Bol. San. Veg. Plagas, 31: 563-575, 2005

El Chancro Carbonoso de Quercus II: Patogenicidad deBiscogniauxia mediterranea

J. J. JIMÉNEZ, M. E. SÁNCHEZ, A. TRAPERO

El Chancro Carbonoso es una enfermedad causada por el ascomiceto xilariáceo Bis-cogniauxia mediterránea (sin. Hypoxylon mediterraneum). Aunque se conoce desdeantiguo afectando al alcornoque en la Península Ibérica, en los últimos años su inciden-cia ha aumentado asociada al decaimiento de Quercus spp en Andalucía. En inoculacio-nes artificiales en ramas cortadas de Q. ilex y Q. súber con B. mediterránea, se hademostrado que las elevadas temperaturas favorecen el desarrollo de necrosis corticalesy la formación del estroma carbonoso. Las inoculaciones en plantones sanos de Q. súber,Q. ilex y Q. coccifera, mostraron que, si bien el hongo es capaz de colonizar las plantasendofíticamente, las necrosis corticales sólo aparecen cuando las plantas sufren estréshídrico severo, siendo el alcornoque el huésped más susceptible. El comportamientocomo patógeno de debilidad que ha mostrado B. mediterránea indica que el ChancroCarbonoso se puede estar sobrevalorando como causa primaria de muerte en los proce-sos de decaimiento que sufren los Quercus en Andalucía.

J. J. JIMÉNEZ, M. E. SÁNCHEZ, A. TRAPERO. Dpto. Agronomía. ETSIAM. Universidad deCórdoba. Apdo. 3048. 14080-Córdoba. Dirección de correo electrónico:ag 1 sahem @ uco.es

Palabras clave: Carbón, decaimiento, endofito, estrés hídrico, Hypoxylon medite-rraneum, Quercus coccifera, Quercus ilex, Quercus suber

INTRODUCCIÓN

El Chancro Carbonoso o Enfermedad delCarbón se conoce desde antiguo afectando alalcornoque en la Península Ibérica y el nortede Marruecos (BAETA NEVES, 1948; 1949;1954; VIEIRA NATIVIDADE, 1950; TORRES,1985). Su agente causal, Biscogniauxiamediterránea (sinónimo Hypoxylon medite-rraneum), presenta una amplia gama dehuéspedes, principalmente entre las frondo-sas de la cuenca mediterránea (TORRES,1993; VANNINI et al, 1996a) y de Norteamé-rica (SINCLAIR et al, 1987). Su incidencia haaumentado a partir de los años 80, asociadaa los decaimientos de Quercus spp., y así seha citado en Marruecos (BAKRY y ABOU-ROUH, 1995), en Italia (AMORINI et al, 1995;

VANNINI et al, 1996c), en Portugal (NATER-CIA y SANTOS, 1995; SANTOS et al, 1999) yen España (NAVARRO y FERNÁNDEZ, 2000;SÁNCHEZ et al, 2000).

Distintos autores asocian el desarrollo dela enfermedad al estrés hídrico sufrido por elhuésped (VANNINI y MUGNOZZA, 1991;VANNINI et al, 1992; VANNINI y VALENTINI,1994; LUQUE et al, 2000), considerando quees un parásito facultativo que causa lesionesnecróticas sólo en estas condiciones. Sinembargo, otros autores (SANTOS et al, 1999)consideran que B. mediterránea actúa máscomo un saprofito que como patógeno, desa-rrollando su estroma en tejidos que previa-mente han muerto. También está descritacomo endofito en Quercus spp. asintomáti-cas (COLLADO et al, 2001; MAZZAGLIA et al,

Figura 1. Metodología de la inoculación de Quercusspp. con Biscogniauxia mediterranea, a) inoculación

de rama cortada mediante micelio con herida, b)inoculación de rama cortada con 50 ul de suspensiónde ascosporas, c) inoculación en planta viva con 50 ul

de suspensión de ascosporas.

2001), aunque no se conocen bien las condi-ciones necesarias para el paso de la faseendofítica a la fase patogénica. En España sehan realizado pocos trabajos sobre la patoge-nicidad de Biscogniauxia mediterranea, porlo que no está claro el papel que juega en eldecaimiento de Quercus spp. Por ello, eneste trabajo se plantean los siguientes objeti-vos: (i) caracterizar la patogenicidad de B.mediterranea sobre Quercus ilex, Q. suber yQ. coccifera y (ii) determinar la colonizaciónendofítica en Quercus spp.

MATERIAL Y MÉTODOS

Aislamiento a partir de leñas de encinaEn marzo de 2001 se tomaron al azar res-

tos de poda de encina libres de estroma car-bonoso, en una finca con alta incidencia deCarbón, en Villanueva de Córdoba. Se reali-zaron aislamientos de 40 de estas ramas,sembrando cuñas de tejido cortical en placasde PDA acidificado, empleando la metodolo-gía utilizada por SÁNCHEZ et al. (2003).

Ensayos de patogenicidadPara evaluar la capacidad de los aislados

para reproducir los síntomas observados encampo y cumplimentar los postulados deKoch, se realizaron inoculaciones artificialesen diferentes condiciones, utilizando distintotipo de material vegetal.

Experimento 1: Inoculaciones en ramascortadas

El material vegetal se obtuvo de dos fin-cas de la provincia de Huelva, con escasa onula presencia del Carbón, y consistió enramas de encina y alcornoque asintomáticos,de 5-15 mm de diámetro y 24 cm de longi-tud. Las ramas cortadas se lavaron, se desin-festaron superficialmente con un algodónimpregnado en alcohol y se sellaron susextremos con Parafilm. Se utilizaron 3 méto-dos de inoculación, micelio con herida,micelio sin herida y ascosporas.

En las inoculaciones con micelio se utiliza-ron dos aislados monoascospóricos: HYP-8,obtenido de estromas de encina de Villanuevade Córdoba y HYP-22, procedente de estro-mas de un alcornoque situado en Los Barrios

Figura 2. Inoculación de plantas de Quercus spp. con 5. mediterranea, a) plantas sanas de 3 años antes de lainoculación, tutoradas y etiquetadas al azar en umbráculo, b) plantas inoculadas y asintomáticas tras 5 meses de

incubación en umbráculo, trasladadas a invernadero para someterlas a estrés hídrico.

(Cádiz), ambos conservados en la coleccióndel Departamento de Agronomía de la UCO.Como inoculo se emplearon cilindros de agar(PDA con 5 g/1 de extracto de levadura(PDYA), JIMÉNEZ et al, 2004) de 5 mm dediámetro y 3 mm de espesor, conteniendomicelio en crecimiento activo. Para las inocu-laciones con herida, se realizaron heridassuperficiales en el punto medio de la rama conun sacabocados estéril, retirando la cortezaexterna y colocando el inoculo en contactocon la corteza interna (Figura la), según lametodología utilizada por SÁNCHEZ et al.(2003) para la inoculación de ramas de encinacon Botryosphaeria spp. En las inoculacionessin herida, se colocó directamente el disco deagar con micelio en contacto con la corteza,previamente desinfestada con un algodónimpregnado en alcohol, en el punto medio dela rama, y posteriormente se selló con Para-film. En ambos casos, a las ramas testigo seles aplicó una pieza de agar estéril. Las ramasinoculadas y testigo se colocaron en cámarashúmedas. Las cámaras consistieron en bande-jas de 27 x 27 x 12,5 cm con el fondo cubier-to de agua, en las que se colocaron rejillas deplástico sobre las que se situaron las ramas.Las bandejas se cerraron y se incubaron encámaras de crecimiento a 15, 20, 25 y 30° Ccon 12 h de fotoperiodo durante 1 mes.

Para las inoculaciones con ascosporas seutilizaron los mismos estromas de los queprocedían los aislados monoascospóricosempleados en las inoculaciones con micelio:HYP-8, ascosporas producidas en estromascarbonosos presentes en encinas de Villanue-va de Córdoba, y HYP-22, ascosporas pro-ducidas en estromas de alcornoque de LosBarrios, Cádiz. Los estromas se humedecie-ron y se pegaron a la tapa de varias placas dePetri vacías, incubándolas durante 12 h a 22°C para provocar la descarga de ascosporas.Posteriormente, se tomaron 5 mi de aguadesionizada estéril y se lavó un número deplacas suficiente para obtener una concentra-ción de 1,5 x 106 ascosporas/ml. Con unescalpelo estéril se hizo un corte superficiallongitudinal en forma de lengüeta de unos 2cm de longitud, en el punto medio de la ramaa inocular. En la herida se aplicaron 50 mi dela suspensión de ascosporas o de agua estérilen el caso de las ramas testigo (Figura Ib).Todas las ramas se colocaron en cámarahúmeda y se incubaron en cámara de creci-miento a 20° C durante 24 h. Una vez trans-currido este tiempo, se sellaron las heridascon Parafilm y se incubaron las ramas a dis-tintas temperaturas, siguiendo el mismo pro-cedimiento empleado en las inoculacionescon micelio.

En este ensayo se prepararon seis repeti-ciones (ramas) por cada aislado inoculado,huésped, método de inoculación y tempera-tura, así como los correspondientes testigossin inocular, inoculando así un total de 432ramas.

Para la evaluación de síntomas y signos seestimó el porcentaje de superficie de la ramacubierta de estroma según la siguiente esca-la: 0 = ausencia total de estroma, 1 = 1- 33%de superficie cubierta de estroma, 2 =34-66%, y 3 = 67-100%. También se consignóel número de ramas en las que hubo produc-ción de conidias en grietas de la corteza, ytras retirar la corteza externa con un escalpe-lo, se midió la longitud de las necrosis corti-cales, en el sentido basal y apical a partir delpunto de inoculación. Para el reaislamientode la especie inoculada, se tomaron muestrasde tejido cortical cada 2,5 cm y se sembraronen PDYA, empleando la metodología utiliza-da por SÁNCHEZ et al. (2003).

Con los datos correspondientes a la super-ficie cubierta de estroma y a la longitud delas lesiones, se realizó un análisis de lavarianza utilizando el programa Statistix forWindows (ANALYTICAL SOFTWARE, 2003).Las comparaciones de medias se realizaronsegún el test LSD protegido de Fisher, alnivel de probabilidad del 5% (STEEL yTORRIE, 1985). También se hicieron contras-tes polinómicos de la longitud de la lesión enfunción de la temperatura de incubación.

Experimento 2: Inoculaciones en plantasvivas

Los plantones de alcornoque, encina ycoscoja utilizados en este experimento seobtuvieron del vivero San Jerónimo (Sevilla)de la Consejería de Medio Ambiente de laJunta de Andalucía. Eran plantas proceden-tes de semilla, de 3 años de edad y de unaaltura de 1 a 1,8 m. Estas plantas se coloca-ron en umbráculo, se tutoraron y se inocula-ron en abril de 2003, utilizando la mismametodología de inoculación, el mismo tipode inoculo (micelio de aislados monoascos-póricos y ascosporas procedentes de los mis-mos estromas) y los mismos aislados (HYP-8 y HYP-22) empleados en la inoculación de

ramas cortadas. Para la inoculación conascosporas se relizaron cortes en forma delengüeta en el punto medio del tallo y allí sedepositó un volumen de 50 mi de suspensiónde ascosporas o de agua estéril en el caso delas plantas testigo, sellando inmediatamentelas heridas con Parafilm (SÁNCHEZ et al,2002) (Figura le).

En este experimento se realizaron cincorepeticiones por aislado, huésped y métodode inoculación, con sus correspondientestestigos, siendo la unidad experimental laplanta inoculada. De este modo, se inocula-ron un total de 135 plantas.

Las plantas se colocaron en umbráculo alazar (Figura 2a) y se mantuvieron allí duran-te 5 meses, hasta finales de septiembre de2003. Durante este período, se regaron cada48 h, y se fueron realizando observacionesperiódicas de los síntomas. Transcurrido estetiempo, se trasladaron a invernadero, y sesometieron a estrés hídrico (Figura 2b). Elestrés fue gradual, incrementándose progre-sivamente durante 10 semanas. En primerlugar se suprimió el riego hasta que las plan-tas mostraron síntomas de sequía: amarillezy marchitez foliar. Esto sucedió a los 10 días,y entonces se regaron con 50 mi de agua porplanta, utilizando esta dosis cada vez que seregó. Tras cada riego, se incrementó en 1semana el periodo de sequía. De este modo,se regó a la semana siguiente, 2 semanas mástarde y 3 semanas más tarde. Por último, 4semanas después del último riego, se levantóel experimento. Así, el experimento transcu-rrió a lo largo de 8 meses, de los cuales los 3últimos las plantas estuvieron sometidas aestrés hídrico. Una vez concluido el experi-mento se cortaron las plantas a la altura delcuello de la raíz y se eliminaron las ramillaslaterales. Con un escalpelo estéril se retiró lacorteza externa y se midió la longitud de lasnecrosis presentes en la corteza interna.Posteriormente, mediante incisiones másprofundas en el tejido leñoso, se midió lalongitud de la tinción de vasos en el sentidobasal y apical a partir del punto de inocula-ción. Para el reaislamiento de la especie ino-culada, se tomaron cuñas de corteza de todos

los tallos a 2 cm del punto de inoculación yposteriormente cada 10 cm, en las direccio-nes distal y proximal, y se sembraron enmedio PDYA.

Con los datos de longitud de las lesionesy longitud de la tinción de vasos, se realiza-ron análisis de la varianza utilizando el pro-grama Statistix for Windows (ANALYTICALSOFTWARE, 2003). Las comparaciones demedias se realizaron según el test LSD pro-tegido de Fisher, al nivel de probabilidad del5% (STEEL y TORRIE, 1985). En los casos enlos que la varianza interna era muy elevada,se hizo una transformación logarítmica delos datos antes del análisis estadístico.

Una vez finalizada la evaluación, se cortócada tallo en segmentos de 20 cm de longi-tud, y se incubaron durante 1 mes a 30° C encámaras húmedas, siguiendo el mismo pro-cedimiento descrito en el ensayo de patoge-nicidad en rama cortada.

RESULTADOS

Aislamiento a partir de leñas de encinaA partir del tejido cortical de leñas de

encina asintomáticas se obtuvo el anamorfode B. mediterranea (Períconiella sp.) ensiete de las 40 ramas muestreadas (17,5%).También se aislaron otros hongos de losgéneros Diplodia, Fusarium, Trichoderma,Trichotecium y Penicillium.

Ensayos de patogenicidadExperimento 1: Inoculaciones en ramas

cortadasLa sintomatología observada en las ramas

inoculadas fue la producción de estroma enforma de nodulos negros que rompieron lacorteza y salieron al exterior (Figura 3a), laproducción de conidias bajo la corteza(Figura 3b) y la necrosis del tejido cortical(Figura 3c). El tejido cortical necrótico sólofue visible tras retirar la corteza externa,prensentando una coloración de marrónoscura a negra, tomando en ocasiones tonosgrises. La presencia de estos síntomas secorrespondió con el aislamiento consistentedel anamorfo de B. mediterranea a partir del

Figura 3. Sintomatología en rumas cortadas deQuercus spp. inoculadas con B. mediterranea,

a) estroma en forma de nodulos negros,b) producción de conidias en las grietas de la corteza,

c) lesiones necróticas en la corteza interna de unarama inoculada. Abajo, ausencia de síntomas en una

rama testigo.

Figura 4. Inoculación de ramas cortadas de Quercusspp. con B. mediterranea, a) formación de estroma en

función del inoculo, b) formación de estroma enfunción del huésped, c) formación de estroma en

función de la temperatura de incubación.La formación de estroma se evaluó según la escala 0 =

ausencia de estroma, 1 = 1- 33% de superficiecubierta de estroma, 2 =34-66%, y 3 = 67-100%. Para

cada gráfico, las columnas con una letra común nodifieren significativamente (P = 0,05), según el test de

Fisher (Steel y Torrie, 1985).

tejido cortical. Las ramas testigo no presen-taron estos síntomas ni se recuperó el hongoa partir de ellas, por lo que no se incluyeronen los análisis estadísticos.

Los análisis de la varianza no mostrarondiferencias significativas en la superficiecubierta de estroma en función del métodode inoculación (micelio con o sin herida yascosporas), pero sí las hubo en función delinoculo, de la especie de planta y de la tem-peratura de incubación. Así, el inoculo HYP-8 (tanto el aislado monoascospórico comolas ascosporas) dio lugar a una producciónde estroma significativamente más alta queel HYP-22 (aislado monoascospórico yascosporas) (Figura 4a), mientras que se pro-dujo significativamente más estroma enramas de encina que en las de alcornoque(Figura 4b). También hay un incremento sig-nificativo en la producción de estroma con elaumento de la temperatura (Figura 4c).

No se produjo esporulación del anamorfoa 15° C, pero sí se observó esporulación a20° C en las ramas de los dos huéspedes ino-culadas con micelio del aislado HYP 8 con ysin herida, y en ramas de alcornoque inocu-ladas con el aislado HYP 22 mediante mice-lio con herida. Se registró un incremento dela esporulación a 25 y 30° C, temperaturas enlas que esporularon todas las ramas exceptolas testigo.

En cuanto a las lesiones corticales, loscontrastes polinómicos mostraron que hayun incremento lineal y cuadrático de la lon-gitud de la lesión con el aumento de la tem-peratura (Figura 5a). El análisis global de lavarianza mostró que no hay diferencias sig-nificativas en la longitud de las lesiones enfunción del método de inoculación, del ino-culo ni del huésped. El análisis de la varian-za individualizado por temperaturas de incu-bación mostró que solamente a 15° C el ino-culo HYP-8 produce lesiones significativa-mente mayores que el inoculo HYP-22(Figura 5b), y que en ramas de encina se pro-ducen unas lesiones significativamentemayores que en alcornoque (Figura 5c).

Experimento 2: Inoculaciones en plantasvivas

Durante los 5 meses que las plantas testi-go e inoculadas estuvieron libres de estréshídrico, no se observó ningún síntoma. Unavez que se sometieron a estrés hídrico seobservó amarillez y marchitez foliar hastaque se secaron las copas de todas las plantas,incluidas las testigo (Figura 6). Al términodel experimento, tras levantar la corteza, seobservaron necrosis corticales de distintoaspecto según el huésped y tinción de vasos.En encina y coscoja sólo aparecieron peque-ñas lesiones corticales (de 0,9 a 1,6 cm delongitud en encina, y de 1,2 a 3,4 cm de lon-gitud en coscoja) en las plantas inoculadascon micelio de HYP-8 con herida, y variaronde marrón oscuro a gris oscuro o negro(Figura 7a). En los alcornoques, sin embar-go, aparecieron lesiones corticales de mayortamaño (de 6 a 196 cm de longitud) y decolor gris claro en todas las plantas inocula-das (Figura 7b), pero no en los testigos.

Dado que ninguna planta testigo de nin-guna de las tres especies mostró lesionescorticales ni tinción de vasos, y además no sepudo reaislar B. mediterranea a partir deltejido cortical, sus correspondientes valores(todos 0) no se incluyeron en los análisisestadísticos.

El análisis de la varianza de la longitud delas lesiones en alcornoque no mostró dife-rencias significativas en función del inoculoni del método de inoculación.

Para comparar entre sí a los distintoshuéspedes se realizó un análisis de la varian-za de la longitud de la lesión presente en lasplantas inoculadas con el micelio HYP-8mediante herida. La comparación de mediasmostró que la longitud de las lesiones es sig-nificativamente mayor en alcornoque que enencina y coscoja, no habiendo diferenciassignificativas entre estos dos últimos huéspe-des (Figura 8a).

La tinción de vasos consistió en la pig-mentación oscura que adquirió el xilema enla cara donde estaba el punto de inoculación.Esta tinción se observó en los tres huéspe-des, pero únicamente en las inoculacionescon HYP-8 con herida (micelio y ascospo-ras) y en las inoculaciones con ascosporas de

Figura 5. Inoculación de ramas cortadas deQuercus spp. con B. mediterranea,

a) longitud de las lesiones en función de latemperatura de incubación,

b) longitud de las lesiones en función del inoculopara las ramas incubadas a 15° C,

c) longitud de las lesiones en función del huéspedpara ramas incubadas a 15° C.

Para cada gráfico, las columnas con una letra comúnno difieren significativamente (P = 0.05), según el test

de Fisher (Steel y Torrie, 1985).

Figura 6. Plantas de Quercus spp. inoculadas con Zí. mediterranea tras 3 meses de estrés hídrico. Obsérvese lamarchite/ foliar generalizada.

HYP-22. El análisis de la varianza y la com-paración de medias para las plantas inocula-das con HYP-8 (Figura 8b) mostró que para

los tres huéspedes las inoculaciones conmicelio producen una tinción de vasos signi-ficativamente mayor que con ascosporas. El

Figura 7. Lesiones necróticas en plantas de Quercus spp. inoculadas con el micelio HYP-8 de B. mediterraneamediante herida, a) pequeña lesión oscura en encina. Abajo, el mismo tallo una vez retirada la corteza externa.

b) lesión grisácea extensa en alcornoque. Se ha retirado la corteza externa alrededor del punto de inoculación paraapreciar mejor la necrosis del tejido cortical.

análisis de los datos correspondientes a lasplantas inoculadas con ascosporas mostróque las de HYP-22 produjeron una tinciónde vasos significativamente mayor que lasascosporas de HYP-8 (Figura 8c).

El reaislamiento de B. mediterranea apartir del tejido cortical de las plantas inocu-ladas, fue positivo para los tres huéspedesúnicamente en las inoculaciones mediantemicelio de HYP-8 con herida y en las plan-tas inoculadas con ascosporas de los dos orí-genes, en clara correspondencia con la apari-ción de las tinciones de vasos en estas plan-tas. También se reaisló B. mediterranea, enun solo caso, de una planta de coscoja ino-culada con micelio de HYP-8 sin herida.

Cuando, tras evaluar los síntomas, se cor-taron los tallos y se incubaron en cámarahúmeda a 30° C, apareció el estroma y laesporulación del anamorfo de B. mediterra-nea en todos los tallos, incluso en aquellosen los que no fue posible su aislamiento de lacorteza, con la única excepción de las plan-tas testigo.

DISCUSIÓN

El aislamiento de B. mediterranea deramas de encina asintomáticas indica la exis-tencia de una colonización endofítica delhuésped. Los porcentajes de aislamiento sonsimilares a los obtenidos por otros autores alrealizar aislamientos de tejidos asintomáti-cos (BIOCCA y MOTTA, 1995; VANNINI et al,

1996c; 1999; MAZZAGLIA et al., 2001;RAGAZZI et al., 2001). Por lo tanto, la ausen-cia de estroma no indica necesariamente laausencia del hongo, ya que se ha descritocomo endofito en especies del género Quer-cus, pudiendo estar presente en esta fase nopatogénica en toda el área de distribución desus huéspedes. Ya se ha observado que esfrecuente que en las áreas de distribuciónnatural de cada huésped haya un determina-do número de especies endofíticas específi-cas (FISHER et ai, 1994; CARROLL, 1995), yen especial de aquellas con mayor presenciaen el huésped, como es el caso de B. medite-rranea en varias especies de Quercus (Bloc-

Figura 8. Inoculación de plantas de Quercus spp.con B. mediterranea, a) longitud de las lesiones en

función del huésped en plantas inoculadas conmicelio HYP-8 mediante herida, b) longitud de la

tinción de vasos en función del huésped en lasplantas inoculadas con HYP-8. c) longitud de latinción de vasos en función del inoculo en las

plantas inoculadas con ascosporas.Para cada gráfico, las columnas con una letra común

no difieren significativamente (P = 0,05). según el testde Fisher (Steel y Torrie, 1985).

CA y MOTTA, 1995; COLLADO et al, 1996;2001; MAZZAGLIA et al, 2001; RAGAZZI et

al, 2001).En términos generales, los ensayos de

patogenicidad sobre ramas cortadas no mos-traron diferencias en la formación de estro-ma ni en la longitud de las lesiones en fun-ción del método de inoculación empleado,lo que indica que las hifas de B. mediterra-nea son tan infectivas en ramas cortadascomo las ascosporas, y que resultan capacesde atravesar la corteza de encina y de alcor-noque con escasa capacidad de defensa, ori-ginando la misma severidad de síntomas quecuando infectan a través de heridas. Sinembargo, la capacidad de producción deestroma sí fue distinta entre aislados y enfunción del huésped, registrándose mayorproducción en ramas de encina que en alcor-noque. Tampoco se observaron diferenciasen la longitud de las necrosis producida porlos distintos aislados de B. mediterraneainoculados a temperaturas superiores a 15°C, condiciones que resultan más favorablespara el desarrollo de los síntomas. Tambiénen las inoculaciones de plantones, B. medi-terranea fue capaz de infectar a todas lasplantas en todos los casos, como demostróla aparición del estroma fúngico tras la incu-bación de las plantas ya muertas a 30° C encondiciones de elevada HR. Hay que desta-car que las infecciones, en muchos casosasintomáticas, se produjeron a pesar de quelas plantas no se encontraban bajo ningúntipo de estrés y con los tres tipos de inocu-lación. Por lo tanto, la presencia de heridasen la corteza y el estrés hídrico no parecencondiciones indispensables para que tengalugar la infección, como sugieren VANNINI etal (1999), y en contra de lo que afirmanotros autores (OLIVA y MOLINAS, 1984;TORRES, 1985; 1993). Así, el hongo se man-tuvo en estado latente, sin originar síntomas,durante los 5 meses (abril - septiembre de2003) que duró la incubación en umbráculo,a pesar del hecho de que el grado de coloni-zación del huésped aumenta en el transcursodel verano (BIOCCA y MOTTA, 1995; COLLA-

DO et al, 1999; MAZZAGLIA et al, 2001).

Posteriormente, cuando las plantas se some-tieron a estrés hídrico, los síntomas observa-dos (amarillez y marchitez) afectaron atodas las plantas por igual, inoculadas y tes-tigos, por lo que no cabe atribuir estos sín-tomas a la acción del hongo inoculado. Sinembargo, al levantar la corteza externa dealgunas plantas inoculadas, se observaronlesiones necróticas en la corteza interna, aligual que observaron VANNINI y MUGNOZZA

(1991) en Q. cerris sometidos a estrés hídri-co y JACOBS et al (1993) en plantas de Q.suber, con o sin estrés hídrico, aunque lalongitud de las lesiones es mayor en lasplantas sometidas a estrés. Otro síntomaobservado en algunas de las plantas inocula-das fue la tinción de vasos, que ya habíandescrito otros autores en plantas inoculadascon B. mediterranea, como LUISI et al(1995) en Q. cerris, Q. pubescens y Q. tro-jana sometidos a estrés hídrico, y LUQUE etal (2000) en Q. suber, con y sin estrés hídri-co, aunque la tinción de vasos tambiénresultó mayor en plantas sometidas a estrés.Este síntoma se observó únicamente enplantas vivas inoculadas, pero nunca enramas cortadas, por lo que parece constituiruna respuesta de la planta a la presencia delhongo colonizando sus tejidos. Este hechopodría explicar que las inoculaciones conmicelio produjeran tinciones significativa-mente más extensas que las inoculacionescon ascosporas y que el aislado que se mos-tró menos agresivo tanto en ramas cortadascomo en plantas vivas (HYP-22) fuera elque indujo en estas últimas una mayor tin-ción de vasos. La tinción de vasos estuvoademás claramente relacionada con el reais-lamiento de B. mediterranea a partir del teji-do cortical, esto es, con la colonización delos tejidos del huésped. La recuperación delhongo tuvo lugar a lo largo de todo el tallo yno únicamente en las zonas donde aparecíanlas tinciones, lo que sugiere que B. medite-rranea es capaz de colonizar de forma asin-tomática zonas de corteza mucho más exten-sas que las que alcanzan las tinciones.

El alcornoque fue la especie más suscepti-ble, al presentar lesiones en la corteza en

todas las plantas inoculadas con B. medite-rranea, independientemente del método y delinoculo empleado. Sin embargo, la presenciade estas lesiones corticales no dieron lugar aanillamiento y no se tradujeron en un peorestado vegetativo, ya que los alcornoquesinoculados no manifestaron una sintomatolo-gía foliar más severa que la de sus testigos nique la de los otros huéspedes, inoculados ono. El pequeño tamaño de las lesiones corti-cales en las plantas inoculadas y fuertementeestresadas de encina y coscoja, muestra queB. mediterranea tiene una capacidad patogé-nica muy limitada en estas especies, no lle-gando a producir anillamiento y muerte delos tallos infectados, aún en las condicionesextremas de estrés hídrico a las que se some-tieron las plantas. Además, en más del 80%de las plantas de encina y coscoja inoculadas,no apareció ningún tipo de síntoma atribuiblea B. mediterranea, a pesar de las fuertes con-diciones de estrés que indujeron la completamarchitez de las copas.

Nuestros resultados indican que estehongo es capaz de vivir durante largos perí-odos como endófito en varias especies deQuercus, como muestran los experimentosde patogenicidad y como también hemospodido comprobar al aislarlo de leñas deencina asintomáticas. La presencia endofí-tica del hongo puede aumentar en huéspe-des en condiciones de estrés (COLLADO etal, 2001; MAZZAGLIA et al, 2001), perosolamente produce necrosis y producciónde estroma en la corteza de tallos que pre-viamente han muerto por otras causas(SANTOS et al, 1999). Esta hipótesis con-cuerda con los ensayos realizados porMASON et al (1991) para B. atropunctata,en los que demuestra que los cambios en laviabilidad de los tejidos del huésped sonlos responsables de los cambios producidosen su susceptibilidad frente a la coloniza-ción fúngica.

Según Ju et al (1998) las especies delgénero Biscogniauxia invaden los tejidos delos huéspedes sometidos a estrés, y fructifi-can cuando el huésped está gravementedebilitado o muerto. También afirman que

aunque las especies del género Biscogniau-xia persisten en material muerto que hacaído al suelo, no son capaces de invadirlo,ya que no pueden competir con basidiomi-cetos de podredumbre (Ju et al, 1998). Deeste modo, tras la infección, B. mediterra-nea se mantiene como endófito en la planta,y cuando muere ésta o parte de sus tejidos,los coloniza rápidamente, tomando ventaja alos hongos de podredumbre. Esta hipótesisdifiere de la de otros autores (OLIVA y MOLI-NAS, 1984; TORRES, 1985; 1993; VANNINI yMUGNOZZA, 1991; MONTOYA, 1992; VANNINIet al, 1992, 1996a, 1996b, 1996c; AMORINIet al, 1995; LUISI et al, 1995; BIOCCA et al,1996; MAZZAGLIA et al, 2001) que asumenla patogenicidad de B. mediterranea en con-diciones de estrés. Puesto que existen dife-rencias en la patogenicidad del hongo enfunción del huésped, aunque B. mediterra-nea puede causar lesiones importantes en Q.cerris sometidos a estrés hídrico (VANNINI yMUGNOZZA, 1991; VANNINI et al, 1992,1996a, 1996b, 1996c,Luisieía/., 1995) estono parece suceder con las especies de Quer-cus objeto de este trabajo, al menos con unagravedad tal que produzca síntomas severosy muerte de las plantas estresadas.

La incubación de segmentos de tallo oramas asintomáticas en condiciones de ele-vada HR a 30° C puede resultar un buenmétodo de detección de infecciones endofíti-cas de B. mediterranea en condiciones decampo, ya que fue capaz de detectar la pre-sencia del hongo en tallos en los que nohabía sido posible su aislamiento por méto-dos convencionales de siembra de cuñas decorteza en medios de agar.

En cuanto al papel del chancro carbonosocomo factor contribuyente del decaimiento oSeca de los Quercus (MONTOYA, 1992; NAVA-RRO y FERNÁNDEZ, 2000; SÁNCHEZ et al,2000), el comportamiento como patógeno dedebilidad que ha mostrado B. mediterranea,indica que en el proceso de debilitamientopor sequía o infecciones radicales que sufrenla encina y el alcornoque en la Península Ibé-rica, el hongo encuentra una situación muyfavorable para pasar de la fase endofítica a la

patogénica, sobre todo en alcornoque, y cau-sar necrosis corticales. No obstante, la pro-ducción del estroma carbonoso con posterio-ridad a la muerte de la rama o la corteza deltronco, puede dar lugar a que, en muchoscasos, se esté sobrevalorando la importanciade este agente como causa primaria de muer-te en procesos de decaimiento, actuando másbien como saprofito en ramas muertas porotros agentes bióticos o abióticos.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo ha sido financiado por el Pro-yecto de Investigación AGL2002-00530 ypor el Convenio suscrito entre la Consejeríade Medio Ambiente de la Junta de Andalucíay la Universidad de Córdoba para el estudiode la Seca de Quercus en Andalucía. M.E.Sánchez disfruta de un contrato del Progra-ma "Ramón y Cajal" del MEC.

ABSTRACT

JIMÉNEZ J. J., M. E. SÁNCHEZ, A. TRAPERO. 2005. Charcoal Canker of Quercus II: Pat-hogenicity and dispersion of the causal agent. Bol. San. Veg. Plagas, 31: 563-575.

The Charcoal Canker is caused by the ascomycete Biscogniauxia mediterranea (sin.Hypoxylon mediterraneum). Since it is a well known disease affecting cork oak in Iberia,its incidence has increased in the last years associated to Quercus decline in southernSpain. Artificial inoculations on detached branches of Q. ilex and Q. suber demonstratedthat high temperatures favour cortical necrosis and charcoal stroma development. Inocu-lations conducted on healthy plants of Q. suber, Q. ilex and Q. coccifera showed that thefungus colonizes the plants as endophyte, but cortical necrosis only appeared when theplants suffer severe water stress. In addition, cork oak has been the most susceptible hostspecies. This behaviour as weak pathogen of B. mediterranea on Quercus spp. suggeststhat Charcoal Disease may be over valuated as primary agent of death on Quercus decli-ne in southern Spain.

Key words: Charcoal disease, decline, endophyte, Hypoxylon mediterraneum, Quer-cus coccifera, Quercus ilex, Quercus suber, water stress.

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(Recepción: 30 junio 2005)(Aceptación: 17 noviembre 2005)