EFICACIA ANTIMICROBIANA DEL ACEITE ESENCIAL DEL TOMILLO · II Agradecimiento A Dios por haberme...
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
EFICACIA ANTIMICROBIANA DEL ACEITE ESENCIAL DEL TOMILLO
(Thymus vulgaris L.) COMO CONSERVANTE EN UNA EMULSION O/W DE
USO TÓPICO.
Trabajo de investigación presentado como requisito previo para la obtención del título
de Químico Farmacéutico
Autor: Guerrero Rivadeneira Yéssica Patricia
Tutor: Mgs Dayana Paulina Borja Espín
Quito, Marzo 2017
I
Dedicatoria
A mis padres por haberme enseñado que el esfuerzo, la dedicación y el no dejarse
vencer, valen la pena.
II
Agradecimiento
A Dios por haberme dado la sabiduría, la fuerza y sobre todo la bendición en cada paso
dado.
A mis padres, quienes me han dado la mejor educación y que con su ejemplo me han
sabido fomentar que está en uno el querer lograr algo, que los problemas y las
dificultades no son limitantes para alcanzar las metas planteadas, por su apoyo
incondicional, sus consejos y su persistencia.
A mi ñaña que con su carácter y sus locuras siempre ha estado junto a mí, siendo mi
alegría y mi fuerza en momentos difíciles.
A mis abuelitos, que con su humildad y sencillez han velado a través de sus oraciones
para que Dios guie siempre mi camino.
A Verito, por ser una amiga incondicional que ha formado parte de mi vida desde el
momento que decidimos empezar esta gran lucha en la Universidad. Gracias amiga por
formar parte de mi vida y por tu aporte en la realización de este proyecto de
investigación.
A Migue, por haber llegado a mi vida en el momento justo, por ser mi compañero, mi
amigo y sobre todo por estar conmigo en los momentos buenos y en los malos,
dándome aliento cuando me he sentido derrotada, levantándome cuando he tropezado.
Gracias por su ayuda incondicional para la culminación de esta etapa de mi vida.
A mis maestros de la facultad, por darnos las herramientas necesarias para defendernos
como profesionales, en especial agradezco al Dr. Javier Santamaría, que con sus
conocimientos y exigencias me ha sabido guiar durante la realización de este trabajo de
investigación, del cual he aprendido que la preparación nunca termina y que un título
profesional debe ir de la mano de una gran calidad humana; a la Dra. Liliana Naranjo,
por ser una excelente docente y por velar por sus estudiantes.
A mi tutora Dra. Dayana Borja por la orientación y todo su apoyo durante el desarrollo
de este trabajo de investigación.
III
AUTORIZACIÓN DE AUTORÍA INTELECTUAL
Yo, Guerrero Rivadeneira Yéssica Patricia en calidad de autor del trabajo
de investigación: EFICACIA ANTIMICROBIANA DEL ACEITE ESENCIAL
DEL TOMILLO (Thymus vulgaris L.) COMO CONSERVANTE EN UNA
EMULSION O/W DE USO TÓPICO autorizo a la Universidad Central del
Ecuador a hacer uso de todos los contenidos que me pertenece o parte de los que
contiene esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente
autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los
artículos 5, 6,8, 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su
Reglamento.
También, autorizo a la Universidad Central del Ecuador a realizar la
digitalización y publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual,
de conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación
Superior.
…………………………………………….
Yéssica Patricia Guerrero Rivadeneira
CI: 172099425-8
IV
ACEPTACIÓN DEL TUTOR
Yo Dayana Paulina Borja Espin.en calidad de tutor del trabajo de investigación
titulado EFICACIA ANTIMICROBIANA DEL ACEITE ESENCIAL DEL
TOMILLO (Thymus vulgaris L.) COMO CONSERVANTE EN UNA
EMULSION O/W DE USO TÓPICO, elaborado por la estudiante Yéssica
Patricia Guerrero Rivadeneira de la Carrera de QUÍMICA FARMACÉUTICA,
Facultad de CIENCIAS QUIMICAS de la Universidad Central del Ecuador,
considero que el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios en el campo
metodológico y en el campo epistemológico, por lo que lo APRUEBO, a fin de que
sea sometido a la evaluación por parte del tribunal calificador que se designe.
En la ciudad de Quito, a los 08 días del mes de Marzo de 2017
……………………
Mgs Dayana Paulina Borja Espín
C.I. 1710993849
V
ACEPTACIÓN DEL TUTOR
El Tribunal constituido por: Javier Santamaría Aguirre, Inés Catalina Echeverría
Llumipanta, y Dayana Borja Espín, luego de revisar el trabajo de investigación
titulado EFICACIA ANTIMICROBIANA DEL ACEITE ESENCIAL DEL
TOMILLO (Thymus vulgaris L.) COMO CONSERVANTE EN UNA
EMULSION O/W DE USO TÓPICO, previo a la obtención del título de
QUÍMICO FARMACÉUTICO presentado por la señorita Guerrero Rivadeneira
Yéssica Patricia, APRUEBA el trabajo presentado.
Para la constancia de lo actuado firman.
…………………………………..
Javier Rodrigo Santamaría Aguirre
C.I. 1802467132
…………………………………..
Dayana Paulina Borja Espín
C.I. 1710993849
…………………………………..
Inés Catalina Echeverría Llumipanta
C.I. 1715966741
VI
Índice de Contenidos
Resumen ........................................................................................................................XI
Introducción ................................................................................................................... 1
Capítulo I: El problema ................................................................................................ 2
Planteamiento del problema ................................................................................... 2-3
Formulación del problema ....................................................................................... 3
Objetivos de la investigación ................................................................................... 3
Objetivo General .................................................................................................. 3
Objetivos específicos ............................................................................................ 3
Importancia y justificación del problema .............................................................. 3-4
Capítulo II: Marco Teórico .......................................................................................... 5
Antecedentes de la investigación .......................................................................... 5-6
Fundamento teórico ................................................................................................. 6
Presencia y análisis de microorganismo en un producto terminado .................. 6-7
Calidad microbiológica en medicamentos ........................................................ 8
Conservantes ........................................................................................................ 8
Tipos de conservantes .................................................................................. 8-9
Selección del conservantes .............................................................................. 9
Análisis de eficacia de los conservantes .............................................................. 9
Microorganismos de prueba ....................................................................... 9-11
Prueba de eficacia antimicrobiana ................................................................. 11
Aceites esenciales ............................................................................................. 12
Caracterización de los aceites esenciales ....................................................... 12
Factores que afectan la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales
……………………………………………………………………………...12-13
Especie vegetal ................................................................................................. 13
Descripción botánica del tomillo ................................................................... 13
Composición química .............................................................................. 13-14
Acción Farmacológica .................................................................................. 14
Actividad antimicrobiana ......................................................................... 14-15
Formulaciones ..................................................................................................... 15
Emulsiones ...................................................................................................... 15
Componentes de las emulsiones ..................................................................... 16
Contaminación microbiológica de las emulsiones ..................................... 16-17
Estudios de estabilidad ........................................................................................ 17
Estabilidad acelerada y parámetros de evaluación ..................................... 17-18
Fundamento Legal ................................................................................................. 18
Constitución de la República del Ecuador ......................................................... 18
Ley Orgánica de Salud ....................................................................................... 18
Buenas prácticas de manufactura para la industria de productos cosméticos .... 18
Buenas prácticas de manufactura ....................................................................... 18
Secretaría General de la Comunidad Andina (CAN) .......................................... 19
Cosmetics - European Commission (Cosing) ..................................................... 19
VII
USP-36 ................................................................................................................ 19
Hipótesis ................................................................................................................ 19
Sistema de variables ........................................................................................... 19-20
Capítulo III: Metodología ........................................................................................... 21
Diseño de la investigación .................................................................................... 21
Población y muestra ............................................................................................... 21
Métodos y materiales ............................................................................................ 21
Materiales. .......................................................................................................... 21
Materias primas ............................................................................................ 21-22
Microorganismos de prueba ............................................................................... 22
Equipos ............................................................................................................... 22
Diseño experimental ........................................................................................ 22-25
Operacionalización de variables ............................................................................ 25
Procedimientos ..................................................................................................... 25
Control de calidad del aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.). ...... 25-26
Características Organolépticas ...................................................................... 26
Densidad relativa ........................................................................................... 26
Índice de refracción ................................................................................. 26-27
Reacciones de coloración para aceites esenciales .................................... 27-28
Cromatografía en capa fina .......................................................................... 28
Elaboración de la emulsión o/w de uso tópico (loción) ...................................... 28
Elaboración de una emulsión o/w con el conservante sintético. .................... 29
Elaboración de una emulsión o/w con aceite esencial de tomillo, como
conservante antimicrobiano. ........................................................................... 30
Metodología analítica para el producto terminado (emulsión o/w de tipo loción).
............................................................................................................................ 31
Ensayos organolépticos .................................................................................. 31
Ensayos físicos ............................................................................................. 31
Metodología microbiológica. ................................................................................. 31
Examen microbiológico de productos no estériles: Aptitud del método de
recuento en presencia del producto ................................................................ 31-32
Método de Recuento en Placa ....................................................................... 32
Prueba de eficacia antimicrobiana .......................................................... 33-35
Técnicas de procesamiento de datos (análisis estadístico) ....................................... 35
Diseño experimental ............................................................................................ 35
Análisis de varianza ANOVA ................................................................. 35-36
Decodificación general del estudio .......................................................... 36-37
Capítulo IV: Análisis y discusión de resultados ....................................................... 38
Análisis fisicoquímico cualitativo del aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris
L.) ....................................................................................................................... 38
Reacción de caracterización ...................................................................... 38-39
Cromatografía en capa fina del aceite esencial de tomillo .............................. 39
Medición del espectro IR del aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris L.)
............................................................................................................................ 40
VIII
Control de calidad del producto terminado (emulsión o/w: loción) ......... 40-44
Examen microbiológico de productos no estériles: Método de recuento en
placa… ........................................................................................................ 44-45
Prueba de eficacia antimicrobiana. Test de efectividad del preservante
(método USP-36) ....................................................................................... 46-59
Análisis estadístico de la eficacia antimicrobiana del aceite esencial de tomillo
(Thymus vulgaris L.) .................................................................................... 59-60
Tratamiento estadístico (Análisis 1) ......................................................... 60-65
Tratamiento estadístico (Análisis 2) ....................................................... 65-72
Análisis estadístico ANOVA de dos factores .......................................... 72-76
Capítulo V: Conclusiones y Recomendaciones ........................................................ 77
Conclusiones ......................................................................................................... 77
Recomendaciones ................................................................................................. 78
Bibliografía ....................................................................................................... 79-81
IX
Índice de Ilustraciones
Ilustración 2.1 Period After Opening (PAO) ................................................................. 7
Ilustración 2.2 Planta de tomillo (Thymus vulgaris L.) ................................................ 13
Ilustración 2.3 Componentes principales del aceite esencial de (Thymus vulgaris L). 14
Ilustración 4.1 Espectro IR del aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris L.) ......... 40
X
Índice de Gráficas
Gráfica 4.1 Extensibilidad vs tratamientos ................................................................... 42
Gráfica 4.2 Reducción logarítmica del crecimiento microbiano a los intervalos T14 y
T28 vs concentración de aceite esencial de tomillo (0,5%). Análisís1 ......................... 52
Gráfica 4.3 Reducción logarítmica del crecimiento microbiano a los intervalos T14 y
T28 vs concentración de aceite esencial de tomillo (1,0%). Análisis 1. ....................... 52
Gráfica 4.4 Reducción logarítmica del crecimiento microbiano a los a los intervalos
T14 y T28 vs concentración de aceite esencial de tomillo (1,5%). Análisis 1 .............. 53
Gráfica 4.5 Reducción logarítmica del crecimiento microbiano a los a los intervalos
T14 y T28 vs mezcla de parabenos (metilparabeno y propilparabeno). Análisis 1 ....... 54
Gráfica 4.6 Reducción logarítmica del crecimiento microbiano a los intervalos T14 y
T28 vs concentración de aceite esencial de tomillo (0,5%). Análisis 2 ........................ 54
Gráfica 4.7 Reducción logarítmica del crecimiento microbiano a los intervalos T14 y
T28 vs concentración de aceite esencial de tomillo (1,0%). Análisis 2 ....................... 55
Gráfica 4.8 Reducción logarítmica del crecimiento microbiano a los intervalos T14 y
T28 vs concentración de aceite esencial de tomillo (1,5%). Análisis 2 ........................ 55
Gráfica 4.9 Reducción logarítmica del crecimiento microbiano a los intervalos T14 y
T28 vs mezcla de parabenos (metilparabeno y propilparabeno). Análisis 2. ................. 56
Gráfica 4.10 Reducción logarítmica del crecimiento microbiano al intervalo T14 vs
concentración de aceite esencial de tomillo y mezcla de parabenos.Análisis1. ............. 56
Gráfica 4.11 Reducción logarítmica del crecimiento microbiano al intervalo T28 vs
concentración de aceite esencial de tomillo y mezcla de parabenos.Análisis1 .............. 57
Gráfica 4.12 Reducción logarítmica del crecimiento microbiano al intervalo T14 vs
concentración de aceite esencial de tomillo y mezcla de parabenos. Análisis. .............. 58
Gráfica 4.13 Reducción logarítmica del crecimiento microbiano al intervalo T28 vs
concentración de aceite esencial de tomillo y mezcla de parabenos. Análisis2 ............. 59
Gráfica 4.14 Gráfica de caja: concentración de aceite esencial de tomillo y mezcla de
parabenos vs Reducción logarítmica de Pseudomonas aeruginosa .............................. 60
Gráfica 4.15 Gráfica de valores individuales: concentración de aceite esencial de
tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Escherichia coli. ............ 61
Gráfica 4.16 Gráfica de valores individuales: concentración de aceite esencial de
tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Staphylococcus aureus. .. 62
Gráfica 4.17 Gráfica de valores individuales: concentración de aceite esencial de
tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Candida albicans. .......... 64
Gráfica 4.18 Gráfica de intervalos. Prueba de Tukey concentración de aceite esencial
de tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Candida albicans. ..... 64
Gráfica 4.19 Gráfica de valores individuales: concentración de aceite esencial de
tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Pseudomonas aeruginosa
........................................................................................................................................ 66
Gráfica 4.20 Gráfica de intervalos. Prueba de Tukey concentración de aceite esencial
de tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Pseudomonas
aeruginosa ..................................................................................................................... 66
XI
Gráfica 4.21 Gráfica de valores individuales: concentración de aceite esencial de
tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Escherichia coli. ............ 67
Gráfica 4.22 Gráfica de valores individuales: concentración de aceite esencial de
tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Staphylococcus aureus .. 69
Gráfica 4.23 Gráfica de intervalos. Prueba de Tukey concentración de aceite esencial
de tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Staphylococcus aureus
........................................................................................................................................ 69
Gráfica 4.24 Gráfica de valores individuales: concentración de aceite esencial de
tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Candida albicans. .......... 71
Gráfica 4.25 Gráfica de intervalos. Prueba de Tukey concentración de aceite esencial
de tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Candida albicans ..... 71
Gráfica 4.26 Gráfica de valores individuales: concentración de aceite esencial de
tomillo y mezcla de parabenos, y tiempo de análisis vs Reducción logarítmica de
Pseudomonas aeruginosa. .............................................................................................. 72
Gráfica 4.27 Gráfica de valores individuales: concentración de aceite esencial de
tomillo y mezcla de parabenos, y tiempo de análisis vs Reducción logarítmica de
Escherichia coli.. ............................................................................................................ 73
Gráfica 4.28 Gráfica de valores individuales: concentración de aceite esencial de
tomillo y mezcla de parabenos, y tiempo de análisis vs Reducción logarítmica de
Staphylococcus aureus ................................................................................................... 74
Gráfica 4.29 Gráfica de valores individuales: concentración de aceite esencial de
tomillo y mezcla de parabenos, y tiempo de análisis vs Reducción logarítmica de
Candida albicans. ........................................................................................................... 75
XII
Índice de Tablas
Tabla 2.1 Conservantes utilizados habitualmente en productos farmacéuticos y
cosméticos ..................................................................................................................... 8-9
Tabla 2.2 Características de los microorganismos de prueba. Prueba de eficacia
antimicrobiana USP-36 ............................................................................................... 9-11
Tabla 2.3 Categorías de productos Farmacopeicos ...................................................... 11
Tabla 2.4 Criterios para microorganismos evaluados. Prueba de eficacia antimicrobiana
(USP-36). ................................................................................................................... 11-12
Tabla 2.5 Características botánicas del tomillo ............................................................ 13
Tabla 2.6 Concentración mínima inhibitoria para diferentes microorganismos de
acuerdo a estudios investigativos. .................................................................................. 15
Tabla 2.7 Componentes de las emulsiones. ................................................................... 16
Tabla 2.8 Parámetros de referencia del estudio de estabilidad. ..................................... 17
Tabla 3.1 Diseño experimental: Relación función y tipo de factor. .............................. 23
Tabla 3.2 Diseño factorial: dos factores y dos niveles ................................................. 23
Tabla 3.3 Tratamientos experimentales ........................................................................ 23
Tabla 3.4 Microorganismos de prueba ......................................................................... 24
Tabla 3.5 Concentración de aceite esencial de tomillo ................................................ 24
Tabla 3.6 Tratamientos experimentales ....................................................................... 24
Tabla 3.7 Condiciones del estudio de estabilidad ........................................................ 25
Tabla 3.8 Operacionalización de variables ................................................................... 25
Tabla 3.9 Análisis de calidad organoléptica y fisicoquímica para el aceite esencial de
tomillo (Thymus vulgaris L.) .......................................................................................... 25
Tabla 3.10 Condiciones de cultivo para la preparación de inóculos ............................ 32
Tabla 3.11 Test de eficacia del preservante ............................................................. 33-34
Tabla 3.12 Decodificación ANOVA de un solo factor ................................................ 36
Tabla 3.13 Decodificación ANOVA de dos factores ................................................... 37
Tabla 4.1 Análisis físico y organoléptico del aceite esencial Thymus vulgaris L) ....... 38
Tabla 4.2 Resultado de las reacciones de coloración del aceite esencial de (Thymus
vulgaris L.) ................................................................................................................ 38-39
Tabla 4.3 Cromatografía en capa fina del aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris
L.) ................................................................................................................................... 39
Tabla 4.4 Formulación de la emulsión o/w (loción) ................................................. 40-41
Tabla 4.5 Ensayo fisicoquímico de la formulaciones desarrolladas de una emulsión o/w
(loción). .......................................................................................................................... 41
Tabla 4.6 Resultado de los ensayos fisicoquímico de la formulaciones desarrolladas de
una emulsión o/w (loción). ............................................................................................. 42
Tabla 4.7 Resultado de las características fisicoquímicas y organolépticas del producto
terminado. ....................................................................................................................... 43
Tabla 4.8 Aptitud del método de recuento en presencia del producto: Recuento total de
microorganismos aerobios (RTMA) ............................................................................... 44
Tabla 4.9 Recuento total de microorganismos aerobios (RTMA) en el producto ........ 45
XIII
Tabla 4.10 Aptitud del método de recuento en presencia del producto: Recuento total
de levaduras (RTL) ......................................................................................................... 45
Tabla 4.11 Recuento total de levaduras (RTL) en el producto ...................................... 45
Tabla 4.12 Descripción de las formulaciones desarrolladas. ........................................ 46
Tabla 4.13 Intervalos de comprobación de supervivencia de los microorganismos
ATCC, USP-36 ............................................................................................................... 46
Tabla 4.14 Contaje microbiano (Ufc/ml) y reducción logarítmica del análisis 1 al
intervalo de tiempo T0 y T14 ......................................................................................... 47
Tabla 4.15 Contaje microbiano (Ufc/ml) y reducción logarítmica del análisis 1 al
intervalo de tiempo T28.................................................................................................. 48
Tabla 4.16 Contaje microbiano (Ufc/ml) y reducción logarítmica del análisis 2 al
intervalo de tiempo T0 y T14 ......................................................................................... 49
Tabla 4.17 Contaje microbiano (Ufc/ml) y reducción logarítmica del análisis 2 al
intervalo de tiempo T28.................................................................................................. 50
Tabla 4.18 Reducción logarítmica. Análisis 1 y análisis 2 ............................................ 51
Tabla 4.19 Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Pseudomonas
aeruginosa ..................................................................................................................... 60
Tabla 4.20 Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Escherichia coli ....... 61
Tabla 4.21 Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Staphylococcus aureus
........................................................................................................................................ 62
Tabla 4.22 Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Candida albicans ..... 63
Tabla 4.23 Prueba de Tukey para reducción logarítmica de Candida albicans. .......... 63
Tabla 4.24 Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Pseudomonas
aeruginosa. Análisis 2 .................................................................................................... 65
Tabla 4.25 Prueba de Tukey para reducción logarítmica de Pseudomonas aeruginosa
........................................................................................................................................ 65
Tabla 4.26 Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Escherichia coli.
Análisis………………………………………………………………………………...67
Tabla 4.27 Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Staphylococcus aureus.
Análisis 2. ...................................................................................................................... 68
Tabla 4.28 Prueba de Tukey para reducción logarítmica de Staphylococcus aureus .... 68
Tabla 4.29 Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Candida albicans ..... 70
Tabla 4.30 Prueba de Tukey para reducción logarítmica de Candida
albicans…………………………………………………………………………………………..70
Tabla 4.31 Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Pseudomonas
aeruginosa ..................................................................................................................... 72
Tabla 4.32 Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Escherichia coli ........ 73
Tabla 4.33 Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Staphylococcus
aureus………………………………………………….…………………………….…74
Tabla 4.34 Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Candida albicans ..... 75
XIV
Índice de Anexos
Anexo 1 Ficha técnica del aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris L.). ................. 82
Anexo 2 Control de calidad en el producto final ........................................................... 83
Anexo 3 Control organoléptico y fisicoquímico del producto terminado (loción de tipo
emulsión o/w) de uso tópico. ..................................................................................... 84-85
Anexo 4 Prueba de eficacia antimicrobiana. Test de efectividad del preservante en el
producto final (emulsión O/W de uso tópico). Método USP-36 ............................... 86-87
XV
TÍTULO:
Eficacia antimicrobiana del aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.) como
conservante en una emulsión o/w de uso tópico.
AUTOR: Guerrero Rivadeneira Yéssica Patricia
TUTOR: Mgs Dayana Paulina Borja Espín
Resumen
Los cosméticos y productos farmacéuticos requieren conservantes antimicrobianos que
sean capaces de reducir la proliferación microbiana a niveles aceptables durante el
tiempo de vida útil del producto; es importante la investigación de conservantes de
origen natural, como sustitutos de los sintéticos, siempre y cuando tengan por lo menos
la misma eficacia antimicrobiana, y presenten un menor riesgo para la salud.
El presente trabajo de investigación, tuvo como objetivo determinar la eficacia
antimicrobiana del aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.) como conservante
en una emulsión o/w de uso tópico.
La eficacia antimicrobiana del aceite esencial, se ensayó en la emulsión o/w a 3
concentraciones: 0,5%, 1,0% y 1,5%, usando como organismos de prueba Escherichia
coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Candida albicans. Además se
comparó su eficacia frente a la combinación de metilparabeno (0,18%) y
propilparabeno (0,02%).
Los resultados demostraron que el aceite esencial de tomillo en las concentraciones
estudiadas, redujo el crecimiento de los microorganismos de prueba, cumpliendo con
los criterios de aceptación USP-36 para productos de categoría 2. Además mediante el
estudio de estabilidad microbiológica acelerada, se determinó que a una concentración
del 1,5%, se mantiene su comportamiento antimicrobiano durante el tiempo de estudio.
Mostrando una mejor eficacia antimicrobiana que la combinación de parabenos.
PALABRA CLAVES
CONSERVANTE, PARABENOS, ACEITE ESENCIAL, THYMUS VULGARIS L.,
ANTIMICROBIANO.
XVI
Abstract
The Cosmetics and pharmaceuticals products requires antimicrobial preservatives that
are capable of reducing microbial proliferation to acceptable levels over the shelf life of
the product. It is important to investigate preservatives of natural origin, as substitutes
for synthetics. As long as they have at least the same antimicrobial efficacy, and present
a lower health risk.
The present research work, it took as a target to determine the antimicrobial efficacy of
the essential oil of the thyme (Thymus vulgaris L.) as a preservative in an emulsion o/w
for a topical use.
The antimicrobial efficacy of the essential oil was tested in the o/w emulsion at 3
concentrations: 0.5%, 1.0% and 1.5%, using as test organisms such as Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus and Candida albicans. It has also
been proven effective against the combination of methylparaben (0.18%) and
propylparaben (0.02%).
The results showed that the essential oil of thyme in the concentrations studied, reduced
the growth of micro-organisms of trial,fulfilling with the criteria of USP-36 for
products of category 2. Also through the study of accelerated microbiological stability
,it was determined that at a concentration of 1.5%, it maintains its behavior
antimicrobial during the study period. Showing a better antimicrobial effectiveness that
the combination of parabens.
Keywords
PRESERVATIVE, PARABENS, ESSENTIAL OIL, THYMUS VULGARIS L.,
ANTIMICROBIAL.
1
INTRODUCCIÓN
La adición de conservantes en productos farmacéuticos y cosméticos es esencial
para evitar la alteración y degradación por microorganismos durante su
almacenamiento, además ayudan a proteger el producto contra la contaminación
accidental por parte del consumidor durante su uso, siendo los conservantes
sintéticos los más empleados. Sin embargo en los últimos años se ha incrementado
el interés investigativo de varias especies vegetales debido a su alto contenido de
agentes antimicrobianos tales como polifenoles es decir, flavonoides, taninos y
alcaloides presentes en los aceites esenciales.
Independientemente de las propiedades sensoriales de los aceites esenciales, su
actividad antimicrobiana y antifúngica genera un campo prometedor de aplicación
como conservantes en cosméticos y productos farmacéuticos. Llevándose a cabo
varios estudios en condiciones in vitro, que evidencia la actividad antimicrobiana de
los extractos y aceites esenciales de varias especies vegetales. (Olivares Cruz, 2013)
El propósito de este trabajo investigativo es determinar la eficacia antimicrobiana
del aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.) como conservante en una
emulsión o/w de uso tópico mediante la prueba de eficacia antimicrobiana
establecida en la USP 36- NF 30, en la cual se determinará mediante el
procedimiento de recuento en placa el número de unidades formadoras de colonia
(ufc) presentes en cada preparación de prueba, en los intervalos de tiempo
correspondiente (14 y 28 días), expresando los cambios en términos de reducciones
logarítmicas.
La investigación consta de 5 capítulos: el primer capítulo contiene el
planteamiento, formulación, justificación e importancia del problema, además de los
objetivos del estudio.
En el segundo capítulo se detalla la hipótesis nula y alternativa planteada para
dicha investigación, además de la base teórica necesaria para llevar a cabo el
estudio.
En el tercer capítulo se describe la metodología utilizada durante el desarrollo de
la presente investigación, para lo cual se da a conocer las técnicas y métodos usados;
además del diseño experimental a aplicarse. En el cuarto capítulo se presenta el
análisis y discusiones de los resultados. Finalmente en el capítulo cinco se describen
las conclusiones más relevantes de la investigación acorde a los objetivos
establecidos y las recomendaciones.
2
Capítulo I
El problema
Planteamiento del problema
La mayoría de productos farmacéuticos, cosméticos y fórmulas magistrales deben
estar debidamente conservados, principalmente aquellos que contienen agua en su
formulación ya que son más propensos a contaminarse con microorganismos, llevando
a un deterioro del producto, pérdida de rendimiento del mismo y posiblemente
irritación, infecciones u otras reacciones adversas que afecten la salud del consumidor.
Los conservantes se incorporan principalmente para reducir la contaminación
microbiana del producto, evitando su deterioro y asegurando que el producto siga
siendo adecuado y seguro durante su vida útil.
Dentro de los conservantes más utilizados a nivel farmacéutico y cosmético están los
conservantes sintéticos principalmente los parabenos, los cuales han generado dudas
importantes sobre su seguridad. A pesar de estar presentes en mínimas concentraciones
en los productos cosméticos y farmacéuticos, en comparación con los otros excipientes,
son fácilmente absorbidos por el cuerpo y pueden entrar en el torrente sanguíneo
después de ser aplicado tópicamente a la piel. (Díaz & Asencios, 2008). Tanto el
metilparabeno como el propilparabeno pueden ser irritantes para la piel, los ojos y las
membranas mucosas. (Raymond C Rowe, Paul J Sheskey, Marian E Quinn, 2009).
Debido a estos posibles efectos irritantes, alérgicos y dañinos, que ponen en riesgo
el bienestar del consumidor, es importante el estudio de conservantes naturales como
alternativa para reemplazar los conservantes sintéticos. A partir de lo anterior, una de
las líneas de investigación se ha centrado en los aceites esenciales por sus propiedades
antimicrobianas y antimicóticas.
Estos aceites esenciales pueden provenir de especias y hierbas como el orégano
(género Origanum), romero (Rosmarinus officinalis), menta (Mentha piperita), tomillo
(Thymus vulgaris L.), etc, Existen múltiples reportes que demuestran la actividad
antimicrobiana del aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.) frente a
Propionibacterium acnes, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus con una
concentración mínima inhibitoria de 600 ppm, 200ppm y 500ppm respectivamente,
alcanzando la más baja concentración mínima inhibitoria en relación a otras hierbas en
estudio. (Prestes, 2008) Otros estudios mencionan que el tomillo al ser una fuente de
moléculas timol y carvacrol que constituyen 40 a 50 % del aceite esencial, presenta
actividad antimicótica principalmente contra Cryptococcus neoformans y especies de
Candida, Aspergillus, Saprolegnia y Zygorhynchus. (Mesa Arango, 2004).
3
Estos estudios han podido mostrar la eficacia antibacteriana del aceite esencial del
tomillo (Thymus vulgaris L.), además es importante mencionar que en investigaciones
sobre la irritabilidad/ corrosión dérmica realizadas con el aceite esencial al 1% en
conejos, no mostró algún signo de toxicidad. (Carlos Andrés Coy Barrera, Gema
Eunice Acosta, 2013).
Formulación del problema
¿Es el aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.) eficaz como conservante en
una emulsión o/w de uso tópico, demostrando su eficacia antimicrobiana?
Objetivos de la investigación.
Objetivo General.
Determinar la eficacia antimicrobiana del aceite esencial del tomillo (Thymus
vulgaris L.) como conservante en una emulsión o/w de uso tópico.
Objetivos Específicos.
Desarrollar una formulación (emulsión o/w) que presente las mejores
características organolépticas, químicas y físicas.
Realizar la prueba de eficacia antimicrobiana. Test de efectividad del
preservante (Método USP-36) en una emulsión o/w de uso tópico, usando
como conservantes una mezcla de parabenos y aceite esencial de tomillo a
concentraciones del 0,5%, 1,0% y 1,5%.
Efectuar el estudio de estabilidad microbiológica acelerada en el producto
final (emulsión o/w usando como conservante aceite esencial de tomillo)
sometiéndola a condiciones de temperatura y humedad relativa de acuerdo a
la zona climática IVb.
Importancia y justificación de la investigación
En la actualidad la demanda de productos cosméticos se ha incrementado a nivel de
nuestro país y de todo el mundo, convirtiéndose en una necesidad estética, preventiva y
curativa; conllevando a una creciente preocupación en torno a las sustancias químicas
que están presentes en estos productos, ya que pueden estar relacionados con ciertos
problemas de salud, irritación, alergias, daños cutáneos e infecciones, dentro de estas
posibles sustancias agresivas están los conservantes antimicrobianos sintéticos que
pueden provocar aberraciones cromosómicas y estimular el crecimiento de células
tumorales. (Raymond C Rowe, Paul J Sheskey, Marian E Quinn, 2009).
Debido a esto la seguridad y calidad de los cosméticos y productos farmacéuticos,
son puntos de gran importancia para la salud de la población. La seguridad de dichos
productos está relacionada con su calidad microbiológica, que depende del
4
cumplimiento de las normas de buenas prácticas de manufactura y la eficacia de los
conservantes incorporados en su formulación. Si el sistema conservante no es el
apropiado se pueden producir alteraciones indeseadas en el producto, alterando sus
características organolépticas como aspecto, olor, e incluso se pueden inactivar drogas
activas dando lugar a un producto ineficaz e inseguro. (Eurofins, 2008)
Estas causas han llevado a evaluar la capacidad antimicrobiana de productos
naturales, de varias especies vegetales. Siendo Thymus vulgaris L. una de las plantas
más estudiada, con numerosas publicaciones que hacen referencia especialmente a su
aceite esencial (AE), debido a sus propiedades antimicrobianas, siendo activo frente a
bacterias Gram positivas y Gram negativas, fungistático y funguicida. En cuanto a su
toxicidad a nivel dérmico no se ha mostrado investigaciones que comprueben la
generación de reacciones alérgicas, irritaciones e hipersensibilidad.
5
Capítulo II
Marco teórico
Antecedentes de la investigación
Entre los conservantes más utilizados en una amplia gama de productos cosméticos,
preparaciones farmacéuticas están los parabenos otorgándole el segundo puesto dentro
de los ingredientes más comunes en las formulaciones cosméticas, siendo superados
únicamente por el agua, según la FDA (Food and Drug Administration).
A pesar de que los parabenos son utilizados como conservantes en múltiples
productos, se ha puesto en duda su “no toxicidad” debido a que investigaciones sobre
los posibles riesgos que puede generar los parabenos, como por ejemplo en el año 2004
oncólogos en la University of Reading, en Edimburgo llevaron a cabo estudios con
tejidos cancerígenos en el cual el 90% de las muestras analizadas que venían de
biopsias realizadas a mujeres con cáncer de mama, se habían encontrado rastros de
parabenos, sin embargo al realizarse más estudios sobre lo mismo, éstos no arrojaron
ninguna conclusión que estableciera de qué manera los parabenos afectan en el cáncer
de mama, pero algunos de los científicos afirman que los parabenos simulan la acción
de los estrógenos (hormona femenina que sí puede llegar a producir cáncer de mama ) y
eso podría ser lo que contribuye a la formación de tumores cancerígenos. También se le
atribuye reacciones alérgicas, sensibilización, generación del envejecimiento prematuro
según lo informado por live-naturally.co.uk, investigadores de la Kyoto Prefectural
University of Medicine en Japón, que encontraron que el metilparabeno aumenta la
sensibilidad a los daños causados por el sol, es decir, cuando se expone a los rayos
ultravioleta, las células de la piel mueren a un ritmo mucho más rápido de lo normal.
(Nungaray, 2014). Es importante establecer que existe mucha controversia sobre sus
posibles riesgos, ya que por lo general se lo ha caracterizado por ser un conservante “no
tóxico” , debido a que se lo utiliza a una baja concentración, generalmente se formulan
los parabenos a una concentración de (0,1-0,3%).(Blanca Díaz Ley, 2006 ).
Todos los problemas vinculados a estas sustancias han permitido llevar a cabo una
serie de investigaciones que evalúen la actividad antimicrobiana de especies vegetales
como por ejemplo Thymus vulgaris L. conocido comúnmente como tomillo, que
pueda ser utilizado como conservante antimicrobiano natural. En un estudio realizado
en el 2015 sobre el aceite esencial de Thymus vulgaris L. (tomillo) combinado con
EDTA contra Candida albicans, en una crema contenida con el AE suplementado con
derivados terpénicos naturales, determinaron que dicho aceite esencial presentó
actividad inhibitoria sobre Candida albicans a una concentración de 100 mg/mL, con
halos de inhibición de 30,33 ± 0,58 mm, mientras que la adición de EDTA produjo
halos de 35,33 ± 0,58 mm, incrementando su actividad. La
6
concentración mínima inhibitoria para el AE y AE + EDTA fue de 8 mg/mL y 0,5
mg/mL. (Juan Rojas Armas, 2015).
Actividad antibacteriana y determinación de la composición química de los aceites
esenciales de romero (Rosmarinus officinalis), tomillo (Thymus vulgaris L.) y cúrcuma
(Curcuma longa) de Colombia, Dr. C. Carlos Andrés Coy Barrera, MSc. Gema Eunice
Acosta, 2013. En este estudio se determinó que en el aceite de tomillo, de los 30
componentes encontrados, 43 % corresponden a monoterpenos no oxigenados, 40 % a
monoterpenos oxigenados y porcentajes más pequeños a compuestos de tipo
sesquiterpeno, a los cuales se le atribuye la capacidad antimicrobiana que presenta. En
la evaluación de la actividad antibacteriana frente a la cepa de S. aureus, se pueden
observar porcentajes de inhibición de 70 %, con respecto a E. faecalis, otra bacteria
grampositivas 20 %, sin embargo no presentan porcentajes de inhibición
representativos frente a las cepas gramnegativas E. coli y S. typhi.
Actividad de extractos de orégano y tomillo frente a microorganismos asociados con
otitis externa, Luciana de Souza Prestes, Ricardo Frascolla, Rosema Santin, Marco
Aurelio Ziemann dos Santos; Renata Costa Schram, Maria Regina Alves Rodrigues,
Luiz Filipe Damé Schuch, Mario Carlos Araújo Meireles, 2008. Se evaluaron la
actividad antimicrobiana in vitro de 3 tipos de extractos de las plantas Origanum
vulgare L. (orégano) y Thymus vulgaris L. (tomillo), un aceite, una tintura y una
decocción, frente a microorganismos asociados con esa enfermedad, teniendo como
resultado que para el aceite de tomillo la CIM fue > 2,0 % para P. aeruginosa y para
Staphylococcus aureus 0,25 %.
Fundamentación teórica
Presencia y análisis de microorganismos en productos farmacéuticos y
cosméticos.
La contaminación microbiana de los productos farmacéuticos y cosméticos ha sido
extensamente estudiada. Existen formas farmacéuticas que deben ser estériles y otras
no obligatoriamente estériles que se usan por vía oral, tópica, nasal, vaginal, etc,
fabricadas con ingredientes que pueden ser substratos adecuados para los
microorganismos. Las preparaciones farmacéuticas y los cosméticos pueden
contaminarse con hongos filamentosos, levaduras y bacterias. Las materias primas
naturales, el equipamiento, el agua, los operadores, el aire, y el material de empaque
pueden ser fuentes de contaminación de dichos productos. La presencia de
microorganismos puede alterar la calidad, eficacia y seguridad del producto.
La U.S. Food and Drug Administration (FDA) reconoce tres categorías de
microorganismos: patógenos, oportunistas y objetables:
- Patógenos son aquellos microorganismos o toxinas responsables de enfermar
o infectar al hombre (Salmonella spp, Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Clostridium spp, etc).
7
- Se consideran oportunistas a aquellos microorganismos que producen
enfermedad en pacientes inmunocomprometidos y;
- son objetables aquellos microorganismos que pueden inactivar drogas activas
y/o deteriorar el producto provocando una posible falta de eficacia de los
productos farmacéuticos y seguridad en cosméticos. (Salk , 2016)
El producto debe llegar al consumidor con un contenido bajo o nulo de
microorganismos; para conseguir este objetivo se utilizan tres procedimientos: control
microbiológico de las materias primas (con especial atención al agua), buena higiene en
la fabricación y envasado, y utilización de conservantes. Los tres son necesarios y
complementarios. (Elsevier, 2008).
La contaminación microbiana en los productos cosméticos es de gran importancia
para la industria ya que además de generar el deterioro del producto y pérdidas
económicas puede convertirse en un producto peligroso para el consumidor. Para lo
cual la séptima modificación de la Directiva cosmética efectiva en marzo de 2005,
aprobó e incorporó un nuevo concepto basado en los criterios microbiológicos: el
PAO (Period After Opening).
El PAO es el periodo después de que el producto ha sido abierto y utilizado por
primera vez, el cual especifica el tiempo en que el producto cosmético se puede utilizar
sin ningún deterioro vinculado a la contaminación microbiana que pueda perjudicar la
salud del consumidor. El requisito PAO no es relevante cuando no hay riesgo de
deterioro microbiano (es decir, en el caso de recipientes a presión reducida o productos
de un solo uso). (Orus, 2005)
El PAO aparece tanto en el envase primario como secundario del producto,
indicando el tiempo de vida útil por un número seguido de la letra "M" que significa
meses, que puede aparecer en o junto al símbolo del recipiente abierto. (Europe)
Ilustración 2.1 Period after Opening (PAO)
Por: Cosmetics Europe
8
Calidad microbiológica en medicamentos.
Es importante realizar en los productos farmacéuticos (medicamentos) un
seguimiento del contenido de conservante antimicrobiano, por lo menos al principio y
al final del período de vida útil estipulado para el medicamento. Conjuntamente con
esta evaluación se puede efectuar la prueba de desafío microbiológico (ensayo de la
USP sobre la eficacia antimicrobiana de los agentes de conservación), la que es
aplicable a recipientes no abiertos. (Ministerio de la Protección Social, 2009)
Conservantes.
Los conservantes antimicrobianos son sustancias añadidas a los productos
farmacéuticos y cosméticos, para protegerlos del desarrollo microbiano o de
microorganismos que se introducen sin ser advertidos durante el proceso de fabricación
o después de este, ya que dichos productos son una fuente excelente de nutrientes para
bacterias, hongos y levaduras. Sin embargo, es todo un reto, encontrar el tipo de
conservante o sistema conservante adecuado a incorporar en cada fórmula, que
satisfaga todo criterio de conservación y seguridad toxicológica.
Se debe considerar que la concentración del conservante que se indique como eficaz
en el producto final debe ser inferior al nivel que pueda resultar toxico para el
consumidor, por lo que la concentración del conservante puede mantenerse al mínimo
si los ingredientes activos de la formulación poseen eficacia antimicrobiana intrínseca.
Hay que considerar que los conservantes antimicrobianos no deben emplearse en lugar
de las buenas prácticas de manufactura o simplemente para disminuir la población
microbiana. (USP-36, Pruebas microbiológicas. <51>Prueba de eficacia
antimicrobiana, 2013)
Tipos de conservantes.
En la tabla 2.1 pueden observarse los agentes antimicrobianos, utilizados como
conservantes en las formulaciones farmacéuticas y cosméticas, siendo los parabenos los
más utilizados.
Tabla 2.1 Conservantes utilizados habitualmente en productos farmacéuticos y
cosméticos.
9
Por: (Aulton M. , 2004)
Selección del conservante.
El conservante ideal debe ser compatible con los componentes de la formulación y
envasado, no producir ninguna reacción de sensibilización, ser irritante o toxico;
además debe sea resistente a condiciones extremas de pH y temperatura. Al ser la fase
acuosa la más susceptible de contaminación microbiana, el conservante debe ser capaz
de alcanzar una concentración protectora en dicha fase, asimismo no debe alterar las
características organolépticos del producto al cual se ha incorporado.
Análisis de eficacia de los conservantes.
Microorganismos de prueba.
Los microorganismos contaminantes más comunes investigados en productos
farmacéuticos y cosméticos son las bacterias Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa y Staphylococcus aureus (utilizadas para analizar todo los tipos de
productos en el análisis de la USP), junto a los hongos Candida albicans y Aspergillus
niger; que son microorganismos patógenos.
Tabla 2.2 Características de los microorganismos de prueba. Prueba de eficacia
antimicrobiana USP-36
MICROORGANISMO CARACTERÍSTICAS
Pseudomonas aeruginosa -Bacilo gram negativo
-No fermentador
-Oxidasa positivo
-Fuente de contaminación: Sistemas de purificación de
agua donde forman biofilms, en cañerías y otras
10
superficies inertes como acero inoxidable de equipos y
mesadas.
-Afecta mayoritariamente a individuos
inmunocomprometidos produciendo infecciones
externas y leves a nivel de oído o folículo pilosos o bien
infecciones internas o graves, afectando los pulmones,
torrente sanguíneo, o válvulas cardiacas. (Larry M.
Bush)
Escherichia coli - Bacilo gram negativo.
-Fermentador de glucosa
-Bacteria ubicua de una gran variedad de ecosistemas
incluida el tracto gastrointestinal del ser humano y de los
animales de sangre caliente.
-Se asocian con muchos tipos de infecciones como
abscesos, neumonía, meningitis, septicemia e
infecciones intestinales, urinarias y heridas. (Vila
Estapé, 2011)
-Su presencia en un producto farmacéutico implicaría
presencia de contaminación fecal en especial de
productos de consumo oral y en materias primas de
origen natural.
Staphylococcus aureus -Coco gram positivo en forma de racimo.
-Catalasa y coagulasa positivo
-Microorganismo ubicuo que puede colonizar la
nasofaringe, la piel y las mucosas de hombres y
animales, y puede establecerse en un medio ambiente
propicio.
-Produce infecciones agudas, piogénicas, osteomielitis,
neumonía, endocarditis aguda, síndrome del shock
tóxico, síndrome de piel escaldada entre otros. (Seija)
-Presencia de este microrganismo en una materia prima
o producto farmacéutico o cosmético indica que la
fuente de contaminación puede ser de origen humano, es
decir de los operadores.
Candida albicans -Hongo dimórfico, es decir que se desarrolla de forma
distinta en función de la temperatura, como levadura,
normalmente a 37ºC en el huésped, y como hongo de
aspecto filamentoso, a 25ºC en la naturaleza.
-Pertenece al filo Ascomycota y se reproduce de forma
asexual por gemación.
-Los reservorios más importantes son el tracto digestivo
y respiratorio, mucosa genital y superficies húmedas.
11
-Puede producir infecciones superficiales que afectan a
piel, uñas y mucosas. (Berkhout, 2002)
Elaborado por: la autora
Prueba de eficacia antimicrobiana.
El principio fundamental del análisis de los conservantes consiste en inocular
envases separados del producto con concentraciones conocida (1x105 y 1x10
6 ufc/mL
de producto) de los microorganismos de prueba, a continuación tomar muestras de cada
envase en intervalos de tiempo especificados en la tabla 2.4 de acuerdo a la categoría
del producto (ver tabla 2.3) y determinar la proporción del inóculo que sobrevive,
mediante el recuento en placa. Empleando las concentraciones calculadas de ufc/mL
presentes al inicio de la prueba, se calcula el cambio en valores en log10 de la
concentración de ufc/ml en los intervalos de prueba correspondientes y se expresan los
cambios en términos de reducción logarítmica, los cuales son comparados con los
criterios para microorganismos evaluados especificados en la tabla 2.4. (USP-36,
Pruebas microbiológicas. <51>Prueba de eficacia antimicrobiana, 2013)
Tabla 2.3 Categorías de productos Farmacopeicos
Categoría Descripción del Producto
1 Inyectables, otros parenterales incluyendo emulsiones,
productos óticos, productos nasales estériles y productos
oftálmicos preparados con bases o vehículos acuosos.
2 Productos empleados de manera tópica preparados con bases o
vehículos acuosos, productos nasales no estériles y emulsiones,
incluyendo aquellos que se aplican a membranas mucosas.
3 Productos orales a excepción de antiácidos, preparados con
bases o vehículos acuosos.
4 Antiácidos preparados con una base acuosa.
Por: (USP-36, Pruebas microbiológicas. <51>Prueba de eficacia antimicrobiana, 2013)
Tabla 2.4 Criterios para microorganismos evaluados. Prueba de eficacia antimicrobiana
(USP)
En productos de la categoría 1
Bacterias: A los 7 días, una reducción logarítmica de no
menos de 1,0 desde el recuento calculado en
el inicio; a los 14 días, una reducción
logarítmica de no menos de 3,0 del recuento
inicial; y a los 28 días ningún incremento del
recuentro de los 14 días.
12
Levaduras y Hongos
filamentosos:
Ningún incremento a los 7,14 y 28 días
respecto del recuento inicial.
En productos de la categoría 2
Bacterias: A los 14 días, una reducción logarítmica de no
menos de 2,0 desde el recuento calculado en
el inicio; y a los 28 días ningún incremento
del recuentro de los 14 días.
Levaduras y Hongos
filamentosos:
Ningún incremento a los 14 y 28 días respecto
del recuento inicial.
En productos de la categoría 3
Bacterias: A los 14 días, una reducción logarítmica de no
menos de 1,0 desde el recuento calculado en
el inicio; y a los 28 días ningún incremento
del recuentro de los 14 días.
Levaduras y Hongos
filamentosos:
Ningún incremento a los 14 y 28 días respecto
del recuento inicial.
En productos de la categoría 4
Levaduras y Hongos
filamentosos:
Ningún incremento a los 14 y 28 días respecto
del recuento inicial.
Por: (USP-36, Pruebas microbiológicas. <51>Prueba de eficacia antimicrobiana, 2013)
Aceites esenciales.
Características de los aceites esenciales.
Los aceites esenciales son productos de intenso olor que se extraen de plantas
aromáticas, son solubles en alcoholes y disolventes orgánicos (éter, cloroformo) y muy
poco solubles en agua, pero son arrastrables por el vapor de agua. Son importantes en la
industria alimenticia, farmacéutica y cosmética. (Martínez , 2003)
Muchos de ellos poseen propiedades terapéuticas como antimicrobianas, en donde la
inactivación microbiana de los aceites esenciales es causada por daño en la pared
celular de los microorganismos, desórdenes en la membrana citoplasmática,
agotamiento de la fuerzas motrices de los protones, coagulación de los contenidos
celulares o alteración en el flujo de electrones, en el flujo del contenido celular y en el
transporte activo.
Factores que afectan la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales.
El espectro de actividad antimicrobiana de los aceites esenciales depende en gran
medida de los microorganismos a inhibir, ya que los microorganismos difieren en su
13
resistencia. Además, cuando el aceite es incluido en un alimento, cosmético,
medicamento, este puede interactuar aumentando o disminuyendo la capacidad
antimicrobiana y la eficacia del aceite esencial. Algunos factores intrínsecos y
extrínsecos están asociados con la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales.
Estos incluyen temperatura, pH, potencial de óxido-reducción y actividad de agua.
(Portocarrero, 2009).
Especie vegetal.
Descripción botánica del tomillo.
Clasificación científica:
REINO: Plantae
DIVISIÓN: Magnoliophyta
CLASE: Magnoliopsida
ORDEN: Lamiales
FAMILIA: Lamiaceae
GÉNERO: Thymus
Tabla 2.5 Características botánicas del tomillo
ESTRUCTURA CARACTERISTICA
Altura 15 a 30 cm
Tallo Ascendentes, cuadrangulares, de color grisáceo o pardo
purpúreo
Hojas Opuestas, lineal lanceoladas, bordes arrollados,
brevemente pecioladas o sentadas, de color verde grisáceo.
Flores Diminutas, agrupadas en racimos terminales muy densas,
rosadas o blanquecinas.
Por: (Gimeno Gasca, 2001)
Composición química.
La planta de tomillo (Thymus vulgaris L.) está constituido entre el 0,8 al 2,5 % de
aceite esencial; este rendimiento porcentual varía de acuerdo al método de extracción,
época de recolección de la planta, sección utilizada, entre otros factores. El aceite
esencial está formado por el 40% de timol, 15-50% de p-cimeno, 11-15% de alcanfor,
2.5-14.6% de carvacrol, 45% de linalol, 3% de 1,8-cineol, 1-5% de γ-terpineno.
Ilustración 2.2 Planta de tomillo (Thymus
vulgaris L.)
Por: Alonso, 2004
14
Ilustración 2.3 Componentes principales del aceite esencial de Thymus vulgaris L.
Por: Rojas, 2014, Antibacterial activity of essential oils against pectobacterium
carotovorum subsp. carotovorum
También contiene borneol, acetato de bornilo, acetato de linalino, geraniol, α y β-
pineno, limoneno; flavonoides (timonina, cirsilineol, narnigenina, erodictol, etc);
aminoácidos (isoleucina, cistina, valina, glicina), vitaminas (B1, B2, B3 y vitamina C)
y minerales (calcio, potasio, hierro, magnesio, fósforo, sodio, zinc, selenio). (NaturVall,
2015)
Acción farmacológica.
La acción farmacológica que muestra esta planta es atribuida a su composición
química, siendo utilizada por su actividad antiespasmódica y antitusiva, otorgado por la
presencia de flavonoides y compuestos fenólicos (carvacrol y timolol) las cuales están
presenten en mayor cantidad en el aceite esencial. También presenta actividad
anticatarral, expectorante, antimicrobiana, estimulante del apetito, antiparasitaria,
antihelmíntica, antiséptica, cicatrizante, antioxidante, carminativas, estimulante de
algunas funciones cerebrales, depurativo, entre otros.
Actividad antimicrobiana.
El aceite esencial de tomillo debido a sus componentes fenólicos, timol y carvacrol,
tienen actividad antibacteriana frente a bacterias gram positivas y gram negativas,
actuando sobre la membrana bacteriana; antifúngica frente a Candida albicans,
Aspergillus spp, Cripotococcus neoformans, entre otros y antivírica.
El agente activo del tomillo (Thymus vulgaris L.) es el timol, extraído por la
industria farmacéutica por su acción antimicrobiana y antiviral. Es utilizada en
formulación de diversos enjuagues bucales, pastas de dientes, etc. Así mismo una
disolución de 5% de timol en etanol se utiliza para la desinfección dermal y contra
infecciones con hongos (ALONSO, 2004)
De acuerdo a información bibliográfica el aceite esencial de tomillo está indicado
tópicamente como antibacteriano y antifúngico en lociones, cremas y ungüentos en
concentración de 0.1-1.0%. Además en diversas investigaciones realizadas sobre la
15
actividad antimicrobiana del aceite esencial del tomillo, se han obtenido los siguientes
resultados:
Tabla 2.6 Concentración mínima inhibitoria para diferentes microorganismos de
acuerdo a estudios investigativos.
MICROORGANISMO CMI Cita del articulo
Colletotrichum acutatum duna 350 ppm (Alzate, 2008)
Botrytis cinerea 500 ppm (92,2% de inhibición)
Candida albicans 8 mg/mL (8000ppm)
Salmonella spp 1.56% (analizado como como
bioconservador en carne de
pollo)
(Solís Campoverde, 211)
Hongos 1mg/mL (timol para el control
antifúngico sobre películas de
pintura)
( Bogdan , 2015)
Shigella spp 0,5 %. (Aceite esencial para
descontaminación de lechuga).
(Bagamboula, 2004)
Pseudomonas aeruginosa y
Staphylococcus aureus.
5 % y 1,25% respectivamente
(extracto frente a
microorganismos asociados
con otitis externa)
(Souza Prestes, 2008)
Elaborado por: la autora
Formulación.
Emulsiones.
Es un sistema constituido por dos fases líquidas inmiscibles en forma de gotitas
pequeñas, una fase dispersante, continua o externa y una fase dispersa o interna. La
mayoría de las emulsiones incluye gotitas de 0,1-100 µm de diámetro. Existen dos
tipos fundamentales: de aceite en agua (o/w) y de agua en aceite (w/o), dependiendo de
que la fase continua sea acuosa u oleosa. Además se ha desarrollado emulsiones
múltiples de tipo agua en aceite en agua (w/o/w) donde la fase acuosa se encuentra
entre dos fases oleosas y de tipo aceite en agua en aceite (o/w/o) donde la fase interna y
externa están separadas por una fase oleosa, y tienen interés como sistemas de
administración de fármacos de acción retardada.
Las emulsiones se utilizan principalmente para la aplicación externa. Las emulsiones
semisólidas se denominan cremas y los preparados más fluidos se llaman lociones o, si
están destinadas al masaje cutáneo, linimentos. Existen en ambas modalidades, o/w y
w/o. (Aulton , 2004)
16
Componentes de las emulsiones.
Al ser las emulsiones sistemas inestables, es importante tener un buen conocimiento
de los ingredientes básicos que componen la emulsión, desarrollando formulaciones
estables durante el tiempo de vida útil del producto. A continuación se describe en la
tabla 2.7.
Tabla 2.7 Componentes de las emulsiones.
COMPONENTE CARACTERÍSTICAS
Fase oleosa Constituido por ingredientes no polares.
Generalmente no es compatible con el agua.
Incluye materias primas grasas, aceites y ceras, y todos sus
derivados, incluyendo el alcohol y los ácidos grasos, los
ésteres, los hidrocarburos, los glicéridos y las siliconas
Fase acuosa Parte de la emulsión constituida por el agua y por los demás
materiales hidrofílicos del sistema.
Formada por ingredientes humectantes, como la glicerina o
el propilenglicol; polímeros hidrosolubles, preservantes,
colorantes, electrólitos o ingredientes activos, como extractos
botánicos o proteínas hidrolizadas.
Interface Son los tensioactivos con propiedades emulsionantes,
fundamentales para la formulación ya que aumentan la
estabilidad de las emulsiones, reduce la tensión interfacial entre
la fase acuosa y oleosa y permite obtener una dispersión
homogénea.
Los tensioactivos tienen estructura anfifílica, es decir una
parte polar, soluble en agua (hidrofílica), y una parte no polar,
insoluble en agua (hidrofóbica).
Por: (Santos , 2010)
Contaminación microbiológica de las emulsiones.
La contaminación de las emulsiones por microorganismos puede alterar las
propiedades organolépticas y fisicoquímicas del producto, provocando problemas como
la modificación del color, olor y aspecto, producción de gas, hidrólisis de las grasas y
aceites, alteración del pH en la fase acuosa y separación de fases. A pesar que en
algunos casos no exista signos visibles de contaminación, la emulsión puede contener
bacterias oportunistas, objetables y, si entre ellas se incluyen patógenos, puede
constituir un grave riesgo para la salud. La mayoría de los hongos y muchas bacterias
se incrementan fácilmente a temperatura ambiente en la fase acuosa de una emulsión y
17
también a un intervalo de pH amplio. Algunas especies de bacterias del género
Pseudomonas pueden utilizar como un medio nutritivo algunos componentes de la
formulación como polisorbatos e hidrocarburos alifáticos.
Las emulsiones de aceite en agua (o/w) tienden a ser más susceptibles al deterioro
microbiano que las emulsiones agua en aceite (w/o), ya que la fase externa o continua
es oleosa, actuando como barrera ante la dispersión de los microorganismos a través del
producto; es decir que entre menos agua esté presente en la emulsión, menor será el
crecimiento de microorganismos.
Por tanto, es importante incluir sustancias con actividad antimicrobiana para
prevenir el crecimiento de cualquier microorganismo que pudiera contaminar el
producto y genere un riesgo para la salud. (Aulton , 2004)
Estudios de estabilidad.
El propósito del estudio de estabilidad de los cosméticos según la Asociación
Europea de Cosméticos (COLIPA) es asegurar que un producto nuevo o modificado
cumpla con los estándares físicos, químicos y microbiológicos de calidad, dichos
parámetros también son considerados en el caso de productos farmacéuticos.
Ya sea en tiempo real o bajo condiciones aceleradas, las pruebas en el producto
cosmético y farmacéutico deben realizarse con el fin de asegurar:
Estabilidad y la integridad física de los productos tanto cosméticos como
farmacéuticos en condiciones apropiadas de almacenamiento, transporte y uso.
Estabilidad química.
Estabilidad microbiológica.
Compatibilidad entre el contenido y tipo de envase. (CTFA, 2004)
Tabla 2.8 Parámetros de referencia del estudio de estabilidad.
Tipo de estudio Temperatura (°C) Humedad relativa (%)
Natural (largo plazo) 25±2 60±5
Acelerado 40±2 75±5
Por: Farmacopea Argentina 7ma
edición
Estabilidad acelerada y parámetros de evaluación.
Los ensayos acelerados, son reconocidos como una forma de predecir
aproximadamente el tiempo de validez de un producto. Generalmente, las pruebas se
realizan a una temperatura de 30°C, 40°C o 45°C, durante 1, 2 y 3 meses; acelerando la
velocidad de envejecimiento del producto, y lograr observar cualquier alteración a
18
nivel organoléptico, físico, químico, toxicológico y microbiológico en tiempos
reducido. (CTFA, 2004)
De manera general, los parámetros que deben ser evaluados son los parámetros
organolépticos como el aspecto, color, sabor y olor, cuando sean aplicables; parámetros
físico-químicos como el pH, viscosidad, densidad y en algunos casos evaluación de los
activos o excipientes de la formulación; y parámetros microbiológicos que consta en el
conteo microbiano y prueba de desafío del sistema conservante, en la cual deben ser
conservadas las características microbiológicas, conforme los requisitos especificados.
El cumplimiento de las Buenas Prácticas de Fabricación y los sistemas conservantes
utilizados en la formulación pueden garantizar estas características.
Fundamento Legal
Constitución de la República del Ecuador.
TITULO VII: REGIMEN DEL BUEN VIVIR
Art. 363.- El Estado será responsable de: Garantizar la disponibilidad y acceso a
medicamentos de calidad, seguros y eficaces, regular su comercialización y promover
la producción nacional y la utilización de medicamentos genéricos que respondan a las
necesidades epidemiológicas de la población.
Ley Orgánica de Salud.
Capítulo III: DE LOS MEDICAMENTOS
Art. 154.- El Estado garantizará el acceso y disponibilidad de medicamentos de
calidad y su uso racional, priorizando los intereses de la salud pública sobre los
económicos y comerciales.
Buenas prácticas de manufactura para la industria de productos cosméticos.
Deben adoptarse todas las medidas que aseguren la aplicación y cumplimiento de los
procedimientos e instructivos de cada etapa del proceso de fabricación. En todo
momento deben poder identificarse los equipos, instrumentos, materias primas, material
de envase-empaque, productos de limpieza, documentos, componentes o sustancias
consumidas durante el proceso.
Buenas prácticas de manufactura.
PRIMERA PARTE. Administración de la calidad en la industria farmacéutica
Garantía de calidad.- Es el conjunto de medidas adoptadas con el fin de asegurar que
los productos farmacéuticos sean de la calidad necesaria para el uso al que están
destinados. Por tanto, la garantía de la calidad incorpora las BPM y otros factores,
incluyendo aquellos que van más allá del alcance de esta guía, tales como el diseño y la
elaboración del producto.
19
Secretaría General de la Comunidad Andina (CAN).
RESOLUCIÓN N° 1482
Que mediante Resolución 1418, de fecha 9 de junio de 2011, se dispuso modificar el
artículo 4 y el Anexo I de la Resolución 797 “Reglamento de la Decisión 516 sobre
Control y Vigilancia Sanitaria de Productos Cosméticos”, a fin de incluir parámetros
que especifiquen los límites de contenido microbiológico, de acuerdo con los riesgos de
los productos cosméticos.
Cosmetics - European Commission (Cosing).
ICCR Working Group on Cosmetic Product Preservation: Los consumidores de
productos cosméticos y de cuidado personal están protegidos por fuertes requisitos de
seguridad establecidos en la normativa de cosméticos. Al mismo tiempo, los fabricantes
deben utilizar los mejores conocimientos científicos y de investigación últimos datos
disponibles para demostrar la seguridad de un producto cosmético antes de que se
introduzca en el mercado. Algunos productos cosméticos merecen atención especial por
parte de los reguladores debido a su complejidad científica o de mayor riesgo potencial
para la salud del consumidor.
USP-36
Pruebas microbiológicas.
Estipula pruebas para demostrar la actividad de protección antimicrobiana. Los
conservantes antimicrobianos deben estar indicados en la etiqueta. Las pruebas y
criterios de eficacia se aplican al producto en su envase original cerrado, en el que fue
distribuido por el fabricante.
Hipótesis
Ho: El aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.) tiene eficacia como
conservante antimicrobiana en una emulsión o/w de uso tópico.
Hi: El aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.) no tiene eficacia como
conservante antimicrobiana en una emulsión o/w de uso tópico.
Sistema de variables
Independientes.
Segunda etapa (elaboración de la emulsión o/w)
Agente surfactante (Polisorbato 20)
Agente emulsificante (Span 60)
20
Cuarta etapa (evaluación de la eficacia conservante)
Concentración de aceite esencial de tomillo.
Tiempo
Dependientes.
Segunda etapa (elaboración de la emulsión o/w)
Cumple/ no cumple estabilidad de la emulsión
Cuarta etapa (evaluación de la eficacia conservante)
Contaje de microorganismos de prueba (ATCC)
21
Capítulo III
Metodología
Diseño de la investigación
El presente estudio corresponde a una investigación de tipo bibliográfica,
experimental y explicativa ya que se ha manipulado diferentes tipos de variables
como son dependientes e independientes. Primero con los conocimientos teóricos
para su desarrollo, seguido con la parte experimental basado en la determinación de
la eficacia antimicrobiana del aceite esencial del tomillo como conservante
microbiológico, para la cual se parte del desarrollo y elaboración de una emulsión
o/w seguido del análisis de eficacia antimicrobiana del preservante (Método USP
variando el porcentaje de aceite esencial de tomillo en dicha formulación y su
estudio de estabilidad microbiológica acelerado.
Población y muestra
No aplica para el presente estudio debido a que no se va a trabajar con un conjunto
de personas, registros médicos, objetos u otros elementos; por lo cual tampoco se
manejará una muestra en la que se lleve a cabo la investigación.
Métodos y materiales
Materiales.
- Vasos de precipitación
- Varillas de agitación
- Envase primario
- Medios de cultivo (TSA y SAB)
- Cajas monopetri
- Micropipetas THERMO SCIENTIFIC
- Tubos de ensayo con tapa rosca
- Pipetas graduadas
- Erlenmeyer
- Papel empaque
Materia prima.
- Aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris L.)
- Metilparabeno
- Propilparabeno
- Agua destilada.
22
- Lanolina hidrosoluble
- Vaselina líquida
- Alcohol cetílico
- Trietanolamina
- Acido esteárico
- Span 60
- Polisorbato 20
- Cloruro de sodio
Microorganismos de prueba.
- Escherichia coli ATCC 25922
- Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
- Staphylococcus aureus ATCC 25293
- Candida albicans (CÓDIGO RTB 012)
Equipos.
- Vortex CLASSIC - VELP Scientifica
- Incubadora de bacterias INDUCELL-MMM GROUP
- Incubadora de hongos INDUCELL-MMM GROUP
- Balanza semianalítica METTLER TOLEDO
- Potenciómetro METTLER TOLEDO- Seven Multi
- Centrífuga
- Cámara climática HERAEUS
- Espectrofotómetro
- Autoclave DAIHAN SCIENTIFIC- WISD
- Refractómetro de ABBÉ
Diseño experimental
La presente investigación consta de una etapa bibliográfica y cinco etapas
experimentales.
Primera etapa: caracterización del aceite esencial del tomillo.
Para la caracterización del aceite esencial del tomillo se realizará las siguientes
determinaciones:
Control organoléptico
Control físico-químico
Segunda etapa: elaboración y selección de la mejor formulación de una emulsión
o/w. Inicialmente se realizará un ensayo preliminar para establecer la concentración
de cada una de las materias primas seleccionadas, que se mantendrán fijas,
observando las mejores características en cuanto a aspecto y a estabilidad de la
emulsión.
23
Tabla 3.1 Diseño experimental: Relación función y tipo de factor.
MATERIA PRIMA FUNCIÓN TIPO DE FACTOR
Vaselina líquida Emoliente Fijo
Lanolina hidrosoluble Agente emulsificante Fijo
Alcohol cetílico Emoliente Fijo
Acido esteárico Agente solubilizante Fijo
Monoestearato de
sorbitano (Span 60)
Agente emulsificante Variable
(Monolaureato de
sorbitano polioxietileno)
Polisorbato 20
Surfactante no iónico Variable
Trietanolamina Agente emulsificante Fijo
Agua Solvente Fijo
Elaborado por: La autora
Posteriormente se elaborará la emulsión o/w variando la concentración de
polisorbato 20 (surfactante) y span 60 (emulsificante), considerando cada uno de los
tratamientos establecidos en la tabla 3.2, a partir del cual se seleccionará la
formulación más idónea mediante el ensayo de estabilidad de la emulsión.
Tabla 3.2 Diseño factorial: dos factores y dos niveles
VARIABLES NIVEL
1 Surfactante (Polisorbato 20)
P1 2%
P2 4%
2 Emulsificante (Span 60)
S1 2%
S2 4%
Elaborado por: La autora
Tabla 3.3 Tratamientos experimentales
S1 S2
P1 P1S1 P1S2
P2 P2S1 P2S2
Elaborado por: La autora
Tercera etapa: elaboración de la formulación selecciona, incorporando el
conservante (aceite esencial de tomillo) a las diferentes concentraciones a utilizarse
(0,5%, 1,0%; 1,5%) y la mezcla de parabenos.
Cuarta etapa: realización de la prueba de eficacia antimicrobiana (método USP-36)
en el producto final utilizando como conservante antimicrobiano una mezcla de
parabenos y aceite esencial de tomillo. Para la cual se determinará mediante el
procedimiento de recuento en placa (extensión) el número de unidades formadoras
24
de colonia (ufc) presentes en cada preparación de prueba, en los intervalos de tiempo
correspondiente (14 y 28 días), expresando los cambios en términos de reducciones
logarítmicas.
Tabla 3.4 Microorganismos de prueba
MICROORGANISMO DE PRUEBA
E Escherichia coli
P Pseudomonas aeruginosa
S Staphylococcus aureus
C Candida albicans
Elaborado por: La autora
Tabla 3.5 Concentración de aceite esencial de tomillo
VARIABLE Aceite esencial de tomillo
(Thymus vulgaris L.)
C1 0,5%
C2 1,0%
C3 1,5%
Elaborado por: La autora
Tabla 3.6 Tratamientos experimentales
C1 C2 C3
E EC1 EC2 EC3
P PC1 PC2 PC3
S SC1 SC2 SC3
C CC1 CC2 CC3
Elaborado por: la autora
Quinta etapa: realización del estudio de estabilidad microbiológica acelerada
siguiendo lo establecido por la normativa ICH Q1AR (Estudio de estabilidad de los
principios activos y productos nuevos declarados) en el envase original.
25
Tabla 3.7 Condiciones del estudio de estabilidad
Temperatura 30°C ± 2
Humedad
relativa
75% ± 5
Tiempo 0 meses
3 meses
Elaborado por: La autora
Matriz de operacionalización de variables
Tabla 3.8 Operacionalización de variables
VARIABLE NIVELES INDICADOR
Concentración de aceite
esencial de tomillo.
0,5% Reducción logarítmica
1,0% Reducción logarítmica
1,5% Reducción logarítmica
Porcentaje de
emulsificante (Span 60)
2% Estabilidad de la emulsión
Cumple/ No cumple 4%
Porcentaje de surfactante
no iónico (polisorbato 20)
2% Estabilidad de la emulsión
Cumple/ No cumple 4%
Elaborado por: la autora
Procedimientos
Control de calidad del aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris L.).
En la siguiente tabla se describe los parámetros organolépticos y fisicoquímicos
evaluados en el aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.), como parámetros de
calidad.
Tabla 3.9 Análisis de calidad organoléptica y fisicoquímica para el aceite esencial de
tomillo (Thymus vulgaris L.)
ANÁLISIS DE CALIDAD PARÁMETRO
Características
organolépticas
Olor
Color
Aspecto
Ensayos físicos Densidad
Índice de refracción
26
Reacciones de coloración Presencia de alcohol
Presencia de aldehídos y cetonas
Presencia de ésteres
Presencia de carbonilos de aldehídos
Presencia de fenoles
Presencia de insaturaciones
Ensayos cualitativos Cromatografía en capa fina
Elaborado por: La autora
Características Organolépticas.
1. Tomar una alícuota de 1ml de aceite esencial y colocarlo en un tubo de ensayo.
2. Mediante análisis sensorial, utilizar los órganos de los sentidos como la vista
para determinar el color y la apariencia y el sentido del olfato para el olor.
Densidad relativa.
1. Determinar el peso del picnómetro vació con exactitud de 0,1mg. (El
picnómetro debe estar limpio y seco).
2. Llenar el picnómetro con agua destilada, asegurándose que el capilar este lleno
de agua y que no existan burbujas de aire.
3. Determinar su peso en la balanza analítica.
4. Llenar el picnómetro con la muestra, y repetir el procedimiento anterior.
La densidad relativa o peso específico del líquido es el cociente que se
obtiene al dividir el peso del líquido contenido en el picnómetro por el peso del agua
contenida en éste, ambos determinados a 25°C.
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑜 =𝑊𝑃𝑖𝑐.+𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 − 𝑊𝑃𝑖𝑐.𝑣𝑎𝑐𝑖𝑜
𝑊𝑃𝑖𝑐.+𝐻2𝑂 − 𝑊𝑃𝑖𝑐.𝑣𝑎𝑐𝑖𝑜
Índice de refracción.
Para la determinación del índice de refracción del aceite esencial del tomillo (Thymus
vulgaris L.) se utilizó un refractómetro de ABBÉ.
1. Ajuste de la escala:
Colocar de 2 a 3 gotas de agua destilada en la superficie del prisma principal
con una jeringa.
Cerrar el prisma secundario y observar a través del ocular.
Ajustar la escala, a 1.333 (Brix 0%).
27
2. Medición del índice de refracción de las soluciones:
Abrir el prisma secundario y colocar de 2 a 3 gotas de la muestra en el
centro de la superficie del prisma.
Cerrar cuidadosamente el prisma secundario
Observar por el ocular, girar la perilla de compensación de color hasta que
aparezca una línea clara y definida en el campo de visión.
Girar la perilla de medición alineando la línea delimitadora con las líneas de
intersección.
Leer en la escala superior el índice de refracción.
Reacciones de coloración para aceites esenciales.
Presencia de ésteres
1. En un tubo de ensayo agregar una o dos gotas de aceite esencial.
2. Adicionar en caliente una solución alcalina de hidroxilamina, dejar enfriar y
acidular con ácido clorhídrico.
3. Añadir gotas de cloruro férrico y agitar.
4. Observar una coloración púrpura lo que indica que la prueba es positiva.
Presencia de aldehídos y cetonas
1. Colocar en un tubo de ensayo una o dos gotas de aceite esencial.
2. Adicionar dos gotas de etanol y una gota de una solución de 2,4-
dinitrofenilhidrazina.
3. Agitar el tubo.
4. Observar un precipitado de color rojo, amarillo o anaranjado lo que indica que
la prueba es positiva.
Reactivo de Tollen:
1. Colocar en un tubo de ensayo una o dos gotas de aceite esencial.
2. Adicionar unas gotas del reactivo de Tollen y calentar a baño maría.
3. Observar un precipitado negro o la formación del espejo de plata lo que indica
que la prueba es positiva.
Presencia de carbonilos de aldehídos
1. Colocar en un tubo de ensayo una o dos gotas de aceite esencial.
2. Agregar la misma cantidad de Fehling A y fehling B.
3. Agitar el tubo y llevar a baño maría.
4. Observar un precipitado de color rojo lo que indica que la prueba es positiva
Presencia de insaturaciones
1. Colocar en un tubo de ensayo una o dos gotas del aceite esencial.
28
2. Agregar gota a gota una solución acuosa de permanganato de potasio (KMnO4)
al 1%.
3. Agitar el tubo después de cada gota
4. Observar un precipitado de color café lo que indica que la prueba es positiva.
Presencia de fenoles
1. Colocar en un tubo de ensayo una o dos gotas del aceite esencial.
2. Agregar dos gotas de una solución de cloruro férrico.
3. Agitar el tubo.
4. Observar una solución de color azul verdosa, roja verdosa o violeta verdosa lo
que indica que la prueba es positiva. (Domínguez, 1973)
Cromatografía en capa fina.
Las técnicas de separación cromatográfica son métodos de separación de
múltiples etapas en los que los componentes de una muestra se distribuyen entre dos
fases, una de las cuales es estacionaria y la otra móvil. Para lo cual se utilizó como
fase estacionaria (placa de silicagel de 20x20cm) y como fase móvil tolueno: xileno
2:4
1. Siembra: aplicar la muestra (aceite esencial de tomillo) y soluciones estándares
(carvacrol y timolol) sobre la superficie de la fase estacionaria (placa) en
porciones lo suficientemente pequeñas para obtener manchas circulares de 2-5
mm de diámetro.
2. Colocar la placa en la cámara, asegurando que las manchas o bandas estén por
encima de la superficie de la fase móvil.
3. Cerrar la cámara.
4. Dejar que la fase móvil ascienda en la placa hasta que el frente de la fase móvil
haya recorrido tres cuartos de la longitud de la placa o la distancia indicada en la
monografía.
5. Retirar la placa, marcar el frente de la fase móvil con un lápiz, y dejar que se
seque.
6. Visualizar los cromatogramas según se indica.
7. Determinar los valores del factor de retardo cromatográfico (RF) para las
manchas o zonas principales. (USP-36, Pruebas físicas/ Cromatografía, 2013)
Nota: A menudo se usa una fuente de luz ultravioleta (UV) adecuada para
observaciones bajo luz UV de longitud de onda corta (254 nm) y larga (365 nm).
Elaboración de la emulsión o/w de uso tópico (loción).
La elaboración de la emulsión o/w se lleva a cabo bajo el cumplimiento de
las buenas prácticas de manufactura, en la cual se incorporó como conservante
antimicrobiano aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris L.) a una concentración
del 0,5%, 1,0% y 1,5% y como conservante sintético una mezcla de parabenos
(metilparabeno y propilparabeno).
29
Elaboración de una emulsión o/w con el conservante sintético.
EMULSIÓN O/W
Agua destilada (10% en exceso por evaporación) CALENTAR RECIPIENTE 1T°:91°C
DISOLVERPolisorbato 20
Trietanolamina Agitación Manual RECIPIENTE 1
Lanolina hidrosolubleVaselina liquidaAlcohol cetilico Acido esteárico Span 60
ENFRIAR
FUNDIR
EMULSIFICAR RECIPIENTE 2
REALIZAR ENSAYOS FISICOS
pH Viscosidad (viscosímetro de Ostwald). Densidad Producto final
CONTROL ORGANOLÉPTICO Color
Olor Apariencia
ENVASAR
RECIPIENTE 1
T°: 70-75°CV: Agitación manual
ENFRIAR RECIPIENTE 2T°: 30-35°C
V: Agitación manual
T°: 70-75°C
RECIPIENTE 2
DISPERSAR Metilparabeno y
propilparabenoAgitación Manual
30
Elaboración de una emulsión o/w con aceite esencial de tomillo, como
conservante antimicrobiano.
EMULSIÓN O/W
Agua destilada Polisorbato 20 DISOLVER RECIPIENTE 1
Agitación Manual
DISOLVERTrietanolamina Agitación
Manual RECIPIENTE 1
Lanolina hidrosolubleVaselina liquidaAlcohol cetilico Acido esteárico Span 60
CALENTAR
FUNDIR
EMULSIFICAR RECIPIENTE 2
REALIZAR ENSAYOS FISICOS
pH Extensibilidad Estabilidad de la emulsión.
Producto final
CONTROL ORGANOLÉPTICO Color
Olor Apariencia
ENVASAR
RECIPIENTE 1
T°: 70-75°CV: Agitación manual
ENFRIAR RECIPIENTE 2
T°: 30-35°CV: Agitación
manual
T°: 70-75°CV: Agitación
manual
RECIPIENTE 2
DISPERSAR Aceite esencial de tomillo
T°: 30-35°CV: Agitación
manual
RECIPIENTE 2
31
Metodología analítica para el producto terminado (emulsión O/W de tipo
loción).
Ensayos organolépticos.
Igual al realizado en el control organoléptico del aceite esencial
Ensayos físicos.
Determinación del pH
1. Determinar el pH con un potenciómetro marca Mettler Toledo modelo Seven
Multi, calibrado y capaz de reproducir valores de pH con variaciones menores a
0,02 unidades de pH.
2. En un vaso de precipitación colocar una cantidad suficiente del producto e
introducir el electrodo, cuidando que el electrodo no toque las paredes ni el
fondo del recipiente.
3. Efectuar la lectura de pH.
4. Realizar la determinación de pH por triplicado (la diferencia no debe exceder de
0,1 unidades de pH, en caso contrario, debe repetirse la determinación).
Extensibilidad
1. Colocar el producto en una jeringuilla, asegurándose de eliminar el aire.
2. Depositar, en el centro de la cruz marcada en una placa de vidrio, 1ml de
producto formando una mancha circular sin espacios vacíos.
3. Colocar la placa de vidrio superior y medir el diámetro vertical y horizontal
4. Con el promedio del diámetro calcular el área del círculo. (A=π * r2)
Estabilidad de la emulsión
1. En un tubo de ensayo de vidrio con tapa rosca colocar 5g de la emulsión.
2. Llevar a baño maría a 45+/- 2°C, durante 30 minutos.
3. Centrifugar a 4000rpm durante 30 minutos
4. El sobrenadante no debe ser mayor a 2mm
Metodología microbiológica.
Examen microbiológico de productos no estériles: Aptitud del método de recuento
en presencia del producto.
Muestra: emulsión O/W sin preservante
1. Disolver 1g del producto a examinar en un tubo con 9ml de TSB
2. Agregar un volumen suficiente de suspensión microbiana de Pseudomonas
aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Candida albicans para
obtener un inóculo de no más de 100ufc. El volumen de la suspensión del
inóculo no debe exceder del 15 del volumen del producto diluido.
Para verificar las condiciones de prueba realizar:
32
Un control positivo de crecimiento, a 9 ml TSB (sin incluir la muestra) inocular
con una dilución apropiada de microorganismo para obtener no más de 100 Ufc
en el tubo de muestra. Repetir este procedimiento por separado, con cada cepa
bacteriana y fúngica.
Un control negativo de crecimiento, incubar 9 ml de TSB con y 1 g de muestra
(sin incluir el inóculo). No debe observarse crecimiento de microorganismos.
Del tubo del paso 2 sembrar en 2 cajas TSA (para bacterias) por extensión y 2 por
vertido. En el caso de la Candida albicans sembrar en SAB.
Métodos de Recuento en Placa.
Método de Vertido en Placa
1. Agregar a la placa 1 mL de la muestra preparada y de 15 a 20 mL de Agar
Digerido de Caseína y Soja o Agar Sabouraud Dextrosa, manteniendo la
temperatura de ambos medios a no más de 45º.
2. Incubar las placas según se indica en la Tabla 3.10.
3. Tomar la media aritmética de los recuentos obtenidos en cada medio y calcular
el número de ufc en el inóculo original.
Tabla 3.10 Condiciones de cultivo para la preparación de inóculos
Por: (USP-36, Pruebas microbiológicas. <51>Prueba de eficacia
antimicrobiana, 2013)
Método de Extensión en Superficie
1. Agregar de 15 a 20 mL de Agar Digerido de Caseína y Soja o Agar Sabouraud
Dextrosa a cada placa de Petri de 9 cm de diámetro, aproximadamente a 45°C y
dejar solidificar.
2. Secar las placas en un gabinete con flujo de aire laminar o en una incubadora.
3. Esparcir un volumen medido de no menos de 0,1 mL de la muestra preparada
sobre la superficie del medio. Incubar y realizar el recuento según se indica en
Método de Vertido en Placa.
4. Contar las colonias y comparar con el contaje del inóculo inicial.
33
PARTE II: Prueba de recuento en producto
1. Disolver 1g del producto a examinar en un tubo con 9 ml de TSB.
2. Sembrar en 2 cajas TSA (para bacterias) por extensión y 2 por vertido. En el
caso de la Candida albicans sembrar en SAB.
3. Contar las colonias en caso de haber crecimiento. (Téran Soto, 2016)
Prueba de eficacia antimicrobiana.
Preparación del inóculo
1. Medir la turbidez de la escala 0,5 McFarland y preparar la suspensión bacteriana
de una turbidez similar en el tubo con 5ml de solución de NaCl 0,85%.
2. De esta solución calcular cuánto se debe tomar para que en la muestra haya una
concentración de microorganismos de aproximadamente 1x105 a 1x10
6 ufc/ml
de emulsión O/W. (Téran Soto, 2016)
Inoculación en el producto
1. La inoculación puede realizarse asépticamente en el recipiente original
directamente con una jeringa estéril.
2. El volumen de inóculo empleado es de entre 0,5% y 1,0% del volumen del
producto.
Luego de la inoculación del producto se procede a la incubación para lo cual se debe
seguir el siguiente procedimiento:
Tabla 3.11 Test de eficacia del preservante
S. aureus P. aeruginosa E. coli C. albicans
Preparación del
inóculo
microbiano
0,5McFarland
5ml NaCl
0,85%+
microorganismo
5ml NaCl
0,85%+
microorganismo
5ml NaCl
0,85%+
microorganismo
5ml NaCl
0,85%+
microorganismo
Preparación de la
muestra
Producto+
inóculo= 1x106
ufc/ml de
producto
Producto+
inóculo= 1x106
ufc/ml de
producto
Producto+
inóculo= 1x106
ufc/ml de
producto
Producto+
inóculo= 1x106
ufc/ml de
producto
Incubación de la
muestra
preparada
Incubar a 20-25°C por 14 y 28 días
A los 14 días
34
Preparación de las
diluciones
Dilución 10-1=
1ml de muestra
preparada+ 9ml
NaCl 0,85%
Dilución 10-1=
1ml de muestra
preparada+ 9ml
NaCl 0,85%
Dilución 10-1=
1ml de muestra
preparada+ 9ml
NaCl 0,85%
Dilución 10-1=
1ml de muestra
preparada+ 9ml
NaCl 0,85%
Dilución 10-2 Dilución 10-2 Dilución 10-2 Dilución 10-2
Dilución 10-3 Dilución 10-3 Dilución 10-3 Dilución 10-3
Dilución 10-4 Dilución 10-4 Dilución 10-4 Dilución 10-4
Dilución 10-5 Dilución 10-5 Dilución 10-5 Dilución 10-5
Dilución 10-6 Dilución 10-6 Dilución 10-6 Dilución 10-6
Pase a caja TSA
para bacterias y a
SAB para
levaduras+
neutralizante por
extensión
Diluciones 10-2,
10-4 y 10-6
Diluciones 10-2,
10-4 y 10-6
Diluciones 10-2,
10-4 y 10-6
Diluciones 10-2,
10-4 y10-6
Incubación Incubar a 35°C
por 48-72 horas
Incubar a 35°C
por 48-72 horas
Incubar a 35°C
por 48-72 horas
Incubar a 20°C
por 5 a 7 días
Repetir el procedimiento que se hizo a los 14 días pero ahora a los 28 días
Por: (Téran Soto, 2016)
4. La concentración inicial de microorganismos viables en cada preparación de
prueba se calcula a partir de la concentración de microorganismos de cada
inóculo normalizado determinado mediante el método de recuento de placas.
5. Registrar todos los cambios observados en apariencia en estos intervalos de
tiempo.
6. Determinar mediante el procedimiento de recuento en placas (método de
extensión en superficie) el número de ufc presentes en cada preparación de
prueba.
Cálculo de Ufc/ml mediante recuento en placa:
𝑈𝑓𝑐
𝑚𝑙=
𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠
𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑥 0,1
7. Empleando las concentraciones calculadas de ufc por mL presentes al inicio de
la prueba, calcular el cambio en valores en log10 de la concentración de ufc por
mL de cada microorganismo en los intervalos de prueba correspondientes y
expresar los cambios en términos de reducciones logarítmicas.
35
Cálculo de la reducción logarítmica:
𝑅𝑒𝑑. 𝐿𝑜𝑔 = log[𝑁0] − log[𝑁𝑋]
Donde:
𝑁0: Número de microorganismos inoculados al T0
𝑁𝑋: Número de microorganismos supervivientes en cada intervalo de tiempo.
Criterios de eficacia antimicrobiana.
Los requisitos de eficacia antimicrobiana se cumplen si se aceptan los
criterios especificados en la tabla 3. (Producto de categoría 2). La expresión “ningún
incremento” se define como no más de 0,5 unidades de log10 por encima del valor
medio previamente. (Ver tabla 2.4). (USP-36, Pruebas microbiológicas. <51>Prueba
de eficacia antimicrobiana, 2013)
Técnicas de procesamiento de datos (análisis estadístico)
Diseño experimental.
Análisis de varianza ANOVA
En el presente estudio se realizará un análisis de varianza (ANOVA) que
evalúan la importancia de un factor (ANOVA unifactorial) o más factores (ANOVA
multifactorial) al comparar las medias de la variable de respuesta en los diferentes
niveles de los factores. La hipótesis nula establece que todas las medias de la
población (medias de los niveles de los factores) son iguales mientras que la
hipótesis alternativa establece que al menos una es diferente. Ademas se utilizará la
gráfica de caja y de valores individuales.
Hipótesis nula 𝐻𝑂: 𝜇1 = 𝜇2 = 𝜇3 = 𝜇4 =
Hipótesis alternativa 𝐻𝑎: 𝜇1 ≠ 𝜇2 ≠ 𝜇3 ≠ 𝜇4 ≠
El anova de dos factores busca determinar diferencias entre medias de dos o
más grupos, pero al mismo tiempo detectar si existe diferencias entre los datos
debidas a algun tipo o tipos de factores que afecten interiormente a cada grupo
(tratamientos).
36
Factores
Los factores para el presente estudio corresponde a 2 tipos: la concentracion
de aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.) utilizado como conservante
microbiológico en el producto final, Factor 1 y el tiempo de análisis correspondiente
al estudio de estabilidad microbiológico acelerado, Factor 2. Se realizarán 3
repeticiones por cada tratamiento.
Niveles
Los niveles para cada factor de estudio corresponde a: 3 niveles para la
concentracion de aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris L.). asi como 2 niveles
para el tiempo de analisis del estudio de estabilidad microbiológico acelerado.
Prueba de Tukey.
El método de Tukey se utilizará para crear intervalos de confianza para todas
las diferencias en parejas entre las medias de los niveles de los factores mientras
controla la tasa de error por familia que especifique. Además se utilizará la gráfica
de intervalos de confianza de 95% de Tukey.
Decodificación general del estudio.
Tabla 3.12 Decodificación ANOVA de un solo factor
Microorganismo de prueba ATCC
Concentración 0,5% 1,0% 1,5% M-P
R1 R1 R1 R1
R2 R2 R2 R2
R3 R3 R3 R3
R: número de replica. Elaborado por: la autora
0,5%, 1,0%,1,5%: concentración de aceite esencial del tomillo.
M-P: conservante sintético (metilparabeno y propilparabeno)
NOTA: Diseño estadístico aplicado para cada microorganismo de prueba ATCC ,
siendo la variable respuesta la reducción logarítmica del análisis realizado a T28: a los
28 dias desde la inoculación.
37
Tabla 3.13 Decodificación ANOVA de dos factores
Microorganismo de prueba ATCC
FACTOR 2
TIEMPO DE ANÁLISIS
FACTOR 1 CONCENTRACIÓN Análisis 1
(día 0)
Análisis 2
( día 90)
0,5% R1,R2,R3 R1,R2,R3
1,0% R1,R2,R3 R1,R2,R3
1,5% R1,R2,R3 R1,R2,R3
M-P R1,R2,R3 R1,R2,R3
Elaborado por: la autora
NOTA: El análisis 1, corresponde al análisis de eficacia del preservante realizado una
vez elaborado el producto final y el análisis 2, es el análisis de eficacia del preservante
realizado después de un periodos de 3 meses (90 días) de haber sido sometidas las
muestras a condiciones extremas de temperatura y humedad relativa 40°C±2°C/75%
H.R±5%H.R.
38
Capitulo IV
Análisis y discusión de resultados
Análisis fisicoquímico cualitativo del aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris
L.)
Los resultados de las pruebas de control físico y organolépticos realizadas al
aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris L.) se resumen en la siguiente tabla:
Tabla 4.1 Análisis físico y organoléptico del aceite esencial Thymus vulgaris L.
ENSAYO ORGANOLÉPTICO RESULTADO
Olor Característico
Color Amarillo
Apariencia Líquido aceitoso
ENSAYO FÍSICO RESULTADO
Índice de refracción 1,5080 a 20°C
Densidad relativa 0,9468g/ml a 25°C
Elaborado por: La autora
Interpretación
De acuerdo al valor de índice de refracción y densidad relativa que presenta el aceite
esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.), se puede deducir que presenta compuestos
oxigenados aromáticos o alicíclicos, debido a que presenta densidades e índices de
refracción superior a 0,9g/ml y 1,47 respectivamente. (Domínguez, 1973)
Reacciones de caracterización.
Tabla 4.2 Resultado de las reacciones de coloración del aceite esencial de (Thymus
vulgaris L.)
FUNCIÓN
QUÍMICA
REACCIÓN COLOR DE LA
REACCIÓN
RESULTADO
Ésteres Con solución alcalina de
hidroxilamina
Roja Positivo
Cetonas y Con 2,4- Precipitado color Positivo
39
aldehídos dinitrofenilhidracina amarillo
Tollens Precipitado negro Positivo
Carbonilo de
aldehídos
Tollens Espejo de plata Negativo
Fehling Precipitado rojo Negativo
Instauraciones Con permanganato de
potasio
Precipitado color café Positivo
Fenoles Con cloruro férrico Azul-verdosa Positivo
Elaborado por: La autora
Interpretación
De acuerdo a los resultados obtenidos en la tabla 4.2 se puede deducir que el aceite
esencial del tomillo usado en la presente investigación, presenta compuestos con
insaturaciones (alquenos), grupos fenólicos, cetonas, aldehídos y ésteres. Reportándose
que compuestos con estructuras fenólicas tienen una alta actividad antimicrobiana
seguido por aldehídos, cetonas, alcoholes y otros hidrocarburos. (Rosas Gallos, 2011)
Cromatografía en capa fina del aceite esencial del tomillo.
Tabla 4.3 Cromatografía en capa fina del aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris
L.)
BANDA DE COMPUESTO VALOR DE Rf
Timol muestra 0,82
Timol estándar teórico 0,82
Carvacrol muestra 0,81
Carvacrol estándar teórico 0,81
Elaborado por: La autora
Interpretación
En la tabla 4.3 se muestra el factor de retención de los metabolitos mayoritarios
presentes en el aceite esencial del tomillo, observándose la presencia de carvacrol y
timol al ser comparados con los valores estándares de dichos compuestos. A estos
compuestos con estructuras fenólicas se le atribuye una mayor actividad antimicrobiana
en relación a los otros compuestos que constituyen el aceite esencial, además la
presencia y localización de grupos hidroxilo es un factor importante en esta actividad.
(Rosas Gallos, 2011)
40
Medición del espectro IR del aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.).
Ilustración 4.1 Espectro IR del aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.)
Por: Laboratorio OSP- Universidad Central del Ecuador
Interpretación
La absorción a 2874,49 cm-1
caracterizado por una banda ancha muestra una tensión C-
H. El doblete (un par de picos) de la absorción N-H alrededor de 3300 cm-1
sugiere una
amida primaria, R-CONH2. Como no hay absorción C-H por encima de 3300 cm-1
,
probablemente se trate de una amida saturada. La presencia de tensiones C=C alrededor
de 1500 cm-1
indica la presencia de un anillo aromático. Además la absorción entre
2100 y 2200 cm-1
puede corresponder a una señal de tensión C ≡ C entre 2100 y 2200
cm-1
, sin embargo la absorción de un alquino interno puede ser débil o estar ausente,
debido a la simetría de triple enlace disustituido que genera un momento dipolar muy
pequeño o nulo.
Control de calidad del producto terminado (emulsión o/w: loción).
Tabla 4.4 Formulación de la emulsión o/w (loción)
Formula
porcentual
Formula
manufactura
MATERIA PRIMA % g
Vaselina liquida 3,00 0,80
Lanolina hidrosoluble 4,50 1,20
4000,0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400,0
3,2
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100,0
cm-1
%T
3957,81
3397,96
2874,49
2728,02
2561,34
2362,70
2345,06
2234,42
1884,50
1618,27
1587,24
1515,89
1458,96
1420,64
1382,17
1363,80
1341,95
1290,63
1263,04
1228,64
1180,72
1153,62
1113,26
1089,01
1060,88
1020,37
995,20
946,42
888,00
859,85
809,13
782,19
738,72
721,11
705,62
626,07
592,39
582,03
545,16
41
Alcohol cetílico 0,80 0,32
Acido esteárico 1,60 0,64
Span 60 S S
Polisorbato 20 P P
Trietanolamina 0.40 0,16
Agua Solvente c.s.p
Total 100 40,00
S y P: variables Elaborado por: La autora
Tabla 4.5 Ensayo fisicoquímico de la formulaciones desarrolladas de una emulsión o/w
(loción).
Tratamiento P1S1 P1S2 P2S1 P2S2
N° de
repeticiones
Estab.
emulsión
pH Estab.
emulsión
pH Estab.
emulsión
pH Estab.
emulsión
pH
R1 C 8,10 C 8,06 C 8,06 C 8,00
R2 C 8,09 C 8,15 C 8,08 NC 8,01
R3 C 8,11 C 8,07 NC 7,98 NC 8,00
�̅� 8,10 8,09 8,04 8,00
R: número de repeticiones
P1S1: 2% Polisorbato 20/ 2% Span 60; P2S2: 2% Polisorbato 20/ 4% Span 60
P2S1: 4% Polisorbato 20/ 2% Span 60; P2S2: 4% Polisorbato 20/ 4% Span 60
C: cumple; NC: no cumple.
Cálculo de la extensibilidad
Ejm Tratamiento: P1S1 Emulsión O/W (2% Polisorbato 20/ 2% Span 60)
Diámetro: 9,7cm=97,0 mm
𝐴 = 𝜋. 𝑟2
𝐴 = 𝜋 ( 97,0 𝑚𝑚
2)2
𝑨 = 𝟕𝟑𝟖𝟗, 𝟏𝟏𝒎𝒎𝟐
Elaborado por: La autora
42
Tabla 4.6 Resultado de los ensayos fisicoquímico de la formulaciones desarrolladas de
una emulsión o/w (loción).
Tratamiento
experimental
Extensibilidad
(mm 2)
Estab.Emuls.
C/NC
pH
P1S1 7389,81 C 8,10
P1S2 4778,36 C 8,09
P2S1 5607,94 NC 8,04
P2S2 5607,94 NC 8,00
Elaborado por: La autora
Gráfica 4.1 Extensibilidad vs tratamientos
Elaborado por: la autora
Interpretación
En la gráfica 4.1 se observa que el tratamiento P1S1 (2% polisorbato 20: 2% span 60)
presenta una mayor extensibilidad en relación a los otros tratamientos, además en la
tabla 4.6 se evidencia que cumple con la prueba de estabilidad al igual que el
tratamiento P1S2 (2% Polisorbato 20/ 4% Span 60), sin embargo el tratamiento P1S1
presenta la relación del menor porcentaje de agente emulsificante y surfactante por lo
que dicha formulación fue la seleccionada para el desarrollo de la presente
investigación a la cual se incorporó como conservante natural (aceite esencial de
tomillo) a concentraciones del 0,5%, 1,0% y 1,5% y como conservante sintético una
mezcla de parabenos (metilparabeno y propilparabeno).
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
Ext
ensi
bil
idad
mm
2
Tratamientos
Extensibilidad vs Tratamiento
P1S1
P1S2
P2S1
P2S2
43
Tabla 4.7. Resultado de las características fisicoquímicas y organolépticas del producto terminado.
En la presente tabla se muestra las características organolépticas y fisicoquímicas del producto terminado (loción de tipo emulsión o/w),
realizados al final de la elaboración (C1: control 1) y luego de ser sometidos a condiciones extremas de temperatura y humedad,
especificados para el estudio de estabilidad acelerada (C2: control 2). Los controles se efectuaron por triplicado de cada una de las
formulaciones elaboradas, por lo que los resultados indicados corresponden a la media de las réplicas. (Ver Anexo 5)
FORMULA
UNITARIA/CARA
CTERISITICAS
COLOR
OLOR
ASPECTO
pH
Estabilidad
de la
emulsión
C1 C2 C1 C2 C1 C2 C1 C2 C1 C2
1 (0,5%) Blanco
amarillento
Blanco
amarillento
Tenue a
especia
Tenue a especia Líquido
homogéneo
Líquido
homogéneo
7,77 7,65 C C
2 (1,0%) Blanco
amarillento
Blanco
amarillento
Ligeramente a
especia
Ligeramente a
especia
Líquido
homogéneo
Líquido
homogéneo
7,81 7,63 C C
3 (1,5%) Blanco
amarillento
Blanco
amarillento
Fuertemente a
especia
Fuertemente a
especia
Líquido
homogéneo
Líquido
homogéneo
7,82 7,62 C C
4 Metilparabeno y
propilparabeno
Blanco Blanco Característico Característico Líquido
homogéneo
Líquido
homogéneo
7,81 7,57 C C
5 (Sin preservante) Blanco Blanco Característico Característico Líquido
homogéneo
Líquido
homogéneo
7,91 7,65 C C
C: cumple NC: no cumple Elaborado por: la autora
44
Interpretación
Las características organolépticas reportadas, están dentro de lo esperado para la
formulación desarrollada, en cuanto al color, al haber desarrollado la formulación sin
adición de colorante es de esperarse que sea de color blanco como en el caso de la
fórmula 4 y 5, sin embargo el tono amarillento es otorgado por el aceite esencial de
tomillo y el olor característico va aumentando a medida que la concentración de aceite
esencial incrementa. En cuanto a la estabilidad de la emulsión se puede establecer que
las formulaciones desarrolladas son estables y no presentan ningún indicio de
separación que ocasione una reformulación. Los valores reportados para pH poseen
diferencias mínimas entre ellos y se encuentran dentro del rango de pH aceptados para
productos de uso tópico que es de 4,5 a 8,5. Además los controles organolépticos y
fisicoquímicos realizados al tercer mes del estudio de estabilidad acelerado, no reportan
algún tipo de alteración organoléptica y en cuanto al pH no hay una variabilidad alta
con los valores reportados al inicio del estudio.
Examen microbiológico de productos no estériles: Método de recuento en placa
Tabla 4.8 Aptitud del método de recuento en presencia del producto: Recuento total de
microorganismos aerobios (RTMA)
Microorganismo Método de extensión.
TSA ufc/caja
Método de vertido.
TSA ufc/caja
Recuento
inicial
Recuento
final
Recuento
inicial
Recuento
final
Pseudomona aeruginosa 100 93 100 97
Escherichia coli 100 95 100 95
Staphylococcus aureus 100 97 100 95
Elaborado por: La autora
45
Tabla 4.9 Recuento total de microorganismos aerobios (RTMA) en el producto
Método de extensión.
TSA ufc/caja
Método de vertido.
TSA ufc/caja
Recuento final
Recuento final
NC NC
NC: no hubo crecimiento de microorganismos.
Tabla 4.10. Aptitud del método de recuento en presencia del producto: Recuento total
de levaduras (RTL)
Microorganismo
Método de extensión.
SAB ufc/caja
Método de vertido. SAB
ufc/caja
Recuento
inicial
Recuento
final
Recuento
inicial
Recuento
final
Candida albicans 100 95 100 97
Elaborado por: La autora
Tabla 4.11. Recuento total de levaduras (RTL) en el producto
Método de extensión.
SAB ufc/caja
Método de vertido.
SAB ufc/caja
Recuento final
Recuento final
NC NC
NC: no hubo crecimiento de levaduras Elaborado por: La autora
Interpretación
En las tablas 4.8 y 4.10 que muestra los resultados de la aptitud del método de recuento
en presencia del producto, permite establecer que el método es apto para el recuento de
microorganismos en el producto ya que se puede evidenciar en el recuento final de
microorganismos expresado en ufc/caja una recuperación de microorganismos similar
al recuento inicial, estableciéndose que los excipientes o los factores intrínsecos de la
formulación, no inhiben el crecimiento de los microorganismos que pudieran estar
presente en la forma farmacéutica o de aquellos que pudieran contaminarla
posteriormente. Además en la tabla 4.9 y 4.11 se determina que en la prueba de
recuento en producto no hubo crecimiento de microorganismos, asegurando que el
proceso de elaboración se realizó en condiciones lo más asépticamente posible evitando
una contaminación microbiológica del producto.
46
Prueba de eficacia antimicrobiana. Test de efectividad del preservante en el
producto final (emulsión o/w de uso tópico) de categoría 2 (método USP-36).
La prueba de eficacia antimicrobiana en el producto final, fue realizada una vez
elaborado las 4 formulaciones descritas en la tabla 4.12 (Análisis 1) y después de un
periodos de 3 meses (90 días) de haber sido sometidas las muestras a condiciones
extremas de temperatura y humedad relativa 40°C±2°C/75% H.R±5%H.R (Análisis 2).
En cada uno de las evaluaciones una vez inoculado los microorganismos de prueba se
homogeniza y se dejan a temperatura entre 20 y 25° C, examinándose luego de los
tiempos establecidos en la tabla 4.13. Además la prueba de eficacia antimicrobiana fue
realizado por triplicado (R1: replica 1, R2: replica 2, R3: replica 3) tomando 3 muestras
del lote elaborado respectivamente para cada una de las formulaciones.
Tabla 4.12 Descripción de las formulaciones desarrolladas.
N° de
Formulación
Descripción
1 Formula de loción, emulsión tipo O/W, que contiene como conservante
aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris L.) al 0,5%.
2 Formula de loción, emulsión tipo O/W, que contiene como conservante
aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris L.) al 1,0%.
3 Formula de loción, emulsión tipo O/W, que contiene como conservante
aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris L.) al 1,5%.
4 Formula de loción, emulsión tipo O/W, que contiene como conservante
una mezcla de parabenos (metilparabeno y propilparabeno,
0,18%:0,02%)
Elaborado por: La autora
Tabla 4.13 Intervalos de comprobación de supervivencia de los microorganismos
ATCC, USP-36
Código intervalo
de Tiempo
Intervalo de tiempo
T0 Inmediatamente después de la inoculación
T14 A los 14 días, desde la inoculación
T28 A los 28 días, desde la inoculación
Elaborado por: La autora
47
Tabla 4.14. Contaje microbiano (Ufc/ml) y reducción logarítmica del análisis 1 al intervalo de tiempo T0 y T14.
Concentración 0,50% 1,00% 1,50% M-P
Microorganismo/
Réplicas
T0
Ufc/ml
T14
Ufc/ml
Red.
Log
T0
Ufc/ml
T14
Ufc/ml
Red.
Log
T0
Ufc/ml
T14
Ufc/ml
Red.
Log
T0
Ufc/ml
T14
Ufc/ml
Red.
Log
Pseudomonas aeruginosa
R1 2,60E+06 1,04E+03 3,4 2,30E+06 4,58E+02 3,7 2,10E+06 NC 6,0 2,45E+06 1,55E+03 3,2
R2 2,26E+06 5,68E+04 1,6 1,43E+06 NC 6,0 2,43E+06 4,84E+02 3,7 1,98E+06 9,92E+04 1,3
R3 2,33E+06 1,47E+03 3,2 1,10E+06 4,37E+02 3,4 1,50E+06 NC 6,0 2,01E+06 5,05E+04 1,6
Escherichia coli
R1 6,33E+05 3,99E+02 3,2 5,67E+05 1,13E+02 3,7 5,47E+05 NC 6,0 4,43E+05 1,11E+04 1,6
R2 5,67E+05 3,57E+02 3,2 5,25E+05 1,04E+02 3,7 4,67E+05 1,86E+02 3,4 5,25E+05 3,31E+02 3,2
R3 6,00E+05 4,67E+02 3,1 5,33E+05 NC 6,0 4,33E+05 1,72E+02 3,4 5,89E+05 7,41E+02 2,9
Staphylococcus aureus
R1 8,33E+05 1,66E+02 3,7 1,19E+06 2,37E+02 3,7 1,56E+06 9,84E+02 3,2 8,69E+05 1,73E+02 3,7
R2 1,30E+06 2,59E+02 3,7 9,65E+05 NC 6,0 1,29E+06 8,13E+02 3,2 7,56E+05 1,51E+02 3,7
R3 1,40E+06 NC 6,0 8,75E+05 NC 6,0 1,00E+06 6,30E+02 3,2 8,00E+05 2,01E+04 1,6
Candida albicans
R1 1,07E+06 2,69E+04 1,6 9,29E+05 7,37E+03 3,1 1,63E+06 NC 6,0 1,42E+06 5,65E+04 1,4
R2 1,21E+06 6,06E+04 1,3 1,13E+06 1,13E+03 3,0 1,54E+06 3,07E+02 3,7 1,33E+06 4,21E+04 1,5
R3 1,10E+06 5,51E+04 1,3 9,08E+05 1,14E+03 2,9 1,28E+06 NC 6,0 1,37E+06 5,45E+04 1,4
NC: Ningún crecimiento del microorganismo Elaborado por: La autora
48
Tabla 4.15. Contaje microbiano (Ufc/ml) y reducción logarítmica del análisis 1 al intervalo de tiempo T28.
Concentración 0,50% 1,00% 1,50% M-P
Microorganismo/Réplicas
T28
Ufc/ml Red. Log
T28
Ufc/ml Red. Log
T28
Ufc/ml Red. Log
T28
Ufc/ml Red. Log
Pseudomonas aeruginosa
R1 1,64E+03 3,2 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0
R2 8,99E+02 3,4 2,85E+02 3,7 NC 6,0 NC 6,0
R3 NC 6,0 4,37E+02 3,4 NC 6,0 NC 6,0
Escherichia coli
R1 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0
R2 3,58E+02 3,2 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0
R3 2,39E+02 3,4 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0
Staphylococcus aureus
R1 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0
R2 2,59E+02 3,7 NC 6,0 2,57E+02 3,7 3,00E+02 3,4
R3 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0
Candida albicans
R1 NC 6,0 9,29E+04 1,0 NC 6,0 4,49E+04 1,5
R2 NC 6,0 NC 6,0 3,07E+02 3,7 4,21E+04 1,5
R3 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0 4,32E+04 1,5
NC: Ningún crecimiento del microorganismo Elaborado por: La autora
49
Tabla 4.16 Contaje microbiano (Ufc/ml) y reducción logarítmica del análisis 2 al intervalo de tiempo T0 y T14.
Concentración 0,50% 1,00% 1,50% M-P
Microorganismo/
Réplicas
T0
Ufc/ml
T14
Ufc/ml
Red.
Log
T0
Ufc/ml T14
Ufc/ml
Red.
Log
T0
Ufc/ml T14
Ufc/ml
Red.
Log
T0
Ufc/ml T14
Ufc/ml
Red.
Log
Pseudomonas aeruginosa
R1 1,32E+06 5,25E+03 2,4 1,30E+06 2,59E+03 2,7 9,86E+05 1,96E+03 2,7 1,34E+06 5,33E+02 3,4
R2 1,06E+06 2,66E+04 1,6 1,53E+06 3,84E+04 1,6 1,13E+06 2,84E+04 1,6 1,59E+06 3,99E+04 1,6
R3 1,28E+06 5,09E+03 2,4 1,22E+06 2,43E+03 2,7 1,32E+06 1,66E+03 2,9 9,37E+05 3,73E+02 3,4
Escherichia coli
R1 2,33E+06 4,64E+02 3,7 1,67E+06 3,33E+02 3,7 1,77E+06 3,53E+02 3,7 2,34E+06 1,86E+03 3,1
R2 1,69E+06 6,72E+02 3,4 1,86E+06 3,71E+02 3,7 2,07E+06 NC 6,0 1,75E+06 4,40E+04 1,6
R3 2,31E+06 1,46E+03 3,2 2,96E+06 NC 6,0 1,93E+06 NC 6,0 2,11E+06 2,66E+03 2,9
Staphylococcus aureus
R1 7,29E+05 1,83E+04 1,6 8,93E+05 1,78E+02 3,7 8,63E+05 1,72E+02 3,7 9,49E+05 2,38E+03 2,6
R2 8,03E+05 5,06E+02 3,2 8,25E+05 NC 6,0 7,89E+05 1,57E+02 3,7 8,86E+05 1,40E+03 2,8
R3 7,96E+05 5,02E+02 3,2 7,77E+05 NC 6,0 8,00E+05 1,59E+02 3,7 8,36E+05 1,67E+03 2,7
Candida albicans
R1 9,71E+05 4,87E+04 1,3 1,17E+06 2,33E+03 2,7 1,23E+06 NC 6,0 1,20E+06 6,01E+03 2,3
R2 1,05E+06 6,62E+03 2,2 1,00E+06 1,58E+03 2,8 1,09E+06 2,17E+02 3,7 9,98E+05 3,97E+03 2,4
R3 9,66E+05 9,66E+03 2,0 9,80E+05 7,78E+02 3,1 1,10E+06 NC 6,0 1,16E+06 5,81E+03 2,3
NC: Ningún crecimiento del microorganismo Elaborado por: La autora
50
Tabla 4.17. Contaje microbiano (Ufc/ml) y reducción logarítmica del análisis 2 al intervalo de tiempo T28.
Concentración 0,50% 1,0% 1,50% M-P
Microorganismo/Réplicas
T28
Ufc/ml Red. Log
T28
Ufc/ml Red. Log
T28
Ufc/ml Red. Log
T28
Ufc/ml Red. Log
Pseudomonas aeruginosa
R1 3,32E+04 1,6 6,51E+03 2,3 NC 6,0 1,06E+03 3,1
R2 2,66E+03 2,6 3,84E+03 2,6 NC 6,0 1,59E+03 3,0
R3 4,05E+03 2,5 2,43E+03 2,7 NC 6,0 1,49E+03 2,8
E. coli
R1 4,64E+02 3,7 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0
R2 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0 1,39E+03 3,1
R3 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0 1,33E+03 3,2
Staphylococcus aureus
R1 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0 1,89E+02 3,7
R2 1,60E+02 3,7 NC 6,0 NC 6,0 2,22E+04 1,6
R3 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0 1,66E+02 3,7
Candida albicans
R1 4,87E+04 1,3 NC 6,0 NC 6,0 2,39E+03 2,7
R2 2,64E+04 1,6 NC 6,0 NC 6,0 2,51E+04 1,6
R3 1,22E+03 2,9 NC 6,0 NC 6,0 1,84E+03 2,8
NC: Ningún crecimiento del microorganismo Elaborado por: La autora
51
Tabla 4.18. Reducción logarítmica. Análisis 1 y análisis 2.
Concentración de aceite de
tomillo (Thymus vulgaris L.)
Concentración de aceite de
tomillo (Thymus vulgaris L.)
Microorganismo de
prueba
0,5% 1,0% 1,5% M-P 0,5% 1,0% 1,5% M-P
Análisis 1 Análisis 2
T14 T28 T14 T28 T14 T28 T14 T28 T14 T28 T14 T28 T14 T28 T14 T28
Pseudomonas aeruginosa 2,7 4,2 4,3 4,3 5,2 6,0 2,1 6,0 2,2 2,3 2,3 2,5 2,4 6,0 2,8 2,9
Escherichia coli 3,1 4,2 4,4 6,0 4,2 6,0 2,6 6,0 3,4 5,2 4,4 6,0 5,2 6,0 2,5 4,1
Staphylococcus aureus 4,4 5,2 5,2 6,0 3,2 5,2 3,0 5,2 2,7 5,2 5,2 6,0 3,7 6,0 2,7 3,0
Candida albicans 1,4 6,0 3,0 4,3 5,2 5,2 1,4 1,5 2,8 1,9 2,8 6,0 5,2 6,0 2,3 2,3
T14: análisis realizado a los 14 días desde la inoculación; T28: análisis realizado a los 28 días desde la inoculación. Elaborado por: La autora
Interpretación
En la tabla 14.18 se describe la reducción logarítmica microbiana considerando el microorganismo de prueba, concentración del aceite esencial
de tomillo, mezcla de parabenos (Metilparabeno y propilparabeno) y el tiempo de estudio, evidenciándose que a una concentración de aceite
esencial de tomillo del 0,5%, 1,0% y 1,5% evaluados en el análisis 1 y análisis 2 cumple con los criterios establecidos en la USP-36 para la
prueba de eficacia antimicrobiana, dándose a los 14 días una reducción logarítmica no menos de 2,0 y a los 28 días ningún incremento del
recuento de los 14 días para bacterias y ningún incremento a los 14 y 28 días del recuento inicial para levaduras.
52
Gráfica 4.2. Reducción logarítmica del crecimiento microbiano a los intervalos T14 y
T28 vs concentración de aceite esencial de tomillo (0,5%). Análisís1
Elaborado por: La autora
Interpretación
En la gráfica 4.2 se puede observar que la eficacia antimicrobiana a una concentración
del 0,5% de aceite esencial de tomillo frente a los microorganismos de prueba, aumenta
con el tiempo, teniendo una mayor reducción logarítmica a los 28 días desde la
inoculación; además cumple con los criterios establecidos para bacterias y levaduras
descritos en la tabla 2.4 para productos de categoría 2.
Gráfica 4.3. Reducción logarítmica del crecimiento microbiano a los intervalos T14 y
T28 vs concentración de aceite esencial de tomillo (1,0%). Análisis 1.
Elaborado por: La autora
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
14 28
RE
DU
CC
IÓN
log
TIEMPO, días
ACEITE ESENCIAL Thymus vulgaris L. al 0,5%
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Candida albicans
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
14 28
RE
DU
CC
IÓN
log
TIEMPO, días
ACEITE ESENCIAL Thymus vulgaris L. al 1,0%
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Candida albicans
53
Interpretación
En la gráfica 4.3 se puede observar que a una concentración del 1,0% de aceite esencial
de tomillo cumple con los criterios establecidos por la USP-36 para todos los
microorganismos de prueba. Además se evidencia que transcurrido 28 días desde la
inoculación para Pseudomonas aeruginosa, la reducción logarítmica se mantuvo igual
a la evaluada a los 14 días, además de existir una reducción total de Escherichia coli y
Staphylococcus aureus.
Gráfica 4.4. Reducción logarítmica del crecimiento microbiano a los a los intervalos
T14 y T28 vs concentración de aceite esencial de tomillo (1,5%). Análisis 1
Elaborado por: La autora
Interpretación
En la gráfica 4.4 se puede observar que a una concentración del 1,5% de aceite esencial
de tomillo, cumple tanto para bacterias como para levaduras con los criterios
establecidos en la USP-36 para productos de categoría 2 (ver tabla 2.4). Además se
evidencia que transcurrido 28 días desde la inoculación para Candida albicans la
reducción logarítmica se mantuvo igual a la evaluada a los 14 días. Tambien presenta
un efecto letal a los 28 días después de la inoculación para Pseudomonas aeruginosa y
Escherichia coli.
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
14 28
RE
DU
CC
IÓN
log
TIEMPO, días
ACEITE ESENCIAL Thymus vulgaris L. al 1,5%
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Candida albicans
54
Gráfica 4.5 Reducción logarítmica del crecimiento microbiano a los a los intervalos
T14 y T28 vs mezcla de parabenos (Metilparabeno y propilparabeno). Análisis 1
Elaborado por: La autora
Interpretación
En la gráfica 4.5 se puede observar que la reducción logarítmica de Pseudomonas
aeruginosa evaluado a los 14 días desde la inoculación, se encuentra muy cercano a los
criterios establecidos por la USP-36, para eficacia del conservante, sin embargo a los 28
días después de la inoculación alcanza una mayor eficacia, que puede deberse a un
mayor tiempo de contacto entre el preservante y el microorganismo a evaluarse.
Gráfica 4.6. Reducción logarítmica del crecimiento microbiano a los intervalos T14 y
T28 vs concentración de aceite esencial de tomillo (0,5%). Análisis 2
Elaborado por: La autora
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
14 28
RE
DU
CC
IÓN
log
TIEMPO, días
METILPARABENO Y PROPILPARABENO
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Candida albicans
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
14 28
RE
DU
CC
IÓN
log
TIEMPO, días
ACEITE ESENCIAL Thymus vulgaris L. al 0,5%
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Candida albicans
55
Gráfica 4.7. Reducción logarítmica del crecimiento microbiano a los intervalos T14 y
T28 vs concentración de aceite esencial de tomillo (1,0%). Análisis 2
Elaborado por: La autora
Gráfica 4.8. Reducción logarítmica del crecimiento microbiano a los intervalos T14 y
T28 vs concentración de aceite esencial de tomillo (1,5%). Análisis 2
Elaborado por: La autora
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
14 28
RE
DU
CC
IÓN
log
TIEMPO, días
ACEITE ESENCIAL Thymus vulgaris L. al 1,0%
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Candida albicans
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
14 28
RE
DU
CC
IÓN
log
TIEMPO, días
ACEITE ESENCIAL Thymus vulgaris L. al 1,5%
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Candida albicans
56
Gráfica 4.9. Reducción logarítmica del crecimiento microbiano a los intervalos T14 y
T28 vs mezcla de parabenos (metilparabeno y propilparabeno). Análisis 2
Elaborado por: La autora
Interpretación
En las gráficas 4.6, 4.7, 4.8 y 4.9 se puede determinar que al ser sometido el producto
de ensayo a condiciones extremas de temperatura y humedad relativa, las diferentes
concentraciones de aceite esencial usadas como conservante antimicrobiano, cumple
con los criterios establecidos en la USP-36 para la prueba de eficacia antimicrobiana,
dándose a los 14 días una reducción logarítmica no menos de 2,0 y a los 28 días ningún
incremento del recuento de los 14 días para bacterias y ningún incremento a los 14 y 28
días del recuento inicial para levaduras.
Gráfica 4.10. Reducción logarítmica del crecimiento microbiano al intervalo T14 vs
concentración de aceite esencial de tomillo y mezcla de parabenos.Análisis1.
M-P: mezcla de parabenos (metilparabeno y propilparabeno)
Elaborado por: La autora
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
14 28
RE
DU
CC
IÓN
log
TIEMPO, días
METILPARABENO Y PROPILPARABENO
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Candida albicans
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0,50% 1,00% 1,50% M-P
RE
DU
CC
IÓN
lo
g
Concentración de aceite esencial
REDUCCIÓN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO A LOS 14 DÍAS DESDE LA INOCULACIÓN (ANÁLISIS 1)
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Staphylocuccus aureus
Candida albicans
57
Interpretación
Como se puede observar en la tabla 14.18 y en la gráfica 4.10 la reducción logarítmica
de los microorganismos de prueba varia con la concentración de aceite esencial de
tomillo, obteniéndose una mayor reducción de Escherichia coli, Staphylococcus aureus
a una concentración del 1,0% de aceite esencial de tomillo y al 1,5% para Pseudomonas
aeruginosa y Candida albicans.
Gráfica 4.11. Reducción logarítmica del crecimiento microbiano al intervalo T28 vs
concentración de aceite esencial de tomillo y mezcla de parabenos.Análisis1
Elaborado por: La autora
Interpretación
En la gráfica 4.11 se evidencia una mayor reducción logarítmica de Pseudomonas
aeruginosa, Escherichia coli a una concentración del 1,5% de aceite esencial de
tomillo, presentando un comportamiento similar a la mezcla de parabenos frente a estas
dos bacterias; mientras que al 1,0% presenta una mayor eficacia antimicrobiana frente
a Staphylococcus aureus y al 0,5% para Candida albicans.
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
0,50% 1,00% 1,50% M-P
RE
DU
CC
IÓN
lo
g
Concentración de aceite esencial
REDUCCION DEL CRECIMIENTO MICROBIANO A LOS 28 DÍAS DESDE LA INOCULACIÓN (ANÁLISIS 1)
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Staphylocuccus aureus
Candida albicans
58
Gráfica 4.12. Reducción logarítmica del crecimiento microbiano al intervalo T14 vs
concentración de aceite esencial de tomillo y mezcla de parabenos. Análisis 2
Elaborado por: La autora
Interpretación
Como se puede observar en la gráfica 4.12 al realizar el test de efectividad del
preservante después de haber sido sometiendo el producto final a una temperatura de
40°C±2°C y a 75%±5% de humedad relativa por 3 meses, se evidencia que existe una
mayor reducción de Escherichia coli, Candida albicans a una concentración del 1,5%
de aceite esencial de tomillo, al 1,0% para Staphylococcus aureus y en el caso de
Pseudomonas aeruginosa presenta una mayor reducción con la mezcla de parabenos
(metilparabeno y propilparabeno), sin embargo no muestra una variación alta en
relación a las diferentes concentraciones de aceite esencial.
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0,50% 1,00% 1,50% M-P
RE
DU
CC
IÓN
lo
g
Concentración de aceite esencial
REDUCCION DEL CRECIMIENTO MICROBIANO A LOS 14 DÍAS DESDE LA INOCULACIÓN (ANÁLISIS 2)
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Staphylocuccus aureus
Candida albicans
59
Gráfica 4.13. Reducción logarítmica del crecimiento microbiano al intervalo T28 vs
concentración de aceite esencial de tomillo y mezcla de parabenos. Análisis2
Elaborado por: La autora
Interpretación
En la Gráfica 4.13, se observa que a los 28 días desde la inoculación en el producto
final, existe una reducción total de Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli,
Staphylococcus aureus y Candida albicans a una concentración del 1,5% de aceite
esencial de tomillo, sin embargo al 1% también se muestra una reducción similar al
1,5% frente a Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
Además se evidencia que a las concentraciones de 1,0% y 1,5% de aceite esencial
muestra una mayor eficacia antimicrobiana en relación a la mezcla de parabenos (M-P)
Análisis estadístico de la eficacia antimicrobiana del aceite esencial de tomillo
(Thymus vulgaris L.).
Los datos serán evaluados mediante un análisis estadístico de varianzas de tipo
ANOVA que pruebe la hipótesis de que las medias de dos o más poblaciones son
iguales, con un factor (concentración de aceite esencial de tomillo) con 3 repeticiones
para cada ensayo, siendo un total de 3 tratamientos, además de compararlo con una
mezcla de parabenos (metilparabeno y propilparabeno), midiendo como variable
respuesta la reducción logarítmica de bacterias (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia
coli, Staphylococcus aureus) y levadura (Candida albicans). Además como análisis
funcional se utilizará la prueba de Tukey al 5% con ayuda del programa MINITAB y
Microsoft Excel 2016.
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
0,50% 1,00% 1,50% M-P
RE
DU
CC
IÓN
lo
g
Concentración de aceite esencial
REDUCCION DEL CRECIMIENTO MICROBIANO A LOS 28 DÍAS DESDE LA INOCULACIÓN (ANÁLISIS 2)
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Staphylocuccus aureus
Candida albicans
60
Los datos también serán evaluados por ANOVA de dos factores: concentración de
aceite esencial de tomillo y tiempo de análisis (análisis 1 y análisis 2), y como variable
respuesta reducción logarítmica de microorganismos.
Tratamiento estadístico (Análisis 1).
Tabla 4.19. Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Pseudomonas
aeruginosa
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados
de
libertad
Promedio de
los
cuadrados F Probabilidad
Valor crítico
para F
Entre grupos 9,166614832 3 3,055538277 2,65454934 0,119872134 4,066180551
Dentro de los
grupos 9,208458036 8 1,151057254
Total 18,37507287 11
Elaborado por: La autora
Interpretación
El valor P (0,12) al ser mayor que 0,05 al 95% de confianza y que el valor F calculado
(2,6545) es menor que el F tabulado (4,0662), la concentración de aceite esencial de
tomillo no tiene un efecto estadísticamente significativo sobre la reducción logarítmica
de Pseudomonas aeruginosa y presenta un comportamiento similar al conservante
sintético (metilparabeno-propilparabeno). Lo que significa que se acepta la hipótesis
nula entre los tratamientos.
Gráfica 4.14 Gráfica de caja: concentración de aceite esencial de tomillo y mezcla de
parabenos vs Reducción logarítmica de Pseudomonas aeruginosa
61
Interpretación
En el diagrama de caja se puede observar la media y la distribución de los datos para
cada muestra, se observa una mayor respuesta (reducción logarítmica) para la
concentración de 1,5% de aceite esencial de tomillo y para la mezcla de parabenos
(metilparabeno y propilparabeno), también se puede evidenciar una mayor dispersión
de los datos a una concentración del 0,5% y 1,0% de aceite esencial de tomillo por la
anchura de la caja.
Tabla 4.20. Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Escherichia coli
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Promedio
de los
cuadrados F Probabilidad
Valor crítico
para F
Entre grupos 7,48494696 3 2,49498232 3,9876103 0,05225802 4,066180551
Dentro de los
grupos 5,00546871 8 0,62568359
Total 12,4904157 11
Elaborado por: La autora
Interpretación
Siendo el valor P (0,052) mayor que 0,05 al 95% de confianza y que el valor F
calculado (3,9876) menor que el F tabulado (4,0662), la concentración de aceite
esencial de tomillo no tiene un efecto estadísticamente significativo sobre sobre la
reducción logarítmica de Escherichia coli. Lo que significa que se acepta la hipótesis
nula entre los tratamientos, es decir que la concentración de aceite esencial de tomillo
no influye sobre la variable respuesta (reducción logarítmica para Escherichia coli.)
Gráfica 4.15. Gráfica de valores individuales: concentración de aceite esencial de
tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Escherichia coli
M-P1,5%1,0%0,5%
6,0
5,5
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
Concentración del conservante
Reducció
n L
og
Gráfica de valores individuales
62
Interpretación
En la gráfica de valores individuales, se compara la reducción logarítmica transcurrido
28 días desde el recuento inicial para Escherichia coli en relación a las diferentes
concentraciones de aceite esencial de tomillo y el conservante sintético (M-P).
Presentando a una concentración del 1,0% y 1,5% un comportamiento antimicrobiano
similar al M-P, además a una concentración del 0,5% hay una mayor variación
(dispersión de los puntos) de los datos.
Tabla 4.21. Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Staphylococcus aureus
Origen de
las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de
los cuadrados F Probabilidad
Valor crítico
para F
Entre
grupos 1,3591001 3 0,45303337 0,33342284 0,80174755 4,066180551
Dentro de
los grupos 10,869882 8 1,35873525
Total 12,2289821 11
Elaborado por: La autora
Interpretación
Siendo el valor P (0,80) mayor que 0,05 al 95% de confianza y que el valor F calculado
(0,3334) es menor que el F tabulado (4,0662), la concentración de aceite esencial de
tomillo no tiene un efecto estadísticamente significativo sobre sobre la reducción
logarítmica de Staphylococcus aureus. Lo que significa que se acepta la hipótesis nula
entre los tratamientos.
Gráfica 4.16 Gráfica de valores individuales: concentración de aceite esencial de
tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Staphylococcus aureus.
M-P1,5%1,0%0,5%
6,0
5,5
5,0
4,5
4,0
Concentración
Reducció
n L
og.
Gráfica de valores individuales
63
Interpretación
Como se puede observar en la gráfica 4.16 la media de la reducción logarítmica
correspondiente a una concentración del 1,0% de aceite esencial, frente a
Staphylococcus aureus es mayor en relación a las otras concentraciones ensayadas,
presentando una mayor eficacia antimicrobiana frente al microorganismo de prueba.
Tabla 4.22. Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Candida albicans
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de los
cuadrados F Probabilidad
Valor crítico
para F
Entre grupos 34,6422443 3 11,5474148 4,54213577 0,03863178 4,066180551
Dentro de los
grupos 20,3382996 8 2,54228745
Total 54,9805438 11
Elaborado por: La autora
Interpretación
Siendo el valor P (0,04) menor que 0,05 al 95% de confianza y que el valor F calculado
(4,5421) mayor que el F tabulado (4,0662), la concentración de aceite esencial de
tomillo tiene un efecto estadísticamente significativo sobre sobre la reducción
logarítmica de Candida albicans. Lo que significa que se acepta la hipótesis alternativa
entre los tratamientos.
Prueba de Tukey para Candida albicans
Se utilizara el Test HSD (Diferencia significativamente honesta) de Tukey ya que
permite comparar las medias de los niveles de un factor después de haber rechazado la
Hipótesis nula de igualdad de medias mediante la técnica ANOVA.
Tabla 4.23. Prueba de Tukey para reducción logarítmica de Candida albicans
HSD= 4,17013295
Multiplicador= 4,53
MSe= 2,542287446
n= 3
0,50% 1,00% 1,50% M-P
0,50%
1,7 0,8 4,5
1,00% 1,7
-0,9 2,8
1,50% 0,8 0,9
3,7
M-P 4,5 2,8 3,7
Elaborado por: La autora
64
Interpretación
Mediante la diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey, se puede establecer
que existe una diferencia estadísticamente significativa en cuanto al valor de reducción
logarítmica de Candida albicans entre la concentración de 0,5% de aceite esencial de
tomillo y la mezcla de parabenos (Metilparabeno y propilparabeno).
Gráfica 4.17 Gráfica de valores individuales: concentración de aceite esencial de
tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Candida albicans.
Gráfica 4.18 Gráfica de intervalos. Prueba de Tukey concentración de aceite esencial
de tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Candida albicans
Interpretación
La gráfica 4.18 muestra un símbolo de la media con una barra de intervalos de
confianza del 95%, identificando tres grupos homogéneos, es decir a la concentración
de aceite esencial de tomillo de 0,5%, 1,0% y 1,5% todas las barras de intervalos son
fácilmente superponibles entre sí, lo que estadísticamente significaría homogeneidad
entre estos tratamientos, sin embargo la barra del intervalo de la mezcla de parabenos
M-P1,5%1,0%0,5%
6
5
4
3
2
1
Concentración
Reducció
n L
og.
6
4,33333
5,21774
1,50369
Gráfica de valores individuales
M-P1,5%1,0%0,5%
12
10
8
6
4
2
0
-2
-4
Concentración
Reducció
n L
og.
0
6
4,333335,21774
1,50369
95% IC para la mediaGráfica de intervalos
65
(M-P) no se sobrepone con respecto a la concentración de 0,5% por lo que la diferencia
entre las medias son significativamente diferentes. Además en la gráfica 4.17 se puede
observar que las medias entre los tres primeros grupos (0,5%, 1,0% y 1,5%) son
próximos, identificándose un mayor rango de dispersión entre las medias del 0,5% y M-
P.
Tratamiento estadístico (Análisis 2).
Tabla 4.24. Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Pseudomonas
aeruginosa.
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de
los cuadrados F Probabilidad
Valor
crítico
para F
Entre grupos 27,1978885 3 9,06596282 97,009013 1,2472E-06 4,06618
Dentro de los
grupos 0,74763881 8 0,09345485
Total 27,9455273 11
Elaborado por: La autora
Interpretación
Siendo el valor p (0.00) menor que 0,05 con un nivel de confianza del 95% y el valor
de F calculado (97,0090) mayor que el valor F tabulado (4,0662), se rechaza la
hipótesis nula, determinando que la concentración de aceite esencial de tomillo tiene un
efecto estadísticamente significativo sobre la variable respuesta (reducción logarítmica
de Pseudomonas aeruginosa).
Prueba de Tukey para Pseudomonas aeruginosa
Tabla 4.25. Prueba de Tukey para reducción logarítmica de Pseudomonas aeruginosa
HSD= 0,79953688
Multiplicador= 4,53
MSe= 0,09345485
n= 3
Elaborado por: La autora
0,50% 1,00% 1,50% M-P
0,50% -0,3 -3,7 -0,7
1,00% 0,3 -3,5 -0,4
1,50% 3,7 3,5 3,1
M-P 0,7 0,4 -3,1
66
Interpretación
Mediante la diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey, se puede establecer
que existe una diferencia estadísticamente significativa en cuando al valor de reducción
logarítmica de Pseudomonas aeruginosa entre la concentración de 0,5% de aceite
esencial de tomillo con 1,5%; 0,5% con la mezcla de parabenos (M-P), 1% con 1,5% de
aceite esencial de tomillo y entre 1,5% con mezcla de parabenos (M-P).
M-P1,5%1,0%0,5%
6
5
4
3
2
1
Concentración
Re
du
cció
n L
og
.
Gráfica de valores individuales
Gráfica 4.19. Gráfica de valores individuales: concentración de aceite esencial de
tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Pseudomonas aeruginosa
M-P1,5%1,0%0,5%
6
5
4
3
2
1
Concentración
Re
du
cció
n L
og
.
95% IC para la media
Gráfica de intervalos
Gráfica 4.20. Gráfica de intervalos. Prueba de Tukey concentración de aceite esencial
de tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Pseudomonas
aeruginosa
67
Interpretación
La gráficas 4.19 y 4.20 muestra intervalos de confianza del 95% para cada una de las
medias. A partir de los cual se puede identificar dos grupos homogéneos, es decir a la
concentración de aceite esencial de tomillo de 0,5%, donde es fácilmente superponible
entre sí con la concentración al 1,0% y mezcla de parabenos (M-P), y el límite superior
es prácticamente superponible al límite inferior de la mezcla de parabenos (M-P), lo
que estadísticamente significaría homogeneidad entre estos tratamientos.
Tabla 4.26 Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Escherichia coli
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados
de
libertad
Promedio de
los cuadrados F Probabilidad
Valor
crítico
para F
Entre grupos 7,45012612 3 2,48337537 2,1516148 0,17182461 4,06618
Dentro de los
grupos 9,23353157 8 1,15419145
Total 16,6836577 11
Elaborado por: La autora
Interpretación
Siendo el valor P (0,17) mayor que 0,05 al 95% de confianza y que el valor F calculado
(2,1516) menor que el F tabulado (4,0662), la concentración de aceite esencial de
tomillo no tiene un efecto estadísticamente significativo sobre sobre la reducción
logarítmica de Escherichia coli. Lo que significa que se acepta la hipótesis nula entre
los tratamientos.
M-P1,5%1,0%0,5%
6,0
5,5
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
Concentración
Re
du
cció
n L
og
.
Gráfica de valores individuales
Gráfica 4.21. Gráfica de valores individuales: concentración de aceite esencial de
tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Escherichia coli
68
Interpretación
En la gráfica 4.21 se puede evidenciar que a una concentración del 1,0% y 1,5% de
aceite esencial de tomillo, presentan un comportamiento antimicrobiano similar frente a
Escherichia coli, por otra parte la eficacia antimicrobiana de la mezcla de parabenos
(M-P) frente a Escherichia coli es menor en comparación con el aceite esencial a las
concentraciones ensayadas.
Tabla 4.27 Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Staphylococcus aureus
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de
los cuadrados F Probabilidad
Valor
crítico
para F
Entre grupos 18,308452 3 6,10281733 7,6749824 0,00968946 4,06618
Dentro de los
grupos 6,36125744 8 0,79515718
Total 24,6697094 11
Elaborado por: La autora
Interpretación:
Siendo el valor p (0,01) menor que 0,05 con un nivel de confianza del 95% y el valor
de F calculado (7,6750) mayor que el valor F tabulado (4,0662), se rechaza la hipótesis
nula determinando que la concentración de aceite esencial de tomillo tiene un efecto
estadísticamente significativo sobre la variable respuesta (reducción logarítmica de
Staphylococcus aureus).
Prueba de Tukey para Staphylococcus aureus
Tabla 4.28. Prueba de Tukey para reducción logarítmica de Staphylococcus aureus
HSD= 2,33219074
Multiplicador= 4,53
MSe= 0,79515718
n= 3
0,50% 1,00% 1,50% M-P
0,50% -0,8 -0,8 2,2
1,00% -0,8 0,0 3,0
1,50% -0,8 0,0 3,0
M-P 2,2 3,0 3,0
Elaborado por: La autora
69
Interpretación
Mediante la diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey, se puede establecer
que existe una diferencia estadísticamente significativa en cuanto a la reducción
logarítmica de Staphylococcus aureus entre la concentración del 1,0% y 1,5% de aceite
esencial de tomillo con la mezcla de parabenos (M-P) como se indica en la tabla 4.28 y
se observa en la gráfica 4.22.
M-P1,5%1,0%0,5%
6
5
4
3
2
1
Concentración
Re
du
cció
n L
og
.
Gráfica de valores individuales
Gráfica 4.22 Gráfica de valores individuales: concentración de aceite esencial de
tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Staphylococcus aureus
M-P1,5%1,0%0,5%
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Concentración
Re
du
cció
n L
og
.
95% IC para la media
Gráfica de intervalos
Gráfica 4.23 Gráfica de intervalos. Prueba de Tukey concentración de aceite esencial
de tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Staphylococcus aureus
70
Interpretación
La gráfica 4.23 muestra intervalos de confianza del 95% para cada una de las medias. A
partir de los cual se puede identificar tres grupos homogéneos, es decir a la
concentración de aceite esencial de tomillo de 0,5%, donde su límite superior es
fácilmente superponible entre sí con la concentración al 1,0% y 1,5% y su límite
inferior es superponible con la mezcla de parabenos, y el límite superior es
prácticamente superponible al límite inferior de la mezcla de parabenos (M-P), lo que
estadísticamente significaría homogeneidad entre estos tratamientos.
Tabla 4.29. Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Candida albicans
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de los
cuadrados F Probabilidad
Valor
crítico
para F
Entre grupos 44,8214639 3 14,940488 56,759031 9,798E-06 4,06618
Dentro de los
grupos 2,10581295 8 0,26322662
Total 46,9272768 11
Elaborado por: La autora
Interpretación:
Siendo el valor p (0.00) menor que 0,05 con un nivel de confianza del 95% y el valor
de F calculado (56,759031) mayor que el valor F tabulado (4,0662), se rechaza la
hipótesis nula determinando que la concentración de aceite esencial de tomillo tiene un
efecto estadísticamente significativo sobre la variable respuesta (reducción logarítmica
de Candida albicans).
Prueba de Tukey para Candida albicans.
Tabla 4.30. Prueba de Tukey para reducción logarítmica de Candida albicans.
HSD= 1,34184539
Multiplicador= 4,53
MSe= 0,26322662
n= 3
0,50% 1,00% 1,50% M-P
0,50% -4,1 -4,1 -0,4
1,00% 4,1 0,0 3,7
1,50% 4,1 0,0 3,7
M-P 0,4 -3,7 -3,7
Elaborado por: La autora
71
Interpretación
Mediante la diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey, se puede establecer
que existe una diferencia estadísticamente significativa en cuando al valor de reducción
logarítmica de Candida albicans entre la concentración del 0,5% de aceite esencial de
tomillo con el 1,0% y 1,5%, mezcla de parabenos (M-P) con el 1,0 y 1,5% de aceite
esencial de tomillo como se puede identificar en la tabla 4.30.
M-P1,5%1,0%0,5%
6
5
4
3
2
1
Concentración
Re
du
cció
n L
og
.Gráfica de valores individuales
Gráfica 4.24 Gráfica de valores individuales: concentración de aceite esencial de
tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Candida albicans.
M-P1,5%1,0%0,5%
6
5
4
3
2
1
0
Concentración
Re
du
cció
n L
og
.
95% IC para la media
Gráfica de intervalos
Gráfica 4.25 Gráfica de intervalos. Prueba de Tukey concentración de aceite esencial
de tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Candida albicans
Interpretación
La gráfica 4.25 muestra intervalos de confianza del 95% para cada una de las medias. A
partir de los cual se puede identificar dos grupos homogéneos, es decir a la
concentración de aceite esencial de tomillo de 0,5%, donde es fácilmente superponible
entre sí con la mezcla de parabenos (M-P) y las barras de intervalos son fácilmente
72
superponibles al 1,0% con las barras de intervalo al 1,5% ,lo que estadísticamente
significaría homogeneidad entre estos tratamientos.
Análisis estadístico ANOVA de dos factores.
Tabla 4.31. Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Pseudomonas
aeruginosa
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de los
cuadrados F Probabilidad
Valor
crítico para
F
Tiempo 17,3591268 1 17,3591268 27,8970798 7,448E-05 4,49399848
Concentración 29,1509622 3 9,71698741 15,6157379 5,1814E-05 3,23887152
Interacción 7,21354107 3 2,40451369 3,8641869 0,02965711 3,23887152
Dentro del
grupo 9,95609684 16 0,62225605
Total 63,6797269 23
Elaborado por: La autora
Interpretación
Los valores-P prueban la significancia de cada uno de los efectos, teniendo un valor p
de 0,00 para el análisis 1 y 0,00 para la concentración de aceite esencial de tomillo y
0,03 para la interacción dentro del grupo, siendo menores que 0,05 con un nivel de
confianza del 95% se establece que el tiempo de análisis y la concentración de aceite
esencial de tomillo tienen un efecto estadísticamente significativo sobre la reducción
logarítmica de Pseudomonas aeruginosa.
Día
Concentración
900
1,50%1,00%0,50%0,00%1,50%1,00%0,50%0,00%
6
5
4
3
2
1
Re
d.
Lo
g.
Gráfica de valores individuales de Red. Log. vs. Día. Concentración
Gráfica 4.26 Gráfica de valores individuales: concentración de aceite esencial de
tomillo y mezcla de parabenos, y tiempo de análisis vs Reducción logarítmica de
Pseudomonas aeruginosa.
Nota: 0,00%: hace referencia al metilparabeno y propilparabeno
73
Interpretación
En la gráfica 4.26 se puede observar que hay una diferencia en el comportamiento de la
eficacia antimicrobiana frente a Pseudomonas aeruginosa a una concentración del 0,5%
y 1,0% de aceite esencial de tomillo, con respecto al análisis 1 y 2.
Tabla 4.32 Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Escherichia coli
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de los
cuadrados F Probabilidad
Valor
crítico para
F
Tiempo 0,29212239 1 0,29212239 0,32825045 0,57465528 4,49399848
Concentración 8,04553607 3 2,68184536 3,01352095 0,06081763 3,23887152
Interacción 6,88953702 3 2,29651234 2,58053211 0,0896579 3,23887152
Dentro del
grupo 14,2390003 16 0,88993752
Total 29,4661958 23
Elaborado por: La autora
Interpretación
Teniendo como resultado un valor p de 0,57 para el tiempo de análisis (análisis 1 y
análisis 2), 0,06 para la concentración de aceite esencial de tomillo y 0,09 para la
interacción dentro del grupo, al ser mayores que 0,05 con un nivel de confianza del
95% se establece que el tiempo de análisis y la concentración de aceite esencial de
tomillo no presentan un efecto estadísticamente significativo sobre la reducción
logarítmica de Escherichia coli.
Día
Concentración
900
1,50%1,00%0,50%0,00%1,50%1,00%0,50%0,00%
6,0
5,5
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
Re
d.
Lo
g
Gráfica de valores individuales de Red. Log vs. Día. Concentración
Gráfica 4.27 Gráfica de valores individuales: concentración de aceite esencial de
tomillo y mezcla de parabenos, y tiempo de análisis vs Reducción logarítmica de
Escherichia coli.
74
Interpretación
En la gráfica 4.27 se puede observar que a una concentración de aceite esencial de 1,0%
y 1,5% presentan una mayor eficacia antimicrobiana frente a Escherichia coli, y no se
ve influenciado por el de tiempo de análisis, manteniendo la misma potencia
microbiológica desde su elaboración hasta la terminación del estudio de estabilidad con
respecto a Escherichia coli.
Tabla 4.33 Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Staphylococcus aureus
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de los
cuadrados F Probabilidad
Valor
crítico para
F
Tiempo 0,80746442 1 0,80746442 0,74977228 0,39934664 4,49399848
Concentración 12,1068246 3 4,03560819 3,74726995 0,03262455 3,23887152
Interacción 7,56072753 3 2,52024251 2,34017491 0,11197205 3,23887152
Dentro del
grupo 17,2311394 16 1,07694622
Total 37,706156 23
Elaborado por: La autora
Interpretación
Teniendo como resultado un valor p de 0,40 para el tiempo de análisis (análisis 1 y
análisis 2), 0,03 para la concentración de aceite esencial de tomillo y 0,11 para la
interacción dentro del grupo, al ser mayor que 0,05 y menor que 0,05 respectivamente
con un nivel de confianza del 95% se establece que el tiempo no presenta un efecto
estadísticamente significativo sobre la variable respuesta y que la concentración de
aceite esencial de tomillo tiene un efecto estadísticamente significativo sobre la
reducción logarítmica de Staphylococcus aureus.
Día
Concentración
900
1,50%1,00%0,50%0,00%1,50%1,00%0,50%0,00%
6
5
4
3
2
1
Re
d.
Lo
g
Gráfica de valores individuales de Red. Log vs. Día. Concentración
Gráfica 4.28 Gráfica de valores individuales: concentración de aceite esencial de
tomillo y mezcla de parabenos, y tiempo de análisis vs Reducción logarítmica de
Staphylococcus aureus.
75
Interpretación
Como se puede evidenciar en la gráfica 4.28 a una concentración de 1,0% y 1,5% de
aceite esencial de tomillo se alcanza una mayor inhibición del crecimiento de
Staphylococcus aureus. Además en las gráficas 4.25, 4.26 y 4.27 se observa una
disminución de la eficacia antimicrobiana de la mezcla de parabenos (metilparabeno y
propilparabeno) en el análisis 2.
Tabla 4.34 Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Candida albicans
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de los
cuadrados F Probabilidd
Valor
crítico para
F
Tiempo 0,21938601 1 0,21938601 0,1563963 0,69771923 4,49399848
Concentración 48,8893667 3 16,2964556 11,6174471 0,00027207 3,23887152
Interacción 30,5743414 3 10,1914471 7,26529748 0,00271772 3,23887152
Dentro del grupo 22,4441125 16 1,40275703
Total 102,127207 23
Elaborado por: La autora
Interpretación
Teniendo como resultado un valor p de 0,70 para el tiempo de análisis (análisis 1 y
análisis 2), 0,00 para la concentración de aceite esencial de tomillo y 0,00 para la
interacción dentro del grupo, al ser mayor que 0,05 y menor que 0,05 respectivamente
con un nivel de confianza del 95% se establece que el tiempo de análisis no presenta un
efecto estadísticamente significativo sobre la variable respuesta y que la concentración
de aceite esencial de tomillo tiene un efecto estadísticamente significativo sobre la
reducción logarítmica de Candida albicans.
Día
Concentración
900
1,50%1,00%0,50%0,00%1,50%1,00%0,50%0,00%
6
5
4
3
2
1
Re
d.
Lo
g
Gráfica de valores individuales de Red. Log vs. Día. Concentración
Gráfica 4.29 Gráfica de valores individuales: concentración de aceite esencial de
tomillo y mezcla de parabenos, y tiempo de análisis vs Reducción logarítmica de
Candida albicans.
76
Interpretación
Como se puede observar en la gráfica 4.29 hay una reducción notable de la actividad
microbiológica frente a Candida albicans a una concentración del 0,5% de aceite
esencial de tomillo con respecto al tiempo de análisis, puede deberse a una degradación
del aceite esencial o a una disminución de la afinidad micelar del aceite esencial con el
surfactante, lo que pudo haber neutralizado parcialmente su actividad antimicrobiana.
(Nostro, 2004)
77
Capítulo V
Conclusiones y Recomendaciones
Conclusiones
Se determinó que al utilizar como conservante natural microbiológico, una
concentración del 1,5% de aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.) en una
emulsión O/W de uso tópico (loción), protege al producto contra la proliferación
microbiana de Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Escherichia coli (ATCC
25922) y Staphylococcus aureus (ATCC 25293), y micótica frente a Candida
albicans (ATTC RTB012) durante el periodo de vida útil. Satisfaciendo los criterios
establecidos para la Prueba de Eficacia Antimicrobiana de la USP-36. (Véase
Grafica 4.16)
De acuerdo al estudio de estabilidad microbiológica acelerado, es posible
establecer que al utilizar una concentración de aceite esencial de tomillo del 1,5% no
se ve afectada su actividad antimicrobiana frente Pseudomonas aeruginosa,
Escherichia coli, Staphylococus aureus y Candida albicans durante el periodo de
vida útil de la loción (emulsión O/W) de uso tópico. Además de mostrar una mejor
eficacia antimicrobiana que la mezcla de parabenos (metilparabeno y
propilparbeno).
Se confirma la hipótesis planteada, en la cual el aceite esencial del tomillo
(Thymus vulgaris L.) incorporado como conservante antimicrobiano en una
emulsión o/w de uso tópico a una concentración del 0,5%, 1,0% y 1,5%, tiene
actividad antimicrobiana, ya que cumple con los criterios establecidos para
productos de categoría 2 por la USP-36. Produciéndose a los 14 días desde la
inoculación para el análisis 1 y 2, una reducción logarítmica de no menos de 2,0 de
Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Staphylococus aureus desde el
recuento inicial y a los 28 días desde la inoculación ningún incremento del recuento
de los 14 días, y para Candida albicans ningún incremento a los 14 y 28 días
respecto al recuento inicial.
Las fórmulas de loción del tipo de emulsión aceite en agua (o/w) elaboradas
utilizando como conservante natural aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris L.)
a concentraciones del 0,5%, 1,0% y 1,5% y como conservante sintético una mezcla
de parabenos (metilparabeno y Propilparabeno), cumplen con las especificaciones
organolépticas y fisicoquímicas, manteniendo su estabilidad durante el tiempo de
estudio.
78
Recomendaciones
Ampliar la investigación del aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.),
en su uso como conservante antimicrobiano en otras formulaciones farmacéuticas y
cosméticas.
Realizar un estudio de estabilidad a largo plazo, para determinar si el aceite
esencial de tomillo (Thymus vulgaris L.) mantiene su comportamiento como
conservante antimicrobiano durante el periodo de vida útil del producto.
Efectuar una evaluación toxicológica del aceite esencial de tomillo (Thymus
vulgaris L.), para establecer parámetros de seguridad.
Llevar a cabo un estudio cinético de la combinación del metilparabeno y
propilparabeno, y compararlo con el efecto que tiene sobre su actividad como
conservante antimicrobiano, debido a que en la presente investigación, se evidenció
una reducción de la eficacia antimicrobiana de esta combinación después de haber
sometido al producto final a un estudio de estabilidad microbiológica acelerada.
79
BIBLIOGRAFÍA
Bogdan , S. (2015). Evaluación de timol para el control antifúngico sobre películas de pintura.
REVISTAMETERIA, 699-704.
ALONSO, J. (2004). Tratado de Fitofármacos y Nutracéuticos (Primera ed.). Argentina. 230-928
y 1037-1041.
Alzate, D. (2008). EVALUACIÓN DE LA FITOTOXICIDAD Y LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA CONTRA
Colletotrichum acutatum DE LOS ACEITES ESENCIALES DE TOMILLO (Thymus vulgaris),
LIMONCILLO (Cymbopogon citratus), Y SUS COMPONENTES MAYORITARIOS. VITAE,
116-125.
Aulton , M. E. (2004). Tipos de emulsión. En Farmacia. La ciencia del diseño de las formas
farmacéuticas (Segunda ed., págs. 348-349). España: ELSEVIER.
Aulton, M. (2004). Contaminación microbiológica y conservación de los productos
famacéuticos. En M. Aulton, Farmacia: La ciencia del diseño de las formas
famacéuticas (Segunda ed., págs. 664-665). España: Elsevier.
Bagamboula, C. (2004). Inhibitory effect of thyme and basil essential oils, carvacrol, thymol,
estragol, linalool and p-cymene towards Shigella sonnei and S. flexneri. Elsevier, 33-42.
Berkhout, R. (2002). Candida albicans. Iberoam Micol. Obtenido de http://hongos-
alergenicos.reviberoammicol.com/files/025.PDF
Blanca Díaz Ley, F. H.-S. (2006 ). Parabenos: ¿mito o realidad? Servicio de Dermatología.
Escuela Nacional de Medicina del Trabajo., 231-240.
Carlos Andrés Coy Barrera, Gema Eunice Acosta. (2013). Actividad antibacteriana y
determinación de la composición química de los aceites esenciales de romero
(Rosmarinus officinalis), tomillo (Thymus vulgaris) y cúrcuma (Curcuma longa) de
Colombia. Revista Cubana de Plantas Medicinales, 237-246.
Correa Perez, R. (2014). Chile Patente nº PCT/CL2013/000063 .
CTFA. (Marzo de 2004). GUIDELINES ON STABILITY TESTING OF COSMETIC PRODUCTS.
Obtenido de All rights reserved to CTFA and Colipa:
file:///C:/Users/USUARIO/Downloads/Guidelines%20on%20Stability%20Testing%20of
%20Cosmetics%20Colipa-CTFA,%202004.pdf
Díaz, J. A., & Asencios, R. S. (2008). ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE PLANTAS. DelAlba.
Obtenido de http://www.apicoladelalba.cl/actividad-antimicrobiana-de-plantas-sci/
Domínguez, X. A. (1973). Aceites esenciales o esencias vegetales. En X. A. Domínguez,
Métodos de INVESTIGACIÓN FITOQUÍMICA (págs. 229-235). México: Limusa.
Dr. C. Carlos Andrés Coy Barrera, M. G. (2013). Actividad antibacteriana y determinación de la
composición química de los aceites esenciales de romero (Rosmarinus officinalis),
80
tomillo (Thymus vulgaris) y cúrcuma (Curcuma longa) de Colombia . Revista Cubana de
Plantas Medicinales, 237-246.
Elsevier. (2008). Conservantes. Tipos y sistemas de conservación. Obtenido de OFFARM:
http://www.elsevier.es/ct-revista-offarm-4-articulo-conservantes-tipos-sistemas-
conservacion-13114932
Eurofins. (2008). ESTUDIOS MICROBIOLÓGICOS DEL SISTEMA CONSERVANTE. Obtenido de
http://www.eurofins.es/media/1041/md-18-esp_-_eficacia_conservante_-
_bpt_rev_2.pdf
Europe, C. (s.f.). Period After Opening (PAO). Obtenido de
https://www.cosmeticseurope.eu/using-cosmetics-colipa-the-european-cosmetic-
cosmetics-association/labelling-/how-to-keep-products-/period-after-opening-pao-
.html
Gimeno Gasca, J. M. (2001). Tomillo (Thymus vulgaris L.). Medicina Naturista, 173-175.
Obtenido de file:///C:/Users/USUARIO/Downloads/Dialnet-TomilloThymusVulgarisL-
202456.pdf
Juan Rojas Armas, J. O. (2015). Aceite esencial de Thymus vulgaris L (tomillo), su combinación
con EDTA contra Cándida albicans y formulación de una crema . An Fac med, 235-240.
Larry M. Bush. (s.f.). Infecciones por Pseudomonas. Obtenido de Infecciones producidas por
Pseudomonas aeruginosa: http://www.merckmanuals.com/es-
ca/hogar/infecciones/infecciones-bacterianas/infecciones-por-pseudomonas
Leranoz, S. (AGOSTO de 2002). Conservantes cosméticos. Obtenido de Dermofarmacia:
Conservantes cosméticos :
http://apps.elsevier.es/watermark/ctl_servlet?_f=10&pident_articulo=13034831&pid
ent_usuario=0&pident_revista=4&fichero=4v21n07a13034831pdf001.pdf&ty=14&acc
ion=L&origen=doymafarma&web=www.doymafarma.com&lan=es
Martínez , A. (Febrero de 2003). ACEITES ESENCIALES. Obtenido de
http://farmacia.udea.edu.co/~ff/esencias2001b.pdf
Matiz Melo, G. E. (2015). Actividad antibacteriana in vitro de diecinueve aceites esenciales
frente a bacterias asociadas al acné. Revista Cubana de Farmacia, 103-116 .
Mesa Arango, A. (2004). Productos naturales con actividad antimicótica. Rev Esp Quimioterap,
325-331.
Ministerio de la Protección Social. (2009). DOCUMENTO TÉCNICO GUÍA DE ESTABILIDAD DE
MEDICAMENTOS. Obtenido de
https://www.minsalud.gov.co/Documentos%20y%20Publicaciones/GU%C3%8DA%20
PARA%20EL%20DESARROLLO%20Y%20PRESENTACI%C3%93N%20DE%20LOS%20ESTU
DIOS%20DE%20ESTABILIDAD%20DE%20MEDICAMENTOS%20CONVENCIONALES.pdf
NaturVall. (5 de Abril de 2015). Propiedades del Tomillo -Thymus vulgaris L. Obtenido de
http://www.naturvall.es/tomillo-thymus-vulgaris-l-propiedades-y-aplicaciones/
Nostro, A. (2004). Efficiency of Calamintha officinalis essential oil as preservative in two topical
product types. Journal of Applied Microbiology, 395-401.
81
Nungaray, G. (2014). ¿Cuáles son los efectos secundarios de los parabenos? Obtenido de What
Are the Side Effects of Parabens?: http://www.livestrong.com/es/cuales-son-efectos-
lista_22106/
Olivares Cruz, M. A. (2013). Potencial antimicrobiano de mezclas que incluyen aceites
esenciales o sus componentesen fase vapor. Ingeniería de Alimentos, 78-86. Obtenido
de 2013: http://web.udlap.mx/tsia/files/2013/12/TSIA-71-Olivares-Cruz-et-al-
2013.pdf
Orus, P. (2005). Current trends in cosmetic microbiology. International microbiology, 77-79.
Obtenido de http://www.im.microbios.org/0802/0802077.pdf
Portocarrero, E. (2009). Agentes antimicrobianos presentes en especies y hierbas .
Deparatamento de Ingeñeria Química y Alimentos , 85-93.
Prestes, L. (2008). Actividad de extractos de orégano y tomillo frente a microorganismos
asociados con otitis externa. Rev Cubana Plant Med. Obtenido de
http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1028-47962008000400003
Raymond C Rowe, P. J. (2009). Handbook of Pharmaceutical Excipients (Sexta ed.). (APhA, Ed.)
London.
Rosas Gallos, A. (2011). Actividad antimicrobiana de aceite esencial de tomillo (Thymus
vulgaris). Obtenido de http://www.udlap.mx/WP/tsia/files/No5-Vol-1/TSIA-5(1)-
Rosas-Gallo-et-al-2011.pdf
Salk , J. (2016). MANUAL DE MICROBIOLOGÍA APLICADA A LAS INDUSTRIAS FARMACÉUTICA,
COSMÉTICA Y DE PRODUCTOS MÉDICOS. Obtenido de
http://www.aam.org.ar/descarga-archivos/manual-microbiologia-aplicada.pdf
Santos , H. (2010). Emulsiones Cosméticas. Cosméticos & Tecnología Latinoamérica, 31-35.
Seija, V. (s.f.). Etiopatogenia microbiológica. Obtenido de Género Staphylococcus:
http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/Staphylococcus.pdf
Solís Campoverde, P. N. (211). “EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS
ACEITES ESENCIALES DE ORÉGANO (Origanum vulgare L.) Y TOMILLO (Thymus vulgaris
L.) COMO POTENCIALES BIOCONSERVADORES EN CARNE DE POLLO. Riobamba: Tesis
de grado.
Souza Prestes, L. (2008). Actividad de extractos de orégano y tomillo frente a microorganismos
asociados con otitis externa. Revista Cubana de Plantas Medicinales, 1028-4796.
Téran Soto, R. (2016). Manual de Laboratorio de Microbiología Farmacéutica.
USP-36. (2013). Pruebas físicas/ Cromatografía. En USP-36, FARMACOPE DE LOS ESTADOS
UNIDOS DE AMERICA (Vol. I, pág. 291).
USP-36. (2013). Pruebas microbiólogicas. <51>Prueba de eficacia antimicrobiana. En
Farmacopea de los Estados Unidos (Vol. I, págs. 57-60).
Vila Estapé, J. (2011). Brotes epidémicos causados por Escherichia coli diarreagénicas. Elsevier.
Obtenido de http://www.elsevier.es/es-revista-gastroenterologia-hepatologia-14-
articulo-brotes-epidemicos-causados-por-escherichia-S0210570511003748
82
Anexos
Anexo 1. Ficha técnica del aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.)
83
Anexo 2. Control de calidad en el producto final
.
84
Anexo 3. Control organoléptico y fisicoquímico del producto terminado (loción de tipo emulsión o/w) de uso tópico.
FORMULA
UNITARIA/CARA
CTERISITICAS
COLOR
OLOR
ASPECTO
pH
Estabilidad
de la
emulsión
C1 C2 C1 C2 C1 C2 C1 C2 C1 C2
1 (0,5%) R1 Blanco
amarillento
Blanco
amarillento
Tenue a
especia
Tenue a
especia
Líquido
homogéneo
Líquido
homogéneo
7,77 7,65 C C
R2 Blanco
amarillento
Blanco
amarillento
Tenue a
especia
Tenue a
especia
Líquido
homogéneo
Líquido
homogéneo
7,76 7,64 C C
R2 Blanco
amarillento
Blanco
amarillento
Tenue a
especia
Tenue a
especia
Líquido
homogéneo
Líquido
homogéneo
7,77 7,64 C C
2 (1,0%) R1 Blanco
amarillento
Blanco
amarillento
Ligeramente a
especia
Ligeramente a
especia
Líquido
homogéneo
Líquido
homogéneo
7,80 7,63 C C
R2 Blanco
amarillento
Blanco
amarillento
Ligeramente a
especia
Ligeramente a
especia
Líquido
homogéneo
Líquido
homogéneo
7,82 7,62 C C
R3 Blanco
amarillento
Blanco
amarillento
Ligeramente a
especia
Ligeramente a
especia
Líquido
homogéneo
Líquido
homogéneo
7,81 7,63 C C
3 (1,5%) R1 Blanco
amarillento
Blanco
amarillento
Fuertemente a
especia
Fuertemente a
especia
Líquido
homogéneo
Líquido
homogéneo
7,82 7,61 C C
R2 Blanco
amarillento
Blanco
amarillento
Fuertemente a
especia
Fuertemente a
especia
Líquido
homogéneo
Líquido
homogéneo
7,82 7,62 C C
R3 Blanco
amarillento
Blanco
amarillento
Fuertemente a
especia
Fuertemente a
especia
Líquido
homogéneo
Líquido
homogéneo
7,81 7,62 C C
85
4 Metilparabeno y
propilparabeno
R1 Blanco Blanco Característico
Característico Líquido
homogéneo
Líquido
homogéneo
7,80 7,58 C C
R2 Blanco Blanco Característico Característico Líquido
homogéneo
Líquido
homogéneo
7,81 7.55 C C
R3 Blanco Blanco Característico Característico Líquido
homogéneo
Líquido
homogéneo
7,81 7,57 C C
5 (Sin preservante) R1 Blanco Blanco Característico Característico Líquido
homogéneo
Líquido
homogéneo
7,91 7,67 C C
R2 Blanco Blanco Característico Característico
Líquido
homogéneo
Líquido
homogéneo
7,92 7,62 C C
R3 Blanco Blanco Característico Característico
Líquido
homogéneo
Líquido
homogéneo
7,92 7,65 C C
R: Número de réplica; C1: control organoléptico y fisicoquímico realizado al inicio del estudio. ; C2: control organoléptico y fisicoquímico realizado al
tercer mes del estudio de estabilidad acelerado; C: cumple con la prueba de estabilidad de la emulsión. ELABORADO POR: La autora
86
Anexo 4. Prueba de eficacia antimicrobiana. Test de efectividad del preservante en el
producto final (emulsión O/W de uso tópico). Método USP-36
Análisis 1 en el intervalo T28
Análisis 2 en el intervalo T28
87