Efectos de la aplicación del fragmento Hc-TeTx de la ...
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Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Unidad de Bioquímica de Medicina Efectos de la aplicación del fragmento Hc-TeTx de la toxina tetánica sobre un modelo in vivo de degeneración dopaminérgica Natalia Moreno Galarza TESIS DOCTORAL Bellaterra 2010
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Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
Unidad de Bioquímica de Medicina
Efectos de la aplicación del fragmento Hc-TeTx de la
toxina tetánica sobre un modelo in vivo de
degeneración dopaminérgica
Natalia Moreno Galarza
TESIS DOCTORAL
Bellaterra 2010
Efectos de la aplicación del fragmento Hc-TeTx de la toxina tetánica sobre
un modelo in vivo de degeneración dopaminérgica
Memoria de tesis doctoral presentada por Natalia Moreno Galarza para optar al
grado de doctor en Bioquímica y Biología Molecular por la Universidad
Autónoma de Barcelona
Trabajo realizado en la unidad de Bioquímica de Medicina en el Departamento
de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad Autónoma de Barcelona,
bajo la dirección de los Doctores José Aguilera Ávila y Carles Gil Giró.
Proyecto subvencionado por el Ministerio de Educación y Ciencia SAF2006-15184.
Bellaterra, 22 de Noviembre de 2010
Doctorando Director Director
Natalia Moreno Galarza Dr. José Aguilera Ávila Dr. Carles Gil Giró
A mis amores:
los grandes,
los chiquitos y
los peludos.
Los ejes de mi carreta Porque no engraso los ejes
me llaman abandonao´...
Si a mí me gusta que
suenen,
¿Pa´ qué los quiero
engrasaos?
…
Los ejes de mi carreta
nunca los voy a engrasar.
Atahualpa Yupanqui
Agradecimientos
Agradecimientos
Agradezco al Ministerio de Ciencia e Innovación del Gobierno de España (MICINN) la
financiación de la investigación llevada a cabo en esta tesis doctoral, a través del
proyecto “Caracterización de la acción neurotrófica del fragmento C-terminal de la
toxina tetánica. Evaluación de la capacidad terapéutica en el tratamiento de
enfermedades neurodegenerativas”. SAF2006-15184.
Asimismo, quisiera agradecer a los doctores José Aguilera y Carles Gil la oportunidad
que me han dado de participar en esta investigación, permitiéndome obtener al fin la
llave que abrirá la puerta de mi futuro.
Doy gracias a todos los compañeros y jefes del Departamento y del Institut de
Neurociències que han participado de alguna manera en la elaboración de mi tesis,
sea con consejos que con material, haciendo un trabajo al estilo Fuenteovejuna.
También, y de manera especial, me gustaría mencionar a todos los que no me habéis
prestado ayuda, porque como decía mi abuelita Delia, de todo se aprende.
Agradecimientos
Índice
i
Índice
Índice ............................................................................................................................... i
Abreviaturas .................................................................................................................... v
Resumen ......................................................................................................................... vii
I- INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 1
1. Toxina tetánica (TeTx) y fragmento C de la toxina tetánica (Hc-TeTx) ………………. 3
1.1. La toxina tetánica …………………………………………………..…………………… 3
1.1.1. Origen y estructura molecular ………………………….…………………….. 3
1.1.2. Proceso de intoxicación ………………………………………………............ 3
1.2. El fragmento C de la toxina tetánica (Hc-TeTx) .………………………………….... 7
1.2.1. Estructura del fragmento Hc-TeTx …………………………………….....….. 7
1.2.2. Efectos del fragmento Hc-TeTx sobre vías de señalización ...…................ 9
1.2.2.1. Neurotrofinas, receptores y cascadas de señalización ....................... 9
1.2.2.2. Efectos del fragmento Hc-TeTx y vías de señalización........................ 11
2. La enfermedad de Parkinson ........................................................................................ 13
2.1. Descubrimiento y epidemiología ............................................................................ 13
2.2. Histopatología de la EP ......................................................................................... 14
2.3. Anatomía y fisiología de los ganglios basales. Fisiopatología de la EP ................. 15
2.3.1. Neurotransmisores de los ganglios basales ............................................... 18
2.3.1.1. Dopamina ........................................................................................... 18
2.4. Sintomatología clínica …………………………………………………………………. 21
2.5. Causas y factores de riesgo putativos relacionados con la EP …………………… 21
2.6. Diagnóstico y terapia en la EP ………………………………………………………... 29
3. Modelos experimentales de la enfermedad de Parkinson. Parkinsonismo ................ 31
3.1. Modelos celulares.................................................................................................. 31
3.2. Modelos animales.................................................................................................. 33
Índice
ii
3.2.1. Modelos genéticos ..................................................................................... 33
3.2.2. Modelos basados en la utilización de toxinas ……………………………… . 34
3.2.2.1. MPTP(1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina) .................................. 34
3.2.2.2. 6-Hidroxidopamina (6-OHDA) ............................................................. 39
3.2.2.3. Paraquat y Maneb .............................................................................. 40
3.2.2.4. Rotenona ............................................................................................ 42
3.2.2.5. Lipopolisacárido (LPS) ....................................................................... 44
II- OBJETIVOS ................................................................................................................. 45
III- MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................ 49
1. Obtención del fragmento Hc de la toxina tetánica ....................................................... 51
1.1. Crecimiento bacteriano.......................................................................................... 51
1.2. Purificación del fragmento Hc-TeTx....................................................................... 52
1.3. Comprobación, diálisis y cuantificación de la proteína ........................................... 52
2. Estudio de la captación de sustancias en sinaptosomas provenientes de núcleo
estriado de rata ............................................................................................................... 54
2.1. Animales ............................................................................................................... 54
2.2. Obtención de la fracción sinaptosomal de núcleo estriado de rata ....................... 55
2.3. Determinación radiométrica del transporte de 3H-DA en sinaptosomas de núcleo
estriado de rata .................................................................................................... 56
2.3.1. Determinación de las constantes cinéticas del sistema de transporte
dopaminérgico. Curvas de saturación ................................................................... 56
2.3.1.1. Análisis del efecto producido por el pre-tratamiento con Hc-TeTx
sobre las constantes cinéticas del transporte de dopamina ................ 58
2.3.2. Ensayos de captación de dopamina a una concentración invariable .......... 59
2.3.2.1. Efecto del fragmento Hc-TeTx sobre el transporte de DA .................... 59
2.3.2.2. Efecto del fragmento Hc-TeTx sobre el transporte de DA, previo
tratamiento con MPP+ ......................................................................... 59
2.4. Determinación radiométrica del transporte de 3H-MPP+ en sinaptosomas ............. 59
2.5. Análisis de los datos obtenidos mediante determinación radiométrica .................. 61
Índice
iii
3. Estudios in vivo del efecto producido por el fragmento Hc-TeTx ............................... 61
3.1. Animales y diseño experimental ............................................................................ 61
3.2. Técnicas de administración de sustancias ............................................................ 62
3.3. Sacrificio de animales ........................................................................................... 65
3.4. Procedimientos experimentales ............................................................................ 66
3.4.1. Western blot ............................................................................................. 66
3.4.2. HPLC ........................................................................................................ 69
3.4.3. Histología, histoquímica e inmunohistoquímica ......................................... 71
3.4.3.1. Tinción histoquímica con azul de toluidina .......................................... 72
3.4.3.2. Detección de tirosina hidroxilasa en núcleo estriado .......................... 75
3.4.3.3. Detección del transportador vesicular de glutamato, V-Glut, en núcleo
estriado ............................................................................................. 77
3.4.3.4. Detección de colina acetiltransferasa, ChAT, en núcleo estriado ........ 78
3.4.3.5. Detección de tirosina hidroxilasa en substantia nigra y tinción
histológica con Fluoro-Jade B ............................................................ 79
3.4.4. Hibridación in situ ..................................................................................... 82
4. Estudio del estado de fosforilación del enzima TH ..................................................... 84
5. Análisis estadístico ....................................................................................................... 84
IV- RESULTADOS .................................................................................................... 85
1. Aplicación estereotáxica de la neurotoxina MPP+ en el núcleo estriado.
Caracterización del modelo in vivo .............................................................................. 87
1.1. Efecto a lo largo del tiempo de la inyección intraestriatal de MPP+ en rata adulta,
sobre los niveles de catecolaminas y sus metabolitos, en el núcleo estriado ........ 87
1.2. Efecto de la inyección estereotáxica de MPP+ en el núcleo estriado 5 días post-
lesión, sobre los niveles de TH, ChAT y VGlut ..................................................... 90
2. Estudio del efecto derivado de la aplicación del fragmento Hc-TeTx en el modelo
in vivo previamente caracterizado ................................................................................ 94
2.1. Efecto producido por el cotratamiento con MPP+ y el fragmento Hc-TeTx, ambos
aplicados estereotáxicamente, sobre los niveles estriatales de dopamina y sus
metabolitos ........................................................................................................... 94
Índice
iv
2.2. Efecto sobre los niveles estriatales de catecolaminas producido por el
tratamiento estereotáxico con MPP+, previa administración intraperitoneal del
fragmento Hc-TeTx ............................................................................................... 96
3. Influencia del fragmento Hc-TeTx sobre la captación de 3H-DA y 3H-MPP+ en
preparaciones sinaptosomales de núcleo estriado de rata ........................................ 99
3.1. Caracterización y parámetros cinéticos del transporte de dopamina en
sinaptosomas de núcleo estriado de rata ............................................................. 100
3.2. Acción farmacológica del fragmento Hc-TeTx sobre la captación de dopamina en
sinaptosomas de núcleo estriado de rata ............................................................. 101
3.3. Acción del fragmento Hc-TeTx sobre los parámetros cinéticos del transporte de
3H-MPP+ a través del transportador de dopamina DAT ......................................... 104
4. Análisis del efecto de MPP+ y Hc-TeTx sobre la substantia nigra y el núcleo
estriado, 5 días post-lesión ............................................................................................ 105
4.1. Determinación de la ausencia de degeneración, a causa de MPP+, de los
cuerpos neuronales dopaminérgicos de la SNpc .................................................. 106
4.2. Efecto del pretratamiento con Hc-TeTx IP sobre la disminución de fibras TH
positivas en el núcleo estriado producida por MPP+ ............................................. 109
4.3. Análisis de la expresión de mRNA de TH en la SNpc. Hibridación in situ ............. 112
4.4. Estudio de la integridad del núcleo estriado mediante la determinación de
marcadores dopaminérgicos (TH, DAT, VMAT-2) ................................................. 113
5. Determinación del estado de fosforilación de la TH .................................................... 117
5.1. Estado de fosforilación del enzima TH en sinaptosomas provenientes de núcleo
estriado de rata .................................................................................................... 118
5.2. Estado de fosforilación del enzima TH en núcleo estriado de rata in vivo ............. 119
V- DISCUSIÓN ........................................................................................................ 123
VI- CONCLUSIONES ................................................................................................ 143
VII- BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................... 147
Abreviaturas
v
Abreviaturas
ATP: Trifosfato de adenosina
BDNF: Factor de crecimiento derivado del cerebro
COMT: Catecol-O-metiltransferasa
ChAT: Colina acetiltransferasa
CL: Cuerpos de Lewy
DA: Dopamina
DAB: 3,3-Diaminobenzidina
DAT: Transportador de dopamina
DOPAC: Ácido 3,4-Dihidroxifenilacético
EP: Enfermedad de Parkinson
GPe: Globo pálido externo
GPi: Globo pálido interno
FJB: Fluoro-Jade B
Hc-TeTx: Fragmento carboxi-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica
H2O2: Peróxido de hidrógeno
HVA: Ácido homovanílico
HPLC: Cromatografía líquida de alta precisión
IC: Intracraneal
IP: Intraperitoneal
IR: Inmunoreactividad
KM: Constante de Michaelis
LPS: Lipopolisacárido
MAO-B: Monoaminaoxidasa tipo B
MPP+:1-Metil-4-fenilpiridinio
MPDP+: 1-Metil-4-fenil-2,3-dihidropiridinio
MPTP: 1-Metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina
3-MT: 3-Metoxitiramina
NA: Noradrenalina
NAT: Transportador de noradrenalina
NE: Núcleo estriado
NGF: Factor de crecimiento nervioso
NO: Óxido nítrico
NOS: Óxido nítrico sintasa
Abreviaturas
vi
O2: Oxígeno
O2•-: Radical superóxido
OH•: Radical hidroxilo
OH-: Anión hidroxilo
6-OHDA: 6-Hidroxidopamina
ONOO-: Peroxinitrito
ROS: Especies reactivas de oxígeno
SERT: Transportador de serotonina
SNC: Sistema nervioso central
SNP: Sistema nervioso periférico
SNpc: Substantia nigra pars compacta
SNpr: Substantia nigra pars reticulata
STN: Núcleo subtalámico
SQ•-: Semiquinona
TeTx: Toxina tetánica
TH: Tirosina hidroxilasa
Trk: Kinasa del receptor de tropomiosina
V-Glut 1: Transportador vesicular de glutamato 1
VMAT2: Transportador vesicular de monoaminas
Vmax: Velocidad máxima
WB: Western blot
Resumen
vii
Resumen
La enfermedad de Parkinson (EP) es el segundo desorden neurodegenerativo
más frecuente relacionado con el envejecimiento, caracterizada por una
degeneración progresiva de las neuronas dopaminérgicas situadas en la
substantia nigra pars compacta (SNpc) con una concomitante pérdida de
dopamina (DA) en el estriado (núcleos caudato y putamen). El déficit de DA es
responsable de los principales síntomas motores de la EP, que incluyen
temblor en reposo, bradiquinesia, inestabilidad postural y rigidez. A pesar de
que los eventos moleculares que originan la enfermedad son hasta ahora poco
conocidos, existen diferentes tratamientos paliativos utilizados para aliviar la
mayor parte de estos síntomas, siendo la administración de L-Dopa (Levodopa)
el tratamiento más efectivo en el inicio de la enfermedad. Desafortunadamente,
todas las terapias actuales son sintomáticas y ninguna de ellas es capaz de
evitar o ralentizar la degeneración de las neuronas dopaminérgicas. Diversos
estudios neuropatológicos han mostrado que en un Parkinsonismo moderado,
el déficit estriatal de DA excede la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la
SNpc, sugiriendo que la degradación de terminales dopaminérgicas precede a
la muerte celular en la SNpc, que ocurre de forma retrógrada. Las
investigaciones actuales se centran en la prevención de la muerte de este tipo
neuronal y con esa meta son utilizados diversos modelos animales de la EP,
como la inducción de la pérdida de neuronas dopaminérgicas con la
neurotoxina 1-Metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP), compuesto capaz
de producir este efecto en humanos, primates no humanos, roedores y
especies de no-mamíferos. En el cerebro el MPTP es metabolizado a 1-metil-4-
fenilpiridinio (MPP+), que penetra en las células dopaminérgicas a través del
transportador de dopamina DAT y actúa en la mitocondria bloqueando la
cadena de transporte de electrones. Esto favorece la producción de especies
ractivas de oxígeno (ROS) a la vez que disminuye la síntesis de ATP en la
Resumen
viii
neurona. La crisis energética y el estrés oxidativo propician la degeneración y
muerte celular.
En este estudio se ha optimizado y caracterizado un modelo pre-existente de
EP utilizando una dosis baja de neurotoxina MPP+ para obtener un modelo en
el cual no se produzca muerte neuronal en la SNpc pero sí degeneración de las
terminales nerviosas dopaminérgicas y así, el contenido estriatal de DA. Esta
situación sería similar a la observada en estadios iniciales y asintomáticos de la
enfermedad de Parkinson. Por otro lado, también se analiza el efecto producido
por el tratamiento con el fragmento Hc de la toxina tetánica (Hc-TeTx),
observándose como resultado principal la preservación de los niveles de
marcadores típicos de neuronas dopaminérgicas tales como la dopamina, la
tirosina hidroxilasa o sus transportadores (DAT, VMAT-2). Estos resultados
hacen del fragmento Hc-TeTx un candidato excepcional como fármaco
para el tratamiento preventivo de enfermedades neurodegenerativas en
las que se produce degeneración de las terminales sinápticas, como es la
enfermedad de Parkinson.
I- INTRODUCCIÓN
Introducción
3
I- Introducción
1. Toxina tetánica (TeTx) y fragmento C de la toxina tetánica (Hc-TeTx)
1.1 La toxina tetánica
1.1.1 Origen y estructura molecular
La toxina tetánica (TeTx) pertenece a la familia de las neurotoxinas clostridiales
(CNTs) y es producida por la bacteria de la especie Clostridium tetani. Se trata de un
bacilo Gram-positivo, anaerobio estricto y formador de esporas ampliamente
distribuido en la naturaleza. Esta neurotoxina es una de las sustancias, entre las
conocidas, con mayor toxicidad (LD50 0.1-1 ng/kg en ratón) y es responsable de todos
los síntomas clínicos de la enfermedad del tétanos, siendo los más característicos: la
risa sardónica, el trismo (contracción de los músculos masticatorios que produce la
oclusión forzosa de la boca), el opistótono (rigidez y arqueo severo de la espalda) y la
parálisis espástica (Montecucco y Schiavo, 1995).
Las esporas penetran en una herida y, en caso de hipoxia tisular, germinan,
generando una toxina compuesta de un único polipéptido de peso molecular elevado
(150 KDa) (Stanier, 1986). Esta cadena polipeptídica simple posee una actividad
tóxica reducida y se denomina endotoxina. La endotoxina es hidrolizada por una
endoproteasa (bacteriana o del huésped) antes de ser secretada. La forma liberada o
exotoxina (figura 1), es la forma activa y presenta dos cadenas polipeptídicas unidas
por un puente disulfuro. Estas corresponden a una cadena ligera (L) de 50 KDa con
actividad toxigénica sobre la neurosecreción y a una cadena pesada (H) de 100 KDa
con características de unión específica al tejido diana. Experimentalmente se obtuvo
un fragmento adicional de la toxina tetánica al someterla a la acción de la proteasa
papaína, ya que este enzima producía la ruptura de la cadena pesada H en dos
fragmentos: el fragmento N-terminal (HN) y el fragmento C-terminal (HC) (Craven y
Dawson, 1973; Helting et al., 1977).
1.1.2 Proceso de intoxicación
Montecucco y colaboradores (1994) proponen que la intoxicación debida a TeTx se
lleva a cabo en un proceso que consta de cuatro fases: unión a la membrana celular,
Introducción
4
internalización, translocación a través de la membrana vesicular y acción catalítica de
la toxina (alteración de la diana en el citoplasma de la terminal sináptica). Diversos
estudios relacionan cada uno de los tres dominios estructurales de la toxina tetánica
con una función en la intoxicación. Así, el fragmento HC sería el responsable del
reconocimiento específico de unión a la terminal nerviosa y de su entrada por
endocitosis, el fragmento HN controlaría la translocación de la cadena L al interior del
citosol y la cadena ligera L sería la responsable del bloqueo de la exocitosis de los
neurotransmisores (Aguilera et al., 1996; Herreros et al., 1999).
Una vez alcanzada la circulación general, la TeTx activa se distribuye por todo el
cuerpo. Para alcanzar su lugar final de acción, ésta tiene que unirse e internalizarse en
dos tipos diferentes de neuronas: motoneuronas periféricas e interneuronas inhibitorias
de la médula espinal (células de Renshaw). La TeTx se une con alta afinidad a las
zonas no mielinizadas de las membranas plasmáticas neuronales del sistema nervioso
periférico (Habermann y Dimpfel, 1973), mostrando un elevado tropismo por las g-
motoneuronas, uniéndose específicamente a la membrana presináptica de la unión
neuromuscular (NMJ). Aunque han sido muchos los esfuerzos realizados para
identificar los receptores de la toxina tetánica o del fragmento Hc-TeTx, no se ha
llegado a esclarecer concretamente su identidad.
Figura 1. Estructura cristalográfica de los dominios de la toxina tetánica. El dominio
catalítico, la cadena ligera (Light chain), se ha representado en naranja y el dominio de
translocación (HN), en verde. El dominio de unión, Hc, se muestra dividido en sus dos
subdominios: en gris, su extremo amino-terminal (HCN) y en azul, el carboxi-terminal (HCC). La
cadena pesada está constituida por HN y Hc (Lacy et al., 1998).
Introducción
5
En el año 1986 Montecucco (Montecucco et al., 1986) propuso un modelo de doble
receptor (figura 2A) según el cual el fragmento Hc interacciona inicialmente con los
gangliósidos (glicoesfingolípidos) presentes en la membrana plasmática, que actúan
como receptores de alta afinidad, sobre todo con los polisialogangliósidos, que poseen
dos o más residuos de ácido siálico unidos a galactosa tales como GD1b y GT1b
(Helting et al., 1973; Van Heyningen, 1963). Por otro lado, se ha demostrado que la
TeTx se une a la célula diana en los denominados Lipid Rafts (Herreros et al., 2001).
Estos microdominios de membrana son zonas de la membrana plasmática ricas en
colesterol y esfingolípidos que juegan papeles cruciales en la iniciación de la
transducción de señales intracelulares mediadas por receptores y en el tráfico de
membrana (Tsui-Pierchala et al., 2002). Posteriormente, la toxina unida al gangliósido
se desplazaría de manera lateral por la membrana hasta encontrar el receptor proteico
(Lazarovici y Yavin, 1986) con el cual establecería una interacción, provocando así un
cambio conformacional en la membrana. La interacción simultánea del gangliósido con
el receptor proteico habría de ser considerada como una unión de muy alta afinidad.
Ésto lleva a la formación de una vesícula endocítica pequeña (SSV) que internaliza la
molécula junto con el complejo receptor (Lalli et al., 2003; Montecucco et al., 2004).
Cabe remarcar que una vez introducida en la vesícula, la TeTx queda inaccesible a
cualquier ataque por proteasas o anticuerpos específicos antitoxina (Montecucco et al.,
1994). La toxina viaja entonces retroaxonalmente (figura 2B) hacia la médula espinal
acumulándose en el hasta ventral de la materia gris. Posteriormente, se produce un
salto transsináptico de la TeTx mediado por vesículas endocíticas sinápticas (Matteoli
et al., 1996) hacia las neuronas intercalares inhibitorias de la médula espinal.
Para poder llevar a cabo su efecto, la toxina tiene que acceder al citosol de las células
(figura 2C). En la membrana lipídica de la vesícula existe una bomba de protones
ATPasa de tipo V que acidifica el medio provocando un descenso del pH, lo cual
produce un cambio conformacional en la molécula favoreciendo la inclusión tanto de
la cadena H como de la cadena L en la bicapa lipídica. Aparentemente, 4 moléculas
actúan en proximidad formándose así un canal selectivo de cationes compuesto por 4
dominios HN tras lo cual, la cadena ligera L podría pasar a través de la membrana
vesicular quedando situada en el exterior. Una vez fuera, el pH neutro devuelve a la
cadena L su conformación tridimensional y por último, se reduce el enlace disulfuro
intercatenario liberando la cadena L en el citosol (Binz y Rummel, 2009; Herreros,
1999).
Introducción
6
Es entonces cuando la cadena L puede ejercer su actividad endopeptidasa
dependiente de Zinc sobre la proteína VAMP-2/sinaptobrevina (Vesicle associated
membrane protein), proteína constituyente del complejo SNARE (soluble
Figura 2. Representación del acceso de la toxina tetánica a su lugar de acción. A) La
internalización de la TeTx es mediada por la unión del fragmento Hc a polisialogangliósidos y a
su receptor proteico (R). A continuación, la toxina es captada por la terminal presináptica por
endocitosis. B) La TeTx sufre un transporte retroaxonal que la lleva hacia el soma de la
motoneurona. Allá, a través de un salto transsináptico alcanzará la neurona inhibidora
intercalar. C) Translocación de la cadena L al citosol, pH dependiente.
N-ethylmaleimine sensitive factor attachment protein receptor) y único substrato
conocido de la TeTx (Schiavo et al., 1992). Este complejo es un conjunto de proteínas
involucradas en la exocitosis de neurotransmisores de la terminal nerviosa de la
neurona presináptica, que junto con otras proteínas actúa en las diferentes etapas
previas a la fusión de las vesículas sinápticas a la membrana plasmática (figura 3).
De este modo, la cadena L produce el bloqueo de la liberación de neurotransmisores
inhibidores (p.e. glicina) por parte de la interneurona inhibitoria. Ese bloqueo depriva a
las motoneuronas del input inhibitorio causando hiperactividad en las mismas y
Introducción
7
consecuentemente una contracción muscular o parálisis espástica característica de la
enfermedad del tétanos (Schwab et al., 1979).
Figura 3. La base del complejo SNARE lo conforman tres proteínas sinápticas: VAMP-2/
Sinaptobrevina, Sintaxina y SNAP-25. VAMP-2/ Sinaptobrevina (azul) se encuentra anclada a
la membrana vesicular y, Sintaxina (roja) y SNAP-25 (verde) por el contrario, interaccionan con
la membrana plasmática de la terminación nerviosa. Cuando la cadena L de la toxina tetánica
accede al citosol de la neurona, se dirige hacia el complejo SNARE y actúa sobre la proteína
VAMP-2/ Sinaptobrevina impidiendo, en consecuencia, el acercamiento de la vesícula sináptica
a la membrana plasmática y por tanto, la fusión de las membranas, de modo que se inhibe la
neurosecreción.
Desde principios del siglo XX el modo de prevenir la enfermedad tetánica está basado
en la vacunación o inmunización activa, en la que se inyecta toxoide. El toxoide
tetánico se ha considerado seguro y útil desde que Descombey por primera vez
informó de su producción y de su utilización exitosa en 1924 (Descombey et al., 1924).
Este toxoide consta de una toxina inactivada con formaldehido que, después de una
serie de dosis adecuadamente espaciadas en el tiempo, estimula la producción de
anticuerpos específicos contra la toxina del tétanos. Otra posibilidad es la
inmunización pasiva, que consiste en la aplicación de globulinas anti-tetánicas (tetanus
inmune globuline, TIG) de manera posterior a la intoxicación con toxina tetánica (Keller
y Stiehm, 2000).
1.2 El fragmento C de la toxina tetánica (Hc-TeTx)
1.2.1 Estructura del fragmento Hc-TeTx
La estructura cristalográfica por rayos X muestra que el fragmento Hc de la toxina
tetánica está compuesto por dos subdominios de aproximadamente el mismo tamaño
Introducción
8
(25 KDa): HCC y HCN. El extremo amino-terminal guarda cierta similitud con la fracción
de unión a carbohidratos presente en lectinas (jelly-roll lectin like fold) y es una región
altamente conservada entre las toxinas clostridiales (Fotinou et al., 2001). Aunque no
se conoce con certeza la función de esta región, se ha demostrado que es incapaz de
unirse a la membrana plasmática neuronal (Figueiredo et al., 1995). Asimismo, se
postula que sea necesaria para dirigir la TeTx hacia una ruta determinada en la última
fase de intoxicación, en la cual la TeTx sufre la transcitosis hacia las interneuronas
inhibitorias (Lalli et al., 2003). El extremo carboxi-terminal, HCC, adopta una
conformación en ß-trefoil que presenta 4 sitios de unión a carbohidratos, dos de ellos
funcionales y dos sin función aparente. El “bolsillo” de reconocimiento más conservado
de unión a oligosacáridos juega un papel primordial en la interacción con receptores
superficiales que contienen ácido siálico como los poligangliósidos y posiblemente con
glicoproteínas neuronales, como así lo demuestra un estudio en el cual, a
consecuencia de su mutación, se pierde la interacción con la membrana neuronal
(Sinha et al., 2000). Por otra parte, este dominio de unión de carbohidratos
interacciona con un derivado soluble del gangliósido GT1b. También se ha
demostrado que para conseguir una unión altamente específica a la membrana
neuronal es necesaria la presencia de un segundo bolsillo de unión a carbohidratos
capaz de anclar ácido siálico. De hecho, la depleción de parte de esta región provoca
la pérdida de unión de la TeTx a las motoneuronas inhibiéndose así su transporte
retrógrado in vivo (Sinha et al., 2000).
Figura 4. Estructura del fragmento Hc-TeTx. La región HCN adopta una conformación
tridimensional en jelly-roll lectin like fold incapaz de unirse a la membrana plasmática. La región
Hcc en cambio, presenta una estructura tridimensional en forma de ß-trefoil que le permite la
interacción con la membrana neuronal (Fotinou et al., 2001).
Introducción
9
1.2.2 Efectos del fragmento Hc-TeTx sobre vías de señalización.
Como se ha comentado anteriormente, la unión de la toxina tetánica al tejido neuronal
implica la presencia del dominio C terminal de la toxina, Hc-TeTx, tal como demuestra
la habilidad de dicha región de unirse a membranas cerebrales de rata (Goldberg et
al., 1981; Pierce et al., 1986), a cultivos primarios de neuronas (Halpern et al., 1993;
Lalli et al., 1999) y a las líneas celulares de neuroblastoma (Staub et al., 1986;
Herreros et al., 2000a, 2000b), entre otros.
Ya desde el pasado son muchas las investigaciones que se han llevado a cabo in vivo
e in vitro con el afán de identificar el receptor proteico de Hc-TeTx, así como de la
TeTx entera. Diversos estudios han encontrado similitudes en el mecanismo de acción
de la toxina tetánica y el de las neurotrofinas, principalmente el NGF (Nerve growth
factor) (Dumas et al., 1979; Schwab y Thoenen, 1977; Stöckel et al., 1975). En este
sentido, incluso se ha propuesto la hipótesis de que el fragmento Hc-TeTx pudiera
actuar siguiendo las mismas rutas que las neurotrofinas, aprovechando tanto sus
receptores como la estrategia de ingreso en la neurona, así como su mecanismo de
transporte retroaxonal (Butowt y von Barthelt, 2003; Lalli y Schiavo, 2002). En apoyo a
esta hipótesis existen resultados del grupo en el que se ha realizado la presente tesis
doctoral que demuestran, la activación de cascadas de señalización propias de los
receptores de neurotrofinas (Gil et al., 2000, 2001, 2003).
1.2.2.1 Neurotrofinas, receptores y cascadas de señalización
Las neurotrofinas constituyen una familia de factores neurotróficos con funciones
esenciales para la supervivencia, diferenciación y plasticidad sináptica de las
neuronas. Dentro de la familia de neurotrofinas, en mamíferos, podemos destacar el
factor de crecimiento nervioso (Nerve growth factor, NGF), el factor neurotrófico
derivado del cerebro (Brain-derived neurotrophic factor, BDNF), la neurotrofina 3, NT-
3, (también conocida como Hippocampus-derived neurotrophic factor, HDNF) y la
neurotrofina 4/5 (NT-4/5). Estos factores tróficos son incorporados por las
terminaciones nerviosas y transportados retroaxonalmente hacia el soma neuronal
donde ejercen su efecto trófico.
Introducción
10
Figura 5. Ilustración de las vías de señalización activadas por la unión de la neurotrofina
al receptor p75NTR
y al receptor trk. La unión de las neurotrofinas al receptor trk activa la vía
de las p21Ras/ERK, la vía de PI3K/AKT y la vía PLCけ1/PKC promoviendo diferenciación,
supervivencia y plasticidad sináptica respectivamente. Por otro lado, la activación del receptor
p75NTR lleva a la activación de RhoA, de la vía JNK/c-Jun y de NF-せB promoviendo inhibición
del crecimiento de las neuritas, apoptosis y supervivencia repectivamente (Reichardt, 2006).
La señalización de las neurotrofinas es llevada a cabo mediante dos tipos de
receptores de membrana de naturaleza glucoproteica (Ibáñez et al., 1991). Un primer
tipo de receptor de baja afinidad, p75NTR (receptor de neurotrofina de 75 KDa) que
reconoce con moderada afinidad a las distintas neurotrofinas citadas, y otro tipo de
receptor de alta afinidad ligando-específico,Trk (quinasa del receptor de tropomiosina),
del cual se han identificado tres tipos: TrkA, TrkB y TrkC. La unión de la neurotrofina al
receptor es específica siendo trkA aceptor de NGF, trkB de BDNF, principalmente, y
NT-4/5 y trkC de NT-3. Asimismo, se ha reportado la formación del complejo Trk-
p75NTR-neurotrofina (Bibel et al., 1999; Dumas et al., 1979; Von Bathelt et al., 1996).
El p75NTR es un miembro de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral
(TNF) que no posee actividad enzimática intrínseca reconocida y lleva a cabo la
señalización mediante la asociación a otras proteínas citoplasmáticas (Roux y Barker,
2002). Diversas cascadas de señalización son activadas en respuesta a la unión del
Introducción
11
dímero de neurotrofinas al receptor (figura 5). Una de las principales vías activadas
por la unión de neurotrofinas a p75NTR es la cascada de señalización del factor nuclear
せB (NF-せB), que promueve la supervivencia neuronal dependiente de NF-せB. Además,
también se ha reportado que la activación de p75NTR impulsa la vía de señalización de
Jun quinasa, lo que lleva al desencadenamiento de un proceso apoptótico debido por
un lado, a la activación de p53 y, por otro, a la expresión del ligando Fas a través de la
activación del receptor Fas en células neuronales (Reichardt, 2006). Asimismo, la
unión de neurotrofinas al receptor controla la actividad de la proteína G monomérica
RhoA a través de una interacción directa, teniendo esto como consecuencia una
inhibición de la elongación de las neuritas debido a la regulación del cono de
crecimiento (Yamashita et al., 1999, 2002).
Los receptores Trk son dimerizados al interaccionar con las neurotrofinas, que actúan
como homodímeros unidos de forma no covalente (McDonald et al., 1995). Este hecho
provoca una auto-transfosforilación de los residuos tirosina, resultando en la activación
de las quinasas presentes en sus dominios citoplasmáticos. La fosforilación de estos
residuos lleva a una conformación más abierta del receptor permitiendo el acceso de
los substratos a la quinasa (Cunningham y Greene, 1998). La fosforilación de otros
residuos promueve la activación de cascadas de señalización ya que actúan como
sitios de acoplamiento para moléculas adaptadoras, que contienen dominios de unión
de fosfotirosina (phosphotyrosine-binding, PTB) o de homología a src-2 (SH2)
(Patapoutian et al., 2001). Esta unión produce la activación de diversas vías,
destacando la vía p21Ras/ERK, que es necesaria para la normal diferenciación
neuronal, así como para promover la supervivencia de muchas subpoblaciones
neuronales. Por otro lado, también se activa la vía de PI3K/AKT, que está implicada en
el tráfico vesicular, así como en la supervivencia neuronal. Por último, la vía de PLC-
け/PKC, donde se genera inositoltrifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG) dependiente de
PLC-け, provoca la movilización de las reservas de calcio intracelular y la activación de
proteínas quinasas reguladas por calcio y DAG. Esta vía parece jugar un importante
papel en la regulación de la secreción y en la plasticidad sináptica (Brunet et al., 2001;
Kaplan y Miller, 2000; Reichardt et al., 2006; Roux y Barker, 2002).
1.2.2.2 Efectos del fragmento Hc-TeTx y vías de señalización
En el año 1990 Aguilera y Yavin (Aguilera y Yavin, 1990) reportaron la translocación
del enzima PKC del compartimento citosólico, donde se encuentra inactiva, a una
forma activa unida a la membrana, y su posterior down-regulation, subsecuente a la
Introducción
12
administración intraventricular de la toxina tetánica en ratas adultas. Estudios ulteriores
realizados en cultivos primarios de cerebro de rata (Gil et al., 1998) mostraron el
mismo efecto sobre la PKC. En este caso se relacionó el aumento de actividad con un
incremento en la hidrólisis de fosfoinosítidos. Más tarde (Gil et al., 2000) se demostró
que el tratamiento de la fracción P2 de sinaptosomas de rata con toxina tetánica
inducía la fosforilación del receptor trkA. Al igual que en el caso del factor neurotrófico
NGF, la fosforilación de dicho receptor activa la vía de la PLC-け, lo que se traduce en
un aumento de DAG y IP3. El DAG y el Ca2+ inducido por el IP3 promueven la
translocación a la membrana y activación de PKC, en este caso concreto, de las
isoformas clásicas く y け, y nueva h. Paralelamente, se observó la activación de la
cascada de señalización de la vía p21Ras/ERK.
Un año más tarde en Gil et al., 2001, se repitió el mismo estudio utilizando el
fragmento de la cadena pesada de la toxina tetánica en lugar de la toxina tetánica
entera. El resultado obtenido fue idéntico al anterior, de lo que se deduce que el
fragmento C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica, Hc-TeTx, es el
responsable de la activación de las citadas vías de señalización. A pesar de encontrar
la fosforilación del receptor trkA después del tratamiento con Hc-TeTx, no ha sido
posible demostrar una interacción real, al resultar infructuosos los experimentos
realizados en nuestro grupo encaminados a detectar la interacción entre Hc-TeTx y
receptores trk.
En un estudio comparativo entre TeTx y Hc-TeTx (Gil et al., 2003), se observó que
ambas formas son capaces de activar las cascadas de señalización p21Ras/ERK y
PI3K/AKT in vitro en un modelo carente de receptor trkA, como son los cultivos
primarios de neuronas corticales de rata. Dichos resultados indican que el receptor
trkA no es necesario, a pesar de resultar fosforilado como resultado del tratamiento
con Hc-TeTx, o que la molécula tiene la capacidad de activar distintos tipos de trk.
En resultados adicionales, se demuestra la capacidad del fragmento Hc-TeTx de
rescatar neuronas granulares de cerebelo (CGN) en cultivo de la apoptosis inducida
por deprivación de potasio. Dicho efecto neuroprotector va acompañado de la
fosforilación del receptor de neurotrofinas trkB y activación de la proteína G soluble
p21Ras, y es dependiente de las vías de señalización PI3K/AKT y p21Ras/ERK. En
este estudio también se demostró la capacidad de Hc-TeTx de inhibir el corte de la
pro-caspasa-3 (Chaib-Oukadour et al., 2004). Dentro de la misma línea experimental,
se demostró que el fragmento Hc-TeTx evita la muerte por apoptosis provocada por la
neurotoxina 1-Metil-4-fenilpiridinio (MPP+) in vitro, en un modelo de CGN (Chaib-
Oukadour et al., 2009). Como ya se había observado previamente, Hc-TeTx es capaz
Introducción
13
de activar la cascada se señalización PI3K/AKT, lo cual deriva en la fosforilación de la
proteína pro-apoptótica Bad. A través de la fosforilación de uno o más residuos de
Serina, Bad reside en un complejo inactivo con la proteína chaperona 14-3-3. Cuando
Bad se defosforila, se disocia de 14-3-3 y desplaza a la proteína proapoptótica Bax de
su unión con la proteína antiapoptótica Bcl-XL, sustituyéndola en ese complejo. La
proteína Bax libre es subsecuentemente translocada a la membrana mitocondrial
donde favorece la salida de citocromo c. Por este motivo, la fosforilación de Bad se
traduce en un bloqueo del proceso de la apoptosis, de modo que Hc-TeTx promueve
la supervivencia celular. En el mismo estudio se comprobó que existía un incremento
de la unión del factor NF-せB al DNA, lo cual fomenta un aumento de la expresión de
genes regulados por dicho factor, que propician la supervivencia celular.
Diversas investigaciones han revelado que el fragmento Hc-TeTx aislado conserva la
capacidad de viajar retroaxonalmente in vivo sin causar los síntomas clínicos de la
enfermedad del tétanos (Bizzini et al., 1977; Fishman y Carrigan, 1987). Por ese
motivo, y cada vez con más frecuencia, el fragmento Hc-TeTx, en forma proteica o de
DNA desnudo, está siendo probado como herramienta terapéutica, ya sea utilizado en
solitario (Mendieta et al, 2009; Moreno-Igoa et al., 2010) o a modo de transportador de
proteínas exógenas hacia el SNC (Ciriza et al., 2008; Coen et al., 1997; Figueiredo et
al., 1997; Miana-Mena et al., 2004).
2. La enfermedad de Parkinson
2.1 Descubrimiento y epidemiología
En el año 1817 el médico británico Dr. James Parkinson describió en su ensayo
monográfico “Essay on the Shaking Palsy” la parálisis agitante, que posteriormente
recibió el nombre de Enfermedad de Parkinson en su honor. La enfermedad de
Parkinson (EP) es el segundo desorden neurodegenerativo más frecuente en los
países occidentales por detrás del Alzheimer y, debido al aumento de la esperanza de
vida y por ende, al envejecimiento de la población, se prevé un incremento dramático
en el número de individuos afectados por este mal en los próximos años (Dorsey et al.,
2007).
La prevalencia de la enfermedad de Parkinson en el mundo es 150/ 100.000 individuos
y aumenta la incidencia por encima de los 70 años de edad. Habitualmente los
síntomas se inician a partir de la 6ª década de la vida del individuo, aunque existen
Introducción
14
casos de Parkinsonismo juvenil en los que la sintomatología se manifiesta a edades
más tempranas (20-40 años). El riesgo de padecer esta enfermedad varía según la
edad, el sexo, la raza y la localización geográfica. La frecuencia de aparición es mayor
en hombres que en mujeres, siendo en Europa mayor el riesgo que en Norte América.
Un hombre anciano caucásico de una zona industrializada es el que mayor riesgo
tiene de desarrollar la EP (Choonara et al., 2009).
2.2 Histopatología de la EP
En el mesencéfalo existen tres grupos celulares de neuronas dopaminérgicas
denominados A8, A9 y A10. El grupo A8 está localizado en la formación reticular
lateral, el A9 en la substantia nigra pars compacta (SNpc) y el A10 en el tegmento
medial y dorsal (área tegmental ventral, VTA). Las neuronas de A9 envían
proyecciones hacia los núcleos caudato y putamen interviniendo así en las vías de los
ganglios basales (GB). Los GB constituyen un conjunto de núcleos subcorticales que
procesan las señales que fluyen desde el córtex permitiendo una correcta ejecución de
los movimientos voluntarios. En humanos, este circuito está compuesto por el cuerpo
estriado (constituido por caudado y putamen), el globo pálido (interno, GPi, y externo,
GPe), el núcleo subtalámico de Luys (NST) y la substantia nigra (SN). Inicialmente, la
pérdida de neuronas dopaminérgicas se localiza únicamente en la zona
correspondiente a A9 devastando la SNpc. En fases posteriores, la degeneración
incluye también la substantia nigra pars reticulata (SNpr) así como las regiones A8 y
A10 (Orr et al., 2002).
En la EP la neurodegeneración no se da únicamente en el sistema dopaminérgico,
sino que existen otras áreas afectadas como el locus coeruleus, los núcleos del rafe y
el núcleo basal de Meynert, y núcleo motor dorsal del vago, además del córtex
cerebral, el bulbo olfactorio, el hipocampo y el sistema nervioso autónomo. Los
defectos generados en las vías noradrenérgica, serotoninérgia y colinérgica no han
sido tan profundamente caracterizados como los relativos a las lesiones de la vía
dopaminérgica (Dauer y Przedborski, 2003).
Diversas investigaciones han demostrado que la degeneración neuronal, sobre todo
en la SNpcpero también en las otras regiones anteriormente citadas, suele ir
acompañada por la acumulación, agregación y secuestro de un amplio rango de
proteínas en los llamados cuerpos de Lewy (CL) (figura 6), así como en procesos
neuríticos filamentosos que reciben el nombre de neuritas de Lewy (NL). Estas
estructuras (CL) corresponden a inclusiones intraneuronales eosinofílicas de entre 8-
Introducción
15
30 µm de diámetro con muy alto contenido en g-sinucleína, neurofilamentos, ubiquitina
y proteínas ubiquitinizadas, entre otras. En el interior del CL, las proteínas acumuladas
son oxidadas, nitradas, ubiquitinizadas y/o fosforiladas.
Figura 6. Cuerpo de Lewy esférico de una neurona dopaminérgica de la SNpc de un paciente
fallecido por PD. La fluorescencia roja muestra la presencia de proteínas ubiquitininazas, la
verde de g-sinucleína y la azul marca el núcleo (N) de la célula. Nótese la elevada
concentración de ubiquitina en el centro del CL (Lewy body, LB) así como de g-sinucleína en la
periferia del mismo. La punta de flecha señala lo que podrían ser pequeños agregados de
proteínas ubiquitinizadas dirigiéndose hacia la formación del cuerpo de Lewy (McNaught et al.,
2006).
La consistente organización de estas estructuras sugiere que no se trata de un
fenómeno originado al azar y se especula que la formación de los cuerpos de Lewy
pueda actuar como un agregosoma. Éstos sirven para secuestrar, segregar y degradar
niveles excesivos de proteínas anormales y potencialmente tóxicas, y agregarlas
cuando no es posible su degradación por otras vías proteolíticas. Por esta razón, estas
inclusiones podrían ser consideradas como citoprotectivas. En realidad, el papel que
juegan los cuerpos de Lewy en la muerte celular observada durante el desarrollo de la
EP es motivo de controversia ya que es posible observar neurodegeneración en la
SNpc en ausencia de CL así como pueden encontrarse CL sin observar
neurodegeneración (McNaught et al., 2006).
2.3 Anatomía y fisiología de los ganglios basales. Fisiopatología de la EP
Los ganglios basales (figura 7) se pueden considerar como un circuito que regula el
flujo de información desde la corteza cerebral hacia las neuronas motoras de la
médula espinal. Este circuito facilita la ejecución de movimientos voluntarios a la par
Introducción
16
que obstaculiza los movimientos no deseados. El cuerpo estriado (caudado y
putamen) es la principal estructura de los ganglios basales y su emisión de impulsos
se lleva a cabo a través de dos vías: la vía directa y la vía indirecta. La vía directa o
excitadora tiende a transformar la idea abstracta de un movimiento en la realización
del mismo. La idea de movimiento se origina en la corteza asociativa, que posee
conexiones activadoras (glutamatérgicas) con el cuerpo estriado. El cuerpo estriado
posee conexiones gabaérgicas y por tanto inhibidoras, con el globo pálido interno
(GPi) y la substantia nigra pars reticulata (SNpr), de modo que cuando el cuerpo
estriado se activa, el GPi y la SNpr disminuyen su actividad. El GPi y la SNpr tienen
también conexiones gabaérgicas con el tálamo, siendo asimismo inhibitorias. De este
modo, cuando se activa el cuerpo estriado aumenta la actividad del tálamo
(desinhibición del tálamo) debido a que se inhibe la inhibición del GPi y la SNpr, y dos
vías inhibidoras en serie producen activación. Los núcleos talámicos activan la corteza
motora suplementaria a través de conexiones glutamatérgicas, que remite la orden de
movimiento a la corteza motora primaria que por último envía la orden a las
motoneuronas de la médula espinal para que se ejecute el movimiento. Por esta vía la
idea de un movimiento se transforma en su ejecución.
Figura 7. Esquema de los ganglios basales en un cerebro humano. Los ganglios basales
son un circuito conformado por el cuerpo estriado (constituido por el caudado mostrado en
marrón, y putamen, en celeste), por el globo pálido interno (azul oscuro) y externo (azul más
claro), el núcleo subtalámico de Luys (verde oliva) y la sustancia negra (verde oliva). La
información del movimiento parte del córtex y es modulada por estas estructuras para acabar
en el tálamo, desde donde vuelve a la corteza cerebral generándose o no el movimiento.
Introducción
17
La vía indirecta tiende a producir el fenómeno contrario, es decir, a inhibir los
movimientos no deseados. Algunas neuronas del cuerpo estriado establecen
conexiones gabaérgicas (inhibidoras) con el globo pálido externo (GPe). Las
conexiones entre el GPe y el núcleo subtalámico (NST) son también inhibitorias de
modo que cuando el córtex excita el estriado, este inhibe el GPe lo cual resulta en la
desinhibición del NST (glutamatérgico). Esto activa el GPi y la SNpr (gabaérgicos)
causando una inhibición de los núcleos talámicos y consecuentemente la inhibición de
la corteza motora. Esta vía inhibe el movimiento porque tiene tres sinapsis inhibidoras
en serie en lugar de dos, como ocurre en la vía directa.
Figura 8. Diagrama del circuito ganglios basales-tálamo-corticales en individuos
normales. El cuerpo estriado controla el movimiento a través de dos vías: la vía directa y la vía
indirecta. La vía directa facilita el movimiento mediante la desinhibición del tálamo, es decir,
inhibe las proyecciones inhibidoras del GPi y la SNr hacia el tálamo, resultando en una
activación del movimiento. La vía indirecta ejerce en cambio un efecto negativo sobre el
movimiento ya que al inhibirse las proyecciones inhibitorias del GPe, se activan las
proyecciones excitatorias del STN, incrementando la transmisión gabaérgica de GPi y la SNr
hacia el tálamo, disminuyendo así la activación del área motora del córtex. SP: sustancia P,
Enk: encefalina, GPi: Globo Pálido interno, GPe: Globo Pálido externo, SNr: Sustancia Nigra
pars reticulata, SNc: Sustancia Nigra pars compacta, STN: Núcleo Subtalámico, GABA: ácido
gamma aminobutírico, PPN: núcleo pedúnculo pontino (Lewis SJG et al., 2003).
Introducción
18
La vía directa tiende a activar los movimientos voluntarios y la vía indirecta, a inhibir la
aparición de componentes involuntarios en el movimiento. Un adecuado equilibrio
entre las dos produce los movimientos normales.
La SNpc brinda inervación dopaminérgica a las neuronas estriatales de ambas vías
regulando su actividad relativa. Las neuronas estriatales de la vía directa expresan el
receptor del subtipo D1 excitador, y las de la vía indirecta expresan el subtipotipo D2
inhibidor. De este modo, la dopamina que se descarga en el cuerpo estriado tiende a
incrementar la actividad de la vía directa y a reducir la de la vía indirecta (Parent y
Hazrati, 1995). En la figura 8 se ha hecho una representación esquemática del
complejo funcionamiento de este circuito.
En la EP, ocurre que la pérdida de la inervación dopaminérgica que conecta el cuerpo
estriado con la SNpc provoca una disminución de la actividad de la vía directa y una
sobreactivación simultánea de la vía indirecta (DeLong y Wichmann, 2009).
2.3.1 Neurotransmisores de los ganglios basales
La actividad individual de los diferentes ganglios basales es regulada a través de
neurotransmisores. En esta regulación juegan un papel primordial el ácido け-amino-
butírico (GABA), que actúa inhibiendo los núcleos consecutivos, el glutamato, que
ejerce una acción excitatoria sobre las proyecciones, y la dopamina. La sustancia P y
la encefalina son neuropéptidos que, aunque juegan un papel secundario, también
ayudan a modular la actividad de las sinapsis gabaérgicas presentes en el NE.
2.3.1.1 Dopamina
La vía nigroestriatal está regulada principalmente por el neurotransmisor dopamina
(DA). Éste, es una catecolamina compuesta por un núcleo catecol (un anillo de
benzeno con dos grupos hidroxilo en posición orto) y una cadena de etilamina. Las
catecolaminas proceden del aminoácido L-fenilalanina, que es transformado en L-
tirosina por acción del enzima fenilalanina hidroxilasa en el hígado. Desde allí, la L-
tirosina viaja por el torrente sanguíneo hasta alcanzar el interior de la terminación
nerviosa.
Las neuronas capaces de sintetizar catecolaminas poseen un enzima, la tirosina
hidroxilasa (TH, E.C. 1.14.16.2), que es el enzima limitante de la vía de síntesis de
dopamina, norepinefrina y epinefrina (Nagatsu et al., 1964). Este enzima es una
Introducción
19
monooxigenasa mixta que utiliza oxígeno molecular (O2) y L-tirosina a modo de
sustratos, y tetrahidrobiopterina (BH4) como cofactor (Shiman et al., 1971) para añadir
un grupo hidroxilo a la L-tirosina, formando así la 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina (L-DOPA),
que inmediatamente, a través la descarboxilación producida por la acción de la DOPA
descarboxilasa, acabará por dar lugar a la dopamina (figura 9).
Figura 9. Síntesis de dopamina. El aminoácido L-tirosina es transformado en 3,4-dihidroxi-L-
fenilalanina (L-DOPA) mediante la hidroxilación llevada a cabo por el enzima tirosina
hidroxilasa. Posteriormente la DOPA descarboxilasa o Descarboxilasa de Aminoácidos
Aromáticos (DAA) cataliza su descarboxilación obteniéndose así la dopamina.
Cuando un potencial de acción invade la terminación nerviosa, provoca la
despolarización de la membrana neuronal, lo que induce la apertura los canales de
calcio dependientes de voltaje, produciéndose en consecuencia la entrada y aumento
de concentración citosólica de este catión. El aumento de Ca2+ es un requisito
indispensable para que se produzca la exocitosis del neurotransmisor. Este proceso
consiste en la fusión de la membrana de la vesícula sináptica con la membrana
plasmática de la terminación nerviosa presináptica y la posterior evacuación del
neurotransmisor en la hendidura sináptica (Eguiagaray et al., 2004).
La acción de la dopamina viene dada por su efecto sobre los receptores
dopaminérgicos, receptores acoplados a proteína G que, bien estimulan la actividad
adenilato ciclasa (familia de receptores tipo D1, que incluye el subtipo de receptor D1 y
Introducción
20
D5) o bien la inhiben (familia de receptores tipo D2, que incluye los subtipos de
receptores D2, D3, D4). La inhibición de este enzima tiene como consecuencia una
disminución en la formación de adenosín 3´-5´-monofosfato cíclico (AMPc), lo que a su
vez reduce la actividad del enzima quinasa dependiente de AMPc (PKA). En cuanto a
su localización, los receptores del subtipo D1 son principalmente postsinápticos y los
del subtipo D2, tanto presinápticos como postsinápticos (Missale et al., 1998).
Una vez producido su efecto, la acción de la dopamina debe ser terminada. Este
proceso es llevado a cabo a través de dos mecanismos. Por un lado, la recaptación
del neurotransmisor mediada por el transportador de dopamina (DAT) localizado en la
membrana neuronal presináptica, que representa el mecanismo principal, y por otro, la
degradación enzimática efectuada por el enzima catecol-O-metiltransferasa (COMT).
El DAT es una proteína integral de membrana que posee 12 dominios transmembrana
y que puede ser regulado por fosforilación (vía PKC o MAPK). Para transportar la
dopamina desde la hendidura sináptica necesita co-transportar 2 iones Na+ y uno Cl-
junto con el neurotransmisor. El gradiente de iones es a su vez mantenido mediante
una bomba Na+/K+ ATPasa situada en la membrana plasmática, que extrae de la
célula 3Na+ por cada 2K+ que entran. DAT se encuentra únicamente en neuronas que
sintetizan dopamina de modo que puede ser considerado como un marcador
específico de células dopaminérgicas en el sistema nervioso central. De manera
relevante, este transportador también es responsable de la captura de toxinas como la
6-hidroxidopamina y el 1-Metil-4-fenilpiridinio (MPP+) (Bahena-Trujillo et al., 2000;
Mayer et al., 1986).
La biodegradación de la dopamina es llevada a cabo principalmente por dos enzimas:
la monoaminooxidasa (MAO) y la catecol-O-metiltransferasa (COMT). Mientras la
MAO se encuentra en el interior de la neurona, localizada en la membrana
mitocondrial externa catalizando la degradación de la dopamina intracelular, la COMT
se halla en la hendidura sináptica ligada a la membrana neuronal postsináptica, donde
colabora con la inactivación de la actividad del neurotransmisor degradándolo en el
exterior celular. La acción conjunta de ambos enzimas produce una serie de
metabolitos derivados de la dopamina, de entre los cuales destacan tres: el ácido 4-
hidroxi-3-metoxi-fenilacético (ácido homovanílico, HVA), el ácido 3,4-
dihidroxifenilacético (DOPAC) y la 3-metoxitiramina (3-MT), que se muestran en la
figura 10 (Cumming et al., 1992).
Introducción
21
Figura 10. Representación esquemática de la biodegradación de la dopamina. A través de
los enzimas monoaminooxidasa (MAO) y aldehído deshidrogenasa en el interior de la neurona,
y la catecol-O-metiltransferasa (COMT) en el exterior, la dopamina es degradada para formar
los metabolitos ácido homovanílico (HVA), el ácido 3,4-dihidroxifenilacético (DOPAC) y la 3-
metoxitiramina (3-MT).
2.4 Sintomatología clínica
La EP es una enfermedad crónica, progresiva e irreversible que se caracteriza por la
pérdida preferencial de las neuronas dopaminérgicas que contienen neuromelanina
presentes en la SNpc (Hirsch et al., 1988). Esta situación produce un empobrecimiento
de los niveles del neurotransmisor dopamina en el núcleo estriado provocando en
consecuencia, los síntomas motores característicos de la dolencia. Bradiquinesia,
temblor, rigidez e inestabilidad postural son algunos de los síntomas, los llamados
“signos cardinales”, que presentan los pacientes (Obeso et al., 2002), si bien no los
únicos ya que también se pueden observar síntomas no motores (para revisión
Pandya et al., 2008) como estreñimiento, incontinencia urinaria y disfunción sexual
(Chadwick y Aminoff, 2004), así como insomnio (Wells et al., 2009), depresión (Errea y
Ara, 1999), demencia, síndromes psicóticos y ansiedad (Riedel et al., 2010).
2.5 Causas y factores de riesgo putativos relacionados con la EP
La identificación tanto de causas genéticas (Vila y Przedborski, 2004) como
ambientales (Di Monte et al., 2003) ligadas al desarrollo de la enfermedad de
Introducción
22
Parkinson permiten únicamente explicar una pequeña proporción de los casos de esta
enfermedad. Las causas que originan el Parkinson idiopático o esporádico, que es el
que padece la vasta mayoría de enfermos, son todavía desconocidas. A ese respecto,
varios factores han sido propuestos como posibles desencadenantes, tales como el
estrés oxidativo, los defectos mitocondriales, procesos inflamatorios, la
excitotoxicidad, el plegamiento inadecuado y agregación de proteínas, los mecanismos
apoptóticos y la predisposición genética (Dauer y Przedborski, 2003).
El estrés oxidativo es un proceso patológico clave común a todas las enfermedades
neurodegenerativas, que si bien se da en todas las áreas del cerebro, en las neuronas
dopaminérgicas de la SNpc, que contienen neuromelanina, parece tener un efecto
más devastador. Casi el 100% del oxígeno molecular es consumido por la respiración
mitocondrial y potentes oxidantes son generados constantemente como subproductos.
El daño aparece cuando el equilibrio entre las sustancias oxidantes y los mecanismos
detoxificadores de la célula se descompensa. La mitocondria es la mayor fuente de
producción de radicales libres, que son moléculas que presentan un electrón
desapareado en el último orbital, lo cual las torna inestables y altamente reactivas, por
lo que también se denominan especies de oxigeno reactivas (reactive oxygen species,
ROS). Dos ejemplos son el anión superóxido (O2•-) y el radical hidroxilo (OH•). En
realidad el superóxido es químicamente inactivo pero tiene tendencia a reaccionar con
el óxido nítrico (NO•) formando peroxinitrito (ONOO-), que es muy reactivo y produce
oxidación de lípidos, proteínas y DNA. El superóxido puede dar lugar al no radical
peróxido de hidrógeno (H2O2) y a radicales hidroxilo OH•, que a su vez atacarán
macromoléculas como proteínas, lípidos, azúcares y polinucleótidos, que son
sensibles a la oxidación.
En comparación con el resto del cerebro, en la SNpc la cantidad de estrés oxidativo
generada es mucho mayor debido al catabolismo de la DA que ocurre bien de manera
dependiente de MAO (figura 11A), generándose en el proceso peróxido de hidrógeno,
o bien por autooxidación (figura 11B) cuando se encuentra en presencia de oxígeno,
creándose peróxido de hidrógeno además de semiquinonas (SQ•-). Las semiquinonas
polimerizan a través de una cascada metabólica sintetizándose así la neuromelanina,
de la cual el cuerpo no puede deshacerse, de modo que se acumula en el interior de
las células de la substantia nigra, así designada a causa del color negro que le
confiere dicho compuesto (Graham, 1978).
Introducción
23
El H2O2 puede transformarse en un agente extremadamente tóxico en presencia de
formas reducidas de los iones de los metales de transición como Fe2+ o Cu+, ya que se
forman radicales hidroxilos a través de la reacción de Fenton (figura 11C). En
cerebros de pacientes fallecidos por la EP se han encontrado muchos marcadores
biológicos de daño oxidativo (Dauer y Przedborski, 2003).
A) DA + O2 + H2O DOPAC + NH3 + H2O2
B) DA + O2 SQ•- + O2•- + 2H+
DA + O2•- SQ•- + O2 + H2O2
C) O2•- + Fe3+ O2 + Fe2+
H2O2 + Fe2+ OH• + OH- + Fe3+ Reacción de Fenton
O2•- + H2O2 O2 + OH• + OH- Ciclo de Haber-Weiss
Figura 11. Oxidación de la dopamina y reacción de Fenton. La degradación de la dopamina
enzimática (A) o no enzimática (B) tiene como resultado la formación de especies reactivas de
oxígeno. C) El peróxido de hidrógeno resultante participa en la reacción de Fenton, segundo
paso en el ciclo de Haber-Weiss, generando radicales OH•, que son la especie más reactiva y
perjudicial de todas las formas existentes de oxígeno activas. En dicho ciclo es necesario un
primer paso a través del cual se reduce el ión Fe3+a Fe2+, que cataliza la reacción de Fenton.
Por otra parte, la elevada presencia de iones Fe2+ en la SN favorece la reacción de Fenton y
por ende la producción de radicales de oxígeno reactivos.
Las disfunciones mitocondriales son otra posible causa de la EP idiopática. Esta
hipótesis se basa en la descripción de la disminución de la actividad del Complejo I de
la cadena respiratoria en las mitocondrias de la SN de pacientes con EP así como en
sus plaquetas. Diversos estudios revelan que estas disfunciones no tienen su origen
en una mutación del DNA mitocondrial sino más bien en genes nucleares que afectan
directa o indirectamente el funcionamiento de las mitocondrias, como son PINK,
Parkin, g-sinucleína, DJ-1 y LRRK2, todos ellos relacionados con las formas de
Parkinson familiar (Schapira, 2007; Vila et al., 2008). Del mismo modo, ha sido
demostrado que la inhibición del Complejo I de la cadena respiratoria aumenta la
producción de ROS (Drechsel y Patel, 2008). La evidencia de que existen toxinas
capaces de inhibir la actividad del Complejo I de la cadena de transporte de electrones
MAO
Introducción
24
de la mitocondria provocando una degeneración selectiva de la SN refuerzan la teoría
de que las disfunciones mitocondriales podrían ser una causa de la
neurodegeneración en la EP (Przedborski et al., 2004).
Muchos estudios avalan la hipótesis de la implicación de procesos inflamatorios en
la neurodegeneración observada en la EP. La presencia de glía reactiva en la SNpc de
los pacientes con EP es un fenómeno ampliamente descrito, así como el aumento de
citoquinas (IL-1ß, IL-2, IL-6, TNF-g) y prostaglandinas proinflamatorias (COX-1 y COX-
2) (McGeer et al., 1988; Mogi et al., 1996; Vila et al., 2001b). La microglía activada,
produce además especies reactivas de oxígeno y especies reactivas de nitrógeno
(NO•) a consecuencia de la inducción de la expresión del enzima iNOS (Orr et al.,
2002). Asimismo, el estudio post-mortem de pacientes con parkinsonismo inducido por
MPTP reveló la presencia de gliosis y agrupación de células microgliales en las
neuronas dopaminérgicas, incluso después de muchos años de la intoxicación
(Langston et al., 1999). Estos datos sugieren que tras un daño producido, ya sea por
una toxina, por un factor ambiental o por causas genéticas, la reacción glial puede
perpetuar la degeneración de neuronas dopaminérgicas (Hartmann et al., 2003). En
concordancia, diversos agentes antiinflamatorios han mostrado capacidad
neuroprotectora en modelos animales de EP reforzando la hipótesis (Castano et al.,
2002; Orr et al., 2002).
Otro factor que se ha propuesto como causante de la neurodegeneración que tiene
lugar en la EP es la excitotoxicidad. Uno de los efectos de la formación de especies
reactivas de oxígeno (ROS) en las células es la liberación del neurotransmisor
excitatorio glutamato, causante de la denominada “neurotoxicidad glutamatérgica” que
se produce como consecuencia de la activación excesiva de los receptores
ionotrópicos NMDA (N-Metil-D-aspartato), debido a su unión con el glutamato. Esto
resulta en un incremento de los niveles de calcio citosólico y posteriormente
mitocondrial, lo cual lleva a la activación de enzimas como la oxido nítrico sintasa
(NOS), generándose óxido nítrico (NO) en elevadas concentraciones que al difundir,
incrementa la liberación de glutamato en la neurona presináptica. Esta neurotoxicidad
puede derivar en daño mitocondrial e incluso llevar a la muerte celular dependiente de
calcio (Duchen, 2004). Por otra parte, el glutamato puede actuar inhibiendo la
recaptación de cisteína, molécula precursora del glutatión, lo que tiene por
consecuencia el descenso de las defensas antioxidantes y por ende el aumento de la
presencia de ROS. Se ha postulado que la desinhibición del núcleo subtalámico (STN)
producida por la deficiencia de dopamina en la EP podría generar una neurotoxicidad
Introducción
25
glutamatérgica y subsecuente degeneración dopaminérgica en la SNpc, que contiene
receptores de glutamato NMDA (Rodríguez et al., 1998).
La deposición anómala de proteínas en el tejido cerebral es un rasgo característico de
muchas enfermedades neurodegenerativas asociadas al envejecimiento, entre ellas la
EP. Si bien la composición y localización de los agregados proteicos difiere entre las
distintas patologías, esta peculiaridad común a todas sugiere que la deposición
proteica per se, o algún evento relacionado, es tóxico para las neuronas (Dauer y
Przedborski, 2003). Este fenómeno ha sido observado tanto en la forma esporádica
como familiar de la EP. La generación de proteínas anómalas es algo habitual en los
procesos celulares. En la SN, donde la producción de ROS está incrementada, se
potencia su formación debido a que éstos atacan sobre todo a las proteínas. Proteínas
mal plegadas o agregadas pueden interferir con procesos intracelulares llegando a ser
neurotóxicas, de modo que el equilibrio entre producción y eliminación de proteínas
anómalas es crucial para la viabilidad celular. Existen dos vías de degradación
proteica: la autofagia (mediada por lisosomas) y el sistema ubiquitin-proteosoma
(UPS), que degrada enzimáticamente las proteínas marcadas previamente con
moléculas de ubiquitina. Un desequilibrio en el sistema desemboca en el llamado
“estrés proteolítico”, en el que partes de proteínas degradadas, mutadas, plegadas
incorrectamente, desnaturalizadas, oxidadas o dañadas de otro modo se acumulan y
se agregan entre ellas y con otras proteínas normales. En la EP, donde el estrés
proteolítico es un elemento clave, agregados proteicos y cuerpos de Lewy pueden ser
observados en el citoplasma de las neuronas (McNaught et al., 2006).
Si bien la mayoría de casos de EP son idiopáticos, diversas mutaciones en los loci de
los genes denominados “PARK” (PARK1-13) han sido relacionados con la aparición
de casos de EP familiar. La proteína g-sinucleina (PARK1) es ubicua en el SNC y
abundante en el cerebro adulto. Su mutación causa una aparición temprana y
desarrollo rápido de la EP. Bajo determinadas circunstancias se produce una
agregación de la molécula provocando un daño selectivo de las neuronas
dopaminérgicas acompañado por la aparición de cuerpos de Lewy (Polymeropoulos et
al., 1997). Al igual que en esta EP familiar, en la mayoría de casos de EP de tipo
esporádico también se ha observado la presencia de CL que contienen g-sinucleina.
La mutación del gen Parkin (PARK2) está asociada al parkinsonismo juvenil. En este
caso, la pérdida de función del enzima Ubiquitin-E3 ligasa provoca una acumulación
de proteínas que no se pueden eliminar a través del proteosoma. Es un tipo de EP que
no presenta cuerpos de Lewy. Del mismo modo, las mutaciones en UCH-L1 (PARK5)
impiden que las proteínas mal plegadas entren en el proteosoma para degradarse,
Introducción
26
acumulándose así en la célula. PINK1 (PARK6) y DJ-1 (PARK7) parecen ejercer una
función antioxidante en la mitocondria y su mutación llevaría a la pérdida de protección
contra el estrés oxidativo y a la muerte celular. Las mutaciones en el gen LRRK2
(PARK8) son una de las causas más frecuentes en el Parkinson familiar y también se
han encontrado en algunos casos de EP esporádica. Aunque no se sabe cómo
funciona, su mutación podría producir neurodegeneración (McNaught et al., 2006;
George et al., 2009).
Si bien se desconoce en muchos casos el funcionamiento exacto de las proteínas y en
definitiva, el efecto real que provocan sus diversas mutaciones, existe la hipótesis de
que el plegamiento incorrecto de las proteínas sumado a una incorrecta degradación
de las mismas son el factor que relaciona las causas genéticas con la
neurodegeneración dopaminérgica observada en casos EP familiar (Vila y
Przedborski, 2004).
Tabla 1. Loci de genes identificados relacionados con la enfermedad de Parkinson. Locus Gene Chromosome Inheritance Probable function
PARK1,4 g-Synuclein 4q21 AD Presynaptic protein, Lewy body
PARK2 Parkin 6q25.2-27 AR Ubiquitin E3 ligase
PARK3 Unknown 2p13 AD Unknown
PARK4 Unknown 4p14 AD Unknown
PARK5 UCH-L1 4p14 AD Ubiquitin C-terminal hydrolase
PARK6 PINK1 1p35-36 AR Mitochondrial kinase
PARK7 DJ-1 1p36 AR Chaperone, Antioxidant
PARK8 LRRK2 12p11.2 AD Mixed lineage kinase
PARK9 ATP13A2 1p36 AR Unknown
PARK10 Unknown 1p32 AD Unknown
PARK11 Unknown 2q36-37 AD Unknown
PARK12 Unknown Xq21-q25 Unknown Unknown
PARK13 HTRA2 2p12 Unknown Mitochondrial serine protease
AD: autosómico dominante, AR: autosómico recesivo
Por último, también se ha propuesto que los factores ambientales podrían
representar un factor de riesgo de la EP, si bien los estudios realizados hasta el
momento no son concluyentes. El extendido uso de pesticidas como el Paraquat o la
Rotenona, y la exposición constante a metales de transición como el hierro o el cobre
podrían contribuir al desarrollo de esta enfermedad (Di Monte et al., 2003).
En resumen, todos estos factores potencialmente patológicos están estrechamente
relacionados, siendo unos causa o consecuencia de los otros. En este sentido, el
estrés oxidativo provoca el plegamiento incorrecto y agregación de las proteínas, la
disfunción mitocondrial genera estrés oxidativo. La acumulación anómala de proteínas
Introducción
27
genera estrés oxidativo y disfunciones mitocondriales. Por otra parte, la inflamación así
como los procesos excitotóxicos también generan estrés oxidativo, disfunción
mitocondrial y plegamiento proteico incorrecto. Todas estas evidencias refuerzan la
teoría de una etiología multifactorial de la enfermedad de Parkinson (figura 12).
Figura 12. Esquema de los factores que podrían contribuir al desencadenamiento de la
enfermedad de Parkinson.
Enfermedad de Parkinson y apoptosis
La apoptosis o muerte celular programada es un proceso genéticamente controlado
por el que las células inducen su propia muerte en respuesta a determinados
estímulos. En condiciones normales constituye un mecanismo fundamental para el
mantenimiento de la homeostasis del organismo. No obstante, la desregulación de
esta vía en el cerebro puede estar vinculada a procesos neurodegenerativos (Dauer y
Przedborski, 2003).
Este proceso se caracteriza por cambios morfológicos como por ejemplo la
condensación nuclear y citoplasmática, por la pérdida de potencial de membrana
mitocondrial, por la fragmentación del DNA, por la alteración en la composición de la
membrana plasmática y por la formación de cuerpos apoptóticos, entre otras cosas
(Levy et al., 2009).
Introducción
28
La vía apoptótica presenta unos componentes centrales que son los miembros de la
familia de las caspasas (proteasas dependientes de cisteína con especificidad por
aspartato). Las caspasas se dividen en dos grupos principales: las caspasas
iniciadoras, que dan comienzo a la cascada proteolítica, y las caspasas efectoras,
como la caspasa-3, que provocan la muerte de la célula actuando sobre moléculas
intracelulares diana. Se sintetizan como pro-enzimas y son activadas mediante cortes
específicos en residuos de aspartato. Tras la activación, las caspasas cortan otras
moléculas diana intracelulares, incluyendo otras caspasas, resultando en una cascada
de muerte celular amplificada (Cryns y Yuan, 1998).
Existe controversia acerca del tipo de muerte neuronal que se produce en la EP (ver
Vila y Przedborski, 2003) ya que a menudo resulta complicado caracterizar
morfológicamente las neuronas muertas en tejidos procedentes de autopsias debido a
que se encuentran en baja proporción y a su rápida eliminación del organismo. Sí
existen, sin embargo, evidencias de que marcadores biológicos del proceso de
apoptosis (Bax, Bcl-XL, caspasa-3, -8 y -9) aparecen alterados en muestras post-
mortem procedentes de enfermos fallecidos a causa de la EP. Por ejemplo, la proteína
pro-apoptótica Bax aparece sobreexpresada y localizada en la pared mitocondrial en
neuronas dopaminérgicas de la SNpc (Hartmann et al., 2001). Asimismo, los niveles
de la proteína anti-apoptótica Bcl-XL se encuentran elevados coincidiendo con la
activación de los efectores de la apoptosis caspasa-3, caspasa-8 (Hartmann et al.,
2000, 2001b, 2002) y caspasa-9 (Viswanath et al., 2001).
Debido a las limitaciones existentes para realizar un estudio exhaustivo de las
muestras cerebrales de pacientes fallecidos con EP comentadas anteriormente, se ha
recurrido a la investigación con distintos modelos animales de EP a fin de corroborar la
hipótesis de la muerte celular por apoptosis en la enfermedad de Parkinson. Los
resultados obtenidos refuerzan esta teoría, ya que en estos modelos también se
observa la activación de caspasas, además de otros acontecimientos característicos
de esta muerte celular programada como por ejemplo la salida del citocromo c de la
mitocondria, el cambio de morfología y la fragmentación del DNA. En concordancia, la
inhibición de la vía de las caspasas evita la muerte neuronal por apoptosis en varias
de las investigaciones realizadas (Levy et al., 2009).
En resumen, estos estudios demuestran que la maquinaria del proceso apoptótico se
encuentra activada en tejidos cerebrales procedentes de pacientes con EP, lo que no
descarta que existan otros tipos de muerte celular (Dauer y Przedborski, 2003).
Introducción
29
2.6 Diagnóstico y terapia en la EP
Dado que hasta nuestros días no ha sido descubierto ningún marcador biológico
específico para la identificación de la enfermedad de Parkinson, el diagnóstico es
realizado a través de la observación y evaluación de las manifestaciones sintomáticas
del paciente por parte del médico especialista. Por este motivo, no son excepcionales
los casos de falsos diagnósticos y por tanto de tratamientos poco adecuados. Sólo el
80% de los casos de EP son confirmados post-mortem (Choonara et al., 2009).
Como las causas de la EP son hasta ahora prácticamente desconocidas, las terapias
existentes están dirigidas hacia el tratamiento sintomático. Si bien en la actualidad se
utilizan tratamientos paliativos, la investigación y el avance de la ciencia permitirán
encontrar un método para detener o ralentizar el proceso neurodegenerativo asociado
a esta enfermedad.
Actualmente la Levodopa (L-DOPA ó 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina) es el fármaco más
efectivo en el tratamiento sintomático de la enfermedad de Parkinson. Éste es un
aminoácido neutro y grande que, al contrario que la dopamina, es capaz de atravesar
la barrera hematoencefálica. En las neuronas dopaminérgicas, mediante la acción
enzimática de la DOPA descarboxilasa es transformada en DA, recuperándose los
niveles estriatales de dicho neurotransmisor. A fin de disminuir efectos indeseados, la
administración de L-DOPA suele prescribirse en combinación con Carbidopa o
Benserazida, que son inhibidores de la DOPA-descarboxilasa, con lo que se limita el
paso de L-DOPA a DA en el sistema periférico, aumentándose la entrada del
medicamento en el SNC (Choonara et al., 2009). A pesar de ser efectiva, la L-DOPA
no es la sustancia ideal, ya que no detiene el proceso neurodegenerativo y provoca
diferentes efectos colaterales relacionados sobre todo con la larga duración del
tratamiento (Marsden, 1994): debido a su corta vida media el paciente debe ingerir
más de una dosis diaria y además, como no es específica para el sistema
nigroestriatal, tras su ingesta la L-DOPA difunde por el SNC pudiendo producir efectos
secundarios tales como alucinaciones, psicosis y cambios en el comportamiento del
individuo. Como consecuencia más grave se producen disquinesias y fluctuaciones en
la función motora, como los fenómenos de On-Off y de wearing-off. Las disquinesias
son movimientos involuntarios resultantes de la administración continuada de L-DOPA.
Los periodos On se definen como aquellos intervalos de tiempo en los que L-DOPA es
efectiva contra los síntomas de la EP, en contraposición con los periodos Off, durante
los cuales la EP no responde al tratamiento. El fenómeno de wearing-off se da cuando
los efectos de la Levodopa no se mantienen hasta la siguiente dosis del tratamiento, y
se define como el periodo de beneficio clínico inducido por dosis individuales de L-
Introducción
30
DOPA. A partir de los 5 años de terapia, un alto porcentaje de pacientes dejan de
responder al tratamiento (George et al., 2009).
Aunque no son tan eficaces como la L-DOPA, existen otras sustancias que se pueden
administrar en las fases iniciales de la EP a fin de controlar o reducir sus
manifestaciones sintomáticas.
El tratamiento con agonistas dopaminérgicos como la Bromocriptina o el Pergolide
tiene la complicación de que tan solo es efectivo en un 30-50% de los pacientes
cuando se administra como monoterapia. No obstante, en los pacientes en que es
eficaz, se evitan las fluctuaciones motoras gracias a que estos fármacos tienen una
vida media larga. Además, se consigue prorrogar la administración de Levodopa,
retrasando a su vez la aparición de disquinesias y fluctuaciones causadas por el largo
tratamiento con dicho fármaco.
Otros ejemplos son la Apomorfina, el Pramipexole y Ropinirole, si bien estudios
recientes están poniendo en duda la efectividad de estas sustancias y sugieren que el
uso de agonistas dopaminérgicos no tiene un efecto importante en el curso de la EP
(George et al., 2009; Marsden, 1994).
La estrategia de la administración de moléculas inhibidoras de MAO se basa en la
inhibición de la degradación de la Dopamina, con lo cual se mantienen los niveles del
neurotransmisor. Por ejemplo la Selegilina (L-Deprenil, inhibidor irreversible de MAO
B) presenta una actividad neuroprotectora y antiapoptótica adicional a su habilidad de
mejorar los síntomas de la EP. Su administración en las primeras fases retrasa el inicio
del tratamiento con L-DOPA y se recomienda a los pacientes más jóvenes. En
ocasiones se coadministra con la L-DOPA reduciendo la dosis de ésta (George et al.,
2009).
El uso de anticolinérgicos o antagonistas de NMDA (Amantadina) en las fases
previas mejora sólo en un 20% los síntomas de los pacientes, lo cual es suficiente
para mantener cierta independencia y retrasar la toma de Levodopa, pero en pacientes
ancianos, los efectos secundarios que produce son incompatibles con la terapia
(problemas de memoria, alucinaciones, psicosis, etc) (Marsden, 1994; Orr et al., 2002).
Existen intervenciones quirúrgicas ablativas en las que se interrumpen de manera
extremadamente precisa las proyecciones del tálamo, globo pálido interno o núcleo
subtalámico. Estas incisiones están indicadas cuando el temblor, las disquinesias o las
fluctuaciones son incontrolables mediante la toma de alguno de los diversos fármacos
que se utilizan actualmente para paliar la EP (Iacono et al., 1995). Otra técnica es la
Introducción
31
implantación estereotáxica de un microelectrodo que produce una estimulación crónica
de alta frecuencia en el tálamo (Benabid et al., 1991). Otros métodos como la
implantación de células dopaminérgicas embrionales directamente en el núcleo
estriado de pacientes con la enfermedad de Parkinson no han aportado por el
momento un resultado satisfactorio (Olanow et al., 2003).
3. Modelos experimentales de la enfermedad de Parkinson. Parkinsonismo
El principal obstáculo existente en el desarrollo de drogas neuroprotectoras es el
desconocimiento de los eventos moleculares específicos que llevan al
desencadenamiento de la enfermedad de Parkinson. A pesar de los esfuerzos
realizados y de los avances obtenidos, todos los tratamientos vigentes son
sintomáticos y ninguno de ellos es capaz de detener o ralentizar la degeneración de
las neuronas dopaminérgicas de la SNpc. La tendencia actual en las líneas de
investigación es la elucidación de los mecanismos implicados en la evolución de la
dolencia con la finalidad de evitarla o de moderar la velocidad de su progreso. A lo
largo de la historia los modelos celulares y animales han demostrado, por lo general,
ser una herramienta muy válida para la investigación y aunque en este caso concreto
el desarrollo de la EP no sea espontáneo, los modelos que se han conseguido
reproducen con distinto grado de analogía y a diferente escala, el mal de Parkinson.
Estos modelos, tanto celulares como animales, han sido basados bien en
aproximaciones genéticas o bien en la administración de neurotoxinas.
3.1 Modelos celulares
La mayor parte de las nuevas estrategias terapéuticas desarrolladas para la lucha
contra la enfermedad de Parkinson son inicialmente evaluadas en modelos celulares.
Los cultivos celulares presentan diversas ventajas: ofrecen un acceso fácil e ilimitado a
pruebas genéticas y farmacológicas posibilitando así un screening rápido tanto de la
patogénesis como de drogas candidatas para su tratamiento. Asimismo, permiten la
realización de experimentos repetitivos para evaluar mediante diferentes técnicas la
viabilidad, estado metabólico, toxicidad, presencia de agregados proteicos o diversos
parámetros bioquímicos, a la vez que disminuyen el número necesario de
experimentos con animales. Por otra parte, poseen el inconveniente de que su
Introducción
32
supervivencia es dependiente de las condiciones de cultivo, además de que las células
no desarrollan su red de contactos naturales.
En la investigación de la EP diversos tipos de modelos son utilizados, siendo los más
comunes los cultivos primarios mesencefálicos y las líneas celulares de origen
dopaminérgico. Los cultivos primarios de neuronas mesencefálicas (obtenidos de
embriones en estadio E14) están compuestos por neuronas gabaérgicas, células
gliales y por neuronas dopaminérgicas. Aunque estas últimas se encuentran en una
proporción muy baja (entre un 5-10% de la población total del cultivo) tienen la ventaja
de que estas están ya diferenciadas (Hsuan et al., 2006). Las líneas celulares
inmortalizadas constituyen un modelo muy práctico y muy utilizado ya que
proporcionan poblaciones celulares homogéneas que expresan la mayoría de
proteínas que caracterizan las neuronas dopaminérgicas. La desventaja radica en que
son células en continua proliferación, lo cual produce un cambio de apariencia y
comportamiento a lo largo de los pases a causa de la acumulación de alteraciones
genéticas y epigenéticas (Falkenburger y Schulz, 2006). No obstante, existen varias
líneas celulares dopaminérgicas bien caracterizadas que son de uso habitual en los
laboratorios de investigación. Generalmente, estas poblaciones adquieren fenotipos
más neuronales y más dopaminérgicos cuando se diferencian, aunque también puede
trabajarse con ellas cuando se encuentran en un estado inmaduro, es decir, sin
diferenciar. Varios ejemplos de estos modelos serían las líneas de células
inmortalizadas mesencefálicas de rata 1RB3AN27 (conocida también como N27)
(Adams et al., 1996) y de ratón SN4741 (Son et al., 1999), la línea de feocromocitoma
de rata PC12 (Greene y Tischler, 1976) o las líneas derivadas de neuroblastomas
murino como MN9D (Oh et al., 1995) o NPB2 (Adams et al., 1996), o humano SH-
SY5Y (Sheehan et al., 1997), SK-N-MC (Sherer et al., 2003). Por último, la utilización
de cultivos organotípicos procedentes de la SNpc de embriones de rata posee la
ventaja de contener neuronas dopaminérgicas diferenciadas que además se
encuentran en su medio de desarrollo habitual de modo que este sistema combina
características de cultivo celular y de animales intactos. Aunque todavía existen
dificultades en cuanto a la determinación de viabilidad y alteraciones bioquímicas, se
espera que con los avances de la técnica este tipo de cultivo pueda llegar a ser un
modelo relevante para la investigación de la enfermedad de Parkinson (Falkenburger y
Schulz, 2006).
Diversas toxinas (descritas en el apartado 3.2.2) han sido aplicadas a los modelos
celulares de neuronas dopaminérgicas previamente detallados a fin de intentar
elucidar los mecanismos relacionados con el desarrollo y progreso de la enfermedad
Introducción
33
de Parkinson (por ejemplo Prasad et al., 1998; Kress y Reynolds, 2005; Fonck y
Baundry, 2001).
3.2 Modelos animales
3.2.1 Modelos genéticos
El descubrimiento de la implicación de la mutación de diversos genes específicos en la
EP es especialmente interesante ya que a priori permite teorizar sobre una relación
putativa entre dichas mutaciones y el Parkinson idiopático además de hacer posible la
creación de modelos que permitan comprender los fenómenos bioquímicos y
fisiológicos que acompañan a este desorden neurodegenerativo.
Tres tipos de modelos genéticos de la EP han sido recientemente desarrollados.
Primero, modelos de ratón basados en la depleción de genes importantes para el
desarrollo o mantenimiento de las neuronas dopaminérgicas o su fenotipo. A pesar de
la pérdida de células dopaminérgicas que se observa, los animales presentan una
patología nigroestriatal modesta y carecen de cuerpos de Lewy, por lo que se discute
su relevancia científica (Meredith et al., 2008). Segundo, modelos de rata o ratón
modificados genéticamente para conseguir un déficit (Knockout) o una sobreexpresión
de determinados genes relacionados con formas autosómicas dominantes de la
enfermedad de Parkinson familiar. Aunque existen modelos con mutaciones en genes
como Parkin, PINK1, DJ1 y LRRK2, la mutación más estudiada es la del gen que
codifica para la proteína g-sinucleína (snca), debido a que es el único nexo
demostrado entre una mutación causante de EP familiar y la EP esporádica. Los
modelos de ratones transgénicos knockout para la proteína g-sinucleína generados
hasta el momento, demuestran que la ablación del gen no está asociada a ningún
cambio neuropatológico sugiriendo que la EP asociada a la mutación de esta proteína
es debido a un efecto de ganancia de función (Dauer y Przedborski, 2003). Es sabido
que las mutaciones sin sentido Ala53Thr (Polymeropoulos et al., 1997), Ala30Pro
(Krüger et al., 1998) y E46K (Zarranz et al., 2004) así como duplicaciones o
triplicaciones del gen snca (Hope et al., 2004) son responsables de la EP familiar en
humanos. De este modo, modelos de ratón que sobreexpresan g-sinucleína salvaje o
que presentan alguna de las mutaciones descritas constituirían a priori un modelo
excelente para el estudio de la EP esporádica (Chesselet et al., 2008), sin embargo,
estos ratones transgénicos no logran reproducir la pérdida significativa de neuronas
dopaminérgicas nigrales característica de la EP (Meredith et al., 2008). Por ese motivo
surgió el tercer tipo de modelo genético de la EP basado en la sobreexpresión de
Introducción
34
genes en su forma salvaje o con mutaciones causantes de EP familiar, a través de la
inyección estereotáxica de vectores virales en individuos adultos, generalmente en
neuronas DA nigroestriatales. En estos modelos, en los que se expresó g-sinucleína
humana en forma salvaje y mutada, se observa la pérdida selectiva y progresiva de
neuronas dopaminérgicas así como los déficits de comportamiento asociados.
Asimismo, se detecta la aparición de neuritas distróficas similares a las observadas en
la EP y de inclusiones citoplasmáticas de g-sinucleína. Estas investigaciones fueron
llevadas a cabo en primates no humanos (Kirik et al., 2003) y en ratas (Lo Bianco et
al., 2002; Ulusoy et al., 2008). Estudios más recientes realizados utilizando esta
aproximación revelan la fosforilación en el residuo Serina 1β9 de la proteína g-
sinucleína, cuya presencia ha sido también identificada en estudios post-mortem de
pacientes con EP (Fujiwara et al., 2002).
3.2.2 Modelos basados en la utilización de toxinas
3.2.2.1 MPTP (1-Metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina)
El MPTP es un subproducto de la síntesis de la meperidina (narcótico analgésico,
Demerol®) capaz de producir un síndrome parkinsoniano casi indistinguible de la EP,
que responde al tratamiento con L-DOPA (Langston et al., 1983). Desde su
descubrimiento hasta la actualidad, el MPTP ha sido utilizado como herramienta
farmacológica en una amplia variedad de modelos in vivo e in vitro con el único
objetivo de esclarecer los procesos subyacentes a la neuropatología de la enfermedad
de Parkinson así como de otras enfermedades neurodegenerativas (Speciale, 2002) y
si bien los modelos experimentales utilizados difieren en algunos aspectos de la EP
idiopática, el procedimiento basado en la administración de MPTP es considerado
como el mejor modelo de EP existente (Dauer y Przedborski, 2003).
Esta neurotoxina tiene la capacidad de originar un síndrome parkinsoniano persistente
en humanos y primates no humanos acompañado por la pérdida de neuronas del
sistema nigroestriatal, que responde al tratamiento con L-DOPA. En contraste, la
administración periférica de la molécula en roedores produce pérdidas en el contenido
de DA cerebral y daña el sistema nigroestriatal únicamente cuando se administra a
dosis relativamente elevadas no observándose déficits motores persistentes (Jenner y
Marsden, 1986).
Por otra parte, el tratamiento con MPTP/MPP+ no parece que induzca la formación de
cuerpos de Lewy (Shimoji et al., 2005), aunque en algunos estudios se ha descrito que
Introducción
35
puede dar lugar a inclusiones intraneuronales que recuerdan a este tipo de agregados
proteicos (Forno et al., 1993).
Al igual que en la enfermedad de Parkinson, son muchos los factores que intervienen
en el desencadenamiento y desarrollo de la intoxicación producida por MPTP/MPP+ y
es esa similitud la que hace interesante la utilización de este modelo en la
investigación contra la EP.
Biotransformación
Tras una administración sistémica, el MPTP, que es una molécula altamente lipofílica,
es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica en cuestión de pocos minutos
(figura 13, figura 14). Una vez en el cerebro, sufre una transformación secuencial que
consta de dos pasos: en primer lugar el MPTP es oxidado por la acción del enzima
MAO-B dando lugar al 1-Metil-4-fenil-2,3-dihidropiridinio, MPDP+. Esta transformación
es llevada a cabo en el interior de astrocitos o neuronas serotoninérgicas, que son las
únicas células que contienen MAO-B (Chiba et al., 1984; Markey et al., 1984). En un
segundo paso, el MPDP+ es nuevamente oxidado de modo probablemente
espontáneo, formándose así el 1-Metil-4-fenilpiridinio, MPP+, que es el metabolito
tóxico activo. Éste es excretado posteriormente a través del transportador de cationes
orgánicos, Oct-3, hacia el espacio extracelular (Cui et al., 2009).
El MPP+, a diferencia de su precursor, no es capaz de difundir libremente a través de
las bicapas lipídicas de modo que depende del transporte específico mediante un
transportador de membrana para ingresar en las células. Diversos experimentos han
demostrado su gran afinidad por el transportador de dopamina, DAT, al igual que por
los transportadores de noradrenalina, NAT, y serotonina, SERT (Przedborski et al.,
2001), si bien tras el tratamiento con MPTP, la mayor parte de MPP+ puede ser
localizada en neuronas dopaminérgicas del sistema nigroestriatal (Javitch et al., 1985).
De hecho, la administración de distintos inhibidores de DAT, in vitro e in vivo, previene
de la intoxicación de las neuronas dopaminérgicas causada por el tratamiento con
MPTP (Javitch et al., 1985; Mayer et al., 1986), al igual que la ausencia del
transportador DAT en ratones transgénicos (Bezard et al., 1999).
Introducción
36
Figura 13. Biotransformación del MPTP. Dentro de los astrocitos o de neuronas
serotoninérgicas el MPTP es oxidado por acción del enzima MAO-B obteniéndose como
producto el MPDP+. Éste es muy inestable y de inmediato es convertido en MPP+, la molécula
tóxica activa, presumiblemente mediante una oxidación espontánea.
MPTP:1-Metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina, MPDP+:1-Metil-4-fenil-2,3-dihidropiridinio, MPP+:
1-Metil-4-fenilpiridinio, MAO-B: Monoaminooxidasa B
Una vez dentro de la neurona, el MPP+ puede seguir al menos tres rutas: (1) puede
unirse al transportador vesicular de monoaminas-2 (VMAT-2), que lo transloca al
interior de las vesículas sinaptosomales (Staal y Sonsalla, 2000), (2) puede
permanecer en el citosol y reaccionar con diferentes enzimas citosólicos como la
xantina oxidasa o la aldehído deshidrogenasa (Klaidman et al., 1993), y (3) puede
penetrar y acumularse en la mitocondria a través de un mecanismo que depende del
gradiente eléctrico de la membrana mitocondrial (Ramsay y Singer, 1986).
El secuestro del MPP+ en el interior vesicular protege las células de la acción tóxica de
la molécula, y concordantemente, la inhibición del transportador VMAT-2 promueve la
neurotoxicidad celular producida por el MPP+ (Staal y Sonsalla, 2000). El MPP+ que no
es incluido en las vesículas puede acceder al interior de la mitocondria, desde donde
ejerce su función principal.
Mecanismo de toxicidad inducida por el MPP +
La acumulación de MPP+ en la mitocondria lleva a una disminución de la actividad
mitocondrial. Una vez en su interior, el MPP+ se une al Complejo multienzimático I
(NADH/Ubiquinona oxidoreductasa) de la cadena de transporte de electrones
bloqueando así el proceso fosforilación oxidativa (Nicklas et al., 1985), de modo que
se produce un empobrecimiento de los niveles de ATP celulares.
Introducción
37
Más concretamente, el MPP+ es capaz de unirse a dos sitios distintos dentro de la
cadena de transporte de electrones, siendo necesaria la unión a ambos lugares
simultáneamente para provocar la inhibición completa de la respiración mitocondrial.
La unión al primer sitio, más hidrofílico, es responsable únicamente de un decremento
del 40% en la oxidación de NADH, sin embargo la unión al segundo sitio, más
hidrofóbico, parece provocar un bloqueo más potente del Complejo I (Przedborski et
al., 2004). Un estudio realizado por Chan y colaboradores demuestra que la aplicación
de MPTP en ratón produce una reducción de tan sólo un 20% y de manera transitoria
los niveles estriatales de ATP (Chan et al., 1991). Este acontecimiento repercute sin
duda en todos los procesos dependientes de energía, pero no explica la degeneración
neuronal observada tras la aplicación de la neurotoxina.
Otra consecuencia de la interrupción del flujo de electrones de la cadena respiratoria
mitocondrial es el aumento de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS),
especialmente de superóxido (O2•-), que puede reaccionar con óxido nítrico (NO•)
producido en células no dopaminérgicas, generando peroxinitrito (ONOO -), sustancia
capaz de producir peroxidación lipídica y lesiones en la membrana así como una
posterior degeneración celular.
Asimismo, la administración de la neurotoxina provoca la fuga de DA almacenada en
las vesículas sinápticas a través del transportador VMAT-2 debido a que la carencia de
ATP impide el mantenimiento del gradiente de concentraciones mediado por la H+-
ATPasa vacuolar (Dauer y Przedborski, 2003). La DA liberada (ver figura 11) puede
ser desaminada a través de la acción del enzima MAO generándose en el proceso
peróxido de hidrógeno, o bien puede autooxidarse cuando se encuentra en presencia
de oxígeno, creándose peróxido de hidrógeno además de radical superóxido y
semiquinonas (SQ•-). El H2O2 resultante de ambos procesos, en presencia de ión
ferroso (Fe2+), abundante en los ganglios basales, contribuye a la formación de más
radicales OH• a través de la reacción de Fenton (Obata, 2002).
Estudios de Przerborski y colaboradores evidencian la importancia de la implicación
de las especies reactivas de oxígeno en la neurodegeneración inducida por MPTP in
vivo, ya que ratones transgénicos que sobreexpresaban la superóxidodismutasa-1
(Cu/ZnSOD1), enzima clave para la detoxificación de ROS celular, resultaron ser
resistentes a la degeneración neuronal (Przerborski et al., 1992).
Por otra parte, la participación de procesos inflamatorios en la toxicidad inducida por
MPTP ha sido demostrada tanto en humanos (Langston et al., 1999) como en modelos
Introducción
38
animales, en los cuales se ha visto disminuida dicha toxicidad a consecuencia de la
administración de sustancias antiinflamatorias tales como Meloxicam o dexometasona
(Castano et al., 2002; Orr et al., 2002). La administración sistémica de MPTP produce
una activación de la microglía y la sobreexpresión del enzima iNOS, lo que contribuye
al aumento NO• y de ROS, y lleva a un estado de inflamación mantenida que
desemboca en la muerte de las neuronas dopaminérgicas (Orr et al., 2002).
La administración intraestriatal de MPP+ provoca una acumulación de calcio y un eflujo
masivo de DA del núcleo estriado. La concentración intracelular anormal de Ca2+
causa un aumento de producción de radical superóxido. La DA extracelular puede ser
oxidada generando grandes cantidades de radical hidroxilo, quinonas y semiquinonas,
que resulta en un daño sitio-específico produciéndose, en primer lugar, una
degeneración del botón sináptico de las neuronas dopaminérgicas y posteriormente
una degeneración retrógrada de las neuronas nigroestiatales (Obata et al., 2002).
A resultas del aumento de ROS se produce también la exocitosis de glutamato de las
neuronas. La hiperexcitación de los receptores NDMA por el glutamato acarrea
diversas consecuencias, como por ejemplo la entrada de calcio que, además de la
exocitosis de DA comentada anteriormente, puede originar la activación de enzimas
reguladas por este ión (proteasas, fosfatasas, nucleasas, lo que puede dar lugar a la
destrucción de proteínas, fosfolípidos y ácidos nucleicos) (Coyle y Puttfarcken, 1993).
En definitiva, la desregulación de la homeostasis del calcio provoca un mal
funcionamiento de la mitocondria, lo que genera una caída en la producción de ATP a
la par que un aumento en la concentración de ROS, situación que conduce a la muerte
celular (Schinder et al., 1996). Al mismo tiempo se promueve un decremento en la
síntesis de glutatión, lo cual reduce las posibilidades de detoxificación de la célula, a la
vez que se ve elevada la producción de NO• debido a la activación del enzima iNOS.
En síntesis, la administración de MPP+ sume a la célula en un estado de crisis
energética y estrés oxidativo que desencadena una serie de eventos celulares que
conducen a la postre a la muerte, presuntamente apoptótica, de las neuronas
dopaminérgicas.
MPTP/MPP+ y apoptosis
Como se comentó anteriormente, la dificultad de realizar estudios post-mortem en
cerebros de pacientes fallecidos por EP ha llevado a la utilización de modelos
Introducción
39
animales a fin de profundizar los conocimientos en los procesos involucrados en la
generación y desarrollo de esta enfermedad. Tanto la EP como el modelo basado en
la administración de MPTP se han asociado a la pérdida de neuronas dopaminérgicas
de la SNpc y aunque no se tiene la certeza de que este tipo de muerte celular sea el
mayoritario en esta patología, la apoptosis ha sido implicada en el proceso
neurodegenerativo.
En ratones tratados con MPTP se ha reportado la degeneración de células
dopaminérgicas de la SN con presencia de DNA fragmentado y activación de la
caspasa-3 (Tatton y Kish, 1997; Hartmann et al., 2000). Otras investigaciones
demuestran que ratones inyectados de igual manera, presentan una activación y
traslocación a la pared mitocondrial de la proteína pro-apoptótica Bax (Perier et al.,
2005) y en concordancia con este resultado, ratones knock out para Bax o ratones que
sobreexpresaban la proteínas anti-apoptóticas de la familia Bcl2, resultaron ser
resistentes a la neurotoxina (Vila et al., 2001).
Por último, la inhibición de la cascada de las caspasas resulta en una protección
contra la degeneración neuronal dopaminérgica tanto in vivo como in vitro,
observándose en los ratones tratados con MPTP salida del citocromo c, activación de
la caspasa-3, caspasa-8, caspasa-9 y corte de Bid en la SN, todos estos hechos
característicos del proceso apoptótico (Viswanath et al., 2001).
3.2.2.2 6-Hidroxidopamina (6-OHDA)
La 6-OHDA fue el primer agente tóxico utilizado para producir un modelo animal de la
enfermedad de Parkinson. Ungerstedt demostró en 1968 que la aplicación de esta
sustancia llevaba a la muerte de las células dopaminérgicas de la SNpc (Ungerstedt,
1968). Si bien el modelo no mimetiza completamente la EP, es un modelo
extensamente utilizado en la investigación.
La toxicidad producida por la 6-OHDA es relativamente selectiva para neuronas
catecolaminérgicas, resultado de una recaptación preferencial por parte de los
transportadores de dopamina (DAT) y noradrenalina (NAT) (Luthman et al., 1989). En
el interior de las neuronas, la 6-OHDA se acumula en el citosol, generando especies
reactivas de oxígeno (ROS) e inactivando macromoléculas biológicas a través de la
generación de quinonas y peróxido de hidrógeno (Cohen, 1984; Heikkila y Cohen,
1973).
Debido a que la 6-OHDA no es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica, su
aplicación debe ser llevada a cabo mediante inyección estereotáxica en la SN, el haz
Introducción
40
prosencefálico medial (que comprende el tracto nigroestriatal) o bien en el complejo
caudato-putamen (Deumens et al., 2002), a fin de promover su acceso a la vía
nigroestriatal. Las lesiones perpetradas en la SNpc producen una agresión aguda que
da lugar a una muerte neuronal de morfología no apoptótica (Jeon et al., 1995). Por el
contrario, las lesiones en el núcleo estriado producen una degeneración retrógrada
progresiva de la vía nigroestriatal con características apoptóticas (Jeon et al., 1995),
en modo dosis- dependiente (Przedborski et al., 1995).
Por lo general, el modelo de EP más utilizado en animales es el que resulta de la
inyección estereotáxica intraestriatal unilateral, lo cual permite usar el núcleo
contralateral como control. Esta inyección causa un movimiento rotacional típico, la
magnitud del cual depende del grado de lesión de la vía nigroestriatal (Przedborski et
al., 1995; Ungerstedt y Arbuthnott, 1970). Este comportamiento es potenciado por la
administración de drogas que estimulan los receptores dopaminérgicos como la
apomorfina, que induce una rotación contralateral al hemisferio de la lesión, o la
anfetamina, que induce un movimiento ipsilateral (Ghorayeb et al., 2002). La
posibilidad de cuantificar la rotación ha sido ampliamente utilizada para evaluar los
efectos antiparkinsonianos de distintas sustancias potencialmente neuroprotectoras.
Aunque a priori pueda parecer un modelo válido para el estudio de la EP, todavía no
se ha esclarecido si el mecanismo a través del cual la 6-OHDA mata las neuronas
dopaminérgicas comparte características moleculares con la EP, ya que hasta ahora,
en ninguno de los modelos generados con la toxina se ha detectado la presencia de
inclusiones citoplasmáticas de g-sinucleína o CL (Dauer y Przedborski, 2003).
3.2.2.3 Paraquat y Maneb
El Paraquat o dicloruro de 1,1´-dimetil-4-4´-bipiridinio, es un potente herbicida
peligrosamente venenoso para los mamíferos si es ingerido o inhalado. Al igual que
sucede con otros pesticidas, su uso se ha relacionado con un aumento del riesgo de
padecer EP en humanos, aunque las inconsistencias encontradas en diferentes
investigaciones epidemiológicas no hacen posible establecer una relación directa entre
el uso de la sustancia y la EP (Di Monte, 2003).
El Paraquat atraviesa la barrera hematoencefálica de modo específico utilizando un
transportador de aminoácidos neutros y posteriormente penetra en las neuronas del
núcleo estriado a través de un sistema dependiente de Na+ (Shimizu et al., 2001)
produciendo toxicidad en el sistema nervioso central (figura 14). En modelos animales
Introducción
41
se ha demostrado que la administración intranigral de Paraquat provoca la
degeneración de las neuronas dopaminérgicas de la vía nigroestriatal así como un
comportamiento rotatorio contralateral a la lesión tras la administración de apomorfina
(Liou et al., 1996). Por otra parte, ratones inyectados intraperitonealmente con este
pesticida experimentan una pérdida significativa de neuronas tirosina hidroxilasa
positivas en la SNpc dosis-dependiente. Asimismo, se detectan inclusiones g-
sinucleína positivas compatibles con CL (McCormack et al., 2002).
Se ha sugerido que el Paraquat actúa como un productor de especies reactivas de
oxígeno (ROS), que producen peroxidación de los lípidos de la membrana celular y
subsecuentemente destruye las organelas, llevando así a la célula a la muerte. Por
otro lado, la SN es una región del cerebro caracterizada por una elevada presencia de
microglía, que es activada por efecto de diversos herbicidas, como por ejemplo el
Paraquat. La elevada respuesta inmune sumada a las citoquinas excretadas por la
microglía activada (IL-1ß, IL-6, TNF-g) podrían promover un aumento de la
degeneración neuronal tras la exposición a esta sustancia (Cicchetti et al., 2005).
El Maneb o Etilenbisditiocarbamato manganoso, es un fungicida utilizado en las
mismas regiones geográficas que el Paraquat. Al igual que este, ejerce efectos sobre
el sistema dopaminérgico y sobre el sistema locomotor, aunque a pequeña escala. Su
mecanismo de acción se ha representado en la figura 14. Dado que es conocida la
aplicación simultánea de los dos productos, diversos estudios en roedores han
probado la coadministración de Paraquat y Maneb obteniendo como resultado la
degeneración específica de células dopaminérgicas de la SNpc y de fibras
nigroestriatales, una elevada respuesta inflamatoria y una afectación del sistema
locomotor (parkinsonismo), siendo en definitiva, los efectos de ambas toxinas juntas
superiores a los observados por separado (Cicchetti et al., 2005; Thiruchelvam et al.,
2000). Por otra parte, las investigaciones revelan una interacción entre la edad de los
animales y los efectos de las neurotoxinas siendo más susceptibles a la aplicación
sistémica de Paraquat/Maneb los animales más viejos.
A pesar de que a priori podría ser un buen modelo para investigar la EP, en ningún
caso se han detectado inclusiones similares a CL y algunos de los efectos periféricos
adversos observados como alteraciones pulmonares que llevan al distress respiratorio,
y la pérdida de peso excesiva, limitan su utilización principalmente debido a que estos
síntomas no están relacionados con la EP humana (Cicchetti et al., 2009).
Introducción
42
3.2.2.4 Rotenona
La rotenona es un compuesto citotóxico natural que se extrae de plantas tropicales y
que, debido a su potencia, es ampliamente utilizado como pesticida. Su naturaleza
altamente lipofílica le permite atravesar fácilmente la barrera hematoencefálica y
penetrar las membranas biológicas de las células (figura 14). En su interior, accede a
la mitocondria donde inhibe el Complejo I de la cadena respiratoria mitocondrial
provocando la depleción de ATP pero sobre todo, un incremento en los niveles de
especies reactivas de oxígeno (ROS), lo cual genera estrés oxidativo, que es lo que
realmente lleva a la muerte celular (Sherer et al., 2003).
A diferencia de otros compuestos, la rotenona no necesita de un transportador para
ingresar en la célula, de modo que es potencialmente capaz de ingresar en cualquier
tipo celular de cualquier órgano del cuerpo. De hecho ha sido encontrado en corazón,
hígado y riñón. El hallazgo de que su administración sistémica produzca una
degeneración del sistema nigroestriatal, sugiere que las neuronas dopaminérgicas de
dicha vía son preferencialmente susceptibles a la inhibición del Complejo I de la
cadena de transporte de electrones mitocondrial (Greenamyre et al., 2001).
En ratas tratadas con esta sustancia de forma crónica, se han observado paralelismos
con la enfermedad de Parkinson. En este modelo, aparte de la degeneración
dopaminérgica de la vía nigroestriatal han sido identificadas inclusiones g-sinucleína y
ubiquitina positivas en estructuras similares a cuerpos de Lewy (Betabert et al., 2000),
además de un aumento de marcadores de estrés oxidativo que concuerda con el
reportado en casos de EP humana. Asimismo, se detectaron cambios en el
comportamiento de los animales, que presentaban cierto grado de parkinsonismo
(Greenamyre et al., 2001).
Estudios más recientes revelan que muchos de los modelos animales basados en la
administración de rotenona propuestos con anterioridad en realidad no son aptos para
la investigación de la EP debido a la alta variabilidad, baja reproducibilidad y a la
escasa selectividad de esta substancia para el SNC, en concreto para la vía
nigroestriatal, lo que genera toxicidad periférica y una gran variedad de efectos
adversos que llevan a la muerte de los individuos analizados (para revisión Cicchetti et
al., 2009).
El hecho de que la rotenona sea utilizada como pesticida al igual que el Paraquat,
contribuye a la hipótesis de que la enfermedad de Parkinson pudiera desarrollarse
como resultado de la exposición a factores ambientales (Di Monte et al., 2003).
Introducción
43
Figura 14. Mecanismo de acción de diversas toxinas utilizadas para la producción de
modelos de investigación de la enfermedad de Parkinson. La Rotenona atraviesa la barrera
hematoencefálica (BBB) debido a su naturaleza altamente lipofílica, en cambio el Paraquat lo
hace a través de un transportador de aminoácidos neutros (AA). Se desconoce el mecanismo a
través del cual traspasa el Maneb. Todos los compuestos salvo el Paraquat tienen como diana
complejos mitocondriales, atacando específicamente la Rotenona el Complejo I de la cadena
de transporte de electrones y el Maneb el Complejo III. La disfunción mitocondrial causada por
el Paraquat podría ser efecto del aumento de ROS en el citosol. La afectación del sistema
respiratorio mitocondrial es extremadamente dañina y lleva a la muerte celular. El MPTP es la
toxina más utilizada para generar modelos animales de la EP. Es una sustancia lipofílica capaz
de atravesar la BBB y la membrana celular de los astrocitos, se oxida para formar el 1-Metil-4-
fenilpiridinium (MPP+), la molécula tóxica. Seguidamente, el metabolito es excretado a través
del transportador de cationes orgánicos Oct-3 hacia el medio extracelular. El MPP+ ingresa
entonces en las neuronas dopaminérgicas a través del transportador de dopamina (DAT) y
penetra en la mitocondria, donde al igual que la Rotenona, ataca al Complejo I de la cadena
respiratoria mitocondrial. UPS: ubiquitin proteosome system.
Introducción
44
3.2.2.5 Lipopolisacárido (LPS)
El lipopolisacárido es una endotoxina de origen bacteriano que posee la capacidad de
activar la microglía mediante su unión al receptor situado en la membrana plasmática
celular. Este suceso promueve la localización nuclear del factor de transcripción NF-せB
y la subsecuente activación de genes en las vías proinflamatorias.
La inyección de LPS en la SNpc de rata produce una fuerte respuesta microglial
seguida de la muerte de las neuronas dopaminérgicas. La inyección en otras regiones
del cerebro como córtex o hipotálamo no produce la muerte de ningún otro tipo
neuronal, demostrando la selectividad hacia las células dopaminérgicas. Por otra
parte, la elevada concentración de células microgliales presentes en la SNpc la hacen
extremadamente vulnerable a los efectos producidos por agentes proinflamatorios
como el LPS (Kim et al., 2000). El LPS per se no es directamente tóxico para las
neuronas, sino que es la presencia de las células gliales lo que potencia su actividad
perniciosa. Dicha muerte celular implica la up-regulación del enzima iNOS en la
microglía de la SNpc, ya que su inhibición resultó proteger contra la muerte de células
dopaminérgicas (Iravani et al., 2005), la producción de NO y superóxido, que
reaccionan para formar peroxinitrito (ONOO-) que es altamente neurotóxico, y la
excreción de citoquinas como TNF-g y IL-1ß (Orr et al., 2002). La producción de todos
estos factores derivados de la microglía precede a la muerte de las neuronas
dopaminérgicas. En cuanto al comportamiento motor, después de la administración de
anfetamina se observa un robusto comportamiento rotatorio ipsiversivo en los
animales tratados con LPS, lo que demuestra una lesión dopaminérgica (Iravani et al.,
2008).
Por otra parte, la inyección sistémica de LPS en ratón, es capaz de producir
degeneración específica del sistema nigroestriatal a lo largo del tiempo. Este proceso
es mediado por la producción de TNF-g, sintetizado en el hígado del ratón y distribuido
a través de la circulación sanguínea, que penetra en el cerebro e interacciona con el
receptor TNF-g, induciendo la síntesis de TNF-g adicional y de otras sustancias pro-
inflamatorias, creando una neuroinflamación persistente que induce una progresiva y
retardada pérdida de neuronas dopaminérgicas en la SN de ratones (Qin et al., 2007).
II- OBJETIVOS
Objetivos
47
II- Objetivos
La potente capacidad antiapoptótica que presenta el fragmento C-Terminal de la
cadena pesada de la toxina tetánica, Hc-TeTx, reiteradamente observada en
experimentos realizados tanto por nuestro grupo como por otros, así como la
demostrada similitud con diversos factores de crecimiento (NGF o BDNF) en lo que
respecta a las vías de transducción de señal, sumado a la elevada eficiencia que
muestra esta molécula para transportarse retroaxonalmente hacia el sistema nervioso
central, han sido la base de la investigación que justifica esta tesis doctoral.
Así pues, teniendo en cuenta lo expuesto, los objetivos de este trabajo son los
siguientes:
1- Caracterización del estado del sistema dopaminérgico de un modelo animal de
parkinsonismo, basado en la aplicación de una dosis baja de la neurotoxina
MPP+ en el núcleo estriado, con el objetivo de producir degeneración de las
terminaciones dopaminérgicas que inervan dicha región cerebral. De esta
forma se pretende obtener un modelo que reproduzca un parkinsonismo en
fase inicial. Para poder interpretar los efectos de potenciales agentes
neuroprotectores sobre este modelo in vivo de parkinsonismo es de gran
importancia conocer la magnitud de la lesión ocasionada por la aplicación
estereotáxica del MPP+ en el núcleo estriado de rata. Los efectos se analizan a
nivel bioquímico e histológico principalmente sobre el sistema nigroestriatal.
2- Evaluación de los efectos provocados por la administración del fragmento Hc
de la cadena pesada de la Toxina tetánica (Hc-TeTx) en modo aislado o en
combinación con la aplicación de una baja concentración de la droga MPP+,
como se ha descrito en el apartado anterior. La primera aproximación se
realiza a fin de determinar si esta molécula en forma solitaria es responsable
de la variación de alguno de los parámetros estudiados. La segunda, para
comprobar si el tratamiento con Hc-TeTx es capaz de prevenir los efectos
derivados de la administración intraestriatal de MPP+, es decir, para determinar
su potencial efecto neuroprotector en estadios iniciales de la enfermedad de
Parkinson, en base a los resultados obtenidos en el modelo in vivo utilizado en
esta tesis.
Objetivos
48
III- MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales y métodos
51
III- Materiales y métodos
1. Obtención del fragmento Hc de la toxina tetánica, Hc-TeTx
1.1 Crecimiento bacteriano
La cepa bacteriana Escherichia coli (E.coli) M15 transformada con el plásmido pQE3-
Hc-TeTx-His6 fue cedida amablemente por el Dr. Juan Blasi (Departament de
patología i terapéutica experimental, Universitat de Barcelona). Dicho plásmido
contiene por una parte el operón Lac, pudiéndose inducir su expresión con IPTG
(Isopropyl-ß-D-galactopyranoside) y por otra, el gen く-lactamasa, que le confiere
resistencia a la ampicilina.
Lanzamiento del cultivo
A fin de obtener un precultivo, se sembró una pequeña cantidad de glicerinado de
E.coli en un tubo estéril de crecimiento con 6 mL de medio de cultivo Luria-Bertani con
ampicilina (50 µg/mL) (LBA). Se dejó en agitación (200 rpm) durante la noche a 37°C.
Al día siguiente, se traspasó el precultivo a 500 mL de LBA. Se dejó crecer en
agitación y a 37°C hasta que la densidad óptica (DO600) llegó a 0,7-1 (4 h
aproximadamente). Entonces, se indujo la expresión génica añadiendo al cultivo IPTG
(0,4 mM) y se dejó crecer en agitación a 37°C durante 4 h.
Centrifugación y sonicación
Seguidamente, se centrifugó el cultivo durante 20 min a 4000 g y a 4°C. Se decantó el
sobrenadante y se resuspendió el pellet restante en 10 mL de Tampón de Sonicación
a 4°C. Se dejó durante la noche a -20°C. Al día siguiente se descongeló la solución y
se sonicó con un sonicador (DYNATECH Sonic Dismembrator Model 300) con una
potencia media del 35%, hasta que el lisado se volvió translúcido (4 pulsos de 20 s,
manteniendo la muestra en hielo). Posteriormente, se centrifugó a 30000 g durante 30
min a 4°C.
Materiales y métodos
52
1.2 Purificación del fragmento Hc-TeTx
Purificación del fragmento Hc-TeTx en columna de Níquel-Agarosa
El fragmento de Hc-TeTx clonado en el plásmido contiene una cola de 6 histidinas, lo
que facilita su purificación mediante un método de inmovilización por cromatografía de
afinidad a metales.
La resina que se utiliza en la columna, Ni2+-nitrilotriacetate-agarose (Quiagen), retiene
las moléculas de Hc-TeTx debido a la afinidad entre el Ni2+ y la característica
electronegativa de la cola de histidinas. Para liberar el fragmento Hc-TeTx, añadimos
imidazol, que se une al níquel, en concentración creciente, de modo que se liberen en
primer lugar las moléculas que se han unido con menor afinidad y por último, las
moléculas de interés.
Preparación de la columna
Se centrifugó la resina durante 1 minuto a 1000 rpm y se descartó el sobrenadante.
Seguidamente, se lavó 2 veces con Tampón A (ver tabla 1). La resina lavada se
mezcló con el sobrenadante bacteriano resultante de la última centrifugación del
apartado anterior y se dejó en agitación orbital a 4°C durante 1 h.
Elución
En primer lugar, se dejó eluir todo el contenido líquido presente en la columna.
Posteriormente, se lavó la agarosa con 5 mL de tampón A y se descartó nuevamente
el producto eluído. Por último, se fueron añadiendo volúmenes de Tampón A con
Imidazol a 50, 100 y 200 mM, y se fueron recogiendo las fracciones resultantes, hasta
un total de 8.
1.3 Comprobación, diálisis y cuantificación de la proteína
Comprobación de las fracciones por electroforesis
Se preparó un gel de poliacrilamida al 10% y se resolvieron 15 µL de cada fracción
obtenida. Entre las muestras se incluyó un marcador de peso molecular, Dual Color
(Biorad). Posteriormente, se llevó a cabo la electroforesis durante 60 min a un voltaje
constante de 100 V.
Materiales y métodos
53
Tinción y secado del gel
Se introdujo el gel en una cubeta con solución Coomassie® Brilliant Blue R-250
(Biorad) y se dejó teñir, en agitación y a temperatura ambiente, hasta quedar
completamente azul (aproximadamente 1 h). Después, el colorante se descartó y se
realizaron varios lavados con solución decolorante hasta que el gel quedó
transparente. Entonces, se retiró la solución decolorante y se rehidrató en agua
destilada a 4°C toda la noche.
Figura 1. Gel de comprobación de la purificación del fragmento Hc-TeTx. Se muestran las
fracciones obtenidas de la purificación en columna de Níquel-agarosa a concentración de
Imidazol 50 mM (carriles 1, 2), 100 mM (3, 4) y 200 mM (5, 6, 7, 8). A la izquierda del gel se ve
el marcador de peso molecular (Dual Color). A partir del carril 4, la banda mayoritaria se
encuentra a la altura de 50 KDa y coincide con el peso teórico del fragmento Hc-TeTx. En este
caso se tomaron las fracciones 4, 5 y 6, se juntaron y se dializaron en tampón fosfato.
Por último, se secó el gel del siguiente modo: se depositó el gel sobre papel Whatman
humedecido, se tapó con film transparente y se introdujo en la secadora de geles
durante 1 h a 80°C, haciendo el vacío previamente.
Diálisis de las proteínas purificadas
Con la información que nos ofrecen geles como el que se muestra en la figura 1, se
escogieron las fracciones con mayor pureza, se juntaron, y se dializaron con el
objetivo de eliminar el imidazol. Para ello, se utilizaron casetes de diálisis (Slide-A-
Lyzer Dialysis Cassette Trial Kit, 10K MWCO, Pierce). Se introdujo un máximo de 3 mL
de muestra por casete y se sumergió en tampón de diálisis. Se dejó en agitación toda
la noche a 4°C realizando un cambio de tampón a las 4 h. Una vez terminado el
proceso, se extrajo la muestra del casete y se cuantificó el nivel de proteína. El resto
del volumen se conservó a -20°C.
Materiales y métodos
54
Cuantificación de proteína
Para cuantificar la proteína purificada se utilizó el kit BCATM Protein Assay Kit (Pierce;
USA). Este preparado es compatible con detergentes y se basa en el ácido
bicinconínico (BCA) para la detección colorimétrica y cuantificación de la proteína total.
El color púrpura resultante es debido a la quelación de 2 moléculas de BCA con un ión
cuproso. Este complejo soluble en agua tiene una alta absorción a 562 nm que es casi
lineal en un rango entre 20-2000 µg/mL. Generalmente, las concentraciones proteicas
se determinan haciendo referencia a estándares de una proteína común. En este caso
se utilizó la albúmina de suero bovino (BSA). Se realizaron una serie de diluciones con
concentración conocida de esta proteína a fin de obtener una curva estándar a partir
de la cual poder extrapolar el valor de concentración de la muestra analizada.
En la tabla 1 se describe la composición de todas las soluciones utilizadas para la
obtención y purificación del fragmento Hc-TeTx.
Tabla 1. Soluciones utilizadas en el proceso de purificación del fragmento Hc-TeTx
Soluciones Composición
Luria-Bertani (LB) 10 g tryptona, 5 g extracto levadura, 10 g NaCl
Tampón de Sonicación 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 0.5% Triton X-100 pH: 8
Tampón A 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl pH : 8
Solución Coomassie 0,1% Coomassie, 10% ácido acético Glacial, 20% metanol
Solución decolorante 40% metanol, 10% ácido acético, 50% agua destilada
Tampón de diálisis 10 mM NaH2PO4, 40 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH: 7,4
2. Estudio de la captación de sustancias en sinaptosomas provenientes de
núcleo estriado de rata
2.1 Animales
Todos los protocolos experimentales que se han utilizado en esta tesis han sido
aprobados por la Comissió d´Ètica en l’experimentació Animal i Humana del
Departament de Medi Ambient i Habitatge, de acuerdo con el artículo 32 del Decreto
Materiales y métodos
55
214/1997 de 30 de Julio, sobre protección de animales utilizados para la
experimentación y otras finalidades científicas.
Los animales de experimentación utilizados fueron machos de la cepa OFA (Sprague-
Dawley) procedentes del Servei d’Estabulari de la Universitat Autònoma de Barcelona,
de edad comprendida entre las 6 y las 8 semanas, y de un peso aproximado de 250 a
300 gramos.
Dichos animales permanecieron estabulados en el del Servei d’Estabulari de la
Universitat Autònoma de Barcelona bajo condiciones de temperatura (22 ± 2°C) y
humedad relativa (40-60%) constantes, y ciclo de luz/oscuridad de 12/12 horas de 8:00
a 20:00 y de 20:00 a 8:00, respectivamente. La distribución fue de 3 animales por
jaula, con un régimen de ingesta de comida y agua “ad libitum”.
2.2 Obtención de la fracción sinaptosomal de núcleo estriado de rata
Los animales utilizados para este estudio fueron recogidos del estabulario y
directamente sacrificados mediante decapitación con guillotina. El cerebro fue extraído
rápidamente, depositado sobre una superficie fría y mantenido a 0-4°C durante el
tiempo de disección. La extracción de los núcleos estriados del animal se llevó a cabo
según un protocolo de disección publicado por Glowinsky e Iversen en 1966.
Preparación de la fracción P2 de sinaptosomas de núcleo estriado de rata
La preparación de fracción P2 de sinaptosomas fue llevada a cabo según el protocolo
de Gray y Whittaker (Gray y Whittaker, 1962), con algunas modificaciones. El tejido de
interés fue pesado y homogeneizado en 40 volúmenes (p/v) de sacarosa 0,32 M
(Sigma, pH 7,4). La homogeneización se llevó a cabo con 12 golpes a 900 rpm, con un
homogeneizador Potter (PYREX® Potter-Elvehjem) con émbolo de Teflón. El
homogenizado fue centrifugado durante 5 min, a 1000 g y 4°C. El sobrenadante
resultante fue nuevamente centrifugado durante 25 min, a 12000 g a 4°C. El pellet de
sinaptosomas crudos obtenido fue resuspendido en 5 mL de tampón Bicarbonato-
Ringer-Kreb’s (tabla 2) con una concentración final de 11 mM de glucosa y 0,64 mM
de ácido ascórbico. Antes de utilizarlo, el tampón fue gaseado con una mezcla de 95%
de CO2 y 5% de O2 en agitación durante 20 min. Finalmente, se estimó la
concentración de proteína mediante el método BCA. Los experimentos fueron
realizados utilizando una concentración final de proteína de 0,6-0,8 mg/mL.
Materiales y métodos
56
Antes de efectuarse el tratamiento, los sinaptosomas fueron sometidos a un periodo
de atemperamiento de 30 min a 37°C, en agitación.
Tabla 2. Tampón para la preparación de sinaptosomas
Soluciones Composición
Tampón Bicarbonato-Ringer-
Kreb’s
125 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM MgSO4•7 H2O, 1,2 mM CaCl2•2
H2O, 22 mM NaHCO3. 1 mM NaH2PO4•H2O pH: 7,4
2.3 Determinación radiométrica del transporte de 3H-DA en sinaptosomas de
núcleo estriado de rata
2.3.1 Determinación de las constantes cinéticas del sistema de transporte
dopaminérgico. Curvas de saturación
El método utilizado está basado en el descrito por Valtier y colaboradores (1992) con
algunas modificaciones (Valtier et al., 1992).
Esta determinación se llevó a cabo a fin de calcular el transporte específico e
inespecífico de dopamina. Se trabajó con dos grupos a los que se denominó: Total e
Inespecífico. La reacción se inició añadiendo a la fracción sinaptosomal (50 µL) un
volumen de 3H-DA (50 µL) con una concentración final de dopamina variable (rango de
0-640 nM). A excepción del punto 0 (ausencia de sustrato), en todas las muestras el
preparado radioactivo contenía una concentración constante de 3H-DA
correspondiente a 10 nM y una concentración variable de dopamina fría para llegar a
la concentración final adecuada. En el punto 0 se añadieron 50 µL de vehículo. El
grupo inespecífico fue tratado de la misma manera, pero fue mantenido a 0-4°C
durante el resto del ensayo. Este último grupo sirve para detectar la captación
inespecífica de dopamina tritiada.
Tras 2 min de incubación de los sinaptosomas con la dopamina, las muestras fueron
filtradas mediante un aparato automático de filtración al vacío para múltiples muestras,
Brandel Cell Harvester (Semat Technical, Herts, UK), utilizando filtros de fibra de vidrio
Whatman GF/C (Whatman Internacional Ltd.) empapados durante la noche anterior
con una solución de Polietilenimina (0,3%, Sigma) a 4°C para reducir posibles uniones
inespecíficas. Una vez filtradas, las muestras se lavaron tres veces con 5 mL de
tampón Bicarbonato-Ringer-Kreb’s a 4°C. Se dejaron secar los filtros, se introdujeron
Materiales y métodos
57
en viales con 3 mL de líquido de centelleo Biodegradable Counting Scintillant
(Amersham Int. Plc) y se dejaron durante la noche a temperatura ambiente. Al día
siguiente, se agitaron enérgicamente y se procedió a la cuantificación de la actividad
radioactiva en un contador de centelleo líquido Wallac 1409/1411 (Pharmacia, Turku,
Finland).
La radioactividad acumulada en las muestras de sinaptosomas incubados a 0-4°C
(grupo Inespecífico) fue sustraída rutinariamente de la actividad Total, y la captación
dependiente de temperatura, es decir, la específica, fue definida como la diferencia
entre la captación a 37°C y a 0-4°C. Cada condición fue analizada por triplicado y cada
ensayo fue repetido un mínimo de tres veces.
Valoración de la actividad específica de la dopamina y del transportador de
dopamina
El valor de la concentración de la de 3H-DA se calculó del siguiente modo, teniendo en
cuenta los datos del Batch 206 de [7,8]-3H-Dopamine (Amersham Biosciences):
にのど継貸滞系件 抜 な 兼兼剣健ねど系件 抜 なにのど継貸滞詣 噺 にの継貸滞警
En este ensayo, como se explicó anteriormente, la dopamina utilizada no corresponde
sólo a la dopamina radioactiva, sino que en cada muestra hay otra fracción mayoritaria
de dopamina no marcada radiactivamente, también denominada “fría”. Así, la
concentración final responde a la suma de los dos tipos de dopamina. En todas las
muestras la concentración de dopamina tritiada es la misma, 10 nM, no así la de
dopamina fría (Dopamine hydrochloride, Sigma), que se añade en función de la
concentración final en 100 µL de volumen total.
La actividad específica del transportador de dopamina DAT, expresada en fmol/min x
mg de proteína, se determinó aplicando la siguiente fórmula:
穴喧兼 抜 な 兼兼剣健隙 系件 抜 な 系件に┻にに継怠態穴喧兼抜 な 血兼剣健な継貸怠態兼兼剣健 抜 な建件結兼喧剣 岫 岻 抜 な兼訣 喧堅剣建 El valor de X es obtenido multiplicando la actividad de la sustancia (40 Ci/mmol), por
la fracción que representa la DA tritiada de la concentración de DA total. En el caso de
40 nM, 10 nM de 3H-DA representa な ね斑 , así que 隙 噺 ねど 抜 な ね斑 噺 など 系件 .
Materiales y métodos
58
2.3.1.1 Análisis del efecto producido por el pre-tratamiento con Hc-TeTx sobre
las constantes cinéticas del transporte de dopamina
Esta determinación se llevó a cabo utilizando cinco grupos de estudio: Control,
Inespecífico y tratado con 1, 10, 100 nM de fragmento Hc-TeTx. El volumen de
fracción sinaptosomal P2 fue para todas las muestras 50 µL. A este, se le adicionó un
µL que contenía, dependiendo del grupo, vehículo o fragmento Hc-TeTx a diferentes
concentraciones.
Al grupo Control así como al grupo Inespecífico, se le añadió únicamente el volumen
del vehículo, siendo mantenidos a 37°C a 0-4°C, respectivamente, durante el resto del
ensayo. Los grupos tratados con el fragmento Hc-TeTx de la toxina tetánica a
concentración final: 1, 10 y 100 nM, fueron incubados durante 15 min a 37°C en
agitación. Estos tratamientos se llevaron a cabo en tubos de polipropileno.
Captación
Pasado el tiempo de pre-tratamiento, se inició el proceso de captación añadiendo a los
sinaptosomas un volumen de 3H-DA (50 µL) con una concentración final variable de
DA (rango de 0-640 nM). Al igual que en el caso anterior, el preparado radioactivo
contenía una concentración constante de 3H-DA correspondiente a 10 nM y una
concentración variable de DA fría para llegar a la concentración final adecuada. En el
punto 0, se añadieron 50 µL de vehículo.
Después de 2 min de incubación de los sinaptosomas con DA, se paró la reacción
mediante el filtrado de las muestras, se lavaron los filtros tres veces con 5 mL de
tampón Bicarbonato-Ringer-Kreb’s a 4°C, se dejaron secar y, posteriormente, se
introdujeron en viales con 3 mL de líquido de centelleo para, finalmente, cuantificar la
actividad radioactiva acumulada con un contador de centelleo líquido.
La radioactividad acumulada en las muestras de sinaptosomas incubados a 0-4°C
(grupo Inespecífico) fue sustraída rutinariamente de la radioactividad Total, y la
captación dependiente de temperatura fue definida como la diferencia entre la
captación a 37°C y a 0-4°C. Cada condición fue analizada por triplicado y cada ensayo
fue repetido un mínimo de tres veces.
Materiales y métodos
59
2.3.2 Ensayos de captación de dopamina a una concentración invariable (160
nM)
2.3.2.1 Efecto del fragmento Hc-TeTx sobre el transporte de dopamina
El ensayo se realiza a fin de observar más precisamente los posibles cambios en la
captación de DA a una concentración invariable de sustrato, cercana al valor de la
constante de Michaelis (KM). De este modo se evitan posibles distorsiones generadas
por los puntos adyacentes con los que se traza la curva de saturación.
El procedimiento del pre-tratamiento y la captación, es el mismo que el descrito en los
apartados anteriores, con la diferencia esencial de que la dopamina se añadió a una
concentración final de 160 nM y no en un rango de concentraciones. También se
analizaron 5 grupos: Control, Inespecífico y tratados con Hc-TeTx (1, 10 y 100 nM,
concentración final). Cada tratamiento se realizó por cuadruplicado.
2.3.2.2 Efecto del fragmento Hc-TeTx sobre el transporte de dopamina, previo
tratamiento con MPP+
Se realizó este ensayo para averiguar el posible efecto que genera la aplicación de
MPP+ iodide (50 µM) en los sinaptosomas de núcleo estriado de rata de manera previa
a la captación de dopamina.
Al igual que en el caso anterior, realizamos un ensayo de captación a una
concentración invariable de 160 nM de DA. Se analizaron 4 grupos distintos: Control,
Inespecífico, MPP+ y Hc/MPP+. Con este último grupo intentamos ver si existen
diferencias de captación cuando pre-tratamos los sinaptosomas con el fragmento Hc-
TeTx (concentración final, 10 nM) antes de su exposición a la neurotoxina MPP+.
Tras el pre-tratamiento de 15 min a 37 °C con Hc-TeTx, se aplicó el MPP+ (50 µM) en
los grupos correspondientes, incubándolo durante 5 min más. Justo después, se inició
el proceso de captación adicionando 50 µL de DA radioactiva a los 50 µL de fracción
sinaptosomal. A partir de este punto, el procedimiento es idéntico al detallado en
apartados anteriores. Cada tratamiento fue realizado por cuadruplicado.
2.4 Determinación radiométrica del transporte de 3H-MPP+ en sinaptosomas
El experimento se efectuó con tres grupos de estudio: Control, tratado con Hc-TeTx e
Inespecífico.
Materiales y métodos
60
El ensayo para medir la captación de MPP+ tritiado por sinaptosomas de núcleo
estriado de rata se llevó a cabo del siguiente modo:
La fracción sinaptosomal, P2 (50 µL), fue pre-tratada con el fragmento Hc-TeTx
(concentración final, 100 nM) durante 15 min a 37°C en agitación. A los grupos Control
e Inespecífico, se les adicionó únicamente el volumen del vehículo, siendo mantenidos
a 37°C y 0-4°C, respectivamente, durante el resto del ensayo. Estos tratamientos se
llevaron a cabo en tubos de polipropileno.
Captación
Pasado el tiempo de tratamiento, se inició la captación añadiendo a los sinaptosomas
50 µL de 3H-MPP+ con una concentración final variable de MPP+ (rango de 0-1500
nM). En todos los casos, el preparado radioactivo contenía una concentración
constante de 3H-MPP+ (10 nM) y, en los casos necesarios, se adicionó la
concentración adecuada de MPP+ frío (1-Methyl-4-phenylpyridinium iodide, Sigma)
para llegar a la concentración final deseada. En el punto 0 se añadieron 50 µL de
vehículo.
Después de 2 min de incubación, se repitió el procedimiento de modo idéntico al
descrito en el apartado anterior para la captación de DA [apartado 2.3.1.]
La radioactividad acumulada en las muestras de sinaptosomas incubados a 0-4°C
(grupo Inespecífico) fue sustraída rutinariamente de la radioactividad Total, y la
captación dependiente de temperatura fue definida como la diferencia entre la
captación a 37°C y a 0-4°C. Cada condición fue analizada por triplicado y cada ensayo
fue repetido un mínimo de tres veces.
Valoración de la actividad específica del 3H- MPP+
El valor de la concentración de la de 3H- MPP+ se calculó del siguiente modo, teniendo
en cuenta los datos del fabricante (PerkinElmer):
のど継貸滞系件 抜 な 兼兼剣健ぱな系件 抜 なのど継貸滞詣 噺 な┻にぬ継貸泰警
En este ensayo, al igual que en el estudio realizado con dopamina, se utilizó MPP+
radioactivo (10 nM) y no radioactivo, siendo la suma de las dos fracciones la
concentración final de la muestra (40, 80, 160, 320, 640, 1500 nM) en 100 µL de
volumen total.
Materiales y métodos
61
La actividad específica del transportador de dopamina DAT, expresada en fmol/min x
mg de proteína, se determinó aplicando la siguiente fórmula:
穴喧兼 抜 な 兼兼剣健隙 系件 抜 な 系件に┻にに継怠態穴喧兼抜 な 血兼剣健な継貸怠態兼兼剣健 抜 な建件結兼喧剣 岫 岻 抜 な兼訣 喧堅剣建 El valor de X se obtuvo multiplicando la actividad de la sustancia (81 Ci/mmol), por la
fracción que representa el MPP+ tritiado de la concentración total de MPP+. En el caso
de 40 nM, 10 nM de 3H- MPP+ representa な ね斑 , así que 隙 噺 ぱな 抜 な ね斑 噺 にど┻にの 系件. La actividad específica es el resultado de la diferencia entre la actividad Total y la
actividad Inespecífica, obtenida en el grupo incubado a 0-4°C.
2.5 Análisis de los datos obtenidos mediante determinación radiométrica
El cálculo de los parámetros cinéticos, KM y Vmax, se realizó mediante regresión no
lineal, utilizando el programa informático GrafPad PRISM 5.0.
3. Estudios in vivo del efecto producido por el fragmento Hc-TeTx
3.1 Animales y diseño experimental
Todos los animales utilizados en la investigación realizada in vivo de esta tesis
doctoral, responden a las características descritas anteriormente [apartado 2.1.]
Diseño experimental
Estudio del efecto del MPP+ a lo largo del tiempo
Para analizar el efecto producido por la inyección intraestriatal de 10 µg de MPP+ en el
núcleo estriado de rata, 3-4 individuos por grupo fueron inyectados estereotáxicamente
a día 0 y sacrificados posteriormente los días 3, 5, 7 y 9 post-lesión.
Estudio del efecto del MPP+. Co-tratamiento con Hc-TeTx intracraneal
En este caso se trabajó con 4 grupos: Control, Hc-TeTx, MPP+ y Hc/MPP+.
A día 0, se aplicó intraestriatalmente en un volumen de 2,5 µL: agua desionizada
estéril (Braun) al grupo Control, una solución 1 µM de Hc-TeTx ( ~ 125 ng) al grupo Hc-
Materiales y métodos
62
TeTx, 10 µg de MPP+ al grupo MPP+ y simultáneamente, 10 µg de MPP+ en solución 1
µM de Hc-TeTx al grupo Hc/MPP+. A día 5 se procedió al sacrificio de todos los
animales, siendo n= 3-4 animales por grupo.
Estudio del efecto del MPP+. Pre-tratamiento con Hc-TeTx intraperitoneal.
Este ensayo se llevó a cabo con 4 grupos: Control, Hc-TeTx, MPP+ y Hc/ MPP+.
A día 0, a las ratas de los grupos Control y MPP+ se les administró por vía
intrapertitoneal 1 mL/kg de suero fisiológico (Braun), y a las ratas de los grupos Hc-
TeTx y Hc/ MPP+, 1 mL/kg de una solución 10 µM del fragmento Hc-TeTx (125 µg,
diluido en suero fisiológico).
A día 3, se repitió la misma aplicación en los mismos grupos de ratas.
A día 7, se les administró mediante una aplicación intraestriatal estereotáxica 1 µL de
suero fisiológico (grupos Control y Hc-TeTx) ó 1 µL (10 µg/µL) de MPP+ (grupos MPP+
y Hc/ MPP+).
Finalmente, a día 12, todos los animales fueron sacrificados utilizando métodos
diferentes en función del tipo de análisis posterior del tejido (por ejemplo WB, HPLC,
etcétera).
3.2 Técnicas de administración de sustancias
Administración intraperitoneal
La inyección intraperitoneal (IP) es una vía de administración vía parenteral muy
frecuente en roedores utilizada para depositar sustancias líquidas en la cavidad
peritoneal. Esta vía permite inyectar volúmenes relativamente grandes y es muy bien
tolerada por el animal aunque presenta el riesgo de ruptura de algún órgano interno de
la cavidad abdominal. La colocación de la cabeza en un plano inferior al resto del
cuerpo reduce dicho riesgo. El punto de inyección se localiza en el cuadrante inferior
derecho del animal, lateral a la línea media y al menos dos cm caudal a la última
costilla (Álvarez Gómez de Segura y cols, 2001).
De esta manera fueron administradas sustancias como el suero fisiológico (NaCl,
0,9%, 1mL/kg), la solución Hc-TeTx (10 µM) diluido en suero fisiológico (1mL/kg) y la
desipramina (Desipramine hydrochloride, Sigma). La desipramina, un inhibidor de la
captación del transportador de noradrenalina, NAT, fue administrada a fin de evitar la
entrada inespecífica de MPP+ a través de los transportadores noradrenérgicos (Barc et
Materiales y métodos
63
al., 2002). La inyección se realizó 15 min antes de la administración intracraneal a una
dosis de 25 mg/kg en un volumen de 2 mL/kg debido a la alta densidad del compuesto
en disolución. Este fue disuelto en suero fisiológico y se mantuvo a temperatura
ambiente hasta el momento de su administración.
Administración intracraneal estereotáxica
La administración intracraneal es una técnica muy adecuada para administrar
sustancias en la cavidad craneal, cuando estas no son capaces de llegar por sí
mismas, debido por ejemplo, a que no atraviesan la barrera hematoencefálica.
Anestesia
El anestésico elegido fue el Isofluorano (Rhône-Poulenc) debido a las múltiples
ventajas que poseen los anestésicos por vía inhalatoria. En este caso, el equipo
utilizado fue un vaporizador de isofluorano y oxígeno (Flow- meter, Medical Supplies &
Services, England). El isofluorano produce un efecto anestésico casi instantáneo, se
puede regular con mucha precisión su administración, reduciendo así una muerte por
sobredosis. Además, cuando deja de administrarse, el animal se despierta
rápidamente, disminuyéndose el riesgo de complicaciones provocadas por la
hipotermia inducida por la anestesia.
La anestesia se administró en dos fases: en la primera, fase de inducción, se
suministró una mezcla al 4% y 0,8% de Isofluorano y Oxígeno puro (Air Liquide),
respectivamente, hasta que comprobamos que el animal estaba completamente
dormido. Esta fase se llevó a cabo en el interior de una cámara de anestesia. En la
segunda fase, de mantenimiento, se reguló la anestesia en una mezcla 1,5% de
Isofluorano y 0,6% de Oxígeno. En esta fase se ha de ir comprobando que el animal
sigue dormido. La mezcla se le proporcionó al animal a través de una mascarilla de
inhalación.
Fijación del animal al aparato de estereotaxia
Una vez anestesiado en la cámara, el animal fue fijado al aparato de estereotaxia
(David Kopf instruments, Tujunga, CA) a través de una pieza bucal, que inmoviliza los
dientes incisivos a la vez que mantiene la boca abierta para evitar que se ahogue, y de
dos piezas metálicas alargadas y romas, que se introducen en las orejas (Ear Bars)
sujetando el cráneo firmemente al sistema. Inmediatamente, se introdujo el morro del
Materiales y métodos
64
animal en la mascarilla de inhalación para evitar que despertara. Cuando la rata
estuvo bien fijada, comprobamos que estaba profundamente dormida y procedimos a
bajar la dosis de anestesia, fase de mantenimiento, y a realizar la aplicaión
estereotáxica de las sustancias.
Selección del área de inyección. Perforación del cráneo
Una vez fijado el animal, se rasuró el pelo del área de la cabeza en la cual se realizó
subsiguientemente una incisión anteroposterior, pinzando a continuación los colgajos
originados, a fin de dejar bien expuesto la zona del cráneo a manipular. Después, se
limpió la superficie para poder localizar el punto de referencia Bregma (figura 2A).
El aparato estereotáxico está compuesto por tres estructuras metálicas milimetradas
correspondientes a los tres planos del espacio, con los que se puede orientar
perfectamente la punta de la aguja con la que vamos a inyectar. Las coordenadas en
las que realizamos la aplicación, coinciden con el núcleo estriado derecho de la rata, y
fueron tomadas respecto a Bregma, según el Atlas de Paxinos y Watson (2005).
Estas fueron las siguientes: +0.7 mm anteroposterior con respecto a Bregma, -2.8 mm
lateral respecto a la línea media, +6.0 mm dorsoventral por debajo de la duramadre
(figura 2B). De este modo, una vez localizado el punto Bregma, nos colocamos con la
aguja por encima y repetimos las coordenadas, anteroposterior y lateral. Llegados a
ese punto, volvimos a limpiar la zona y perforamos el cráneo con mucha delicadeza,
con un microperforador. Limpiamos nuevamente la superficie.
Inyección de las sustancias
Una vez perforado el cráneo, repetimos la coordenada dorsoventral (6 mm de
profundidad), e inyectamos las sustancias mediante un inyector eléctrico (KD Scientific
Inc., Holliston/Massachusetts, USA) programado para uso de nuestra jeringa Hamilton
26 G (Hamilton, Reno, NV, USA) de 5 µL para que inyectara del siguiente modo: 1 µL
de líquido a lo largo de cinco min (ratio 0,2 µL/min). Pasado el tiempo, dejamos la
aguja en el interior de la cavidad durante otros 5 min para permitir que la sustancia se
distribuyera en la zona de inyección. Por último, retiramos la aguja, siempre a través
de los mandos adecuados, a lo largo de un min para evitar arrancar partes de tejido
cerebral o provocar lesiones adicionales. Se suturó la piel con hilo de sutura de grosor
3/0 (Laboratorio Aragó SA), se desinfectó la zona y se dio por finalizada la
intervención.
Mediante esta técnica fueron inyectados suero fisiológico, una solución Hc-TeTx (1
µM) y una solución de MPP+ iodide (10 µg/µL).
Materiales y métodos
65
Figura 2. Aplicación estereotáxica de sustancias. A) Imagen del cráneo de rata sobre el que
se muestran los puntos de referencia Bregma y Lambda, además de la línea interaural. A esa
altura se fija el animal al aparato estereotáxico mediante varillas insertadas en las orejas. B)
Lámina en la que se han representado las coordenadas de la inyección intraestriatal:
anteroposterior respecto a Bregma +0,7 mm, lateral -2,8 mm respecto a la línea media,
dorsoventral 6,0 mm por debajo de la duramadre. La X marca el punto teórico de la aplicación
de las sustancias inyectadas, en el núcleo estriado del hemisferio derecho del animal.
3.3 Sacrificio de los animales
El día previsto, los animales fueron recogidos del estabulario y sacrificados de manera
inmediata. El tipo de sacrificio fue decidido en función del objetivo del experimento.
Sacrificio por decapitación
Este tipo de sacrificio está indicado para animales de pequeño y mediano tamaño. Se
inmovilizó la rata con una mano, se llevó hacia la guillotina y se presionó la palanca. El
proceso dura unos dos segundos, por lo que se evitó cualquier maniobra de
aturdimiento previa o anestesia, que estresa más al animal por el mero hecho de
manipularlo, que el sacrificio en sí. La cabeza se depositó rápidamente en una
superficie helada, y el cuerpo se congeló a -20° C para poder entregarlo al servicio de
cremación del estabulario.
Materiales y métodos
66
De este modo fueron sacrificados los animales cuando la finalidad fue la de estudiar
los núcleos estriados mediante las técnicas de Western Blot o HPLC, y también para
obtener la fracción enriquecida de sinaptosomal P2.
Sacrificio por perfusión transcardíaca
Técnicas como la inmunohistoquímica y la hibridación in situ requieren la fijación del
tejido, ya que con ello se facilita la manipulación, se evitan las alteraciones
morfológicas y estructurales, y se preservan las características de las moléculas. Para
ello, se anestesió al animal con isofluorano y se lo introdujo en una cabina de
extracción de flujo laminar. En roedores, se cateteriza la arteria aorta o el ventrículo
izquierdo del corazón después de haber realizado una toracotomía a fin de exponer los
órganos. Se deja fluir el fijador, en este caso la solución para perfusión descrita en la
tabla 3, e inmediatamente se realiza un corte en la aurícula derecha del corazón para
que vayan saliendo la sangre y el líquido de perfusión desalojados. La solución de
perfusión se deja fluir durante 10 min a un flujo aproximado de 20 mL/min. El animal
fallece a lo largo del procedimiento.
Tabla 3. Solución para la perfusión de los animales
Soluciones Composición
Solución de perfusión Paraformaldehído al 4% + Glutaraldehido al 0,2% en tampón
fosfato 0,1 M, pH: 7,4
3.4 Procedimientos experimentales
3.4.1 Western Blot
Homogeneización del tejido y obtención de la muestra
Después de diseccionar los núcleos estriados se homogeneizó el tejido en tampón
RIPA en proporción 1: 9 (p/v).
Se dejaron las muestras en hielo durante 30 min tras lo cual fueron centrifugadas, a
3000 g durante 10 min a 4°C, en una centrífuga Eppendorf. Se recogió el
sobrenadante y se determinó la concentración de proteína mediante la técnica BCA.
Las alícuotas se mantuvieron a -80°C hasta el momento de su utilización.
Materiales y métodos
67
Electroforesis en gel de SDS-Poliacrilamida
Para analizar las proteínas provenientes del núcleo estriado de rata, se recurrió a la
técnica de electroforesis desnaturalizante en gel de SDS-Poliacrilamida (Poly
Acrylamyde Gel Electrophoresis-Sodium dodecyl Sulfate; PAGE-SDS), utilizando el kit
de Western Blot Mini Protean III (BioRad).
Los homogeneizados se diluyeron en el tampón de muestra, se calentaron 5 min a
99°C en agitación y se separaron por electroforesis en geles con un 10% de
acrilamida. En cada carril se cargaron entre 20-30 µg de proteína. En cada gel se
utilizó el marcador de peso molecular Magic mark XP western protein standard
molecular weight marker (Invitrogen) y/o Dual Color (BioRad). La electroforesis se
realizó a un voltaje fijo de 120 V durante 75 min.
Electrotransferencia de proteínas. Western Blot
Una vez finalizada la electroforesis, se llevó a cabo la transferencia de las proteínas
del gel a una membrana de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell). Para ello, se utilizó el
sistema Mini-Trans Blot Electroforesis Transfer Cell (Bio Rad). La transferencia se
efectuó a un voltaje constante de 100 V y a una intensidad variable durante 90 min.
Posteriormente, se rescató la membrana, se lavó tres veces con H2O Milli-Q y después
se tiñó con rojo Ponceau para evidenciar las proteínas transferidas. A continuación, se
lavó el Ponceau con tampón TBS-T y posteriormente, se bloqueó la membrana
durante 1 h a temperatura ambiente en tampón de bloqueo, en agitación constante.
Después, se incubó la membrana, bien durante 1 h a temperatura ambiente, o bien
durante toda la noche a 4°C en agitación, con Anticuerpo primario a la dilución
pertinente, en solución de bloqueo. Posteriormente, se lavaron las membranas 3-4
veces durante 5 min con TBS-T y se incubaron 1 h a temperatura ambiente con
Anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (1:2000), diluido en tampón de
bloqueo, en agitación constante. Transcurrido el tiempo, se lavaron las membranas 3-4
veces durante 5 min con TBS-T en agitación.
Por último, las membranas fueron incubadas durante 5 min con 2 mL de Luminol
(SuperSignal West Pico Chemiluminescent, Pierce Biotechnology) en la oscuridad. La
señal quimioluminiscente de la membrana fue adquirida utilizando el sistema de
imagen GeneGnome HR (Syngene bioimaging), programado para realizar una lectura
acumulativa de hasta 35 min, a través del programa informático “Gene Snap”. El
tratamiento de las imágenes y la cuantificación de las bandas, se efectuó con el
programa “Gene Tools”, perteneciente al mismo del sistema de análisis.
Materiales y métodos
68
Tabla 4. Soluciones utilizadas para inmunoblot
Tampón Composición
Tampón RIPA
150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH = 7,4, 50 mM NaF, 0,5% deoxicolato
sódico, 0,1% SDS, 0,5% Tritón X-100, 2,5 mM EDTA, 10 µg/mL leupeptina
y aprotinina, 1 mM fenilmetilsulfonil fluorido (PMSF), 1 mM Ortovanadato
sódico
Tampón de muestra 4X 280 mM Tris-HCl, SDS 4,4%, Glicerol 44%, H2O milli-Q, Azul de
bromofenol, 2-Mercaptoetanol 1/100
Tampón de electroforesis 25 mM Tris, 192 mM glicina, 0,1% SDS
Tampón de transferencia 25 mM Tris, 192 mM glicina, 10% metanol
TBS-Tween (TBS-T) 12,4 mM Tris, 75 mM NaCl, 1,.5 mM KCl, pH = 7,4, 0,1% Tween 20
Tampón de bloqueo TBS-T + 4% de leche desnatada en polvo
Todas las soluciones utilizadas para la técnica de Western Blot se han descrito en la
tabla 4, y todos los anticuerpos primarios y secundarios, en la tabla 5. Todos los
productos utilizados, a no ser que se indique otra cosa, son de la marca Sigma.
Tabla 5. Descripción de anticuerpos primarios
Anticuerpo primario Dilución Casa comercial
Monoclonal anti-Tyrosine Hydroxilase
Clone TH-16 1:2000 Sigma
Rabbit polyclonal anti-DAT 1:150 Santa Cruz
Rabbit polyclonal anti VMAT-2 1:500 Chemicon
Rabbit polyclonal anti pTHSer19 1:1000 Chemicon
Rabbit polyclonal anti-pTHSer31 1:1000 Chemicon
Rabbit polyclonal anti-pTHSer40 1:1000 Cell Signaling
Monoclonal anti-ß-actina 1:10000 Sigma
Anticuerpo secundario Dilución Casa comercial
Rabbit anti-mouse HRP conjugated 1: 2000 Dako Cytomation
Goat anti-rabbit IgG (H+L) HRP
conjugated 1:2000
Southern Biotechnology
Associates Inc.
Materiales y métodos
69
3.4.2 HPLC (High Performance Liquid Cromatography)
Extracción de los neurotransmisores del tejido obtenido
Se extrajeron los núcleos estriados, se pesaron y se congelaron a -80°C. A cada
muestra congelada se le adicionó una cantidad de tampón de desproteinización igual
al valor obtenido de la resta de 700 µL menos el peso en mg del núcleo en cuestión.
También se añadieron 40 µL de estándar interno 3,4-Dihidroxibenzilamina
bromhidrato, 3,4-DHBA, (1000 pg/µL).
Paralelamente, se preparó una muestra que contenía una mezcla de estándares (NA,
DA, DOPAC, 3-MT, HVA, 5-HT) con un volumen final igual al el resto de homogenados
y a una concentración de cada estándar de 40 pg/µL, en medio desproteinizante (tabla
6).
A continuación, se sonicaron las muestras a una potencia del 35% durante 20 s dos
veces (4 °C). Se congeló la muestra a -80 °C durante al menos 24 horas.
Determinación de los niveles de aminas biógenas y metabolitos por
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
La cromatografía es una técnica que consiste en la separación de los componentes de
una mezcla basándose en la diferente distribución de estos componentes en dos
fases, una que fluye o móvil, y una que no, la fase estacionaria.
La HPLC es una técnica cromatográfica en la que la fase móvil, es un líquido forzado a
pasar a elevada presión, ejercida por una bomba, a través de una columna en la que
se encuentra la fase estacionaria (soporte sólido).
En este caso, la cromatografía se realizó en condiciones de fase inversa (la fase
estacionaria es apolar y la fase móvil polar, eluyéndose antes los componentes
polares) y la separación, en condiciones isocráticas (la composición de la fase móvil
no se modifica con el tiempo).
Una vez separados los componentes de la muestra es necesario detectarlos. Para
ello, se utilizó la detección electroquímica. La detección electroquímica está basada en
la medida de la corriente resultante de la reacción de óxido/reducción de los analitos,
que es inducida por electrodos ajustados a un determinado potencial electroquímico.
Dado que el nivel de corriente originado es directamente proporcional a la
concentración del analito, este tipo de detección permite su cuantificación. La
Materiales y métodos
70
detección electroquímica es la habitual para sustancias de origen biológico
susceptibles de ser oxidadas, tales como las catecolaminas.
El registro resultante de la separación de los distintos componentes de la muestra en
función del tiempo, a la salida de la columna cromatografía y después de su paso por
el sistema de detección, da origen a un cromatograma. El registro de cada
componente de la muestra, en función del tiempo, da lugar a un pico cromatográfico.
La identificación de los componentes de la muestra se puede realizar utilizando
patrones de sustancias puras que permiten determinar el orden de elución de las
sustancias y calcular su tiempo de retención (parámetro cromatográfico característico
de cada sustancia en unas condiciones cromatográficas determinadas). La
cuantificación de dichos componentes se puede realizar comparando las respuestas
de muestras (alturas o áreas de los picos cromatográficos) con patrones de
concentración conocida.
Un equipo cromatográfico para HPLC está formado por un sistema de bombeo para
impulsar la fase móvil, una válvula de inyección para introducir las muestras en el
sistema cromatográfico en flujo continuo y a altas presiones, una columna de
cromatografía que contiene la fase estacionaria, un detector para determinar las
sustancias separadas, y un sistema registrador que permite obtener los
cromatogramas
Procedimiento y condiciones cromatográficas
Se descongelaron las muestras a temperatura ambiente y se centrifugaron a 16000 g
en una centrífuga Eppendorff durante 10 min a 4 °C. Se recogió el sobrenadante, se
filtró y se procedió a analizarlo con la ayuda de un aparato de cromatografía líquida de
alta resolución, HPLC, de la marca LaChrom Elite (Merck).
El cromatógrafo Elite Lachrom está formado por los siguientes elementos: Bomba Elite
LaChrom, Detector electroquímico ESA Coulochem II modelo 5200 con una célula
analítica modelo 5011. El software de análisis es EZChrom Elite 3.1.3.
Las condiciones para la determinación de catecolaminas mediante HPLC con
detección electroquímica (Pastó y Sabrià, 1990) fueron las siguientes:
Fase móvil: (tabla 6). Se añade trietilamina para ajustar el pH hasta 2,3. Se filtra con
filtros Millipore de 0,2 µm y se desgasifica.
Materiales y métodos
71
Fase estacionaria: Columna Chromolith® Performance RP-18e 100 mm longitud- 4.6
mm diámetro interno.
Temperatura de la columna: 30°C
Volumen de inyección: 20 たL de muestra
Flujo: 1 mL /min, constante durante todo el análisis
Presión: 65 bar
Potencial del electrodo E1: -0,05 V y E2: -0,4 V
Concentración del estándar: 40 pg/µL
Tiempo de retención para los estándares: NA (3,05 min), DHBA (4,38 min), DA (6,52
min), DOPAC (7,56 min), 3-MT (11,35 min), HVA (14,77 min) y 5-HT (17,41 min).
Tabla 6. Composición de tampones para HPLC
Tampón Composición
Tampón desproteinizante 0,25 M ácido perclórico, 250 µM EDTA-Na2, 100 µM metabisulfito
sódico
Fase móvil 0,1 M Ácido cítrico anhídrido, 0,05 mM EDTA Na2 H2O, 1 mM
Octanosulfonato Sódico y 0,3% acetonitrilo. pH: 2,3
3.4.3 Histología, histoquímica e inmunohistoquímica
Obtención del tejido y procesamiento de la muestra
Estos procesos requieren la fijación del tejido. Una vez perfundido el animal, se cortó
la cabeza y muy rápidamente se extrajo el cerebro. Obsérvese que en este caso se
conserva el cerebro entero. Después de haberle extraído las meninges (para facilitar la
difusión del fijador), este se introdujo en un tubo con 50 mL de PFA 4% y se dejó post-
fijar por inmersión durante 48 h a 4°C (en ese tiempo se hicieron 2 cambios de fijador).
Después se lavó con PB y se sumergió el cerebro en una solución crioprotectora de
sacarosa al 30% en PB durante 48 h (hasta que el cerebro se depositó en el fondo del
tubo). La sacarosa sustituye el agua del cerebro evitando así que al congelarse, se
formen cristales que degradarían el tejido. Posteriormente, se congeló con Isopentano
Materiales y métodos
72
(Panreac) a -40°C, en nieve carbónica. Los cerebros se conservaron a -80°C hasta el
momento de su utilización. Las superficies y materiales sólidos se descontaminaron
con RNaseZAP (Ambion), que proporciona un ambiente libre de RNasas. Los
tampones y sustancias líquidas utilizadas se prepararon con H2O DEPC 0,02%
(Sigma) y fueron esterilizadas.
Tabla 7. Soluciones para el procesamiento del tejido cerebral de rata
Tampón Composición
Solución anticongelante 0,1 M PB al 40%, glicerol al 30%, etilenglicol al 30%
Tampón fosfato 0,1 M (PB) 10,9 g Na2HPO4, 3,2 g NaH2PO4 en 1L H20, pH:7,4
Los cerebros, conservados a -80°C, fueron extraídos de a uno para ser procesados.
Se incluyeron en OCT Compound (Tissue-tek) sobre una base metálica y se cortaron
con un criostato Cryotome (Thermo electron corporation). Este aparato posee una
cámara refrigerada, en este caso programada a -18°C, dentro de la cual se encuentra
un micrótomo de rotación. Mediante una manivela o un pedal se controla el avance de
la muestra hacia la cuchilla. Una vez efectuado el corte, la muestra se recogió con un
pincel o aguja. Los cortes se llevaron a cabo del siguiente modo: para obtener la zona
correspondiente al núcleo estriado, se tomó desde la coordenada +1,70 mm hasta -
1,40 mm respecto a Bregma (Paxinos, Watson, 1996), y se realizaron cortes seriados
de 30 µm. Para recoger la substantia nigra, se tomó entre las coordenadas -4,40 mm y
6.30 mm, y se hicieron cortes seriados de 20 µm. Todos los cortes fueron recogidos en
flotación y guardados en una placa en solución anticongelante estéril (tabla 7). Las
placas se conservaron a -20°C hasta el momento de utilización de los cortes.
3.4.3.1 Tinción histoquímica con Azul de Toluidina
Esta tinción morfológica se realiza para tener la certeza de que la zona de inyección
ha sido correcta. Como el sacrificio se lleva a cabo 5 días después de la lesión, en
algunos casos es un poco complicado ver la herida o cicatriz, sobre todo en las ratas
pertenecientes al grupo Control, pero por lo general proporcionó un buen marcaje
(figura 3).
Materiales y métodos
73
Procedimiento
Se extrajeron los cortes del congelador (-20°C) y se seleccionó en frío una serie
completa, correspondiente a entre 12 y 15 cortes por animal. Cada serie se compone
de 1 de cada 6 cortes consecutivos realizados a lo largo de la zona de interés.
Figura 3. Azul de toluidina. Sección coronal (30 µm) de un cerebro de rata en la que se ha
realizado una tinción histológica con azul de toluidina. La flecha señala la lesión causada por la
aguja al efectuarse la inyección estereotáxica, localizada en el núcleo estriado derecho del
animal.
Se lavó con TBS tres veces durante 20 min para eliminar de la muestra los posibles
restos de solución anticongelante en la que se conservaron los cortes. Estos pasos se
llevaron a cabo en agitación, 150 rpm, y a temperatura ambiente.
Una vez lavados, los cortes se ordenaron (de rostral a caudal) sobre la superficie de
los portaobjetos previamente gelatinizados* para aumentar la adherencia. Para evitar
rupturas en el tejido, se trabajó suavemente con un pincel y siempre en medio líquido,
en este caso, TB. Se dejaron secar completamente a temperatura ambiente.
Tinción
Se sumergieron los portaobjetos con los cortes adheridos durante 45 segundos en la
solución colorante (solución de trabajo). Después se realizaron 3 lavados en H2O milli-
Q a temperatura ambiente y agitación para limpiar el exceso de colorante. A
continuación, se realizó una deshidratación seriada con alcoholes de concentración
creciente.
Materiales y métodos
74
Etanol 50%
Etanol 80%
Etanol 96% (x2)
Etanol Absoluto (x3)
Xilol (x2)
Al finalizar, se eliminó el exceso de xilol, se extendió el medio de montaje sobre el
cubreobjetos, concretamente DPX (Fluka), y se cubrió el portaobjetos. Se dejó secar
2-3 días hasta la observación en microscopio.
Tabla 8. Tampones para la tinción con azul de toluidina
Tampón Composición
Azul de toluidina solución colorante stock: 0,1% (Azul de toluidina, Panreac)
H2O milli-Q
Tampón Walpole 0,2 M 3 partes de ácido acético + 2 partes de acetato sódico
Solución trabajo 15 mL de solución stock + 100 mL de tampón Walpole
Tris Buffer (TB) 50 mM Tris Base pH 7,6
Tris Buffer Salino (TBS) 50 mM Tris Base, 0,9% NaCl, pH 7,6
Todas las soluciones utilizadas para llevar a cabo esta tinción, así como su
composición detallada, se han recogido en la tabla 8.
*Gelatinización de portaobjetos:
Se lavaron los portaobjetos con agua destilada, se secaron y a continuación fueron
introducidos en la solución de gelatina tibia durante 2 min. Se limpió el exceso de
gelatina y se dejaron secar en forma vertical durante la noche a 37ºC.
Solución de gelatina: Agua destilada 1 L, Gelatina 10 gr, Sulfato de cromo potasio
CrK (SO4)2 1 gr. Calentar el agua destilada para poder disolver la gelatina (no
5 min
2- 3 min
5 min
Materiales y métodos
75
superar los 50 ºC). Una vez disuelta, añadir el sulfato de cromo potasio. Filtrar la
solución.
3.4.3.2 Detección de tirosina hidroxilasa en núcleo estriado
El procesamiento de los cortes se llevó a cabo en flotación. Se analizó 1 de cada 6
cortes consecutivos, en un total de 12-15 cortes por animal. A no ser que se indique lo
contrario, todos los lavados e incubaciones se realizaron en agitación (150 rpm) y a
temperatura ambiente. Las soluciones utilizadas así como los anticuerpos se han
recogido en las tablas 9 y 10, respectivamente.
Se lavó con TBS tres veces durante 20 min para eliminar de la muestra la solución
anticongelante en la que se conservaron los cortes. Después, se lavó una vez durante
15 min con TBS-T. Posteriormente, se bloqueó en solución de bloqueo durante 1 h.
La incubación con el anticuerpo primario anti-tirosina hidroxilasa se realizó durante la
noche a 4°C. Por la mañana, se continuó incubando durante dos horas a temperatura
ambiente. Después, se lavó tres veces durante 20 min en TBS-T para eliminar los
restos de anticuerpo.
En este momento, se procedió a inhibir la peroxidasa endógena añadiendo la “solución
de inhibición de la peroxidasa” a los cortes durante 15 min, para así lograr el
agotamiento de la actividad del enzima peroxidasa presente en las muestras. La
finalidad de ello es evitar que en el revelado del experimento, visualizado a través de
la reacción de la peroxidasa de rábano, tengamos una señal artefactual debida a la
presencia de enzima activa preexistente en el tejido. Se lavó tres veces durante 7 min
en TBS-T.
Posteriormente, se incubaron los cortes con el anticuerpo secundario durante 1 h.
Este, se encuentra conjugado con biotina, de modo que a la vez que reconoce el
anticuerpo primario expone la biotina para ser reconocido y así amplificar la señal. Se
lavó 3 tres veces durante 7 min en TBS-T.
La avidina-peroxidasa (Dako Cytomation Denmark) es un complejo compuesto por
estreptavidina, que se une a la biotina del anticuerpo secundario, y por el enzima
peroxidasa del rábano (Horse Raddish Peroxidase, HRP), que reaccionará con el
cromógeno que se utiliza para revelar el experimento. Los cortes se incubaron 1 h con
este compuesto tras lo cual, se lavó dos veces 5 min en TBS-T y dos veces 5 min en
TB.
Materiales y métodos
76
Como solución de revelado se utilizó la 3,3’-diaminobenzidina (DAB, Sigma), un
cromógeno que actúa como sustrato de la HRP. El cromógeno es un donador de
electrones que cuando se oxida por acción del enzima se transforma en un producto
coloreado. En este caso el color que se obtiene es el marrón y nos permite visualizar
las zonas donde se encuentra nuestra proteína de interés. El proceso se realiza bajo
campana de extracción y con mucha precaución, ya que el compuesto es altamente
tóxico. La incubación con solución de revelado fue de 5-9 min. Sin abandonar la
campana de extracción, lavamos tres veces 10 min con TB para eliminar al máximo los
restos de DAB.
Para finalizar, se montaron los cortes en portaobjetos gelatinizados, se deshidrataron y
se cubrieron con DPX.
Tabla 9. Soluciones utilizadas para IHC. Detección de TH en núcleo estriado
Tabla 10. Anticuerpos utilizados para la detección de TH
Anticuerpos Dilución Casa comercial
1°- Monoclonal anti-Tyrosine
Hydroxilase Clone TH-16
1:1250
TBS-T 0,2%, BSA 2,5% Sigma
2°- RPN1004V1 Rat anti-Mouse 1:200
TBS-T 0,2%, BSA 5% Amersham Bioscience, UK
Tampón Composición
Tris Buffer (TB) 50 mM Tris Base pH 7,6
Tris Buffer Salino (TBS) 50 mM Tris Base, 0,9% NaCl, pH: 7,6
TBS Triton 0,2% (TBS-T) 500 mL TBS, 1 mL Triton
Solución de bloqueo TBS, Triton 0,2%, Albúmina de suero bovino (BSA) 5%
Solución inhibición Peroxidasa endógena 20% metanol, 2% H2O2 en TBS-T 0,2%
Complejo Avidina-Peroxidasa: Avidin/ HRP 1:400. TBS-T 0,2%, BSA 2,5%
DAB/ H2O2 1 mL DAB 50 mg/mL DAB, 33 µL H2O2, 100 mL TB
Materiales y métodos
77
Cuantificación de la inmunoreactividad de TH en el núcleo estriado
El grado de inervación dopaminérgica del núcleo estriado fue cuantificado midiendo la
densidad óptica (DO) de la inmunoreactividad de la tirosina hidroxilasa (IR-TH) en una
de cada 6 secciones (12-15 secciones por animal). Las imágenes fueron captadas con
una cámara digital Nikon DXM 1200F conectada a un microscopio Nikon eclipse 90i,
conectado a su vez a un ordenador (Software ACT-1), a un aumento 2x.
El análisis de las imágenes fue llevado a cabo con el software gratuito Image J. El
núcleo estriado fue delineado como sigue: el borde exterior del estriado se definió
medialmente por el tercer ventrículo, dorsal y lateralmente por el cuerpo calloso, y por
una línea trazada entre la comisura anterior y el extremo del cuerpo calloso. La DO se
midió como la densidad integrada de los valores medios de gris por área analizada. La
TH-IR fue valorada bilateralmente y fueron asignadas unidades arbitrarias. Los
resultados fueron obtenidos a partir de 5 experimentos (n = 3 por grupo), y se
expresaron en forma de porcentaje respecto al grupo Control.
3.4.3.3 Detección del transportador vesicular de glutamato, V-Glut, en núcleo
estriado
El procedimiento utilizado fue muy similar al descrito en el apartado anterior, teniendo
en cuenta que en este caso el anticuerpo secundario está conjugado a la fosfatasa
alcalina, de modo que no es necesario ni inhibir la peroxidasa endógena ni incubar con
Avidina-Peroxidasa para amplificar la señal. En lugar de ello, se inhibió la fosfatasa
alcalina endógena con una solución de Tetramisole hydrochloride (Fluka, Germany),
que es un inhibidor de dicho enzima. El tratamiento no se realizó en un paso sino que
se incorporó la sustancia a todos los tampones de lavado e incubación en una
concentración 48 g/L de líquido, justo después de la incubación con el anticuerpo
primario. La composición de algunas de las soluciones utilizadas se describe en la
tabla 9 (TB, TBS, TBS-T, solución de bloqueo).
Después de la incubación con el anticuerpo secundario y de los lavados, se procedió
al revelado. Para ello, se utilizó la solución Western Blue Stabilized Substrate for
Alkaline Phosphatase (Promega, Madison, USA), también apta para uso
inmunohistoquímico, durante 1 min.
Para eliminar el exceso de reactivo de revelado, se efectuaron diversos lavados ya sin
Tetramisole hydrochloride, de 3 veces 5 min con TBS-T (0,5%), 2 veces 5 min con
TBS, y 2 veces 5 min con TB.
Materiales y métodos
78
Por último, se montaron las secciones en un portaobjetos, se dejaron secar bien al aire
y se cubrieron utilizando Mowiol. Estas preparaciones se mantiuvieron a 4°C.
El modo de cuantificación y procesamiento de imágenes fue el mismo que el descrito
en el apartado anterior.
Tabla 11. Anticuerpos utilizados en la detección del transportador vesicular de glutamato
Anticuerpos Dilución Casa comercial
1° Mouse Monoclonal anti VGLUT1 1:800 en
TBS-T 0,2%, BSA 2,5% Synaptic Systems
2° Anti-mouse Alkaline Phosphatase
conjugated
1:200 en
TBS-T 0,2%, BSA 5% Promega
3.4.3.4. Detección de la colina acetiltransferasa, ChAT, en núcleo estriado
El procedimiento utilizado para esta detección es prácticamente igual que el descrito
anteriormente [apartado 3.4.3.2] para la detección de TH en núcleo estriado, salvando
los pasos relacionados con la peroxidasa de rábano (HRP). En este caso, el
anticuerpo secundario está conjugado con el fluorocromo Alexa 488, de modo que a
partir de la incubación con este, se siguió el protocolo en oscuridad.
Los tampones utilizados para lavar y bloquear las secciones se describen en la tabla 9
y los anticuerpos primario y secundario con los que se incubaron los cortes, en la tabla
11.
Una vez finalizado el último lavado, se montaron los cortes en portaobjetos gelatinados
y se dejaron secar perfectamente al aire. Después, se cubrieron los portaobjetos
utilizando como medio de montaje el Mowiol.
Se dejó secar nuevamente y se procedió al análisis microscópico de las muestras. En
este caso se utilizó el filtro de fluorescencia FITC (Ex 465-495 nm; DM: 505; BA: 515-
555 nm) obteniéndose imágenes en color verde.
Materiales y métodos
79
Tabla 12. Anticuerpos utilizados en la detección de la colina acetiltransferasa
Anticuerpos Dilución Casa comercial
1° Goat anti Choline
AcetilTransferase
1:800 en
TBS-T 0,2%, BSA 2,5% Chemicon
2° Donkey anti-goat Alexa Fluor 488 1:200 en
TBS-T 0,2%, BSA 5% Invitrogen
3.4.3.5 Detección de tirosina hidroxilasa en substantia nigra y tinción
histológica con Fluoro-Jade B
En este ensayo se realizó una doble detección: por una parte se marcaron
específicamente las neuronas TH positivas de la substantia nigra pars compacta
mediante una técnica inmunohistoquímica, y por otra, se realizó una tinción histológica
que detecta neuronas en degeneración. Ambos protocolos se efectuaron sobre las
mismas secciones, de modo que al superponer las fotografías realizadas se podría, en
principio, detectar neuronas dopaminérgicas en estado de degeneración.
Debido a que nuestro protocolo de utilización de animales no nos permitía usar otro
fármaco distinto del MPP+, y este no produce degeneración a la dosis utilizada,
pedimos un control positivo al Dr. Antonio Valente, que nos proporcionó unas
secciones de cerebro de ratón previamente tratado con radiación ionizante. Sobre
estos cortes y en paralelo, se realizaron las mismas detecciones que en nuestro
experimento, como se podrá comprobar en el apartado Resultados. En este caso se
capturaron las neuronas dopaminérgicas correspondientes al área tegmental ventral
del ratón (VTA), encontrándose una degeneración masiva debido al tratamiento con
radiación.
Detección de tirosina hidroxilasa en substantia nigra
El protocolo es muy similar al descrito en el apartado anterior con algunas diferencias.
En este caso el anticuerpo secundario no estaba conjugado a biotina sino con el
cromóforo Alexa, con lo cual no fue necesario el proceso de la inhibición de la
peroxidasa endógena ni la amplificación de la señal mediante incubación con complejo
Avidina-Peroxidasa. Al trabajar con fluorescencia, a partir de la incubación con el
anticuerpo secundario, se trabajó en absoluta oscuridad hasta el final del protocolo.
Materiales y métodos
80
Por lo que respecta a la composición de las soluciones utilizadas para este
experimento, se ha descrito en la tabla 13. Los anticuerpos primario y secundario
utilizados, se detallan en la tabla 14.
Tinción histológica con Fluoro-Jade
El Fluoro-Jade es un derivado aniónico de la fluoresceína que se une de forma
sensible a neuronas en degeneración y a sus procesos celulares (Schmued and
Hopkins, 2000). Ha sido utilizado para examinar la degeneración inducida por
metamfetamina en neuronas corticales (Eisch et al. 1998), e hipocampales (Schmued
y Bowyer, 1997), así como degeneración inducida por la 1-Metil-4-fenil-1,2,3,6-
tetrahidropiridina (MPTP) en neuronas de la substantia nigra y tálamo (Freyaldenhoven
et al., 1997).
Procedimiento:
Los cortes, ya montados sobre los portaobjetos gelatinizados y completamente secos
fueron sometidos a una batería de deshidratación en alcoholes de gradación creciente.
Etanol 30%
Etanol 50%
Etanol 70%
Etanol 96%
Etanol Absoluto
Inmediatamente los cortes fueron rehidratados en alcoholes de gradación decreciente.
Etanol 96%
Etanol 70%
Tras la rehidratación se lavaron los cortes dos veces en agua destilada durante 5 min.
A partir de aquí, todos los pasos del protocolo se realizaron a temperatura ambiente y
en agitación constante de 150 rpm.
Posteriormente se efectuó una oxidación con permanganato de potasio a fin de reducir
el ruido de fondo y aumentar el contraste entre las células marcadas y las que no lo
están. Los portaobjetos fueron introducidos en una cubeta con solución de
permanganato de potasio. Se mantuvo durante 15 min en oscuridad. Después se lavó
en agua destilada dos veces durante 5 min.
2 min
5 min
10 min
Materiales y métodos
81
Inmediatamente se sumergieron los portaobjetos en una cubeta con una solución de
Fluoro-Jade de trabajo (Fluoro-Jade B, Chemicon International, Temecula, California)
al 0,001% y se dejaron durante 20 min, tras lo cual se aclaró con agua destilada tres
veces durante 5 min.
Tabla 13. Soluciones utilizadas en el marcaje doble TH y Fluoro-Jade B
Soluciones Composición
Tris Buffer (TB) 50 mM Tris Base pH 7,6
Tris Buffer Salino (TBS) 50 mM Tris Base, 0,9% NaCl, pH: 7,6
TBS Triton 0.2% (TBS-T) 500 mL TBS, 1 mL Triton
Permanganato de potasio MnO4K 0,06% en agua destilada
Solución de Fluoro-Jade stock 0,01% en agua destilada (4°C)
Solución Fluoro-Jade de trabajo
1:10 de la solución stock + ácido acético glacial al 0,1%
Después de los lavados, se dejaron secar los portaobjetos con los cortes durante la
noche. Por la mañana, se sumergieron en xilol durante 2 min y posteriormente se
cubrieron con medio de montaje DPX y un cubreobjetos. El secado tiene que ser
completo, por lo menos 48 horas, antes de la observación con el microscopio.
Tabla 14. Anticuerpos utilizados en el doble marcaje de TH y Fluoro-Jade B
Anticuerpos Dilución Casa comercial
1°- Monoclonal anti-Tyrosine
Hydroxilase Clone TH-16
1:1250
TBS-T 0,2%, BSA 2,5% Sigma
2°- Goat anti mouse Alexa Fluor 555 1:800
TBS-T 0,2%, BSA 5% Invitrogen Oregon, USA
El análisis de la doble detección se llevó a cabo utilizando los filtros de fluorescencia
G2-A (Ex 510-560 nm; DM: 575 nm; BA 590 nm) para observar la tinción específica de
las neuronas dopaminérgicas (rojo) y el filtro FITC (Ex 465-495 nm; DM: 505; BA: 515-
Solución de bloqueo TBS, Triton 0,2%, Albúmina de suero bovino (BSA) 5%
Materiales y métodos
82
555 nm) para observar el marcaje del Fluoro-Jade (verde). Se fotografiaron las
estructuras a un aumento de 20x y 40x.
3.4.4 Hibridación in situ
Obtención del tejido y procesamiento de la muestra
El método histológico utilizado para obtener el tejido a analizar mediante esta técnica
fue exactamente el descrito anteriormente [apartado 3.4.3], con la única diferencia de
que en este caso no se trabajó en flotación, sino que las secciones fueron montadas
en portaobjetos gelatinados y se dejaron secar completamente.
Las superficies y materiales sólidos se descontaminaron con RNaseZAP (Ambion),
que proporciona un ambiente libre de RNasas. Los tampones y sustancias líquidas
utilizadas se prepararon con H2O DEPC 0,02% (Sigma) y fueron esterilizadas.
Para llevar a cabo la pre-hibridación, los portaobjetos ordenados en cestillas plásticas
fueron pasados a través de una batería de soluciones (tabla 15). En primer, lugar se
post-fijaron en Paraformaldehido al 4% durante 20 min, se lavaron 2 veces en KPBS 5
min, luego se digirieron con Proteinasa K a 37°C 15 min tras lo cual, se lavaron los
cortes con H2O DEPC y TEA 0,1 M, y se acetilaron en solución de acetilación.
Finalmente, se lavaron durante 5 min con SSC2X, se deshidrataron en una batería de
etanol de concentración creciente (50, 70, 95, 2 X 100%, cada uno 3 min) y se dejaron
secar al aire en una campana de extracción.
La sonda utilizada para el proceso de hibridación, ya marcada radioactivamente con 35S-UTP, fue cedida amablemente por el Dr. A. Armario (Departamento de Fisiología
animal, Universidad Autónoma de Barcelona). Esta, corresponde al cDNA
complementario al mRNA del gen que codifica para el enzima tirosina hidroxilasa
(GeneID: 25085). La hibridación de la sonda se llevó a cabo añadiendo por encima de
cada portaobjetos 100 µL de tampón de hibridación, que contenía la sonda marcada
con 35S-UTP (1 x 106 dpm/ 100 µL), previamente calentado a 60-65°C. A continuación,
se selló con un cubreobjetos. Las secciones fueron incubadas en una cámara húmeda
entre 8-24 h, dentro de una estufa a 60°C.
Después de la hibridación con la sonda radioactiva, los portaobjetos fueron sometidos
a otra batería se soluciones, en una primera fase a 37°C en agitación y
posteriormente, a temperatura ambiente y sin agitación. Los portaobjetos cubiertos se
lavaron en SSC4X durante 30 min. Después, se retiró cuidadosamente el cubreobjetos
Materiales y métodos
83
y se siguieron lavando 4 veces 5 min en SSC4X con 1mM DTT. Posteriormente, se
lavó en tampón RNasa durante 5 min y seguidamente se incubó con RNasa A
(Amersham Pharmacia Biotech, UK) (tabla 15) durante 30 min para eliminar el exceso
de sonda y la uniones inespecíficas de RNA. Inmediatamente, y ya a temperatura
ambiente, los portaobjetos se lavaron en una serie de SSC de concentración
decreciente con 1 mM de DTT: 2 X 5 min en SSC2X, 10 min en SSC1X, 10 min en
SSC0,5X, 30 min SSC0,1X a 65°C, 5 min en SSC0,1X a TA. Justo después se
deshidrataron mediante una serie de etanol de concentración creciente con 1 mM de
DTT (50, 70, 95, 2 X 100%, cada uno 3 min) y se dejaron secar completamente.
Los portaobjetos fueron expuestos a un film Kodak Biomax MR autoradiography film
(Kodak, España) durante 8-24 h. Las imágenes fueron digitalizadas y cuantificadas
densitométricamente con el Software Scion Image. Dado que las unidades obtenidas
son arbitrarias, se expresaron los resultados en forma de porcentaje respecto al grupo
Control.
Tabla 15. Soluciones utilizadas para la técnica de hibridación in situ
Soluciones Composición
Paraformaldehido 4% 4 g/ 100 mL en PBS pH: 7,4
KPBS 3,81 g K2HPO4, 0,45 g, KH2PO4, 8,1 g NaCl en 1 L H2O DEPC
Solución Proteïnasa K 0,01 mg/ mL de proteinasa K (Roche) en Tris- HCl 100 mM + 50 mM
EDTA, pH: 8,0
TEA 0,1 M Trietilamina 0,1 M pH: 8,0
Solución acetilación 0,25% acético anhídrico en 0,01 M TEA
SSC 20X 175,3 g NaCl, 88,2 g Na3C6H5O7 en 1 L H2O DEPC pH: 6,2
Tampón de hibridación
50% formamida, 0,3 M NaCl, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM pH: 8,0,
Denhardts 1X, Sulfato de dextrano 10%, tRNA levadura 500 µg/ mL, 10
mM DTT
Tampón RNasa 0,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH:8,0
Tampón RNasa + RNAsa 0,02 mg/ mL de RNAsa en tampón RNAsa
Materiales y métodos
84
4. Estudio del estado de fosforilación del enzima TH
Este estudio se llevó a cabo en un sistema de sinaptosomas e in vivo.
La preparación de la fracción P2 enriquecida de sinaptosomas de núcleo estriado de
rata se realizó siguiendo el protocolo descrito anteriormente [apartado 2.2.]
Los tratamientos se llevaron a cabo durante 15 min a 37 °C en agitación. Al grupo
Control se le añadió únicamente el vehículo, al grupo Hc-TeTx 10 nM (concentración
final) de fragmento Hc-TeTx, y al grupo PPI se le añadió una dilución 1:100 del cocktail
de inhibidores de fosfatasas (Sigma P-2850). Tras el tratamiento, los sinaptosomas
fueron centrifugados en una centrífuga Eppendorf durante 5 min a 13000 rpm. El pellet
se resuspendió en tampón de lisis (tabla 16) y se sonicó durante 10 segundos.
Posteriormente, se cuantificó mediante la técnica de BCA [apartado 1.3] la
concentración de proteína. Después, se añadió el tampón de muestra y se calentó a
99 °C durante 5 min. Tras reposar en hielo, se resolvieron las muestras mediante la
técnica de western blot [apartado 3.4.1.]
Tabla 16. Composición de los tampones utilizados para el inmunoblot de sinaptosomas
Tampón Composición
Tampón de lisis 4X 280 mM Tris, SDS 4,4%, Glicerol 44%, H2O milli-Q
Tampón de muestra 4X 280 mM Tris, SDS 4,4%, Glicerol 44%, H2O milli-Q, 2-Mercaptoetanol
1/100, Azul de bromofenol
Para realizar el análisis in vivo, los animales fueron administrados según el protocolo
anteriormente descrito [apartado 3.1.]. Cinco días más tarde, se sacrificaron estos
fueron sacrificados, se extrajeron los núcleos estriados de ambos hemisferios y se
procesaron a fin de analizarlos mediante la técnica de Western Blot [apartado 3.4.1].
5. Análisis estadístico
El análisis estadístico efectuó utilizando el programa informático PRISM GraphPad 5.0.
Para la comparación de dos valores se realizó un análisis Student´s t-test. En caso de
tener que comparar tres o más valores, se utilizó el análisis de la varianza ANOVA de
una vía seguido de un post test de comparación múltiple de Bonferroni. Se aceptó un
valor de p < 0,05 como estadísticamente significativo.
IV- RESULTADOS
Resultados
87
IV- Resultados
1. Aplicación estereotáxica de la neurotoxina MPP+ en el núcleo estriado.
Caracterización del modelo in vivo
1.1 Efecto a lo largo del tiempo de la inyección intraestriatal de MPP+ en rata
adulta, sobre los niveles de catecolaminas y sus metabolitos, en núcleo estriado
Para determinar el efecto producido por el tratamiento agudo con una dosis baja del
fármaco MPP+ a lo largo del tiempo, machos Sprague-Dawley de 6 a 8 semanas de
edad, fueron inyectados estereotáxicamente de manera unilateral en el núcleo estriado
derecho (coordenadas: A: +0,7 mm, L: -2,8 mm, DV: 6,0 mm) aplicando, bien solución
salina estéril en los animales del grupo Control, o bien 10 µg de MPP+ en los animales
problema. En los días establecidos, se sacrificaron los animales y se extrajeron los
núcleos estriados (ipsilateral y contralateral) y el hipotálamo para, posteriormente,
determinar mediante HPLC los niveles de dopamina, sus metabolitos y noradrenalina,
en una ventana de tiempo de 0 a 9 días.
En la figura 1, se han representado gráficamente los valores de la concentración de
dopamina (A) obtenidos en el análisis del núcleo estriado inyectado en función del
tiempo. Se observa un descenso paulatino en la concentración de dopamina (DA)
alcanzando el valor mínimo (50%, aproximadamente) a los 5 días de la lesión. A partir
del 7º día, los valores de DA se restablecen, de modo que no existen diferencias
significativas entre las ratas tratadas con MPP+ y las ratas del grupo Control (p > 0,05).
Los valores hallados para las concentraciones de DA se analizaron estadísticamente
con el test one way ANOVA seguido del post test de comparación múltiple de
Bonferroni, siendo significativamente diferentes el día 3 y el día 5 para el núcleo
ipsilateral (**p < 0,01, ***p < 0,001, respectivamente).
Los enzimas responsables del catabolismo de las catecolaminas, monoaminooxidasa
(MAO) y aldehído deshidrogenasa, de localización fundamentalmente intraneuronal, y
catecol-O-metiltransferasa (COMT), que actúa sobre catecolaminas extracelulares,
generan diversos metabolitos de dopamina de entre los que destacan tres: DOPAC
(Ácido 3,4-dihidroxifenilacético), HVA (Ácido Homovanílico) y 3-MT (3-metoxitiramina)
(figura 9 apartado Introducción).
Resultados
88
Figura 1. Estudio a lo largo del tiempo del efecto producido por la aplicación de MPP
+
sobre los niveles estriatales de dopamina y sus metabolitos, y noradrenalina. Siguiendo
la aplicación de MPP+ estriatal (10 µg), los niveles de DA (A) y metabolitos DOPAC (B), HVA
(C), 3-MT (D), así como los de NA (E), fueron analizados después de 0, 3, 5, 7 y 9 días
mediante HPLC acoplada a detección electroquímica. Las gráficas muestran un decremento
significativo de DA a día 3 y día 5, y una recuperación espontánea a día 7. Las concentraciones
estriatales de DOPAC, HVA y 3-MT siguen el mismo patrón. Por el contrario, los niveles de NA
no se ven modificados significativamente a lo largo del tiempo. Los resultados representan la
media ± SD, **p < 0,01, ***p < 0,001. (DA, dopamina; DOPAC, Ácido 3,4-dihidroxifenilacético;
HVA, Ácido Homovanílico y 3-MT, 3-metoxitiramina; NA, noradrenalina).
Por este motivo, además de los niveles de DA, se analizó el contenido estriatal de sus
metabolitos DOPAC (B), HVA (C) y 3-MT (D). En los tres casos, la concentración
observada disminuye significativamente entre los días 3 y 5 (**p < 0,01) coincidiendo
con el descenso de DA, y experimenta una recuperación hasta los niveles presentados
por los animales del grupo Control, entre los días 7 y 9.
Resultados
89
En ningún caso se observaron diferencias significativas a lo largo del tiempo en los
niveles estriatales de DA o sus metabolitos de los hemisferios contralaterales.
Del mismo modo, el contenido estriatal de NA no sufre variaciones debidas al
tratamiento con MPP+ a lo largo del tiempo, manteniéndose constantes sus niveles en
ambos núcleos estriados (p > 0,05) (figura 1E).
Para descartar la difusión de MPP+ al hipotálamo, realizamos el mismo tipo de
estudios en esta estructura. El hipotálamo es una región cerebral situada por debajo
del tálamo que juega un papel primordial en la conexión entre el sistema nervioso y el
sistema endocrino, y que tiene la capacidad de detectar cambios tanto en la
composición de la sangre como en la del líquido cerebroespinal.
Figura 2. Estudio a lo largo del tiempo del efecto producido por la aplicación de MPP+
sobre los niveles hipotalámicos de DA, DOPAC y NA. A los 0, 3, 5, 7 y 9 días de la
inyección intraestriatal unilateral de 10 µg de MPP+ los niveles de DA (A), DOPAC (B) y NA (C)
fueron analizados mediante HPLC, no encontrándose diferencias significativas entre los valores
obtenidos para las ratas tratadas con MPP+ en comparación con las ratas pertenecientes al
grupo Control (p > 0,05). Los valores se han expresado como la media ± S.D. (DA, dopamina;
DOPAC, Ácido 3,4-dihidroxifenilacético; NA, noradrenalina).
Curiosamente, el hipotálamo carece de la protección proporcionada por la barrera
hematoencefálica, de modo que si el MPP+ difundiera desde el núcleo estriado a
Resultados
90
través de algún fluido, podría acceder libremente a él haciendo variar las
concentraciones de diferentes neurotransmisores. Por esta razón, de forma paralela a
las mediciones realizadas en el núcleo estriado, se analizó el contenido de DA,
DOPAC y noradrenalina (NA) en tejido hipotalámico, no encontrándose diferencias
remarcables entre los valores obtenidos para las ratas tratadas con MPP+ en
comparación con las del grupo Control (figura 2).
En resumen, la aplicación intraestriatal aguda de 10 µg del compuesto MPP+ en rata
adulta provoca una variación de los niveles endógenos de dopamina y metabolitos del
núcleo estriado inyectado, ocasionando una disminución transitoria de sus niveles, que
toca su punto máximo al 5° día y se recupera completamente al 9° día. En todo
momento el contenido estriatal de estas sustancias permanece invariable en el núcleo
estriado contralateral. Asimismo, los niveles de noradrenalina tampoco se ven
modificados por el tratamiento con MPP+.
El análisis del tejido hipotalámico no muestra cambios en las concentraciones de DA,
DOPAC o NA, sugiriendo que no hay difusión de la sustancia inyectada, o bien que
esta carece de una actividad importante en dicha región cerebral.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en este estudio a lo largo del tiempo, se
decidió sacrificar metódicamente los animales al quinto día del tratamiento agudo con
MPP+, ya que ese es el momento en que el contenido estriatal de DA experimenta el
mayor descenso en el sistema descrito, proporcionando así un escenario adecuado
para trabajar en un modelo in vivo de Parkinsonismo o de degeneración
dopaminérgica, en una etapa muy inicial.
1.2 Efecto de la inyección estereotáxica de MPP+ en el núcleo estriado 5 días
post-lesión, sobre los niveles de TH, ChAT y VGlut
Dado que el contenido estriatal de dopamina había experimentado un descenso
significativo a los 5 días de la aplicación intraestriatal de la neurotoxina MPP+, y que el
enzima tirosina hidroxilasa es el enzima limitante en la síntesis del neurotransmisor
(Nagatsu et al., 1964), se quiso comprobar si la reducción de dopamina estaba
relacionada con una disminución del enzima total presente en el núcleo estriado.
Por otra parte, en esta sección se creyó oportuno examinar un posible efecto
inespecífico causado por de MPP+ sobre otros tipos neuronales presentes en el núcleo
estriado, tales como las interneuronas colinérgicas o las aferencias glutamatérgicas,
ya que algunos estudios publicados demuestran que el daño producido por la
Resultados
91
aplicación de MPP+ en el núcleo estriado podría tener efectos no sólo en las neuronas
dopaminérgicas.
Con este fin se inyectaron los animales estereotáxicamente, bien con suero salino
estéril, o bien con 10 µg de MPP+, y se sacrificaron a los 5 días mediante perfusión
intracardíaca con PFA (4%) y glutaraldehído (0,2%). Posteriormente, se extrajeron los
cerebros y el tejido fue procesado a fin de poder realizar análisis inmunohistoquímicos
para visualizar la tirosina hidroxilasa, TH, la colina acetiltransferasa, ChAT, y el
transportador vesicular de glutamato, VGlut1, que se revelaron con DAB, anticuerpo
secundario conjugado con Alexa 488, y anticuerpo secundario conjugado con
fosfatasa alcalina, respectivamente.
En la figura 3 se muestran secciones representativas del núcleo estriado ipsilateral de
los grupos de animales Control y tratados con MPP+, (A) para la tirosina hidroxilasa y
(B) para el transportador vesicular de glutamato, VGlut.
En ambos experimentos se evaluó el efecto producido por la neurotoxina MPP+ en el
núcleo estriado mediante el análisis de la densidad óptica (DO), que fue valorada a lo
largo de todo el núcleo estriado, con ayuda del software Image J. En el caso de la
tirosina hidroxilasa, se observa un descenso significativo de la inmunoreactividad en el
núcleo inyectado con MPP+ (40% aproximadamente), en comparación con la obtenida
para el grupo Control. Contrariamente, la inmunoreactividad del transportador vesicular
de glutamato no sufre modificaciones aparentes a causa del tratamiento con la
neurotoxina MPP+. El estudio de los hemisferios contralaterales no revela diferencias
significativas de inmunoreactividad ni para la TH ni para el VGlut (resultados no
mostrados).
Resultados
92
Figura 3. Inmunoreactividad de TH y VGlut en núcleo estriado de rata 5 días post-lesión.
Fotomicrografías representativas de secciones coronales (30 µM) del hemisferio inyectado con
vehículo o con MPP+ (10 µg). La IR de la TH (A) disminuye significativamente (*p < 0,05) en el
núcleo inyectado con MPP+ mientras que la del transportador vesicular de glutamato, (B), no
presenta diferencias remarcables (p > 0,05) respecto al grupo Control. Los valores obtenidos se
recogen en las gráficas adyacentes, que muestran el porcentaje de IR respecto al grupo
Control para cada anticuerpo. Barra = 500 µm. TH, tirosina hidroxilasa; VGlut, transportador
vesicular de glutamato; IR, inmunoreactividad.
A diferencia de lo que ocurre con las neuronas dopaminérgicas y glutamatérgicas, el
cuerpo celular de las interneuronas colinérgicas reside en el núcleo estriado,
característica que permitió efectuar un recuento celular completo de las neuronas
ChAT positivas a fin de analizar el efecto de la aplicación de MPP+ sobre este tipo
celular. En la figura 4 se muestran imágenes representativas de las secciones
analizadas por inmunohistoquímica tomadas con objetivos de 2x (A), 10x (B) y 40x (C)
aumentos. Dada la dificultad de contar las neuronas a 2x, el recuento se realizó a 10x
y en caso de duda se resolvió a 20x ó 40x aumentos. El porcentaje de neuronas ChAT
positivas presentes en el núcleo estriado inyectado con MPP+ no sufre variaciones
significativas respecto al del grupo Control (p > 0,05). Asimismo, el número de
neuronas ChAT positivas del hemisferio contralateral tampoco experimenta
modificaciones a causa del tratamiento con MPP+ (no mostrado).
Resultados
93
Figura 4. Recuento de neuronas ChAT positivas en núcleo estriado de rata 5 días post-
lesión. Fotomicrografías representativas de núcleo estriado sobre las que se realizó el
recuento celular. Imágenes tomadas con objetivos de 2x (A), 10x (B) y 40x (C) aumentos con
microscopio de fluorescencia. En la gráfica (D) se ha representado el porcentaje de neuronas
ChAT positivas encontradas para el grupo Control y para el grupo tratado con MPP+. Las barras
de A, B y C corresponden a 200, 100 y 20 µm, respectivamente.
En resumen, se puede decir que la aplicación intraestriatal de 10 µg de MPP+ produce
una disminución de la inmunoreactividad del enzima tirosina hidroxilasa en el
hemisferio ipsilateral a la lesión, de aproximadamente un 40% con respecto al grupo
Control, no observándose diferencias en el núcleo estriado contralateral. Esta cantidad
de MPP+ no afecta a la inmunoreactividad de transportador de glutamato VGlut
presente en el núcleo estriado inyectado, sugiriendo que la neurotoxina MPP+ no altera
el funcionamiento de las terminaciones glutamatérgicas, ni del hemisferio lesionado ni
del contralateral. Por último, la inyección de 10 µg de MPP+ no es capaz de dañar las
interneuronas colinérgicas residentes en el núcleo estriado, ni en el hemisferio
lesionado ni en el intacto
Resultados
94
2. Estudio del efecto derivado de la aplicación del fragmento Hc-TeTx en el
modelo in vivo previamente caracterizado
2.1 Efecto producido por el cotratamiento con MPP+ y el fragmento Hc-TeTx,
ambos aplicados esterotáxicamente, sobre los niveles estriatales de dopamina y
sus metabolitos
Los resultados obtenidos en el estudio a lo largo del tiempo sobre el efecto producido
por la neurotoxina MPP+, mostraron que a los cinco días de la lesión, el contenido
estriatal de dopamina correspondía aproximadamente a un 40-60% de los niveles de
una rata sana. Con esta información se quiso averiguar cuál era el efecto producido
por el cotratamiento con MPP+ y el fragmento Hc-TeTx sobre los niveles de DA y sus
metabolitos en el núcleo estriado.
Así, se efectuó un estudio en el que se analizaron cuatro condiciones denominadas
como: Control, Hc-TeTx, MPP+ y Hc/MPP+. En todas ellas el procedimiento
desarrollado fue idéntico, variando sólo los productos inyectados estereotáxicamente
(vehículo, MPP+, Hc-TeTx o Hc-TeTx y MPP+).
Después de la intervención intraestriatal, se dejó recuperar a los animales durante 5
días y posteriormente, se procedió al sacrificio. Se extrajeron los núcleos estriados y
siguiendo el protocolo detallado en el apartado “Materiales y Métodos”, se analizaron
las concentraciones de dopamina y sus metabolitos mediante la técnica de HPLC.
En la figura 5 se presentan los resultados obtenidos, evidenciándose varios
resultados. En primer lugar, la aplicación de vehículo parece no tener efecto alguno
per se. Del mismo modo, la administración intracraneal del fragmento Hc-TeTx no
modifica las concentraciones de DA (A) ni de sus metabolitos DOPAC (B), HVA (C) y
3-MT (D). En el grupo tratado con MPP+ los niveles de DA (**p < 0,01) así como los de
DOPAC, HVA (*p < 0,05) y 3-MT (**p < 0,01), al igual que en el estudio a lo largo del
tiempo (figura 1), se ven reducidos significativamente en el hemisferio lesionado. Por
último, en los animales cotratatados con Hc-TeTx y MPP+, se mantienen los niveles de
las sustancias estudiadas en el núcleo ipsilateral.
Por otra parte, la administración en el hemisferio ipsilateral de cualquiera de los
tratamientos descritos, no causa un efecto notable sobre los niveles de DA (E) o sus
metabolitos (F, G, H) en el hemisferio contralateral al lado de la lesión (p > 0,05).
Resultados
95
Figura 5. Nivel estriatal de DA y metabolitos. Aplicación intraestriatal de Hc-TeTx, MPP
+ o
Hc/MPP+. De manera unilateral fue inyectado estereotáxicamente un volumen de 2,5 µL de:
vehículo (Control), Hc-TeTx (1µM) (Hc-TeTx), MPP+ (10µg) (MPP+) o simultáneamente MPP+
en solución Hc-TeTx (1µM) (Hc/MPP+). A los 5 días de la lesión se analizó mediante HPLC el
contenido estriatal de DA (A), DOPAC (B), HVA (C) y 3-MT (D) de ambos núcleos estriados. La
aplicación de vehículo así como de Hc-TeTx intracraneal no produce cambios remarcables en
los niveles de DA o de sus metabolitos en el núcleo ipsilateral. Sin embargo, el tratamiento con
MPP+ provoca una reducción significativa de estos valores. La coaplicación de Hc-TeTx y MPP+
mantiene los niveles de concentración tanto de DA como de sus metabolitos, siendo éstos
similares a los de los animales Control (p > 0,05). Los datos obtenidos para estas sustancias en
el hemisferio contralateral no presentan diferencias significativas entre ellos (E, F, G, H). Se
han representado las medias ± S.E.M de los valores obtenidos en 5 experimentos
independientes (n = 3-4 animales). (ANOVA, test post hoc Bonferroni, *p < 0,05, **p < 0,01).
Resultados
96
Como resumen de los resultados presentados en este apartado se puede decir que la
aplicación de la neurotoxina MPP+ produce un descenso estadísticamente significativo
de los niveles, tanto de dopamina como de sus metabolitos en el núcleo estriado del
hemisferio lesionado, en tanto que la coaplicación del fragmento Hc-TeTx de la toxina
tetánica previene totalmente la disminución de dichos valores.
Es muy importante destacar que la inyección estereotáxica en el núcleo estriado de
rata del fragmento Hc-TeTx en solitario, no produce variaciones estadísticamente
significativas en los niveles de dopamina o de sus metabolitos, ni en el hemisferio
lesionado ni en el hemisferio contralateral.
2.2 Efecto sobre los niveles estriatales de catecolaminas producido por el
tratamiento estereotáxico con MPP+, previa administración intraperitoneal del
fragmento Hc-TeTx
Siendo el resultado encontrado anteriormente tan positivo pero la vía de aplicación del
fragmento Hc-TeTx de la toxina tetánica tan poco práctica en caso de una posible
utilización como fármaco, se optó por estudiar otra vía de administración de la
molécula Hc-TeTx. Así, se probó la inyección intraperitoneal (IP), en lugar de la
aplicación intracraneal.
La coaplicación de Hc-TeTx en el momento de producir la lesión estereotáxica con
MPP+, asegura la presencia de Hc-TeTx en el núcleo estriado en el momento
oportuno. Sin embargo, la aplicación intraperitoneal de la molécula retarda su llegada
al lugar de acción teórico, debido al necesario transporte del SNP al SNC. Por este
motivo aplicamos el Hc-TeTx en forma de pretratamiento 7 y 4 días antes de la
intervención estereotáxica con la neurotoxina MPP+.
La figura 6 muestra el esquema de trabajo utilizado a partir de este momento en los
experimentos llevados a cabo in vivo, en el que se detalla el tratamiento aplicado a
cada grupo de animales en un día concreto, y la vía de administración de las
sustancias.
Después de la administración intracraneal (Día 7) se dejó recuperar a los animales
durante 5 días y posteriormente, se procedió al sacrificio (Día 12).
Resultados
97
Figura 6. Esquema cronológico de trabajo de un experimento in vivo . A Día 0 y Día 3 se
realizó una inyección IP (1mL/Kg) a los animales, bien con vehículo, o bien con Hc-TeTx (10
µM). A Día 7 se les aplicó estereotáxicamente 1 µL de vehículo ó 1 µL de la neurotoxina MPP+
(10 µg/ µL) en el hemisferio derecho del cerebro. Tras 5 días de recuperación, se sacrificaron
los animales y se procedió al procesamiento del tejido en función del experimento a realizar. IP:
intraperitoneal; IC: intracraneal; WB: Western Blot; IHC: inmunohistoquímica; HPLC:
cromatografía de alta precisión; ISH: Hibridación in situ.
En este caso en concreto, la extracción y procesamiento de los núcleos estriados se
realizó de modo idéntico al experimento comentado anteriormente [apartado 1.1]. Los
homogenizados se analizaron mediante HPLC y los resultados obtenidos se han
representado en la figura 7.
El análisis de los valores obtenidos para el grupo Hc-TeTx, muestra que los niveles de
DA (A) no sufren alteraciones en el costado de la lesión estereotáxica (p > 0,05) a
causa del tratamiento. Asimismo, los resultados hallados para los metabolitos de DA,
DOPAC (B), HVA (C) y 3-MT (D), demuestran que el pretratamiento con Hc-TeTx no
modifica el metabolismo de la DA, ya que los niveles de dichos metabolitos son
equiparables a los obtenidos para los animales del grupo Control (p > 0,05).
Los niveles de DA (A) del lado ipsilateral a la lesión correspondientes al grupo MPP+,
se ven reducidos entre un 40-60% después del tratamiento con la neurotoxina (*p <
0,05). Al igual que en el experimento anterior, los niveles de metabolitos de la DA (B,
C, D) del hemisferio lesionado caen considerablemente, siendo estos descensos
estadísticamente significativos para el HVA (**p < 0,01) y para la 3-MT (**p < 0,01), no
así para el DOPAC (p > 0,05,) aunque la tendencia al descenso es muy notable.
Tiempo Control Hc-TeTx MPP+ Hc/MPP+ Vía
Día 0 Vehículo Hc-TeTx Vehículo Hc-TeTx IP
Día 3 Vehículo Hc-TeTx Vehículo Hc-TeTx IP
Día 7 Vehículo Vehículo MPP+ MPP+ IC
Día 12 Sacrificio Sacrificio Sacrificio Sacrificio --
WB, IHC, HPLC, ISH
Resultados
98
Figura 7. Nivel estriatal de DA y metabolitos. Pretratamiento con Hc-TeTx. La aplicación
intraestriatal de 10 µg de MPP+ produce un descenso en la concentración de DA (A) así como
en la de sus metabolitos (B, C, D) en el lado ipsilateral después de 5 días de la lesión. Estos
niveles se ven altamente restaurados en animales pretratados con Hc-TeTx (0,5 mg/Kg, IP). El
grupo de animales inyectados únicamente con Hc-TeTx (IP) no experimenta variaciones en los
niveles de DA o sus metabolitos. De igual manera, estos valores no presentan cambios
estadísticamente significativos en los núcleos estriados del hemisferio contralateral a la lesión
(E, F, G, H). Los datos han sido expresado en forma de media ± S.E.M de los resultados
obtenidos en 5 experimentos independientes (n = 3-4 animales). (ANOVA, test post hoc
Bonferroni *p < 0,05, **p < 0,01).
Resultados
99
Los animales del grupo Hc/ MPP+, pretratados con Hc-TeTx (IP) e inyectados con
MPP+ (IC), no presentan variaciones en los niveles de DA (A) del núcleo estriado del
hemisferio lesionado así como tampoco lo hacen en las concentraciones de DOPAC,
HVA y 3-MT (B, C, D).
Los análisis realizados con los núcleos estriados contralaterales a la lesión
demuestran que el contenido estriatal tanto de DA como de sus metabolitos no sufre
cambios estadísticamente significativos en ninguna de las condiciones estudiadas
(figura 7E, F, G y H).
En síntesis, el pretratamiento con el fragmento Hc-TeTx (0,5 mg/Kg), aplicado por vía
intraperitoneal 7 y 4 días previos a la inyección intraestriatal de MPP+, restituye los
niveles de dopamina y de sus metabolitos DOPAC, HVA y 3-MT en el núcleo estriado
ipsilateral a la lesión en la misma medida que la coaplicación intracraneal de Hc-TeTx
con la neurotoxina MPP+.
Este dato indica que la vía de administración intraperitoneal no constituye una
limitación para que el fragmento Hc-TeTx ejerza su efecto neuroprotector dentro del
SNC, ya que en este ensayo se observa un efecto comparable al obtenido al coaplicar
intracranealmente la molécula con el tóxico MPP+.
3. Influencia del fragmento Hc-TeTx sobre la captación de [3H]-DA y
[3H]-MPP+ en preparaciones sinaptosomales de núcleo estriado de rata
La internalización de la neurotoxina MPP+ en las neuronas dopaminérgicas depende
del transportador de dopamina DAT (Bezard et al., 1999), situado en la membrana
plasmática. Dado que estudios previos de nuestro grupo habían dejado patente la
capacidad del fragmento Hc-TeTx de alterar la captación de 5-HT a través de su
transportador SERT (Najib et al., 1999), que es estructural y funcionalmente similar al
transportador de dopamina DAT, se resolvió comprobar si el fragmento Hc-TeTx
ejercía algún efecto sobre los parámetros cinéticos (KM y Vmax) del transportador de
dopamina.
Este transportador se encuentra presente mayoritariamente en los axones y terminales
sinápticas de las neuronas dopaminérgicas del núcleo estriado (Hersch et al., 1997).
Por este motivo, se optó por realizar el estudio utilizando un modelo in vitro de la
terminal sináptica: los sinaptosomas (ver Gray y Whittaker, 1962).
Resultados
100
3.1 Caracterización y parámetros cinéticos del transporte de dopamina en
sinaptosomas de núcleo estriado de rata
A fin de determinar el valor de estos parámetros específicos para el transporte de
dopamina, se extrajo el tejido estriatal de una rata adulta de la cepa Sprague-Dawley a
partir del cual se prepararon fracciones ricas en sinaptosomas (P2).
Se utilizó dopamina tritiada ([7,8-3H]-dopamina, [3H]-DA) a concertaciones crecientes
en un rango de 0-640 nM. El estudio del transporte total se realizó incubando los
sinaptosomas a 37ºC durante 2 min, y el del transporte inespecífico con incubaciones
a 0-4ºC, en las mismas condiciones [mirar apartado Materiales y Métodos]. El
transporte específico (actividad específica del transportador) responde a la ecuación:
A específica = A total - A inespecífica
Los resultados obtenidos con [3H]-DA se presentan en la figura 8, según un ajuste a
una hipérbola cuadrangular (representación de Michaelis-Menten).
Los valores aparentes obtenidos para los parámetros cinéticos fueron Vmax= 4967 ±
222 fmol/mg prot ·min y KM= 0,179 ± 0,02 µM, determinados utilizando un análisis de
regresión no lineal con el programa GraphPad Prism 5.0.
Figura 8. Determinación de los parámetros cinéticos del transporte de dopamina en
sinaptosomas de núcleo estriado de rata. Se incubaron sinaptosomas de núcleo estriado de
rata con concentraciones crecientes de [3H]-DA a 37° y 0-4°C. Se ha representado el transporte
total (37° C), el transporte inespecífico (0-4°C) y el transporte específico, que es el resultado de
la resta de las dos curvas anteriores. Obsérvese que el transporte inespecífico responde a una
recta y en cambio transporte específico genera una curva que tiende a la saturación. Se han
representado las medias ± S.E.M. obtenidas en tres experimentos realizados de forma
independiente. El análisis no lineal de los valores hallados nos permite determinar tanto la Vmax
como la KM.
Resultados
101
3.2 Acción farmacológica del fragmento Hc-TeTx sobre la captación de
dopamina en sinaptosomas de núcleo estriado de rata
Una vez calculados los parámetros cinéticos Vmax y KM del transporte de dopamina en
condiciones fisiológicas, se quiso averiguar si el fragmento recombinante Hc-TeTx
generaba un cambio cinético con constantes aparentes distintas a las calculadas en
condiciones fisiológicas.
En este caso, las alícuotas de sinaptosomas se pretrataron durante 15 minutos con
concentraciones diferentes de Hc-TeTx (1, 10, 100 nM, concentraciones finales) y
subsecuentemente con [3H]-DA, durante 2 minutos. Al igual que en el apartado
anterior, la captación Total se efectuó a 37ºC y la Inespecífica a 0-4ºC. Del mismo
modo, la actividad específica se calculó restando la actividad Inespecífica a la
actividad Total.
Figura 9. Efectos del pretratamiento con Hc-TeTx sobre la captación de [
3H]-DA en
sinaptosomas de núcleo estriado de rata. Los sinaptosomas (P2) fueron pretratados con
diferentes concentraciones de fragmento Hc-TeTx (1, 10 y 100 nM, concentración final) durante
15 minutos a 37°C y subsecuentemente con [3H]-DA durante 2 minutos (A) en un rango de
concentración entre 0-640 nM y (B) a una concentración invariable de 160 nM de [3H]-DA,
cercana al valor de la KM. A) Las curvas de saturación obtenidas para los sinaptosomas
pretratados con 1, 10 y 100 nM de fragmento Hc-TeTx no difieren significativamente de la del
grupo Control (ANOVA, p > 0,05). B) En la gráfica se ha representado la actividad específica
obtenida para la captación de DA a una concentración invariable (160 nM) para cada
tratamiento, como porcentaje respecto al grupo Control. La presencia de Hc-TeTx no es capaz
de alterar la captación de dopamina a través del transportador DAT (ANOVA, p > 0,05).
En la figura 9A se muestran las curvas de saturación obtenidas mediante el análisis
de los datos por regresión no lineal para un sitio de unión, realizado con el software
Resultados
102
GraphPad Prism 5.0. El análisis estadístico ANOVA reveló que no existían diferencias
estadísticamente significativas entre las curvas de saturación obtenidas para los
sinaptosomas tratados con el fragmento Hc-TeTx y los del grupo Control (p > 0,05).
Con este mismo programa informático calculamos los valores experimentales de las
constantes cinéticas Vmax y KM para los diferentes tratamientos, obteniéndose los
valores que se encuentran reflejados en la tabla 1. El análisis estadístico ANOVA
desvela que no hay diferencias remarcables entre los valores de los parámetros
cinéticos del grupo Control y los del los sinaptosomas tratados con diferentes
concentraciones de Hc-TeTx (p < 0,05).
Estos resultados sugieren que el pretratamiento de los sinaptosomas de núcleo
estriado de rata con concentraciones 1, 10 y 100 nM del fragmento Hc-TeTx durante
15 minutos no es capaz de modificar los parámetros cinéticos Vmax y KM
experimentales relativos a la captación de dopamina a través del transportador de
dopamina DAT en sinaptosomas de núcleo estriado de rata.
Tabla 1. Parámetros cinéticos del transporte de [
3H]-DA en sinaptosomas de núcleo
estriado de rata
Los valores aparentes de Vmax y KM fueron determinados mediante análisis de regresión no
lineal a partir de las curvas de saturación obtenidas en 5 experimentos realizados por triplicado.
Los valores de Vmax están expresados en fmol/mg proteína·min y la KM, en µM, y representan la
media ± S.E.M. de los resultados. Los parámetros cinéticos de los grupos pretratados con
diferentes concentraciones de fragmento Hc-TeTx no difieren significativamente de los
parámetros cinéticos hallados para el grupo Control ANOVA (p > 0,05). n.s = no significativo
Adicionalmente se realizó una pequeña serie de experimentos a una concentración
invariable de dopamina, 160 nM, para valorar con más precisión los posibles cambios
ejercidos por el pretratamiento con el fragmento Hc-TeTx a 1, 10 y 100 nM, a una
concentración de dopamina cercana a la KM. En este caso al igual que en el anterior,
Vmax
(fmol/mg prot * min)
KM
(µM)
Control 4967 227 0.179 0.02
Hc-TeTx 1 nM 4741 494 0.159 0.04 n.s
Hc-TeTx 10 nM 4628 86 0.201 0.009 n.s
Hc-TeTx 100 nM 5156 258 0.133 0.019 n.s
Resultados
103
los sinaptosomas de núcleo estriado de rata se preincubaron durante 15 minutos con
1, 10 ó 100 nM de Hc-TeTx a 37 ºC y subsecuentemente con [3H]-DA, durante 2
minutos. La captación Total se efectuó a 37ºC y la Inespecífica a 0-4ºC. Los resultados
representados son la media ± S.E.M. de los valores obtenidos en tres experimentos
independientes realizados por cuadruplicado.
Como se puede observar en la figura 9B, el pretratamiento con el fragmento
recombinante Hc-TeTx de la toxina tetánica a concentraciones 1, 10 y 100 nM no
modifica la captación de dopamina cuando utilizamos una concentración invariable de
dopamina, 160 nM, que se encuentra cercana al valor de la KM.
Por último, a fin de intentar reproducir el escenario en el que se lleva a cabo la
inyección estereotáxica de MPP+ en el núcleo estriado de rata, se diseñó una pequeña
aproximación en la que se trataron los sinaptosomas con Hc-TeTx (10 nM), con MPP+
(50 µM ≈ 7,5 µg), con ambos o sólo con vehículo y posteriormente, se analizó la
captación de [3H]-DA. Como se observa en la figura 10, el tratamiento de los
sinaptosomas con MPP+ durante 5 minutos reduce al 50% la captación de [3H]-DA, y el
pretratamiento con Hc-TeTx (10 nM) durante 15 minutos no es capaz de revertir este
descenso de la captación (*p < 0,05).
Figura 10. Efecto del pretratamiento con Hc-TeTx y MPP
+ sobre la captación de [
3H]-DA.
Los sinaptosomas fueron preincubados durante 15 min con Hc-TeTx (10 nM), 5 min con MPP+
(50 µM), con ambas sustancias consecutivamente o sólo con vehículo, y posteriormente 2
minutos con [3H]-DA (160 nM). El tratamiento con MPP+ reduce al 50% la captación de [3H]-DA
a través del transportador DAT y el pretratamiento con Hc-TeTx (10 nM) no es capaz de
restituir la actividad del transportador en los sinaptosomas de núcleo estriado de rata. Se han
representado las medias ± S.E.M de los resultados obtenidos en 2 experimentos
independientes realizados por cuadruplicado. (ANOVA, test post hoc Bonferroni, *p < 0,05).
Resultados
104
3.3 Acción del fragmento Hc-TeTx sobre los parámetros cinéticos del
transporte de [3H]-MPP+ a través del transportador de dopamina DAT
Como ya se indicó en párrafos anteriores, el transporte del 1-metil-4-fenilpiridinio
(MPP+) hacia el interior de las neuronas dopaminérgicas depende de la actividad del
transportador de dopamina (DAT). El objetivo de este experimento fue el de determinar
los parámetros cinéticos Vmax y KM del transporte de MPP+ a través del transportador
DAT así como averiguar si el pretratamiento con el fragmento Hc-TeTx modificaba
dichos parámetros.
Figura 11. Curvas de saturación específica de la captación de [
3H]-MPP
+ en
sinaptosomas de núcleo estriado de rata. Efecto del Hc-TeTx. Los sinaptosomas fueron
pretratados con vehículo o bien con el fragmento recombinante Hc-TeTx (concentración final
100 nM) durante 15 minutos a 37°C y subsecuentemente incubados con concentraciones
crecientes de [3H]-MPP+ (0-1500 nM) durante 2 minutos. Para determinar la actividad
Inespecífica se incubaron grupos idénticos a los anteriores a una temperatura de 0-4°C. Se ha
representado la actividad específica obtenida para cada condición, siendo esta la media ±
S.E.M. de los valores de tres experimentos realizados por triplicado. Las curvas de saturación
del grupo Control y del grupo Hc-TeTx 100 nM no muestran diferencias estadísticamente
significativas (t-test, p > 0,05).
Se trabajó con dos grupos experimentales: Control y Hc-TeTx. Este último grupo se
preincubó durante 15 minutos con fragmento Hc-TeTx a una concentración final de
100 nM y subsecuentemente con [3H]-MPP+ en un rango de concentración entre 0-
1500 nM durante 2 minutos. Para cada grupo experimental se analizaron dos
condiciones: a 37°C y a 0-4°C, a fin de obtener como en los casos anteriores, la
actividad Total y la actividad Inespecífica, respectivamente.
Resultados
105
Mediante el programa informático GraphPad Prism 5.0 se obtuvieron las curvas de
saturación, representadas en la figura 11, así como los valores experimentales
aparentes de los parámetros cinéticos Vmax y KM, recogidos en la Tabla 2. El análisis
estadístico t-test demuestra que no hay diferencias estadísticamente significativas
entre los parámetros cinéticos hallados para el grupo Hc-TeTx 100 nM comparándolos
con los del grupo Control.
Estos resultados indican que el pretratamiento de la fracción sinaptosomal P2 de
núcleo estriado de rata con el fragmento Hc-TeTx de la toxina tetánica, no modifica la
actividad del transportador de dopamina DAT, de modo que la neurotoxina MPP+ es
captada por el transportador de dopamina de la misma manera, en ausencia y en
presencia de Hc-TeTx.
Tabla 2. Parámetros cinéticos del transporte específico de [3H]-MPP
+ en sinaptosomas de
núcleo estriado de rata
Los valores aparentes de Vmax y KM se determinaron mediante análisis de regresión no lineal a
partir de las curvas de saturación mostradas en la figura 8. Se han representado las medias ±
S.E.M. de los resultados. Los parámetros cinéticos obtenidos para el grupo tratado con el
fragmento Hc-TeTx 100 nM no difieren significativamente de los parámetros cinéticos del grupo
control (t-test p > 0,05).
4. Análisis del efecto de MPP+ y Hc-TeTx sobre la substantia nigra y el
núcleo estriado, 5 días post-lesión
La bibliografía publicada describe, por lo general, que de manera posterior a la
inyección intraestriatal de MPP+, se produce un daño retrógrado irreversible en los
cuerpos neuronales dopaminérgicos de la SNpc. Las mismas fuentes muestran un
descenso en la inmunoreactividad de la TH en el núcleo estriado lesionado, no así en
el intacto.
Vmax
(fmol/mg prot * min)
KM
(µM)
Control 38097 4840 0.95 0.27
Hc-TeTx 100 nM 33874 3821 1.11 0.26 n.s
Resultados
106
4.1 Determinación de la ausencia de degeneración, a causa del MPP+, de los
cuerpos neuronales dopaminérgicos de la SNpc
En el primer análisis realizado se quiso verificar si la inyección intraestriatal de 10 µg
de MPP+ causaba una degeneración retrógrada de las neuronas dopaminérgicas de la
SNpc. También se analizaron los animales inyectados con vehículo, Hc-TeTx y
Hc/MPP+ [para esquema de tratamientos, ver figura 6].
Para ello, se utilizó una técnica histoquímica basada en el marcaje fluorescente de
procesos y cuerpos neuronales en degeneración con el fluorocromo Fluoro-Jade B.
Debido a que en la SNpc coexisten neuronas dopaminérgicas, la mayor parte, con
neuronas gabaérgicas, las restantes, se realizó una doble tinción con Fluoro-Jade B y
tirosina hidroxilasa.
Cortes coronales de 20 µm de la zona del encéfalo que incluye la SNpc (coordenadas:
entre -4.40 mm y -6.30 mm respecto al punto de referencia Bregma) fueron incubados
en flotación con el anticuerpo antitirosina hidroxilasa. Después de haber montado las
secciones en un portaobjetos y haberlas dejado secar, se llevó a cabo el protocolo de
tinción con Fluoro-Jade B [mirar apartado Materiales y Métodos].
Una vez finalizado el proceso de marcaje, el tejido fue examinado utilizando un
microscopio de fluorescencia con filtro G2-A, para ver las neuronas TH positivas (rojo)
y filtro FITC, para ver las neuronas Fluoro-Jade B positivas (verde).
En la figura 12A se muestran microfotografías representativas de los resultados
obtenidos en este experimento. Ninguno de los grupos sobre los que se realizó el
análisis (Control, Hc-TeTx, MPP+, Hc/MPP+) resultó presentar neuronas
dopaminérgicas positivas para la neurodegeneración revelada mediante el marcador
aniónico Fluoro-Jade B.
Se realizaron diversos controles positivos de los reactivos, de entre los cuales se ha
seleccionado el que se muestra en la figura 12B, que corresponde a una sección
transversal de cerebro de ratón tratado con radiación ionizante. Esta sección contiene
una zona altamente dopaminérgica, el área tegmental ventral (VTA), a fin de
demostrar que tanto los productos como las técnicas fueron adecuadas en el proceso
de detección histoquímica, lográndose revelar tanto neuronas TH positivas (rojo) como
neuronas en proceso de degeneración (verde).
Resultados
107
Figura 12. Doble marcaje de la substantia nigra con TH y Fluoro-Jade B. En secciones de
20 µm de grosor correspondientes a la zona de la SNpc se realizó un doble marcaje con el
marcador específico de neuronas en proceso de degeneración, Fluoro-Jade B (FJB-verde), y el
enzima limitante en la síntesis de dopamina, tirosina hidroxilasa (TH-rojo) para detectar las
neuronas dopaminérgicas. A) En las imágenes correspondientes a la superposición de los dos
marcajes (MERGE-amarillo) no vemos neurona alguna. En ninguno de los grupos analizados
se observa, bajo estas condiciones de estudio, marcaje positivo para la degeneración celular.
Se muestra únicamente el hemisferio ipsilateral a la lesión. Fotomicrografías sacadas con un
objetivo de 10x aumentos. Barra = 50 µm. B) Control positivo en el que se muestran neuronas
dopaminérgicas en proceso de degeneración, positivas para TH y para FJB. Nótese el color
amarillo resultante de la superposición de los marcajes (merge). Microfotografías realizadas a
con un objetivo de 40x aumentos. Barra = 25 µm.
Resultados
108
Posteriormente, se quiso ratificar el resultado obtenido realizando un recuento de los
cuerpos celulares de neuronas TH positivas presentes en una serie completa de
secciones de SNpc (10-12 cortes), con ayuda de un microscopio óptico. En este caso
la inmunoreactividad se visualizó después de la incubación (5-9 minutos) con DAB
(3,3-diaminobenzidina tetraclorhidrato/H2O2) en lugar de con fluorescencia.
El resultado obtenido se recoge en la figura 13, en la que se muestran
microfotografías representativas de los distintos grupos y tratamientos realizadas con
un objetivo de 2x (A) y 40x (B) aumentos. A bajo aumento puede apreciarse que la
densidad relativa de la sección de SNpc del hemisferio inyectado no varía
notablemente (apreciación visual) respecto a la del grupo Control. A mayor aumento,
ya realizando un recuento celular exhaustivo, se confirma que ninguno de los tres
tratamientos (Hc-TeTx, MPP+, Hc/MPP+) produce una disminución del número de
neuronas TH positivas en la SNpc como consecuencia de su aplicación, con respecto
al grupo Control, en el que tampoco se observa un descenso de marcaje si lo
comparamos con el hemisferio contralateral. En la gráfica (C) se ha representado la
media ± S.E.M del número de neuronas TH positivas totales contadas en ambos
hemisferios para cada tratamiento. El análisis estadístico aplicado, one way ANOVA,
no revela diferencias estadísticamente significativas en el número de células TH
positivas presentes en la SNpc de ninguno de los tratamientos respecto al grupo
Control.
Así pues, el doble marcaje con Fluoro-Jade B y tirosina hidroxilasa no desvela proceso
degenerativo alguno en ninguno de los animales pertenecientes a los grupos de
tratamiento analizados (Control, Hc-TeTx, MPP+, Hc/MPP+), ya que la tinción con FJB
así como las colocalizaciones de ambos marcajes resultan en todos los casos
negativas (figura 12).
Por otra parte, el recuento de neuronas TH positivas llevado a cabo en la SNpc
refuerza el resultado anterior, dado que no se detectan diferencias significativas en lo
referente al número total de neuronas dopaminérgicas, ni en el hemisferio lesionado ni
en el intacto (ANOVA, p > 0,05) (figura 13).
Resultados
109
Figura 13. Evaluación del contenido de neuronas dopaminérgicas en la SNpc. El número
de neuronas TH inmunoreactivas se determinó contando 1 de cada 6 secciones a lo largo de la
SNpc en toda su extensión. Las células TH positivas tanto del hemisferio ipsi como del
contralateral se contaron usando un objetivo de 40x. A) Microfotografías representativas del
área que incluye la SNpc y la VTA de animales inyectados (2x). Barra = 200 µm. B) Detalle de
los cuerpos TH positivos en la SNpc a una 40x aumentos. Barra = 20 µm. C) La cuantificación
del número de neuronas TH positivas en la SNpc de animales tratados y animales Control no
muestra diferencias significativas entre ninguno de los grupos analizados (ANOVA, p > 0,05).
Los resultados están expresados como la media ± S.E.M obtenida en 3 experimentos
independientes (cada grupo n = 5).
4.2 Efecto del pretratamiento con Hc-TeTx (IP) sobre la disminución de fibras
TH positivas en el núcleo estriado producida por MPP+
Como ya se expuso anteriormente, la aplicación de 10 µg de MPP+ en el núcleo
estriado de rata provoca una pérdida de inmunoreactividad del enzima tirosina
hidroxilasa de aproximadamente un 40%. En este experimento se quiso estudiar el
efecto producido por la inyección intraperitoneal del fragmento Hc-TeTx (0,5 mg/Kg) 7
y 4 días previos a la intervención estereotáxica.
Entre 10-12 secciones de 30 µm de grosor se procesaron en flotación, se incubaron
con el anticuerpo anti-tirosina hidroxilasa y se revelaron con DAB [mirar apartado
Material y métodos]. La cuantificación de la inmunoreactividad se llevó a cabo con el
Resultados
110
software Image J siguiendo el método descrito anteriormente por Zhu y colaboradores
(Zhu et al., 2004). El núcleo estriado fue delimitado como sigue: el borde exterior del
estriado fue definido por el ventrículo lateral medialmente, por el cuerpo calloso dorsal
y lateralmente y por una línea trazada entre la comisura anterior y el cuerpo calloso
ventralmente. La densidad óptica ha sido expresada en unidades de porcentaje
respecto al grupo Control.
En la figura 14A se muestran imágenes representativas de los resultados obtenidos
en 5 experimentos independientes (cada grupo n = 3). En la figura 14B, se han
representado los valores obtenidos en el análisis de densidad óptica llevado a cabo
para los dos hemisferios, lesionado e intacto. El análisis estadístico indica que existen
diferencias significativas entre la inmunoreactividad de TH en el grupo MPP+ del lado
ipsilateral a la lesión comparado con la del grupo Control (*p < 0,05). En el mismo
análisis no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre la
inmunoreactividad presentada por ninguno de los otros grupos analizados y el grupo
Control, ni en el hemisferio lesionado ni en el intacto.
En resumen, la aplicación intraestriatal de 10 µg de MPP+ provoca un descenso de
aproximadamente un 40% en la inmunoreactividad de la TH en el núcleo estriado
ipsilateral a la lesión. La aplicación intraperitoneal de Hc-TeTx, 7 y 4 días previos a la
aplicación intraestriatal de 10 µg de MPP+, es capaz de prevenir la reducción de
inmunoreactividad del enzima tirosina hidroxilasa en el núcleo estriado del hemisferio
ipsilateral a la lesión. Por otra parte, la aplicación de Hc-TeTx intraperitoneal per se no
parece ejercer ningún efecto sobre la cantidad de TH presente en esta región.
Resultados
111
Figura 14. Cuantificación de la inervación dopaminérgica en el núcleo estriado 5 días
post-lesión. Efecto del fragmento Hc-TeTx. Secciones coronales de cerebro de 30 µm de
grosor fueron marcadas con TH. A) Imágenes representativas del Control, Hc-TeTx (0,5
mg/Kg), MPP+ (10 µg) y Hc/MPP+. El lado ipsilateral fue ligeramente seccionado en el extremo
inferior del corte a fin de facilitar su identificación (línea discontinua en la imagen del Control).
Un ejemplo de área cuya densidad óptica fue analizada, se muestra como un punteado en el
lado contralateral de la imagen del grupo Control. B) La inyección de MPP+ causa un
significativo y remarcable descenso de TH en el lado ipsilateral del cerebro. El pretratamiento
con Hc-TeTx restaura en gran medida los niveles de TH en el núcleo estriado. Los resultados
han sido expresados como la media ± S.E.M obtenidos en 5 experimentos independientes (n =
3). Los datos fueron analizados usando el test estadístico one way ANOVA y test post hoc
Bonferroni multiple comparison (*p < 0,05).
Resultados
112
4.3 Análisis de la expresión de mRNA de TH en la SNpc. Hibridación in situ
Teniendo en cuenta los resultados anteriores, se quiso averiguar si tanto el descenso
de la inmunoreactividad de la TH observado en el núcleo estriado de los animales
inyectados con MPP+ (IC), como su restitución en los animales del grupo Hc/MPP+,
pretratados con Hc-TeTx (IP), eran resultado de una regulación en la transcripción del
gen de la tirosina hidroxilasa.
Para ello, realizamos un estudio de hibridación in situ. Una de cada seis secciones
coronales de cerebro de 20 µm de grosor correspondientes a la zona en la cual se
extiende la SNpc fue sometida a la hibridación con sonda radioactiva para detectar el
mRNA del enzima TH. Las secciones fueron expuestas en la oscuridad a temperatura
ambiente en un film de autoradiografía durante 8-24 hs. El análisis de las imágenes
obtenidas se llevó a cabo con el software Image J.
Figura 15. Hibridación in situ de TH en la SNpc 5 días post-lesión. A) Imágenes obtenidas
mediante la técnica de hibridación in situ del mRNA del enzima TH en la SNpc a los 5 días de
la lesión intraestriatal. Secciones de 20 µm de grosor correspondientes a la zona de la SNpc
fueron hibridadas con la sonda radioactiva 35S-TH y detectadas por autoradiografía. B) En la
gráfica se han representado los valores de la media ± S.E.M obtenidos en 3 experimentos
realizados de manera independiente (n = 3) expresados en porcentaje respecto al grupo
Control. No se observan diferencias estadísticamente significativas en la expresión de mRNA
de TH de la SNpc en ninguno de los animales de ninguno de los tratamientos realizados, ni en
el hemisferio lesionado ni en el intacto (ANOVA, p > 0,05).
Resultados
113
En la figura 15A se muestran imágenes representativas de secciones coronales de la
SNpc de cada grupo realizadas 5 días después de la intervención estereotáxica,
obtenidas mediante esta técnica. Con una sonda radioactiva de 35S-cDNA de TH se
llevó a cabo la hibridación in situ del mRNA de TH presente en la SNpc de todos los
animales tratados (Control, Hc-TeTx, MPP+, Hc/MPP+). La gráfica (figura 15B)
muestra el porcentaje de mRNA de TH de la SNpc de los animales tratados con
respecto a los del grupo Control. El análisis estadístico realizado demuestra que no
existen diferencias significativas en la expresión del gen th en la SNpc de los animales
tratados respecto al grupo Control en ninguno de los dos hemisferios a los 5 días de la
lesión.
En síntesis, la aplicación intracraneal de una baja dosis de MPP+ en el núcleo estriado
no provoca una modificación de la expresión del gen que codifica para la tirosina
hidroxilasa detectable en la SNpc a los 5 días de la intervención, ni en el núcleo
correspondiente al hemisferio lesionado ni en el contralateral. Asimismo, la inyección
intraperitoneal del fragmento Hc-TeTx tampoco parece ejercer ningún efecto sobre la
regulación de la transcripción de este gen en la SNpc de ninguno de los dos
hemisferios.
4.4 Estudio de la integridad del núcleo estriado mediante la determinación de
marcadores dopaminérgicos (TH, DAT, VMAT-2)
La aparente ausencia de relación entre la disminución de proteína TH presente en el
núcleo estriado lesionado con MPP+ y los niveles de mRNA del enzima detectados en
la SNpc correspondiente al hemisferio inyectado, nos indujo a pensar que se estaba
produciendo un daño específico localizado sobre la terminal sináptica dopaminérgica
situada en el núcleo estriado.
Con la intención de comprobar el estado de la integridad del núcleo estriado se llevó a
cabo el estudio de diferentes marcadores típicos de neuronas dopaminérgicas como
son el DAT, la TH y el VMAT-2.
En este caso, el análisis fue realizado mediante la técnica de Western Blot. Para ello,
se trataron los animales según el esquema de la figura 6 y a los 5 días de la
intervención estereotáxica, ambos núcleos estriados fueron extraídos y
homogeneizados por separado. La misma cantidad de proteína fue cargada en un gel
SDS-PAGE y transferida a una membrana de nitrocelulosa, que fue posteriormente
Resultados
114
incubada con anticuerpos anti-DAT, anti-TH y anti- VAMT-2. Se utilizó anti-ß-actina
como control de carga de las muestras.
El la figura 16 se muestran membranas representativas de los resultados obtenidos
mediante esta técnica.
El transportador de dopamina DAT (A), que se detecta como una sola banda de unos
80 KDa, experimenta un descenso de aproximadamente un 40-50% (*p < 0,05) en el
caso de los animales inyectados intracranealmente con 10 µg de la neurotoxina MPP+.
En los animales pretratados intraperitonealmente con Hc-TeTx, este descenso se ve
parcialmente recuperado, un 85-90%, con respecto a los animales Control.
La TH (B) se detecta como una única banda específica correspondiente a un peso
molecular de 60 KDa. Al igual que en los resultados obtenidos mediante
inmunohistoquímica, sufre un descenso de alrededor de un 50% (***p < 0,001) en el
núcleo estriado del hemisferio lesionado. El pretratamiento con Hc-TeTx, aunque no
logra recuperar completamente los niveles de TH estriatales, eleva hasta el 75% la
concentración de la proteína respecto al Control.
Por último, el transportador vesicular de monoaminas-2 VMAT-2 (C), se detecta con el
anticuerpo primario específico (AB1598P; Chemicon), en forma de tres bandas de 75,
55 y 45 KDa, aproximadamente. Las bandas de 75 y 55 KDa corresponderían a
formas alta y medianamente glicosiladas de VMAT-2, situándose la proteína sin
modificaciones a una altura de 45 KDa (Cruz-Muros et al., 2007). En este caso, se
analizaron las tres bandas en conjunto obteniéndose una reducción de alrededor de un
40-50% después de la aplicación intraestriatal de MPP+. El pretratamiento con Hc-
TeTx, como en los casos anteriores, recupera parcialmente los niveles originales de
transportador, situándolos en un 80-90% con respecto al grupo Control.
En síntesis, el análisis mediante WB revela, por una parte, que la aplicación
intraestriatal de 10 µg de MPP+ produce una reducción significativa (40-50%) en los
niveles de DAT, TH y VMAT-2 en el núcleo estriado del lado ipsilateral a la lesión y por
otra, que cuando se ha pretratado los animales con Hc-TeTx (IP) dichos niveles
experimentan un menor descenso. Además, la administración de Hc-TeTx per se no
produce cambios en la expresión de estos marcadores dopaminérgicos. Por último, en
ninguno de los casos analizados se observaron cambios remarcables en los niveles de
las proteínas del núcleo estriado correspondiente al hemisferio intacto (p > 0,05) (D, E,
F).
Resultados
115
Figura 16. Análisis por Western Blot de marcadores de la terminal dopaminérgica
(transportador de dopamina, DAT; Tirosina hidroxilasa, TH; transportador vesicular de
monoaminas 2, VMAT-2) en ambos núcleos estriados ipsi y contralateral 5 días después de la
inyección intraestriatal. Extractos totales de proteína de ambos hemisferios cerebrales fueron
analizados. No se detectaron diferencias significativas en el lado contralateral (D, E, F),
mientras que en el hemisferio ipsilateral la inyección de MPP+ (10 µg) provoca un descenso
general de la presencia de marcadores de la terminal dopaminérgica DAT (A), TH (B), VMAT-2
(C) como muestra la figura, de aproximadamente un 50%. El pretratamiento con Hc-TeTx
preserva notablemente el contenido de marcadores dopaminérgicos. Se muestra un blot
representativo de cada caso en la parte superior y una cuantificación de la DO de la señal en la
parte inferior. Los resultados se han expresado como los valores de la media ± S.E.M de 4
experimentos independientes (n = 3). Se utilizó el análisis estadístico ANOVA y test post hoc
Bonferroni (vs Control *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,0001; MPP+ vs Hc/MPP+: #p <0,05, ##p <
0,01).
Resultados
116
Así pues, como resumen de los resultados expuestos en este apartado podemos decir
que:
a. La aplicación intraestriatal unilateral de 10 µg de la neurotoxina MPP+, según el
doble marcaje realizado con Fluoro-Jade B y anticuerpo anti-tirosina
hidroxilasa, no produce ni degeneración ni muerte de neuronas dopaminérgicas
de la SNpc detectable a los 5 días de la lesión estereotáxica, ni en el
hemisferio tratado ni en el intacto. El recuento exhaustivo de neuronas
dopaminérgicas llevado a cabo en la SNpc, muestra que no hay diferencias
entre el número de células TH positivas presentes en la SNpc de los animales
tratados con MPP+ con respecto a los animales del grupo Control, así como
tampoco hay variaciones con respecto al lado contralateral a la lesión.
b. El análisis inmunohistoquímico del núcleo estriado realizado 5 días post-lesión
revela que la administración intraestriatal de MPP+ causa una reducción de la
inmunoreactividad del enzima tirosina hidroxilasa de aproximadamente un
40%, y que el pretratamiento con el fragmento recombinante Hc-TeTx, 7 y 4
días previos a la intervención estereotáxica, revierte parcialmente esa
reducción de TH en el núcleo estriado del hemisferio ipsilateral a la lesión.
c. La reducción de inmunoreactividad de TH en el núcleo estriado ipsilateral a la
lesión observada a los 5 días de la lesión, no es debida a la regulación
negativa en la expresión de mRNA del enzima TH en la SNpc, ya que la
técnica de hibridación in situ con sonda radioactiva para el mRNA de TH, no
revela diferencias significativas entre los niveles de mRNA de TH de los
animales tratados con MPP+ con respecto a los animales del grupo Control.
d. Por último, el análisis por WB de la integridad del núcleo estriado indica que
existe una reducción significativa de los niveles de TH así como de otros
marcadores de terminales dopaminérgicas como el DAT o el VMAT-2 a los 5
días de la lesión intraestriatal con MPP+. Del mismo modo, la administración
previa de Hc-TeTx (IP), reduce el efecto tóxico de la neurotoxina
produciéndose un menor descenso de dichos marcadores.
En síntesis, la inyección estereotáxica de MPP+ en el núcleo estriado provoca una
merma en la presencia de enzima TH y de transportadores, DAT y VMAT-2, en las
terminales dopaminérgicas localizadas en esta región, pero no conduce a un daño
retrógrado sobre los cuerpos celulares dopaminérgicos situados en la SNpc. Por otra
parte, el decremento de inmunoreactividad de TH en el núcleo estriado no guarda
relación con una disminución en los niveles de mRNA del enzima, ya que no se
observa una down-regulación de la expresión de este gen en la SNpc.
Resultados
117
5. Determinación del estado de fosforilación de la TH
El enzima tirosina hidroxilasa regula el paso limitante en la síntesis de catecolaminas
(dopamina, noradrenalina y adrenalina) y cataliza la hidroxilación de la L-tirosina a L-
DOPA. La molécula de TH consta de una región N-Terminal reguladora, un dominio
catalítico y un dominio C-Terminal de asociación, a través del cual se tetrameriza. La
activación de la TH por fosforilación es el primer mecanismo responsable del
mantenimiento de los niveles de catecolaminas en el tejido después de la secreción de
las mismas. En este sentido, se ha descrito que diversas proteínas quinasas y
fosfatasas regulan la actividad de la TH mediante la fosforilación o defosforilación de
residuos Serina presentes en el dominio regulatorio de la proteína en rata: Ser8,
Ser19, Ser31, Ser40 (Haycock, 1990), si bien sólo los tres últimos son regulados in
vivo (Haycock y Haycock, 1991). Aunque son muchas las quinasas implicadas en el
proceso de fosforilación de estos residuos in vitro, la lista se reduce en el análisis in
vivo, siendo los protagonistas la proteina quinasa A (PKA) para fosforilar el residuo
Ser40, ERK 1/2 para el residuo Ser31 y la CAMPKII (Calcium and calmodulin-
stimulated protein kinase) para el residuo Ser19 (Bevilaqua et al., 2001). Asimismo, las
fosfatasas PP2A y PP1C regulan la defosforilación de los mismos in vivo, a excepción
del residuo Ser31, en el que no se ha podido demostrar. De hecho, la fosforilación del
residuo Ser31 tampoco se incrementó en respuesta al tratamiento con ácido okadaico
(inhibidor de fosfatasas de proteínas) llevado a cabo en sinaptosomas estriatales de
rata (Lindgren et al., 2001).
Experimentos in vivo demuestran la relación directa entre la fosforilación del residuo
Ser40 y el incremento de actividad del enzima tirosina hidroxilasa (Lew et al., 1999).
En cuanto a la fosforilación del residuo Ser31, hasta el momento no existen suficientes
evidencias ni a favor ni en contra para determinar una correspondencia entre
fosforilación y aumento de la actividad del enzima TH. En los casos de los residuos
Ser19 y Ser8, no se ha podido demostrar este fenómeno. Aunque se conoce la
existencia de una fosforilación jerárquica entre la Ser19 y la Ser40, en la que la
fosforilación del primer residuo provoca un cambio conformacional en la molécula que
permite la fosforilación del segundo, la fosforilación del residuo Ser19 per se, no
produce un aumento de actividad del enzima (Bevilaqua et al., 2001).
En este apartado quisimos estudiar el estado de fosforilación de los residuos Serina
del enzima TH (Ser19, Ser31, Ser40) después del tratamiento con el fragmento Hc-
TeTx, a fin de intentar establecer una relación entre el tratamiento con la molécula, el
fenómeno de fosforilación y el aumento de la actividad del enzima, para así poder
elaborar una hipótesis que explique con sentido una recuperación del 100% del
Resultados
118
contenido estriatal de DA contando el núcleo estriado únicamente con un 75% del
enzima responsable de su síntesis.
5.1 Estado de fosforilación del enzima TH en sinaptosomas provenientes de
núcleo estriado de rata
En primer lugar, realizamos una aproximación con un modelo de sinaptosomas de
núcleo estriado de rata para averiguar cuál era el estado de fosforilación del enzima
TH en condiciones normales, y tras el tratamiento de dichos sinaptosomas con una
concentración de Hc-TeTx (10 nM) durante 15 minutos a 37°C. Un coctel de
inhibidores de fosfatasas (PPI), que contiene inhibidores de fosfatasa alcalina y de las
fosfatasas PP1 y PP2A, se adicionó a un grupo de sinaptosomas para observar la
fosforilación acumulada a lo largo del tiempo (control positivo). Como se dijo
anteriormente, en el caso de la Ser31 no se ha podido demostrar que la regulación de
la defosforilación se lleve a cabo mediante las serin/treonin fosfatasas PP2A y PP1C,
de manera que el tratamiento con estos inhibidores de fosfatasas no logra aumentar la
marca de fosforilación.
En la figura 17A se muestran blots representativos de los resultados obtenidos. En
esta se puede observar que el tratamiento con 10 nM de Hc-TeTx es capaz de
aumentar en un 60% (**p < 0,01) la fosforilación del residuo Ser40 de la TH, mientras
que los niveles de fosforilación de las Ser19 y 31 no sufren modificaciones
estadísticamente significativas (p > 0,05). También se presentan blots en los que se ve
el enzima TH total así como la proteína total ß-Actina de cada grupo experimental. En
la gráfica (figura 17B) se han representado los valores obtenidos mediante
densitometría de las bandas expresados en forma de porcentaje respecto al grupo
Control correspondientes a los residuos Serina 19, 31 y 40.
En resumen, estos resultados indicaban que el tratamiento con Hc-TeTx de los
sinaptosomas de núcleo estriado de rata era capaz de incrementar la fosforilación del
residuo Serina 40 del enzima tirosina hidroxilasa en un 60% con respecto al grupo
Control. Con este antecedente se quiso indagar en el estado de la fosforilación del
enzima en un sistema in vivo, de modo que se analizaron mediante WB los núcleos
estriados de las ratas Control, Hc-TeTx, MPP+ y Hc/MPP+.
Resultados
119
Figura 17. Estado de fosforilación de la TH en sinaptosomas de núcleo estriado de rata.
A) La fosforilación del residuo Ser40 del enzima TH aumenta significativamente tras 15 minutos
de incubación con el fragmento Hc-TeTx (10 nM). La fosforilación de los residuos Ser19 y 31 no
se ve modificada significativamente por el tratamiento con Hc-TeTx. Los inhibidores de
fosfatasas (PPI) evitan la defosforilación de los residuos Ser19 y 40 fosforilados
proporcionando un control positivo. En la parte inferior se muestran la TH total y ß-Actina
correspondientes a cada condición estudiada. B) Representación gráfica de los resultados
obtenidos por western blot en los que se muestran los niveles de fosforilación de los residuos
Serina 19, 31 y 40 de la TH expresados en porcentaje con respecto al grupo Control. PPI:
inhibidores de fosfatasas. (**p < 0,01).
5.2 Estado de fosforilación del enzima TH en núcleo estriado de rata in vivo
Con el fin de estudiar el estado de fosforilación del enzima TH in vivo se examinaron
mediante western blot (figura 18A) los homogenados obtenidos a partir de los núcleos
estriados de las ratas previamente tratadas siguiendo el protocolo anteriormente
detallado [mirar apartado Materiales y Métodos (figura 6)].
Dado que se estaba trabajando en un sistema en el que se produce un decremento de
enzima TH total en algunos grupos debido a los tratamientos aplicados, se creyó
oportuno llevar a cabo un análisis de los residuos fosforilados con respecto a la
cantidad total de enzima tirosina hidroxilasa presente en los núcleos estriados, con el
objetivo de comparar la proporción de la fosforilación del enzima.
Resultados
120
Figura 18. Estado de fosforilación de la TH in vivo. A) Se muestran blots representativos de
los resultados obtenidos en 4 experimentos independientes, tras los diferentes tratamientos in
vivo, a los 5 días de la lesión estereotáxica. La fosforilación de los residuos Serina 19, 31 y 40
analizada con respecto a la cantidad de TH total en el núcleo estriado ipsilateral (B) no
presenta diferencias estadísticamente significativas con respecto al grupo Control en ninguno
de los casos estudiados, al igual que ocurre en el hemisferio contralateral a la lesión (C).
En el lado ipsilateral a la lesión (figura 18B) no encontramos diferencias
estadísticamente significativas (p < 0,05) en el estado de fosforilación, en ninguna de
las condiciones estudiadas para la fosforilación de los residuos Ser19, Ser31 o Ser40.
En los núcleos contralaterales tampoco se observan modificaciones destacables en la
fosforilación de ninguno de los residuos susceptibles de ser fosforilados, en ninguno
de los casos estudiados (p < 0,05) (figura 18C).
Resultados
121
Podemos concluir que la inyección intraperitoneal del fragmento Hc-TeTx realizada los
días 7 y 4 previos a la lesión estereotáxica no es capaz de modificar el patrón de
fosforilación de los residuos Serina 19, 31 y 40 del enzima tirosina hidroxilasa de modo
significativo cuando se lleva a cabo el análisis a los 5 días de la lesión estereotáxica.
Resultados
122
V- DISCUSIÓN
Discusión
125
V- Discusión
Después de la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson (EP) es el
segundo desorden neurodegenerativo más frecuente, y el aumento de la esperanza de
vida de la población augura en los próximos años un incremento dramático en el
número de individuos afectados. Esta enfermedad se caracteriza por una pérdida
selectiva y pronunciada de neuronas dopaminérgicas residentes en la substantia nigra
pars compacta (SNpc) y una subsecuente merma de dopamina (DA) estriatal.
Lamentablemente, ninguno de los tratamientos vigentes son capaces de detener o
ralentizar la degeneración de las neuronas dopaminérgicas de la SNpc, ya que éstos
son puramente sintomáticos.
El principal obstáculo en el desarrollo de fármacos neuroprotectores es el
desconocimiento de los eventos moleculares específicos que llevan al
desencadenamiento de la EP. Por ese motivo, la tendencia actual en las líneas de
investigación se centra en la elucidación de los mecanismos implicados en la
evolución de la enfermedad, con la finalidad de crear nuevas estrategias terapéuticas
dirigidas hacia la ralentización tanto del inicio como del progreso de la patología, como
la prevención de la muerte neuronal dopaminérgica.
A lo largo de la historia, los modelos celulares y animales de enfermedades humanas
han demostrado ser muy útiles para la investigación y, a pesar de no existir la EP en
las especies mas comúnmente usadas en investigación, los modelos por intoxicación
química que se han conseguido, reproducen con mayor o menor grado de analogía el
mal de Parkinson (Ghorayeb et al., 2002). A este respecto, el descubrimiento de la
neurotoxina dopaminérgica MPTP (1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina) posibilitó la
creación de un buen modelo experimental de EP, que hasta la fecha, continúa siendo
considerado uno de los mejores (Przedborski et al., 2004). El MPTP mimetiza en gran
medida las alteraciones bioquímicas y patológicas observadas en pacientes con la EP,
convertiéndose en una herramienta muy apropiada para el estudio de la enfermedad
(Fallon et al., 1997). Además, gracias a su mecanismo de acción, permite el análisis
exhaustivo de algunos de los posibles procesos moleculares implicados en el
desencadenamiento de la enfermedad, como son el estrés oxidativo, la disfunción
mitocondrial, la excitotoxicidad y los procesos inflamatorios (Przedborski et al., 2004).
Discusión
126
En el afán de descubrir fármacos neuroprotectores que eviten la muerte de las
neuronas dopaminérgicas, los modelos in vivo de la enfermedad de Parkinson, como
el obtenido mediante la administración de MPP+/MPTP, son generados con la
intención de provocar apoptosis o necrosis celular en los animales. Con este propósito,
se han aplicado cantidades muy elevadas de MPP+ (100-200 nmol), de manera aguda
o crónica, siendo muy acusados los efectos encontrados en las vías nigroestriatales
(Banerjee et al., 2007; Chen et al., 2002; Chuang et al., 2002; Fallon et al., 1997; Frim
et al., 1994; Ghorayeb et al., 2002; Herkenham et al., 1991). Este abordaje
experimental proporciona un escenario adecuado para la exploración de un estadio
avanzado y terminal de la EP.
Sin embargo, en la EP, el grado de pérdida de terminales dopaminérgicas del núcleo
estriado parece ser más pronunciado que la magnitud de muerte neuronal en la SNpc,
sugiriendo que las terminales dopaminérgicas del núcleo estriado son el punto de
partida del proceso degenerativo y que la muerte neuronal se produce a través de un
fenómeno conocido como “muerte retrógrada” (Dauer y Przedborski, 2003). En este
sentido, estudios neuropatológicos llevados a cabo con la neurotoxina MPTP in vivo,
evidencian que esta sustancia provoca un déficit de DA sin que se observe,
inicialmente, una pérdida de neuronas dopaminérgicas en la SNpc (Herkenham et al.,
1991), dando soporte al concepto de muerte retrógrada comentado. Por otra parte, la
aplicación de una dosis baja de MPP+ ejerce un efecto específico sobre las células
dopaminérgicas, especificidad dopaminérgica que se va perdiendo a medida que se
aumenta la dosis del tratamiento (Obata et al., 2002; Yazdani et al., 2006). Así, esta
aproximación, podría estar mimetizando un estadio inicial asintomático de la EP, lo
que permitiría indagar en los factores que influyen en el desencadenamiento y la
instauración de la enfermedad (Ricaurte et al., 1986), que arrojaría un poco de luz
sobre el oscuro panorama de la etiopatología de la enfermedad de Parkinson.
Puesto que, unos de los objetivos de esta tesis fue el generar un daño dopaminérgico
leve, que reprodujera mejor los estadios iniciales de la patología, el modelo in vivo de
la EP diseñado se basó en la administración de una dosis baja única de la neurotoxina
MPP+ (10 µg ~ 29 nmol/animal), con el objetivo de estimar la magnitud de la toxicidad
derivada de la aplicación de dicha sustancia.
Una vez administrado el MPP+ en el núcleo estriado, es internalizado específicamente
en la neurona dopaminérgica a través del transportador de dopamina, DAT, y
posteriormente, en la mitocondria inhibiendo la fosforilación oxidativa mediante la
interrupción del flujo de electrones del Complejo I de la cadena respiratoria. Este
Discusión
127
bloqueo lleva a un rápido descenso del contenido de la carga energética
(ATP+½ADP/ATP+ADP+AMP), lo que repercute en todos los procesos dependientes
de energía química, como el almacenamiento de DA en las vesículas. El enzima MAO
puede metabolizar la DA generando H2O2, que es también capaz de bloquear la
respiración mitocondrial. Paralelamente, se produce una acumulación de ión Ca2+ en la
neurona que provoca un eflujo masivo de DA. Ésta, puede ser oxidada dando lugar a
la formación de O2- , que al reaccionar con el NO forma peroxinitrito; quinonas, que
generan la neuromelanina; y H2O2, que a través de la reacción de Fenton produce
radicales OH.. Todos estos fenómenos conducen a la degeneración, en un principio de
las terminaciones sinápticas y posteriormente, de las neuronas dopaminérgicas de la
SNpc, todo ello en función de la dosis de tóxico administrada [ver Introducción].
En primer lugar, quisimos averiguar cuál es el efecto producido a lo largo del tiempo
por la administración unilateral de 10 µg de MPP+ sobre los niveles de dopamina y de
sus metabolitos, DOPAC, 3-MT y HVA. En estos ensayos, la aplicación del neurotóxico
se realizó en el núcleo estriado derecho del animal. El MPP+ es captado por la
neurona dopaminérgica a través del transportador de dopamina, DAT. Este
transportador se halla presente en la membrana plasmática de las dendritas de la
substantia nigra, así como en los axones y terminales del núcleo estriado (Hersch et
al., 1997), por lo que, tanto la inyección intranigral como intraestriatal de MPP+ en rata,
es capaz de generar toxicidad en las neuronas dopaminérgicas (Banerjee et al., 2006).
No obstante, diversos experimentos también han demostrado su alta afinidad por los
transportadores de noradrenalina, NAT, y serotonina, SERT (Przedborski et al., 2001),
aunque en menor medida (Javitch et al., 1985). Con el objeto de evitar una
intoxicación inespecífica debido a la incorporación de MPP+ a través del transportador
NAT, 15 min antes de la intervención estereotáxica (en la que se aplicó MPP+ o
solución vehículo), se administró una dosis de desipramina (25 mg/kg, IP), que es un
inhibidor específico de la captación del transportador de noradrenalina (Barc et al.,
2002).
Después de la aplicación de desipramina, las ratas macho de la cepa de Sprague-
Dawley, de 6-8 semanas y de peso aproximado entre 250-300 g, fueron sometidas a la
inyección intraestriatal de la neurotoxina y posteriormente, sacrificadas al cabo de 0, 3,
5, 7 y 9 días. En los análisis realizados mediante HPLC se observa un descenso
paulatino en la concentración de dopamina (DA), alcanzando el valor mínimo
(aproximadamente un 50%) a los 5 días de la lesión. A partir del 7º día, los valores de
Discusión
128
DA se restablecen de modo que no existen diferencias remarcables entre las ratas
tratadas con MPP+ y las ratas Control. Aunque se desconoce el motivo, esta reducción
transitoria del contenido estriatal tanto de DA como de sus metabolitos y su posterior
“recuperación espontánea”, ha sido ya reseñada por otros investigadores y se postula
que pueda ser debido a un mecanismo compensatorio llevado a cabo por las neuronas
dopaminérgicas que permanecen funcionales (Espino et al., 1995; Pierucci et al.,
2009; Ricaurte et al., 1986). A este respecto, está descrito que en la EP las neuronas
dopaminérgicas supervivientes se encuentran hiperactivadas a modo compensatorio, y
esta compensación retrasa las anormalidades motoras hasta que la pérdida de
neuronas dopaminérgicas representa alrededor de un 80% del total (Cohen, 2000). De
este modo, podríamos estar contemplando, no una recuperación del sistema debido al
fenómeno de sprouting o a la detoxificación de las neuronas del MPP+, motivos por los
que podría argüirse que no es un modelo válido, sino un proceso fisiológico de
compensación de los niveles de DA, tal como se observa en el caso de la EP. Quizás
sería adecuado realizar un estudio del efecto de la neurotoxina a más largo plazo para
así poder comprobar si se mantienen los niveles elevados de DA o si por el contrario,
disminuyen, produciéndose esta reducción acompañada por la degeneración de las
neuronas dopaminérgicas situadas en la SNpc.
Asimismo, los metabolitos de la dopamina, derivados de la acción de los enzimas
MAO y COMT en el interior y exterior celular, respectivamente, DOPAC, 3-MT y HVA,
siguen un patrón de expresión similar al de su precursor. El contenido estriatal de NA
no sufre variaciones a lo largo de los días debido al tratamiento con MPP+, ni en el
núcleo ipsilateral ni en el núcleo contralateral (ver figura 2) que pudiera indicar, como
era de esperar, que la administración de desipramina limita la entrada de MPP+ a
través del transportador noradrenérgico (Przedborski et al., 2001). Existen estudios en
concordancia con estos resultados, que revelan que la aplicación de una dosis baja de
MPP+ tampoco modifican las concentraciones de serotonina, GABA o glutamato
encontrada en el núcleo estriado (Yazdani et al., 2006). En cuanto al núcleo estriado
contralateral, en ningún caso se observaron diferencias significativas a lo largo del
tiempo en los contenidos de DA o sus metabolitos. Este hecho es una constante
encontrada en toda la bibliografía consultada para la realización de este trabajo
doctoral, en la que se reportan aplicaciones de MPP+ intranigral o intraestriatal, de
modo agudo o crónico, e incluso intraventricular crónico en rata, no sólo con respecto
a los niveles de catecolaminas sino a todos los aspectos estudiados, ya sea mediante
histoquímica o bioquímica, e incluso detectable a nivel de comportamiento. La
unilateralidad del efecto provocado por el tratamiento de la rata con MPP+ se
Discusión
129
encuentra, pues, bien establecida, tanto en la bibliografía como en nuestros
resultados.
Así, los resultados obtenidos en este apartado nos llevaron a tomar la decisión de
sacrificar metódicamente los animales al 5° día de la intervención estereotáxica.
Dado que la concentración estriatal de dopamina había experimentado una reducción
significativa a los 5 días de la aplicación de la neurotoxina MPP+ (IC) y que el enzima
tirosina hidroxilasa es el enzima limitante en la síntesis del neurotransmisor (Nagatsu
et al., 1964), quisimos comprobar si su descenso estaba relacionado con una
disminución del enzima total presente en el núcleo estriado. Por otra parte, quisimos
descartar la existencia de un posible efecto inespecífico causado por la inyección de
MPP+ sobre otros tipos neuronales presentes en el núcleo estriado, como las
interneuronas colinérgicas o las aferencias glutamatérgicas, provenientes
principalmente del córtex cerebral y el hipotálamo (David et al., 2005). El motivo de
ello, radica en que diversos estudios demuestran que el daño producido por la
aplicación de MPP+ en el núcleo estriado no se limita únicamente a células
dopaminérgicas (Banerjee et al., 2006; Ghorayeb et al., 2002).
Los resultados obtenidos a través de un estudio inmunohistoquímico de los tejidos,
muestran un descenso en la inmunoreactividad del enzima tirosina hidroxilasa, TH, de
aproximadamente un 40% con respecto al grupo Control, concordando este dato con
la disminución observada en la producción de DA. Por el contrario, la
inmunoreactividad del transportador vesicular de glutamato, VGlut1, así como el
número de células positivas para la colina-acetiltransferasa, ChAT, no sufren
variaciones notables, de modo que se podría pensar que el tratamiento con MPP+ a
dosis bajas es selectivo para las células dopaminérgicas, hecho que ya se había
reportado (Yazdani et al., 2006). Nuevamente, en los núcleos contralaterales no
encontramos variaciones remarcables.
Así, estos resultados demuestran que la entrada de MPP+ en las terminaciones
dopaminérgicas se lleva a cabo de manera específica, produciéndose una
degeneración significativa de las fibras estriatales, circunstancia apropiada tratándose
de un modelo de la enfermedad de Parkinson. En contraposición, las terminales
glutamatérgicas, así como el número de interneuronas colinérgicas, no experimentan
cambios, lo cual es esperable dado que en principio el MPP+ sólo es incorporado de
Discusión
130
manera específica a través del transportador de dopamina DAT, del cual carecen
estos tipos celulares.
En el caso de la investigación efectuada por nuestro Grupo, hubiera resultado
interesante llevar a cabo un estudio detallado de la inmunoreactividad de las neuronas
gabaérgicas, ya que representan un 90% de las neuronas residentes en el núcleo
estriado y sus proyecciones regulan las vías directa e indirecta de los ganglios
basales, modulando en gran parte el proceso de movimiento.
Habiendo estudiado el efecto neuroquímico (DA y metabolitos) producido por el
tratamiento con MPP+ a lo largo del tiempo y habiendo llegado a la conclusión
(mediante técnicas inmunohistoquímicas) de que este se limitaba, aparentemente, a
una acción específica sobre las neuronas dopaminérgicas, decidimos abordar el
segundo objetivo de esta tesis, que fue el de explorar la repercusión de la aplicación
del fragmento recombinante, no tóxico, carboxilo-terminal de la cadena pesada de la
toxina tetánica, Hc-TeTx, sobre el modelo animal descrito. El fragmento Hc-TeTx, in
vitro, actúa como un potente neuroprotector previniendo la muerte de las neuronas
granulares mediante apoptosis provocada por la deprivación de potasio (Chaïb-
Oukadour et al., 2004) así como por la neurotoxina mitocondrial MPP+ (Chaïb-
Oukadour et al., 2009). Del mismo modo, es capaz de activar los receptores de las
neurotrofinas y a través de ellos, las cascadas de señalización en las que las PKC
(protein Kinase C), las ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinase 1/2) y la AKT
(protein kinase B), están relacionadas con la supervivencia de las neuronas corticales
(Gil et al., 1999, 2001, 2003).
Diversas investigaciones han revelado que el fragmento Hc-TeTx aislado conserva la
capacidad de viajar retroaxonalmente in vivo a la vez que es atóxico, de modo que no
ocasiona los síntomas clínicos de la enfermedad del tétanos (Bizzini et al., 1977;
Fishman y Carrigan, 1987). Estas cualidades sumadas a las habilidades descritas
anteriormente, son las razones de que cada vez con más frecuencia, el fragmento Hc-
TeTx, en su forma proteica o de DNA desnudo (o plásmido portador del gen
bacteriano), estén siendo utilizados como herramienta terapéutica, ya sea utilizado en
solitario (Mendieta et al, 2009; Moreno-Igoa et al., 2010) o a modo de transportador de
proteínas exógenas hacia el SNC (Coen et al., 1997; Figueiredo et al., 1997; Miana-
Mena et al., 2004; Ciriza et al., 2008; Toivonen et al., 2010).
Discusión
131
En primer lugar, se aplicó el fragmento Hc-TeTx (125 ng) como cotratamiento,
administrándolo de manera intraestriatal conjuntamente con la neurotoxina MPP+
(10 µg). De acuerdo con el protocolo que nosotros mismos habíamos establecido en el
apartado anterior, sacrificamos los animales al 5° día de la intervención estereotáxica.
El resultado fue: en las ratas inyectadas sólo con MPP+, una disminución tanto de la
dopamina como de sus metabolitos en el núcleo estriado ipsilateral a la lesión, y en las
ratas cotratadas con Hc-TeTx, una restauración completa de dichos valores. La
inyección de Hc-TeTx en solitario no produjo variaciones en el contenido estriatal de
DA ni de sus metabolitos, lo cual está en consonancia con el resultado obtenido por
Aguilera y colaboradores al inyectar estereotáxicamente la toxina tetánica completa
(Aguilera et al., 1991). En los núcleos contralaterales estudiados no se observaron
cambios significativos en ningún caso.
Estos resultados se recogieron como parte de una investigación mayor, en la que se
realizó, además, un estudio del comportamiento de los animales después de los
diversos tratamientos, observándose adicionalmente una mejoría del sistema motor de
las ratas (Mendieta et al., 2009).
Partiendo de estos datos tan positivos sobre neuroprotección, pero siendo conscientes
de que la vía de administración (intraestriatal) es poco práctica en caso de querer
recurrir al uso del Hc-TeTx como agente terapéutico, nos dispusimos a comprobar si
una administración intraperitoneal de la molécula lograba ejercer el mismo efecto
neuroprotector en SNC.
En este sentido, existen evidencias de que la toxina tetánica nativa alcanza el SNC,
puesto que entre los síntomas comunes del tétanos clásico, se encuentra una
alteración típica del sueño debido a un incremento significativo de los niveles de
serotonina en el SNC. Este aumento de serotonina es debido a la inhibición
generalizada de la secreción neuronal producido por la actividad proteásica del
fragmento L de la TeTx (Zacks et al., 1965; Aguilera y Gonzalez-Sastre, 1988).
Aunque, como se ha comentado, el Hc-TeTx viaja con la misma eficacia que la TeTx
nativa, quisimos demostrarlo en nuestro sistema. Lamentablemente, nuestros
esfuerzos utilizando la proteína de fusión Hc-TeTx-GFP con la intención de comprobar
la presencia de este fragmento en el núcleo estriado o en algún área cerebral cercana,
o cuanto menos relacionada con el sistema dopaminérgico, resultaron infructuosos. La
falta de visualización podría deberse, bien a que la proteína de fusión utilizada Hc-
Discusión
132
TeTx-GFP sufre alguna modificación estructural tal como la escisión de algún dominio
proteico, en el interior del cuerpo del animal o durante el procesamiento del tejido, que
le impida emitir fluorescencia o ser reconocido por un anticuerpo secundario anti-GFP,
o bien a que la cantidad que accede a la zona explorada es tan pequeña que no
resulta evidenciable a pesar de la utilización de anticuerpos específicos.
Al inyectar el Hc-TeTx intracranealmente, teníamos la certeza de que dicha molécula
estaba presente en el núcleo estriado en el momento en que aplicamos el agente
tóxico MPP+, ya que de hecho, la estamos co-administrando. Sin embargo, al inyectar
el fragmento Hc-TeTx intraperitonealmente se produce indefectiblemente un retraso de
la llegada de la molécula al lugar de acción, que puede variar entre horas y días
dependiendo de cuál sea el punto de ingreso en el sistema nervioso y la distancia
axonal que tenga que recorrer (Perreault et al., 2006). Por este motivo, decidimos
administrar el fragmento Hc-TeTx (0,5 mg/kg, ~ 125 µg) 7 y 4 días antes de aplicar
intraestriatalmente el MPP+.
El análisis del contenido estriatal de DA y sus metabolitos al quinto día de la
intervención estereotáxica, dio como resultado un descenso de los niveles de DA así
como de DOPAC, 3-MT y HVA en las ratas tratadas con MPP+, y una recuperación
total de los mismos en las ratas pretratadas con Hc-TeTx periféricamente. De nuevo,
el tratamiento en solitario con Hc-TeTx no originó variaciones significativas, siendo los
valores obtenidos equivalentes a los del grupo Control, al igual que los hallados para
los núcleos estriados del hemisferio intacto.
La constatación de que el efecto neuroquímico producido por la administración
intraperitoneal del fragmento Hc-TeTx es exactamente el mismo que el observado tras
la aplicación intraestriatal, nos llevó a seguir la investigación objeto de esta tesis,
utilizando la vía periférica de administración, debido a los motivos que se expusieron
anteriormente.
Llegados a este punto, y habiendo visto que la aplicación del fragmento Hc-TeTx, ya
sea de modo intraestriatal o intraperitoneal, es capaz de restaurar los niveles de
dopamina y sus metabolitos en ratas lesionadas con MPP+, y conociendo que el
fragmento Hc-TeTx inhibe la captación de serotonina a través del transportador SERT,
debido a su fosforilación mediante el enzima PKC (Najib et al., 1999), y siendo además
patente la similitud tanto estructural como funcional de este transportador y el de
dopamina DAT, decidimos asegurarnos del correcto funcionamiento del transportador
Discusión
133
de dopamina bajo la influencia del Hc-TeTx, transportador responsable de la entrada
de la neurotoxina MPP+.
Estos experimentos fueron llevados a cabo sobre un sistema “ex vivo”: la fracción P2;
fracción enriquecida en sinaptosomas provenientes de núcleo estriado de rata. En
primer lugar, se determinaron los parámetros cinéticos para el transporte de dopamina,
siendo estos concordantes con los valores publicados en la literatura para DAT (Barc
et al., 2001). Posteriormente, se realizaron tratamientos a distintas concentraciones de
Hc-TeTx, obteniendo como resultados constantes cinéticas no significativamente
diferentes de las halladas para el grupo Control.
Teniendo en cuenta que el fragmento Hc-TeTx podría tener un uso terapéutico, es
primordial que no ejerza efectos sobre el transporte de DA ya que si, por ejemplo,
aumentara el valor de la KM, podría producirse una acumulación de DA en el espacio
sináptico, que es potencialmente neurotóxica para el sistema dopaminérgico
(Giménez-Xavier et al., 2006; Obata, 2002) y si lo disminuyera, la DA sería
rápidamente recaptada por la neurona, lo que propiciaría su oxidación en el citosol
generando ROS (Przedborski et al., 2001). Además, permaneciendo la DA poco
tiempo en la hendidura sináptica, se agravaría la situación de un enfermo de
Parkinson. En este sentido, consideramos muy importante el resultado obtenido.
De modo similar, realizamos experimentos de recaptación de la neurotoxina MPP+ a
través del transportador DAT que, como se dijo anteriormente, es el encargado de
transportar la neurotoxina hacia el interior de la neurona dopaminérgica, en este caso
utilizando el fragmento Hc-TeTx a una concentración final de 100 nM. El análisis
estadístico realizado indicó que no existen diferencias significativas entre los
parámetros cinéticos hallados para el grupo tratado con Hc-TeTx y los del grupo
Control. Este resultado es de vital importancia para nuestro modelo experimental, ya
que si la presencia de Hc-TeTx alterara los parámetros cinéticos de DAT, por ejemplo
aumentando el valor de KM, la captación de MPP+ por los terminales sinápticos se
vería reducida o bloqueada, de modo que el efecto neuroprotector atribuido al
fragmento Hc-TeTx no sería tal, sino que simplemente se estaría impidiendo la entrada
de la sustancia en las neuronas dopaminérgicas del núcleo estriado.
Asimismo, se diseñó un experimento en el que pretratamos los sinaptosomas con Hc-
TeTx (10 nM), MPP+ (50 µM) o con ambos, con el objeto de evocar la situación que se
crea durante la inyección estereotáxica de MPP+ en el núcleo estriado de rata in vivo y
posteriormente, analizamos la captación de [3H]-DA. En este caso, el tratamiento de
los sinaptosomas con MPP+ durante 5 min redujo un 50% la captación de [3H]-DA, lo
Discusión
134
cual concuerda con los datos publicados por Barc (Barc et al., 2001), y el
pretratamiento con Hc-TeTx (10 nM) no fue capaz de prevenir esta reducción. Este
resultado sugiere que inmediatamente después de la aplicación del MPP+ en el núcleo
estriado, se produce en la terminal sináptica dopaminérgica un déficit de ATP que
impide la ejecución de cualquier actividad dependiente de energía, como es
indirectamente la captación de DA ya que, a pesar de que el transporte a través de
DAT no precise de ATP, la bomba Na+/K+ ATPasa que mantiene el gradiente de iones
sí lo necesita para ser funcional. Esto ocurre independientemente de si el animal ha
sido pretratado o no con Hc-TeTx. In vivo, esta inhibición de la captación tras la
aplicación de MPP+ podría tener consecuencias neurotóxicas generadas por la
acumulación extracelular de la DA. En realidad, esta es una parte del modo de acción
del MPP+ ya que de hecho, la perfusión en el estriado de MPP+, aumenta el eflujo de
dopamina y esto induce la formación de especies reactivas de oxigeno (ROS) como el
radical hidroxilo, debido a la oxidación enzimática o no enzimática de la dopamina.
Estas ROS parecen provocar la peroxidación lipídica específica de las membranas
estriatales (Obata, 2002).
En suma, el fragmento Hc-TeTx no modifica la actividad del transportador de
dopamina, de modo que la captación de DA así como la del neurotóxico MPP+ se
producen de manera adecuada según este modelo. Así pues, podemos descartar que
los resultados obtenidos por el tratamiento con Hc-TeTx en los grupos de estudio en
que se combinan ambas sustancias, Hc/MPP+, sean fruto de la ausencia o disminución
de intoxicación por MPP+ de las neuronas dopaminérgicas a causa de un efecto
inhibitorio total o parcial del transportador DAT mediado por Hc-TeTx, resultados que
anularían la validez del modelo propuesto.
Teniendo la certeza de que el transportador de dopamina funcionaba adecuadamente
en presencia de Hc-TeTx y, por tanto, se había producido la intoxicación del núcleo
estriado con MPP+ correctamente, asumimos que el fragmento Hc-TeTx sí ejercía un
efecto protector manteniendo los niveles de aminas en los núcleos estriados
lesionados. Sólo entonces, nos dispusimos a examinar histológicamente el efecto que
tenía la administración de Hc-TeTx, de MPP+ o de ambas conjuntamente, en el núcleo
estriado así como en la substantia nigra de la rata.
En la bibliografía consultada se describe que, de manera posterior a la inyección
intraestriatal de MPP+, se produce un daño retrógrado irreversible en los cuerpos
neuronales dopaminérgicos de la SNpc y de hecho, a cantidades de ~100 nmol se
Discusión
135
observa una disminución en el número de neuronas TH positivas, además de signos
típicos de muerte apoptótica, y marcajes TUNEL o Nissl positivos (Banerjee et al.,
2006; Chen et al. 2002, Ghorayeb et al., 2002; Lo et al., 2008; Obata, 2002; Yazdani et
al., 2006, entre otros). Por esa razón, en el primer análisis histológico realizado,
quisimos comprobar si la inyección intraestriatal de 10 µg de MPP+ causaba una
degeneración retrógrada de las neuronas dopaminérgicas de la SNpc, así como
observar el estado de la misma en los otros grupos de tratamiento.
Para ello, utilizamos un método histoquímico basado en el marcaje fluorescente de
procesos y cuerpos neuronales en degeneración con el compuesto Fluoro-Jade B, que
reacciona selectivamente con neuronas en degeneración después de haber sufrido un
daño tóxico (Schmued y Hopkins, 2000) y, dado que en la SNpc existen dos tipos
distintos de neuronas, dopaminérgicas y gabaérgicas (Nair-Roberts et al., 2008),
quisimos asegurarnos de la especificidad de nuestro estudio llevando a cabo una
doble tinción con Fluoro-Jade B y tirosina hidroxilasa, que se encuentra, en esta
región, únicamente en las neuronas dopaminérgicas. Los resultados obtenidos
muestran que en la SNpc de las ratas tratadas con MPP+ y sacrificadas a los 5 días de
la intervención estereotáxica, no se produce una degeneración de las neuronas
dopaminérgicas, ya que en ningún caso se encontraron neuronas Fluoro-Jade B
positivas (figura 12, apartado Resultados).
El análisis de los otros grupos tratados, Control, Hc-TeTx y Hc/MPP+ llevó a la misma
conclusión, al no encontrarse neuronas Fluoro-Jade B positivas en ningún caso en las
SN ipsilaterales a la lesión y tampoco en sus respectivas contralaterales.
Como la detección de neuronas que están sufriendo apoptosis resulta muy complicada
debido a que se encuentran en números bajos y a que parecen ser eliminadas muy
rápidamente del medio (Dauer y Przedborski, 2003), quisimos corroborar el resultado
obtenido realizando un recuento de neuronas TH positivas presentes en la SNpc de
todos los grupos de tratamiento, tanto del hemisferio ipsilateral como del contralateral.
Dicho recuento no reveló diferencias significativas en lo referente al número total de
neuronas dopaminérgicas, ni en el hemisferio lesionado ni en el intacto en ninguno de
los grupos de tratamiento analizados (Control, Hc-TeTx, MPP+, Hc/MPP+) (ver figura
13, apartado Resultados).
En resumen, a los 5 días de la inyección intracraneal de 10 µg de MPP+ en el núcleo
estriado, no se encuentran evidencias ni de muerte ni de degeneración de neuronas
dopaminérgicas en la SNpc correspondiente al hemisferio inyectado. Dicho de otra
manera, la aplicación de 10 µg de MPP+ no ejerce un efecto degenerativo retrógrado
Discusión
136
sobre las neuronas dopaminérgicas del lado correspondiente al núcleo estriado
lesionado detectable a los 5 días de la lesión. Este resultado contrasta aparentemente
con el mencionado en la bibliografía, si bien es cierto que las dosis empleadas casi sin
excepción triplican la que se ha utilizado para llevar a cabo el estudio que
presentamos en esta tesis.
Las mismas fuentes que señalan una muerte retrógrada de neuronas dopaminérgicas
en la SNpc, citadas anteriormente, documentan una reducción de la inmunoreactividad
(IR) de la TH en el núcleo estriado lesionado tras el tratamiento con MPP+. Este dato
coincide con el resultado obtenido en nuestro modelo, en el que la inyección
intraestriatal de 10 µg de MPP+ conlleva un descenso de aproximadamente un 40% de
la IR para la TH, lo que concuerda con la disminución de DA y sus metabolitos en el
núcleo estriado discutido anteriormente. En este caso, quisimos analizar si el
pretratamiento con Hc-TeTx tenía alguna repercusión sobre los niveles de dicho
enzima de modo que llevamos a cabo una cuantificación de la inervación
dopaminérgica en el núcleo estriado 5 días post-lesión mediante una técnica
inmunohistoquímica, en la que se detectaron específicamente y compararon, los
niveles de inmunoreactividad del enzima TH de los grupos tratados: Control, Hc-TeTx,
MPP+, Hc/MPP+. Los resultados, resumidos en la figura 14 del apartado Resultados,
muestran que el pretratamiento intraperitoneal con el fragmento Hc-TeTx restaura en
un alto porcentaje los niveles de TH del núcleo estriado ipsilateral a la lesión. Los
animales administrados únicamente con Hc-TeTx no experimentaron variaciones
significativas en los valores de TH total.
Así, la aplicación intraperitoneal de Hc-TeTx (0,5 mg/Kg) 7 y 4 días previos a la
administración intraestriatal de 10 µg de MPP+, es capaz de prevenir la reducción de
inmunoreactividad del enzima tirosina hidroxilasa en el núcleo estriado del hemisferio
ipsilateral a la lesión. Por otra parte, la aplicación de Hc-TeTx intraperitoneal per se no
parece ejercer ningún efecto sobre la cantidad de TH presente en esta región.
Teniendo en cuenta los resultados anteriores, quisimos esclarecer si tanto el descenso
de la IR de la TH obsevado en los animales tratados con MPP+, como su restitución en
animales pretratados con Hc-TeTx, era consecuencia de una regulación en la
transcripción del gen de la tirosina hidroxilasa.
Con ese fin, realizamos un estudio de hibridación in situ sobre la SNpc (figura 15)
para detectar mediante la hibridación con una sonda radioactiva el mRNA del enzima
Discusión
137
TH. El estudio comparativo realizado sobre todos los grupos de tratamiento, Control,
Hc-TeTx, MPP+, Hc/MPP+, no desveló diferencias significativas en los niveles de
mRNA de la tirosina hidroxilasa. Para nuestra sorpresa, los animales del grupo MPP+,
que ven reducida en un 40% la inmunoreactividad de la proteína TH, tampoco
experimentaron un descenso detectable en los niveles de mRNA del enzima. La
cantidad total de proteína TH presente en el núcleo estriado no depende únicamente
de la regulación de la transcripción del gen TH, sino que también está sujeta a la
regulación por parte de otros mecanismos como la traducción, que en este caso, se da
en la terminal sináptica. De hecho, estudios previos mostraron que la TH existe en dos
formas, citosólica libre y asociada a membrana. La forma citosólica es más habitual en
compartimentos somatodendríticos de la neurona de la SN o la VTA, mientras que la
forma asociada a membrana es más común en áreas cerebrales ricas en
terminaciones axonales, como el núcleo estriado o el accumbens (Cartier et al., 2010).
En este sentido, la integridad del núcleo estriado es esencial para que se lleve a cabo
este proceso. Algunos estudios apuntan a que la aplicación de MPP+ resulta en una
lesión lugar-específica de los botones sinápticos de las terminales dopaminérgicas en
el sistema nigroestriatal debido a la presencia de DA en el espacio sináptico causada
por la aplicación de MPP+. Esta DA es susceptible de ser oxidada de manera
espontánea o mediante la actividad enzimática de MAO generando radicales OH·
reactivos y otras especies reactivas de oxígeno (ROS) que son capaces de iniciar la
peroxidación de lípidos de membrana (Barc et al., 2002; Obata, 2002).
La constatación de que la inmunoreactividad de TH en el núcleo estriado ipsilateral a
la lesión observada a los 5 días de la lesión no era debida a la regulación negativa en
la expresión de mRNA del enzima en la SNpc, nos hizo pensar que se estaba
produciendo efectivamente un daño específico localizado sobre la terminal sináptica
dopaminérgica, situada en el núcleo estriado. Con el propósito de comprobar el estado
de la integridad del núcleo estriado, llevamos a cabo el estudio de diferentes
marcadores típicos de neuronas dopaminérgicas como son el DAT, la TH y el VMAT-2,
ya que estos son ampliamente utilizados para hacer esta valoración (Joyce et al.,
2004; Zhu et al., 2004 entre otros).
El análisis efectuado mediante la técnica de WB sobre homogenados provenientes de
los núcleos estriados de ratas tratadas, desveló que la aplicación intraestriatal de
10 µg de MPP+, además de producir un descenso de la cantidad total de enzima TH,
reduce de manera significativa los niveles de los otros marcadores de terminales
Discusión
138
dopaminérgicas analizados, DAT y VMAT-2, a los 5 días de la lesión, siendo el
descenso en todos los casos de entre un 40-50% respecto al grupo Control. Por otra
parte, la administración de Hc-TeTx (IP) previa a la lesión estereotáxica, atenúa el
efecto tóxico del MPP+, ocasionándose un menor descenso en la presencia de dichos
marcadores. A este respecto, nos parece notable que la restauración de los niveles de
TH represente tan solo un 75% del Control, habiendo visto previamente, mediante la
técnica de inmunohistoquímica, una recuperación casi del 100%. Aunque a nuestro
parecer ninguna de las dos técnicas es estrictamente cuantitativa, creemos que el WB
podría ser considerado un poco más preciso, y de este modo, asumimos que la
recuperación de los niveles de TH en el grupo Hc/MPP+ es únicamente parcial.
En síntesis, la inyección estereotáxica de MPP+ en el núcleo estriado origina un
descenso de enzima TH y de transportadores DAT y VMAT-2 en las terminales
dopaminérgicas localizadas en esta región, pero no provoca un daño retrógrado sobre
los cuerpos celulares dopaminérgicos situados en la SNpc. Por otra parte, el descenso
de inmunoreactividad de TH en el núcleo estriado no guarda relación con un descenso
en los niveles de mRNA del enzima, ya que no se produce una disminución de la
expresión de este gen en la SNpc.
Con la intención de encontrar una explicación al hecho de que los niveles de enzima
TH fueran de un 75% con respecto al Control en el grupo Hc/MPP+, siendo el
contenido de dopamina en este mismo grupo equivalente al del grupo Control, se
realizó una serie de estudios para determinar el nivel de fosforilación del enzima TH,
como un indicador de su estado de activación.
El enzima TH posee un dominio de regulación con 3 residuos Serina principales
susceptibles de ser fosforilados (Ser19, Ser31, Ser40) y cuya fosforilación podría
participar directamente en la aceleración de la actividad enzimática (Dunkley et al.,
2004). Así, en este ensayo quisimos estudiar mediante la técnica de WB el estado de
fosforilación de los residuos Serina del enzima TH (Ser19, Ser31, Ser40) después del
tratamiento con el fragmento Hc-TeTx in vitro y posteriormente, in vivo.
La primera aproximación, la realizamos sobre un sistema de sinaptosomas (fracción
P2) provenientes de núcleo estriado de rata. Los resultados obtenidos indicaron que el
tratamiento con Hc-TeTx durante 15 min era capaz de incrementar la fosforilación del
residuo Serina 40 del enzima TH en un 60% con respecto al grupo Control, no así los
otros residuos, cuya fosforilación permaneció invariable tras el tratamiento. A este
Discusión
139
respecto, está muy bien documentada la fosforilación del residuo Ser40 mediada por la
proteína kinasa A (PKA) y, si bien es la forma de fosforilación más habitual, no es la
única, ya que se han descrito otras kinasas capaces de realizar la misma función in
vitro. Sin ir más lejos, la proteína kinasa C (PKC) también tiene la capacidad de
fosforilar el residuo Ser40 de la TH in vitro manteniéndose la fosforilación durante 20-
30 min, y produciéndose hasta los 15 min un aumento de actividad del enzima (Albert
et al., 1984). En este sentido, investigaciones de nuestro grupo demostraron, también
en sinaptosomas, que el fragmento Hc-TeTx produce una activación y translocación de
la PKC del citoplasma a la membrana dependiente de la activación del receptor TrkA y
de la activación de la PLC-け (Gil et al., 2001). Por otra parte, la fosforilación del residuo
Ser31 en sinaptosomas estriatales de rata es llevada a cabo a través de la vía de
señalización MAPK/ERK1/2 y habiéndose descrito la fosforilación de ERK1 a
consecuencia del tratamiento con el fragmento Hc-TeTx en sinaptosomas de rata (Gil
et al., 2001) sería esperable encontrar también un aumento en la fosforilación del
residuo Ser31 de la TH. El hecho de que esta no se observe coincide con lo publicado
por Lindgren, que describe que el tratamiento con Forskolina aumenta la fosforilación
de ERK pero eso no lleva a la fosforilación de la Ser31 de la TH, a pesar de que se
conoce la regulación de ERK mediada por cAMP (Lindgren et al., 2000, 2001).
Asimismo, se describe que el tratamiento de sinaptosomas estriatales de rata tratados
con KCl produce un incremento notable en la fosforilación de los residuos Ser19,
Ser31 y Ser40 de la TH, lo cual hubiera resultado ser un buen control positivo para
nuestro experimento (Lindgren et al., 2001). Con este antecedente in vitro quisimos
indagar en el estado de la fosforilación del enzima en un sistema in vivo, de modo que
analizamos los núcleos estriados de las ratas Control, Hc-TeTx, MPP+ y Hc/MPP+.
Del análisis de los homogenados obtenidos a partir de los núcleos estriados de ratas
tratadas y sacrificadas a los 5 días de la lesión estereotáxica se desprenden varios
resultados. En primer lugar, la inyección de Hc-TeTx (IP) no modifica el patrón de
fosforilación de los residuos Serina (19, 31, 40) de la TH, siendo los niveles obtenidos
equiparables a los del grupo Control. Este hecho puede ser debido a diversos factores.
Por un lado, existe la posibilidad de que el fragmento Hc-TeTx no participe en esta vía
de regulación in vivo. Por otra parte, el tiempo puede ser el responsable principal de
este resultado ya que in vitro (sinaptosomas), la fosforilación de Ser40 fue encontrada
a los 15 min del tratamiento con Hc-TeTx y la fosforilación es un método de regulación
del enzima a corto plazo.
Por lo general este tipo de estudios in vivo suelen desarrollarse entre 20-40 min
después de la administración de una sustancia o de la realización de un tratamiento
Discusión
140
(Lew et al., 1998; Salvatore et al., 2000; Haycock y Haycock, 1991 entre otros). Aún
sabiendo esto, la razón por la que quisimos realizar el análisis es que desconocemos
si la molécula Hc-TeTx sigue estando presente en el núcleo estriado al cabo de esos
días ejerciendo algún tipo de efecto, ya que la administración IP de Hc-TeTx está
pensada para que la molécula esté en el núcleo estriado en el momento de la
intervención intraestriatal, pero ignoramos el momento exacto en el que se produce su
ingreso y cuánto tiempo permanece allí. Se sabe que la TH presenta varios sistemas
de regulación negativa, como son la regulación alostérica, la inhibición por feedback
(por interacción con grupos catecol) y la desfosforilación (Dunkley et al., 2004). Así
pues, no descartamos su fosforilación en etapas previas a las estudiadas en este
trabajo in vivo, lo cual a su vez estaría respaldado por los resultados obtenidos en el
estudio realizado sobre sinaptosomas (figura 17).
En el grupo MPP+ se observa, aunque no de manera estadísticamente significativa,
una tendencia al aumento de la fosforilación de la Ser40 de la TH. Este hecho podría
ser debido simplemente a mecanismos de compensación promovidos por la ausencia
de dopamina.
Paralelamente, esperábamos que en el grupo Hc/MPP+ se produjera un aumento muy
destacable de la fosforilación del residuo Ser40 debido al efecto de Hc-TeTx, que
hubiera sido por otro lado lógico, ya que observamos unos niveles de dopamina
estriatal equiparables a los del grupo Control teniendo unos valores de TH de tan sólo
un 75%. Tal vez si hubiéramos analizado la fosforilación días antes hubiéramos
encontrado un aumento en la Ser40, pero ahora que los niveles de DA son adecuados,
en realidad una hiperfosforilación de TH tampoco sería necesaria. Siendo los niveles
de DA normales, probablemente una parte de la TH se encuentre inhibida debido al
feedback. Aparentemente existe un pool de TH que permanece inactivo en la neurona
(Joh et al., 1978; Kumer y Vrana, 1996), de modo que con sólo un 75% de TH total, la
neurona sería capaz de sintetizar toda la dopamina necesaria para un buen
funcionamiento del sistema dopaminérgico. Por otra parte, también es cierto que una
parte de la TH inactiva también está fosforilada en este residuo (Dunkley et al., 2004).
En cualquier caso podemos afirmar que, a los 5 días de la lesión, los patrones de
fosforilación de los residuos Ser19, Ser31 y Ser40 del enzima tirosina hidroxilasa no se
encuentran modificados significativamente como causa de la inyección intraperitoneal
del fragmento Hc-TeTx, realizada los días 7 y 4 previos a la lesión
Discusión
141
En resumen:
El fragmento recombinante Hc-TeTx, coaplicado intraestriatalmente o administrado
intraperitonealmente a modo de pretratamiento, logra mantener las concentraciones de
dopamina y sus metabolitos, en los grupos intoxicados con MPP+, a niveles de
normalidad.
Puesto que el fragmento Hc-TeTx no modifica los parámetros cinéticos del
transportador de dopamina, ni para el transporte de DA ni para el de MPP+, se asume
que la entrada de la neurotoxina en las terminales sinápticas dopaminérgicas se
produce con la misma eficacia tanto en los animales tratados como en los no tratados
con Hc-TeTx, por lo que los efectos protectores encontrados, no serían debidos a la
ineficacia del modelo de parkinsonismo utilizado.
Los estudios histoquímicos abordados muestran la idoneidad del modelo de
parkinsonismo basado en dosis bajas de MPP+, en cuanto que dichas dosis no
modifican los marcadores celulares de las neuronas colinérgicas y glutamatérgicas
presentes en el núcleo estriado, si bien reducen, en aproximadamente un 40%, los
niveles de inmunoreactividad de la TH. Además, la aplicación de 10 µg de MPP+ no
ocasiona una degeneración retrógrada ni produce muerte de las neuronas
dopaminérgicas de la SNpc, así como tampoco modifica el patrón de expresión de
mRNA del enzima TH.
Por otra parte, este tratamiento con MPP+ compromete la integridad del núcleo
estriado, ya que los niveles de los marcadores de las terminaciones dopaminérgicas
VMAT-2 y DAT se observan disminuidos en un 50%. La administración previa del
fragmento Hc-TeTx, mantiene en gran medida dicha la integridad, y conserva
notablemente los niveles de TH, VMAT-2 y DAT. Dado que, aparentemente el Hc-TeTx
no participa en la transcripción del mRNA de la TH, ni en la regulación de su actividad
por fosforilación a largo plazo, pero sin embargo, mantiene el contenido estriatal de DA
y sus metabolitos, sugerimos que su efecto neuroprotector sea debido a la
preservación de la integridad de las terminaciones sinápticas dopaminérgicas.
Puesto que, todo apunta a una degeneración localizada del botón sináptico mediada
por la crisis energética mitocondrial y por el estrés oxidativo que se origina como
consecuencia de la aplicación de MPP+, proponemos que el fragmento Hc-TeTx tiene
la capacidad de mantener el equilibrio entre los agentes oxidantes y los mecanismos
detoxificantes de la célula, como podría ser la regulación de los enzimas antioxidantes
superóxido dismutasa, catalasa, glutatión peroxidasa, etcétera. O bien, la regulación
Discusión
142
de sustancias con la misma función como el glutatión o las vitaminas A, C o E. Estos
mecanismos tienen relación directa con el efecto neuroprotector demostrado del
fragmento Hc-TeTx, observado por nuestro grupo e indirectamente por otros grupos
(Toivonen et al., 2010).
Independientemente de los mecanismos que pudieran estar implicados, los resultados
de neuroprotección obtenidos mediante la aplicación periférica del fragmento Hc-TeTx
alientan enormemente su estudio como terapia alternativa en patologías debidas a
degeneración neuronal.
VI- CONCLUSIONES
Conclusiones
145
VI- Conclusiones
I. La administración intraestriatal de una dosis baja de MPP+ en rata:
1.- Causa el empobrecimiento específico, paulatino y transitorio de los niveles de
dopamina y sus metabolitos, DOPAC, HVA y 3-MT, en el núcleo lesionado.
2.- Provoca la disminución de los niveles de catecolaminas va acompañada de un
descenso, entre el 40% y 50%, de los niveles proteicos de tirosina hidroxilasa y de
otros marcadores de terminales sinápticas dopaminérgicas, indicando degeneración
de estas terminales.
3.- No ocasiona una degeneración dopaminérgica retrógrada en la SNpc a los 5 días
de la intervención estereotáxica. Este hecho no excluye que este evento se dé con
posterioridad.
4.- Proporciona una plataforma sólida para seguir indagando en los mecanismos que
participan en procesos de degeneración neuronal, tales como el estrés oxidativo y la
inflamación, entre otros. Debido a la especificidad mostrada y la levedad de los
síntomas generados, este modelo posee la cualidad de ser un escenario adecuado
para el estudio de la enfermedad de Parkinson en fase inicial.
II. El tratamiento con el fragmento Hc-TeTx en el modelo degenerativo in vivo
descrito:
1.- Evita la disminución del contenido estriatal de dopamina y sus metabolitos,
DOPAC, HVA y 3-MT, en el núcleo lesionado, tanto con la administración intracraneal,
como con la administración intraperitoneal del fragmento Hc-TeTx.
2.- Modera la disminución de los marcadores dopaminérgicos, TH, DAT y VMAT-2, en
el núcleo estriado.
3.- No modifica la expresión del mRNA del enzima tirosina hidroxilasa en la SNpc
correspondiente al hemisferio lesionado, descartándose cambios en los niveles de
expresión de la proteína TH por Hc-TeTx.
Conclusiones
146
4.- No produce por sí sólo, administrado intracraneal o intraperitonealmente,
variaciones significativas en ninguno de los parámetros analizados en las condiciones
utilizadas.
III. El tratamiento de la fracción sinaptosomal P2 con el fragmento Hc-TeTx
demuestra que:
1.- El fragmento Hc-TeTx no modifica los parámetros cinéticos del transportador DAT,
KM y VMax, para los sustratos DA y MPP+, por lo que podemos afirmar que el efecto
neuroprotector ejercido no es debido a una restricción de la entrada de neurotoxina
MPP+, ni a una modificación de la captación de DA por las terminales dopaminérgicas.
2.- El Hc-TeTx produce un aumento significativo de la fosforilación del residuo Ser40
del enzima tirosina hidroxilasa sin modificar los estados de fosforilación de los residuos
Ser19 y Ser31. Esto indicaría una activación a corto plazo del enzima por modificación
reversible de la misma.
En resumen:
La coaplicación intracraneal así como la aplicación intraperitoneal del fragmento Hc-
TeTx previa a la administración estereotáxica de la neurotoxina MPP+, ejerce un efecto
neuroprotector frente a las alteraciones provocados por dicha toxina, y aunque
desconocemos los mecanismos implicados en este proceso, sugerimos que actúa
promoviendo la preservación de la integridad física del lugar que contiene la
maquinaria y en el que se llevan a cabo los eventos que posibilitan el funcionamiento
adecuado de las neuronas dopaminérgicas en el núcleo estriado, es decir, sus
terminales sinápticas.
Las propiedades del fragmento Hc-TeTx de transportarse retroaxonalmente, su falta
de toxicidad, su larga vida media y estabilidad, su tropismo por las células nerviosas,
sumadas a la cualidad que presenta el fragmento Hc-TeTx de no alterar los
mecanismos relacionados con el transporte y con la regulación de fenómenos
“dopaminérgicos”, hacen del fragmento Hc-TeTx un candidato excepcional como
fármaco para el tratamiento preventivo de enfermedades neurodegenerativas en
las que se produce degeneración de las terminales sinápticas, como es la enfermedad
de Parkinson.
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