicales de la linaza se deben principalmente a la presencia de

compuestos bioactivos con capacidad antioxidante como el lignano secoisolariciresinol

diglucósido (SDG) y sus oligómeros, los ácidos fenólicos libres y glucosilados, y los

flavonoides como el herbacetin diglucósido (Johnsson 2004; Strandås et al. 2008); se ha

comprobado que la acción antioxidante de estos compuestos fenólicos en la semilla es mayor

que la resultante de la vitamina E (Morris 2007). Los metabolitos del SDG, el

secoisolariciresinol, el enterodiol y la enterolactona poseen 3 veces mayor poder antioxidante

que el SDG (Prasad 2000). Velioglu et al. (1998), Jiménez-Escrig et al. (2001), Padilla et al.

(2008), Alothman et al. (2009) y, Valavanidis et al. (2009) han reportado una correlación

positiva entre el contenido de polifenoles totales y la actividad antioxidante; sin embargo, la

linaza nacional tiene menor poder antiradical que la semilla importada aún cuando presenta el

mayor contenido de polifenoles totales. Según Strandås et al. (2008), los oligómeros del SDG

tienen menor habilidad donadora de hidrógeno comparado con el SDG puro, confirmando que

los oligómeros en los cuales los grupos fenólicos están bloqueados por glucosilación son

inactivos como antioxidantes. Por otra parte, el contenido de polifenoles no es el único factor

influyente en la capacidad antioxidante de una muestra ya que hay otros compuestos

bioactivos presentes, además del efecto intrínseco de la sinergia entre los componentes del

alimento (Sánchez-Moreno et al. 1999a). Valavanidis et al. 2009 señalan que algunos

polifenoles muestran diferente actividad antioxidante dependiendo del método de ensayo

utilizado, por lo cual recomiendan utilizar varios métodos para evaluar la capacidad

antioxidante de una muestra.

78

De acuerdo con su forma de acción, los antioxidantes pueden clasificarse como terminadores

de radicales libres, queladores de iones metálicos o atrapadores de oxígeno; los antioxidantes

fenólicos caen dentro de la categoría de agentes terminadores de radicales libres,

principalmente debido a aspectos relacionados con su estructura (Sánchez-Moreno et al.

1998).

Las semillas de linaza importada tienen una EC50 comparable al de la semilla de Cacao (T.

cacao 4,05 g/g DPPH), al de la pulpa de guayaba rosada (P. guajava L. 3,70 g SS/g DPPH), y

al de la pulpa de guayaba silvestre (P. acutangulum 3,72 g SS/g DPPH), mientras que la

semilla nacional es comparable a la del vino rosé var Garnacha (6,1 g SS/g DPPH) (Sánchez-

Moreno et al. 1999b; Jiménez-Escrig et al. 2001; Padilla et al. 2008). Las EC50 de ambas

variedades de linaza son mayores a las reportadas para el vino tinto (1,58 g SS/g DPPH), pero

menores a la del vino rosé var Tempranillo (7,73 g SS/g DPPH) (Sánchez-Moreno et al.

1999b); sin embargo, la EA de las 2 variedades de vinos (24,4×10-3 y 3,77×10-3

respectivamente) es mayor a la de ambas variedades de linaza, lo que indica que a pesar de

que las concentraciones efectivas necesarias son menores en la linaza, el vino tinto y el rosé

(var Tempranillo) tienen mayor poder antiradical. La EA de las semilla de linaza nacional es

comparable con la del sorgo (1,65×10-3) y el vino blanco (1,57×10-3 - 2,43×10-3), mientras que

la EA de la linaza importada es comparable con la del ácido gálico (2,62×10-3) (Sánchez-

Moreno et al. 1998, 1999b; Padilla et al. 2008).

En la Figura 3.4. se muestra el comportamiento cinético obtenido para el gráfico % Remanente

de DPPH* (Y) vs tiempo de reacción (X). La variedad importada sigue un modelo

multiplicativo: Y = aXb, donde a y b son constantes que representan al intercepto y a la

pendiente, respectivamente. Por su parte, la variedad criolla presentó un comportamiento

modelo raíz cuadrada de Y: Y = (a + bX)2. De acuerdo a la clasificación cinética realizada por

Sánchez-Moreno et al. (1998, 1999b), que se encuentra basada en el TEC50, ambas semillas

presentan un comportamiento lento (> 30 min). El antioxidante sintético hidroxibutianisol

79

(BHA) también presenta un comportamiento que se puede calificar como lento (TEC50 =

103,85 min) comparable al de la linaza (Sánchez-Moreno et al. 1998).

50

60

70

80

90

100

0 20 40 60 80 100 120Tiempo (min)

% R

eman

ente

DPP

H*

5,081E-01 1,016E-01

6,352E-02 5,081E-02

50

60

70

80

90

100

0 20 40 60 80 100 120

Tiempo (min)

% R

eman

ente

DPP

H*

5,942E-01 1,188E-017,427E-02 5,942E-02

Figura 3.4. Comportamiento cinético del radical DPPH* para las semillas de linaza

(a) Importada (b) Nacional, a diferentes concentraciones (g de SS / g DPPH).

3.4. Efectos de los procesamientos sobre la composición de la semilla.

En la Tabla 3.10. se presenta el contenido remanente de mucílago en la semilla procesada. No

se observaron diferencias significativas entre los procesamientos y las variedades de semillas,

lo que indica que utilizando la cocción o el remojo, la cantidad de mucílago que permanece

adherido a la semilla es la misma. No se determinó un efecto significativo de la temperatura

del agua de remojo sobre la cantidad de mucílago removido, lo que indica que la agitación

juega un papel importante en la separación del mucílago de la semilla. Las semillas remojadas

solo se agitaron levemente al inicio del remojo, como usualmente se haría en condiciones

caseras. La cantidad de mucílago que se solubiliza a los extractos (agua de remojo y/o

cocción) es hasta de un 31,46% en la semilla importada y de un 12,81% en la nacional. La

metodología empleada para determinar el mucílago no es aplicable a la semilla molida debido

a que se produce contaminación con proteínas (Daun et al. 2003), razón por la cual en la torta

remanente de la molienda no pudo determinarse el contenido de mucílago. En el Anexo 3 se

presentan los resultados del análisis estadístico realizado.

(a) (b)

80

Tabla 3.10. Contenido remanente de mucílago en linaza de origen importado y nacional después del procesamiento (g/100 g SS).

Tipo de Procesamiento Semilla Importada

Semilla Nacional

Cocción 17,58 ± 2,99 a 18,30 ± 1,17 a

Remojo, semilla entera, agua fría

16,71 ± 1,40 a 19,35 ± 0,88 a

Remojo, semilla entera, agua caliente

18,79 ± 1,69 a 19,69 ± 1,17 a

Se reportan medias y desviación estándar de triplicados, expresados en base seca (SS). Letras diferentes en la misma columna indican diferencia significativa entre los procesamientos. Letras diferentes en la misma fila indican diferencias significativas entre las variedades de linaza analizadas.

En la Tabla 3.11. se presenta el contenido de grasa remanente en la torta de linaza luego de la

molienda y el remojo. No se observaron diferencias significativas entre el remojo en agua fría

o en agua caliente, pero si entre la variedad de semilla importada y la nacional. La pérdida de

grasa se atribuye a su suspensión en el agua de remojo, siendo el porcentaje de grasa que pasa

al agua hasta del 17,63% cuando se utilizaron semillas de linaza nacional y del 3,82% cuando

se utilizaron semillas de linaza importada.

Tabla 3.11. Contenido de grasa en la torta de linaza remanente de la molienda y remojo (g/100 g SS).

Tipo de Procesamiento Semilla Importada

Semilla Nacional

Remojo, semilla molida, agua fría

41,80 ± 2,53 a 35,46 ± 2,27 b

Remojo, semilla molida, agua caliente

41,91 ± 1,00 a 33,49 ± 3,92 b

Se reportan medias y desviación estándar de triplicados, expresados en base seca (SS). Letras diferentes en la misma columna indican diferencia significativa entre los procesamientos. Letras diferentes en la misma fila indican diferencias significativas entre las variedades de linaza analizadas.

81

En la Tabla 3.12. se muestra el contenido de proteínas solubles en el agua de remojo o

cocción. Se observan diferencias significativas entre las variedades de semilla y los

procesamientos aplicados. La máxima solubilización de proteínas ocurre, para ambas

variedades de linaza, durante el remojo de la semilla molida en agua fría, sin embargo, durante

el remojo de la semilla entera también se produjo solubilización de proteínas en mediana

cantidad. Bhatty (1993) reporta que los principales componentes de los extractos acuosos de

linaza son los polisacáridos que conforman el mucílago y las proteínas solubles. Se observó

que la cocción no influye sobre el contenido de proteínas en el extracto, contraria a la hipótesis

de que la cocción ocasiona daño a las paredes de la semilla permitiendo una mayor extracción

de las proteínas solubles.

Tabla 3.12. Contenido de proteínas solubles en los extractos de remojo y cocción de las semillas de linaza (mg/100 ml de extracto).

Tipo de Procesamiento Semilla Importada

Semilla Nacional

Remojo, semilla molida, agua fría

592,70 ± 8,45 a 547,28 ± 0,38 a, b

Remojo, semilla molida, agua caliente

489,90 ± 7,79 b 368,73 ± 6,54 c

Remojo, semilla entera,

agua fría 126,68 ± 1,24 d, e 170,24 ± 30,66 d

Remojo, semilla entera, agua caliente

96,64 ± 2,09 d, e 52,91 ± 4,31 e

Cocción 96,99 ± 4,55 d, e 67,69 ± 2,18 e

Se reportan medias y desviación estándar de triplicados, expresados en base seca. Letras diferentes en la misma columna indican diferencia significativa entre los procesamientos. Letras diferentes en la misma fila indican diferencias significativas entre las variedades de linaza analizadas.

Para ambas variedades de semillas no existen diferencias significativas (p > 0,05) entre la

cocción y el remojo de la semilla entera en agua caliente. Se observó en casi todos los casos

que la solubilidad de proteínas fue mayor en agua fría. Oomah y Mazza (1998) reportan que la

solubilidad de las proteínas de linaza en agua es solo del 20-24% y la clasifican como pobre,

debido a que en su mayor parte son globulinas. La reacción principal del método de Biuret

82

utilizado para esta determinación, se basa en la formación, en medio básico, de un compuesto

coloreado violeta, que se genera al formarse un complejo entre los iones Cu2+ y los pares de

electrones no compartidos del nitrógeno de los enlaces peptídicos. La intensidad del color es

proporcional al contenido de proteínas de la muestra.

En la Tabla 3.13. se muestra el contenido de ácido cianhídrico (HCN) equivalente en la linaza

procesada. Se observan diferencias significativas (p ≤ 0,05) entre las variedades de semilla y

los procesamientos. El tostado ocasionó una reducción del 39,82% del HCN equivalente

presente en la semilla importada y del 39,53% en la semilla nacional. La disminución de la

actividad enzimática pudiera explicar la disminución en el contenido de HCN equivalente de

la semilla, aunque la metodología experimental involucra una hidrólisis ácida que hace

innecesaria la acción enzimática. Yamashita et al. (2007) reportaron que la linaza sin procesar

o procesada en frio posee enzimas que descomponen a los glucósidos cianógenos, mientras

que la linaza procesada en caliente no. Queda descartada la pérdida de HCN por evaporación

ya que durante el tostado la semilla permanece entera, lo que aunado a la alta temperatura,

impide la degradación enzimática de los glucósidos cianógenos y por tanto la generación de

HCN. Se sugiere entonces que la temperatura pudiera catalizar la hidrólisis de los glucósidos

cianógenos y generar HCN (que se evaporaría y por lo tanto no se cuantificaría), o producir

otras sustancias no detectadas por la metodología experimental utilizada. Barceloux (2009)

señala que el agua hirviendo puede remover el 90% del HCN; sin embargo, la cocción solo

ocasionó una disminución del 22,36% en la semilla nacional, mientras que en la semilla

importada no se encontraron diferencias significativas (p > 0,05) en el contenido de HCN con

respecto a la semilla sin procesar, es decir no se produjo reducción alguna. El calentamiento

por debajo de los 100°C mantiene la actividad enzimática de las β-glucosidasas, las cuales se

inactivan por encima de los 120°C (Yamashita et al. 2007), por esta razón, la cantidad de

HCN perdida en la semilla nacional cocida puede atribuirse a la evaporación, si se asume que

durante la cocción se producen rupturas en la estructura de la semilla que permitan el contacto

entre las enzimas y los glucósidos cianógenos. En este caso, se asume que la cáscara de la

semilla nacional es más delgada o más susceptible a la temperatura que la de la semilla

importada que no permitió el contacto de las enzimas con el sustrato cianogénico. Morris

(2007) reporta que la cocción destruye las enzimas responsables de metabolizar a los

83

glucósidos pero no reporta las condiciones en las que se realizó su estudio. Probablemente el

tiempo de cocción sea también un factor influyente en la degradación de los glucósidos

cianógenos.

Tabla 3.13. Contenido de ácido cianhídrico (HCN) equivalente en las semillas de linaza importada y nacional procesadas (mg /100 g SS).

Tipo de Procesamiento Semilla Importada

Semilla Nacional

Remojo, semilla molida, agua fría

8,72 ± 0,87 a 7,42 ± 1,63 a

Remojo, semilla molida, agua caliente

8,85 ± 0,84 a 18,06 ± 1,80 b

Remojo, semilla entera,

agua fría 15,84 ± 0,47 b, c 14,86 ± 0,95 c

Remojo, semilla entera, agua caliente

7,41 ± 0,90 a 9,72 ± 2,84 a

Cocción 41,02 ± 0,89 d 29,21 ± 1,06 e

Tostado 23,70 ± 0,95 f 22,75 ± 0,75 f

Se reportan medias y desviación estándar de triplicados, expresados en base seca. Letras diferentes indican diferencia significativa entre los procesamientos y las variedades de linaza analizadas.

En la variedad importada no se observaron diferencias significativas entre el remojo de la

semilla molida en agua fría o caliente, y el remojo de la semilla entera en agua caliente; en

todos los casos se produjo una disminución de más del 77% del HCN. Por su parte, para la

semilla nacional molida y remojada se produjo una disminución del 80,28% (en agua fría) y

51,99% (en agua caliente) del HCN; la diferencia observada entre el agua fría y agua caliente

obedece a la actividad o inactividad de las enzimas según la temperatura de procesamiento

(Yamashita et al. 2007). La disminución de la concentración en las semillas molidas

remojadas puede atribuirse a que los glucósidos cianógenos o el HCN producido se solubiliza

en los extractos. Estudios previos indican que durante el calentamiento, la semilla molida es

capaz de retener mayor actividad enzimática que la semilla entera, lo cual es atribuido a que

las β-glucosidasas responsables de la hidrólisis de los glucósidos cianógenos son mas

efectivamente inactivadas en la semilla entera que en la semilla molida a causa de menor

84

pérdida de agua (Daun et al. 2003). Durante el remojo de la semilla entera en agua fría se

produce una disminución cercana al 60% del HCN.

En la Tabla 3.14. se presenta el contenido de HCN en los extractos de remojo y cocción. El

menor contenido de HCN lo presentan los extractos de la cocción, ya que la mayor parte de los

cianógenos permanecen en la semilla (Tabla 3.13.). Por el contario, el extracto con la mayor

concentración de HCN pertenece a las semillas molidas remojadas en agua caliente. En

general se observa que los extractos provenientes del remojo en agua caliente presentan una

mayor concentración de HCN con respecto a los extractos de remojo en agua fría, lo que

podría sugerir que la temperatura exacerba en algún grado la reacción.

Tabla 3.14. Contenido de ácido cianhídrico en los extractos de remojo/cocción de las semillas de linaza (mg/ L de extracto).

Tipo de Procesamiento Semilla Importada

Semilla Nacional

Remojo, semilla molida, agua fría

6,97 ± 0,15 a 6,85 ± 0,09 a

Remojo, semilla molida, agua caliente

13,65 ± 0,33 b 21,74 ± 0,14 c

Remojo, semilla entera,

agua fría 8,04 ± 0,01 a 8,98 ± 0,53 a, d

Remojo, semilla entera, agua caliente

11,01 ± 0,11 b, d 8,36 ± 0,01 a, d

Cocción 3,81 ± 0,06 e 2,24 ± 0,10 e

Se reportan medias y desviación estándar de triplicados. Letras diferentes indican diferencia significativa entre los procesamientos y las variedades de linaza analizadas.

Los resultados se corresponden con la disminución del HCN en la semilla (Tabla 3.13.), lo

cual corrobora la hipótesis de que los glucósidos cianógenos se solubilizan en el agua de

remojo. Aubourg et al. (2006) señalan que en el extracto acuoso de linaza están presentes

diferentes tipos de glucósidos hidrosolubles, entre los cuales están la linamarina y la

lotaustralina, ambos cianógenos. En países como Alemania, Estados Unidos, y el Reino Unido

85

el límite de toxicidad del HCN es de 10ppm (UNAM 2008). Según estas recomendaciones los

extractos provenientes del remojo de la semilla molida en agua caliente no deberían ser

consumidos sino desechados.

La Tabla 3.15. muestra el efecto de los procesamientos sobre el contenido de polifenoles en la

semilla. Se observan diferencias significativas entre los procesamientos y las variedades de

semillas. Con excepción de la cocción, la semilla nacional se vio menos afectada por los

procesamientos que la semilla importada, en la cual ocurrieron las mayores reducciones del

contenido de polifenoles. Los menores porcentajes de reducción se produjeron para ambas

variedades de linaza durante el remojo de la semilla entera en agua fría, siendo del 6,63% para

la semilla nacional y del 11,45% para la semilla importada. Durante el remojo de la semilla

entera en agua caliente se observó una disminución hasta del 42% del contenido inicial de

polifenoles, mientras que la cocción ocasionó pérdidas hasta del 47,35%. Xu y Chang (2008)

determinaron que durante el remojo de caraotas negras (P. vulgaris L) por 16h se disminuía en

un 52% el contenido de polifenoles totales, mientras que la cocción por 1h ocasionaba hasta

76,7% de pérdidas; dichas pérdidas se atribuyeron a la difusión de algunos compuestos

polifenólicos en el agua de remojo. Ismail et al. (2004) también observaron pérdidas

significativas en el contenido de polifenoles en vegetales como la espinaca (S. oleracea L.) y

el repollo (B. oleracea), que van del 12% al 26% después de solo 1 minuto de cocción en agua

hirviendo.

Durante el tostado de las semillas, se produjo la mayor reducción (70,38%) del contenido de

polifenoles para las semillas de linaza importada, mientras que para la nacional no se

determinaron diferencias significativas entre el tostado, la cocción o el remojo de la semilla

molida en agua caliente. La disminución de la concentración de secoisolariciresinol durante el

tostado a 150°C después de 20 min observada por Murkovic et al. (2004), pudiera explicar la

reducción abrupta del contenido de polifenoles durante este procesamiento.

86

Tabla 3.15. Contenido de polifenoles en las semillas de linaza nacional e importada procesada (mg*/100g).

Tipo de Procesamiento Semilla Importada

Semilla Nacional

Remojo, semilla molida, agua fría

580,91 ± 50,01 a 1049,18 ± 44,32b

Remojo, semilla molida, agua caliente

560,02 ± 62,17 a 830,03 ± 51,19 c

Remojo, semilla entera,

agua fría 1270,64 ± 76,74 d 1545,31 ± 98,00e

Remojo, semilla entera, agua caliente

831,28 ± 107,74 c 1286,49 ± 94,77d

Cocción 917,3 ± 99,49 c 871,33 ± 79,28 c

Tostada 425,05 ± 10,36 f 819,52 ± 40,64 c * Expresados como mg equivalentes de ácido tánico. Se reportan medias y desviación estándar de triplicados expresados en base seca. Letras diferentes indican diferencia significativa entre los procesamientos y las variedades de linaza analizadas.

En la Tabla 3.16. se presenta el contenido de polifenoles de los extractos de remojo y cocción.

No se detectaron polifenoles en los extractos de remojo de las semillas enteras, ni en el agua

de cocción de la linaza importada. No se determinaron diferencias significativas entre ambos

tipos de semilla pero si entre los procesamientos. La mayor concentración de polifenoles se

detectó en los extractos de remojo de la semilla molida en agua fría. No se determinaron

diferencias significativas entre la cocción y el remojo de la semilla en agua caliente. Se

observó que el contenido de polifenoles presente en los extractos fue bajo en comparación con

el vino blanco (292 mg/L), que resultó tener el menor contenido de polifenoles de las muestras

de vino y jugo de uva (292-1869 mg/L) analizadas por Sánchez-Moreno et al. (1999a).

Xu y Chang (2008) detectaron niveles significativos de polifenoles (hasta 2,77 mg/g) en las

aguas de remojo y cocción de caraotas negras; asimismo observaron que la suma de los

polifenoles en el grano procesado y en el agua de remojo era menor al contenido inicial de

polifenoles del grano sin procesar, lo que indica pérdida de los mismos. Aún cuando la

naturaleza química de esta reducción no es completamente conocida, se atribuye a

87

transformaciones químicas como la descomposición de los polifenoles o la formación de

compuestos complejos con proteínas (Jiménez-Monreal et al. 2009).

Tabla 3.16. Contenido de polifenoles en los extractos de remojo y cocción de las semillas de linaza (mg*/ L de extracto).

Tipo de Procesamiento Semilla Importada

Semilla Nacional

Remojo, semilla molida, agua fría

93,46 ± 9,12 a 81,63 ± 7,91 a, b

Remojo, semilla molida, agua caliente

67,44 ± 4,61 b, c 57,31 ± 1,00 c

Remojo, semilla entera,

agua fría ND ND

Remojo, semilla entera, agua caliente

ND ND

Cocción ND 48,71 ± 9,30 c

* Expresados como mg equivalentes de ácido tánico. Se reportan medias y desviación estándar de triplicados. Letras diferentes indican diferencia significativa entre los procesamientos. ND: No detectado.

En la Tabla 3.17. se observa cómo se modificó la capacidad antioxidante de las semillas de

linaza con los diferentes procesamientos aplicados. Se observó un aumento de la EC50 de la

mayor parte de las muestras, lo cual significa una disminución en su poder antiradical. En la

semilla importada, con excepción del proceso de cocción, la eficiencia antiradical no presentó

variación significativa (p > 0,05) entre los procesamientos aplicados, pero si una considerable

disminución (hasta del 65,38%) con respecto a la linaza sin procesar. Xu y Chang (2008)

determinaron que la capacidad atrapadora de las caraotas negras disminuyó entre 6 y 8%

después del remojo y del 17 al 44% durante la cocción; le atribuyen esta disminución al efecto

acumulativo de diferentes factores como la solubilización de antioxidantes en el agua, la

formación o ruptura de los mismos por efecto del calor (que resulta destructivo para ciertos

compuestos antioxidantes), y la pérdida de sólidos durante los procesamientos.

Tabla 3.17. Capacidad antioxidante de las semillas de linaza procesadas.

Tipo de Procesamiento Semilla Importada Semilla Nacional

EC50 (g* / g de DPPH·) TEC50 (min) EA (×10-3) EC50 (g* / g de

DPPH·) TEC50 (min) EA (×10-3)

Remojo, semilla molida, agua fría 7,99 ± 0,01 a 94,81 ± 2,23 a, b 1,32 ± 0,03 a 10,63 ± 0,22 b, c 114,16 ± 3,44 a, b 0,82 ± 0,02 a

Remojo, semilla molida, agua caliente 11,18 ± 0,60 b, c 118, 14 ± 23,80 b 0,83 ± 0,02 a 7,25 ± 0,39 a 103,48 ± 8,42 a, b 1,36 ± 0,15 a

Remojo, semilla entera,

agua fría 11,59 ± 0,81 c 111,57 ± 4,26 a, b 0,78 ± 0,02 a 7,49 ± 0,13 b 105,41 ± 0,05 a, b 1,28 ± 0,19 a

Remojo, semilla entera, agua caliente 10,28 ± 0,82 b 95,23 ± 5,18 a, b 1,03 ± 0,14 a 4,85 ± 0,04 d 169,78 ± 8,79 c 1,22 ± 0,14 a

Cocción 1,63 ± 0,28 d 87,81 ± 0,93 a 7,22 ± 0,72 b 7,01 ± 0,04 a 90,30 ± 2,52 a, b 1,59 ± 0,02 a

Tostada 7,58 ± 0,38 a 100,91 ± 1,96 a, b 1,31 ± 0,09 a 5,75 ± 0,15 d 95,34 ± 2,50 a, b 1,85 ± 0,08 a * Gramos de muestra en base seca. Se reportan medias y desviación estándar de triplicados. Letras diferentes en los mismos parámetros indican diferencias significativas entre el tipo de semilla y los procesamientos aplicados.

89

Durante la cocción de la semilla importada se observó un incremento del 220% de la EA con

respecto a la semilla sin procesar. Efectos positivos como este, en el que la actividad

antioxidante se ve incrementada durante los procesamientos térmicos han sido observados por

diversos investigadores en té, tomates y maíz dulce (Jiratanan y Liu 2004, Xu y Chang 2008).

Este efecto es atribuido a 2 causas: la formación de compuestos de Maillard como

consecuencia del calor y la ruptura de compuestos fenólicos en otros con mayor actividad

antioxidante. El hidroximetilfural es uno de los compuestos tipo Maillard generados cuya

presencia se ha observado en ciruelas procesadas a 65 y 85°C, y que se degrada a temperaturas

mayores a 160°C; la formación de compuestos fenólicos durante el proceso de calentamiento

puede deberse a la disponibilidad de precursores de moléculas fenólicas por interconversión

no enzimática por efectos de un factor externo como la temperatura (Soong y Barlow 2004).

La EC50 y la EA de la linaza importada cocida es comparable a la de la cáscara de guayaba

rosada (1,92 g SS/g DPPH y 7,00×10-3, respectivamente) (Jiménez-Escrig et al. 2001). La EA

también es similar a la del pericarpio de mamón (7,32×10-3) (Padilla et al. 2008). La

correlación entre el contenido de polifenoles de la linaza importada y la EC50 (R2 = 0,0075) o

la EA (R2 = 0,0336) no fue significativa y fue muy baja.

Por su parte, en la semilla nacional, los procesamientos no afectaron la EA de la linaza. Un

comportamiento similar observaron Jiratanan y Liu (2004), quienes no determinaron efectos

significativos sobre la actividad antioxidante durante la cocción de remolacha (Beta vulgaris

var. conditiva) a diferentes tiempos y temperaturas. Jiménez-Monreal et al. (2009) tampoco

observaron variación significativa en la actividad antioxidante de vainitas (P. vulgaris, Savi.)

después de la cocción por 21 min y el horneado a 200°C y 35 min. La EC50 de la linaza

nacional tostada es comparable a la del pericarpio y la semilla de mamón (5,88 y 5,69 g/g

DPPH, respectivamente), mientras que la EC50 de la linaza entera remojada es ligeramente

menor a la del sorgo (12,44 g/g DPPH) (Padilla et al. 2008). La EA de la linaza nacional es

ligeramente menor que la del sorgo (1,65×10-3) (Padilla et al. 2008). El TEC50 aunque

disminuyó en algunos casos, en comparación a las semillas sin procesar, sigue clasificado

como lento (> 30 min). En el caso de la semilla nacional, a pesar de no haberse obtenido una

correlación significativa (R2 = 0,0003), se pudo observar que la disminución en el contenido

de polifenoles ocasionó un efecto negativo sobre las EC50 de las muestras, pero no sobre su

90

eficiencia antiradical (R2 = 0,1927), lo que quizás si es debido al mayor contenido de

polifenoles en esta variedad. Kähkönen et al. (1999) e Ismail et al. (2004) tampoco observaron

relación alguna entre el contenido de polifenoles y la actividad antioxidante, concluyendo que

la capacidad antioxidante no solo depende de los polifenoles sino de la interacción de los

diversos componentes de cada alimento.

En la Tabla 3.18. se observa que el procesamiento afecta significativamente la capacidad

antioxidante de los extractos de remojo y cocción de las semillas de linaza, obteniendo la

mejor actividad antiradical los extractos de la cocción; sin embargo, la mejor eficiencia

antiradical está presente en los extractos del remojo de la semilla entera en agua fría. Xu y

Chang (2008) analizaron la capacidad antioxidante de las aguas de remojo y cocción de

caraotas negras para confirmar su hipótesis sobre la solubilización de algunos compuestos

fenólicos durante estos procesamientos, y determinaron una mayor actividad antioxidante en

los extractos de la cocción que en los de remojo, lo cual hace suponer que la temperatura juega

un papel importante en las reacciones de formación de los compuestos fenólicos producidos

durante la aplicación de calor. No se observó relación entre el contenido de polifenoles de los

extractos y su capacidad antioxidante, lo cual sugiere que sus propiedades antioxidantes se

deben a la solubilización de otros compuestos no polifenólicos y/o a la sinergia de sus

componentes. Como se mencionó anteriormente, Aubourg et al. (2006) señalan que en el

extracto acuoso de linaza están presentes diferentes tipos de glucósidos hidrosolubles, lo cual

de acuerdo con sus estudios, le confiere al agua ciertas propiedades antioxidantes. Estudios

más profundos a la composición de los extractos acuosos de linaza permitirían conocer mejor

a que se atribuyen sus propiedades antioxidantes. En comparación con la semilla, se

observaron valores altos de la EC50, lo que indica que el poder antiradical de los extractos es

menor. El TEC50 de las semillas enteras remojadas es menor que el del resto de los extractos,

pero sigue clasificado como lento (TEC50 >30 min). Las EC50 de los extractos obtenidos a partir

del remojo de la semilla molida en agua fría son comparables, aunque ligeramente menores

que la del vino blanco (15,65 g/g DPPH) (Sánchez-Moreno et al. 1999b), mientras que la EA

es comparable con la del ácido tánico (0,57×10-3) y la del DL-α-tocoferol (0,52×10-3), ambas

clasificadas como de eficiencia baja (Sánchez-Moreno et al. 1998). Estos extractos de remojo

de la semilla molida en agua fría presentaron el mayor contenido de polifenoles (Tabla 3.16.).

91

Tabla 3.18. Capacidad antioxidante de los extractos de remojo/cocción de las semillas de linaza.

Tipo de Procesamiento

Semilla Importada Semilla Nacional

EC50 (g* / g de DPPH·) TEC50 (min) EA (×10-3) EC50 (g* / g de

DPPH·) TEC50 (min) EA (×10-3)

Remojo, semilla molida, agua fría

14,06 ± 1,17 a, b 122,58 ± 3,34 a, e 0,58 ± 0,03 a 14,97 ± 1,36 b 108,72 ± 1,37 a 0,62 ± 0,01 a

Remojo, semilla molida, agua caliente

13,66 ± 0,27 c 133,24 ± 3,51 d, e 0,56 ± 0,02 a 9,34 ± 1,57 d, e 107,60 ± 5,69 a 1,01 ± 0,12 b

Remojo, semilla entera, agua fría

8,19 ± 0,55 d, e 55,86 ± 7,01 b, c 2,29 ± 0,02 c 13,13 ± 0,70 a, b 40,97 ± 3,27 b 1,89 ± 0,04 d

Remojo, semilla entera, agua caliente

10,95 ± 0,27 a, e 55,55 ± 0,01 b, c 1,64 ± 0,04 d, e 21,26 ± 0,85 c 58,30 ± 0,46 c 0,81 ± 0,09 a, b

Cocción 3,98 ± 0,24 f 148,80 ± 5,22 d 1,69 ± 0,16 d, e 6,11 ± 0,08 d, f 112,17 ± 0,63 a 1,46 ± 0,03 e

* Gramos de muestra en base seca. Se reportan medias y desviación estándar de triplicados. Letras diferentes en los mismos parámetros indican diferencias significativas entre el tipo de semilla y los procesamientos aplicados.

CAPÍTULO IV

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

4.1. Conclusiones El manejo de la cosecha y la posterior manipulación de la semilla de linaza afectan la calidad

microbiológica de la semilla, lo cual se evidenció claramente en la variedad nacional.

Las variedades de linaza, nacional e importada, difieren en su composición proximal, con

excepción del contenido de fibra dietaria. En ambas variedades destacó el alto contenido de

grasa insaturada, fibra dietaria, proteínas y minerales como potasio, fósforo y magnesio, así

como también un elevado contenido de ácido α-linolénico (ALA).

El contenido de polifenoles es mayor en la linaza nacional; sin embargo, en ambas variedades

la eficacia antiradical está clasificada como media y con un tiempo de reacción lento. No se

observó relación entre el contenido de polifenoles y la capacidad antioxidante, lo que sugiere

que otros compuestos presentes en la semilla, así como su sinergia, también contribuyen en

dicha capacidad.

La aplicación de la cocción, el remojo de la semilla en agua fría o el remojo de la semilla en

agua caliente fueron igualmente efectivos en la remoción de mucílago.

Los glucósidos cianógenos presentes en la semilla de linaza importada y nacional producen

aproximadamente 40 mg/ 100g de HCN equivalente. De los procesamientos evaluados, el

remojo de la semilla entera o molida permite reducir la mayor parte del contenido de

glucósidos cianógenos presentes, lo cual hace suponer que estos compuestos están asociados a

las capas externas de la semilla. El contenido de HCN presente en los extractos de remojo de

93

la semilla molida en agua caliente supera los límites de toxicidad establecidos en varios países

por lo que no debería consumirse en esa forma.

El contenido de polifenoles se ve considerablemente afectado por los procesamientos que

involucran calor, tales como el remojo en agua caliente, cocción, y tostado.

La cocción ocasionó un incremento significativo de la Eficiencia Antiradical de la semilla

importada, mientras que el resto de los procesamientos aplicados no ocasionaron variación

alguna en este parámetro, pero si una considerable disminución en comparación con la semilla

sin procesar. Por el contrario, en la semilla nacional los procesamientos no afectaron

significativamente la EA.

Durante el remojo y la cocción de la linaza, la mayor parte del mucílago, grasas y proteínas

quedan adheridas a la semilla o formando parte de la torta remanente de linaza molida y solo

una pequeña parte pasa al agua de remojo. Los extractos acuosos de linaza poseen entonces

pocas propiedades funcionales en comparación con la ingesta de la semilla completa. La

presencia de una baja pero significativa capacidad antioxidante en los extractos, a pesar de la

ausencia de compuestos polifenólicos en algunos de ellos, sugiere la presencia de otros

componentes hidrosolubles con propiedades antioxidantes.

En virtud de las modificaciones en la composición de la semilla obtenidas por los

procesamientos aplicados, el índice que debe considerarse para evaluar la forma mas

apropiada de consumo de linaza es el contenido de HCN equivalente. Por tal razón se

recomienda la ingesta de la semilla recién molida con o sin remojo previo, sin ingerir el agua

de remojo.

4.2. Recomendaciones Dadas las propiedades nutricionales y como alimento funcional de la semilla de linaza, se

recomienda promover el cultivo de linaza en el país para disminuir, aunque sea parcialmente,

la dependencia de la importación de la semilla canadiense.

94

Se deben realizar evaluaciones adicionales para conocer mas sobre la composición de la

semilla, como por ejemplo, contenido de vitaminas, taninos, inhibidores de tripsina,

flavonoides y otros componentes cuya presencia ha sido descrita de manera imprecisa por

diferentes autores. Adicionalmente, sería de interés profundizar los análisis de la fracción

proteica y la fibra dietaria de linaza, cuyos estudios han sido relegados por los de otros

constituyentes.

Es necesario analizar los extractos de remojo para detectar las sustancias polifenólicas y no

polifenólicas presentes que le atribuyen actividad antioxidante. Conjuntamente, se deben

utilizar métodos adicionales para evaluar la capacidad antioxidante de la linaza y tener un

mejor conocimiento sobre sus propiedades antiradicales. Asimismo, se debe determinar la

concentración de lignanos en la semilla nacional y evaluar su contribución a las propiedades

antioxidantes.

Sería de interés realizar un estudio de estabilidad a la semilla tostada, la más usada a nivel

industrial, con énfasis en la modificación de su perfil de ácidos grasos para observar los

cambios producidos por este procesamiento.

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ANEXOS

106 Anexo 1. Hoja de diseño experimental.

Cor

rida

Tipo de Semilla Procesamiento

Semillas Extracto

Muc

ílago

Gra

sa

HC

N

Polif

enol

es

DPP

H

Muc

ílago

H

CN

Polif

enol

es

DPP

H

Prot

eína

s So

lubl

es

1 Nacional Molida. Remojo en agua caliente 2 Importada Molida. Remojo en agua caliente 3 Importada Molida. Remojo en agua caliente 4 Nacional Entera. Remojo en agua fría 5 Importada Cocción 6 Nacional Entera. Remojo en agua caliente 7 Importada Molida. Remojo en agua fría 8 Importada Cocción 9 Nacional Entera. Remojo en agua caliente 10 Nacional Molida. Remojo en agua caliente 11 Importada Entera. Remojo en agua caliente 12 Nacional Tostada 13 Nacional Molida. Remojo en agua fría 14 Importada Entera. Remojo en agua fría 15 Importada Entera. Remojo en agua caliente 16 Nacional Tostada 17 Nacional Cocción 18 Importada Tostada 19 Nacional Molida. Remojo en agua fría 20 Nacional Entera. Remojo en agua fría 21 Importada Tostada 22 Importada Entera. Remojo en agua fría 23 Nacional Cocción 24 Importada Molida. Remojo en agua fría

107

Anexo 2. Resultados de los análisis estadísticos aplicados: Prueba t de dos muestras independientes. Color

(Parámetro L) Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 3 52,2000 0,0200 0,012 2 3 40,4700 0,0900 0,052 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: 11,7300 95% CI for difference: (11,5822; 11,8778) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 220,37 P-Value = 0,000 DF = 4

(Parámetro a) Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 3 5,3500 0,0300 0,017 2 3 4,6800 0,0300 0,017 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: 0,670000 95% CI for difference: (0,601991; 0,738009) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 27,35 P-Value = 0,000 DF = 4

(Parámetro b) Two-Sample T-Test and CI Sample N Mean StDev SE Mean 1 3 7,9800 0,0300 0,017 2 3 4,8300 0,0500 0,029 Difference = mu (1) - mu (2) Estimate for difference: 3,15000 95% CI for difference: (3,05653; 3,24347) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 93,57 P-Value = 0,000 DF = 4

Proteínas Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Semilla N Inferior Desv.Est. Superior Criolla 5 0,0997850 0,178235 0,616611 Importada 6 0,0546820 0,093261 0,266814 Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 3,65; valor p = 0,188 Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 2,12; valor p = 0,179

108

T de dos muestras para Proteínas Media del Error Semilla N Media Desv.Est. estándar Criolla 5 22,309 0,178 0,080 Importada 6 21,4678 0,0933 0,038 Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: 0,8412 IC de 95% para la diferencia: (0,6527; 1,0298) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = 10,09 Valor P = 0,000 GL = 9 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,1377

Grasas Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Semilla N Inferior Desv.Est. Superior Criolla 5 0,148084 0,264505 0,915068 Importada 6 0,195387 0,333235 0,953366 Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 0,63; valor p = 0,675 Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 0,00; valor p = 0,947 T de dos muestras para Grasa Media del Error Semilla N Media Desv.Est. estándar Criolla 5 40,664 0,265 0,12 Importada 6 43,463 0,333 0,14 Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: -2,800 IC de 95% para la diferencia: (-3,217; -2,382) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = -15,18 Valor P = 0,000 GL = 9

Cenizas Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Semillas N Inferior Desv.Est. Superior Criolla 6 0,0122588 0,0209075 0,0598153 Importada 6 0,0073070 0,0124622 0,0356537 Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 2,81; valor p = 0,281 Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 1,26; valor p = 0,287

109

T de dos muestras para Cenizas Media del Error Semillas N Media Desv.Est. estándar Criolla 6 3,2158 0,0209 0,0085 Importada 6 3,2745 0,0125 0,0051 Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: -0,05877 IC de 95% para la diferencia: (-0,08091; -0,03663) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = -5,91 Valor P = 0,000 GL = 10 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,0172

Fibra Dietaria Total Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Semillatipo N Inferior Desv.Est. Superior Criolla 3 0,437529 0,915892 8,16630 Importada 3 0,396009 0,828977 7,39134 Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 1,22; valor p = 0,901 Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 0,01; valor p = 0,936 T de dos muestras para FibraTotal Media del Error Semillatipo N Media Desv.Est. estándar Criolla 3 33,544 0,916 0,53 Importada 3 31,974 0,829 0,48 Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: 1,570 IC de 95% para la diferencia: (-0,410; 3,551) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = 2,20 Valor P = 0,092 GL = 4 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,8735

Fibra insoluble Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Semillatipo N Inferior Desv.Est. Superior Criolla 3 0,066988 0,140228 1,25031 Importada 3 0,426282 0,892348 7,95637 Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 0,02; valor p = 0,048

110

Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 0,80; valor p = 0,422 T de dos muestras para F_Insoluble Media del Error Semillatipo N Media Desv.Est. estándar Criolla 3 17,271 0,140 0,081 Importada 3 16,385 0,892 0,52 Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: 0,886 IC de 95% para la diferencia: (-0,562; 2,334) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = 1,70 Valor P = 0,165 GL = 4 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,6387

Fibra soluble Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Semillatipo N Inferior Desv.Est. Superior Criolla 3 0,499516 1,04565 9,32326 Importada 3 0,086042 0,18011 1,60594 Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 33,70; valor p = 0,058 Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 0,88; valor p = 0,401 T de dos muestras para F_Soluble Media del Error Semillatipo N Media Desv.Est. estándar Criolla 3 16,27 1,05 0,60 Importada 3 15,589 0,180 0,10 Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: 0,684 IC de 95% para la diferencia: (-1,017; 2,385) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = 1,12 Valor P = 0,327 GL = 4 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,7503

Mucílago Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares S_tipo N Inferior Desv.Est. Superior Criolla 5 0,401460 0,717083 2,48078 Importada 5 0,362426 0,647361 2,23958

111

Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 1,23; valor p = 0,848 Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 0,18; valor p = 0,685 T de dos muestras para Mucilago Media del Error S_tipo N Media Desv.Est. estándar Criolla 5 20,994 0,717 0,32 Importada 5 24,379 0,647 0,29 Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: -3,385 IC de 95% para la diferencia: (-4,381; -2,389) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = -7,84 Valor P = 0,000 GL = 8 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,6831

Minerales

(Sodio, Na) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Semilla N Inferior Desv.Est. Superior Criolla 5 6,37508 11,3871 39,3942 Importada 5 1,91591 3,4222 11,8392 Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 11,07; valor p = 0,039 Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 5,83; valor p = 0,042 T de dos muestras para Na Media del Error Semilla N Media Desv.Est. estándar Criolla 5 46,6 11,4 5,1 Importada 5 55,75 3,42 1,5 Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: -9,12 IC de 95% para la diferencia: (-23,89; 5,64) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = -1,72 Valor P = 0,161 GL = 4

(Potasio, K) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares

112

Semilla N Inferior Desv.Est. Superior Criolla 5 14,5718 26,0280 90,0451 Importada 5 7,2639 12,9746 44,8863 Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 4,02; valor p = 0,206 Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 1,31; valor p = 0,285 T de dos muestras para K Media del Error Semilla N Media Desv.Est. estándar Criolla 5 2227,4 26,0 12 Importada 5 2221,6 13,0 5,8 Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: 5,8 IC de 95% para la diferencia: (-24,2; 35,8) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = 0,44 Valor P = 0,669 GL = 8 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 20,5645

(Magnesio, Mg) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Semilla N Inferior Desv.Est. Superior Criolla 5 6,70136 11,9699 41,4104 Importada 5 3,78079 6,7532 23,3630 Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 3,14; valor p = 0,293 Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 1,39; valor p = 0,272 T de dos muestras para Mg Media del Error Semilla N Media Desv.Est. estándar Criolla 5 388,2 12,0 5,4 Importada 5 390,64 6,75 3,0 Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: -2,41 IC de 95% para la diferencia: (-16,59; 11,76) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = -0,39 Valor P = 0,705 GL = 8 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 9,7181

113

(Calcio, Ca) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Semilla N Inferior Desv.Est. Superior Criolla 5 1,14313 2,04185 7,0639 Importada 5 2,35477 4,20605 14,5510 Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 0,24; valor p = 0,190 Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 0,78; valor p = 0,403 T de dos muestras para Ca Media del Error Semilla N Media Desv.Est. estándar Criolla 5 239,51 2,04 0,91 Importada 5 239,39 4,21 1,9 Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: 0,13 IC de 95% para la diferencia: (-4,70; 4,95) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = 0,06 Valor P = 0,953 GL = 8 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 3,3061

(Cromo, Cr) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Semilla N Inferior Desv.Est. Superior Criolla 3 0,0303217 0,0634734 0,565942 Importada 5 0,0517193 0,0923803 0,319594 Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 0,47; valor p = 0,691 Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 0,46; valor p = 0,521 T de dos muestras para Cr Media del Error Semilla N Media Desv.Est. estándar Criolla 3 0,2326 0,0635 0,037 Importada 5 0,3150 0,0924 0,041 Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: -0,0824 IC de 95% para la diferencia: (-0,2322; 0,0675) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = -1,35 Valor P = 0,227 GL = 6 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,0839

114

(Zinc, Zn) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Tipo_Sem N Inferior Desv.Est. Superior Criolla 5 0,204543 0,365353 1,26395 Importada 5 0,236233 0,421956 1,45978 Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 0,75; valor p = 0,787 Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 0,01; valor p = 0,933 T de dos muestras para Zn Media del Error Tipo_Sem N Media Desv.Est. estándar Criolla 5 8,295 0,365 0,16 Importada 5 7,293 0,422 0,19 Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: 1,002 IC de 95% para la diferencia: (0,427; 1,578) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = 4,02 Valor P = 0,004 GL = 8 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,3947

(Hierro, Fe) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Tipo_Sem N Inferior Desv.Est. Superior Criolla 5 0,649858 1,16077 4,01573 Importada 5 0,885360 1,58142 5,47099 Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 0,54; valor p = 0,564 Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 0,46; valor p = 0,515 T de dos muestras para Fe Media del Error Tipo_Sem N Media Desv.Est. estándar Criolla 5 15,82 1,16 0,52 Importada 5 12,41 1,58 0,71 Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: 3,407 IC de 95% para la diferencia: (1,384; 5,430) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = 3,88 Valor P = 0,005 GL = 8 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 1,3871

115

(Cobre, Cu) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Tipo_Sem N Inferior Desv.Est. Superior Criolla 5 0,0428218 0,076488 0,264613 Importada 5 0,0928170 0,165788 0,573553 Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 0,21; valor p = 0,163 Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 2,62; valor p = 0,144 T de dos muestras para Cu Media del Error Tipo_Sem N Media Desv.Est. estándar Criolla 5 0,9112 0,0765 0,034 Importada 5 1,252 0,166 0,074 Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: -0,3405 IC de 95% para la diferencia: (-0,5287; -0,1522) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = -4,17 Valor P = 0,003 GL = 8 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,1291

(Manganeso, Mn) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Tipo_Sem N Inferior Desv.Est. Superior Criolla 5 0,0427172 0,0763009 0,263967 Importada 5 0,0194953 0,0348223 0,120469 Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 4,80; valor p = 0,158 Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 1,60; valor p = 0,241 T de dos muestras para Mn Media del Error Tipo_Sem N Media Desv.Est. estándar Criolla 5 3,8536 0,0763 0,034 Importada 5 3,1565 0,0348 0,016 Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: 0,6972 IC de 95% para la diferencia: (0,6107; 0,7837) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = 18,59 Valor P = 0,000 GL = 8 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,0593

116

(Fósforo, P) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares TipoSem N Inferior Desv.Est. Superior Criolla 3 0,607706 1,27213 11,3426 Importada 5 0,465943 0,83226 2,8792 Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 2,34; valor p = 0,425 Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 0,13; valor p = 0,733 T de dos muestras para P Media del Error TipoSem N Media Desv.Est. estándar Criolla 3 524,07 1,27 0,73 Importada 5 490,637 0,832 0,37 Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: 33,433 IC de 95% para la diferencia: (31,645; 35,221) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = 45,75 Valor P = 0,000 GL = 6 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 1,0006

(Selenio, Se) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares tipoSemilla N Inferior Desv.Est. Superior Criolla 3 0,0002440 0,0005108 0,0045542 Importada 3 0,0001800 0,0003769 0,0033604 Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 1,84; valor p = 0,705 Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 0,13; valor p = 0,736 T de dos muestras para Se Media del Error tipoSemilla N Media Desv.Est. estándar Criolla 3 0,025828 0,000511 0,00029 Importada 3 0,026167 0,000377 0,00022 Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: -0,000339 IC de 95% para la diferencia: (-0,001357; 0,000678) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = -0,93 Valor P = 0,407 GL = 4 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,0004

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Ácidos Grasos

(Palmítico) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares C1 N Inferior Desv.Est. Superior Criolla 2 0,0043334 0,0108236 0,69085 Import 2 0,0189799 0,0474063 3,02586 Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 0,05; valor p = 0,286 * NOTA * No se puede calcular la prueba de Levene para estos datos. T de dos muestras para Importada Media del Error C1 N Media Desv.Est. estándar Criolla 2 4,6313 0,0108 0,0077 Import 2 5,0428 0,0474 0,034 Diferencia = mu (Criolla) - mu (Import) Estimado de la diferencia: -0,4115 IC de 95% para la diferencia: (-0,5594; -0,2635) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = -11,97 Valor P = 0,007 GL = 2 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,0344

(Esteárico) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares C1 N Inferior Desv.Est. Superior Criolla 2 0,0076415 0,0190862 1,21824 Import 2 0,0269840 0,0673980 4,30189 Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 0,08; valor p = 0,351 * NOTA * No se puede calcular la prueba de Levene para estos datos. T de dos muestras para Esteárico Media del Error C1 N Media Desv.Est. estándar Criolla 2 2,7476 0,0191 0,013 Import 2 2,8556 0,0674 0,048 Diferencia = mu (Criolla) - mu (Import) Estimado de la diferencia: -0,1080 IC de 95% para la diferencia: (-0,3211; 0,1052) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = -2,18 Valor P = 0,161 GL = 2 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,0495

118

(Oleico) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares C1 N Inferior Desv.Est. Superior Criolla 2 0,181227 0,452652 28,8919 Import 2 0,205533 0,513361 32,7669 Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 0,78; valor p = 0,920 * NOTA * No se puede calcular la prueba de Levene para estos datos. T de dos muestras para Oleico Media del Error C1 N Media Desv.Est. estándar Criolla 2 14,216 0,453 0,32 Import 2 14,009 0,513 0,36 Diferencia = mu (Criolla) - mu (Import) Estimado de la diferencia: 0,206 IC de 95% para la diferencia: (-1,876; 2,289) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = 0,43 Valor P = 0,711 GL = 2 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,4840

(Linoleico) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares C1 N Inferior Desv.Est. Superior Criolla 2 0,0243214 0,0607478 3,87742 Import 2 0,0338351 0,0845100 5,39412 Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 0,52; valor p = 0,794 * NOTA * No se puede calcular la prueba de Levene para estos datos. T de dos muestras para Linoleico Media del Error C1 N Media Desv.Est. estándar Criolla 2 16,5002 0,0607 0,043 Import 2 16,5161 0,0845 0,060 Diferencia = mu (Criolla) - mu (Import) Estimado de la diferencia: -0,0159 IC de 95% para la diferencia: (-0,3325; 0,3008) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = -0,22 Valor P = 0,849 GL = 2 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,0736

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(α-linolénico) Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares C1 N Inferior Desv.Est. Superior Criolla 2 0,144931 0,361994 23,1054 Import 2 0,125734 0,314047 20,0450 Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 1,33; valor p = 0,910 * NOTA * No se puede calcular la prueba de Levene para estos datos. T de dos muestras para alfa-linolénico Media del Error C1 N Media Desv.Est. estándar Criolla 2 61,905 0,362 0,26 Import 2 61,576 0,314 0,22 Diferencia = mu (Criolla) - mu (Import) Estimado de la diferencia: 0,329 IC de 95% para la diferencia: (-1,129; 1,787) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = 0,97 Valor P = 0,434 GL = 2 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 0,3389

Polifenoles Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Semilla_tipo N Inferior Desv.Est. Superior Criolla 3 21,6206 45,2591 403,540 Importada 3 27,3032 57,1546 509,603 Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 0,63; valor p = 0,771 Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 0,12; valor p = 0,748 T de dos muestras para Polifenoles Media del Error Semilla_tipo N Media Desv.Est. estándar Criolla 3 1655,0 45,3 26 Importada 3 1435,0 57,2 33 Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: 220,0 IC de 95% para la diferencia: (103,1; 336,8) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = 5,23 Valor P = 0,006 GL = 4 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 51,5511

120

HCN Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para desviaciones estándares Sem_tipo N Inferior Desv.Est. Superior Criolla 5 0,44533 0,79545 2,75190 Importada 5 1,19891 2,14148 7,40854 Prueba F (distribución normal) Estadística de prueba = 0,14; valor p = 0,081 Prueba de Levene (cualquier distribución continua) Estadística de prueba = 1,87; valor p = 0,208 T de dos muestras para HCN Media del Error Sem_tipo N Media Desv.Est. estándar Criolla 5 37,619 0,795 0,36 Importada 5 39,38 2,14 0,96 Diferencia = mu (Criolla) - mu (Importada) Estimado de la diferencia: -1,76 IC de 95% para la diferencia: (-4,11; 0,60) Prueba T de diferencia = 0 (vs. no =): Valor T = -1,72 Valor P = 0,124 GL = 8 Ambos utilizan Desv.Est. agrupada = 1,6153

Capacidad Antioxidante

(EC50) 95% Bonferroni confidence intervals for standard deviations Muestra N Lower StDev Upper Criolla 3 0,057469 0,120301 1,07263 Imp 3 0,132013 0,276348 2,46398 F-Test (normal distribution) Test statistic = 0,19; p-value = 0,319 Levene's Test (any continuous distribution) Test statistic = 1,03; p-value = 0,368 Two-sample T for EC50 Muestra N Mean StDev SE Mean Criolla 3 6,571 0,120 0,069 Imp 3 3,879 0,276 0,16 Difference = mu (Criolla) - mu (Imp) Estimate for difference: 2,69240 95% CI for difference: (2,20927; 3,17553) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 15,47 P-Value = 0,000 DF = 4 Both use Pooled StDev = 0,2131

121

(TEC50) 95% Bonferroni confidence intervals for standard deviations Muestra N Lower StDev Upper Criolla 3 0,26211 0,5487 4,892 Imp 3 5,50864 11,5314 102,816 F-Test (normal distribution) Test statistic = 0,00; p-value = 0,005 Levene's Test (any continuous distribution) Test statistic = 2,06; p-value = 0,225 Two-sample T for TEC50 Muestra N Mean StDev SE Mean Criolla 3 112,139 0,549 0,32 Imp 3 115,2 11,5 6,7 Difference = mu (Criolla) - mu (Imp) Estimate for difference: -3,06733 95% CI for difference: (-31,74530; 25,61064) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -0,46 P-Value = 0,691 DF = 2

(AE) 95% Bonferroni confidence intervals for standard deviations Muestra N Lower StDev Upper Criolla 3 0,0000130 0,0000271 0,0002417 Imp 3 0,0000788 0,0001649 0,0014707 F-Test (normal distribution) Test statistic = 0,03; p-value = 0,053 Levene's Test (any continuous distribution) Test statistic = 0,80; p-value = 0,422 Two-sample T for AE Muestra N Mean StDev SE Mean Criolla 3 0,0013574 0,0000271 0,000016 Imp 3 0,002253 0,000165 0,000095 Difference = mu (Criolla) - mu (Imp) Estimate for difference: -0,000896 95% CI for difference: (-0,001164; -0,000628) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -9,28 P-Value = 0,001 DF = 4 Both use Pooled StDev = 0,0001

122

Anexo 3. Resultados de los análisis estadísticos aplicados: ANOVA multifactorial para mucílago y grasa en semillas procesadas.

Mucílago en Semillas Procesadas Analysis of Variance for Mucilago_Semilla - Type I Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Tipo 0,474067 1 0,474067 0,20 0,6661 B:Procesamiento 28,4204 3 9,47346 4,01 0,0517 INTERACTIONS AB 16,0962 3 5,3654 2,27 0,1574 RESIDUAL 18,9086 8 2,36357 TOTAL (CORRECTED) 63,8992 15 All F-ratios are based on the residual mean square error.

Grasa en Semillas Procesadas Analysis of Variance for Col_3 - Type I Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Tipo 108,93 1 108,93 10,63 0,0311 B:Procesamiento 1,72934 1 1,72934 0,17 0,7023 INTERACTIONS AB 2,14235 1 2,14235 0,21 0,6712 RESIDUAL 40,9871 4 10,2468 TOTAL (CORRECTED) 153,788 7 All F-ratios are based on the residual mean square error. Multiple Range Tests for Col_3 by Tipo Method: 95,0 percent Duncan Tipo Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups Nacional 4 34,4754 1,60053 X Importada 4 41,8554 1,60053 X Contrast Sig. Difference Importada - Nacional * 7,38003 * denotes a statistically significant difference.

123

Anexo 4. Resultados de los análisis estadísticos aplicados para la evaluación de polifenoles en semillas procesadas. Analysis of Variance for Polifenoles - Type I Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Tipo 547381, 1 547381, 197,55 0,0000 B:Procesamiento 1,62427E6 5 324854, 117,24 0,0000 INTERACTIONS AB 182803, 5 36560,6 13,19 0,0002 RESIDUAL 33250,0 12 2770,83 TOTAL (CORRECTED) 2,38771E6 23 All F-ratios are based on the residual mean square error. Variance Check Test P-Value Bartlett's 3,14626 0,520932 ANOVA Table for Polifenoles by Col_4 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2,35446E6 11 214041, 77,25 0,0000 Within groups 33250,0 12 2770,83 Total (Corr.) 2,38771E6 23 Multiple Range Tests for Respuesta by Factor Method: 95,0 percent Duncan Col_4 Count Mean Homogeneous Groups Xii 2 425,049 X II 2 560,023 X VI 2 580,912 X Viii 2 819,515 X I 2 830,025 X VII 2 831,275 X Xi 2 871,334 X IV 2 917,335 X iX 2 1049,18 X X 2 1270,64 X V 2 1286,49 X III 2 1540,94 X

Contrast Sig. Difference I - II <* 270,002 I - III <* -710,92 I - IV -87,3099 I - V <* -456,465 I - VI <* 249,113 I - VII -1,24985 I - Viii 10,5099 I - X <* -440,611 I - Xi -41,3091 I - Xii <* 404,976 I - iX <* -219,155 II - III <* -980,922

124

II - IV <* -357,312 II - V <* -726,467 II - VI -20,8887 II - VII <* -271,252 II - Viii <* -259,492 II - X <* -710,613 II - Xi <* -311,311 II - Xii <* 134,974 II - iX <* -489,157 III - IV <* 623,61 III - V <* 254,455 III - VI <* 960,033 III - VII <* 709,67 III - Viii <* 721,429 III - X <* 270,309 III - Xi <* 669,61 III - Xii <* 1115,9 III - iX <* 491,764 IV - V <* -369,155 IV - VI <* 336,423 IV - VII 86,06 IV - Viii 97,8197 IV - X <* -353,301 IV - Xi 46,0007 IV - Xii <* 492,286 IV - iX <* -131,845 V - VI <* 705,578 V - VII <* 455,215 V - Viii <* 466,975 V - X 15,8541 V - Xi <* 415,156 V - Xii <* 861,441 V - iX <* 237,31 VI - VII <* -250,363 VI - Viii <* -238,603 VI - X <* -689,724 VI - Xi <* -290,422 VI - Xii <* 155,863 VI - iX <* -468,269 VII - Viii 11,7598 VII - X <* -439,361 VII - Xi -40,0593 VII - Xii <* 406,226 VII - iX <* -217,905 Viii - X <* -451,121 Viii - Xi -51,819 Viii - Xii <* 394,466 Viii - iX <* -229,665 X - Xi <* 399,302 X - Xii <* 845,587 X - iX <* 221,456 Xi - Xii <* 446,285 Xi - iX <* -177,846 Xii - iX <* -624,132 * denotes a statistically significant difference.

125

Anexo 5. Resultados de los análisis estadísticos aplicados para la evaluación de HCN en semillas procesadas. Analysis of Variance for HCN - Type I Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Tipo 2,36674 1 2,36674 1,23 0,2887 B:Procesamiento 829,255 5 165,851 86,35 0,0000 INTERACTIONS AB 1541,68 5 308,336 160,53 0,0000 RESIDUAL 23,0494 12 1,92079 TOTAL (CORRECTED) 2396,35 23 All F-ratios are based on the residual mean square error. Variance Check Test P-Value Bartlett's 3,57471 0,416622 ANOVA Table for Respuesta by Factor Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2373,3 11 215,755 112,33 0,0000 Within groups 23,0494 12 1,92079 Total (Corr.) 2396,35 23 Multiple Range Tests for Respuesta by Factor Method: 95,0 percent Duncan Factor Count Mean Homogeneous Groups iX 2 7,17355 X VII 2 7,41095 X VI 2 8,7236 X II 2 8,84845 X Xi 2 9,71845 X III 2 14,8618 X X 2 15,8383 XX I 2 18,0622 X Viii 2 22,7546 X Xii 2 23,7015 X V 2 29,2056 X IV 2 41,0217 X Contrast Sig. Difference I - II <* 9,2138 I - III <* 3,2005 I - IV <* -22,9595 I - V <* -11,1433 I - VI <* 9,33865 I - VII <* 10,6513 I - Viii <* -4,6923 I - X 2,22395 I - Xi <* 8,3438 I - Xii <* -5,63925 I - iX <* 10,8887 II - III <* -6,0133 II - IV <* -32,1733 II - V <* -20,3571

126

II - VI 0,12485 II - VII 1,4375 II - Viii <* -13,9061 II - X <* -6,98985 II - Xi -0,87 II - Xii <* -14,8531 II - iX 1,6749 III - IV <* -26,16 III - V <* -14,3438 III - VI <* 6,13815 III - VII <* 7,4508 III - Viii <* -7,8928 III - X -0,97655 III - Xi <* 5,1433 III - Xii <* -8,83975 III - iX <* 7,6882 IV - V <* 11,8161 IV - VI <* 32,2981 IV - VII <* 33,6108 IV - Viii <* 18,2672 IV - X <* 25,1834 IV - Xi <* 31,3033 IV - Xii <* 17,3202 IV - iX <* 33,8482 V - VI <* 20,482 V - VII <* 21,7946 V - Viii <* 6,45105 V - X <* 13,3673 V - Xi <* 19,4871 V - Xii <* 5,5041 V - iX <* 22,032 VI - VII 1,31265 VI - Viii <* -14,031 VI - X <* -7,1147 VI - Xi -0,99485 VI - Xii <* -14,9779 VI - iX 1,55005 VII - Viii <* -15,3436 VII - X <* -8,42735 VII - Xi -2,3075 VII - Xii <* -16,2906 VII - iX 0,2374 Viii - X <* 6,91625 Viii - Xi <* 13,0361 Viii - Xii -0,94695 Viii - iX <* 15,581 X - Xi <* 6,11985 X - Xii <* -7,8632 X - iX <* 8,66475 Xi - Xii <* -13,983 Xi - iX 2,5449 Xii - iX <* 16,5279 * denotes a statistically significant difference.

127

Anexo 6. Resultados de los análisis estadísticos aplicados para la evaluación de la Capacidad Antioxidante en semillas procesadas.

6.1. EC50

Analysis of Variance for EC50 - Type I Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Procesamiento 72,0412 5 14,4082 52,51 0,0000 B:Tipo 29,843 1 29,843 108,75 0,0000 INTERACTIONS AB 161,428 5 32,2857 117,65 0,0000 RESIDUAL 3,29298 12 0,274415 TOTAL (CORRECTED) 266,605 23 All F-ratios are based on the residual mean square error.

Variance Check Test P-Value Bartlett's 4,75724 0,247106 ANOVA Table for EC50 by Factor_Unifactorial Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 263,312 11 23,9375 87,23 0,0000 Within groups 3,29298 12 0,274415 Total (Corr.) 266,605 23 Multiple Range Tests for EC50 by Factor_Unifactorial Method: 95,0 percent Duncan Level Count Mean Homogeneous Groups IV 2 1,62925 X V 2 4,845 X Viii 2 5,75 X Xi 2 7,0125 X I 2 7,245 X III 2 7,491 X Xii 2 7,58 X VI 2 7,99 X VII 2 10,28 X iX 2 10,74 XX II 2 11,1825 XX X 2 11,5925 X Contrast Sig. Difference I - II <* -3,9375 I - III <* 5,9645 I - IV <* 5,61575 I - V <* 2,4 I - VI -0,745 I - VII <* -3,035 I - Viii <* 1,495 I - X <* -4,3475 I - Xi 0,2325 I - Xii -0,335

128

I - iX <* -3,495 II - III <* 9,902 II - IV <* 9,55325 II - V <* 6,3375 II - VI <* 3,1925 II - VII 0,9025 II - Viii <* 5,4325 II - X -0,41 II - Xi <* 4,17 II - Xii <* 3,6025 II - iX 0,4425 III - IV -0,34875 III - V <* -3,5645 III - VI <* -6,7095 III - VII <* -8,9995 III - Viii <* -4,4695 III - X <* -10,312 III - Xi <* -5,732 III - Xii <* -6,2995 III - iX <* -9,4595 IV - V <* -3,21575 IV - VI <* -6,36075 IV - VII <* -8,65075 IV - Viii <* -4,12075 IV - X <* -9,96325 IV - Xi <* -5,38325 IV - Xii <* -5,95075 IV - iX <* -9,11075 V - VI <* -3,145 V - VII <* -5,435 V - Viii -0,905 V - X <* -6,7475 V - Xi <* -2,1675 V - Xii <* -2,735 V - iX <* -5,895 VI - VII <* -2,29 VI - Viii <* 2,24 VI - X <* -3,6025 VI - Xi 0,9775 VI - Xii 0,41 VI - iX <* -2,75 VII - Viii <* 4,53 VII - X <* -1,3125 VII - Xi <* 3,2675 VII - Xii <* 2,7 VII - iX -0,46 Viii - X <* -5,8425 Viii - Xi <* -1,2625 Viii - Xii <* -1,83 Viii - iX <* -4,99 X - Xi <* 4,58 X - Xii <* 4,0125 X - iX 0,8525 Xi - Xii -0,5675 Xi - iX <* -3,7275 Xii - iX <* -3,16 * denotes a statistically significant difference.

129

6.2. TEC50 Analysis of Variance for Tec50 - Type I Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Procesamiento 4286,28 5 857,257 5,96 0,0054 B:Tipo 837,229 1 837,229 5,82 0,0328 INTERACTIONS AB 5419,11 5 1083,82 7,53 0,0021 RESIDUAL 1727,38 12 143,948 TOTAL (CORRECTED) 12270,0 23 All F-ratios are based on the residual mean square error. Variance Check Test P-Value Bartlett's 10,4431 0,368126 ANOVA Table for Tec50 by Factor_Unifactorial Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 10542,6 11 958,421 6,66 0,0014 Within groups 1727,38 12 143,948 Total (Corr.) 12270,0 23

Multiple Range Tests for Tec50 by Factor_Unifactorial Method: 95,0 percent Duncan Level Count Mean Homogeneous Groups IV 2 87,8121 X Xi 2 90,3035 XX VI 2 94,8102 XX VII 2 95,231 XX Viii 2 95,3354 XX Xii 2 100,91 XX I 2 103,482 XX III 2 105,407 XX X 2 111,565 XX iX 2 115,042 XX II 2 118,141 X V 2 169,775 X Contrast Sig. Difference I - II -14,6598 I - III -1,92535 I - IV 15,6696 I - V <* -66,2938 I - VI 8,67145 I - VII 8,25065 I - Viii 8,14625 I - X -8,0831 I - Xi 13,1781 I - Xii 2,57135 I - iX -11,5608 II - III 12,7345 II - IV <* 30,3294 II - V <* -51,634 II - VI 23,3313 II - VII 22,9105

130

II - Viii 22,8061 II - X 6,57672 II - Xi 27,8379 II - Xii 17,2312 II - iX 3,09897 III - IV 17,5949 III - V <* -64,3685 III - VI 10,5968 III - VII 10,176 III - Viii 10,0716 III - X -6,15775 III - Xi 15,1035 III - Xii 4,4967 III - iX -9,6355 IV - V <* -81,9634 IV - VI -6,9981 IV - VII -7,4189 IV - Viii -7,5233 IV - X -23,7527 IV - Xi -2,49143 IV - Xii -13,0982 IV - iX -27,2304 V - VI <* 74,9653 V - VII <* 74,5445 V - Viii <* 74,4401 V - X <* 58,2107 V - Xi <* 79,472 V - Xii <* 68,8652 V - iX <* 54,733 VI - VII -0,4208 VI - Viii -0,5252 VI - X -16,7545 VI - Xi 4,50667 VI - Xii -6,1001 VI - iX -20,2323 VII - Viii -0,1044 VII - X -16,3338 VII - Xi 4,92746 VII - Xii -5,6793 VII - iX -19,8115 Viii - X -16,2294 Viii - Xi 5,03186 Viii - Xii -5,5749 Viii - iX -19,7071 X - Xi 21,2612 X - Xii 10,6544 X - iX -3,47775 Xi - Xii -10,6068 Xi - iX -24,739 Xii - iX -14,1322 * denotes a statistically significant difference.

131

6.3. Eficiencia Antiradical (EA)

Analysis of Variance for AE - Type I Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Procesamiento 50,6309 5 10,1262 31,83 0,0000 B:Tipo 0,562342 1 0,562342 1,77 0,2084 INTERACTIONS AB 77,2437 5 15,4487 48,56 0,0000 RESIDUAL 3,81774 12 0,318145 TOTAL (CORRECTED) 132,255 23 All F-ratios are based on the residual mean square error. Variance Check Test P-Value Bartlett's 19,5567 0,0603095

ANOVA Table for AE by Factor_Unifactorial Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 128,437 11 11,6761 36,70 0,0000 Within groups 3,81774 12 0,318145 Total (Corr.) 132,255 23 Multiple Range Tests for AE by Factor_Unifactorial Method: 95,0 percent Duncan Level Count Mean Homogeneous Groups X 2 0,77517 X iX 2 0,814765 X II 2 0,82874 X VII 2 1,02845 X V 2 1,22375 X III 2 1,28043 X Xii 2 1,30995 X VI 2 1,3204 X I 2 1,35689 X Xi 2 1,58855 X Viii 2 1,8488 X IV 2 7,22743 X Contrast Sig. Difference I - II 0,528145 I - III <* -6,13737 I - IV <* -5,87054 I - V 0,13314 I - VI 0,036485 I - VII 0,328435 I - Viii -0,491915 I - X 0,581715 I - Xi -0,231665 I - Xii 0,046935 I - iX 0,54212 II - III <* -6,66551 II - IV <* -6,39869 II - V -0,395005 II - VI -0,49166 II - VII -0,19971

132

II - Viii -1,02006 II - X 0,05357 II - Xi -0,75981 II - Xii -0,48121 II - iX 0,013975 III - IV 0,266825 III - V <* 6,27051 III - VI <* 6,17385 III - VII <* 6,4658 III - Viii <* 5,64545 III - X <* 6,71908 III - Xi <* 5,9057 III - Xii <* 6,1843 III - iX <* 6,67948 IV - V <* 6,00368 IV - VI <* 5,90703 IV - VII <* 6,19898 IV - Viii <* 5,37863 IV - X <* 6,45226 IV - Xi <* 5,63888 IV - Xii <* 5,91747 IV - iX <* 6,41266 V - VI -0,096655 V - VII 0,195295 V - Viii -0,625055 V - X 0,448575 V - Xi -0,364805 V - Xii -0,086205 V - iX 0,40898 VI - VII 0,29195 VI - Viii -0,5284 VI - X 0,54523 VI - Xi -0,26815 VI - Xii 0,01045 VI - iX 0,505635 VII - Viii -0,82035 VII - X 0,25328 VII - Xi -0,5601 VII - Xii -0,2815 VII - iX 0,213685 Viii - X 1,07363 Viii - Xi 0,26025 Viii - Xii 0,53885 Viii - iX 1,03404 X - Xi -0,81338 X - Xii -0,53478 X - iX -0,039595 Xi - Xii 0,2786 Xi - iX 0,773785 Xii - iX 0,495185 * denotes a statistically significant difference.

133

Anexo 7. Resultados de los análisis estadísticos aplicados para la evaluación del contenido de Polifenoles en los extractos de los procesamientos. Analysis of Variance for Polifenoles - Type I Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Tipo 768,912 1 768,912 11,98 0,0135 B:Procesamiento 1841,42 2 920,71 14,34 0,0052 RESIDUAL 385,164 6 64,194 TOTAL (CORRECTED) 2995,5 9 All F-ratios are based on the residual mean square error. Variance Check Test P-Value Levene's 4,44095E29 0,082575 ANOVA Table for Polifenoles by Col_4 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2611,8 4 652,949 8,51 0,0187 Within groups 383,7 5 76,74 Total (Corr.) 2995,5 9 Multiple Range Tests for Polifenoles by Col_4 Method: 95,0 percent Duncan Col_4 Count Mean Homogeneous Groups Xi 2 48,7125 X I 2 57,3119 X II 2 67,4368 XX iX 2 81,6257 XX VI 2 93,4616 X Contrast Sig. Difference I - II -10,1248 I - VI <* -36,1497 I - Xi 8,59945 I - iX <* -24,3137 II - VI <* -26,0249 II - Xi 18,7243 II - iX -14,1889 VI - Xi <* 44,7491 VI - iX 11,836 Xi - iX <* -32,9132 * denotes a statistically significant difference.

134

Anexo 8. Resultados de los análisis estadísticos aplicados para la evaluación del contenido de HCN en los extractos de los procesamientos.

Analysis of Variance for HCN - Type I Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Tipo 19,9923 1 19,9923 11,48 0,0069 B:Procesamiento 465,029 4 116,257 66,75 0,0000 INTERACTIONS AB 55,9081 4 13,977 8,02 0,0036 RESIDUAL 17,4176 10 1,74176 TOTAL (CORRECTED) 558,347 19 All F-ratios are based on the residual mean square error.

Variance Check Test P-Value Bartlett's 7,46906 0,10496 ANOVA Table for HCN by Factor UNI Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 540,929 9 60,1033 34,51 0,0000 Within groups 17,4176 10 1,74176 Total (Corr.) 558,347 19 Multiple Range Tests for HCN by Factor UNI Method: 95,0 percent Duncan Factor UNI Count Mean Homogeneous Groups Xi 2 2,24332 X IV 2 3,80545 X iX 2 6,85285 X VI 2 6,97315 X X 2 8,04185 XX VII 2 8,35679 XX III 2 8,9769 XX V 2 11,0056 XX II 2 13,648 X I 2 21,7446 X Contrast Sig. Difference I - II <* 8,0966 I - III <* 12,7677 I - IV <* 17,9391 I - V <* 10,7389 I - VI <* 14,7714 I - VII <* 13,3878 I - X <* 13,7027 I - Xi <* 19,5012 I - iX <* 14,8917 II - III <* 4,67105 II - IV <* 9,8425 II - V 2,6423 II - VI <* 6,6748 II - VII <* 5,29116 II - X <* 5,6061

135

II - Xi <* 11,4046 II - iX <* 6,7951 III - IV <* 5,17145 III - V -2,02875 III - VI 2,00375 III - VII 0,620106 III - X 0,935047 III - Xi <* 6,73358 III - iX 2,12405 IV - V <* -7,2002 IV - VI <* -3,1677 IV - VII <* -4,55135 IV - X <* -4,23641 IV - Xi 1,56213 IV - iX <* -3,0474 V - VI <* 4,0325 V - VII 2,64886 V - X 2,9638 V - Xi <* 8,76233 V - iX <* 4,1528 VI - VII -1,38364 VI - X -1,0687 VI - Xi <* 4,72983 VI - iX 0,1203 VII - X 0,314941 VII - Xi <* 6,11348 VII - iX 1,50394 X - Xi <* 5,79854 X - iX 1,189 Xi - iX <* -4,60953 * denotes a statistically significant difference.

136

Anexo 9. Resultados de los análisis estadísticos aplicados para la evaluación de la Capacidad Antioxidante en los extractos de los procesamientos.

9.1. EC50

Analysis of Variance for EC50 - Type I Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Procesamiento 290,52 4 72,6299 27,25 0,0000 B:Tipo 39,0042 1 39,0042 14,63 0,0033 INTERACTIONS AB 115,527 4 28,8818 10,83 0,0012 RESIDUAL 26,657 10 2,6657 TOTAL (CORRECTED) 471,708 19 All F-ratios are based on the residual mean square error. Variance Check Test P-Value Bartlett's 3,81471 0,367203 ANOVA Table for EC50 by f_unifactorial Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 445,051 9 49,4501 18,55 0,0000 Within groups 26,657 10 2,6657 Total (Corr.) 471,708 19 Multiple Range Tests for EC50 by f_unifactorial Method: 95,0 percent Duncan f_unifactorial Count Mean Homogeneous Groups IV 2 3,98 X Xi 2 6,11 XX X 2 8,19 XX I 2 9,34 XXX VII 2 10,95 XXX III 2 13,125 XXX II 2 13,655 XX VI 2 14,06 XX iX 2 14,97 X V 2 21,255 X Contrast Sig. Difference I - II <* -4,315 I - III -3,785 I - IV <* 5,36 I - V <* -11,915 I - VI <* -4,72 I - VII -1,61 I - X 1,15 I - Xi 3,23 I - iX <* -5,63 II - III 0,53 II - IV <* 9,675 II - V <* -7,6 II - VI -0,405 II - VII 2,705 II - X <* 5,465

137

II - Xi <* 7,545 II - iX -1,315 III - IV <* 9,145 III - V <* -8,13 III - VI -0,935 III - VII 2,175 III - X <* 4,935 III - Xi <* 7,015 III - iX -1,845 IV - V <* -17,275 IV - VI <* -10,08 IV - VII <* -6,97 IV - X <* -4,21 IV - Xi -2,13 IV - iX <* -10,99 V - VI <* 7,195 V - VII <* 10,305 V - X <* 13,065 V - Xi <* 15,145 V - iX <* 6,285 VI - VII 3,11 VI - X <* 5,87 VI - Xi <* 7,95 VI - iX -0,91 VII - X 2,76 VII - Xi <* 4,84 VII - iX <* -4,02 X - Xi 2,08 X - iX <* -6,78 Xi - iX <* -8,86 * denotes a statistically significant difference. 9.2. TEC50

Analysis of Variance for T ec50 - Type I Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Procesamiento 23797,2 4 5949,3 101,89 0,0000 B:Tipo 1557,83 1 1557,83 26,68 0,0004 INTERACTIONS AB 862,081 4 215,52 3,69 0,0427 RESIDUAL 583,885 10 58,3885 TOTAL (CORRECTED) 26801,0 19 All F-ratios are based on the residual mean square error.

Variance Check Test P-Value Bartlett's 8,58976 0,0726061 ANOVA Table for T ec50 by f_unifactorial Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 26217,1 9 2913,01 49,89 0,0000 Within groups 583,885 10 58,3885 Total (Corr.) 26801,0 19

138

Multiple Range Tests for T ec50 by f_unifactorial Method: 95,0 percent Duncan f_unifactorial Count Mean Homogeneous Groups III 2 40,9693 X VII 2 55,5549 X X 2 55,8562 X V 2 58,3007 X I 2 107,602 X iX 2 108,725 X Xi 2 112,165 X VI 2 122,575 XX II 2 133,235 XX IV 2 148,796 X Contrast Sig. Difference I - II <* -25,6338 I - III <* 66,6322 I - IV <* -41,1945 I - V <* 49,3008 I - VI -14,9735 I - VII <* 52,0466 I - X <* 51,7454 I - Xi -4,5635 I - iX -1,123 II - III <* 92,266 II - IV -15,5607 II - V <* 74,9345 II - VI 10,6603 II - VII <* 77,6804 II - X <* 77,3791 II - Xi <* 21,0703 II - iX <* 24,5108 III - IV <* -107,827 III - V -17,3314 III - VI <* -81,6057 III - VII -14,5856 III - X -14,8868 III - Xi <* -71,1957 III - iX <* -67,7552 IV - V <* 90,4952 IV - VI <* 26,221 IV - VII <* 93,2411 IV - X <* 92,9398 IV - Xi <* 36,631 IV - iX <* 40,0715 V - VI <* -64,2742 V - VII 2,74585 V - X 2,4446 V - Xi <* -53,8642 V - iX <* -50,4238 VI - VII <* 67,0201 VI - X <* 66,7188 VI - Xi 10,41 VI - iX 13,8505 VII - X -0,30125 VII - Xi <* -56,6101 VII - iX <* -53,1696

139

X - Xi <* -56,3088 X - iX <* -52,8684 Xi - iX 3,4405 * denotes a statistically significant difference.

9.3. Eficiencia Antiradical (EA)

Analysis of Variance for AE - Type I Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Tipo 0,196654 1 0,196654 8,90 0,0137 B:Procesamiento 5,8265 4 1,45662 65,92 0,0000 INTERACTIONS AB 0,90771 4 0,226928 10,27 0,0014 RESIDUAL 0,220983 10 0,0220983 TOTAL (CORRECTED) 7,15185 19 All F-ratios are based on the residual mean square error.

Variance Check Test P-Value Bartlett's 6,76108 0,122886 ANOVA Table for AE by f_unifactorial Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 6,93086 9 0,770096 34,85 0,0000 Within groups 0,220983 10 0,0220983 Total (Corr.) 7,15185 19

Multiple Range Tests for AE by f_unifactorial Method: 95,0 percent Duncan f_unifactorial Count Mean Homogeneous Groups II 2 0,5643 X VI 2 0,58185 X iX 2 0,6174 X V 2 0,81385 XX I 2 1,00625 X Xi 2 1,45935 X VII 2 1,64435 XX IV 2 1,69455 XX III 2 1,89125 X X 2 2,29465 X Contrast Sig. Difference I - II <* 0,44195 I - III <* -0,885 I - IV <* -0,6883 I - V 0,1924 I - VI <* 0,4244 I - VII <* -0,6381 I - X <* -1,2884 I - Xi <* -0,4531 I - iX <* 0,38885 II - III <* -1,32695

140

II - IV <* -1,13025 II - V -0,24955 II - VI -0,01755 II - VII <* -1,08005 II - X <* -1,73035 II - Xi <* -0,89505 II - iX -0,0531 III - IV 0,1967 III - V <* 1,0774 III - VI <* 1,3094 III - VII 0,2469 III - X <* -0,4034 III - Xi <* 0,4319 III - iX <* 1,27385 IV - V <* 0,8807 IV - VI <* 1,1127 IV - VII 0,0502 IV - X <* -0,6001 IV - Xi 0,2352 IV - iX <* 1,07715 V - VI 0,232 V - VII <* -0,8305 V - X <* -1,4808 V - Xi <* -0,6455 V - iX 0,19645 VI - VII <* -1,0625 VI - X <* -1,7128 VI - Xi <* -0,8775 VI - iX -0,03555 VII - X <* -0,6503 VII - Xi 0,185 VII - iX <* 1,02695 X - Xi <* 0,8353 X - iX <* 1,67725 Xi - iX <* 0,84195 * denotes a statistically significant difference.