EFECTOS DEL HUMO DE CIGARRILLO EN CULTIVOS DE

EPITELIO RESPIRATORIO Y RETINIANO HUMANOS:

ESTRÉS OXIDATIVO E INFLAMACIÓN

Dugour A, Marazita M, Suburo A, Figueroa JM

Buenos Aires

DEGENERACION MACULAR ASOCIADA A LA EDAD (DMAE)

Mácula: o mancha amarillenta en la retina.o visión central, fotopica, detalles, letras, caras.o ausencia de bastones, formada solo por conos y

epitelio pigmentario denso.o gran contenido de pigmentos xantofílicos

(luteína, zeaxantina= fotoprotectores).

DMAE afecta a los componentes de la retina externa

Fotoreceptores

Epitelio

Pigmentario

Retiniano

Coroides

retinografia

La DMAE se

caracteriza por la

aparición de anomalías

histologicas:

- neovascularización

- fibrosis

- remodelación

DMAE

Factores de riesgo DMAE:

EDAD Tabaquismo

EPR: • separa fotorreceptores de coroides (vascular)• barrera, intercambio de nutrientes, iones, factores tróficos• absorbe luz, contiene antioxidantes• regula inmunidad ocular

asociación DMAE-EPOC

ROSantioxidantes

salud

ROS

antioxidantes

DMAE

ROS

antioxidantes

EPOC

DMAE: fisiopatología propuesta

TEJIDO EPITELIAL

•El tejido epitelial es básicamente un tejido de cubrimiento.

•Se especializa en absorber, secretar, transportar, excretar o proteger los órganos que recubre.

•Estas células mueren y se regeneran constantemente.

Produce y libera factores reguladores de INMUNIDAD, INFLAMACION,

y PROLIFERACION

OBJETIVO:

Profundizar en el conocimiento del daño que causa el HC en cultivos de

células de epitelio respiratorio y retiniano in vitro y buscar similitudes y

diferencias entre los mecanismos participantes en ambos casos

Cultivos de líneas celulares de EPITELIO RESPIRATORIO y RETINIANO:

modelos utilizados para el estudio de la EPOC y la DMAE

Cultivo de células epiteliales en monocapa:

permite estudiar la actividad de estas células

en una disposición similar a la que tienen en

el individuo y al mismo tiempo

independientes de toda influencia de otras

células

(del conectivo, del sistema inmune, etc.).

Modelo de epitelio bronquial (Calu-3)

Morfológicamente representativo del epitelio bronquial

- Se cultivan en monocapa. Desarrollan uniones tight junction.- Muy similares a cultivos primarios. - Expresan CFTR.- Capacidad de secreción de moco al medio apical.- Sintetizan y liberan IL-8, IL 6, VEGF, etc.

CONCENTRADO DE HUMO DE CIGARRILLO (CHC)

Reference Cigarette Program. College of Agriculture. Universidad de Kentucky http://www2.ca.uky.edu/refcig

Tratamiento de los epitelios

Valoraciones

Sobre la monocapa de células:

1)Viabilidad celular:

- LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity, Life Technologies

-The CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell

Proliferation Assay (Promega, EEUU).

2) Inducción de ROS

Mediante la sonda diacetato de 2’,7’-

diclorodihidrofluoresceína (DCFDA) (Molecular Probes).

En el sobrenadante:

3) Inducción de inflamación:

ELISA de Captura (Human IL-8/IL-6 ELISA Set, BD

Bioscienses).

CHC NAC o Medio de cultivo (C)o CHC

o CHC + N-Ac.Cist. (NAC: antioxidante)

Viabilidad Celular. Epitelio Respiratorio.

El CHC tiene un efecto citotóxico, promoviendo la muerte celular en células CALU-3.

C

CHC 200 µg/ml

Análisis de la morfología celular con microscopia de fluorescencia. Celulas CALU – 3. Aumento 400 x. Luego de 72 horas post-tratamiento las células se tiñeron con los colorantes del kit LIVE/DEAD® (green-fluorescent calcein y red-fluorescent). Verde (filtro Ex 450-490, DM 500, BA 515) Rojo (filtro Ex 541-551, DM 565, BA 590).

Viabilidad Celular. Epitelio Retiniano.

El CHC tiene un efecto citotóxico, promoviendo la muerte celular en células ARPE-19.

C

CHC 200 µg/ml

Análisis de la morfología celular con microscopia de fluorescencia. Celulas ARPE-19. Aumento 200 x. Luego de 72 horas post-tratamiento las células se tiñeron con los colorantes del kit LIVE/DEAD® (green-fluorescent calcein y red-fluorescent). Verde (filtro Ex 450-490, DM 500, BA 515) Rojo (filtro Ex 541-551, DM 565, BA 590).

Estrés Oxidativo. Epitelio Respiratorio

El CHC aumenta los niveles de intracelulares de especies reactivas de oxígeno (ROS) en células CALU-3.

NAC previene el efecto de CHC sobre las ROS.

Celulas CALU-31-Sonda DCFDA 30 min. 2-CHC y CHC+ NAC 15 min. Microscopio de fluorescencia (ex 460–480 nm y em a 495–540 nm). Programa: ImageJ 1.42.

p <0,05. Tukey test

Estrés Oxidativo. Epitelio Retiniano

El CHC aumenta los niveles intracelulares de ROS en células ARPE-19. NAC previene el efecto de CHC sobre las ROS

Celulas ARPE-19. 1-Sonda DCFDA 30 min. 2-CHC/CHC+NAC 15 min. Cuantificacion de ROS en un Luminometro

p <0,05. Tukey test

Inducción de Inflamación. Epitelio Respiratorio

El CHC aumenta los niveles de IL-6 e IL-8 liberados por las células CALU-3.

NAC previene este efecto

CALU-3. CHC 100 µg/ml y CHC 100 µg/ml + NAC 5 mM 24 hs. Se cuantifico la IL-6 y la IL-8 liberada por ELISA de Captura. Los resultados representan el promedio ± SE de 5 ensayos independientes realizados por cuadruplicado.

p < 0.05 Newman-Keuls Multiple Comparison Test

p < 0.05 Newman-Keuls Multiple Comparison Test

Senescencia. Epitelio Retiniano

El CHC induce senescencia celular en cultivos de células ARPE-19. NAC previene dicho efecto.

ARPE-19 CHC / CHC+NAC por 3 días y luego mantenidas por 9 días más en medio fresco. La actividad de SA-βgal fue estudiada por tinción con el sustrato X-gal. Se evaluaron 3 pocillos por tratamiento. Figura representativa de 3 ensayos independientes

Inducción de Inflamación. Epitelio Respiratorio

El CHC aumenta los niveles de IL-6 e IL-8 liberados por las células ARPE-19.

NAC revierte el efecto

ARPE-19 senescentes. CHC 100 µg/ml y CHC 100 µg/ml + NAC 5 mM. Se cuantifico la IL-6 y la IL-8 liberada por ELISA de Captura. Los resultados representan el promedio ± SE de 5 ensayos independientes realizados por cuadruplicado.

p<0.01 .Newman-Keuls Multiple Comparison Test

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Conclusiones

Nuestros modelos parecen aptos para el estudio de fármacos con acción antioxidante en vistas a nuevos tratamientos para la EPOC, la DMAE, y

la asociación entre ellas.

El CHC reduce la viabilidad celular en nuestros modelos..

El hecho de que la NAC bloquee completamente el aumento de ROS y la liberación de IL-6 e IL-8 en nuestras células implica que el aumento de ROS es un paso ineludible en la generación de inflamación mediada por estos epitelios ante la exposición al CHC..

El CHC induce un aumento intracelular de ROS.

Las semejanzas en los mecanismos de daño entre ambos epitelios explican la asociación epidemiológica entre ambos.

Gracias por su atención !!

www.fundacioncassara.org.ar

adugour@fundacioncassara.org.ar

Viabilidad Celular. Epitelio Respiratorio.

La incubación simultánea con CHC y NAC 2,5 mM previene significativamente el daño causado por el CHC