El nematodo Caenorhabditis elegans como modelo biológico de estudios

tóxico-moleculares para la evaluación de la calidad de aguas

Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires,

Área Ciencias Agropecuarias

Araceli M. Clavijo Lara

Licenciada en Biología - Universidad de Granada (España) - 2006

Lugar de trabajo: Departamento de Biología Aplicada y Alimentos. Cátedra de

Bioquímica. Facultad de Agronomía. Universidad de Buenos Aires

Escuela para Graduados Ing. Agr. Alberto Soriano

Facultad de Agronomía – Universidad de Buenos Aires

ii

COMITÉ CONSEJERO

Directora de tesis

Dra. MBA. Lic. Eliana R. Munarriz

Licenciada en Ciencias Biológicas (Universidad Buenos Aires, Argentina)

Doctora en Biología Molecular y Celular (Universidad Roma “Tor Vergata”, Italia)

Co-director

Dr. MSc. Ing. Agr. Eduardo A. Pagano

Ingeniero Agrónomo (Universidad Buenos Aires, Argentina)

Doctor en Ciencias Biológicas (Universidad de Granada, España)

Consejero de Estudios

Dr. MSc. Ing. Agr. Jorge A. Zavala

Ingeniero Agrónomo (Universidad Buenos Aires, Argentina)

Doctor Rerum Naturalis (Friedrich-Schiller-Universität, Jena, Alemania)

JURADO DE TESIS

Dra. Paola Lax

Centro de Zoología Aplicada

– Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales – U.N.C.

IDEA – CONICET

Dra. María Semmartin

Recursos Naturales y Ambiente

– Facultad de Agronomía – U.B.A.

IFEVA – CONICET

Dr. Hochbaum Daniel

Lab. Biología del Desarrollo de las Plantas

– Facultad de Ciencias Exactas y Naturales – U.B.A.

DBBE – CONICET

Fecha de defensa de la tesis: 15 de Septiembre de 2017.

iii

A Antonio, Araceli y Rosa, mi adorada tribu.

Esto no es el final. Ni tampoco es el principio del final.

Pero quizás sea el final del principio.

W. Churchill

iv

AGRADECIMIENTOS

Quiero dar las gracias de todo corazón a todos aquellos que han sabido brindarme el apoyo que

necesité en este largo viaje que comenzó en el año 2013.

Agradezco a mi directora de tesis, la Dra. Eliana Munarriz, por creer en mí desde el principio y

ayudarme a crecer en este tiempo.

Agradezco al Dr. Ing. Agr. Eduardo Pagano, mi codirector y jefe de la Cátedra de Bioquímica

de la FAUBA, por apostar por todo el grupo brindándonos las herramientas necesarias

para nuestro trabajo y en mi caso particular, por confiar en mí y dar el pistoletazo de

salida.

A la Dra. Florencia Kronberg por ser compañera y amiga en estos años. Por solucionar los

problemas graves y no bajar la guardia nunca con nosotras. A la Ing. Agr. Aldana Moya

por andar contando gusanos conmigo a horas absurdas. Y por ser una muy buena amiga.

Gracias a las dos por haber alegrado mis días de trabajo.

A la Dra. Romina Giaccometti, Daniela Tejedor y la Dra. Natalia Ilina, por su amistad y su

apoyo constante.

A toda la gente de la catedra de Bioquímica de la FAUBA y del INBA-CONICET, por

compartir cada día juntos, por construir un lugar de trabajo en el que todos nos

ayudamos mutuamente y con la mejor disposición luchamos para que el lugar crezca.

A la Dra. Ariana Rossen, por ser la mejor compañera para escribir papers. Por las horas

pindaleras o en casa y por las charlas amigas.

A todos los profesionales con los que establecimos colaboraciones en algún momento de toda

esta aventura y que resultaron ser excelentes: el Ing. Agr. José Morabito y su grupo de

trabajo del Instituto Nacional del Agua de Mendoza, el Lic. Daniel Calvo del Instituto

Nacional del Agua – sede Ezeiza y el Ing. Agr. Daniel Grenón de Facultad de Ciencias

Agrarias - Universidad Nacional del Litoral.

A la gente de Pergamino que nos abrieron sus casas y nos permitieron realizar el trabajo.

A la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica Argentina, que a través de su

PID 0032/2011 me permitió iniciar la investigación para mi tesis doctoral. Agradezco

también a CONICET por haberme otorgado la beca de finalización de doctorado sin la

cual no hubiese podido hoy terminar este proyecto.

A la UBA, universidad pública, gratuita y universal, por haberme permitido realizar mi

posgrado. Por tener la máxima calidad y formar a los estudiantes de la mejor manera

posible.

v

A los integrantes del jurado, la Dra. Semmartin, el Dr. Hochbaum y la Dra. Lax, por sus

opiniones brindadas para mejorar el presente trabajo.

A Giorgio, Carlo y Madda, por acompañarme desde el país de la bota, manteniendo viva una

amistad de tantos años.

A la madrina, que monitorea siempre de cerca y con cariño los pasos que doy en la vida.

A la familia Pagano que hicieron más fáciles los primeros días en la gran ciudad.

A Carol y Juani, mi regalo vietnamita.

A las ladies: Ceci, Olga, Ana y Adri; grandes mujeres que me acompañaron estos años con sus

enseñanzas de vida.

A Megi por recorrer conmigo parte de este camino.

A mis amigos de la vida, Diego, Ángel, Leyla, Nat, Néstor, Erika, Mariescuerzo, Rocío, Arme,

Corolain, Migue, Virgilio, Paco, Carlos, que acortaron distancias en estos años, en los

momentos fáciles y en los difíciles, con mensajes, fotos y gestos continuos de apoyo y

cariño.

A mis familias materna y paterna, por ser tantos y tan divertidos. Por esperar con los brazos

abiertos mi llegada y poner todo el empeño en entender de qué iba eso de los gusanos.

A las primis, por ser hermanas.

A Alex, hermanito y compañero de viajes. Por acudir a darme amor cuando lo necesitaba.

A JP, que tomó mi mano hacia el final de esta aventura. Y aún hoy la sostiene fuerte. Gracias

por haberme transmitido tu sensibilidad por las cosas simples de la vida. Gracias por tu

amor.

A mis padres y a mi hermana, por apoyar cada proyecto de mi vida de manera incondicional,

por ser el pilar fundamental en todo lo que soy, en toda mi educación, tanto académica,

como de la vida; por su leal apoyo perfectamente mantenido a través del tiempo y la

distancia. Gracias por quererme tanto y hacérmelo sentir en todo momento.

A la vida, por ser maravillosa y darme siempre un motivo estupendo para seguir sonriendo.

vi

PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS

Clavijo, A., Rossen, A., Calvo, D., Kronberg, M.F., Moya, A., Pagano, E.A.,

Munarriz, E.R., 2017. Water quality and toxicological impact assessment using the

nematode Caenorhabditis elegans bioassay in a long-term intensive agricultural area.

Water, Air & Soil Pollution, 228(9), 333.

Clavijo, A., Kronberg, M.F., Rossen, A., Moya, A., Calvo, D., Salatino, S.E.,

Pagano, E.A., Morábito, J.A., Munarriz, E.R., 2016. The nematode Caenorhabditis

elegans as an integrated toxicological tool to assess water quality and pollution. Science

of the Total Environment, 569, 252-261

Clavijo, A., Calvo, D., Rossen, A., Salatino, S.E., Morábito, J.A., Kronberg, M.F.,

Moya, A., Munarriz, E.R., 2016. Evaluación estacional de las aguas del río Tunuyán

(Mendoza) mediante ICA y el empleo de C. elegans como indicador biológico. En:

IFRH 2016 - 3er. Encuentro de Investigadores en Formación en Recursos Hídricos:

Resúmenes. Editado por Martín Sabarots Gerbec... [et.al.]. - 1a ed. - Ezeiza: Instituto

Nacional del Agua. ISBN 978-978-45194-6-7

Clavijo, A., Kronberg, M.F., Moya, A., Pagano, E.A., Munarriz, E.R., 2015.

Utilización del nematodo C. elegans en ensayos de toxicidad de muestras de agua en

cultivos de la región pampeana. En: Libro de resúmenes del XXV Congreso Nacional

del Agua, Conagua 2015, Argentina. ISBN 978-987-27407-4-0

vii

Clavijo, A., Salatino, S.E., Kronberg, M.F., Rossen, A., Hernández, R., Pagano,

E.A., Munarriz, E.R., 2015. Análisis ecotoxicológico de las aguas de los ríos Tunuyán y

Mendoza (Mendoza) mediante el empleo de C. elegans como indicador biológico. En:

Libro de resúmenes del XXV Congreso Nacional del Agua, Conagua 2015, Argentina.

ISBN 978-987-27407-4-0

Moya, A., Kronberg, M.F., Clavijo, A., Mazzarella, D., Pagano, E.A., Munarriz,

E.R., 2015. Plaguicidas disruptores endócrinos, uso del nematodo Caenorhabditis

elegans como modelo biológico. Publicado en la Revista SNS, Nº 7, enero-marzo de

2015 ISSN 2314-2901

Kronberg, M.F., Clavijo, A., Moya, A., Heredia, O., Pagano, E.A., Munarriz,

E.R., 2014. Utilización del nematodo Caenorhabditis elegans en ensayos de toxicidad

de muestras de agua. En: IFRH 2014 - 2º Encuentro de Investigadores en Formación en

Recursos Hídricos: Resúmenes. Editado Damiano Tagliavini ... [et.al.]. - 1a ed. - Ezeiza:

Instituto Nacional del Agua. ISBN 978-987-45194-2-9

viii

INDICE GENERAL

Capítulo 1. Introducción ............................................................................................................. 2

1.1. Caenorhabditis elegans como organismo modelo .............................................................. 2

1.1.1. Clasificación taxonómica ............................................................................................. 2

1.1.2. Historia ........................................................................................................................ 4

1.1.3. Características fisiológicas y anatómicas ..................................................................... 5

1.1.4. Ciclo de vida ................................................................................................................ 6

1.1.5. Ventajas de C. elegans como modelo biológico .......................................................... 8

1.1.6. Caenorhabditis elegans como modelo toxicológico .................................................... 9

1.1.7. Caenorhabditis elegans como bioindicador ambiental .............................................. 12

1.2. Manejo del recurso hídrico ............................................................................................... 13

1.2.1. Estado del arte ............................................................................................................ 13

1.2.2. Gestión de los recursos hídricos ................................................................................ 14

1.2.3. Evaluación de la calidad del agua .............................................................................. 17

1.2.4. Agricultura y calidad de agua .................................................................................... 19

1.3. Glifosato ............................................................................................................................ 22

1.3.1. Formulaciones comerciales de glifosato .................................................................... 22

1.3.2. Comportamiento y persistencia.................................................................................. 24

1.3.3. Toxicidad ................................................................................................................... 26

1.3.4. Marco legal de productos fitosanitarios. Registro e instrumentos regulatorios ......... 28

1.3.5. Uso del glifosato en Argentina ................................................................................ 29

ix

1.4. Objetivos ........................................................................................................................... 31

1.4.1. Objetivo general ......................................................................................................... 31

1.4.2. Objetivos específicos ................................................................................................. 32

1.5. Contenido .......................................................................................................................... 33

Capítulo 2. Materiales y metodología ....................................................................................... 35

2.1. Mantenimiento y procesamiento de C. elegans ................................................................ 35

2.1.1. Medios de cultivo para el nematodo y E. coli ............................................................ 35

2.1.2. Sincronización de los nematodos ............................................................................... 36

2.1.3. Conservación y recuperación de C. elegans .............................................................. 37

2.1.4. Transferencia y esterilización del nematodo en placas .............................................. 38

2.2. Bioensayos con C. elegans ................................................................................................ 39

2.2.1. Efecto crónico del glifosato comercial sobre el ciclo de vida del nematodo ............. 39

2.2.2. Ensayos con aguas ..................................................................................................... 40

2.3. Análisis de crecimiento, reproducción y fertilidad de C. elegans ..................................... 41

2.4. Detección de especies reactivas del oxígeno (ERO) ......................................................... 42

2.5. Extracción de ARN y PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR) ................................... 42

2.6. Cuantificación de la actividad catalasa ............................................................................. 45

2.7. Obtención y conservación de muestras de agua ................................................................ 46

2.7.1. Pergamino (Buenos Aires) ......................................................................................... 46

2.7.2. Río Tunuyán (Mendoza) ............................................................................................ 47

2.8. Determinación de parámetros fisicoquímicos in situ ........................................................ 48

2.9. Determinaciones analíticas ............................................................................................... 48

2.9.1. Determinación de glifosato y AMPA ........................................................................ 48

x

2.9.1.1. Calibración ......................................................................................................... 49

2.9.1.2. Determinación .................................................................................................... 50

2.9.2. Determinación de cationes por técnica de absorción atómica ................................... 51

2.9.3. Determinación de aniones carbonato y bicarbonato .................................................. 52

2.9.4. Determinación de cloruros ......................................................................................... 53

2.9.5. Determinación de sulfatos.......................................................................................... 54

2.9.6. Determinación de nitratos .......................................................................................... 55

2.9.7. Determinación de la relación de absorción de sodio (RAS) ...................................... 56

2.9.8. Determinación del fósforo total ................................................................................. 56

2.9.9. Determinación de fosfato soluble .............................................................................. 57

2.9.10. Determinación de la Demanda Química de Oxígeno ............................................... 57

2.9.11. Análisis bacteriológicos ........................................................................................... 57

2.10. Diagrama de Piper ........................................................................................................... 58

2.11. Índice de categorización de efectos tóxicos .................................................................... 58

2.12. Índice de Calidad de Aguas (ICA) .................................................................................. 58

2.13. Análisis estadístico .......................................................................................................... 61

Capítulo 3. Estudio de la respuesta de C. elegans tras la exposición a glifosato ................. 67

3.1. Introducción ...................................................................................................................... 67

3.2. Objetivos ........................................................................................................................... 69

3.3. Resultados y discusión ...................................................................................................... 70

3.3.1. Efecto crónico del glifosato sobre el ciclo de vida del nematodo C. elegans ............ 70

3.3.2. Generación de ERO inducida por glifosato ............................................................... 73

xi

3.3.3. Respuesta específica del estrés oxidativo inducida por formulaciones comerciales de

glifosato ........................................................................................................................... 76

3.4. Conclusiones ..................................................................................................................... 78

Capítulo 4. Caracterización de aguas de la región Pampeana. Uso de C. elegans para la

evaluación de la toxicidad ........................................................................................................ 81

4.1. Introducción ...................................................................................................................... 81

4.1.1. Selección de la zona de estudio ................................................................................. 81

4.2. Objetivos ........................................................................................................................... 87

4.3. Resultados y discusión ...................................................................................................... 88

4.3.1. Análisis de parámetros fisicoquímicos ...................................................................... 88

4.3.2. Caracterización hidrogeoquímica .............................................................................. 97

4.3.3. Cálculo del ICA ......................................................................................................... 99

4.3.4. Determinación de glifosato y AMPA ...................................................................... 100

4.3.5. Bioensayo con C. elegans para la determinación de la calidad de aguas ................ 105

4.3.6. Categorización de efectos tóxicos ............................................................................ 112

4.4. Conclusiones ................................................................................................................... 114

Capítulo 5. Caenorhabditis elegans como herramienta integrada para la evaluación de la

calidad y toxicidad en una cuenca de río de la provincia de Mendoza .............................. 118

5.1. Introducción .................................................................................................................... 118

5.1.1. Selección de la zona de estudio ............................................................................... 119

5.2. Objetivos ......................................................................................................................... 123

5.3. Resultados y discusión .................................................................................................... 124

5.3.1. Análisis de parámetros fisicoquímicos y bacteriológicos ........................................ 124

xii

5.3.2. Cálculo del ICA ....................................................................................................... 133

5.3.3. Bioensayo con C. elegans para la determinación de la calidad de aguas ................ 135

5.3.4. ACP .......................................................................................................................... 138

5.3.5. Modelo linear multivariado y regresión simple del crecimiento relativo versus el ICA

....................................................................................................................................... 141

5.4. Conclusiones ................................................................................................................... 144

Capítulo 6. Conclusiones generales y perspectivas futuras .................................................. 146

Bibliografía ............................................................................................................................... 157

Apéndices .................................................................................................................................. 180

Apéndice 1. Normativa internacional en materia de agroquímicos ....................................... 181

Apéndice 2. Normativa nacional ambiental. Uso y comercialización de plaguicidas ........... 182

Apéndice 3. Normativa nacional e internacional de calidad de aguas para la construcción del

ICA de la región pampeana .................................................................................................... 185

xiii

INDICE DE CUADROS

Cuadro 2.1. Cebadores utilizados ............................................................................................. 44

Cuadro 2.2. Volúmenes inyectados de fase móvil.................................................................... 50

Cuadro 2.3. Límites de detección de cationes por espectrofotometría. ................................. 51

Cuadro 2.4. Interpretación de la titulación ............................................................................. 53

Cuadro 3.1. Valores de CE50 del formulado comercial de glifosato para C. elegans........ .. 72

Cuadro 4.1. Caracterización de los puntos de muestreo en la cuenca de Pergamino……. . 87

Cuadro 4.2. Parámetros fisicoquímicos y concentraciones de glifosato y AMPA en las

muestras de agua. ....................................................................................................................... 92

Cuadro 4.3. Niveles de glifosato en los sitios destinados a aguas para consumo (µg L-1).. 104

Cuadro 4.4. Crecimiento relativo de C. elegans en muestras de agua de los diferentes sitios

de la cuenca del rìo Pergamino. .............................................................................................. 110

Cuadro 5.1. Localización, coordenadas y características de los sitios seleccionados en la

cuenca del Tunuyán. ................................................................................................................ 123

Cuadro 5.2. Parámetros fisicoquímicos de las muestras de agua de la cuenca del Tunuyán.

................................................................................................................................................... 128

Cuadro 5.3. Parámetros bacteriológicos de las muestras de agua de la cuenca del

Tunuyán. ................................................................................................................................... 131

Cuadro 5.4. Autovectores del ACP………………………………………………………….140

Cuadro 5.5. Diferentes modelos lineales considerando al crecimiento relativo de C. elegans

como variable dependiente. ..................................................................................................... 142

xiv

INDICE DE FIGURAS

Figura 1.1. Comparaciones de las divergencias evolutivas en genes SSU rRNA entre pares

de especies dentro de los nematodos y deuterostomados .......................................................... 3

Figura 1.2. Anatomía de Caenorhabditis elegans. ..................................................................... 6

Figura 1.3. Ciclo de vida de C. elegans a 20 ºC. ......................................................................... 7

Figura 1.4. Estructura química y modelo de enlaces del glifosato ......................................... 23

Figura 1.5. Estructura química de la polioxietil amina (POEA) ........................................... 24

Figura 1.6. Estructura química y modelo de enlaces del AMPA. .......................................... 25

Figura 2.1. Bioensayo con C. elegans, de acuerdo con métodos estándar. ............................ 40

Figura 3.1. Mecanismos de protección del estrés oxidativo. .................................................. 69

Figura 3.2. Test de toxicidad crónica con C. elegans. ............................................................. 71

Figura 3.3. Producción de ERO en nematodos expuestos a glifosato. ................................... 74

Figura 3.4. Análisis cuantitativo por RT-PCR de genes involucrados en la respuesta a

estrés oxidativo en nematodos expuestos a glifosato. .............................................................. 76

Figura 3.5. Análisis cuantitativo por RT-PCR de genes de catalasa (A) y actividad

específica de la catalasa (B) en nematodos expuestos a concentraciones crecientes de

glifosato. ...................................................................................................................................... 77

Figura 4.1. Zona de estudio ....................................................................................................... 82

Figura 4.2. Límite (divisoria de aguas) de la cuenca del Río Arrecifes, red hidrográfica y

bañados……. .............................................................................................................................. 83

Figura 4.3. Mapa de la zona de estudio. ................................................................................... 84

Figura 4.4. Imagen satelital de la zona de estudio ................................................................... 85

Figura 4.5. Gráficos boxplot de las diferencias entre grupos de agua para 5 parámetros

fisicoquímicos, según análisis ANAVA no paramétrico (Kruskal-Wallis). ......................... ..94

Figura 4.6. Diagrama de Piper para los diferentes puntos de monitoreo. ............................ 98

Figura 4.7. Valores del ICA de los sitios de monitoreo de la cuenca del río

Pergamino……………………………………………………………………………………...99

Figura 4.8. Porcentajes de muestras con presencia de glifosato, AMPA o

ambos…..…………………………………………………………………………………..….102

Figura 4.9. Crecimiento (A), reproducción (B) y fertilidad (C) de C. elegans tras la

exposición. ................................................................................................................................. 106

Figura 4.10. Valores medios de crecimiento relativo, representados en boxplots, para los

diferentes grupos de muestras de agua (A) y en las diferentes estaciones (B). ................... 111

Figura 4.11. Categorización de efectos tóxicos sobre el crecimiento relativo de C. elegans

en las diferentes muestras de agua. ........................................................................................ 112

Figura 5.1. Área de estudio y sitios de monitoreo en la cuenca del río Tunuyán. .............. 122

xv

Figura 5.2. Representación en boxplots del análisis no paramétrico de Mann-Whitney.. 132

Figura 5.3. Datos del ICA para los diferentes sitios de monitoreo de la cuenca del río

Tunuyán. ................................................................................................................................... 134

Figura 5.4. Análisis no paramétrico (Test de Mann-Whitney p=0,0003) de los valores del

ICA por subcuencas (A) y por estaciones: otoño e invierno (O-I) versus primavera y

verano (P-V) (B). ...................................................................................................................... 135

Figura 5.5. Crecimiento relativo de C. elegans a lo largo de los sitios de monitoreo. ........ 136

Figura 5.6. Análisis no paramétrico (Test de Mann-Whitney p=0,0003) de los valores de

crecimiento relativo de C. elegans analizados por subcuencas (A) y por estaciones: otoño e

invierno (O-I) versus primavera y verano (P-V) (B). ............................................................ 137

Figura 5.7. Crecimiento relativo de C. elegans en los diferentes meses de monitoreo. ..... 138

Figura 5.8. Representación del ACP de los sitios de monitoreo según el crecimiento

relativo de C. elegans y los parámetros fisicoquímicos y bacteriológicos... ....................... 139

Figura 5.9. Análisis de regresión entre el crecimiento relativo de C. elegans y los valores

del ICA. ..................................................................................................................................... 143

xvi

ABREVIATURAS

ADN Ácido desoxirribonucleico

ARN Ácido ribonucleico

AMPA Ácido amino metilfosfónico

CASAFE Cámara de Sanidad Agropecuaria y Fertilizantes de Argentina

CCME Consejo Canadiense de Ministros del Ambiente

cDNA DNA complementario o copia

CE Conductividad Eléctrica

CE50 Concentración efectiva de un químico que causa el 50% de determinada

respuesta en un tiempo determinado.

C. elegans Caenorhabditis elegans

CGC Caenorhabditis Genetics Center

CONABIA Comisión Nacional Asesora de Biotecnología Agropecuaria

DBO Demanda Biológica de Oxígeno

DDT Dicloro Difenil Tricloroetano

DQO Demanda Química de Oxígeno

DRA Dosis de Referencia Aguda

E. coli Escherichia coli

EDTA Ácido etilendiaminotetraacético

ERO Especie Reactiva del Oxígeno

EPA Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos

ESP Enzima 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato

FAO Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación

GABA Ácido gamma-aminobutírico

GAT Gen Glifosato N-acetil Transferasa

GFP Proteína Verde Fluorescente, del inglés green fluorescent protein

xvii

HPLC-MASA Cromatografía Líquida de Alta Resolución con espectrometría de masas

IARC Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer, del inglés

International Agency for Research on Cancer

ICA Índice de Calidad de Aguas

MINAGRI Ministerio de Agroindustria de Argentina

MIP Manejo Integrado de Plagas

NGM Medio de cultivo estandarizado para nematodos, del inglés Nematode Growth

Medium

NOAEL Nivel sin efecto adverso observable

NRC Consejo Nacional de Investigación, Canada (National Research Council).

OD Oxígeno Disuelto

OGM Organismos Genéticamente Modificados

OMS Organización Mundial de la Salud

ONU Organización de Naciones Unidas

ORP Potencial de óxido reducción

POEA Polioxietileno-amina

RAS Relación de Absorción de Sodio

RR Cultivos desarrollados en la década de 1980 y que son tolerantes a herbicidas

de la familia Roundup®. Del inglés Roundup Ready

RT-PCR Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real

SENASA Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria de Argentina

SSU rRNA Subunidad pequeña del ácido ribonucleico ribosómico (rRNA)

TSD Total de Sólidos Disueltos

xviii

RESUMEN

Caenorhabditis elegans es un nematodo saprófito de vida libre que habita en el

suelo y la hojarasca terrestre que se ha convertido en un importante organismo modelo

animal en toxicología. Las características que han contribuido a su éxito son su genoma

bien caracterizado y descrito, facilidad de mantenimiento en laboratorio, ciclo de vida corto

y prolífico, y pequeño tamaño del cuerpo. Además, la mayoría de sus procesos fisiológicos

son similares a los de organismos superiores, incluyendo humanos. El objetivo de esta tesis

fue establecer en Argentina al nematodo C. elegans como una herramienta toxicológica

integral tanto para complementar el monitoreo tradicional de aguas como para caracterizar

los mecanismos moleculares activados por los agroquímicos de uso frecuente en nuestro

país. Se utilizó el crecimiento relativo del nematodo para evaluar los efectos toxicológicos

en dos cuencas argentinas: río Pergamino (Buenos Aires) y río Tunuyán (Mendoza). Estos

resultados se analizaron junto con los parámetros fisicoquímicos y bacteriológicos, así

como con su correspondiente valor de un Índice de Calidad de Aguas elaborado para cada

cuenca. Se demostró que el crecimiento de C. elegans es una herramienta útil para detectar

toxicidad, incluso cuando la calidad del agua cumple con los parámetros regulatorios

vigentes. Además se estudiaron los efectos de una formulación comercial del herbicida

glifosato sobre el ciclo de vida de C. elegans. Se realizó la caracterización molecular de la

respuesta del nematodo mediante el estudio de la expresión de genes de las vías de estrés

oxidativo. La información obtenida en esta tesis permitió evaluar la situación toxicológica

actual de las regiones de estudio y contribuirá a establecer reglamentaciones para proteger

el ambiente y la salud de la población rural.

Palabras clave: recursos hídricos, bioensayo, toxicología ambiental, glifosato, Argentina.

xix

ABSTRACT

The soil nematode Caenorhabditis elegans is a ubiquitous free-living organism

that has become an important animal model in aquatic and soil toxicology.

Characteristics of this model that have contributed to its success include its well and

fully described genome, ease of maintenance, short and prolific life cycle, and small

body size. Moreover, most of their physiological processes are conserved in higher

organisms, including humans. The aim of this thesis was to establish the nematode C.

elegans in Argentina as an integrated tool to complement traditional water monitoring

system and also to characterize the molecular mechanisms activated after the exposure

to chemicals frequently used in the country. The Tunuyán and the Pergamino River

Basins have been selected as representative of traditional water monitoring systems. In

order to generate an integrated water quality assessment, the C. elegans relative growth

bioassay was performed on them. These results were analyzed together with

physicochemical and bacteriological parameters and compared to a specific Water

Quality Index developed for each basin. It was shown that C. elegans bioassay is a

sensible and suitable tool to detect toxicity even when water samples met regulatory

requirements. Furthermore, the effects of a commercial formulation of glyphosate

herbicide on the life cycle of C. elegans were studied. Gene expression of the oxidative

stress response was characterized. On the basis of this thesis, the current toxicological

status of these regions was evaluated. These toxicological studies may contribute in the

future to establish regulations to protect both the environment and the rural population

health.

Key words: water resources, bioassay, environmental toxicology, glyphosate, Argentina

1

CAPÍTULO 1.

INTRODUCCIÓN

2

Capítulo 1. Introducción

1.1. Caenorhabditis elegans como organismo modelo

1.1.1. Clasificación taxonómica

Su nombre procede del latín y griego: caeno (reciente), rhabditis (palito), elegans

(elegante). Es un nematodo del género Caenorhabditis, familia Rhabditidae, orden

Rhabditida, clase Chromadorea, filo Nematoda, metazoo y eucariota (Taxonomía NCBI

– Centro Nacional de Información sobre Biotecnología, del inglés, National Center for

Biotechnology Information). Inicialmente fue descrito como Rhabditis elegans (Maupas,

1900) y, posteriormente, se clasificó como Caenorhabditis elegans (Dougherty, l955).

Es un organismo que forma parte de las 25.000 especies de nematodos descritas (Zhang

et al., 2016).

Este gusano saprofito de vida libre habita en el suelo y la hojarasca de lugares

templados y húmedos (Barrière & Félix, 2005). Ciertos estudios han indicado una

asociación entre el nematodo y gasterópodos terrestres, además de otros pequeños

organismos habitantes del suelo (Brenner, 2003; Fire, 2007). Los nematodos se

separaron de otros animales muy antiguamente; sus tasas de evolución molecular son

mucho más rápidas en ellos que en deuterostomados. No existe una estimación fiable de

la fecha de divergencia debido a la considerable tasa de heterogeneidad entre los

distintos linajes de genes; por consiguiente, la mejor medida de la diferenciación

taxonómica en Rhabditida es la cantidad relativa de las diferencias en las secuencias

(Kiontke & Fitch, 2005) (Fig. 1.1.).

3

A B

Figura 1.1. (A) Comparaciones de las divergencias evolutivas en genes SSU rRNA entre pares de especies dentro de los nematodos (rojo) y deuterostomados

(verdes). Las divergencias entre pares se estimaron mediante la suma de las longitudes de las ramas que intervienen entre taxones en (B); las desviaciones estándar (barras de

error) se calcularon como la raíz cuadrada de la suma de los cuadrados de las desviaciones estándar de estas ramas. (B) Filograma de probabilidad de los genes de las

subunidades pequeña y grande del ADN ribosómico (ADNr SSU y ADNr LSU) y los genes RNAP2, par-6 y pkc-3 utilizados para calcular las divergencias graficadas en (A)

(Kiontke et al., 2004).

Div

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speci

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Especies de referencia

4

1.1.2. Historia

Victor Nigon de la Universidad de Lion (Francia) en 1949 colectó una de las

primeras cepas de C. elegans con importancia histórica, denominada Bergerac (Nigon,

1949). Años más tarde, fue aislada la cepa Bristol por L.N. Staniland (Servicio Nacional

de Asesoramiento Agrícola, Londres) de una muestra de compost de Bristol, Inglaterra

(Nicholas et al., 1959). Sin embargo no fue hasta 1974, cuando el laureado Nobel

Sydney Brenner obtuvo la línea N2, que deriva de la cepa Bristol, proponiendo a este

organismo como un modelo biológico emergente basándose en la simplicidad de su

sistema nervioso y la posibilidad de ser manipulado con facilidad (Brenner, 1974). En

esa fecha los grandes avances en los conocimientos sobre genética y biología molecular

se habían conseguido gracias a la utilización de organismos simples como virus y

bacterias, que ofrecían la oportunidad de trabajar con grandes cantidades de individuos

y con tiempos de generación muy cortos. Hasta entonces existían otros modelos

animales bien consolidados, tales como la mosca Drosophila melanogaster o el ratón

Mus musculus; sin embargo, C. elegans ofrecía la posibilidad de trabajar con un modelo

que presentaba el equilibrio justo entre lo sencillo de su uso y mantenimiento en el

laboratorio y lo complejo de su biología.

Quizás, una de las pruebas más relevantes de la importancia del uso de C. elegans

como organismo modelo está ejemplarizada por la concesión de los premios Nobel de

fisiología y medicina en los años 2002 y 2006, y de química en 2008, a científicos que

realizaron su investigación y aportes fundamentales a la ciencia utilizando este

nematodo. En concreto, Sydney Brenner, Robert Horvitz y John Sulston, por sus

estudios sobre el proceso de apoptosis o muerte celular programada (Brenner, 2003;

Sulston & Hodgkin, 1988), Andrew Fire y Craig Mello por el descubrimiento del ARN

5

de interferencia en el año 2007 (Fire, 2007) y Martin Chalfie en 2009 por la aplicación

de la proteína verde fluorescente (GFP) en el estudio de la expresión génica.

1.1.3. Características fisiológicas y anatómicas

El genoma de C. elegans posee 97 x 107 pares de bases, 1/30 del humano,

habiendo sido intensamente estudiado a través de animales mutantes, transgénicos y con

genes noqueados, como así también mediante la técnica de interferencia de ARN,

descubierta en esta especie (Fire et al., 1998). Este nematodo fue el primer organismo

multicelular del cual se obtuvo la secuencia completa de su genoma (Caenorhabditis

elegans Sequencing Consortium, 1998; Hodgkin & Herman, 1998).

Caenorhabditis elegans es un organismo hermafrodita que puede reproducirse por

autofecundación (produce tanto ovocitos como esperma) aunque no puede fertilizar a

otros hermafroditas. Tiene 5 pares de cromosomas autosómicos y un par de

cromosomas sexuales. Si el sexto par es XX da lugar a un hermafrodita, mientras que si

es X0 se produce un macho. En condiciones naturales el porcentaje de ocurrencia de

especímenes masculinos es menos del 0,05% del total. El hermafrodita adulto tiene 959

células somáticas y el macho 1031. Es un animal eutélico en su fase adulta, es decir,

tanto el número de células como su posición son constantes en la especie.

Ambos sexos tienen un tamaño similar (Fig. 1.2.). El adulto tiene una estructura

bilateral simétrica, vermiforme, con un cuerpo cilíndrico tubular típico de cualquier

nematodo (Altun et al., 2012). Su estructura anatómica está conformada por una boca,

faringe, intestino, gónadas y una cutícula de colágeno. El orificio bucal aparece en el

extremo anterior de la cabeza y le permite ingerir las bacterias con las que se alimenta

(Fig.1.2.); el ano se ubica en la zona ventral, cerca de la región posterior. Los machos

6

tienen una sola gónada, vasos eferentes y una cola especializada para la cópula. Los

hermafroditas poseen dos ovarios, oviductos, una cavidad para almacenar el esperma y

un útero.

Figura 1.2. Anatomía de Caenorhabditis elegans. Adaptado de York et al., 2014.

1.1.4. Ciclo de vida

El ciclo de vida de C. elegans consta de una fase embrionaria, seguido de cuatro

estadios larvales (llamados L1, L2, L3 y L4) y los adultos. Cada etapa larval se

caracteriza por patrones específicos de división y diferenciación celular, estando

marcadas por una muda de cutícula (Casada & Russell, 1975). Es un ciclo de vida corto,

pues en condiciones de laboratorio normales a 20 °C, ocurre en 4 días (Fig. 1.3.). El

desarrollo embrionario se produce durante unas 14 h y el postembrionario durante 43 h.

Este nematodo puede crecer en un amplio rango de temperaturas, de tal manera que con

el aumento de la misma se eleva también su tasa de crecimiento, variando así la longitud

7

de su ciclo desde los 6 días a 15 ºC hasta los 3 días a 25 °C. A lo largo de su vida genera

entre 200 y 300 huevos. Estos se deponen aproximadamente en la fase de 30 células

(Yochem, 2006).

Figura 1.3. Ciclo de vida de C. elegans a 22 ºC. Se indica en azul el tiempo entre cada muda

larval y la longitud corporal (µm) para cada etapa de desarrollo. Modificado de Altun et al.,

2012.

Además de la temperatura, el ciclo de vida de C. elegans depende también de

otros factores. Hacia el final del estadio L2, si las condiciones del medio son

desfavorables (hacinamiento o ausencia de alimento) pueden estimular la formación de

un estadio intermedio L2d (denominado dauer o diapausa) que detiene su desarrollo y

no se alimenta, pudiendo permanecer en esa condición alrededor de 4 meses (Albert &

Riddle, 1988). Estas larvas dauer alteran su metabolismo energético y acumulan grasa

en el hipodermo y las células intestinales. Son delgadas y su boca sufre un sellado tal

8

que no pueden comer, permaneciendo inmóviles la mayor parte del tiempo a menos que

sean tocadas. Una vez que las condiciones ambientales son nuevamente propicias,

continúa su desarrollo normal, mudando a L4 (Hodgkin & Barnes, 1991) (Fig. 1.3.).

1.1.5. Ventajas de C. elegans como modelo biológico

Distintas características de este nematodo han acrecentado su popularidad como

modelo animal para la investigación en el campo de las ciencias biológicas. Su

mantenimiento en el laboratorio es económico y sencillo ya que su dieta se basa en la

bacteria Escherichia coli (Altun et al., 2012). Su elevado potencial reproductivo permite

la producción a gran escala en un periodo corto de tiempo. Tiene un tamaño corporal

pequeño (1,3 mm el adulto en ambos sexos), que posibilita llevar a cabo ensayos in vivo

en microplacas de 96 pocillos; es un organismo de relativa simplicidad desde el punto

de vista anatómico: su cuerpo es transparente y su linaje celular es invariable, lo cual

permite la observación, en preparaciones vivas, de todas sus células desde el desarrollo

embrionario hasta el animal adulto (Yochem, 2006). Su manipulación es sencilla, se

pueden hacer experimentos genéticos y transgénicos de manera más fácil y menos

costosa que en otros modelos animales, ofreciendo la posibilidad de estudiar en detalle

mecanismos biológicos a nivel molecular, con alta reproducibilidad en los resultados

(Fire, 2007; Wah Chu & Chow, 2002). Otra ventaja que presenta es que puede ser

congelado y mantenido durante largo tiempo a -80 ºC o a medio plazo en el estadio

dauer.

La mayoría de las cepas de este nematodo que se han utilizado durante los últimos

30 años han sido depositadas por los diferentes laboratorios de investigación en el

Caenorhabditis Genetics Center (Centro Genético para Caenorhabditis: CGC) de la

9

Universidad de Minnesota, el cual no sólo cumple la función de mantener la colección

de mutantes sino que también los distribuye comercialmente con un costo mínimo.

Asimismo, la comunidad científica ha desarrollado importantes herramientas

bioinformáticas imprescindibles para la planificación cotidiana de experimentos. Entre

ellas cabe destacar Wormbase en la cual se encuentra información acerca de la

estructura, secuencia y función de todos los genes de C. elegans, como así también

alelos mutantes y reactivos disponibles. También recapitula toda la bibliografía

publicada hasta el momento (Harris et al., 2010).

Pero la característica más importante, que convierte a C. elegans en un excelente

modelo biológico, es que existe una gran similitud genética y fisiológica con el humano;

entre un 60% y un 80% de homología (Kaletta & Hengartner, 2006). De hecho, la

mayoría de sus procesos fisiológicos básicos y de respuesta a estrés están conservados

tanto en otros nematodos parásitos como en organismos superiores (incluyendo

humanos).

1.1.6. Caenorhabditis elegans como modelo toxicológico

Esta especie se ha convertido en un importante modelo animal, tanto en el campo

de la toxicología clásica como en neurotoxicología, toxicología genética y ambiental por

las ventajas antes mencionadas. Desde los primeros estudios toxicológicos llevados a

cabo con nematodos de vida libre (Honda, 1924) se han venido usando diversas especies

del género Caenorhabditis o de otros géneros emparentados como Pristionchus

(Blaxter, 2011). Sin embargo ha sido C. elegans el más utilizado de manera exitosa

(Hulme & Whitesides, 2011; Menzel et al., 2005). Varios autores han demostrado que

este organismo posee criterios de valoración sensibles para realizar análisis

10

toxicológicos (Dhawan et al., 1999; Höss et al., 2013). De tal manera que representa un

excelente complemento a los sistemas basados en el cultivo de células in vitro o a los

modelos in vivo de vertebrados (Leung et al., 2008). Su sensibilidad es comparable con

la de enquitreidos, lombrices y colémbolos, pero con la ventaja que su manejo demanda

menos tiempo y espacio (Boyd et al., 2000; Cole et al., 2004; Kammenga et al., 1996).

Caenorhabditis elegans tiene también el potencial de predecir respuestas tóxicas que

son comparables con mamíferos (Anderson et al., 2004; Cole et al., 2014; Hunt et al.,

2012; Raley-Susman, 2014), pero libre de los problemas éticos que conlleva la

experimentación con ellos (Casey et al., 2015). Relativo a esto, se han hecho análisis in

vivo del efecto de la exposición de sustancias fitosanitarias sobre mecanismos

moleculares que se dan también en eucariotas superiores (Peterson et al., 2008; Surjo

Prabha & Manoj, 2009). Varios autores han utilizado a este nematodo para analizar los

riesgos potenciales de plaguicidas (Anbalagan et al., 2013; Cheng et al., 2014; Höss et

al., 2013; Jafri Ali & Sharda Rajini, 2012; Leelaja & Rajini, 2013; Lewis et al., 2013;

Meyer & Williams, 2014; Monteiro et al., 2014; Wang & Ezemaduka, 2014), de metales

pesados (Chapman et al., 2013; Jiang et al., 2016; Swain et al., 2004) y otros productos

químicos (Boyd et al., 2010; Li et al., 2012; Nam & An, 2010; Rudel et al., 2013;

Sochová et al., 2007; Yamamuro et al., 2011). También se ha utilizado con éxito para

evaluar los efectos farmacológicos y tóxicos de nanopartículas, conocidos como

estudios de nanotoxicidad (Chen et al., 2013; Rui et al., 2013; Wu et al., 2013; Zhao et

al., 2014), de toxicidad de fármacos (Matsuura et al., 2013; Smith et al., 2013) y toxinas

(Leung et al., 2010). La evaluación con C. elegans de nanocápsulas poliméricas para la

administración de medicamentos también ha mostrado resultados prometedores (Charao

et al., 2015; Jung et al., 2015). Son varios los parámetros que se han usado en esos

estudios, entre ellos: reproducción (Höss et al., 2013; Leelaja & Rajini, 2013; Rui et al.,

11

2013); fertilidad (Höss et al., 2009; Roh & Choi, 2011); esperanza de vida (Cha et al.,

2012; Zhuang et al., 2014); autofluorescencia intestinal (Rui et al.,2013; Wu et al.,

2013; Zhuang et al., 2014); bombeo de la faringe (Jadhav & Rajini, 2009); longitud

media del ciclo de la defecación (Zhao et al., 2014); desarrollo (Helmcke & Aschner,

2010), cambio a estadio dauer (Wang et al., 2010), búsqueda de alimento (Monteiro et

al., 2014); estrés oxidativo (Leelaja & Rajini, 2013), daño oxidativo y cambios en la

expresión génica (Eom et al., 2013; Liu et al., 2012; Rudgalvyte et al., 2013), cambios

en la expresión de proteínas, daño en el ADN y apoptosis (Wang & Ezemaduka, 2014).

También la longitud corporal ha sido usada exitosamente para evaluar el efecto de

plaguicidas sobre el nematodo (Boyd et al., 2010; Meyer & Williams, 2014; Roh &

Choi, 2006).

En la recomendación del Consejo Nacional de Investigación del gobierno de

Canadá sobre modelos toxicológicos alternativos al uso de animales, C. elegans ocupa

un lugar prometedor (ALTEX, 2013). También Europa y EE.UU. son precursores y

fuertes defensores de este concepto; en la Directiva de la Unión Europea 2010/63/UE

sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos y experimentales se

especifica en su artículo 4: Los Estados miembros velarán para que, siempre que sea

posible, se utilice una estrategia o método de pruebas científicamente satisfactorio que

no implique la utilización de animales vivos. En su artículo 47 establece: La Comisión y

los Estados miembros contribuirán al desarrollo y validación de métodos alternativos

que puedan proporcionar los mismos o mayores niveles de información que los

obtenidos en los procedimientos que utilizan animales superiores, pero que no

impliquen el uso de animales o utilizar menos animales o que impliquen procedimientos

menos dolorosos, y tomarán todas las demás medidas que consideren adecuadas para

fomentar la investigación en este campo (Hunt, 2016).

12

1.1.7. Caenorhabditis elegans como bioindicador ambiental

Durante los programas de monitoreo de la contaminación de aguas, es cada vez

más frecuente que se incluyan bioensayos con organismos indicadores capaces de

revelar la presencia de contaminantes (entre ellos, plaguicidas) y así proporcionar

alertas tempranas de potenciales riesgos ambientales. Debido a que las muestras pueden

contener tóxicos indefinidos, la inclusión de un indicador animal para complementar su

análisis es muy valioso. Por otro lado, el estudio de la expresión génica puede ser muy

útil al momento de evaluar la contaminación y ver cómo diferentes tóxicos

(agroquímicos, entre otros) afectan a los organismos y a los ecosistemas naturales

(Poynton et al., 2007). Debido a sus características génicas y fisiológicas, C. elegans, se

ha convertido en una preciada herramienta. Existen reportes que establecen que este

nematodo resulta un bioindicador útil en la evaluación del riesgo ecológico en agua,

sedimentos y suelos (Anbalagan et al., 2013; Hägerbäumer et al., 2015; Höss et al.,

2009; Hunt et al., 2014, 2016; Leung et al., 2008; Peredney & Williams, 2000; Xing et

al., 2009). Si bien se han llevado a cabo estudios de toxicidad de lodos y sedimentos de

ríos (Menzel et al., 2009), hasta el momento no ha sido extensamente utilizado en la

evaluación de muestras ambientales de agua, salvo por Ju y sus colaboradores (2014)

que expusieron al nematodo a muestras concentradas que se sabían contaminadas con

compuestos orgánicos bromados. Se encontró neurotoxicidad pero también

neuroestimulación (cambios en la locomoción y la actividad de la defecación). Efluentes

de agua de riego y sedimentos recolectados en arroyos de una zona afectada por la

minería también inhibieron el crecimiento del nematodo (Turner et al., 2013).

Es importante destacar que C. elegans es un modelo mundialmente aceptado para

la evaluación del impacto ambiental como queda ratificado por las normativas

13

internacionales ISO 10872:2010 (ISO, 2010) y ASTM (ASTM, 2014), que especifican

un método estandarizado para determinar la toxicidad de muestras sobre el crecimiento,

la fertilidad y la reproducción del nematodo (Höss et al., 2012; Leung et al., 2008;

Traunspurger et al., 1997).

1.2. Manejo del recurso hídrico

1.2.1. Estado del arte

La salud de los ecosistemas depende de flujos ambientales aptos para garantizar el

acceso al agua y a los servicios ecosistémicos relacionados con este recurso, así como la

distribución sostenible y equitativa del mismo. La calidad del agua es esencial para

mantener las funciones, los procesos y la capacidad de recuperación de los ecosistemas

acuáticos de los que dependen los medios de sustento y las oportunidades económicas

(WWAP, 2016). El desarrollo sostenible de actividades relacionadas con la salud,

educación, agricultura y producción alimentaria, dependen de una eficaz gestión,

protección y provisión del recurso hídrico (WHO, 1996, 2013).

La calidad del agua es un aspecto esencial del medio hídrico, tanto en lo que

respecta a la caracterización ambiental como desde la perspectiva de la planificación

hidrológica, entendiéndose como un conjunto de características físicas, químicas y

biológicas que hacen que el agua sea apropiada. Existen diversas normativas tendentes a

asegurar la calidad suficiente para garantizar determinados usos, aunque en general no

recogen los efectos y consecuencias que los requerimientos del hombre y sus

actividades tienen sobre las aguas naturales: sobreexplotación y liberación de

contaminantes. Estas acciones deterioran el recurso y disminuyen en general la

14

capacidad de resiliencia de los ecosistemas, por lo que se hace necesario atender a sus

consecuencias (Emerton & Bos, 2004; Meybeck et al., 1996; UN WWDR, 2009).

El Departamento de Asuntos Económicos y Sociales de la Organización de las

Naciones Unidas (ONU), a través de su Informe sobre Calidad del Agua, establece que

el deterioro de la calidad y el acceso a agua para consumo se ha convertido en un

motivo de preocupación a nivel mundial debido al crecimiento de la población humana,

la expansión de la actividad industrial y agrícola, así como las alteraciones en el ciclo

hidrológico debidas al cambio climático (Peña, 2016; UN, 2011). De hecho, en el

Informe sobre el Desarrollo de los Recursos Hídricos en el Mundo del año 2016, la

ONU plantea como objetivos principales por un lado apoyar la protección del agua de la

sobreexplotación y la contaminación, y por otro, satisfacer los requerimientos de agua

para consumo, saneamiento, generación de energía y agricultura (WWAP, 2016).

1.2.2. Gestión de los recursos hídricos

La Directiva Marco del Agua Europea ha establecido un conjunto de lineamientos

para la gestión sostenible e integrada de los recursos hídricos, en el que la información

ambiental sensible de datos biológicos y ecológicos desempeña un papel fundamental

(EC, 2000). Otras organizaciones ambientales tales como la Red de Agua de Canadá y

la Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos (USEPA) han desarrollado

legislaciones que garantizan la seguridad y gobernabilidad del agua (Bakker & Cook,

2011; USEPA, 2015). En la Cumbre Mundial sobre Desarrollo Sostenible de

Johannesburgo (ONU, 2002), la República Argentina junto con otros 187 países

acordaron desarrollar planes de Gestión Integrada de los Recursos Hídricos para

asegurar el uso eficiente del agua (Andrade, 2011; UNEP 2006). Este enfoque del

15

manejo de los recursos promueve la integración de todos los componentes ambientales

para maximizar el bienestar social y económico sin comprometer la sustentabilidad de

los ecosistemas (Aguirre Núñez, 2011; Guerrero et al., 2006; GWP, 2005).

En la República Argentina, la legislación actual sobre aguas está compuesta por la

Constitución Nacional y las normas contenidas en el Código Civil, el Código de

Comercio, el Código de Minería, el Código Penal, el Código Alimentario Argentino y la

Ley 25675 General del Ambiente; esta última establece los presupuestos mínimos de

protección ambiental. A su vez la nación ha ratificado préstamos para obras de

abastecimiento de agua potable y saneamiento urbano y rural, o construcción de obras

de uso múltiple cuya normativa involucra directa o indirectamente al agua (Pochat,

2005). Con la reforma de la Constitución Nacional de 1994 se introduce una disposición

relativa a la pertenencia de los recursos naturales (art. 124). En tal sentido se establece

que corresponde a las provincias el dominio originario de los recursos naturales

existentes en su territorio, aunque pueda haber también poderes concurrentes, cuyo

ejercicio corresponde indistinta y simultáneamente al gobierno nacional y provincial.

Lamentablemente, y en ausencia de una concepción y tratamiento integral, hay muchas

leyes provinciales que se refieren al agua. Esta situación genera una desarmonía entre

las normas, lleva al desconocimiento de las mismas y a la intervención de una

pluralidad de organismos públicos, propiciando una gestión fragmentada y sectorial de

los recursos hídricos. Algunas provincias han dictado códigos de aguas, siendo la más

antigua del año 1884, de la provincia de Mendoza. Son leyes que establecen principios

en materia de concesiones de aguas que por el Código Civil corresponden al dominio

público de ellas. Dentro de la región pampeana, solamente Córdoba cuenta con un

código de aguas que indica que las concesiones deben gestionarse ante la Dirección

Provincial de Hidráulica, ente registrador de los usuarios. En el caso de las aguas

16

superficiales, la concesión es a perpetuidad. Para el caso de las subterráneas, la

concesión es eventual (no permanente) y se requiere informar las características de la

perforación y los equipos previstos, la calidad y el caudal de agua extraída e identificar

al técnico responsable quien debe estar inscripto en un registro especial (Formento,

1998). En 1999 se promulgó la ley 12.257 que sancionó el Código de Aguas de la

Provincia de Buenos Aires, estableciendo el régimen de protección, conservación y

manejo del recurso hídrico de la provincia. En dicho código, se prevé la formación de

consorcios integrados por los beneficiarios y se reglamentan los distintos usos. En

marzo de 2003 los representantes de las jurisdicciones provinciales, suscribieron el acta

constitutiva del Consejo Hídrico Federal (COHIFE) como ámbito de discusión,

concertación y coordinación de la política hídrica en el que participan las provincias, la

Ciudad Autónoma de Buenos Aires y la Subsecretaría de Recursos Hídricos. Desde su

creación, este organismo desarrolla una labor de fortalecimiento del espacio

institucional con activa participación de sus miembros. En septiembre de 2003, el

COHIFE suscribió el Acuerdo Federal del Agua y los Principios Rectores de Política

Hídrica que fueron elevados al Congreso Nacional para materializar una normativa a

través de una Ley Marco Nacional de Política Hídrica coherente y efectiva (COHIFE,

2003). En ella se declara que la autoridad hídrica nacional establecerá niveles guía de

calidad de agua ambiente que sirvan como criterios referenciales para definir su

aptitud en relación con los usos que le sean asignados. Se establece en esta ley la

necesidad de asumir una estrategia integral conformada por acciones consistentes y

sostenidas en el tiempo, que permitan verificar la conservación de la calidad del agua o

el cumplimiento de metas progresivas de restauración de dicha calidad. Además se

contemplan programas de monitoreo y control de emisión de contaminantes,

17

conducentes a una gestión integrada de los recursos hídricos que minimice los conflictos

relacionados con el agua.

1.2.3. Evaluación de la calidad del agua

En los últimos años, la sociedad ha tomado mayor conciencia de la necesidad de

desarrollar prácticas sostenibles para la protección, la gestión y el uso eficiente de los

recursos hídricos. La República Argentina se caracteriza porque aproximadamente el

75% de su territorio es árido o semiárido (con precipitaciones medias menores a 800

mm/año). Los recursos hídricos superficiales (ríos y arroyos) se encuentran distribuidos

de una forma muy irregular, atendiendo a las particularidades geográficas y climáticas

de cada región. El monitoreo continuo de las aguas subterráneas y superficiales para

garantizar la preservación de su calidad, es una de las herramientas más poderosas de

evaluación. Conocer el estado y la dinámica del recurso hídrico con precisión constituye

el trabajo básico de todo proceso de planeamiento y gestión, aportando además

información esencial para controlar la eficiencia y sustentabilidad de los sistemas

hídricos y del conjunto de las actividades sociales y económicas relacionadas con el

agua. Lamentablemente el conocimiento de la condición sanitaria de los ambientes

acuáticos es incompleto y desigual, la evaluación de la calidad de las aguas dulces y el

monitoreo integrado de la polución acuática se encuentra restringido tanto geográfica

como temporalmente (Ferrari, 2015). Actualmente se le da prioridad a los planes de

monitoreo tradicionales, donde se analizan múltiples parámetros fisicoquímicos y

también bacteriológicos (Busch et al, 2016). Los índices de calidad de aguas (ICA) son

una herramienta práctica que sintetiza la información proporcionada por esos

parámetros (Bharti & Katyal, 2011; Bhutiani et al., 2016; Lumb et al., 2006). El

18

resultado es un valor único para cada sitio, que permite una interpretación de la

tendencia en la calidad de un cuerpo de agua a lo largo del espacio facilitando además

su comunicación (Abbasi, 2002; Ali Khan et al., 2004; Sutadian et al., 2016;

Venkatesharaju et al., 2010). No obstante, esta información no es suficiente para

determinar la complejidad de las interacciones entre los contaminantes y en

consecuencia es necesario realizar ensayos que permitan una evaluación toxicológica

integral del agua en modo sencillo, rápido y económico.

El uso de tecnologías analíticas avanzadas tales como la cromatografía líquida de

alta resolución, cromatografía de espectrometría de masas, de gases y de absorción

atómica hace que sea posible detectar una gama más amplia de contaminantes (Ju et al.,

2010; Ruan et al., 2009). Aun así, estos tipos de análisis presentan ciertas limitaciones:

Requieren un set de patrones de referencia conocidos, lo cual limita su espectro

de detección. Es complejo y costoso llevar a cabo análisis cualitativos y cuantitativos de

todos los posibles contaminantes.

Los parámetros fisicoquímicos estándar de agua detectan los contaminantes

medidos, pero no dan datos sobre la toxicidad total de la muestra de agua (son un buen

positivo pero un mal negativo).

No dan información toxicológica de los contaminantes presentes en el agua o de

la toxicidad dada por nuevos compuestos formados a partir de la interacción de

sustancias.

En muchos casos los contaminantes asociados a las actividades antrópicas son

potenciados por fenómenos naturales (por ejemplo escorrentía o lixiviación por lluvias e

inundaciones). Por tanto una única medida puntual no resulta suficiente, se requiere un

seguimiento temporal de las muestras de aguas para obtener un panorama de la

situación ambiental.

19

Dado que existen falencias en la evaluación de los contaminantes y sus

interacciones, lo cual es crucial para evaluar el estado ecológico acuático, se necesita

una herramienta adecuada para determinar el impacto de la contaminación. Los

bioensayos son un complemento a las técnicas analíticas de evaluación de calidad de

aguas, aportando un dato relativo a la toxicidad de las muestras (Castillo, 2004). Esa es

la razón por la cual, durante los últimos 20 años, se han desarrollado diferentes

bioensayos ecotoxicológicos (que abarcan diferentes niveles de organización) para ser

incluidos en los planes de monitoreo de agua y lograr esta visión integrada (De Castro-

Catalá et al., 2015; Faria et al., 2007; Kuzmanovic et al., 2015; Wernersson et al., 2015;

Zhang et al., 2015). En este sentido, C. elegans se establece como herramienta

promisoria para el monitoreo de aguas en el campo de la toxicología ambiental, siendo

su utilización complementaria y no sustitutiva de los índices fisicoquímicos. De esta

manera, los datos de una evaluación completa e integrada de la calidad de aguas,

permitirá a los organismos administradores y autoridades reguladoras contar con la

información más certera para tomar decisiones en forma eficaz y coordinada,

estableciendo políticas de gestión que aseguren la sostenibilidad del recurso.

1.2.4. Agricultura y calidad de agua

La agricultura es el principal usuario de recursos de agua dulce ya que utiliza un

promedio mundial del 70% de todos los suministros hídricos superficiales. Esta

tendencia ha sido impulsada por el crecimiento demográfico (que también ha ido

acompañado de un incremento en la actividad industrial) para satisfacer las necesidades

alimenticias asociadas. La productividad ha aumentado en este tiempo de manera

exponencial, en respuesta a la aplicación de la tecnología moderna y a las prácticas de

20

manejo, basadas fundamentalmente en un paquete tecnológico que combina siembra

directa y aplicación de glifosato en los cultivos transgénicos (soja -Glycine max- y

algodón -Gossypium spp.- como principales; Satorre, 2005). Un mal manejo de los

agroquímicos usados en las actividades agrícolas, sumado a la proximidad de los

campos de cultivo a las aguas superficiales y subterráneas, podría hacer que estas

sustancias llegaran hasta ellas, contaminándolas (Gunningham & Sinclair, 2005; Kolpin

et al., 1998). Las características del cuerpo hídrico (superficie, profundidad y caudal) y

las condiciones climáticas (temperatura, humedad, viento y régimen de precipitaciones)

de cada región particular son factores que afectan a la distribución de estos productos

(Kreuger, 1998; Neumann et al., 2002; Tesfamichael & Kaluarachchi, 2006). Así pues,

las contaminaciones no son solo puntuales, sino que los productos químicos se

distribuyen en el ambiente por medio de fenómenos como la deriva, la escorrentía

superficial y el drenaje (la infiltración y la percolación), pudiéndose encontrar restos de

los mismos lejos del punto de aplicación (Aparicio et al., 2013; Guzzella et al., 2006;

Sasal et al., 2010; Vryzas et al., 2009). Este tipo de contaminación difusa, entre las que

se cuenta el uso de agroquímicos, representa actualmente la principal causa, debido a la

diversidad de compuestos que son arrastrados a los cuerpos de agua y cuyo origen,

control y detección resulta dificultosa comparado con las fuentes puntuales (Baker &

Hunchak-Kariouk, 2006; Carpenter et al., 1998). Además de esto, el uso continuo de

estas sustancias plaguicidas aumenta la preocupación acerca del comportamiento y

efectos adversos potenciales sobre los organismos (Battaglin et al., 2016; Claver, et al.,

2006; Donald et al., 2007).

No obstante, se da la paradoja que la agricultura es al mismo tiempo causa y

víctima de la contaminación de los recursos hídricos: es causa, por la descarga de

contaminantes en las aguas superficiales y subterráneas además de la salinización y

21

anegamiento de las tierras de regadío. Es víctima, por el uso de aguas contaminadas,

que una vez usadas en los cultivos, son susceptibles de transmitir enfermedades a los

consumidores y trabajadores agrícolas.

La Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura

(FAO) en su Estrategia sobre los Recursos Hídricos y el Desarrollo Agrícola Sostenible

y en la Conferencia de las Naciones Unidas sobre Ambiente y el Desarrollo (UNCED,

1992), ha puesto de manifiesto claramente en el documento que...deben adoptarse las

medidas adecuadas para evitar que las actividades agrícolas deterioren la calidad del

agua e impidan posteriores usos de ésta para otros fines. Asimismo asienta la idea de

que deben establecerse sistemas eficaces en función de los costos que permitan

supervisar la calidad del agua destinada a usos agrícolas y trabajar en el

establecimiento de criterios biológicos, físicos y químicos de calidad del agua para los

usuarios agrícolas de los recursos hídricos.

Poniendo el foco en América latina, la degradación de la calidad del agua y la

contaminación de acuíferos superficiales y subterráneos son los mayores problemas que

enfrentan los recursos hídricos (UN WWDR, 2009). De hecho, la calidad de los ríos de

América Latina ha empeorado de manera exponencial, desde la década de los 90. Entre

las principales causas están el aumento de los vertidos residuales no tratados en las

corrientes de agua dulce y las prácticas no sostenibles de uso del suelo que incrementan

la erosión y conducen a un aumento de las cargas de abonos y sedimentos.

En Argentina los datos reportados en los últimos años de contaminación de aguas,

indican un porcentaje significativo de casos en zonas agrícolas del país, originados por

una continua urbanización asociada a una expansión industrial que ha conducido a

descargas industriales y domésticas no controladas y al empleo inapropiado de

productos agroquímicos en las zonas rurales o mixtas, afectando la salud, la producción

22

de alimentos y el desarrollo socio-económico. Se han reportado datos del impacto de la

agricultura sobre el ambiente a escala regional (Rabinovich & Torres, 2004; Viglizzo et

al., 2001, 2011), aunque no hay reportes de literatura sobre un impacto a escalas

superiores. Son escasos los estudios que hablen de contaminación de aguas superficiales

por plaguicidas (Chagas et al., 2014; De Gerónimo et al., 2014; Kraemer et al., 2014;

Mugni, 2008; Paracampo et al., 2012). Ciertos autores han demostrado la presencia de

agroquímicos en aguas subterráneas así como la sobreexplotación de acuíferos

(Calcaterra et al., 2011). Si bien se han hecho experimentos de simulación de redes

tróficas (mesocosmos) para la determinación de efectos biológicos de agroquímicos en

organismos no blanco (Bricheux et al., 2013; Vera et al., 2010), hasta ahora no se han

realizado estudios en el país que integren relevamientos de presencia de estas sustancias

en aguas superficiales en conjunto con ensayos de toxicidad. Por ello, realizar una

evaluación integrada y permanente de la calidad del recurso hídrico y establecer

relaciones causa-efecto en zonas de intensa actividad agrícola (e industrial), se hace

imprescindible.

Por esa razón, en este trabajo de tesis los ensayos de toxicidad se realizaron en dos

sistemas de cuencas hídricas (una de llanura en la región pampeana y otra de montaña

en la provincia de Mendoza) que abarcan ambientes agrícolas, urbanos e industriales.

1.3. Glifosato

1.3.1. Formulaciones comerciales de glifosato

El glifosato (N-fosfonometil-glicina C3H8NO5P; Fig. 1.4.) es un herbicida de

amplio espectro, no selectivo, post emergente, ampliamente usado en la agricultura para

23

el control de malezas anuales, perennes, mono o dicotiledóneas que compiten con los

cultivos por recursos como la luz, el agua y los nutrientes (Martino, 1995, 1997;

Rodrigues & Almeida, 1995).

Figura 1.4. Estructura química y modelo de enlaces del glifosato.

El glifosato es absorbido por las plantas, en las que se acumula preferentemente

en los tejidos metabólicamente activos como son los meristemáticos. Allí se une e

inhibe a la enzima 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), bloqueando de

esta forma las rutas metabólicas que llevan a la producción de los aminoácidos

aromáticos (fenilalanina, tirosina y triptófano) utilizados en la síntesis de proteínas

(Roberts et al., 1998). La EPSPS está presente en plantas y microorganismos, tales

como bacterias y hongos, y ausente en animales y humanos.

Las formulaciones comerciales más usadas contienen el surfactante polioxietileno

amina (POEA), ácidos orgánicos de glifosato relacionados, isopropilamina y agua (Fig.

1.5.). El POEA (sustancia derivada de ácidos sintetizados de grasas animales) es un

detergente que facilita la penetración del glifosato en las células vegetales y mejora su

eficacia, dado que el principio activo per se no es capaz de atravesar las cutículas

foliares y membranas celulares hidrofóbicas de las malezas (Franz et al., 1997; Martino,

1995).

24

Figura 1.5. Estructura química de la polioxietilamina (POEA).

1.3.2. Comportamiento y persistencia

Actualmente el glifosato es el herbicida de mayor uso en el sistema de cultivo

extensivo y uno de los más frecuentemente utilizados a nivel mundial en forestación,

control de malezas acuáticas y agricultura, particularmente en el sistema de siembra

directa (Martino, 1995, 1997).

Con respecto al suelo, es adsorbido fuertemente a las partículas del mismo, a pesar

de su elevada solubilidad (10,5 g L-1) (Prata et al., 2000). Se ha demostrado que el C14

de este herbicida se adsorbe más fácilmente en un suelo arcillo-limoso que en uno

arcillo-arenoso (Sprankle et al., 1975). Por tanto, las diferencias en las características

fisicoquímicas juegan un rol esencial en su adsorción: en particular su pH y su tenor de

Fe, Al, Ca, P2O5 (Dong-Mei et al., 2004; Maqueda et al., 1998). Respecto a la materia

orgánica, varios autores reportaron que está inversamente relacionada: el glifosato

compite con la misma por los sitios de adsorción en los minerales arcillosos y los óxidos

de Fe y Al (Gerritse et al., 1996). Varios investigadores afirman que puede ser

fácilmente desorbido en algunas clases de suelo, liberándose de las partículas y

movilizándose en el mismo. En Europa de hecho se vio que el 80% del glifosato

adicionado se liberó en un período de 2 h (Piccolo et al., 1994). Una vez liberado, es

rápidamente degradado de manera natural por los microorganismos (Dong Mei et al.,

2004; Glass, 1987), siendo este mecanismo una de las formas más importantes de

25

eliminación (Araújo et al., 2003). El producto de su biodegradación es el ácido

aminometil fosfónico, comúnmente conocido como AMPA (Fig 1.6.).

Figura 1.6. Estructura química y modelo de enlaces del AMPA.

En relación al agua, este herbicida se encuentra en la lista de los principales

contaminantes (Séralini, 2015). Los residuos de glifosato y sus metabolitos pueden

encontrarse en aguas superficiales cuando se aplica cerca de sus cursos, por efecto de la

deriva. Por otra parte, sabemos que muchas veces las aplicaciones se realizan mediante

pulverizaciones aéreas lo que puede incrementar su dispersión. La escorrentía es otro de

los mecanismos que influyen en la movilidad del producto, sea disuelto en agua o

adsorbido a las partículas en suspensión. En este sentido, Aparicio et al. (2013) señalan

que la presencia de glifosato y AMPA es más frecuente en la materia particulada y

sedimentos que en el cuerpo de agua en sí; aunque no hay muchos estudios en los que se

hayan investigado las diferentes matrices ambientales (sedimento y agua

principalmente) destino de estas sustancias. Humphries et al. (2005) llevaron a cabo un

monitoreo de aguas superficiales de humedales y arroyos en la zona de Alberta, Canadá,

encontrando glifosato en 8 de los 13 sitios y en el 22% de las muestras tomadas, con una

concentración pico de 6,07 μg L-1. Otro estudio realizado con el formulado comercial

Roundup®, utilizado para el control de malezas en la Reserva Natural de humedales

subtropicales de Mai Po (Hong Kong), concluyó que el formulado fue rápidamente

26

transportado por la corriente de agua, detectándose grandes cantidades del herbicida en

aquellas zonas que no recibieron aplicación del producto (Tsui & Chu, 2008).

1.3.3. Toxicidad

La toxicidad del glifosato fue evaluada por primera vez por la FAO en conjunto

con la Organización Mundial de la Salud, OMS (WHO, 1986), estableciendo la ingesta

diaria admisible (ADI) para el glifosato en 0-1 mg Kg-1 de peso corporal, en base a un

nivel sin efecto adverso observable (NOAEL) de 100 mg Kg-1 de peso corporal por día

en bioensayos crónicos de toxicidad y carcinogenicidad en ratas. Bajo este fundamento,

tanto la OMS como la EPA clasificaron los herbicidas con base de glifosato como Clase

III (levemente tóxico) para exposiciones orales e inhalación y en Clase I (severa) para

exposición ocular (EPA, 1993). Según el criterio de la EPA, considerando las

condiciones de uso presente y esperado, no hay potencial riesgo del herbicida para la

salud. Sin embargo, un estudio ha demostrado que las formulaciones y productos

metabólicos del glifosato comercial, sal de isopropilamina (como el Roundup®) causan

la muerte de embriones, placentas, y células umbilicales humanas in vitro (Benachour &

Séralini, 2009). En la Unión Europea, la última revisión de este herbicida fue hecha por

la Comisión Europea, concluyendo que no existen efectos adversos en la salud humana

o animal tras la exposición a los formulados con este herbicida (EC, 2002). No obstante,

la Agencia Internacional para la Investigación sobre el Cáncer en 2015 clasificó al

glifosato como probable carcinógeno para los seres humanos (grupo 2A) (IARC, 2015).

En Argentina, según la Resolución 350/99 (SENASA, 2015), su principio activo está

dentro del grupo de activos de improbable riesgo agudo. Tanto el glifosato como los

herbicidas formulados a partir de ese principio activo están clasificados en la categoría

27

de menor riesgo toxicológico (Clase IV o banda verde), es decir, productos que

normalmente no ofrecen peligro, según el criterio adoptado por la OMS y la FAO.

Respecto a la toxicidad ambiental, diversos autores han investigado el impacto de

fórmulas comerciales de glifosato como causante de daños (Newman et al., 2016;

Pizarro et al., 2016; Reno et al., 2014; Salazar-López & Madrid, 2011). Existen datos

que demuestran los efectos del estrés oxidativo provocado por glifosato comercial

(Roundup®) y la mayoría tiene que ver con exposiciones agudas (Guilherme et al.,

2010, 2012a, 2012b). Ciertos autores reportaron que los efectos no provienen de su

componente activo, el glifosato, sino del surfactante POEA (Burger & Fernández, 2004;

El-Shenawy, 2009; Moore et al., 2012; Tsui & Chu, 2003). Según Bozzo (2010) el

POEA es extremadamente tóxico para los organismos de ambientes acuáticos, como

disruptor respiratorio; inhibió el crecimiento del macroinvertebrado Daphnia magna y

causó efectos similares en otros organismos acuáticos (Brausch et al., 2007). Otros

autores, sin embargo, no encontraron una relación directa entre la toxicidad de

diferentes formulados de glifosato y la presencia o no del surfactante (Sihtmäe et al.,

2013). La evaluación de la toxicidad aguda de dos herbicidas comerciales formulados

con glifosato, usando peces de la especie Poecilia reticulata reveló mortalidad del 100

% de los especímenes a 100 μl L-1 de una de las sustancias (equivalente a 48 mg L-1 de

principio activo) y a 50 μl L-1 de la otra (equivalente a 24 mg L-1 de principio activo).

Con C. elegans se han llevado a cabo ensayos in vitro de exposición a glifosato,

evaluando diferentes parámetros. Ruan et al. (2009) encontraron una reducción en el

movimiento de la cabeza del nematodo y un aumento en el tiempo de alcance de la edad

reproductiva tras la exposición a una concentración de 0,007 mg L-1 del herbicida.

Negga et al. (2012) señalaron neurodegeneración en individuos expuestos a

concentraciones subletales del herbicida. En otros informes se exploraron los efectos de

28

la mezcla de dos pesticidas en el nematodo (uno de ellos el glifosato), utilizando una

variedad de enfoques diferentes (Gomez-Eyles et al., 2009; Negga et al., 2011; Viñuela

et al., 2010). Recientemente también se reportaron daños en el sistema nervioso y más

concretamente en la morfología neuronal de individuos de C. elegans expuestos a

glifosato (McVey et al., 2016).

Concerniente a aguas, los límites máximos permisibles para exposiciones a

glifosato a corto y largo plazo son 2,7 y 0,8 mg L-1 respectivamente, de acuerdo a las

directrices de calidad de agua para la protección de la vida acuática del Consejo

Canadiense de Ministros del Ambiente, CCME (Statistics Canada, 2014). Para agua de

consumo humano, la EPA establece el límite para la presencia de glifosato en 0,9 mg L-

1 (900 ppb) y como dosis de referencia 2 mg Kg-1 por día. La ley Argentina de residuos

peligrosos (Ley 24051/92) sin embargo, fija un máximo de 0,28 mg L-1; es la Unión

Europea la que fija un máximo más restrictivo, de 0,1 μg L-1. Contrariamente al caso del

glifosato, para AMPA no existe una regulación relativa a los límites permisibles a pesar

de que hayan sido reportados sus efectos tóxicos (Daouk et al., 2013; Domínguez et al.,

2016).

1.3.4. Marco legal de productos fitosanitarios. Registro e instrumentos

regulatorios

El área de registro y manejo de plaguicidas de la FAO tiene por objetivo

introducir prácticas agrícolas sostenibles para reducir los riesgos para la salud y el

ambiente asociados con el uso de plaguicidas. El Código Internacional de Conducta

para la Distribución y Utilización de Plaguicidas (CoC) es un documento internacional

orientativo sobre el manejo de plaguicidas para el público y las entidades privadas

29

involucradas en la distribución y uso de plaguicidas. Fue incluido en 1985 por la

Conferencia de la FAO y desde entonces ha sido la norma aceptada en todo el mundo

para el manejo de plaguicidas. En él se establece el concepto de ciclo de vida del

manejo de los plaguicidas, que aborda todos los aspectos principales relacionados con el

desarrollo, reglamentación, producción, gestión, envasado, etiquetado, distribución,

manipulación, aplicación, uso y control de todo tipo de plaguicidas, incluidas las

actividades posteriores a su registro y la disposición final de estos productos y de sus

envases. El CoC está destinado a utilizarse como base dentro del contexto de la

legislación nacional. En la República Argentina, el manejo de los plaguicidas está

reglamentado en distintas normativas emanadas del Ministerio de Agroindustria a través

de la Dirección de Agroquímicos y Biológicos (DIRABIO) del Servicio Nacional de

Sanidad y Calidad Agroalimentaria de Argentina (SENASA). La autorización de los

mismos se desarrolla en el marco de un proceso de calidad que determina que el

producto no implique riesgos. El registro es obligatorio, con una revisión periódica de

los productos y un seguimiento permanente de los posibles efectos de los agroquímicos

en el ambiente y en la salud humana.

Se presenta un cuadro resumen con la normativa internacional vigente en materia

de agroquímicos (Apéndice 1), la normativa nacional ambiental y demás normas que

rigen el uso y comercialización de plaguicidas en el país (Apéndice 2).

1.3.5. Uso del glifosato en Argentina

Debido a que la producción agrícola en Argentina se basa fundamentalmente en la

combinación de la siembra directa y cultivos transgénicos resistentes a glifosato, este

herbicida pasa a ser el más empleado, aplicándose de 180 a 200 millones de litros cada

30

año (Aparicio et al., 2013). En el 95% de los lotes que se manejan con siembra directa

se usa glifosato en algún momento del ciclo, particularmente, en la etapa de barbecho

químico o aún en pre-siembra (Argenbio, 2016). Sumado a esto, con la aparición de

malezas resistentes al herbicida en los cultivos, se comenzaron a incrementar tanto las

dosis totales por año como la frecuencia de las aplicaciones. Por tanto, el mayor uso de

agroquímicos asociados con el proceso de agriculturización y cambios en los patrones

de aplicación, representa riesgos de contaminación y de toxicidad que deben ser

detectados ya que pueden afectar tanto a la salud humana como al ambiente. Sin

embargo, no se han realizado demasiados estudios de seguimiento para evaluar los

posibles efectos del herbicida sobre el ecosistema. La mayor parte de ellos se ha

centrado en suelos más que en ambientes acuáticos (Maitre et al., 2010; Lorenzatti et al.,

2004; Lupi et al., 2015). Entre los trabajos con muestras ambientales de agua, se destaca

el de Peruzzo et al. (2008) que llevaron a cabo un completo estudio en aguas

superficiales y suelos de la región de Pergamino-Arrecifes, demostrando una mayor

deriva del glifosato debido a las precipitaciones y la lixiviación de partículas de suelo a

las que se asocia el herbicida, derivadas por escorrentía. Ronco et al. (2016) analizaron

el contenido de glifosato y AMPA en muestras de aguas y sedimentos del río Paraná;

De Gerónimo et al. (2014) estudiaron la presencia de diferentes plaguicidas, entre ellos

glifosato, comparando entre cuatro cuencas del país. Paravani et al. (2016) llevaron a

cabo un estudio en el que se determinó la concentración de glifosato en aguas del río

Paraná.

31

1.4. Objetivos

1.4.1. Objetivo general

Para hacer frente a la creciente demanda de alimentos de la población mundial se

requiere aumentar los rendimientos agrícolas. Este escenario plantea al sector

agropecuario la necesidad de emplear, entre otras alternativas, compuestos químicos

capaces de eliminar o controlar en modo eficaz las malezas, insectos y organismos

patógenos que afectan a los cultivos comerciales. Si bien a lo largo de las décadas la

industria de los agroquímicos ha evolucionado y se han ido seleccionando aquellos

compuestos que poseen baja toxicidad, con el mínimo impacto en el ambiente, es

necesaria la evaluación toxicológica integral del efecto de estos productos a largo plazo.

La realización de este tipo de estudios presenta el siguiente dilema: por un lado la

complejidad de los productos químicos de las muestras ambientales para poner a

prueba, evaluar su acción y comprender cómo afectan los mecanismos moleculares en

los organismos superiores. Por otro lado, la limitación de recursos y los problemas

éticos asociados a los ensayos tradicionales con mamíferos. De hecho, cada vez son más

los países que se adhieren a las iniciativas de distintos organismos internacionales de

reducir, mejorar o sustituir a estas especies en las pruebas toxicológicas, con métodos de

ensayo y modelos alternativos.

En este sentido se ha determinado que uno de los organismos modelo ideal para

hacer frente a los desafíos actuales de los campos de la toxicología molecular y

ambiental es el nematodo Caenorhabditis elegans.

El objetivo general de esta tesis es utilizar el nematodo C. elegans como

herramienta integral para evaluar la calidad del agua, considerando diferentes

32

condiciones ambientales y actividades antrópicas tales como la agricultura, industria y

generación de residuos urbanos.

La hipótesis principal de la investigación se establece como: Caenorhabditis

elegans es una herramienta toxicológica ambiental válida y complementaria en la

evaluación integral de la calidad de aguas.

1.4.2. Objetivos específicos

1. Estudio del efecto de la exposición de un formulado comercial de glifosato sobre

distintos aspectos de C. elegans:

A.1) El ciclo de vida del nematodo: puesta a punto del bioensayo.

A.2) La inducción de la respuesta a estrés oxidativo.

A.3) La expresión de genes de catalasa y su actividad.

2. Caracterización de muestras de aguas en dos cuencas representativas de la

República Argentina: río Pergamino y río Tunuyán.

B.1) Análisis fisicoquímico.

B.2) Análisis bacteriológico (río Tunuyán).

B.3) Determinación de la concentración de glifosato y su metabolito

(Pergamino).

B.4) Construcción de un Índice de Calidad de Aguas.

3. Estudio del efecto de la contaminación en aguas.

C.1) Calidad del agua y crecimiento del nematodo: valoración del estado

toxicológico de las muestras.

33

C.2) Análisis de la relación de la calidad de agua y el crecimiento relativo de

C. elegans.

C.3) Construcción de un índice de categorización de efectos tóxicos en

muestras de agua a partir de los valores de crecimiento relativo de C. elegans (cuenca de

Pergamino).

1.5. Contenido

El contenido de la tesis se ha organizado de la manera siguiente:

Un primer capítulo (Capítulo 1) de introducción sobre los aspectos generales

del estado del arte de C. elegans como organismo modelo, manejo ambiental del recurso

hídrico y del herbicida glifosato, además de presentación de los objetivos de la tesis.

A lo largo del capítulo 2 se describen los materiales y metodologías utilizadas

y el abordaje experimental elegido, que son comunes a los 3 capítulos siguientes, en los

que se exponen resultados. En cada uno de ellos, hay una introducción relativa a la

temática que aborda y presentación de los objetivos específicos. Más concretamente, el

capítulo 3 aborda el estudio de la respuesta de C. elegans tras la exposición a glifosato.

En el capítulo 4 se exponen los resultados de los análisis llevados a cabo en la zona de

Pergamino, en la región Pampeana: caracterización de aguas y evaluación de la

toxicidad. En el capítulo 5 se exponen los resultados del análisis espacio temporal de la

cuenca del río Tunuyán en Mendoza, donde se usa a C. elegans como herramienta

toxicológica integrada.

Por último, el capítulo 6 se hace una exposición de las conclusiones generales,

sintetizando los hallazgos principales y el aporte de esta tesis al conocimiento. También

se presentan las posibles líneas futuras a partir de los resultados de esta investigación.

34

CAPÍTULO 2.

MATERIALES Y

METODOLOGÍA

35

Capítulo 2. Materiales y metodología

2.1. Mantenimiento y procesamiento de C. elegans

2.1.1. Medios de cultivo para el nematodo y E. coli

La cepa utilizada fue la N2 de C. elegans var. Bristol, obtenida del CGC, crecida y

mantenida en placas de Petri a 15-20 ºC con un medio de cultivo sólido estandarizado

para nematodos (NGM) (compuesto por litro: 17 g agar, 2,5 g bactopeptona y 3 g NaCl

con la adición, después de la esterilización en autoclave, de: 1 mL 1M CaCl2, 1 mL 1M

MgSO4, 25 mL 1 M KH2PO4, y 1 mL de una solución que contiene 5 g L-1 de colesterol,

preparado en etanol). Se dispuso el medio NGM en placas de 60 mm de diámetro y,

justo antes del vertido, se le agregó: Estreptomicina 1000x y Nistatina 100x (Caldicott

et al., 1994). Las placas se conservaron en la heladera a 4 ºC en un recipiente hermético

hasta su uso.

Las bacterias usadas como fuente de alimento para C. elegans fueron E. coli de la

cepa OP50-1 que se hicieron crecer en un medio LB agar (10 g bactotriptona, 5 g

bactolevadura, 5 g NaCl, 15 g agar, H2O destilada hasta 1 L, pH 7,5) a 20 ºC (Kaletta &

Hengartner, 2006). Con el ansa se pasó una de las colonias aisladas en la placa y en

condiciones de asepsia se inoculó un medio LB líquido (10 g de bactotriptona, 5 g

bactolevadura, 5 g NaCl, H2O destilada hasta 1 L, llevado a pH 7 utilizando 1 M NaOH

y se incubó a 37°C con agitación durante 12 h. En condiciones de esterilidad se

aplicaron aproximadamente 0,05 mL de cultivo líquido de E. coli a placas con NGM; se

cuidó de no propagar la bacteria hasta los bordes de la placa para que los nematodos no

36

queden adheridos en esa zona, se deshidraten y mueran. Se dejó secar el césped de

bacteria durante toda la noche a 20 ºC (Brenner, 1974).

Para la sincronización (ver apartado siguiente) se utilizó M9 (3 g KH2PO4, 6 g

Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 Ml 1M MgSO4 añadido después de autoclavar, H2O hasta 1 L) y

solución de blanqueamiento alcalino (3,5 mL M9, 1 mL lavandina 30%, 0,5 mL 5M

NaOH). Para el crecimiento en medio líquido se utilizó medio S (S Basal 100%, citrato

de potasio 1%, solución 1%, 1M CaCl2 0,3%, 1M MgSO4 3%) con agitación a 150 rpm.

Los componentes de los medios mencionados se describen a continuación:

Medio tampón KPO4 (1 L): 108,3 g KH2PO4; 35,6 g K2HPO4

Colesterol (50 mL): 250 mg colesterol; etanol 95%

S Basal (1 L): 0,85 g NaCl; 1 mL colesterol (5 mg mL-1); 1 g K2HPO4

Medio citrato de potasio 1M (1 L): 20 g C6H8O7; 293,5 g C6H5K3O7.

2.1.2. Sincronización de los nematodos

Para la realización de los ensayos experimentales, se sincronizó previamente la

población de nematodos en el mismo estadio de desarrollo, utilizando el método de

lavandina (Kaletta & Hengartner, 2006). Para este procedimiento se lavaron los gusanos

hermafroditas adultos (con huevos) de la placa, con 1 mL de M9, aspirando y

expulsando con la micropipeta (P1000) para despegarlos. Se transfirió el colectado a un

microtubo de 2 mL (cargando el contenido de no más de dos placas por microtubo). Se

centrifugaron a 3000 rpm durante 5 min y se desechó el sobrenadante. Después se

agregó 1 mL de M9 y se centrifugó de nuevo a 3000 rpm durante 5 min. Se descartó el

sobrenadante y se agregó 400 mL de blanqueamiento alcalino (apartado 2.1.1.) para

37

matar a los nematodos grávidos y disolver su cutícula; de esta manera los huevos, que

son resistentes a esta solución, quedan dispersos en la misma. Se agitó con la mano por

4 min. Se realizaron dos/tres lavados con 1 mL de M9 estéril cada vez. Se centrifugó a

2000 rpm durante 20 s entre cada lavado. Se descartó el sobrenadante. El último

centrifugado se hizo a 11000 rpm durante 2 min, para romper los huevos, comprobando

que no hubiese finalmente olor a lavandina. Seguidamente se resuspendió en el mismo

microtubo de 1,5 mL, en 900 µL de M9 estéril y se colocó en un rotor en agitación

durante 12 h a 21 ºC, para la eclosión de las larvas L1, que fueron transferidas al día

siguiente a placas con césped de bacterias.

2.1.3. Conservación y recuperación de C. elegans

Los nematodos se mantuvieron a corto plazo en las placas NGM con césped de

bacteria a 20 ºC. Para su conservación a largo plazo fueron congelados. Para ello, a los

L1 sincronizados y mantenidos en medio líquido S basal, se les añadió solución de

congelación (Brenner, 1974), un medio líquido compuesto por:

Medio tampón S: 129 mL 0,05 M K2HPO4; 871 mL 0,05 M KH2PO4; 5,85 g

NaCl)

30 % de glicerina (v/v) (autoclave)

Se mezcló bien y se dispusieron en alícuotas de 1 mL en tubos criogénicos de 1,8

mL con rosca interna, empacados en una caja de espuma de poliestireno con ranuras

para la separación, etiquetados con el nombre de la cepa y la fecha. Se les aplicó un

enfriamiento gradual hasta -80 °C (Kaletta & Hengartner, 2006). Para la recuperación

de los nematodos, se descongelaron los viales gradualmente y a temperatura ambiente,

38

en un recipiente con hielo hasta su derretimiento total. Se pasaron después a una placa

con medio NGM sembrada con bacteria.

2.1.4. Transferencia y esterilización del nematodo en placas

El nematodo adulto alcanza aproximadamente 1 mm de longitud, por lo que no es

posible distinguirlo a simple vista. Se utilizó una lupa Nikon 3X (magnificación total

5X a 20X).

Se emplearon dos técnicas para transferir los nematodos de una placa a otra:

Fragmentación o corte de un trozo de agar de la placa y apoyarlo boca

abajo sobre otra, ya sembrada con bacterias. Los gusanos empezarán a distribuirse en

esta nueva placa.

Utilización de un ansa de platino para recuperar los nematodos

individualmente.

La transferencia de nematodos suele hacerse cada 2 o 3 días, para no saturar las

placas de individuos.

Esporádicamente las placas de C. elegans pueden contaminarse con hongos u

otras bacterias que no son las utilizadas normalmente como alimento. Generalmente no

dañan al nematodo, pero podrían dificultar su visualización y alterar su fisiología, por lo

tanto las placas deben mantenerse limpias (Stiernagle, 2005). Se utilizó el método de

descontaminación en placa, usando 5N NaOH y lavandina doméstica (solución al 5% de

lavandina). Se hizo una mezcla 1N NaOH: lavandina (1:1) y se puso una gota de esta

solución en el borde de una placa de NGM sembrada con E. coli. Con un ansa, se

colocaron varios hermafroditas grávidos en la gota, de tal manera que la solución mató a

39

los contaminantes y a los hermafroditas, secándose antes de que eclosionen los huevos y

nazcan los embriones L1.

2.2. Bioensayos con C. elegans

2.2.1. Efecto crónico del glifosato comercial sobre el ciclo de vida del nematodo

Para estudiar la respuesta del nematodo al glifosato comercial, se realizó un test

de toxicidad crónica siguiendo la metodología descrita por Höss et al. (2013) con

pequeñas modificaciones y acorde a métodos estándar (ISO, 2010). Se expusieron 10 L1

a concentraciones crecientes (0; 0,25; 0,50; 0,75; 1; 1,25; 1,75; 2,25; 5; 7,50 y 10 mg

mL-1) de la formulación de glifosato (Roundup® Ultra, distribuido por Monsanto) a una

concentración de 480 g L-1 en M9 suplementada con E. coli (la concentración final de

bacteria fue de 1 unidad de densidad óptica a 600 nm) en un volumen final total de 0,5

mL y se incubaron durante 96 h a 20 ºC. Se hizo un control negativo con medio M9 y

un control positivo del formulado de glifosato a una concentración de 2,5 mg mL-1. Los

ensayos se realizaron por cuadruplicado en placas de cultivo de 24 pocillos (de 1,5 mm

de diámetro cada uno). Transcurrido el tiempo, se detuvo el crecimiento de los

nematodos por calor (20 min a 50 ºC), se tiñeron por el agregado de 0,25 mL de

solución de Rosa Bengala (0,5 g L-1) y se almacenaron a 4 ºC hasta la realización de las

mediciones.

40

2.2.2. Ensayos con aguas

El bioensayo de aguas con C. elegans se desarrolló de acuerdo a métodos

estándar, con algunas modificaciones (Höss et al., 2009; ISO, 2010). El parámetro

usado para determinar la toxicidad fue la medición de la longitud corporal del gusano

adulto (Höss et al., 2012; Traunspurger et al., 1997).

Se incubaron 10 L1 con la muestra ambiental de agua colectada suplementada con

E. coli (la concentración final de bacteria fue de 1 unidad de densidad óptica a 600 nm)

en un volumen final total de 0,5 mL, durante 96 h a 20 ºC. Al igual que en los ensayos

con glifosato, se hicieron dos controles: uno con medio M9 y otro con glifosato a una

concentración de 2,5 mg mL-1. Los ensayos se realizaron por cuadruplicado (tanto las

aguas como los controles) en placas de cultivo de 24 pocillos, de 1,5 mm de diámetro

cada uno (Fig. 2.1.). Después de 96 h de incubación a 20°C, el bioensayo se detuvo

mediante calor (20 min a 50 ºC), se tiñeron por el agregado de 0,25 mL de solución de

Rosa Bengala (0,5 g L-1) y se almacenaron a 4 ºC hasta la realización de las mediciones.

Figura 2.1. Bioensayo con C. elegans, de acuerdo con métodos estándar.

41

2.3. Análisis de crecimiento, fertilidad y reproducción de C. elegans

Los nematodos que han sido usados en el bioensayo (tanto en el caso del glifosato

como con muestras ambientales de agua) ya teñidos, como se ha explicado

anteriormente, fueron transferidos desde las placas de ensayo a cápsulas de Petri con

medio tampón M9 (1000 μL para evitar la deshidratación) utilizando una pipeta Pasteur.

Las muestras fueron fotografiadas utilizando un microscopio óptico Nikon Eclipse 50i a

40X de aumento (o 100X para gusanos en estadio L1), con una cámara digital acoplada

Nikon CoolPix S10. A continuación, se midió la longitud del cuerpo a lo largo de su eje

utilizando el software ImageJ (Schneider et al., 2012). Se calculó la media de los L1 que

fue de 221 ± 20 µm (n = 30). Con este dato se estimó el crecimiento, como la diferencia

entre la longitud medida tras el ensayo (en µm) y la longitud promedio al inicio (media

de L1). Los resultados se expresaron como crecimiento relativo al control (en medio

M9) de cada experimento (Höss et al., 2009; ISO, 2010). La longitud del cuerpo en los

controles con M9 al término del bioensayo varió entre 1200-1300 ± 10 µm. Para el

análisis de la fertilidad, se contabilizó en el microscopio, a 40X de aumento, el número

de grávidos respecto al total de adultos; considerando al animal como grávido cuando

presentó uno o más huevos dentro del cuerpo. La reproducción de los nematodos se

obtuvo dividiendo el número total de L1 (descendencia) después del bioensayo entre el

número de animales que han llegado a adultos. Se expresaron los tres parámetros como

porcentaje de los valores medios para cada concentración, respecto a los obtenidos para

el control en M9 (ISO, 2010).

En los bioensayos llevados a cabo para las muestras ambientales de agua de las

dos cuencas, se eligió solo el crecimiento relativo como parámetro a analizar.

42

2.4. Detección de especies reactivas del oxígeno (ERO)

Se utilizó 2',7' dicloro - dihidro - fluoresceína diacetato (H2DCFDA) suministrado

por Sigma-Aldrich Chemical Company® para visualizar de manera cualitativa la

producción de ERO intracelular en estadio L4 con glifosato (1 mg mL-1), paraquat (0,5

mg mL-1) o con M9 (control), y suplementada con E. coli. La concentración final de

bacteria por pocillo fue de 1 unidad de densidad óptica a 600 nm. El paraquat se usa

como control por ser un potente inductor de estrés oxidativo ampliamente estudiado; se

eligieron ambas concentraciones por ser subletales (Al-Sarar, 2015; Fathi et al., 2015;

Ranjbar, 2014). Los L4 se obtuvieron a partir de L1 sincronizados como se ha descrito

anteriormente. Se trataron durante 16 h (toda la noche) a 20°C; tras este periodo los

nematodos se recolectaron de los pocillos y se lavaron cinco veces con M9. Se

incubaron posteriormente en oscuridad con 25 mM de H2DCFDA en 250 μL de M9,

durante 30 min a 20 °C (LeBel et al., 1992; Oyama el al., 1994). Después de la tinción,

se lavaron tres veces con M9 y fueron preparados con medio tampón fosfato salino

(NaN3 25 mM) para su visualización, con un microscopio de fluorescencia Nikon

Eclipse 50i. La intensidad de la fluorescencia se midió a 530 nm. Las imágenes fueron

tomadas con una cámara digital Nikon CoolPix S10 y son representativas de 50

nematodos procedentes de un ensayo que a su vez es representativo de 3 ensayos

independientes (se repitió 3 veces en el tiempo).

2.5. Extracción de ARN y PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR)

Se trataron 4000 nematodos en estadio L4 con glifosato (1 mg mL-1), paraquat

(0,5 mg mL-1) o con M9 (control), y suplementado con E. coli. La concentración final

43

de bacteria por pocillo fue de 1 unidad de densidad óptica a 600 nm. Los ensayos se

realizaron por triplicado en placas de cultivo de 24 pocillos y se incubaron durante 16 h

a 20 ºC. Transcurrido este tiempo, se recolectaron y lavaron cinco veces con M9, se

transfirieron a un microtubo de 2 mL, se resuspendieron en 500 µl de reactivo Trizol® y

se mantuvieron a -80 °C hasta su uso posterior. El ARN total fue aislado por el método

reactivo de Trizol de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Invitrogen,

Carlsbad, CA). La síntesis de cDNA se realizó a través de la transcriptasa inversa

Superscript II (Invitrogen, Reino Unido). Se añadió 1 μL del cDNA resultante para la

realización de la RT-PCR, utilizando el Fast-Plus EvaGreen® Master Mix (Biotium,

EE.UU.) y un sistema para RT-PCR de Applied Biosystems 7500. Las secuencias de

oligonucleótidos de todos los cebadores fueron diseñadas (Romanowski et al., 2012)

basándose en las de www.wormbase.org (Cuadro 2.1.) usando el software Primer 3 Plus

(Untergasser et al., 2007) y cotejados para especificidad utilizando NCBI BLAST

(Johnson et al., 2008). Los cebadores fueron comprados a Invitrogen. La expresión de

los genes relacionados con el estrés oxidativo se evaluó en relación al control sin

tratamiento de herbicida y un transcripto estable, cdc-42, utilizado como gen de

referencia (Hellemans et al., 2007; Hoogewijs et al., 2008). Los resultados representan

la media de tres réplicas (de 4000 nematodos cada una). El ensayo se repitió 3 veces en

el tiempo para demostrar la reproducibilidad de la prueba, con muestras biológicas

independientes. Los datos presentados pertenecen a uno de ellos.

44

Gen Descripción Secuencia cebador directo Secuencia cebador reverso

gsr-1 Glutatión

reductasa CGGAAAAGACGAGAAAGTCG TTATTCCGGCTTCACACCTC

gpx-7 Glutatión

peroxidasa ACAGGGTGGAACTCTTTTCG GTTTGTCGACGGACCAAATC

gst-36 Glutatión

S-transferasa AGGCAATTCGTCTGCTCTTC CGAGCGATTGCTGTAGTTTG

gst-28 Glutatión

S-transferasa CGCTGGAAAATCTCAGGAAG AATGTCCGCGAAGGTGATAC

sod-3 Superóxido

dismutasa TCGGTTCCCTGGATAACTTG AAGGATCCTGGTTTGCACAG

ctl-1 Catalasa ACTGAAAACCTACAAGGAGACG GCGACCGTTGAAAAACGAACG

ctl-2 Catalasa ACTGAAAACCTACAAGGAGACG GTGTCGGCGGATCCGCTC

ctl-3 Catalasa CACAAAACCCGGACCAATGG GCGACCGTTGAAAAACGAACG

trxr-1 Tiorredoxina

reductasa ACGATTGGTGTCGAAAGAGC TCAGGTGTTCCCTCCAAAAC

trxr-2 Tiorredoxina

reductasa CGGGAAAGAGCTAAAACACG ATCCACAAACTCGGCATAGG

prdx-2 Peroxirredoxina CAACCGAGATTATCGCCTTC TGTCAGCGAGAACTGGAATG

cdc-42 Gen de

referencia CTGCTGGACAGGAAGATTACG CTCGGACATTCTCGAATGAAG

Cuadro 2.1. Cebadores utilizados. El sentido de las secuencias es 5’ a 3’.

El sistema StepOne (Applied Biosystems) fue utilizado para realizar las

reacciones de RT-PCR. Los resultados fueron cuantificados usando el software

LinReg PCR (Ruijter et al., 2009) para determinar los ciclos umbrales de cada

reacción. Posteriormente fueron analizados utilizando el método descrito por Pfaffl

(Hellemans et al., 2007; Pfaffl, 2001).

45

2.6. Cuantificación de la actividad catalasa

Se tomaron muestras de 4000 nematodos tratados con 1 mg mL-1 del glifosato

comercial ya mencionado, durante 16 h (toda la noche) a 20°C. Como control positivo

de inducción, se trataron los animales con paraquat dicloruro a una concentración de 0,5

mg L-1 el mismo tiempo y en las mismas condiciones. Se hizo también un control con

M9. Transcurrido ese periodo, se colectaron los gusanos y se lavó el pellet hasta cinco

veces con M9. En el último lavado se resuspendió el pellet de nematodos en 1 mL de

M9 + EDTA 1 mM + cóctel inhibidor de proteasas Sigma P8340 1X final. Se mantuvo a

-80°C hasta la medición de actividad enzimática. Para ello las muestras se agitaron y se

sonicaron seis veces durante 10 s en un disruptor de células Branson Sonifier (450) para

obtener un homogeneizado que se centrifugó (13000 g, 5 min, 4°C). Se colectó el

sobrenadante para la determinación de la actividad de catalasa (Beers & Sizer, 1952;

Romanowski et al., 2012). La actividad fue medida por triplicado utilizando tres

homogeneizados diferentes de gusanos (con 4000 nematodos cada uno).

Para el ensayo específico de actividad catalasa (experimento dosis respuesta) se hizo el

mismo procedimiento descrito hasta ahora pero exponiendo a los nematodos a las

concentraciones de 0,2; 1 y 5 mg L-1. El contenido de proteínas se cuantificó según el

método de Bradford, utilizando albúmina de suero bovino como estándar. La actividad

catalasa fue determinada por la velocidad de desaparición de H2O2 mediante el

monitoreo de la disminución de la absorbancia a 240 nm durante 3 min a intervalos de

15 s (Aebi, 1987).

46

2.7. Obtención y conservación de muestras de agua

2.7.1. Pergamino (Buenos Aires)

Se seleccionaron veinte sitios de muestreo georreferenciados repartidos entre

aguas rurales subterráneas (ARSub), rurales superficiales (ARS) y urbanas superficiales

(AUS) (Fig. 4.4.; Cuadro 4.1.). Las muestras superficiales fueron tomadas directamente

en medio del ancho del río, de manera manual entrando en el mismo con botas de agua).

La propia turbulencia del caudal del río garantizó su representatividad. En el caso de las

ARSub 1 a 3, 11 y 13 se tomaron de los pozos correspondientes usando el bombeo del

molino mientras que la 4 y 5 fueron tomadas de los sistemas de riego por pivotes

instalados previamente. En todos los casos la colecta se hizo después de dejar correr el

agua durante unos minutos. En los sitios 9 y 10 se hizo directamente desde el

freatímetro, utilizando un tubo tomador de muestras. El nivel de napa freática se registró

en estos puntos y fue variable entre 2-8 m. En cada punto el agua fue tomada en tres

recipientes estériles: una primera parte en una botella de plástico de 0,5 L que se destinó

al laboratorio analítico para medir aniones, cationes, carbonatos, bicarbonatos y

sulfatos. La segunda fracción se recogió en una botella de plástico de 250 mL a la que

se añadió 0,5 mL de una solución al 10% de HCl para la posterior determinación de

glifosato y AMPA. La tercera fracción se colectó en un tubo falcon de 50 mL destinado

al bioensayo con C. elegans. Se realizó un primer muestreo (piloto) en el mes de

septiembre de 2013. Posteriormente se llevaron a cabo otros entre julio de 2014 y

febrero de 2015 (para evaluar la variabilidad temporal). Los meses elegidos fueron

coincidentes con las campañas de cultivo de soja y barbecho químico. El relevamiento

del mes de enero de 2014 no fue llevado a cabo debido a las dificultades operativas para

47

acceder a la zona. Tanto la toma de muestras como su almacenamiento, transporte y

conservación se realizó de acuerdo a metodología estandarizada SM 1060-C (APHA,

2012).

2.7.2. Río Tunuyán (Mendoza)

Se seleccionaron siete sitios georreferenciados, en los que se realizaron muestreos

mensuales desde otoño de 2014 hasta otoño de 2015 (marzo, abril, mayo, agosto,

septiembre, octubre, noviembre y diciembre). Durante los meses de invierno (junio y

julio) el monitoreo se vio suspendido debido a la falta de disponibilidad de agua en los

sitios Dique Tiburcio Benegas (TB) y San Martín (SM). Además, durante enero y

febrero no hubo muestreos debido a dificultades operacionales. En cada uno de ellos, se

tomó el agua en recipientes estériles a 0,4 m de la superficie, en el medio del río (se

relevaron de manera manual utilizando un equipo de protección de traje de neopreno,

guantes de goma y botas de agua). También en este caso, la turbulencia intrínseca al

tipo de cauce, garantizó la representatividad de las muestras. Todos los cursos de agua

fueron poco profundos (menos de 0,50 m) a excepción de los sitios Valle de Uco (VU)

y TB que aun así no superaban los 2 m de profundidad. Cada colecta de agua fue

dividida en cuatro alícuotas: la primera en una botella de plástico de 1 L para medir

aniones, cationes y demanda química de oxígeno (DQO). La segunda fracción se colocó

en una botella de plástico de 250 mL para determinación de nitratos y fosfatos. La

tercera se dispuso en una botella de vidrio esmerilado estéril de 250 mL para el

posterior análisis del oxígeno disuelto (OD) y la última fracción se recogió en una

botella de plástico de 250 mL para la posterior cuantificación de parámetros

bacteriológicos y el bioensayo con C. elegans. Al igual que en el caso anterior, se

48

realizaron todas las operaciones de acuerdo a metodología estandarizada SM 1060-C

(APHA, 2012).

2.8. Determinación de parámetros fisicoquímicos in situ

En las campañas de muestreo se midieron en cada punto de control de acuerdo

con métodos estandarizados (APHA, 2012; ASTM, 2014), los siguientes parámetros

fisicoquímicos: Temperatura (TºC), oxígeno disuelto (OD), pH, conductividad eléctrica

(CE) y el total de sólidos disueltos (TSD). Las determinaciones fueron hechas utilizando

una sonda multiparamétrica (Horiba U-10 Model). El nivel del acuífero se obtuvo con

una cinta de acero marcada con tiza o fue suministrada por los técnicos locales. El

potencial de oxidación reducción (ORP) fue determinado de manera directa, usando un

electrodo redox.

2.9. Determinaciones analíticas

2.9.1. Determinación de glifosato y AMPA

El análisis en las muestras de agua de Pergamino se hizo por la técnica de

cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) utilizando un espectrómetro de masas

Agilent 6460 (Abrahamsson & Sandahl, 2013). Se analizaron las aguas de los 20 puntos

de muestreo en los 7 meses muestreados. El porcentaje de glifosato y AMPA se calculó

considerando el número total de muestras para cada grupo de agua. Se acondicionó el

pH de las aguas, llevándolas a neutralidad. Seguidamente fueron filtradas a través de

discos de 0,45 µm de nylon o acetato de celulosa, verificando la ausencia de Cloro (Cl-)

49

para evitar la degradación del glifosato (agregando 100 mg L-1 de Na2S2O3). Las

muestras se derivatizaron con 0,2 mL de 0,5 mM FMOC (9-fluorenilmetilcloroformato)

1 mg mL-1 (Agilent) más 0,3 mL de medio tampón borato pH=9 (3,1046 g H3BO3 +

3,75 g KCl + 0,8122 g NaOH llevado a 80 mL con agua de calidad miliQ y ajustado a

un pH 9 con 1M NaOH, volumen final de 100 mL), llevado a 4 mL de volumen final

(para evitar la precipitación del FMOC, el H2O debe ser agregada primero). Se dejó

reaccionar a temperatura ambiente por lo menos durante 30 min. Para recuperar el

FMOC que no reaccionó se realizaron 3 extracciones con 1 mL de acetato de etilo cada

vez. Luego se pasó a través de filtros de nylon de 0,45 µm y se inyectó en el HPLC,

según protocolo (Goscinny et al., 2012; Nedelkoska & Low, 2004; Schuster &

Gratzfeld-Hüsgen, 1992). Se utilizó en todo momento material plástico ya que el

glifosato no derivatizado se adsorbe a sitios activos del vidrio.

2.9.1.1. Calibración

Se preparó una solución stock estándar (0,2 mg mL-1 (75:25 H2O: MeOH) -20 ºC).

Posteriormente se realizó una dilución de la misma, de 5 µg mL-1 en H2O a 4 ºC. A

partir de ella, se hicieron 6 más para proceder a la calibración para glifosato/AMPA:

G1/A1: 10 ng mL-1; G2/A2: 25 ng mL-1; G3/A3: 50 ng mL-1; G4/A4: 125 ng mL-1;

G5/A5: 250 ng mL-1; G6/A6: 350 ng mL-1. A continuación se procedió a la

derivatización (Agilent) para la detección de glifosato y AMPA en las muestras de

agua: a 50 µL patrón (muestra) se le añadieron 100 µL de medio tampón borato y se

agitó en vortex durante 30 s. Se agregaron 100 µL de FMOC y se repitió la agitación

por 30 s. Se incubaron 30 min en oscuridad. Al derivatizar los patrones, éstos quedaron

diluidos con las siguientes concentraciones para glifosato/AMPA: G1/A1: 2 ng mL-1 (2

50

ppb); G2/A2: 5 ng mL-1 (2 ppb); G3/A3: 10 ng mL-1 (2 ppb); G4/A4: 25 ng mL-1 (2

ppb); G5/A5: 50 ng mL-1 (2 ppb); G6/A6: 70 ng mL-1 (2 ppb).

2.9.1.2. Determinación

La fase móvil (solventes de corrida) usada para la determinación fue (cuadro 2.2.):

Solvente A: 0,002M KH2PO4 en 7% de acetonitrilo [KH2PO4 para preparar 1L se

pesan 0,2722 g (pm 136,09)], ajustado a pH 7.

Solvente B: acetonitrilo.

Minuto

Solvente de

corrida 0 9 10

SC A (mL) 97 65 3

SC B (mL) 3 35 97

Cuadro 2.2. Volúmenes inyectados de fase móvil. El análisis

cromatográfico total fue de 10 min. SC = solvente de corrida.

Las condiciones cromatográficas fueron:

Columna de fase reversa: ODS (C18).

Detector de fluorescencia: Fluorescencia exc 266 nm y emi 305 y filtro 280

nm.

Volumen de inyección: 5 µL.

Flujo: 0,5 mL min-1.

Tiempo aproximado de retención de glifosato: entre 7,7 y 8,1 min.

51

Tiempo aproximado de retención de AMPA: entre 10,4 y 10,7 min (Nedelkoska

& Low, 2004; Schuster & Gratzfeld-Husgen, 1992).

El límite de detección fue de 0,01 μg L-1

2.9.2. Determinación de cationes por técnica de absorción atómica

La concentración de cationes en las muestras de agua fue determinada por

Espectrofotometría de Absorción Atómica en un equipo AAnalyst 300 Perkin Elmer, a

la longitud de onda propia de cada elemento; para la calibración se utilizaron patrones

según la metodología analítica descrita por Perkin Elmer (1982). Se utilizaron lámparas

de cátodo hueco, y la lectura fue con llama Acetileno/Aire. Los límites de detección se

presentan en el cuadro 2.3.

Catión Límite de detección (mg L-1)

Calcio 0,003

Magnesio 0,0005

Sodio 0,002

Potasio 0,005

Cromo 0,02

Cobre 0,01

Plomo 0,05

Zinc 0,005

Manganeso 0,001

Hierro 0,003

Cadmio 0,01

Cuadro 2.3. Límites de detección de cationes por espectrofotometría.

52

2.9.3. Determinación de aniones carbonato y bicarbonato

Para la determinación de aniones carbonato y bicarbonato se utilizaron los

reactivos:

Fenolftaleína 0,1%: 0,1 g de fenolftaleína fueron llevados a 100 mL de etanol.

Naranja de metilo 0,01%: 0,01 g de naranja de metilo llevados a 100 mL con

H2O destilada.

H2SO4 0,1 N: 2,776 mL de fueron pipeteados en matraz de 1 L. Se llevaron a

volumen con H2O destilada (se controló periódicamente la concentración de esta

solución).

Para la determinación de carbonatos, se tomó una alícuota de 10 mL, a la que se

agregaron 6 gotas de fenolftaleína. Si la coloración se tornó rosada se consideró un

positivo en CO32- y se procedió a su titulación con 0,1 N H2SO4 hasta quedar incoloro.

Se anotó el volumen gastado (F) y sin volver la bureta al punto 0, se prosiguió con la

titulación para bicarbonatos. Si no viró al rosado al agregar la fenolftaleína, se consideró

que la muestra no contenía CO32- y se procedió directamente a la determinación de

bicarbonatos. Para ello, sobre la misma alícuota anterior se agregaron un par de gotas de

naranja de metilo y se tituló con el mismo ácido hasta llevar a coloración rosada. Se

anotó el volumen final gastado (N) (Jackson, 1976). El resultado se calculó según se

indica en el cuadro 2.4., siendo F los mL de 0,1 N H2SO4 gastados para virar la

fenolftaleína de rosa a incoloro y N los mL de 0,1 N H2SO4 gastados para virar el

naranja de metilo de amarillo a rosado (lectura total). Los resultados fueron expresados

en meq L-1.

53

Resultado de la titulación

La muestra contiene

Hidróxido Carbonato Bicarbonato

F= 0 0 0 N

2F> N 0 2F N-2F

2F> N 2F-N 2 (N-F) 0

2F = N N 0 0

Cuadro 2.4. Interpretación de la titulación. Se titula CO3 obteniendo F

y sin volver a 0 se titula HCO3 obteniendo N.

2.9.4. Determinación de cloruros

Se utilizaron los reactivos:

K2CrO4 5%: 5g de K2CrO4 fueron llevados a 100 mL de H2O destilada.

NO3Ag 0,02N: 3,3978 ± 0,0005 g de NO3Ag fueron pesados en papel de

aluminio y luego transferidos a un matraz de 1 L. Se disolvió con H2O destilada

llevando a volumen y se conservó en un frasco color caramelo protegido de la luz (se

controló periódicamente su concentración con una solución patrón de ClNa). Para

realizar el procedimiento se tomó una alícuota de 2 mL de muestra y se agregaron 3

gotas de cromato de potasio (que tomó color amarillo). Se tituló con NO3Ag hasta

obtener coloración anaranjada. Se anotó el volumen de NO3Ag gastado de tal manera

que la concentración de Cl- se calculó como:

Cl- (meq L-1) = VNO3Ag*f*10

Siendo V el volumen de NO3Ag gastado en la titulación (mL) y f el factor de

corrección de concentración del NO3Ag (Jackson, 1976).

54

2.9.5. Determinación de sulfatos

Se utilizaron los reactivos:

HCl.

BaCl2 10%: 100 g de BaCl2 fueron pesados y disueltos con H2O destilada

completando a volumen de 1 L.

Heliantina 0,05%: se disolvieron 0,5 g de heliantina fina en 1 L de H2O

destilada, y se guardó en frasco caramelo.

Para realizar el procedimiento de determinación de sulfatos se tomaron 10 mL de

la muestra previamente filtrada. En un vaso de precipitado se colocaron 13 gotas de

solución de heliantina 0,05% y la cantidad de HCl hasta conseguir el viraje del

indicador. Se calentó la solución y estando en ebullición se agregó rápidamente y con

agitación 1 mL de solución al 10% de BaCl2, durante 15 min. Después se la hizo pasar

a través de papel de filtración lenta (tipo Whatman n 42, SSN 5893, o similar) y se lavó

con agua caliente hasta reacción negativa de cloruros con NO3Ag. Se trasladó el papel

de filtro con el precipitado a un crisol de porcelana, tarado, donde se dejó secar primero

sobre tela metálica amiantada y luego se quemó (evitando que arda con llama).

Finalmente se calcinó al rojo moderado en ambiente oxidante durante 10-15 min (en

mufla). Se enfrió con desecador, se pesó y se repitió la calcinación hasta obtener

constancia de peso (más o menos 0,2 mg). Se calculó:

SO42- (g L-1) = P*0,414*1000/V

Siendo P el peso de BaSO4 obtenido en g; 0,014 el factor de conversión de BaSO4

a SO42- y V el volumen de muestra empleado en mL (IRAM, 1998).

55

2.9.6. Determinación de nitratos

Para la determinación de nitratos se utilizó cloruro al 2% (20 g de H3BO3 fueron

disueltos en 700 mL de H2O destilada). Se agregaron 15-20 gotas de indicador verde de

bromocresol-rojo de metilo y solución de 0,1 N NaOH hasta que el líquido tomó

coloración gris azulada. Se llevó a volumen de un litro y se mezcló bien. Antes de

realizar el procedimiento de determinación de nitratos en agua, se realizó un ensayo

cualitativo para comprobar su presencia, que consistió en medir 1 mL de muestra de

agua, introducirlo en un tubo de ensayo y agregar 4 mL de una solución de difenil

amina disuelta en H2SO4 concentrado. La presencia de nitratos quedó revelada por la

aparición de una coloración tanto más azul cuanto mayor cantidad de nitratos hubiera

disueltos en el agua. La determinación cuantitativa se hizo según se indica: se midió una

alícuota de la muestra de agua (de 200 a 250 mL) y se introdujo en un balón Kjeldhal

(Schlueter, 1977). Se agregó un gramo de aleación de Warda, se alcalinizó el líquido

con NaOH normal usando como indicador fenolftaleína al 1% y se destiló. El amoniaco

destilado se recolectó en 50 mL de solución de H3BO3 al 2%. Finalizada la destilación,

se valoró con H2SO4 0,1 N usando como indicador verde de bromocresol-rojo de metilo.

El viraje fue del verde al azul grisáceo. Para el cálculo de la cantidad de nitratos

presentes en el agua se aplicó la fórmula:

NO3- (meq L-1) = VH2SO4*N*1000/V

Siendo N la normalidad de la solución de H2SO4 y V el volumen de agua medido.

56

2.9.7. Determinación de la relación de absorción de Sodio (RAS)

Se determinó por fotometría de ionización de llama a una longitud de onda de 589

nm de acuerdo a la metodología estandarizada para el análisis de aguas SM 3500-Na+-B

(APHA, 2012). Este método tiene una sensibilidad de 0,015 mg L-1 y un rango óptimo

de concentración de 0,03 a 100 mg L-1 de Sodio (Na). Se nebulizaron las muestras en

una llama de gas bajo condiciones controladas. La concentración en mg L-1 de Na en la

muestra se calculó según:

Na (mg L-1) = (a-b) * d

Donde a es la concentración en mg L-1 de Na en la muestra leída en el

espectrofotómetro, b es el promedio de las concentraciones en mg L-1 de Na en los

blancos leídos en el espectrofotómetro y del factor de dilución si corresponde.

2.9.8. Determinación del fósforo total

Se hizo mediante un análisis colorimétrico usando C6H8O6 de acuerdo a la

metodología estándar para el análisis de aguas SM 4500P.B (APHA, 2012).

Este método se basa en la reacción en medio ácido entre el anión fosfato y el

molibdato amónico en presencia de tartrato de Potasio (K) y Antimonio (Sb) para

generar ácido fosfomolíbdico, el cual es reducido mediante ácido ascórbico generando

una coloración azul debida al Molibdeno (Mo) y susceptible de determinación

colorimétrica. La cantidad de fósforo presente se calcula a partir de las lecturas de

transmitancia de patrones y muestras, construyendo una curva de calibrado.

57

2.9.9. Determinación de fosfato soluble

Los niveles de fosfato soluble (PO43-) se determinaron por el método del ácido

vanadomolibdofosfórico de acuerdo a la metodología estandarizada para el análisis de

aguas SM 4500P.C (APHA, 2012). En una disolución diluida de ortofosfatos, el

molibdato de amonio reacciona en condiciones ácidas con el vanadato para formar un

heteropoliácido, ácido vanadomolibdofosfórico. En presencia del vanadio se forma

ácido vanadomolibdofosfórico de color amarillo. La absorbancia fue medida a longitud

de onda de 420 nm. La intensidad del color amarillo fue directamente proporcional a la

concentración de fosfato.

2.9.10. Determinación de la Demanda Química de Oxígeno (DQO)

Para ello se empleó el método colorimétrico de reflujo cerrado, de acuerdo a la

metodología estandarizada para el análisis de aguas SM 5220-D (APHA, 2012). La

reacción se llevó a cabo a 150°C durante 2 h y se determinó mediante un

espectrofotómetro Hach a 420 nm.

2.9.11. Análisis bacteriológicos

Las bacterias aerobias mesófilas (BAM) se cuantificaron de acuerdo con el

método estándar de recuento en placa (SM 9215-B) (APHA, 2012). Los coliformes

termotolerantes totales (CTT) y coliformes totales (CT) se determinaron por la técnica

de fermentación en tubos múltiples (SM 9221-B y E) (APHA, 2012).

58

2.10. Diagrama de Piper

Con el fin de visualizar el patrón hidrogeoquímico de las aguas superficiales y

subterráneas, se construyó un diagrama triangular de Piper con los iones mayoritarios.

Este es un método de identificación de la composición de iones en aguas. El diagrama

se construyó usando el software libre de la Universidad de Avignon (Francia)

Diagrama, versión 5.4.; para ello, los iones y cationes mayoritarios se representaron en

los dos triángulos de base como porcentajes de miliequivalentes y además fueron

proyectados en el rombo superior definiendo así las características de iones totales

(Chadha, 1999; Piper, 1944).

2.11. Índice de categorización de efectos tóxicos

Para caracterizar la magnitud del efecto tóxico de las aguas sobre C. elegans, se

construyó una escala de categorías de acuerdo a los valores de crecimiento relativo

(respecto al control con M9) del nematodo obtenidos en el bioensayo (Höss et al., 2009)

que van desde 0 a 1: 0,90-1 (no tóxico), 0,89 - 0,75 (ligeramente tóxico), 0,74 - 0,50

(moderadamente tóxico) y 0,49 - 0 (muy tóxico). Se calculó el porcentaje de cada una de

las categorías para cada punto de control.

2.12. Índice de Calidad de Aguas (ICA)

Con el propósito de integrar todos los parámetros fisicoquímicos y

bacteriológicos, se calculó un ICA para cada cuenca analizada incorporando aquellos

59

cuya concentración máxima admisible está regulada por la legislación ambiental

vigente. El cálculo se hizo de acuerdo a la ecuación descrita en el Informe de

Indicadores de Sostenibilidad Ambiental de Canadá (CCME, 1999), a partir de la suma

de los cuadrados de tres factores F1, F2 y F3.

CCME ICA = 100 – [(F1 + F2 + F3)1/2 / 1,732]

donde F1, es el alcance y representa el porcentaje de variables que no cumple con la

normativa local vigente (las variables fallidas) al menos una vez durante el período de

tiempo considerado, en relación al número total de variables medidas:

F1 = (Número de variables fallidas/Número total de variables) * 100

F2 es la frecuencia y representa el porcentaje de mediciones individuales que no

cumplen con la normativa local vigente (mediciones fallidas):

F2 = (Número de mediciones fallidas/Número total de mediciones) * 100

F3 es la amplitud y representa cuánto se aparta el valor obtenido de las mediciones

fallidas que no cumplen con el valor límite, establecido por la normativa local vigente:

F3 = (nse / nse + 1)

donde nse es la suma de dispersiones e indica la cantidad global por la cual una

medición individual está fuera de cumplimiento. Si nse > 0, entonces: 0 < nse / (nse+1).

60

Se calcula sumando todas las dispersiones y dividiendo por el número total de

mediciones (tanto los parámetros que cumplen los límites como los que no):

nse = [∑n i=1dispersióni / número de mediciones]

La dispersión resulta del número de veces que una concentración individual es

mayor que los límites y se calcula como:

dispersióni = (valor de mediciones fallidasi / límitej) - 1

O para los casos en los cuales el valor de la medición no está por debajo del

límite:

dispersióni = (límitej / valor de mediciones fallidasi) – 1

Los valores del índice van desde 0 a 100 (siendo 100 la mejor puntuación posible

de calidad de aguas) y presenta las categorías: excelente (95-100); buena (80-94); media

(65-79); mala (45-64) y muy mala (0-44) (Statistics Canada, 2014).

Para desarrollar el índice de la cuenca del río Pergamino (capítulo 4), se

seleccionaron: TºC, pH, CE, Cl-, Cu2+, NO3-, SO4

2-, Zn2+; Cr, Cd2+ y Fe2+. Los límites

máximos permisibles fueron proporcionados desde distintos reglamentos, teniendo en

cuenta los valores más restrictivos. Para Cu2+, Cr y Cd2+ se fijaron los valores límites de

acuerdo al Decreto 831/93 para protección de la vida acuática en agua dulce, de la Ley

N° 24.051 (1991) de residuos peligrosos. En el caso de Zn2+, pH, Cl- y SO42-, se

tuvieron en cuenta los valores límite de la Resolución 42/06 y para Fe2+ se usó la

61

Resolución N° 336/2003 para la protección de la vida acuática establecida por la Mesa

de la Autoridad del Agua de la provincia de Buenos Aires (Ley N° 12257, Código de

agua. Ministerio de Agroindustria, República Argentina). Para la TºC se usaron los

límites establecidos por la Autoridad de la Cuenca Matanza-Riachuelo (ACUMAR)

para la protección de la vida acuática (Resolución N° 3/2009 ACUMAR. Ley N°

26.168. Secretaría de ambiente y Desarrollo Sustentable, República Argentina), el límite

de la CE para el uso del agua de riego se fijó en menos de 1500 µS cm-1 (de acuerdo con

la clasificación de aguas subterráneas con fines de riego) (UCCC, 1974). En el caso de

la concentración de NO3-, se utilizó el límite para agua potable establecido por el

Código Alimentario Argentino, fijado por debajo de 45 mg L-1 (Capítulo XII. Decreto

N° 2126/07 de la Ley N° 18.284. Código Alimentario Argentino) (ver apéndice 3).

Para construir el ICA del río Tunuyán (capítulo 5) se seleccionaron los siguientes

parámetros: T°C, caudal, pH, CE, RAS, Na+, Cl-, HCO3-, SO4

2-, NO3-, PO4

3-, P, DQO,

OD, BAM, CT y CTT. Los mismos fueron determinados de acuerdo con la normativa

local vigente que proporcionan los límites máximos permisibles para los vertidos

directos e indirectos en los cursos de agua con fines de riego (DGI, 1996).

2.13. Análisis estadístico

Los datos del test de toxicidad crónica con C. elegans (capítulo 3), el bioensayo

piloto (capítulo 4) así como los resultados del análisis cuantitativo por RT-PCR de

genes (capítulo 3), fueron analizados con el programa Graph Pad Prism® versión 6.01

para Windows (Prism, 1994). En el caso del test de toxicidad, los resultados se

graficaron en función de la concentración de glifosato comercial y se calculó la

concentración efectiva media (CE50) aplicando el modelo sigmoidal. Se utilizó el

62

análisis de la varianza seguido de la prueba de Dunnett para comparar los resultados con

el control con M9 (con un nivel de significación de 0,05) y se estudió la correlación

entre las variables con el análisis de Pearson (con un intervalo de confianza del 95%).

El análisis de resultados obtenidos en la cuenca de Pergamino (capítulo 4) y río

Tunuyán (capítulo 5) se hizo con el programa de análisis estadístico R (Core Team,

2016). En ambos casos se realizó previamente la prueba de Shapiro Wilks para probar la

normalidad de las variables. Debido al comportamiento no normal de la mayoría de los

parámetros, se decidió utilizar métodos de análisis de la varianza que no tuvieran a la

normalidad de los datos como supuesto. Para los datos de parámetros fisicoquímicos y

bacteriológicos (en el caso de las muestras del río Tunuyán), la diferencia entre la media

y la mediana se utilizó para evaluar el valor más frecuente de la dispersión promedio

entre los puntos de muestreo (Antonopoulos et al., 2001; Parmar & Bhardwaj, 2014).

Adicionalmente, se realizaron análisis de regresión lineales para ver la relación entre el

crecimiento relativo de C. elegans y los datos del ICA. Para ello, cada valor del ICA se

correlacionó con el conjunto de datos mensuales de crecimiento relativo de C. elegans.

En el caso de los parámetros fisicoquímicos de la cuenca de Pergamino se realizó

un análisis univariado de la varianza (ANAVA) no paramétrico (Kruskal-Wallis) para

comparar las muestras de agua discriminando por origen y por estaciones. El nivel de

significación elegido fue del 5%. Para representar la dispersión de los grupos de datos,

así como los valores atípicos, se utilizaron boxplots. En este análisis, se muestra

posición, dispersión, simetría o asimetría y observaciones atípicas del conjunto de datos.

En el caso del conjunto de datos de SO42-, se utilizó la prueba no paramétrica de Mann-

Whitney también con un nivel de significación del 5% (Conover, 1980). Esta prueba

basada en el rango, no hacen suposiciones acerca de la distribución de las variables y

mantienen una eficiencia relativa asintótica razonable. En el caso de Zn2+, TSD,

63

glifosato y AMPA se realizó una prueba de la mediana; es un caso especial de chi-

cuadrado de Pearson (un análisis no paramétrico) utilizado para probar si dos grupos

difieren en su valor medio. Este análisis determina si los datos proceden de poblaciones

con la misma mediana con el fin de compararlos. Para glifosato y AMPA las

comparaciones se hicieron entre los grupos de agua y por estaciones. Se estudió también

la correlación entre el crecimiento y los parámetros fisicoquímicos con los análisis de

Pearson y Spearman con un nivel de significación del 5%.

Para el análisis de los datos de las variables estudiadas en la cuenca del río

Tunuyán se hicieron comparaciones no paramétricas: pruebas de Mann-Whitney y de

Friedman (bloqueando por mes y considerando a cada sitio de medición como un

tratamiento) con un nivel de significación del 5% (Conover, 1980). Posteriormente se

hicieron comparaciones múltiples entre grupos para aquellas pruebas que resultaron

significativas. Se llevó a cabo un Análisis de Componentes Principales (ACP) para

relacionar los parámetros fisicoquímicos y bacteriológicos con el crecimiento relativo

de C. elegans. El ACP es una técnica útil para identificar grupos con propiedades

similares o diferentes dentro de un gran número de datos que se caracteriza por muchas

variables y unidades experimentales (Li et al., 2007; Llario et al., 2006; Ouyang, 2005;

Simeonov et al., 2002). El propósito del ACP es el de reducir la dimensionalidad de un

conjunto de datos. El método se basa en proyecciones de muestras iniciales

multivariadas dispuestas en unos nuevos ejes de coordenadas (componentes principales)

que son generados considerando la varianza máxima de las muestras y que son

mutuamente ortogonales. El primer componente principal (CP1) de cada observación

multivariada se calculó utilizando la siguiente ecuación:

CP1 = ∑iWi* log (1+Xi)

64

donde cada Xi es cada una de las variables (crecimiento relativo del nematodo,

caudal, Cl, Na+, Ca2+, HCO3-, SO4

2-, BAM, CT, CTT) y Wi el coeficiente de la

combinación lineal que genera el CP1 correspondiente a cada observación multivariada.

El CP1 es un componente de forma que contrasta la variable crecimiento relativo del

nematodo contra las variables fisicoquímicas y bacteriológicas de acuerdo con:

CP1 = W0⋅crecimiento - ∑i Wi * log (1+Xi);W0,Wi> 0

También se realizaron 3 modelos de regresión lineal con objeto de encontrar el

mejor modelo de correlación de los parámetros fisicoquímicos y bacteriológicos con el

crecimiento relativo del nematodo como variable dependiente. De estos, el llamado

modelo completo utiliza todas las variables disponibles como regresoras; el reducido

sólo incluyó las variables presentes en los cálculos del ICA y el óptimo consideró las

mejores regresoras. Todos ellos siguieron la expresión lineal:

yj = β0+β1 Xi1+β2 Xi2+...+βp Xip+εi

donde yi es la variable respuesta (crecimiento relativo del nematodo) correspondiente

para cada i, Xip es la p-ésima variable regresora (datos fisicoquímicos y

bacteriológicos) para cada i. βp es un parámetro estadístico y εi es una variable aleatoria

normal (media 0 y varianza residual σ2). La estimación de los parámetros se realizó por

el método de mínimos cuadrados. El modelo estimado fue usado para producir

predicciones para la variable respuesta (crecimiento relativo) teniendo en cuenta los

valores conocidos de las variables regresoras (parámetros fisicoquímicos y

65

bacteriológicos). Para cada modelo, se calculó el R2 y R2-ajustado, siendo el R2 la

proporción de variabilidad en la variable respuesta que puede ser explicada por el

modelo de regresión lineal con las variables regresoras y el R2-ajustado la proporción de

variabilidad en la variable respuesta que puede ser explicada por el modelo de regresión

lineal con las variables regresoras pero penalizado por el número de parámetros usados

en el modelo (Drapper & Smith, 1981). El modelo que presentó el R2-ajustado más alto

fue el considerado como óptimo.

Tanto para el ACP como para el modelo lineal, se aplicó a los datos una

transformación logarítmica [log (1 + X)], con el objetivo de tener distribuciones

simétricas de variables fisicoquímicas y biológicas (Conover, 1980; Drapper & Smith,

1981; Peña, 2002).

66

CAPÍTULO 3.

ESTUDIO DE LA RESPUESTA

DE C. elegans TRAS LA

EXPOSICIÓN A GLIFOSATO

67

Capítulo 3. Estudio de la respuesta de C. elegans tras la exposición a glifosato

3.1. Introducción

Con el fin de optimizar un bioensayo reproducible y de fácil ejecución que

permita analizar la toxicidad de una sustancia a gran escala, se comenzó por estudiar

tres parámetros de respuesta del ciclo de vida del nematodo C. elegans. En ese sentido,

para establecer el protocolo, se analizaron la variación del crecimiento corporal, la

fertilidad y la reproducción al ser expuestos a concentraciones crecientes del glifosato

comercial; determinando la relación dosis-respuesta.

Se optó por trabajar con una formulación comercial del herbicida, ya que los

principios activos están acompañados de otras sustancias químicas como surfactantes

que pueden influir en la toxicidad final. La mayor parte de la literatura actual sobre la

toxicidad de este herbicida aborda un enfoque desde la toxicología clásica, que centra su

criterio en la valoración de la viabilidad, la reproducción y la fertilidad de diferentes

organismos, existiendo poca información sobre el mecanismo molecular intracelular en

organismos no blanco. Anbalagan et al. (2013) estudiaron la respuesta de C. elegans en

extractos orgánicos de suelos agronómicos. Se utilizaron cepas transgénicas que portan

el gen gfp reportero, permitiendo la correlación entre los datos de expresión

visualizados con él y las concentraciones de metales presentes en el suelo.

El estrés oxidativo es un estado tóxico causado por un desequilibrio entre la

producción y la eliminación de ERO. Estas moléculas incluyen iones de oxígeno,

radicales libres y peróxidos tanto inorgánicos como orgánicos. Son generalmente

moléculas muy pequeñas altamente reactivas debido a la presencia de una capa de

electrones de valencia no apareada. Estas especies se forman de manera natural como

68

subproducto del metabolismo normal del oxígeno y tienen un importante papel en la

señalización celular. Sin embargo, durante condiciones de estrés ambiental sus niveles

pueden aumentar en gran manera, lo cual puede resultar en daños significativos en el

ADN, ARN, proteínas y lípidos. De hecho, se cree que esa puede ser una de las

principales causas del envejecimiento. Cuando un organismo se encuentra en un entorno

desfavorable, sometido a condiciones de estrés oxidativo, se activarán mecanismos

moleculares que le permiten a las células del mismo intentar reparar ese daño sufrido y

en caso de no ser posible, accionar la cascada de muerte celular programada. La

activación específica de estos mecanismos se relaciona con el nivel de expresión de

ARNm de diferentes enzimas clave.

Caenorhabditis elegans posee varios sistemas enzimáticos capaces de detoxificar

ERO y regular el balance redox de la célula (Fig. 3.1.). Uno de estos sistemas está

encargado de detoxificar el anión superóxido, el cual es primero transformado en un

peróxido por la enzima superóxido dismutasa, y este producto es luego transformado en

agua por la enzima catalasa y/o diferentes peroxirredoxinas. Existen dos grandes

sistemas que actúan en conjunto con la superóxido dismutasa y la catalasa para

detoxificar ERO: el sistema tiorredoxina y el sistema glutatión. El sistema tiorredoxina

se basa principalmente en la proteína tiorredoxina (TRX) y la enzima tiorredoxina

reductasa (TRXR). El sistema glutatión incluye al glutatión (GSH), la glutatión

reductasa (GR), glutatión peroxidasas (GPXs), la glutarredoxina (GRX) y glutatión-S-

transferasas (GSTs). En este sistema, el glutatión tiene una forma activa (estado

reducido) capaz de reducir diferentes proteínas blanco (entre las que se encuentran

GPX, GRX, GST). Luego la glutatión reductasa es la encargada de reducir al glutatión

oxidado (GSSG) nuevamente a su forma activa (GSH) (Fig 3.1.).

69

Figura 3.1. Mecanismos de protección del estrés oxidativo. El ion superóxido,

generado durante la respiración aeróbica, es convertido en H2O2 por la superóxido

dismutasa. El peróxido es luego detoxificado a través de catalasas, peroxirredoxinas

dependientes de tiorredoxina o peroxirredoxinas dependientes de glutatión. El sistema

glutatión y el sistema tiorredoxina actúan en conjunto para detoxificar ERO. Fuente:

Romanowski et al., 2012.

El hábitat natural de C. elegans es el suelo, donde está expuesto a diferentes

agentes estresantes, tales como estrés abiótico, oxidativo, térmico (ya sea por frío o

calor), radiación UV, entre otros. Si combinamos este hecho con las características

descritas en la introducción general, podemos decir que por esa razón, es un excelente

modelo para estudiar interacciones con agentes estresantes ambientales mediado por la

respuesta al estrés oxidativo (Cabreiro, 2011; Gems & Doonan, 2009; Van Raamsdonk

& Hekimi, 2010).

3.2. Objetivos

El objetivo general en este capítulo es la combinación de los específicos que se

detallan a continuación:

1. Estudio del efecto del formulado comercial de glifosato (Roundup®

Ultra) sobre el crecimiento, fertilidad y reproducción de C. elegans.

70

2. Estudio de la generación de ERO por exposición a glifosato.

3. Estudio de la inducción de la respuesta a estrés oxidativo, tras la

exposición al glifosato comercial.

3.3. Resultados y discusión

3.3.1. Efecto crónico del glifosato sobre el ciclo de vida del nematodo C. elegans

En la Fig. 3.2. se muestran las curvas dosis-respuesta obtenidas para los

parámetros crecimiento, reproducción y fertilidad, en función de la concentración de

glifosato y el ajuste sigmoidal realizado sobre cada una de ellas.

71

Figura 3.2. Test de toxicidad crónica con C. elegans. Crecimiento (A), fertilidad (B) y

reproducción (C) de nematodos sincronizados en estadio L1 expuestos a concentraciones

crecientes de glifosato en medio tampón M9 con E. coli, durante 96 h a 20°C. Cada ensayo fue

hecho con 10 nematodos por cuadruplicado. Los valores de porcentajes de cada respuesta

relativizados a su respectivo control con M9, se representan frente a las diferentes

concentraciones del plaguicida. Los gráficos muestran las curvas sigmoideas ajustadas a los

datos de respuesta, usando el software GraphPad Prism 6.

En el cuadro 3.1. se muestran los parámetros de las curvas dosis-respuesta. Fue

calculada la CE50 para el crecimiento, la reproducción y la fertilidad del nematodo.

72

Parámetro Crecimiento Reproducción Fertilidad

CE50 [mg mL-1] 1,058 0,827 0,850

Intervalo de confianza 95% 0,8091 a 1,384 0,7737 a 0,8836 0,7496 a 0,9632

R2 0,9653 0,9630 0,9435

Cuadro 3.1. Valores de CE50 del formulado comercial de glifosato para C. elegans.

Los resultados mostraron que tanto el crecimiento de C. elegans como la

reproducción y la fertilidad fueron inhibidos por el glifosato, siendo estos dos últimos

parámetros ligeramente más sensibles que el tamaño del cuerpo.

Las concentraciones ensayadas en esta tesis, son mayores a las encontradas en el

análisis de muestras ambientales de agua realizado en el capítulo 4 de esta tesis (ver

cuadro 4.2.); que no superan los límites establecidos para campo: 0, 9 mg L-1 como

límite para la presencia de glifosato en aguas según la EPA; 0,28 mg L-1 según la ley

Argentina de residuos peligrosos (Ley 24051/92) y 0,1 μg L-1 según la Unión Europea.

Sin embargo, es importante evaluar estos efectos ya que se dan casos de exposición

directa a concentraciones altas ya sea por derrames puntuales o en tareas de

manipulación del herbicida. Los resultados aquí obtenidos son similares a los

encontrados previamente por Cole et al. (2004), uno de los primeros grupos que propuso

a C. elegans como modelo. En este estudio, se usó el comportamiento (mediante un

seguimiento computerizado del movimiento de cada individuo), asumiendo que las

modificaciones en este parámetro del nematodo estaban relacionadas con cambios

neuronales inducidos por diferentes plaguicidas organofosforados. Se calcularon los

valores de EC50 para cada producto químico en el nematodo y se compararon con los

de ratas y ratones, mostrando que los órdenes de magnitud en el caso del glifosato

estaban significativamente correlacionados a un nivel de significancia de 0,01 para ratas

73

y de 0,05 para ratones, utilizando el coeficiente Rank de Spearman. Esto estaría

confirmando que C. elegans es sensible a formulaciones comerciales de glifosato y que

la CE50 es comparable a la de modelos mamíferos. Si se contrastan los resultados de

este trabajo con los de otros donde se han llevado a cabo ensayos in vitro de exposición

de C. elegans a glifosato, en el caso de Ruan et al. (2009), encontraron también una

disminución del crecimiento corporal pero en una exposición aguda y a concentración

menor (0,007 mg mL-1). Otros autores señalaron efectos (neurodegenerativos) a

concentraciones subletales del herbicida (Negga et al., 2012) o reportaron efectos en

diversos parámetros del nematodo (como la reproducción o sobrevida) para la mezcla de

dos pesticidas (Negga et al., 2011; Viñuela et al., 2010). En este trabajo por primera vez

se dan las curvas dosis-respuesta mostradas, y las CE50 correspondientes para el

herbicida glifosato.

Con respecto a otros organismos, García Torres et al. (2014) evaluaron la

exposición al glifosato de dos especies de anélidos (se evaluaron los parámetros

mortalidad, biomasa, fecundidad y viabilidad del adulto) pero los efectos adversos

fueron observados a concentraciones muy superiores a las recomendadas para aplicar en

campo que en general van desde 1 hasta 3 mg Kg-1, variando según el volumen de

cosecha. Ellos observaron efectos adversos, tanto en la fecundidad como en la

viabilidad de los huevos, a concentraciones de glifosato muy altas, de 5000 mg Kg-1; así

que no se establecieron como modelos lo suficientemente sensibles.

3.3.2. Generación de ERO inducida por glifosato

Una vez visto que el glifosato comercial produjo una disminución en el

crecimiento, la fertilidad y la reproducción de C. elegans, se investigó la modificación

74

del equilibrio redox en el nematodo como un posible mecanismo de la toxicidad de este

agroquímico (Fig. 3.3.).

Figura 3.3. Producción de ERO en nematodos expuestos a glifosato. Los

nematodos en estadio L4 fueron tratados con glifosato (1 mg mL-1), paraquat (0,5 mg

mL-1) o incubados con M9 (control), durante 16 h a 20°C. Posteriormente fueron

recolectados, tratados con H2DCFDA y montados para su visualización en el

microscopio. Las imágenes son representativas de 50 nematodos visualizados durante

el ensayo.

Los resultados muestran una apreciación cualitativa de que la exposición a

glifosato incrementó la producción de ERO al mismo nivel que el paraquat, cuando

comparamos con el control. El estrés oxidativo se desarrolla cuando hay un

desequilibrio entre los prooxidantes y la relación de anti-oxidantes, dando lugar a la

75

generación de ERO. Los contaminantes ambientales, tales como herbicidas, metales

pesados e insecticidas, modulan los sistemas de defensa antioxidante y pueden causar

daño oxidativo en los organismos por la producción de ERO (Liu et al., 2006; Monteiro

et al., 2006). En C. elegans se ha estudiado la inducción de la generación de ERO tras la

exposición a diferentes plaguicidas (Zong et al., 2014). Varios autores reportaron

producción de ERO tras el tratamiento con los insecticidas clorpirifós (Jadiya & Nazir,

2012) y monocrotofos (Leelaja & Rajini, 2013). Se ha encontrado que la generación de

ERO a partir de la exposición a plaguicidas organofosforados podría ocasionar lesiones

en el ADN de los peces expuestos (Cavalcante et al., 2008; Ghilherme et al., 2012);

estos daños son producidos por la inhibición tras la exposición de las enzimas

implicadas en su reparación (Saleha et al., 2001). Nwani et al. (2013) también

reportaron resultados similares en la especie Channa punctatus, demostrando que

exposiciones subletales del herbicida glifosato inducen daño genotóxico. Peixoto

(2005), estudió el impacto del Roundup® y del glifosato puro en la fosforilación

oxidativa mitocondrial de ratas, encontrando que el principio activo en sí mismo no

mostró ningún efecto relevante sobre la bioenergética de esta organela, no así los

compuestos formulados, con los que sí hubo toxicidad a nivel energético. Estas

diferencias podrían ser atribuidas a un efecto conjunto del herbicida puro y el

formulado. Esta sinergia también ha sido estudiada y reportada en procesos de división

celular (Marc et al., 2002). La aplicación de un enfoque más sensible, con una

exposición crónica, tal y como se lleva a cabo en este trabajo, es esencial para la

completa evaluación del riesgo ambiental real de los herbicidas (incluyendo así

información del efecto sobre los seres vivos).

76

3.3.3. Respuesta específica al estrés oxidativo inducida por una formulación

comercial de glifosato

Puesto que se observó la producción de ERO, se estudió si la expresión de genes

representativos de respuesta a estrés sufre modificaciones debido al tratamiento con

glifosato comercial.

Figura 3.4. Análisis cuantitativo por RT-PCR de genes involucrados en la respuesta a

estrés oxidativo en nematodos expuestos a glifosato. Nematodos en estadio L4 fueron

tratados con glifosato (1 mg mL-1), paraquat (0,5 mg mL-1) o incubados en M9 (control)

durante 16 h a 20°C. Estos nematodos fueron recuperados y se midió los niveles de mARN

de cada uno por RT-PCR. El nivel de expresión de cada producto de PCR fue relativizado al

gen housekeeping, cdc-42 y al control con M9 (línea punteada). Los valores representan las

medias ± SD de 3 réplicas (n=4000 L1cada uno) y es representativo de 3 ensayos

independientes. *diferencias significativas según ANAVA (p<0.05) y test de Dunnet p <

0,0001.

Como muestra la Fig. 3.4., hubo un aumento muy marcado al poner a prueba la

expresión de algunos genes de respuesta a estrés oxidativo. En el caso de sod-3, tras el

tratamiento con paraquat (control positivo de inducción) la respuesta fue significativa.

Sin embargo no fue así respecto al glifosato, con el que si bien hubo un cierto aumento,

77

la mayoría de los genes no cambiaron respecto al control excepto para el caso de gpx-7,

gst-36 y ctl-1. Ya que en este último fue muy marcado, se decidió investigarlo en más

detalle. Para ello, se hizo un análisis específico de su actividad con un experimento

dosis respuesta, viendo la expresión de los 3 genes que en C. elegans codifican para la

catalasa (ctl-1, ctl-2 y ctl-3) tras la exposición a diferentes concentraciones de glifosato

comercial (Fig. 3.5.).

Figura 3.5. Análisis cuantitativo por RT-PCR de genes de catalasa (A) y actividad

específica de la catalasa (B) en nematodos expuestos a concentraciones crecientes de

glifosato. Se trataron nematodos en estadio L4 con las diferentes concentraciones de la

formulación comercial de glifosato durante 16 h a 20°C. Los niveles de expresión de cada

producto de PCR fueron relativizados al gen housekeeping, cdc-42, y al control con M9 (línea

punteada). Los valores representan las medias ± SD de 3 réplicas (n= 4000 L1cada uno) y es

representativo de 3 ensayos independientes. * diferencias significativas según ANAVA

(p<0.05) y test de Dunnet *p < 0,0001; **p = 0,0023.

A una concentración de 0,2 mg mL-1 de glifosato comercial, 1os genes para

catalasa ctl-1 y ctl-3 fueron inducidos hasta 3 y 2 veces sobre el control, mientras que

para ctl-2 la respuesta no fue significativa (Fig. 3.5.). La forma más activa en C. elegans

es la ctl-2, de localización peroxisomal, que representa un 80% de la actividad total de

la catalasa en el organismo. El resto corresponde a la ctl-1, citosólica y a la ctl-3,

78

posiblemente de localización mitocondrial (Petriv & Rachubinski, 2004). Puede ser que

el patrón de expresión de las distintas isoformas de la enzima esté relacionado con su

localización subcelular particular, de tal manera que puede estar dando información

sobre a qué organela esté afectando el glifosato. Por ejemplo, el hecho de que ctl-2 no

haya sido inducido, podría deberse a que la exposición al agroquímico no interviene con

el metabolismo normal del peroxisoma mientras que si lo hace a nivel del metabolismo

mitocondrial y citosólico (de ahí el marcado incremento en ctl-1 y ctl-3). Esto coincide

con los resultados encontrados por otros autores, que también reportaron una falta de

inducción de ctl-2 tras el tratamiento a glifosato (Anbalagan et al., 2013) y también con

el agroquímico clorpirifós (Roh & Choi, 2008). Modesto y Martínez (2010)

encontraron, en los peces tropicales Prochilodus lineatus, que los niveles de actividad

catalasa así como de superóxido dismutasa disminuían tras la exposición a Roundup®.

La modificación en la expresión génica como respuesta a estrés ambiental, se

utiliza cada vez más en ecotoxicología ya que ofrece valores de alta sensibilidad y

pueden ser muy útiles para el diagnóstico temprano de la contaminación ambiental (Lee

& Choi, 2006; Poynton et al., 2007; Roh et al., 2006, 2007; Snell et al., 2003). De

hecho, los genes que codifican para las tres catalasas pueden resultar posibles

biomarcadores a incluir en un futuro diseño del bioensayo con C. elegans, para la

obtención de una respuesta, también a nivel molecular, del impacto de diferentes

tóxicos.

3.4. Conclusiones

Los resultados demostraron que tanto el crecimiento de C. elegans como la

reproducción y la fertilidad fueron inhibidos por el glifosato comercial de manera

79

concentración-dependiente, calibrando y validando de esta manera el bioensayo con C.

elegans. Se reveló también que esto puede estar relacionado con la generación de estrés

oxidativo que resulta en un incremento en la expresión de genes de respuesta

antioxidante.

La reproducción y la fertilidad fueron ligeramente más sensibles a la exposición al

agroquímico que el tamaño del cuerpo. Para la longitud corporal, la CE50 fue de 1,058

mg mL-1de glifosato y 0,827 mg mL-1 y 0,850 mg mL-1 para la reproducción y la

fertilidad, respectivamente. El estudio de la respuesta antioxidante causada por la

exposición al herbicida comercial sugiere la existencia de un desbalance redox por

acumulación de ERO. Se observó un aumento significativo en la expresión de genes de

catalasa y también su actividad tras el tratamiento con glifosato. Se han identificado los

posibles genes de respuesta a estrés oxidativo tras la exposición, que puedan ser

factibles en un futuro para la evaluación de los cambios moleculares en muestras

ambientales de agua potencialmente contaminadas con este producto. De los genes

analizados, los que codifican las tres catalasas y las dos tiorredoxinas resultaron los

biomarcadores más prometedores.

80

CAPÍTULO 4.

CARACTERIZACIÓN DE

AGUAS DE LA REGIÓN

PAMPEANA. USO DE C. elegans

PARA LA EVALUACIÓN DE LA

TOXICIDAD

81

Capítulo 4. Caracterización de aguas de la región Pampeana. Uso de C. elegans

para la evaluación de la toxicidad

4.1. Introducción

4.1.1. Selección de la zona de estudio

La región pampeana (30-40 S, 55-65 W), una de las más grandes praderas del

mundo (Bilenca & Miñarro, 2004) cuenta con un gran extensión de tierra de alrededor

de 52000000 ha donde predomina un clima templado (Fig. 4.1.). La temperatura media

varía entre 14 °C al sur y 17 °C en el norte. El promedio de precipitaciones anuales, la

mayoría concentradas en primavera y verano, va desde 600 mm en el suroeste a 1000

mm en el noroeste (Viglizzo et al., 1995). Los regímenes de estas precipitaciones varían

a través del tiempo y el espacio, produciéndose episodios cíclicos de sequías e

inundaciones que afectan tanto a cultivos como a la producción de ganado (Viglizzo &

Frank, 2006). Durante las últimas cuatro décadas, ha habido una notable expansión de

los cultivos hacia el oeste en respuesta a un aumento persistente de precipitaciones

(Frank & Viglizzo, 2012; Viglizzo et al., 2011).

82

Figura 4.1. Zona de estudio

Dentro de la región pampeana y en el sistema del Río Paraná se encuentra la

cuenca del Río Arrecifes que linda al sur con el Sistema del Río de la Plata (SSRH INA,

2002). El río Arrecifes nace aguas arriba de la ciudad homónima, a partir de la

confluencia de los arroyos Salto y Pergamino (Fig.4.2.) y desemboca en el delta del río

Paraná (Salgado & Días, 2014).

83

Figura 4.2. Límite (divisoria de aguas) de la cuenca del río Arrecifes (en violeta), red

hidrográfica (en azul) y bañados (en verde). Fuente: Atlas de RRHH superficiales RA

(SSRH INA, 2002).

Estrechamente relacionados a estos cursos superficiales de agua se encuentran los

acuíferos subterráneos, otro importantísimo recurso. El Acuífero Puelche es el principal

en la región y es también el más utilizado del país, pues de él se abastece gran parte del

Conurbano de Buenos Aires y ciudades como Pergamino (Auge, 2004).

La zona de estudio elegida como representativa de la región Pampeana es la

subregión oeste de la cuenca del arroyo Pergamino (Provincia de Buenos Aires,

Argentina) porque desde mediados de la década de los años noventa registra un proceso

de intensificación agrícola, caracterizado por el uso creciente de agroquímicos junto con

la adopción del sistema de siembra directa (Agropanorama, 2016). La cuenca del

Arroyo Pergamino (Fig. 4.3.) incluye toda el área de aporte al escurrimiento superficial

hasta la convergencia con el Arroyo Salto.

84

Figura 4.3. Mapa de la zona de estudio. La cuenca del Arroyo Pergamino, en color celeste,

discurre en el partido del mismo nombre y abarca una superficie aproximada de 2019 km2 que

se encuentra al norte de la Pampa Ondulada, en la provincia de Buenos Aires. Fuente:

Aportación del Proyecto Cuencas Hidrográficas, Inst. Clima y Agua, INTA Castelar.

GEOINTA.

En la cuenca media se encuentra la localidad de Pergamino, cuya población es de

110000 habitantes (http://www.pergamino.gob.ar/). En la ciudad cabecera habitan

95000 personas, 10000 residen en los 12 pueblos de campaña del partido y 5000

corresponden a la población rural, ocupando en total una superficie de 2950 km2. La

ciudad posee un parque industrial de 70 ha, ubicado sobre la margen derecha del arroyo,

a 2 km aguas abajo del centro urbano. En la otra margen y casi enfrentado al parque

industrial se encuentran la planta de tratamiento de efluentes cloacales y la planta de

procesamiento de residuos sólidos domiciliarios. El área destinada a la actividad

agropecuaria supera el 95% debido al alto tenor en materia orgánica y a la penetración

en profundidad de la misma. La rotación más común en la zona es la que combina

cultivos de gramíneas – trigo (Triticum spp.) y maíz (Zea mays) – con las oleaginosas –

soja o girasol (Helianthus annuus) – de tal manera que el uso de agroquímicos no sólo

es frecuente sino también cada vez más intenso. Por lo tanto los cursos hídricos

85

adyacentes están expuestos a un alto impacto de contaminantes que llegan a ellos y

deterioran su calidad, amenazando además la integridad de los ecosistemas y la salud

del hombre.

Se seleccionaron veinte puntos de muestreo para abarcar la heterogeneidad de

usos de suelo de la zona, desde campos agrícolas hasta aguas que discurren por zona

urbana (Fig. 4.4.).

Figura 4.4. Imagen satelital de la zona de estudio. Localización de los puntos de monitoreo

en la cuenca del río Pergamino.

Como se dijo anteriormente, entre los puntos de muestreo se diferenciaron

ARSub, ARS y AUS (Cuadro 4.1.). Las muestras 1, 2, 3, 4, 5, 9, 10, 11 y 13 fueron

ARSub de la cuenca del río Pergamino. Los puntos se localizaron en la parte Noreste

del río Botija teniendo en cuenta la dirección del agua subterránea ubicada en zonas

deprimidas con suelos drenaje deficiente (INTA, 1972; Sainato et al., 2000). Los sitios

2, 3 y 11 se utilizan como agua potable para consumo humano. Las muestras de ARS 6,

86

8, 12, 14, 15 fueron tomadas en la cuenca del arroyo Botija, afluente principal del río

Pergamino. La 7 también de tipo ARS, fue relevada en la confluencia del arroyo Botija

con el río Pergamino, mientras que la 20 fue de un lago artificial. Todos estos sitios de

monitoreo se encuentran aguas arriba de la ciudad de Pergamino. Por el contrario, los

puntos de AUS 16 a 19 pertenecen al río Pergamino a su paso por la ciudad del mismo

nombre.

Sitios Tipo de

muestra

Localización Características

1 ARSub S: 33º 52 m 32,8 s; O: 060º 39 m

47,9 s; Profundidad: 77 m

Lote agrícola. Agua de pozo con

molino

2

ARSub

S: 33º 50 m 43,2 s; O: 060º 40 m

52,8 s; Profundidad: 18 m Actividades agrícolas y de granja. Agua

de pozo con molino, para consumo

humano 3 ARSub

S: 33º 50 m 43,2 s; O: 060º 40 m

52,9 s; Profundidad: 70 m

4 ARSub S: 33º 51 m 51,6 s; O: 060º 39 m

364,6 s; Profundidad: 38-41 m

Sistema de irrigación por pivote. 10

años de antigüedad

5 ARSub S: 33º 51 m 51,6 s; O: 060º 39 m

364,6 s; Profundidad: 40 m

Sistema de irrigación por pivote. 1

año de antigüedad

6 ARS S: 33º 52 m 18,6 s; O: 060º 38 m

23,8 s; Profundidad: 69 m Agua de río

7 ARS S: 33º 52 m 55,7 s; O: 060º 38 m

19,3 s; Profundidad: 63 m

Agua de río. Confluencia de los ríos

Botija y Pergamino

8 ARS S: 33º 53 m 02,3 s; O: 060º 37 m

42,8 s; Profundidad: 57 m Agua de río

9 ARSub S: 33º 52 m 00,4 s; O: 060º 38 m

39,0 s; Profundidad: 37 m Emprendimiento rural. Las muestras

fueron tomadas de piezómetros de 40

años de antigüedad 10 ARSub S: 33º 51 m 53,4 s; O: 060º 39 m

09,2 s; Profundidad: 48 m

Continúa en la página siguiente

87

Sitios Tipo de

muestra

Localización Características

11 ARSub S: 33º 51 m 53,4 s; O: 060º 40 m

46,6 s; Profundidad: 79 m

Jardín orgánico. Rodeada de campos

de soja. Molino de agua de 30 m de

profundidad. Para consumo humano

12 ARS S: 33º 50 m 46,4 s; O: 060º 38 m

17,9 s; Profundidad: 67 m Agua de río

13 ARSub S: 33º 51 m 27,5 s; O: 060º 38 m

51,0 s; Profundidad: 78 m

Lote agrícola. Agua de pozo con

molino

14 ARS S: 33º 54 m 12,1 s; O: 060º 36 m

48,3 s; Profundidad: 70 m

Basural en desuso con un arroyo que

lo atraviesa

15 ARS S: 33º 54 m 07,2 s; O: 060º 35 m

28,6 s; Profundidad: 53 m Agua de río

16

AUS

S: 33º 54 m 05,0 s; O: 060º 35 m

05,1 s; Profundidad: 56 m

Puentes sobre el río Pergamino, en

zona urbana

17 S: 33º 54 m 10,9 s; O: 060º 34 m

39,2 s; Profundidad: 57 m

18 S: 33º 54 m 17,4 s; O: 060º 34 m

10,6 s; Profundidad: 57 m

19 S: 33º 54 m 27,2 s; O: 060º 33 m

44,8 s; Profundidad: 58 m

20

ARS S: 33º 52 m 09,2 s; O: 060º 38 m

43,1 s; Profundidad: 71 m Lago artificial

Cuadro 4.1. Caracterización de los puntos de muestreo en la cuenca de Pergamino. Las

coordenadas fueron localizadas con el sistema oficial Posgard 94 para referencias geodésicas. ARSub =

aguas rurales subterráneas; ARS = aguas rurales superficiales; AUS = aguas urbanas superficiales.

4.2. Objetivos

El objetivo principal de este estudio fue la caracterización de la calidad y del

estado toxicológico de muestras de agua en la cuenca del río Pergamino.

Los objetivos específicos fueron:

88

1. Caracterización de las muestras (superficiales y subterráneas), mediante

el uso de parámetros fisicoquímicos.

2. Cálculo de un ICA.

3. Determinación y cuantificación de glifosato y AMPA.

4. Realización del bioensayo con C. elegans para la evaluación de los

riesgos toxicológicos.

5. Comparación de los resultados del bioensayo con la caracterización

fisicoquímica.

6. Construcción de un índice de categorización de efectos tóxicos a partir de

los valores de crecimiento relativo del nematodo.

4.3. Resultados y discusión

4.3.1. Análisis de parámetros fisicoquímicos

En el cuadro 4.2. se muestran la media, la mediana, el mínimo y el máximo del

conjunto de datos, de los 7 meses monitoreados. Se vio un amplio rango de valores

entre los sitios, en función de su origen.

89

Sitio T°C pH

CE

µS cm-1

ORP

HCO3-

meq L-1

NO3-

mg L-1

SO42-

mg L-1

Cl-

mg L-1

K+

mg L-1

Ca2+

mg L-1

Na+

mg L-1

Mg2+

mg L-1

Gli

µg L-1

AMPA

µg L-1

ARSub

1

Media 22,1 7,8 1046 119 9,7 45 38,2 36 81,4 9,1 171,8 8,1 1,45 1,89

Median 20,3 7,8 1040 126 9,8 47 54,5 36 74,5 8,8 175,3 7,2 0,89 1,53

DE 6,0 0,1 83 33 0,3 4 24,4 0 49,3 11,1 128,1 5,5 1,70 1,17

Min 18,3 7,6 967 71 9,5 39 11,0 36 36,0 2,0 83,3 5,7 0,20 0,94

Max 33,4 7,9 1194 154 10,0 48 65,2 36 170,5 29,5 415,5 20,0 3,82 3,19

2

Media 21,0 7,4 1711 134 13,5 28 86,5 103 79,4 11,5 251,7 8,0 1,12 2,50

Median. 19,4 7,4 1735 132 13,5 26 83,5 89 79,9 10,4 260,0 8,7 0,41 2,50

DE 3,6 0,1 132 26 0,9 9 16,3 44 71,4 13,3 103,9 2,1 1,62 0,87

Min 18,3 7,3 1505 114 12,5 21 68,0 71 30,4 4,7 123,7 4,0 0,12 1,89

Max 28,2 7,7 1883 179 15,0 47 111,4 178 240,5 35,0 391,5 11,0 3,52 3,11

3

Media 19,9 7,5 1553 121 12,4 17 66,9 85 62,9 8,0 261,6 6,3 0,86 0,74

Median. 19,5 7,6 1513 117 12,5 16 69,0 89 57,1 5,8 242,0 6,3 0,72 0,74

DE 2,7 0,1 160 53 1,0 3 10,7 23 58,8 9,5 109,5 1,5 0,74 0,67

Min 16,0 7,4 1364 69 11,5 14 55,2 53 21,3 3,1 124,0 4,6 0,20 0,27

Max 23,7 7,7 1777 213 14,0 21 79,8 107 196,0 28,5 421,0 9,0 1,90 1,21

4

Media 20,7 8,0 1221 120 10,0 28 68,7 57 27,1 3,7 210,2 1,9 1,04 6,00

Median. 21,3 8,0 1189 121 10,0 32 70,0 53 33,5 2,7 221,0 3,2 0,79 6,00

DE 3,3 0,3 127 30 1,8 5 8,8 15 39,6 4,2 58,0 1,5 0,69 6,00

Min 14,5 7,5 1073 89 8,0 22 55,5 36 4,1 1,7 116,2 0,1 0,27 6,00

Max 24,3 8,4 1452 160 13,0 34 77,3 71 113,5 13,0 276,5 4,5 1,97 6,00

5

Media 20,7 8,0 1490 111 10,7 27 68,4 120 71,7 5,3 290,1 4,3 0,86 2,04

Median. 20,2 8,0 1480 108 10,8 26 80,0 115 89,8 5,0 295,0 4,6 0,27 2,04

DE 2,0 0,2 133 47 0,6 4 20,7 62 72,1 6,7 133,0 0,7 1,09 2,24

Min 19,0 7,7 1356 74 10,0 24 40,4 53 23,9 2,0 124,7 3,5 0,20 0,46

Max 23,7 8,3 1680 180 11,5 35 84,8 195 203,5 19,5 521,5 5,0 2,12 3,63

Continúa en la página siguiente

90

Sitio T°C pH

CE

µS cm-1

ORP

HCO3-

meq L-1

NO3-

mg L-1

SO42-

mg L-1

Cl-

mg L-1

K+

mg L-1

Ca2+

mg L-1

Na+

mg L-1

Mg2+

mg L-1

Gli

µg L-1

AMPA

µg L-1

9

Media 19,6 7,6 1385 126 13,6 21 59,1 36 66,3 10,5 260,9 6,4 1,36 3,24

Median 18,4 7,6 1434 126 13,5 22 77,1 36 75,9 11,5 318,0 6,5 1,53 3,46

DE 3,3 0,1 224 20 0,5 14 23,7 0 108,0 14,9 102,4 1,8 0,86 2,40

Min 16,0 7,5 1008 102 13,0 10 35,9 36 7,9 3,8 111,1 3,9 0,42 0,74

Max 25,0 7,7 1647 155 14,5 50 83,0 36 323,5 46,5 422,5 10,0 2,12 5,52

10

Media 19,7 7,5 895 152 9,6 22 46,6 25 97,2 30,7 136,2 11,2 0,41 2,27

Median 19,7 7,5 1007 151 9,5 21 51,3 18 99,6 22,2 185,0 14,3 0,27 2,24

DE 2,1 0,1 219 25 0,7 2 18,7 10 69,6 58,4 86,6 7,2 0,34 1,69

Min 17,6 7,3 518 127 8,5 20 25,1 18 38,0 11,3 27,0 2,4 0,20 0,60

Max 23,7 7,7 1141 183 10,5 25 70,8 36 228,5 172,5 278,5 25,5 1,01 3,98

11

Media 20,7 8,0 1322 119 9,4 49 75,8 92 43,2 3,3 256,9 3,3 1,07 1,87

Median 19,7 8,0 1273 121 10,0 61 75,4 89 42,4 2,1 276,0 3,3 0,98 1,87

DE 4,7 0,3 122 28 1,2 22 3,4 23 83,2 6,0 124,0 1,1 0,95 2,26

Min 15,0 7,3 1169 88 8,0 13 72,1 71 5,5 1,6 112,3 2,2 0,20 0,27

Max 29,5 8,3 1472 164 1,0 75 79,6 124 252,5 18,0 431,0 5,5 2,12 3,47

13

Media 20,4 7,8 1315 114 10,7 32 76,2 36 29,1 3,0 216,9 3,2 0,84 1,73

Median. 20,0 8,0 1336 127 11,0 33 76,5 36 28,5 2,8 228,0 3,1 0,20 1,73

DE 2,8 0,3 131 37 1,0 5 2,5 22 63,7 2,3 90,2 0,5 1,34 0,00

Min 16,5 7,3 1120 55 9,5 24 72,0 0 2,2 1,4 115,8 2,5 0,12 1,73

Max 24,6 8,1 1462 170 12,0 38 78,6 71 192,5 7,4 378,5 4,0 2,86 1,73

ARS

6

Media 21,4 8,3 2286 123 13,1 12 64,0 298 68,9 14,7 368,1 9,2 1,02 0,80

Median. 21,1 8,3 2320 121 13,5 12 90,8 302 67,8 16,5 380,0 10,3 1,09 0,30

DE 4,4 0,2 214 25 1,5 4 55,5 85 73,4 10,8 159,5 2,2 0,55 1,06

Min 14,7 7,9 1942 98 11,0 8 8,9 213 31,0 4,9 148,0 6,1 0,40 0,07

Max 28,8 8,7 2570 153 15,0 19 143,2 391 245,0 39,0 601,0 12,1 1,75 2,02

Continúa en la página siguiente

91

Sitio T°C pH

CE

µS cm-1

ORP

HCO3-

meq L-1

NO3-

mg L-1

SO42-

mg L-1

Cl-

mg L-1

K+

mg L-1

Ca2+

mg L-1

Na+

mg L-1

Mg2+

mg L-1

Gli

µg L-1

AMPA

µg L-1

7

Media 18,7 8,4 4444 110 12,7 9 103,4 951 127,3 48,3 698,1 28,9 0,82 2,05

Median. 19,8 8,5 4560 132 13,0 8 72,3 1083 151,1 40,2 935,3 31,3 0,64 2,31

DE 5,6 0,2 778 31 0,9 8 126,9 547 79,3 44,9 379,2 8,8 0,71 0,52

Min 10,5 8,0 3363 77 11,5 5 67,3 0 42,8 26,8 163,0 15,1 0,27 1,45

Max 27,4 8,7 5620 140 13,5 25 324,4 1385 249,0 143,0 1177,5 39,2 1,75 2,40

8

Media 19,4 8,3 5004 113 12,7 6 128,3 941 119,2 54,8 750,7 39,0 0,86 3,98

Median. 19,5 8,4 5080 133 13,0 5 75,0 1189 111,1 45,1 927,0 40,1 0,57 4,22

DE 4,7 0,3 920 28 1,0 1 144,9 756 87,5 64,2 367,4 20,7 0,64 0,45

Min 11,3 7,9 3999 79 11,0 5 66,1 0 34,7 27,3 161,5 16,3 0,42 3,47

Max 25,4 8,7 6640 139 13,5 7 381,7 1846 283,5 206 1252,0 84,5 1,60 4,26

12

Media 20,4 8,2 2508 79 13,3 12 115,0 364 46,9 13,6 390,8 7,6 0,25 2,00

Median. 21,0 8,2 2498 117 13,6 11 118,9 355 52,0 13,3 387,5 12,0 0,20 1,53

DE 5,8 0,1 395 55 1,6 5 36,7 117 18,7 15,9 104,4 4,5 0,16 1,33

Min 12,8 8,0 1960 11 11,5 8 75,5 249 26,4 6,2 278,0 2,6 0,12 0,98

Max 28,5 8,3 2920 154 14,8 21 164,4 497 77,4 45,0 566,0 12,4 0,49 3,51

14

Media 19,8 8,4 1491 109 12,6 8 68,0 56 64,5 19,5 261,0 6,5 0,72 1,10

Median. 22,4 8,3 1544 107 12,8 8 69,3 71 63,5 17,2 288,5 6,1 0,72 1,00

DE 4,7 0,4 132 25 0,9 8 7,4 28 70,8 42,3 110,5 3,8 0,53 0,73

Min 10,9 7,9 1227 75 11,5 5 56,1 0 26,2 5,9 137,5 3,0 0,22 0,42

Max 23,9 9,1 1643 137 14,0 25 74,7 71 233,0 125,5 465,5 15,0 1,53 1,88

15

Media 21,3 8,4 5088 118 12,4 7 306,9 1377 125,1 55,1 757,6 33,3 0,50 5,46

Median. 20,9 8,4 5210 110 12,3 7 290,8 1278 117,0 51,1 1014,5 35,5 0,49 5,46

DE 4,5 0,3 988 19 1,2 3 42,2 270 112,2 45,1 452,9 15,1 0,13 5,74

Min 15,5 7,9 3999 101 11,3 5 271,5 1136 34,9 27,4 160,0 14,3 0,38 1,40

Max 29,2 8,7 6860 144 14,0 15 374,1 1811 361,0 148,5 1548,5 64,0 0,72 9,52

Continúa en la página siguiente

92

Sitio T°C pH

CE

µS cm-1

ORP

HCO3-

meq L-1

NO3-

mg L-1

SO42-

mg L-1

Cl-

mg L-1

K+

mg L-1

Ca2+

mg L-1

Na+

mg L-1

Mg2+

mg L-1

Gli

µg L-1

AMPA

µg L-1

20

Media 21,3 9,3 947 92 6,2 7 48,0 18 49,2 3,8 225,0 3,7 0,96 1,49

Median. 21,4 9,4 927 100 6,1 5 46,5 18 47,5 2,8 240,8 3,3 0,79 1,49

DE 5,1 0,4 116 25 1,1 10 4,4 16 73,3 14,1 119,6 2,7 0,47 1,12

Min 15,0 8,5 830 68 5,0 5 44,8 0 20,0 1,4 112,7 2,0 0,41 0,70

Max 30,5 9,7 1150 122 7,8 25 54,7 36 215,5 37,0 405,0 9,5 1,53 2,28

AUS

16

Media 21,3 8,4 4672 110 12,0 6 276,5 1235 129,2 52,9 824,6 30,7 0,50 3,93

Median. 21,3 8,5 4680 107 12,5 5 286,3 1243 104,9 44,0 1064,0 33,4 0,42 3,67

DE 4,6 0,3 573 19 2,3 1 47,0 147 117,7 46,4 421,0 8,4 0,44 2,89

Min 14,2 7,9 3999 92 8,5 5 209,7 1101 56,7 30,8 163,2 19,5 0,20 0,66

Max 28,7 8,8 5420 141 15,0 7 340,0 1456 406,5 157,0 1353,0 41,5 1,45 7,70

17

Media 21,3 8,4 4939 111 12,5 7 312,8 1338 129,7 50,9 821,0 32,1 1,59 11,35

Median. 21,4 8,4 5030 109 12,5 7 308,2 1243 110,0 49,7 1161,0 32,7 0,64 2,60

DE 5,0 0,3 867 20 0,6 2 47,2 243 108,8 41,0 421,1 8,8 2,33 18,38

Min 15,0 7,9 3999 94 12,0 5 266,6 1101 31,3 27,6 161,6 16,4 0,24 1,30

Max 30,5 8,8 6550 142 13,5 9 372,7 1740 321,5 146,0 1369,5 43,5 6,77 38,89

18

Media 20,4 8,4 4632 86 12,6 7 282,7 846 146,5 58,8 738,8 34,4 1,07 43,19

Median. 21,7 8,5 4705 109 12,4 7 286,1 1136 171,0 44,6 925,2 33,6 0,72 5,02

DE 6,3 0,3 666 37 0,6 1 35,5 672 101,3 54,4 367,8 14,1 0,80 79,59

Min 12,1 7,7 3999 31 12,3 6 239,5 0 39,5 33,1 162,7 19,8 0,27 0,34

Max 30,4 8,7 5370 124 13,5 9 325,9 1491 326,0 169,0 1221,5 62,0 2,21 162,40

19

Media 21,6 8,4 4566 108 12,9 7 299,2 1251 159,3 54,0 801,2 32,7 1,31 16,12

Median. 20,8 8,5 4460 109 12,9 6 296,6 1278 198,4 43,3 1002,2 33,9 0,19 0,11

DE 4,7 0,2 687 27 0,7 2 23,4 110 93,5 32,0 437,2 6,6 0,74 5,78

Min 15,7 8,0 3999 80 12,0 5 279,5 1101 52,2 33,7 163,5 24,4 0,57 1,10

Max 28,9 8,7 5400 145 13,8 9 326,6 1349 325,0 109,0 1445,5 41,0 0,53 8,97

Cuadro 4.2. Parámetros fisicoquímicos y concentraciones de glifosato y AMPA en las muestras de

agua. Para cada sitio se calcularon los parámetros estadísticos a partir de un n=7 (meses de muestreo).

Median.= mediana. TSD= total de sólidos disueltos; CE= conductividad eléctrica; ORP= potencial de

óxido reducción; Gli = glifosato; AMPA = ácido aminometil fosfónico; DE= Desviación estándar; Min=

mínimo valor; Max= máximo valor. ARSub = aguas rurales subterráneas; ARS = aguas rurales

superficiales; AUS = aguas urbanas superficiales. Se presentan los bicarbonatos que son los

predominantes en el balance iónico, aunque los carbonatos fueron también considerados.

93

La temperatura presentó un gran rango de amplitud, variando desde los 10 a 33

°C, de acuerdo con la fluctuación estacional. Para los valores de ORP, no se detectaron

diferencias particulares siendo todos positivos entre 11 y 200 mV. En la Fig. 4.5. se

muestran en gráficos boxplot los resultados del análisis ANAVA no paramétrico

(Kruskal-Wallis) de determinados parámetros fisicoquímicos para los tres grupos de

muestras de agua, discriminando por origen. Se graficaron aquellos parámetros en los

que se encontraron diferencias significativas relevantes. En cuanto a la CE (Fig. 4.5.A)

se observó una variación drástica entre los grupos, encontrando diferencias

significativas entre los tres (χ²; p < 0,05). Mientras que las ARSub presentaron un rango

desde 518 a 1,680 µS cm-1, lo que indica una condición moderadamente salina, en ARS

y AUS fue mayor, con valores desde 860 a 6640 µS cm-1 y desde 4000 a 6860 µS cm-1,

respectivamente. El valor obtenido para AUS indica una condición de alta salinidad

probablemente debido a los efluentes urbanos y domésticos que contribuyen al deterioro

del medio hídrico. La guía para la calidad del agua de riego de la Universidad de

California señaló que los valores de CE superiores a 1500 µS cm-1 estarían indicando un

riesgo moderado de salinización y consecuentemente se clasifica como no-permisible

para fines de riego (UCCC, 1974). Teniendo en cuenta este criterio, tanto las ARS como

las AUS están lejos de alcanzar un buen criterio de calidad para uso agrícola.

94

La concentración de Na+ reveló un perfil similar a la CE, presentando los valores

más bajos en las ARSub y los más altos en las AUS. La comparación entre los tres

grupos de agua reveló diferencias significativas (χ²; p < 0,05) (Cuadro 4.2. y Fig. 4.5.B).

Las concentraciones del ion Cl- fueron superiores en las AUS seguido por las ARS,

mientras que los valores más bajos se encontraron en las ARSub. Como se puede

observar en la Fig. 4.5.C., hubo diferencias altamente significativas entre el grupo de

ARSub y AUS (χ²; p < 0,05). Además, en todas las muestras de AUS, así como en los

sitios 7, 8 y 15 de ARS, los valores de Cl- superaron el límite establecido por la

normativa local para la protección de la vida acuática (625 mg L-1 Resolución 42/06).

Respecto a SO42-, las concentraciones más bajas fueron en las muestras de ARSub y

ARS, sin diferencias significativas entre los dos grupos (Cuadro 4.2. y Fig. 4.5.D). Sin

embargo, sí que las hubo al comparar cada uno de esos grupos con las AUS (χ²; p <

0,001). Varios informes han demostrado que los iones Cl- y SO42- permanecen en la

superficie en forma de sales debido a la evaporación de las aguas subterráneas,

Figura 4.5. Gráficos boxplots de las

diferencias entre grupos de agua para

5 parámetros fisicoquímicos, según

análisis ANAVA no paramétrico

(Kruskal-Wallis). (ARSub = aguas

rurales subterráneas, n=64; ARS =

aguas rurales superficiales, n=49 y

AUS = aguas urbanas superficiales,

n=28). Conductividad eléctrica (A),

concentración de sodio (B),

concentración de cloruro (C),

concentración de sulfato (D) y

concentración de nitrato (E). Letras

diferentes representan diferencias

significativas (χ² test t; p < 0,05).

95

posteriormente pueden ser levantadas por el viento, retornadas al suelo de nuevo y

finalmente ser lavados por la lluvia (Ferraris & Couretot, 2008). Por otro lado, los

efluentes urbanos podrían estar contribuyendo a esa alta concentración iónica que puede

estar alterando la calidad del agua. En cuanto a los cationes tales como Mg2+, Ca2+ y K+,

las AUS presentaron la mayor concentración. Este fenómeno puede atribuirse a una

preponderancia de la condición mineral del acuífero (Auge, 2006). En el caso del pH,

todas las aguas se caracterizaron por ser neutras o alcalinas, con un pequeño rango en

las ARSub (7,29 a 8,40) y uno mayor para ARS y AUS (de 7,74 a 8,83 y de 7,93 a 9,70

respectivamente) (Cuadro 4.2.). El valor más alto de pH se encontró en el sitio de

monitoreo 14 que se encuentra en un arroyo que atraviesa un antiguo basural (Cuadro

4.1.). Cabe mencionar que un pH alcalino, superior a 9, podría poner en peligro la vida

acuática (Res Nº 42/06 -. Autoridad del Agua de la provincia de Buenos Aires). Todas

las muestras de agua en el área de estudio mostraron un equilibrio iónico entre

carbonatos y bicarbonatos hacia estos últimos, en consonancia con los valores de pH

medidos y de acuerdo con la composición de los sedimentos del acuífero (Heredia et al.,

2014; INTA, 1972).

Como se mencionó anteriormente, las muestras de agua subterráneas pueden

dividirse en aquellas que son de pozo, con molino para el bombeo y extracción,

utilizados para riego (1 y 13) o para el consumo humano (2, 3 y 11), provenientes de un

sistema de riego con pivote (4 y 5) y las que son tomadas con un freatímetro dispuesto

para el monitoreo del nivel de la napa freática (sitios 9 y 10). El análisis reveló que en

los sitios 2 y 11, las concentraciones de NO3- no cumplieron con la normativa para agua

potable (<45 mg L-1) (Cuadro 4.2.). De hecho, el punto 11 presentó la más alta a lo

largo del año, con valores promedios de alrededor de 65 mg L-1, lo cual implican riesgos

para el agua de consumo humano. También en los sitios 1 y 9 se encontraron altas

96

concentraciones de NO3-, aunque estos se utilizan para fines de riego (sitio 1) o para

control del nivel de la napa (sitio 9) lo cual no representaría un riesgo para la salud

humana. En los puntos 1, 2 y 3 se produjo un aumento de la concentración de este

parámetro en septiembre, posiblemente debido a los fertilizantes utilizados en las

actividades agrícolas; sin embargo en el caso de las AUS y ARS fueron menores en

todas las muestras en comparación con las ARSub, con una variación muy pequeña

entre los meses. El análisis reveló diferencias significativas respecto a las

concentraciones de NO3- entre las aguas subterráneas y los dos grupos de aguas

superficiales (χ²; p < 0,001) (Fig. 4.5.E).

En cuanto a la concentración de metales (datos no mostrados) sólo se detectó la

presencia de Cd2+ en octubre y noviembre para todas las muestras con la excepción de

los sitios 11, 12, 19 y 20. El valor máximo fue 0,019 mg L-1 y el mínimo fue 0,0025 mg

L-1 (que superó el límite de regulación de 0,0002 mg L-1). No se encontró Cu2+ y Pb en

la mayoría de los sitios, excepto en el 11 (0,174 mg L-1) y 13 (0,26 mg L-1) en el mes de

agosto. Ambos valores excedieron el límite de la normativa de 0,002 mg L-1. Se

encontró Fe2+ solamente en el sitio de monitoreo 5 durante agosto, con un valor de 2,3

mg L-1, superando también el límite de regulación de 2 mg L-1. No hubo Mg2+ en

ninguna de las muestras de agua. En el caso de Mn2+ en todos los puntos la

concentración fue inferior al límite de la normativa, 0,5 mg L-1. La presencia de Zn2+

fue detectada en todos los sitios de ARSub, excediendo el límite (0,0075 mg L-1)

(Resolución 42/06). En el caso del 2 y el 3, usados como suministro de agua potable,

esto ocurre en los 7 meses monitoreados, alcanzando un valor máximo de 0,721 mg L-1.

Con respecto a aguas superficiales, la concentración de Zn2+ se excedió según la

reglamentación en todos los sitios al menos una vez, con la excepción del 14.

97

4.3.2. Caracterización hidrogeoquímica

El diagrama de Piper para las ARSub se presenta en la Fig. 4.6.A.; todos los sitios

se clasificaron como aguas sodio-potasio bicarbonatadas, lo cual está en concordancia

con estudios anteriores de aguas superficiales y subterráneas en la zona Pergamino-

Arrecifes (Auge, 2006; Losinno et al., 2002, 2005). Cabe destacar que el sitio 10 difirió

del resto del grupo de las ARSub, con más predominancia de Ca2+ y menos

concentración de Na+ y K+, coincidente con los bajos valores de CE encontrados en este

punto (Cuadro 4.2.). En el caso de las ARS (Fig. 4.6.B) los aniones se distribuyeron

regularmente por toda la parte inferior del triángulo, mientras que los cationes

estuvieron concentrados en la parte inferior derecha. Como resultado, este grupo de

muestras de agua presentó una distribución más heterogénea desde una categoría sodio-

potasio bicarbonatada (sitios 14 y 20) hacia cloruro sódica (sitios 7, 8 y 15). Esta

particular disposición coincide con una direccionalidad norte sur a lo largo del río

Botija: las muestras aguas arriba (6 y 12), tuvieron un patrón mixto que se hizo más

clorado río abajo hacia los sitios 7, 8 y 15. Esta observación podría indicar una posible

contaminación debido al intenso uso agrícola en las zonas rurales. Esta polución va

aumentando cuanto más cerca de la ciudad, lo cual coincide con la información revelada

en el análisis de parámetros fisicoquímicos. En la Fig. 4.6.C, donde se representa el

diagrama de Piper para las AUS, se muestra una distribución homogénea de estas aguas

en la categoría hidrogeoquímica de sodio cloradas. Los sitios de las ARSub y ARS son

químicamente similares, lo que podría estar indicando una posible infiltración de las

aguas superficiales en la napa freática.

98

Figura 4.6. Diagrama de Piper para los diferentes puntos de monitoreo. (A) ARSub= aguas rurales

subterráneas; (B) ARS = aguas rurales superficiales; (C) AUS = aguas urbanas superficiales.

99

4.3.3. Cálculo del ICA

En la fig. 4.7. se muestran los valores del ICA anual calculado para las muestras

de agua. De acuerdo con el CCME, todos pertenecen a la categoría buena, media o mala

calidad de agua.

Figura 4.7. Valores del ICA de los sitios de monitoreo de la cuenca del río Pergamino.

ARSub = aguas rurales subterráneas; ARS = aguas rurales superficiales; AUS = aguas

urbanas superficiales; n=7.

La mayoría de las ARSub mostraron una categoría mala, con valores que

oscilaron entre 49,7 y 60,5, excepto para el sitio 10 (65,6) que fue media. La

profundidad de las perforaciones en estos puntos varió de 37 a 86 m (Cuadro 4.1.)

aunque no se encontró una correlación con los valores del ICA. Estos bajos datos del

ICA se podrían explicar por los metales pesados encontrados en estas muestras de agua.

En particular, Cd2+, Zn2+ y Cu2+ han sido reportados como principales contaminantes en

las aguas subterráneas (Auge, 2003, 2004; Galindo et al., 2002). Esta contaminación de

metales pesados podría ser debida a restos de aplicaciones pasadas de agroquímicos, así

como por la composición natural del suelo. Los valores del ICA revelaron una situación

comprometida de la calidad del agua del acuífero en la zona de Pergamino,

100

especialmente en el caso de los sitios 2, 3 y 11 que fueron perforaciones usadas para

suministro de agua potable. En cuanto a las ARS, sólo los puntos 12 y 20, utilizados

para fines recreativos, tuvieron valores correspondientes a la categoría de bueno, con

81,1 y 84,3, respectivamente. El resto de las ARS presentaron una condición mala con

valores que fueron desde 53,9 hasta 62,6. Estos bajos datos del ICA podrían deberse a

una combinación de los múltiples factores que estarían superando los límites de

regulación, tales como Fe2+, EC, metales pesados, NO32-, iones (Cuadro 4.2. y apéndice

4). Los más bajos se obtuvieron para las AUS 16, 17, 18 y 19 (60,4; 59,9; 63,2 y 62

respectivamente), todos ellos pertenecientes a la categoría mala. Estos resultados van en

concordancia con el análisis de parámetros fisicoquímicos, donde se observaron valores

altos en CE, Cl-, Cr, Cd2+ y Fe+ en casi todos los sitios de AUS. Aunque la mayoría de

los valores del ICA de aguas superficiales cayeron en una categoría de calidad mala, los

perfiles de parámetros fisicoquímicos son diferentes de acuerdo a que la contaminación

generada sea por las actividades rurales o urbanas.

El análisis del ICA reveló una calidad en las aguas bastante pobre, aunque es

posible que otros compuestos o la mezcla de ellos, que no son medidos, participen

también del deterioro ambiental. Por esta razón se deberían incorporar otros

instrumentos analíticos e integrados para completar la evaluación de la calidad del

recurso hídrico.

4.3.4. Determinación de glifosato y AMPA

La presencia de estos dos compuestos ha sido detectada en los cuerpos de agua y

en los suelos de todo el mundo, a pesar del hecho de que el glifosato tiene una vida

media relativamente corta (Arunakumara et al., 2013; Coupé et al., 2012; Liu et al.,

101

1991; Lupi et al., 2015; Mamy et al., 2010). Ya que el cultivo predominante en la zona

de estudio es la soja, se analizó la presencia de este herbicida y su metabolito, con el fin

de evaluar una posible contaminación por agroquímicos. En todos los sitios de

monitoreo, ambos productos fueron detectados en al menos uno de los meses

monitoreados, indicando una descarga continua de estos compuestos en la cuenca,

relacionado con la intensa actividad agrícola (Cuadro 4.2.)

En la fig. 4.8. se presenta el análisis del porcentaje de muestras con presencia de

glifosato o AMPA solos y de ambos juntos, en cada grupo. Para el caso del herbicida se

dieron proporciones similares tanto en ARS (38,9%) como en AUS (34,4%), con los

valores mayores en ARSub (45,2%). Esto podría estar indicando un uso persistente de

glifosato en la zona tal que supere la capacidad de metabolización del mismo en el

ambiente y ocurra la percolación del producto. Las muestras positivas para AMPA solo

variaron entre los grupos, encontrándose los valores más altos también en ARSub

(20,5%); en ARS y AUS fueron de 14,8% y 6,3%, respectivamente. Esto podría

explicarse por una alta capacidad de atenuación natural ejercida por la comunidad

microbiana en la matriz subterránea que estaría degradando glifosato a AMPA, tal como

se ha reportado en varios informes en otras partes del mundo (Arunakumara et al., 2013)

así como en la región pampeana (Vera et al., 2010).

102

Figura 4.8. Porcentajes de muestras con presencia de glifosato, AMPA o ambos,

para los tres grupos de muestras de agua (ARSub = aguas rurales subterráneas,

n=64; ARS = aguas rurales superficiales, n=49 y AUS = aguas urbanas

superficiales, n=28).

Las ARSub presentaron los porcentajes más bajos de coexistencia de ambos

compuestos (5,5%), lo cual corresponde a un proceso de transformación eficiente del

herbicida a su metabolito. Sin embargo en el caso de ARS y AUS estos porcentajes

fueron hasta 4 y 8 veces mayor (20,4% y 40,6%, respectivamente). Esto nos puede

sugerir que haya mecanismos de inhibición del proceso de biodegradación a causa de

otros compuestos tóxicos presentes en los cuerpos de agua. También podría ser debido o

a un proceso de concentración de AMPA (ya que tiene una vida media más larga) o a

una mayor presencia de glifosato procedente de zonas rurales cercanas (no

monitoreadas en este trabajo) o a una combinación de ambas circunstancias. De hecho,

las precipitaciones ejercen un papel importante en la movilización de plaguicidas por un

proceso de escorrentía tras la aplicación (Shipitalo & Owens, 2006). Coupé et al. (2012)

observaron resultados similares, encontrando niveles altos del herbicida en agua de

arroyos de zonas sojeras de Estados Unidos, en diferentes momentos de muestreo (antes

y un mes después de la aplicación).

103

Con respecto a la concentración, se hicieron comparaciones entre grupos de agua

y estacionales. Se encontraron valores más altos de glifosato en las muestras de

superficie, ARS y AUS, comparadas con las ARSub (p = 0,013). Este resultado coincide

con informes anteriores de la zona Quequen de la región pampeana que describen que, a

pesar de lo relativamente corta que es la vida media del glifosato, este fue detectado en

los suelos muestreados pre o post eventos de aplicación (Aparicio et al., 2013; Lupi et

al., 2015). También en la zona de Arrecifes-Pergamino, otros autores reportaron niveles

de glifosato en aguas superficiales aunque en valores mucho más altos que los aquí

medidos, variando desde 0,10 hasta 0,70 mg L-1, destacando que tras las aplicaciones,

los eventos de lluvia aceleraban el transporte del herbicida hasta las aguas de arroyos

circundantes (Peruzzo et al., 2008). Por otra parte, la comparación entre los valores de la

mediana para los meses de primavera-verano (juntos) y de invierno resultó ser

significativa (p = 0,004), encontrándose los más altos en el primer grupo con un rango

de 0,18 a 6,8 µg L-1 (datos no mostrados). La mayor concentración de glifosato se midió

en el sitio 12 (29,8 µg L-1) en febrero de 2015. Este valor excepcional podría quizá

atribuirse a una descarga puntual del producto debido a un accidente o a malas prácticas

agrícolas. Cabe recordar que las directrices de Calidad del Agua para la vida acuática

del CCME establecen el límite máximo permisible para exposiciones a glifosato a corto

y largo plazo en 2,7 y 0,8 mg L-1, respectivamente (CCME, 2001; apéndice 4). Los

resultados indicaron que las aguas superficiales de Pergamino no sobrepasaron ninguno

de los dos niveles. Sin embargo, el hecho que se encontrara glifosato, podría implicar un

riesgo para las especies acuáticas. En este sentido múltiples investigaciones han

señalado la presencia de adyuvantes altamente tóxicos que contribuyen al daño causado

a los organismos incluso a concentraciones muy bajas (Myers et al., 2016). Respecto al

agua para consumo humano, de acuerdo con las directrices de la ley argentina sobre

104

residuos peligrosos (Ley 24051/92 para agua de bebida) para el Agua Potable que

establece un límite de 0,28 mg L-1 para la presencia de glifosato, ninguna de las

muestras excedió este valor (ver cuadro 4.3.).

Sitios Jul-2014 Ago-2014 Sept-2014 Oct-2014 Nov-2014 Dic-2014 Feb-2015

2 nd 0,177 nd nd 0,641 3,523 0,125

3 0,199 1,306 nd 0,199 0,715 1,897 nd

11 0,200 1,617 nd nd 0,346 2,119 nd

Cuadro 4.3. Niveles de glifosato en los sitios destinados a aguas para consumo (µg L-1).

nd = no detectado. Se muestran las mediciones puntuales para cada sitio de muestreo entre los

meses de julio de 2014 y febrero de 2015.

En cuanto a AMPA, la prueba de la mediana de Mann-Whitney no mostró

diferencias significativas entre los 3 grupos de muestras de agua (p = 0,078). En la

comparación estacional (datos no mostrados), se encontró la mayor presencia en

invierno (p < 0,01). Contrariamente al glifosato, para AMPA no hay una regulación que

establezca los límites permisibles, a pesar de ser muy útil para identificar sitios

potencialmente contaminados. Analizando los resultados de manera conjunta, se

encontró mayor porcentaje de muestras con glifosato o con AMPA solos en ARSub;

esto podría indicar que estén ocurriendo más eventos de aplicación que los que el

ambiente puede degradar, lo cual hace que haya una mayor percolación hasta el

acuífero. En el caso del metabolito, cabe aclarar que su presencia en aguas no es

necesariamente una medida de la degradación del herbicida, ya que también puede venir

de procesos como el escurrimiento o la erosión por el viento desde campos de cultivo

adyacentes, visto que como ya se ha dicho es más persistente en suelos que el glifosato

(Bento et al., 2017; Busse et al., 2001; Mamy et al., 2010; Ratcliff et al., 2006).

Respecto a las concentraciones, el hecho de encontrar mayores niveles tanto de glifosato

105

como de AMPA en AUS, nos estaría confirmando que los compuestos químicos debe

medirse y analizarse no sólo en los recursos hídricos de los campos de cultivo, sino

también en las áreas urbanas cercanas a ellos. Especialmente porque la contaminación

urbana podría inhibir de manera significativa la biodegradación y, en consecuencia,

aumentar la contaminación del agua. El hecho de que se encuentre más glifosato en

primavera-verano pero más concentración de su metabolito en invierno podría ser

explicado por la alta persistencia del AMPA, que hace que pueda ser medido aún lejos

en el tiempo de los eventos de aplicación (época estival). Si bien los niveles del

herbicida no excedieron los marcados por la normativa vigente, podrían existir además

otros compuestos o la mezcla de ellos que estén causando efectos tóxicos en la cuenca.

4.3.5. Bioensayo con C. elegans para la determinación de la calidad de aguas

Se estudió la aplicabilidad del protocolo del bioensayo con C. elegans para la

determinación de la toxicidad de las aguas de la cuenca de Pergamino, incluyendo de

esta manera otra herramienta para complementar la evaluación de su calidad.

106

Figura 4.9. Crecimiento (A), reproducciòn (B) y fertilidad (C) de C. elegans tras la

exposición. Los nematodos se expusieron a las muestras de agua y se determinaron las

respuestas luego de 96 h de incubación a 20 ºC. Los valores corresponden a la media ±

desviación estándar de 4 experimentos independientes de 10 L1 cada uno; n=40.

*diferencias significativas según ANAVA (p<0.05); *p < 0,0001.

107

En la Fig. 4.9. se presentan los resultados del bioensayo piloto con C. elegans, que

se hizo para el mes de septiembre de 2013 (campaña de muestreo no incluida en el

análisis presentado a continuación desde julio de 2014 y febrero de 2015). Según los

resultados del test de Dunnett, tanto el valor de crecimiento, como reproducción y

fertilidad dieron diferencias significativas en los sitios 2, 7 a 9 y 15 a 19 (p < 0,0001).

La reproducción también se vio afectada en los sitios 1, 2, 3, 5, 10 y 13 (p < 0,0001). Un

contexto similar se observó en las muestras 15 a 19, donde la inhibición de los tres

parámetros fue cercana al 100%. En el sitio 2, hubo valores intermedios de crecimiento

y fertilidad, mientras que en el sitio 20 los valores fueron mayores al control.

Seguramente en este punto haya habido algún elemento o combinación de ellos que

favoreciesen la multiplicación del nematodo.

Estos primeros resultados obtenidos revelaron variaciones entre las distintas

muestras de agua, lo que dio una primera idea de la validez del uso del nematodo C.

elegans como modelo toxicológico para determinar el impacto ambiental. En ese

sentido, este experimento sirvió para definir que la exposición crónica afecta

significativamente a los parámetros seleccionados, indicando que en los cuerpos de agua

seleccionados exista algún tipo de tóxico que esté influyendo en el normal desarrollo del

animal. En estos ensayos se obtuvo una respuesta similar con los tres parámetros

(cuando se ve inhibido el crecimiento también se ven inhibidos los otros dos), así que se

eligió el crecimiento relativo para el análisis completo de toda la campaña y

determinación del estado de calidad de las aguas de la cuenca. Es importante destacar

que es el crecimiento relativo uno de los parámetros usados en la normativa

internacional ISO 10872:2010 (Höss et al., 2009; ISO, 2010) para evaluación en

estudios toxicológicos.

108

Así pues, se realizó el bioensayo de crecimiento relativo con C. elegans para las

20 muestras de agua. En el cuadro 4.4. se presentan la media, la mediana, el mínimo y el

máximo del conjunto de datos para los 7 meses de muestreo. Se llevó a cabo un análisis

estadístico con el objeto de encontrar los parámetros que podrían ser responsables de la

disminución en el crecimiento, estableciendo una posible correlación entre los

resultados del análisis fisicoquímico y los del bioensayo. Los coeficientes de Spearman

y Pearson revelaron una correlación positiva entre el crecimiento relativo del nematodo

y la concentración de CO32- (coeficiente de Spearman 0,249; p < 0,05), de Ca2+

(coeficiente de Pearson 0,204; p < 0,05), de Mn2+ (coeficiente de Spearman 0,253; p <

0,05) y de Fe2+ (coeficiente de Spearman 0,44; p < 0,05). Esto podría indicar que dichos

parámetros estarían favoreciendo el crecimiento de los nematodos. Por el contrario, en

el caso del Cd2+ se encontró una correlación negativa (coeficiente de Spearman -0,215;

p < 0,05). Se detectaron concentraciones de Cd2+ por encima del límite de regulación

para la protección de la vida acuática (0,0002 mg L-1). Además, algunas de las

concentraciones encontradas para este metal estuvieron por encima del valor LOEC para

el crecimiento de C. elegans (0,14 mg mL-1; Traunspurger et al., 1997). La disminución

del crecimiento relativo podría haber sido afectada, en parte, por la presencia de este

elemento; de hecho ha sido reportado que es un compuesto muy tóxico para los

organismos (Barjhoux et al., 2012; Lavado et al., 2001, 2004; Moore & Ramamoorthy,

2012). En concreto para C. elegans, varios informes muestran que el Cd2+ disminuye el

crecimiento, la longitud del ciclo, la reproducción y el comportamiento (Boyd et al.,

2010; Chen et al. 2013; Dietrich et al., 2016; Höss et al. 2011; Hsu et al. 2012; Popham

& Webster, 1979).

109

Con glifosato y AMPA se encontró una correlación negativa aunque las

diferencias no fueron significativas (coeficiente de Pearson -0,074; p = 0,4360 y -0,146;

p = 0,1245, respectivamente).

110

ARSub ARS AUS

1 2 3 4 5 9 10 11 13 6 7 8 12 14 15 20 16 17 18 19

C.

eleg

ans

crec

imie

nto

rel

ativ

o Media 0,98 0,95 0,86 0,60 0,82 0,49 0,95 0,86 0,84 0,65 0,27 0,59 1,07 1,05 0,52 0,99 0,57 0,79 0,44 0,71

Mediana 1,03 0,93 1,02 1,04 0,81 0,71 0,93 0,90 0,90 0,99 0,84 1,00 1,13 1,09 0,64 1,09 0,88 1,11 0,74 1,05

DE 0,20 0,11 0,27 0,43 0,36 0,33 0,14 0,26 0,26 0,44 0,55 0,46 0,24 0,18 0,50 0,33 0,48 0,44 0,61 0,52

Min. 0,68 0,83 0,30 0,02 0,35 0,13 0,75 0,53 0,45 0,04 0,00 0,03 0,83 0,76 0,04 0,47 0,03 0,16 0,05 0,10

Max. 1,23 1,11 1,11 1,32 1,32 1,02 1,20 1,33 1,22 1,37 1,30 1,38 1,36 1,31 1,37 1,36 1,44 1,43 1,48 1,53

Cuadro 4.4. Crecimiento relativo de C. elegans en muestras de agua de los diferentes sitios de la cuenca del río Pergamino. ARSub = aguas rurales

subterráneas; ARS = aguas rurales superficiales; AUS = aguas urbanas superficiales. Para cada sitio, los parámetros estadísticos se calcularon a partir de un

n = 7 (meses de muestreo).

111

En la fig. 4.10. se muestran los valores medios de crecimiento relativo, discriminando

por tipo de agua y por estación climática (Fig. 4.10. A y B, respectivamente).

Figura 4.10. Valores medios de crecimiento relativo, representados en boxplots, para los

grupos de muestras de agua (A) y por estaciones (B). Análisis ANAVA no paramétrico

(Kruskal-Wallis). ARSub = aguas rurales subterráneas; ARS = aguas rurales superficiales;

AUS = aguas urbanas superficiales. Para A el n=64 para ARSub; n=49 para ARS y n=28 para

AUS. Para B el n= 40 en invierno y verano; n= 60 para primavera. Letras diferentes

representan diferencias significativas (χ²; p < 0,05).

La prueba de Kruskal-Wallis no mostró diferencias significativas (p = 0,44) entre

los grupos de muestras (ARSub, ARS y AUS). Sin embargo, cuando se comparó entre

las estaciones del año, el crecimiento relativo aumentó significativamente en verano, en

comparación con primavera y también al comparar con invierno (p = 0,03255). Esto

podría ser debido a que en esta época de más lluvias haya mayor arrastre de elementos

que, como ya se ha dicho, pudieran favorecer o acelerar el crecimiento del nematodo,

tales como Ca2+, Mn2+ y Fe2+ u otros macro o micronutrientes que no hayan sido

medidos y que puedan estar ejerciendo un efecto estimulador del crecimiento. Se sabe

que son esenciales para el mantenimiento de la homeostasis celular. De hecho, en C.

elegans se ha demostrado que concentraciones altas de Mn2+ intracelular proporcionan

protección contra el daño oxidativo favoreciendo la respuesta al estrés, además de

prolongar el ciclo celular (Lin et al., 2006). En cuanto al Fe2+ y Ca2+, varios informes

112

hablan de su implicancia en procesos biológicos esenciales para la vida, como la vía de

la insulina, transporte de oxígeno, neurodesarrollo, así como su papel como cofactores

de las enzimas involucradas en la síntesis de DNA y la producción de energía

(Anderson & Leibold, 2014; Gourley et al., 2003; Tanimoto et al, 2017).

4.3.6. Categorización de efectos tóxicos

Los datos mostraron que todos los sitios de monitoreo pertenecen como mínimo a

una de las tres categorías con efecto tóxico (ligeramente tóxico, moderadamente tóxico

y muy tóxico) (Fig. 4.11.).

Figura. 4.11. Categorización de efectos tóxicos sobre el crecimiento relativo de C. elegans

en las diferentes muestras de agua. Se presentan los porcentajes relativos de las diferentes

categorías tóxicas para cada punto de muestreo de la cuenca de Pergamino. ARSub = aguas

rurales subterráneas; ARS = aguas rurales superficiales; AUS = aguas urbanas superficiales.

n=7 (meses de muestreo).

En la mayoría de las muestras se reveló una categoría de muy tóxico (porcentajes

de 14,3 a 50) con la excepción de los sitios 1, 2, 10, 11, 12 y 14. Todos los puntos

pertenecientes a AUS tuvieron porcentajes elevados para la categoría de muy tóxico, en

113

particular el 18 tuvo un 50%, que fue el más alto de la categorización. En cuanto a

efecto no tóxico, los valores oscilaron desde 14,3 hasta 83,3%. Particularmente en 1

(83,3%), 10 (83,3%), 14 (80%) y 20 (83,3%) se dieron los más altos. De hecho, el

porcentaje de la categoría de no tóxico en las muestras de agua a lo largo de los ríos

Botija y Pergamino fue de alrededor del 50%. Las ARSub presentaron diferentes

escenarios con respecto al bioensayo de toxicidad de C. elegans, con múltiples

combinaciones de las cuatro categorías. Precisamente este grupo incluyó la condición

menos contaminada que fue para el sitio 1 (16,7% ligeramente tóxico y 83,3% no

tóxico) y también la más contaminada, en el sitio 9 (42,9% muy tóxico, 28,6%

moderadamente tóxico, 14,3% ligeramente tóxico y 14,3% no tóxico). Esta variabilidad

en las ARSub podría ser debida a diversos factores que influyen en la complejidad del

sistema del acuífero.

Respecto a las ARS, los dos sitios en los que se encontraron los mayores

porcentajes de efecto no tóxico fueron el 14 con un 80% y el 20 con un 83,3%; en ellos

se dieron también los valores de crecimiento relativo más altos, seguramente

relacionado con un mejor estado del agua. Por otro lado, comparando estos resultados

con los del ICA, no hubo una correlación significativa (p= 0,735; p < 0,05). Esto pone

de manifiesto que no sólo los compuestos desconocidos en las muestras sino también la

compleja interacción dentro de ellas podrían ser responsables de los efectos tóxicos

(Aguirre et al., 2009; Thuong et al., 2013). Y en este sentido, este análisis confirmó que

C. elegans es útil para identificar potenciales amenazas para la vida acuática y para la

salud humana en la cuenca de Pergamino.

114

4.4. Conclusiones

La cuenca del río Pergamino fue seleccionada por ser un área representativa para

estudiar tanto el efecto de la intensificación en la producción de soja como el aumento

de las actividades urbanas que afectan a las fuentes de aguas superficiales y

subterráneas. Este trabajo refuerza el concepto de que existe un impacto antrópico, así

como de la agricultura y del desarrollo urbano, sobre la calidad del agua y esto debe ser

evaluado desde un punto de vista holístico. Los análisis llevados a cabo en este capítulo

y la interrelación entre ellos es un acercamiento a esa idea.

La caracterización hidrogeoquímica de las aguas mostró que la composición de las

mismas es predominantemente sodio-potasio bicarbonatadas. En particular, el grupo de

ARS mostró una distribución más heterogénea que va desde altamente sodio-potasio

bicarbonatadas hacia sodio cloradas. Los parámetros fisicoquímicos tales como: pH,

TºC, CE, NO3-, SO4

2-, Na+, Cl-, Fe2+, Cd2+ y Zn2+ mostraron diferencias significativas

entre los tres grupos de agua y a lo largo del año. Estos resultados demuestran que las

condiciones de la cuenca del río Pergamino son extremadamente dinámicas. Por otra

parte, es importante mencionar que algunos parámetros exceden los límites regulatorios

para diversos usos del agua (riego, protección de la vida acuática, agua potable). Por

este motivo y con el objetivo de obtener una visión integrada de la calidad hídrica de la

cuenca, se utilizaron los parámetros fisicoquímicos para la construcción de un ICA, que

reveló que en la mayoría de los sitios de monitoreo la categoría es mala, lo que indica

que toda la zona presenta una situación ambiental frágil y comprometida. Este deterioro

podría estar asociado con diferentes fuentes de contaminación, como la percolación y

escorrentía de agroquímicos hacia las aguas subterráneas (con una posible

115

contaminación de la napa freática) en las zonas rurales y los vertidos urbanos en el área

urbana.

Además de esto, la contaminación por glifosato y AMPA se detectó a lo largo del

año predominantemente en las aguas superficiales en comparación con las subterráneas,

con valores más altos en la estación cálida coincidente con la campaña de cosecha de

soja. La presencia simultánea de ambos compuestos podría indicar un proceso de alta

degradación o incluso una aplicación frecuente y continua de glifosato en el ambiente.

Además de sentar un precedente de conocimiento relativo a la contaminación ambiental

por el uso del plaguicida aplicado en el país, posibilitará el diseño y elección de aquellos

manejos que minimicen los riesgos ambientales.

Particularmente los sitios de monitoreo que son utilizados para agua de bebida

constituyen una mayor preocupación. En estos sitios, la concentración de NO3- superó el

límite de regulación para agua potable, lo cual representa una importante amenaza para

la salud humana.

Del análisis estadístico realizado para establecer una correlación entre el análisis

fisicoquímico y la disminución en el crecimiento de C. elegans se encontró una

correlación negativa entre el Cd2+ y los resultados del bioensayo. De hecho, se

detectaron concentraciones de Cd2+ por encima del límite de regulación para la

protección de la vida acuática (2 µg L-1). No se encontró una correlación significativa,

entre los resultados del bioensayo y los niveles de glifosato y AMPA. La categorización

de la magnitud de efectos tóxicos sobre el crecimiento de C. elegans ha demostrado ser

una herramienta útil para interpretar las diferentes intensidades en la respuesta

biológica. Se detectaron efectos toxicológicos en los tres grupos de agua y, a pesar de

que los sitios de monitoreo muestran una gran variación a lo largo del año en la

respuesta del crecimiento relativo del nematodo, todos ellos pertenecen a una de las tres

116

categorías (ligeramente tóxico, moderadamente tóxico o muy tóxico) al menos una vez

durante el período de monitoreo. Esta respuesta dada por C. elegans fue particularmente

útil para detectar la toxicidad incluso cuando los parámetros del agua cumplen los

requisitos reglamentarios de la normativa vigente y la calidad parece ser la adecuada.

117

CAPÍTULO 5.

Caenorhabditis elegans COMO

HERRAMIENTA INTEGRADA

PARA LA EVALUACIÓN DE LA

CALIDAD Y TOXICIDAD EN

UNA CUENCA DE RÍO DE LA

PROVINCIA DE MENDOZA

118

Capítulo 5. Caenorhabditis elegans como herramienta integrada para la

evaluación de la calidad y toxicidad en una cuenca de río de la provincia de

Mendoza

5.1. Introducción

Para hacer frente a la creciente demanda de agua para el desarrollo de la

agricultura y la industria, así como también de las comunidades y centros urbanos, es

necesario desarrollar políticas de gestión de recursos hídricos que sean sostenibles a

largo plazo y que aseguren una distribución equitativa del agua a todos los sectores

involucrados. Hoy en día existe el consenso en todo el mundo que la planificación y la

gestión de los recursos hídricos tienen que ser un concepto integrado que incluye no

sólo la cantidad y calidad del agua, sino también la distribución de la misma, el uso y

los servicios ecológicos (Oliveira et al., 2007). Por esta razón, en las últimas décadas se

ha optado por llevar a cabo evaluaciones integradas de la calidad del agua que

incorporen no solo un monitoreo clásico de los cursos de agua (como herramienta

poderosa para proporcionar información confiable) sino también determinaciones

ecológicas y toxicológicas. Esta evaluación integral del estado del recurso hídrico y de

los riesgos asociados a su contaminación, es fundamental para prevenir los daños en el

ambiente, proteger la biodiversidad, la salud de la población y el desarrollo

socioeconómico. Sin embargo, a veces los medios logísticos, técnicos y económicos son

limitados e imposibilitan llevar a cabo las determinaciones de contaminantes a gran

escala o numerosos ensayos ecotoxicológicos.

Las actividades humanas no sólo utilizan los recursos de agua reduciendo el

caudal disponible, sino que también descargan sustancias químicas y bacteriológicas. En

119

consecuencia, las actividades antropógenas son una de las amenazas más importantes

para la conservación de los recursos hídricos. Los ríos en particular son sistemas

dinámicos que muestran una gran variabilidad en la calidad del agua, tanto temporal

como espacial. Aunque gran parte de la misma se debe a las características intrínsecas

del sistema, podría ser también causada por eventos de contaminación antrópica

(Mophin-Kani & Murugesan, 2014). La cuenca del río Tunuyán (Provincia de Mendoza,

Argentina) ha sido seleccionada como un sistema tradicional de monitoreo de agua

representativo y susceptible para probar la aplicabilidad del bioensayo toxicológico con

C. elegans, con la idea de hacer una evaluación integrada de la calidad del agua. A pesar

de los esfuerzos realizados en la provincia de Mendoza para evaluar la situación hídrica

actual, aún falta integrar la calidad toxicológica de los cursos de agua en aras de obtener

una medida de riesgo para el ambiente y la salud de la población (Lemos, 2008).

5.1.1. Selección de la zona de estudio

La provincia de Mendoza fue seleccionada debido a su alta vulnerabilidad: se

encuentra en una de las regiones más secas en la parte occidental de la Argentina que

tiene una de las mayores zonas de riego del país. La elección de esta zona radica en que

constituye un caso emblemático en el uso eficiente de los recursos hídricos, pues el agua

es escasa y su distribución y uso afecta el desarrollo socio-económico (Chambouleyron

et al., 2002). La superficie de la provincia de Mendoza es de 148 827 km2 y posee la

mayor área irrigada del país, representando el 25% del total nacional. El suministro de

agua proviene de los cinco ríos que dan origen a cuatro unidades o cuencas

hidrogeológicas: la de los ríos Mendoza y Tunuyán Inferior (Cuenca Norte), río

120

Tunuyán Superior (Cuenca Centro o Valle de Uco), ríos Diamante y Atuel (Cuenca Sur)

y Malargüe (Hernández & Martinis, 2013).

Los ríos de estas cuencas dan origen a los llamados oasis productivos que son

zonas de aporte de agua suficiente que permiten un desarrollo de áreas cultivadas bajo

riego. Constituyen el elemento básico de organización del espacio provincial y de

desarrollo socio económico, ocupando alrededor del 4% del territorio. Los más

importantes son el oasis norte (conformado por los ríos Mendoza y Tunuyán inferior)

que alberga al Gran Mendoza con más de 1 millón de habitantes, y oasis centro (Río

Tunuyán superior) que corresponde a la región conocida como Valle de Uco. En este

sector se genera aproximadamente el 90% del agua que llega a las zonas urbanas e

irrigadas (Miner Vega, 2011; Pitte et al., 2009). Los cursos de agua tienen un régimen

nival, es decir que presentan mayores caudales en verano producto del aumento de las

temperaturas y el consecuente derretimiento de los mantos níveos y de los glaciares. Los

menores caudales se presentan en invierno, coincidente con bajos (casi nulos)

requerimientos de agua por parte de los cultivos, situación aprovechada para el corte de

agua en los canales y para su mantenimiento. El caudal promedio del río Tunuyán es de

30,6 m3 s-1. Las precipitaciones en forma de lluvia que se producen en las partes altas de

las cuencas tienen poca influencia sobre los caudales. El río Tunuyán se encuentra

dividido en dos subcuencas, la superior (ubicada en el Valle de Uco), con una superficie

de 54000 ha y la inferior 81000 ha con derechos de riego, respectivamente.

Los sitios de monitoreo en la cuenca del río Tunuyán fueron seleccionados en

trabajos previos y abarcan las dos subcuencas (Morábito et al., 2011, 2012a; Salatino et

al., 2014). Fueron escogidos teniendo en cuenta su proximidad a las áreas de desarrollo

productivo y urbanas, donde la calidad del agua se ve amenazada tanto por actividades

agrícolas como por efluentes urbanos e industriales (Morábito et al., 2011; Salatino et

121

al., 2014). En los tramos inferiores del río Tunuyán, de donde se obtiene agua para

regadío, se ha visto una tendencia progresiva de aumento de la salinización del agua,

además de un importante incremento de la contaminación acuática que compromete la

productividad del suelo y los rendimientos de la actividad agrícola con importantes

pérdidas económicas (Neamtu et al., 2009). La zona alta del río Tunuyán superior ha

experimentado en los últimos años un desarrollo masivo de la agricultura producto de la

radicación de importantes empresas locales y extranjeras. Por tanto, el deterioro de la

calidad del agua visto en los tramos inferiores, se origina río arriba coincidiendo con los

oasis de mayor actividad industrial, producción agrícola y desarrollo urbano

mencionados (Laviè, 2009; Morábito et al., 2005, 2008, 2011).

Se seleccionaron siete puntos georreferenciados: el río Las Tunas (LT), arroyo

Aguanda (A), arroyo Yaucha (Y), presa Valle de Uco (VU), Costa Anzorena (CA),

Tiburcio Benegas (TB) y canal San Martín (SM) (Fig.5.1. y cuadro 5.1).

122

Figura 5.1. Área de estudio y sitios de monitoreo en la cuenca del río Tunuyán.

El sitio LT se encuentra en el área menos desarrollada aunque en la última década

la demanda de agua se incrementó debido a la creación de nuevos viñedos. La

subcuenca superior (que incluye LT, A, Y y VU) comprende aproximadamente 54000

ha cultivadas (viñedos y frutales) donde se realizan tratamientos para el control de

plagas. Por ley, en esta área sólo puede ser utilizado el 17% del caudal del río (DGI,

1996). El resto del flujo se utiliza con fines productivos aguas abajo del dique El

Carrizal (360 hm3) que separa las dos subcuencas y que fue construido para múltiples

usos, tales como la generación de energía, riego, recreación y deportes acuáticos. Por

otra parte, aguas debajo de CA, se desarrollan diferentes actividades urbanas, cría de

ganado, actividades agrícolas e industriales. TB se encuentra aguas abajo del dique y

discurre a lo largo del departamento de San Martín, donde se encuentra localizado el

sitio de monitoreo del canal SM. Este último ha sido seleccionado por tener gran

123

impacto de desarrollo urbano y de viñedos (esta actividad consume una gran cantidad

de agua de la subcuenca inferior del río Tunuyán) (Cuadro 5.1).

Código Sitios Localización Altitud Características

LT Arroyo Las

Tunas

S: 24° 68 m; O: 63° 04 m

1606 m Arroyos tributarios a VU.

Representan el 20% del

caudal total. Intensa

actividad agrícola,

vinicultura mayormente.

A Río tributario

Aguanda S: 24° 88 m; O: 62° 12 m 1546 m

Y Arroyo Yaucha S: 24° 86 m; O: 62° 32 m 1300 m

VU

Valle de Uco S: 24° 79 m; O: 62° 64 m 1130 m

Cabecera del río. Representa

el 80% del caudal total.

Intensa actividad agrícola,

vinicultura mayormente.

CA Dique Costa

Anzorena S: 25° 01 m; O: 62° 93 m 848 m

Contaminación urbana,

agrícola e industrial.

TB Dique Tiburcio

Benegas S: 25° 30 m; O: 63° 22 m 728 m Aguas abajo del dique

SM Canal San

Martin S: 25° 55 m; O: 63° 35 m 657 m

Contaminación urbana y

agrícola

Cuadro 5.1. Localización, coordenadas y características de los sitios seleccionados en la cuenca del

Tunuyán. La coordenadas X e Y están localizadas dentro del marco de referencia geodésico nacional

denominado Posgard 94.

5.2. Objetivos

El objetivo principal de esta parte de la investigación fue caracterizar las

diferentes calidades espacio-temporales y las condiciones toxicológicas del agua a lo

largo de la cuenca del río Tunuyán (Mendoza).

Los objetivos específicos fueron:

124

1. Caracterización de las muestras de aguas a través del análisis de

parámetros fisicoquímicos y bacteriológicos.

2. Cálculo de un ICA donde se integran estos parámetros, representativos de

agua para riego.

3. Valorar la idoneidad del bioensayo toxicológico con C. elegans como

herramienta útil para complementar los monitoreos clásicos de agua, considerando las

condiciones ambientales y actividades antropogénicas asociadas al uso del agua (como

agricultura, industrias y centros urbanos).

4. Análisis estadístico conjunto del bioensayo con C. elegans y del ICA

calculado para la evaluación de la sensibilidad y fiabilidad del bioensayo.

5.3. Resultados y discusión

5.3.1. Análisis de parámetros fisicoquímicos y bacteriológicos

En los Cuadros 5.2. y 5.3. se muestran la media, la mediana, el mínimo y el

máximo, del conjunto de parámetros fisicoquímicos y bacteriológicos, de los 8 meses

monitoreados. Se puede observar que los datos abarcaron un amplio rango de valores

entre los sitios de las subcuencas superior e inferior con variaciones en las

características fisicoquímicas y bacteriológicas.

Respecto al pH medido, no se encontró ninguna variación significativa ni a lo

largo del río ni entre las estaciones del año, con valores comprendidos entre 6,5 y a la

7,9 (p = 0,49 en ambos casos). Sin embargo, se detectó un fuerte aumento en la

salinidad (expresado como CE), así como en la concentración de SO42- tanto en VU,

125

CA, TB como en SM, en comparación con A, Y y LT (p < 0,01) (Cuadro 5.1.). De

hecho, estas diferencias se observaron a lo largo del seguimiento anual (en todos los

meses). En SM se encontraron valores tres veces más altos que en los sitios de la

subcuenca superior (A, Y y LT). Las mediciones de CE superaron el límite máximo

permisible (900 µS cm-1) en VU, CA, TB y SM, a pesar que todos los sitios estaban por

debajo del límite máximo tolerable (1800 µS cm-1). Varios informes indican que el

aumento del uso para riego de las aguas subterráneas (con alta CE) en la subcuenca

superior del Tunuyán y su consiguiente escorrentía, podrían ser los responsables de la

salinización de la subcuenca inferior; mientras que la alta concentración de SO42- en la

subcuenca inferior podría deberse a la composición natural del suelo en la zona

(Chambouleyron et al., 1993; Laviè et al., 2008). En el caso de PO43-, se detectaron

durante el mes de mayo y en todos los sitios de monitoreo, valores superiores a los

límites de regulación (0,4 mg L-1) (DGI, 1996). Esta alta concentración podría

explicarse por una disminución del flujo durante la toma de muestras en los meses de

otoño e invierno. No se encontraron diferencias significativas en la concentración de

SO42- en VU, CA, TB y SM, en comparación con A, Y y LT ni tampoco entre los meses

del año (p = 0,23).

126

Sitio T°C

Q

m3 s-1

pH

CE

µS cm-1

RAS

HCO3-

mg L-1

SO4-

mg L-1

NO3-

mg L-1

PO43-

mg L-1

P

mg L-1

DQO

mg L-1

OD

mg L-1

Cl-

mg L-1

Na+

mg L-1

K+

mg L-1

Ca2+

mg L-1

Mg2+

mg L-1

Aguanda

(A)

Media 14,8 0,83 7,29 403,8 0,59 90,00 126,00 1,55 0,43 0,14 26,00 7,30 27,96 19,18 3,46 57,00 13,80

Mediana 16,3 0,77 7,31 400,0 0,63 103,73 129,60 1,33 0,38 0,12 18,00 7,40 26,63 20,70 2,93 56,00 12,00

DE 3,9 0,15 0,37 37,3 0,15 29,49 25,24 0,53 0,18 0,06 29,59 0,38 4,00 4,73 2,67 4,90 5,70

Min 7,0 0,72 6,60 350,0 0,26 36,61 91,20 0,89 0,24 0,08 2,00 6,80 24,85 9,20 1,56 50,00 7,20

Max 19,0 1,14 7,83 481,0 0,78 115,94 158,40 2,66 0,73 0,24 76,00 7,60 35,50 25,30 9,75 64,00 24,00

Yaucha

(Y)

Media 13,8 1,83 7,32 245,5 0,63 110,60 25,20 1,94 1,03 0,33 15,67 7,66 25,29 15,61 1,80 37,00 6,00

Mediana 14,8 1,73 7,50 245,0 0,73 122,04 21,60 1,77 0,82 0,22 6,00 7,80 24,85 18,40 1,56 36,00 4,80

DE 3,6 0,50 0,48 26,0 0,23 29,07 23,48 0,88 0,84 0,28 18,50 0,48 5,51 5,79 1,43 4,00 4,21

Min 6,0 1,41 6,50 190,0 0,26 61,02 0,00 0,89 0,29 0,10 4,00 6,90 17,75 6,90 0,78 32,00 1,20

Max 18,0 3,03 7,86 270,0 0,86 134,24 72,00 3,54 2,42 0,79 37,0 8,10 31,95 20,70 5,07 42,00 12,00

Las Tunas

(LT)

Media 12,2 1,23 7,26 532,6 0,45 55,68 210,00 2,44 0,42 0,13 6,25 7,96 31,95 17,11 2,58 62,50 27,90

Mediana 12,0 1,19 7,29 520,5 0,44 42,71 213,60 1,77 0,22 0,07 7,00 7,60 31,95 17,25 2,54 64,00 25,80

DE 3,3 0,50 0,28 48,8 0,12 25,98 33,53 1,34 0,48 0,16 3,10 1,29 5,02 4,82 0,69 6,74 6,53

Min 7,0 0,31 6,80 480,0 0,23 30,51 139,20 1,33 0,13 0,04 2,00 6,10 24,85 9,20 1,95 50,00 20,40

Max 17,0 2,10 7,72 600,0 0,61 97,63 254,40 5,32 1,47 0,48 9,00 10,10 39,05 25,30 3,90 70,00 37,20

Continúa en la página siguiente

127

Sitio T°C

Q

m3 s-1

pH

CE

µS cm-1

RAS

HCO3-

mg L-1

SO4-

mg L-1

NO3-

mg L-1

PO43-

mg L-1

P

mg L-1

DQO

mg L-1

OD

mg L-1

Cl-

mg L-1

Na+

mg L-1

K+

mg L-1

Ca2+

mg L-1

Mg2+

mg L-1

Valle de

Uco

(VU)

Media 10,9 6,81 7,21 1231,3 1,22 125,85 327,60 2,23 0,64 0,21 20,00 8,53 158,86 65,55 4,83 176,00 22,95

Mediana 12,0 6,73 7,17 1285,0 1,13 109,84 319,20 2,22 0,58 0,19 25,50 9,30 143,78 60,95 3,51 176,00 18,00

DE 2,1 1,84 0,34 177,6 0,41 71,23 104,59 0,84 0,51 0,17 12,03 1,05 48,96 24,65 2,59 17,27 11,25

Min 6,0 4,23 6,70 980,0 0,61 42,71 134,40 0,89 0,00 0,00 2,00 6,90 110,05 32,20 2,73 156,00 12,00

Max 12,0 9,33 7,78 1470,0 1,86 280,69 513,60 3,54 1,74 0,57 27,0 9,40 230,75 101,20 9,75 196,00 39,60

Costa

Anzorena

(CA)

Media 13,6 15,30 7,22 1371,3 1,24 183,82 393,00 1,61 0,65 0,22 26,25 7,64 144,22 69,98 8,53 190,75 31,05

Mediana 14,0 13,89 7,16 1395,0 1,23 186,11 357,60 1,55 0,36 0,12 16,50 7,60 142,00 67,85 7,80 184,00 29,40

DE 2,6 3,10 0,32 149,7 0,40 68,37 82,04 0,62 0,69 0,23 21,90 1,13 18,87 22,05 2,07 25,45 11,48

Min 8,0 12,84 6,90 1160,0 0,61 54,92 321,60 0,89 0,15 0,05 13,00 5,90 117,15 34,50 5,85 156,00 15,60

Max 16,0 22,13 7,74 1560,0 1,90 280,69 532,80 2,66 2,29 0,75 59,0 9,00 170,40 98,90 11,70 232,00 45,60

Tiburcio

Benegas

(TB)

Media 14,9 39,49 7,26 1380,1 1,23 157,89 429,00 1,44 0,37 0,12 12,75 7,18 147,33 69,26 7,85 192,00 36,00

Mediana 15,5 40,25 7,27 1385,0 1,14 164,75 408,00 1,55 0,35 0,11 13,00 7,15 152,65 62,33 7,80 190,00 25,20

DE 4,2 11,88 0,33 143,9 0,40 46,52 74,18 1,18 0,23 0,07 7,85 1,09 17,70 20,55 3,99 11,86 28,52

Min 8,0 24,50 6,70 1230,0 0,56 67,12 355,20 0 0 0 5,00 6,00 120,70 39,10 3,90 180,00 14,40

Max 20,0 52,00 7,69 1660,0 1,80 231,88 585,60 3,54 0,76 0,25 20,0 8,30 166,85 98,90 16,77 216,00 103,20

Continúa en la página siguiente

128

Sitio T°C

Q

m3 s-1

pH

CE

µS cm-1

RAS

HCO3-

mg L-1

SO4-

mg L-1

NO3-

mg L-1

PO43-

mg L-1

P

mg L-1

DQO

mg L-1

OD

mg L-1

Cl-

mg L-1

Na+

mg L-1

K+

mg L-1

Ca2+

mg L-1

Mg2+

mg L-1

San

Martín

(SM)

Media 15,9 1,56 7,21 1341,7 1,24 169,98 417,60 1,84 0,56 0,15 14,80 7,46 139,46 69,99 7,41 199,14 30,17

Mediana 16,5 1,38 7,28 1350,0 1,23 170,86 412,80 1,77 0,40 0,13 10,00 7,10 156,20 64,40 7,80 200,00 22,80

DE 3,6 0,27 0,32 157,5 0,42 31,59 53,31 0,65 0,39 0,07 14,18 1,02 34,52 22,20 2,53 14,69 24,46

Min 8,5 1,33 6,80 1140,0 0,58 140,35 355,20 0,89 0,21 0,07 4,00 6,70 71,00 39,10 3,90 180,00 12,00

Max 19,0 2,00 7,69 1550,0 1,80 231,88 513,60 2,66 1,33 0,26 38,00 9,20 166,85 98,21 11,70 222,00 84,00

Cuadro 5.2. Parámetros fisicoquímicos de las muestras de agua de la cuenca del Tunuyán.. Para cada sitio se calcularon los parámetros estadísticos se calcularon a partir de un n=8

(meses de muestreo). Q= caudal; CE= conductividad eléctrica; RAS= tasa de absorción de sodio; P= Fósforo total; DQO= demanda química de oxigeno; OD= oxígeno disuelto; DE=

Desviación estándar; Min= mínimo valor; Max= máximo valor. Se presentan los bicarbonatos que son los predominantes en el balance iónico, aunque los carbonatos

fueron también considerados.

129

Se analizaron también otros parámetros iónicos tales como Cl-, Ca2+, Mg2+,

HCO3-, K+ y NO3

- no encontrándose ninguna diferencia significativa ni entre los sitios

de monitoreo ni entre los períodos estacionales (p > 0,1) (Cuadro 5.1.). Cuando estas

concentraciones de iones se compararon entre los dos grupos VU, CA, TB y SM por un

lado y A, Y y LT por otro, se observaron diferencias significativas (p < 0,01), con la

excepción de NO3- (p > 0,1). Tanto los valores de NO3

- como de Cl- fueron menores a

los límites de regulación de aguas para riego de Mendoza (concentración máxima

tolerable de 45 mg L-1 para NO3- y 400 mg L-1 para Cl-; DGI, 1996). Las mediciones más

altas de DQO fueron encontradas en A, VU y CA, especialmente durante la temporada

de primavera; lo que puede apuntar a la contaminación orgánica debido a un aumento en

las actividades recreativas y ganaderas (Salatino et al., 2014). La DQO disminuyó río

abajo mostrando una pequeña recuperación en el punto TB que se mantuvo en SM. Sin

embargo no se encontraron diferencias significativas ni entre los sitios de muestreo ni a

lo largo del año (p > 0,1 para ambos casos).

El análisis de los parámetros bacteriológicos reveló una fluctuación de los valores

a lo largo del año con un fuerte incremento durante noviembre y diciembre. En este

sentido, la media y la mediana en el caso de la medición de BAM difirieron en un orden

de magnitud en A, Y, LT y TB (Cuadro 5.3.).

130

Sitio

BAM

(UFC mL-1)

CT

(NMP 100mL-1)

CTT

(NMP 100mL-1)

Aguanda (A)

Media 1,58E+04 7,75E+02 1,15E+02

Mediana 3,35E+03 2,30E+02 4,00E+01

DE 3,42E+04 1,55E+03 1,44E+02

Min 4,50E+02 4,00E+01 3,00E+01

Max 1,00E+05 4,60E+03 4,30E+02

Yaucha (Y)

Media 2,47E+04 6,31E+02 6,18E+02

Mediana 1,85E+03 5,50E+01 4,00E+01

DE 6,28E+04 1,60E+03 1,61E+03

Min 1,30E+02 3,00E+01 3,00E+01

Max 1,80E+05 4,60E+03 4,60E+03

Las Tunas

(LT)

Media 2,34E+03 7,63E+01 3,88E+01

Mediana 1,26E+02 5,50E+01 3,50E+01

DE 5,56E+03 6,55E+01 1,36E+01

Min 2,00E+01 3,00E+01 3,00E+01

Max 1,60E+04 2,30E+02 7,00E+01

Valle de Uco

(VU)

Media 3,52E+03 8,75E+01 4,88E+01

Mediana 1,65E+03 4,00E+01 3,50E+01

DE 3,89E+03 7,80E+01 4,12E+01

Min 2,00E+01 3,00E+01 3,00E+01

Max 9,30E+03 2,30E+02 1,50E+02

Continúa en la página siguiente

131

Sitio

BAM

(UFC mL-1)

CT

(NMP 100mL-1)

CTT

(NMP 100mL-1)

Costa

Anzorena

(CA)

Media 7,99E+04 5,67E+03 3,77E+03

Mediana 1,20E+04 2,40E+03 6,80E+02

DE 1,12E+05 7,94E+03 8,22E+03

Min 1,00E+03 2,10E+02 7,00E+01

Max 3,00E+05 2,40E+04 2,40E+04

Tiburcio

Benegas

(TB)

Media 1,53E+04 3,15E+03 3,03E+03

Mediana 1,60E+03 4,00E+01 3,00E+01

DE 2,84E+04 8,43E+03 8,47E+03

Min 3,10E+02 3,00E+01 3,00E+01

Max 8,00E+04 2,40E+04 2,40E+04

San Martín

(SM)

Media 6,58E+03 1,21E+03 3,84E+02

Mediana 1,85E+03 4,00E+02 3,00E+02

DE 1,20E+04 1,52E+03 3,11E+02

Min 7,80E+02 2,30E+02 7,00E+01

Max 3,10E+04 4,30E+03 9,00E+02

Cuadro 5.3. Parámetros bacteriológicos de las muestras de agua de la cuenca del

Tunuyán. Para cada sitio se calcularon los parámetros estadísticos a partir de un n=8

(meses de muestreo). Q= caudal; BAM= bacterias aerobias mesófilas; CT= coliformes

totales; CTT= coliformes termotolerantes; DE= Desviación estándar; Min= mínimo

valor; Max= máximo valor; UFC= Unidades Formadoras de Colonias; NMP= Número

Más Probable; E = notación exponencial; multiplica al número anterior por 10 elevado

a la enésima potencia (indicada seguidamente).

Cuando se compararon los datos de BAM de A, Y, LT y TB con el grupo VU,

CA y SM se detectó una diferencia moderada (p < 0,01). Los valores más bajos de

parámetros bacteriológicos (BAM, CT y CTT) se encontraron en A, Y LT mientras que

las mayores concentraciones fueron medidas en CA y TB. El aumento de la

concentración bacteriana podría explicarse no sólo por los efluentes domésticos, sino

132

también por el arrastre de residuos provenientes de la ganadería, debido a la escorrentía

consecuencia del deshielo y las lluvias.

Como ya se ha mencionado, a partir de los resultados obtenidos en los monitoreos

se vió que algunos de los parámetros presentaron mayor concentración durante ciertos

periodos del año, que nos habla de una variación en la calidad de agua. Se graficaron los

parámetros en los que se vieron estos cambios espacio-temporales significativos (Fig.

5.2.). Para ello se agruparon, por un lado, los datos correspondientes a los meses de

otoño e invierno (O-I) y, por el otro, a primavera y verano (P-V). Se presentan en

boxplots los análisis realizados para los parámetros T°C (p = 0,0003), RAS (p =

0,0127), Na+ (p = 0,0301) y log BAM (p = 0,0061).

Figura 5.2. Representación en boxplots del análisis no paramétrico de Mann-Whitney.

Se representan en gráficos boxplots la TºC= temperatura; RAS= Relación de Absorción de

Sodio; Na+ y BAM= bacterias aerobias mesófilas (UFC= Unidades Formadoras de

Colonias), analizados por estación: otoño-invierno (O-I) y primavera-verano (P-V). n=28

para cada estación.

Los valores más altos de RAS y Na+ encontrados en los meses estivales, están

directamente relacionados con el proceso de salinización de las aguas en la subcuenca

inferior del Tunuyán, como ya se ha mencionado (Chambouleyron et al., 1993; Laviè et

133

al., 2008).Los valores de BAM son mayores en la época estival respecto al invierno

debido a la mayor frecuencia de deshielo y lluvias propias de esos meses.

Los datos generados mostraron una variación espacio-temporal en la calidad del

agua en el río Tunuyán que pudiera ser dependiente de las actividades antrópicas. Por lo

tanto, la aplicación de una herramienta integrada que pueda sintetizar todos estos

resultados fisicoquímicos y bacteriológicos sería útil para un mejor entendimiento del

estado de la calidad del agua.

5.3.2. Cálculo del ICA

La fig. 5.3. muestra los datos del ICA para los diferentes sitios. El valor más alto

correspondió a LT (91) seguido de A e Y con 86,4 y 86, respectivamente. Los tres

pertenecen a una categoría buena de calidad de agua. Si bien VU forma parte

geográficamente de la subcuenca superior, su valor del ICA fue de 74,2, que está dentro

la categoría media. Una posible explicación es que en VU hay cinco parámetros que

exceden los límites legales permitidos según la DGI, tres más (SO42-, RAS y CE) que

los puntos TB, A e Y (Salatino et al., 2014). Probablemente debido a eventos de

contaminación difusa, ya que en esta zona hay actividad agrícola y también recreativa.

Los valores de ICA junto con el análisis de los parámetros fisicoquímicos y

bacteriológicos vistos hasta ahora, describen que la subcuenca superior tiene una mejor

calidad del agua, con excepción del punto VU.

134

Figura 5.3. Datos del ICA para los diferentes sitios de monitoreo de la

cuenca del río Tunuyán; n=8.

En la subcuenca inferior, los valores del ICA fueron 70,7, 74,2 y 72,5 para CA,

TB y SM, respectivamente (categoría media). Esta pequeña fluctuación en la calidad del

agua desde CA a TB podría ser debido a una mejora puntual de la misma, después de la

salida del curso de agua del embalse El Carrizal. Una vez obtenidos los valores del ICA,

fueron comparados entre ellos, agrupando tanto por subcuencas como por estaciones

(Fig. 5.4.). Los resultados indicaron una clara diferencia entre las subcuencas (Test de

Mann-Whitney p = 0,0003) (Fig. 5.4.). Se vio también una marcada desemejanza

estacional y este notable efecto toxicológico durante los meses cálidos, va en

consonancia con observaciones anteriores en la zona, que muestran que durante ese

periodo la calidad del agua disminuye debido al intenso uso recreativo y agrícola (Laviè

et al., 2008; Morábito et al., 2012b).

135

Figura 5.4. Análisis no paramétrico (Test de Mann-Whitney p = 0,0003) de los valores

del ICA por subcuencas (A); n=3 para CS (subcuenca superior) y n= 4 para CI

(subcuenca inferior) y por estaciones: otoño e invierno (O-I) versus primavera y

verano (P-V) (B); n=4 para cada estación.

A pesar de que todos los datos del ICA describen condiciones aceptables de

calidad, existe un claro deterioro aguas abajo. Esta situación es la que indica que se

requieren estudios adicionales para evaluar el impacto real sobre el ecosistema.

5.3.3. Bioensayo con C. elegans para la determinación de la calidad de aguas

Con objeto de obtener una evaluación integrada de la calidad del agua del río

Tunuyán, se realizó el bioensayo de crecimiento relativo de C. elegans. Los valores de

la mediana mostraron una pequeña disminución en comparación con el control en los

sitios A (0,86), Y (0,90) y LT (0,74). Los datos más bajos se midieron en los otros sitios

de monitoreo: 0,65; 0,74; 0,63 y 0,70 para VU, CA, TB y SM, respectivamente. El box-

plot en la Fig. 5.5. muestra los valores de la mediana para cada punto de control. El

análisis estadístico reveló diferencias significativas en las muestras de agua de los

puntos de monitoreo (p < 0,01).

136

Figura 5.5. Crecimiento relativo de C. elegans a lo largo de los sitios de

monitoreo. Se realizó un análisis ANAVA no paramétrico. Se representa la

dispersión de los grupos de datos mediante boxplots. Los sitios con la misma letra

no presentan diferencias en base al test t-Student (p < 0,05); n=8.

Estas comparaciones indicaron que los crecimientos relativos en A e Y fueron

mayores a los de CA, TB, SM y VU; mientras que en LT el valor medio fue

significativamente mayor al compararlo con VU, TB y SM. Este análisis estadístico

refuerza la conclusión de que la calidad del agua en la subcuenca superior es mejor que

en la inferior. El punto VU resultó tener más similitud con los sitios de monitoreo de la

subcuenca inferior, a pesar de pertenecer a la superior. Este resultado coincidió con el

análisis del ICA. A pesar de que el sitio LT presentó el valor más alto del ICA (91,

categoría buena), el ensayo con C. elegans dio un valor de 0,74, lo que indica que hubo

un efecto tóxico, seguramente debido a sustancias que no están siendo determinadas en

el ICA.

En la Fig. 5.6.A se muestran los valores medios del bioensayo, agrupados por

subcuencas. Se vió una clara diferencia entre ambas. La superior permitió un mayor

crecimiento relativo del nematodo, lo cual va en concordancia con los resultados

137

obtenidos hasta ahora en este trabajo, que indican una mejor calidad de la misma

respecto a la subcuenca inferior. En la Fig. 5.6.B, el análisis de los valores medios del

bioensayo en otoño-invierno y en primavera-verano, mostró claras diferencias

estacionales.

Figura 5.6. Análisis no paramétrico (Test de Mann-Whitney p = 0,0003) de

los valores de crecimiento relativo de C. elegans analizados por subcuencas

(A); n=24 para CS (subcuenca superior); n=32 para CI (subcuenca

inferior) y por estaciones: otoño e invierno (O-I) versus primavera y verano

(P-V) (B); n=32 para cada una.

La diferencia de crecimiento, sugiere que no siempre los valores de los ICA

clásicos son suficientes para evaluar la calidad del agua o para proteger a los

organismos acuáticos: es necesaria la realización de ensayos toxicológicos adicionales

para obtener una evaluación integrada y más realista del estado de las aguas.

En la Fig. 5.7. se comparó la mediana del crecimiento relativo de C. elegans de

los diferentes meses de muestreo. El test de Friedman (p = 0,0003) bloqueado por meses

reveló un valor más bajo en noviembre (0,49) y diciembre (0,43), sugiriendo que la

toxicidad es mayor en esa época. En el resto de los meses, los datos medios fueron de

entre 0,68 y 0,94 sin diferencias significativas entre ellos. Estos resultados son acordes a

138

los revelados por el ICA y a los encontrados en estudios anteriores en la zona, que

remarcan que en la época estival la calidad del agua disminuye debido al intenso uso

recreativo y agrícola, además de la escorrentía por el deshielo y las lluvias (Laviè et al.,

2008; Morábito et al., 2012b).

Figura 5.7. Crecimiento relativo de C. elegans en los diferentes meses

de monitoreo. Se realizó un análisis ANAVA no paramétrico. Se

representa la dispersión de los grupos de datos mediante boxplots. Los

meses con la misma letra no presentan diferencias en base al test t-Student

(p < 0,05); n=7.

Estos resultados subrayan que el bioensayo de crecimiento de C. elegans, junto

con el análisis tradicional de calidad del agua, es una herramienta valiosa para evaluar

los efectos toxicológicos a fin de estimar las amenazas ambientales sobre el recurso.

5.3.4. ACP

Para un estudio más exhaustivo de la relación entre el crecimiento relativo de C.

elegans, los parámetros fisicoquímicos y los bacteriológicos, se realizó un ACP. En la

Fig. 5.8. se puede observar que los dos primeros componentes explicaron el 62% de la

varianza total y diferenciaron dos grupos distintos en el CP1: uno con valores positivos

139

en los sitios A, Y LT, y otro con negativos en VU, CA, TB y SM. En el área superior

derecha del gráfico, el sitio Y presentó los valores más altos, seguidos por A y LT. Por

el contrario, VU exhibió características similares a la subcuenca inferior (CA, TB y

SM).

Figura 5.8. Representación del ACP de los sitios de monitoreo según el

crecimiento relativo de C. elegans y los parámetros fisicoquímicos y

bacteriológicos.

En el cuadro 5.4. se indican los autovectores de los componentes del ACP. Los

coeficientes de las variables de los autovectores del componente 1 revelaron que el

crecimiento (coeficiente positivo) se contrapone a todas las otras variables (coeficientes

negativos). Con la excepción de NO3-, PO4

3- y P con valores de coeficientes positivos

pequeños, que no dominan en el CP1. Los componentes 2º y 3º no tienen interpretación

física inmediata.

140

Variable CP1 CP2 CP3

logQ -0.309 0.006 0.038

logCl -0.373 0.093 -0.010

logNa -0.344 0.064 -0.219

logK -0.336 -0.047 0.164

logCa -0.383 0.078 -0.058

logMg -0.272 0.199 0.269

logCO3H -0.247 0.134 -0.040

logSO4 -0.345 0.083 -0.020

lognitratos 0.096 0.250 0.414

logfosfatos 0.053 -0.465 0.167

logfosforo 0.052 -0.468 0.203

logBAM -0.170 -0.338 0.311

Log col_tot -0.170 -0.377 -0.306

log col_fec -0.172 -0.367 -0.349

Crec. 0.178 0.162 -0.541

Cuadro 5.4. Autovectores del ACP.

Los resultados del ACP muestran que el extremo positivo (Y) refleja tres posibles

combinaciones: un alto crecimiento relativo de C. elegans, bajos valores de parámetros

fisicoquímicos y bacteriológicos, o una combinación de ambos. En contraste, los grupos

con valores más bajos del CP1 expresarían o un bajo crecimiento relativo de C. elegans,

o valores altos en los parámetros fisicoquímicos y bacteriológicos, o una combinación

de ambos.

141

Los sitios A, LT e Y son pequeños ríos de valle sin grandes asentamientos

urbanos y con una moderada actividad agraria en la zona, con leve efecto sobre la

calidad del agua. Por el contrario, los sitios VU, CA, TB y SM son ríos de mayor

caudal, con mayor número de industrias, actividades agrícolas y de recreo en la zona,

con un mayor impacto (Chambouleyron et al., 2002; Hernández & Martinis, 2013;

Laviè et al., 2017). Estos resultados dan la evidencia que confirmaría las diferencias en

la calidad del agua entre las subcuencas del río Tunuyán debido a la composición

fisicoquímica y al crecimiento de C. elegans. Lo interesante entonces, es saber qué

porcentaje de esas diferencias son debidas a la variabilidad medida en los parámetros

fisicoquímicos y cuales a las diferencias en los datos del bioensayo.

5.3.5. Modelo linear multivariado y regresión simple del crecimiento relativo

versus el ICA

Se calcularon tres modelos lineales teniendo en cuenta al crecimiento relativo

como variable dependiente. En el primero, nominado como modelo completo, se

utilizaron todas las variables como regresoras (T°C, caudal, pH, CE, RAS, Cl-, Na2+,

K+, Ca2+, Mg2+, HCO3-, SO4

2-, NO3-, PO4

3-, P, BAM, CT, CTT). El segundo (modelo

reducido) sólo incluyó las variables usadas para el cálculo del ICA (T°C, pH, RAS, Cl-,

Na2+, HCO3-, SO4

2-,NO3-, PO4

3-, CT, CTT). El tercero se construyó teniendo en cuenta

las siguientes variables regresoras: T°C, pH, CE, K+, Ca2+, Mg2+, HCO3-, PO4

3-, BAM,

CTT. Este último es el modelo óptimo dado que tuvo el mayor valor de R2 ajustado. En

el cuadro 5.5. se muestra el porcentaje de R2 y R2 ajustado de los tres. El modelo

reducido tuvo los valores más bajos de ambos, 40,5 y 24,9 respectivamente. El

completo, tuvo un R2 ajustado de 42,1%. El óptimo sin embargo, presentó el R2

142

ajustado más alto con un 51,2%. Ninguno mostró un R2 mayor al 61,8%, lo que

significa que hay una variabilidad de casi un 38% en los datos de crecimiento relativo

de C. elegans que no está siendo explicada por los parámetros fisicoquímicos y

bacteriológicos.

Modelo R2 (%) R2aj (%)

Completo 61,8 42,1

Reducido 40,5 24,9

Óptimo 60,4 51,2

Cuadro 5.5. Diferentes modelos lineales considerando al

crecimiento relativo de C. elegans como variable

dependiente.

A pesar de que este estudio indica que el crecimiento de C. elegans se ve afectado

por otras sustancias que alteran la calidad del agua y que no están siendo medidas,

desafortunadamente no hay disponibilidad en la bibliografía de estudios previos que

midieran otros compuestos en el río Tunuyán. Solo Fernández et al. (2003) compiló los

agroquímicos utilizados en la cuenca del río Mendoza. Dado que ambas cuencas, la del

río Tunuyán y la del río Mendoza comparten características geográficas y actividades

antropogénicas similares, se podría pensar que exista la posibilidad de encontrar

fertilizantes y pesticidas en los cursos de agua.

Otros autores (Salatino et al., 2009) identificaron metales pesados tales como Ar,

Zn, Cr, Cd, Pl, Cu a lo largo de los ríos Tunuyán y Mendoza. Las concentraciones

medidas en este trabajo fueron comparadas con los límites establecidos en las

regulaciones (DGI, 1996; EPAS, 2001) para la calidad del agua de riego, encontrando

que el Cu y Cd estuvieron por encima de lo permisible (0,2 mg L-1 y 0,01 mg L-1,

143

respectivamente) en los sitios LT y VU en particular. Tanto Cu como Cd han sido

detectados en productos tales como antiparasitarios y fertilizantes, por lo que la

presencia en el agua de río no es sorprendente y deberían llevarse a cabo controles

rutinarios de supervisión. En resumen, los ríos de Mendoza están expuestos a diferentes

contaminantes que podrían comprometer la calidad del agua y que no se miden en los

monitoreos tradicionales y controles rutinarios.

El análisis de regresión lineal mostró una asociación lineal débil (R2 = 0,1409)

entre el ICA y los valores de crecimiento relativo. En la figura 5.9. se muestra la gran

dispersión de los datos del crecimiento relativo de C. elegans para cada valor del ICA.

Esto podría ser debido a que para cada uno de los siete datos del ICA (uno para cada

punto de control) había ocho valores mensuales de crecimiento relativo de C. elegans;

también podría explicarse porque los parámetros fisicoquímicos y bacteriológicos

utilizados para el cálculo de este índice solamente explican el 24,9% de la variación del

crecimiento del nematodo (R2 ajustado del modelo lineal; cuadro 5.5.). Además, como

se mostró en la Fig. 5.5., los valores de crecimiento relativo de C. elegans presentan

importantes diferencias estacionales que generaron también dispersión en los datos.

Figura 5.9. Análisis de regresión entre el crecimiento relativo de C. elegans

y los valores del ICA.

144

Se refuerza de nuevo la idea de que hay sustancias químicas que alteran la calidad

del agua y que no estarían siendo medidas en los monitoreos de rutina, cuyo efecto

tóxico si podría ser revelado mediante el uso del bioensayo de crecimiento con C.

elegans.

5.4. Conclusiones

Una de las observaciones más importantes de este estudio es que el crecimiento de

C. elegans se ve afectado por los cambios en la calidad del agua, incluso cuando las

muestras de agua cumplen los requisitos regulatorios. Los ríos de Mendoza están

expuestos a diferentes contaminantes que comprometen el recurso hídrico y que no se

miden en los monitoreos tradicionales y controles rutinarios. Este aspecto refuerza el

concepto de que debe haber otros productos químicos que no se pudieron detectar a

priori, pero que aun así ejercen efectos toxicológicos de peso. Se pone de relieve la idea

que la buena calidad del agua (la que reflejan los ICA) no está necesariamente vinculada

a su condición toxicológica, cosa que sí se obtiene con la respuesta de C. elegans. Estos

resultados subrayan la necesidad de incluir bioensayos ecotoxicológicos en los

monitoreos de rutina para evaluar los efectos de múltiples factores de estrés en los

ecosistemas (CMNUCC, 2014). Hasta el momento, C. elegans parece ser un organismo

sensible para esta evaluación (Cesnaitis et al., 2014; Hägerbäumer et al., 2015; Höss &

Weltje, 2007; Höss et al., 2013); de hecho el crecimiento relativo puede ser un

parámetro adecuado para detectar la interacción de contaminantes ambientales en

muestras de agua que sería imposible con métodos tradicionales, especialmente en

países con escasos recursos económicos donde se dificulta el llevar a cabo análisis

analíticos para una amplia gama de contaminantes y sus interacciones.

145

CAPÍTULO 6.

CONCLUSIONES GENERALES

Y PERSPECTIVAS FUTURAS

146

Capítulo 6. Conclusiones generales y perspectivas futuras

La determinación de la calidad del agua tradicionalmente se ha realizado a partir

de los valores obtenidos de diferentes parámetros fisicoquímicos y bacteriológicos,

contrastados con la legislación local vigente. Sin embargo, estos índices no son

suficientes para evaluar la complejidad de las interacciones entre los contaminantes y en

consecuencia es necesario realizar ensayos que permitan una evaluación integral del

agua.

La caracterización y medición de tóxicos ambientales de manera individual no es

suficiente para asegurar la ausencia de efectos indeseables, puesto que tanto la mezcla

de sustancias como las posibles transformaciones que puedan darse en el ambiente,

pueden modificar su efecto nocivo. De ahí que el uso de ensayos biológicos esté siendo

considerado cada vez con mayor intensidad para la evaluación de la toxicidad global de

los mismos.

Los bioensayos constituyen una herramienta eficaz para la obtención de efectos

observables de la toxicidad de compuestos y sus interacciones, que no se logra mediante

la analítica clásica. De esta manera se pueden identificar situaciones de riesgo a nivel de

poblaciones, comunidades o ecosistemas. Los ensayos de toxicidad que se han venido

usando hasta ahora en aguas, han permitido hacer una evaluación primaria pero los

datos eran difícilmente extrapolables a un organismo superior tal y como es el ser

humano. El aporte fundamental y novedoso de esta tesis es, por un lado la validación de

un bioensayo que complementa a los análisis tradicionales de agua, cubriendo la falta de

información sobre la calidad toxicológica de las mismas. Para ello se ha usado un

modelo multicelular cuyo genoma guarda una gran similitud con el humano,

estimándose un 70-80% de homología génica y en muchos casos también funcional.

147

Por otro lado, proporciona información integrada de datos fisicoquímicos,

bacteriológicos y toxicológicos; que responden a la demanda de información de una

población cada vez más consciente y preocupada por el posible impacto de

contaminantes, conocidos o no, sobre el ambiente y la salud humana.

En una primera parte de esta tesis, se analizaron los efectos de la exposición a un

formulado comercial de glifosato. Se analizó la respuesta in vitro de C. elegans tras la

exposición a diferentes concentraciones del mismo, obteniendo la CE50 para el

crecimiento, la reproducción y la fertilidad (1,058 mg mL-1; 0,827 mg mL-1 y 0,850 mg

mL-1, respectivamente). Los resultados demostraron que estas variables de C. elegans

fueron inhibidas tras el tratamiento de manera concentración-dependiente. Los datos

obtenidos fueron similares a los reportados previamente por Cole et al. (2004) que

demostraron una correlación significativa entre el orden de toxicidad de la CE50

calculada en C. elegans y la de ratas y ratones para compuestos organofosforados, entre

ellos el glifosato. Cabe destacar que C. elegans mostró más sensibilidad al compuesto

que otros organismos como Daphnia magna y Vibrio fischeri (Sihtmäe et al., 2013). Así

pues en este trabajo de tesis se concluye que C. elegans es sensible a formulaciones

comerciales de glifosato y que la CE50 es comparable con la respuesta dada hasta ahora

en modelos de mamíferos.

Se demostró también que la inhibición del crecimiento, reproducción y fertilidad

de C. elegans tras el tratamiento con glifosato podría estar relacionada, en parte, con la

generación de estrés oxidativo ya que se dió un incremento de la expresión de los genes

de respuesta al mismo. Esto también fue un punto novedoso de este trabajo ya que la

escasa literatura disponible sobre los efectos del estrés oxidativo provocado por

glifosato comercial (Roundup®) tiene que ver con exposiciones agudas. La exposición

crónica al herbicida confirmó la existencia de un desbalance redox por acumulación de

148

ERO. Se observó un aumento significativo en la expresión de genes de catalasa y

consecuentemente también de su actividad. Estos hallazgos vienen a cubrir un hueco en

la información sobre el posible mecanismo molecular intracelular de la toxicidad del

glifosato en organismos no blanco. Además, para investigar en más detalle la inducción

de estos genes se decidió hacer un análisis específico de su actividad con un

experimento dosis respuesta con los 3 genes que en C. elegans codifican para la catalasa

(ctl-1, ctl-2 y ctl-3) tras la exposición a diferentes concentraciones del formulado. Se

obtuvo que ctl-1 y ctl-3 fueron inducidos hasta 3 y 2 veces sobre el control, mientras

que para ctl-2 no fue tan marcado. Se hipotetizó que el patrón de expresión de las

distintas isoformas de la enzima probablemente esté relacionado con su localización

subcelular particular y que las diferencias encontradas sugieren el efecto que el glifosato

pudiera estar provocando en el metabolismo específico de cada organela. Estos

resultados coincidieron con los hallados por otros autores que reportaron una falta de

inducción de ctl-2 en cepas transgénicas con gfp de C. elegans, tras la exposición a

glifosato (Anbalagan et al., 2013) y al agroquímico clorpirifós (Roh & Choi, 2008).

La modificación en la expresión génica como respuesta a estrés ambiental, se

utiliza cada vez más en ecotoxicología ya que ofrece valores de alta sensibilidad y

puede ser muy útil para el diagnóstico temprano de la contaminación (Poynton et al.,

2007; Roh et al., 2006, 2007). Quedan identificados de esta manera genes en los cuales

los cambios de su expresión podrían estar indicando estrés oxidativo en el organismo.

Así pues, estos resultados dan pie para que en un futuro, a través de un estudio más

exhaustivo de los mismos, se pueda llegar a establecer un bioensayo indicador de

cambios moleculares en nematodos expuestos a muestras ambientales de agua

(potencialmente contaminadas con glifosato).

149

En una segunda parte de esta tesis, se seleccionaron diferentes cuencas que son

representativas de áreas de monitoreo tradicional de agua: la cuenca del río Pergamino y

la del río Tunuyán. Ambas fueron escogidas para comprobar la sensibilidad y la

aplicabilidad del bioensayo toxicológico de crecimiento con C. elegans.

En el caso de Pergamino, se obtuvo por primera vez una evaluación integrada de

la calidad del agua de esta cuenca en la que se incluyó la identificación y cuantificación

de algunas de las principales amenazas de contaminación. Ya que esta zona es

representativa de la región Pampeana y posee una intensa actividad agrícola con la

secuencia de cultivos maíz-trigo/soja, caracterizada por el uso creciente de

agroquímicos, se decidió analizar también la presencia de glifosato y AMPA en las

muestras de agua. Se detectaron ambos compuestos a lo largo del año. El hecho de

haber encontrado más porcentaje de muestras con glifosato o con AMPA solos en las

ARSub podría estar indicando que quizá estén ocurriendo más eventos de aplicación de

los que el ambiente podría asimilar, lo cual hace que haya una mayor percolación hasta

el acuífero. En términos de concentraciones, las más altas se dieron en AUS, señalando

quizá que la contaminación urbana podría estar inhibiendo el proceso de

biodegradación. Respecto a las estaciones, las más elevadas para el glifosato se

encontraron en verano, coincidente con la campaña de cultivos de soja, mientras que

para AMPA, los mayores valores fueron en invierno. Esto podría ser debido a la alta

persistencia del metabolito per se. Los resultados concuerdan con los reportados en

informes anteriores en otras regiones (Arunakumara et al., 2013) así como en región

pampeana (Vera et al., 2010). La caracterización fisicoquímica e hidrogeoquímica

realizada, reveló diferencias entre las muestras (agrupadas según su origen). También

por primera vez en la zona se construyó un ICA que sintetiza en un dato único la

información de los diferentes parámetros de calidad de agua determinados. Con la

150

información obtenida de este índice se concluyó que la mayoría de los sitios de

monitoreo estaban dentro de la categoría de calidad de agua mala, lo que indicó una

fragilidad que pone en peligro las condiciones ambientales del lugar. Esto demuestra

que a pesar que no se encontraron niveles de concentración de agroquímico por encima

de los límites de la normativa, el estado de la calidad del agua no es bueno. Tampoco se

tiene información sobre los efectos de sinergia que se puedan dar entre los herbicidas

basados en glifosato y otros contaminantes, que puedan representar un riesgo en la zona.

A pesar que la necesidad de un enfoque más ecológico en la evaluación de los

múltiples factores de estrés que afectan al ambiente es un tema que viene avalado por la

comunicad científica, aún siguen siendo escasos los estudios para comprender cómo un

sistema complejo puede responder a mezclas de sustancias químicas (Backhaus &

Faust, 2012; De Laender & Janssen, 2013). De modo que se hace necesario realizar

ensayos que permitan una evaluación toxicológica integral del agua en modo sencillo,

rápido y económico. Para obtener un análisis más completo de las muestras de agua

incluyendo un dato biológico, se realizó el bioensayo de crecimiento relativo de C.

elegans para los 7 meses de muestreo. Para caracterizar la magnitud de los efectos

tóxicos, se realizó una categorización de los mismos basada en los valores de

crecimiento relativo obtenidos. Esta herramienta fue muy útil en la interpretación de la

variabilidad de la respuesta biológica de C. elegans. Los datos mostraron que los sitios

de monitoreo exhibieron diferentes efectos tóxicos, revelándose en la mayoría de las

muestras una categoría de muy tóxico (porcentajes de 14,3 a 50) con la excepción de los

puntos 1, 2, 10, 11, 12 y 14. En particular, en el grupo de aguas urbanas se obtuvieron

porcentajes elevados para la categoría de muy tóxico, destacándose el sitio 18 que tenía

un 50%, el valor más alto. En cuanto al efecto no tóxico, se exhibieron valores que

fueron desde 14,3 hasta 83,3%. Comparando estos resultados con aquellos encontrados

151

en el análisis del ICA, no hubo datos que indicasen que la toxicidad y los parámetros

fisicoquímicos medidos estuvieran correlacionados. Según las conclusiones del capítulo

4, se deduce que por un lado, los valores de glifosato hallados en las muestras no

producirían daño oxidativo en los organismos; de hecho, los valores medidos están muy

por debajo de la CE50 calculada para el nematodo. Por otro lado, puesto que se

evidenció toxicidad en las muestras (revelado en el índice de categorización de efectos

tóxicos) se pone de manifiesto que hay otros compuestos que no se están midiendo y

que afectarían a la calidad del agua. No solamente las sustancias desconocidas que haya

en las muestras podrían ser responsables de los efectos tóxicos, sino también la

interacción entre ellas.

En el caso de la cuenca del río Tunuyán el bioensayo con C. elegans confirmó en

primer lugar diferentes calidades del agua en las dos subcuencas, estando la inferior más

contaminada que la superior. Sin embargo el punto de muestreo de VU exhibió una

calidad similar a la de la inferior a pesar de pertenecer a la superior. En este sentido, el

bioensayo fue útil para identificar posibles situaciones de riesgo toxicológico. Por

ejemplo, se observaron condiciones en las cuales los parámetros fisicoquímicos y

bacteriológicos no presentaban valores de riesgo y en consecuencia el índice calidad de

agua era muy bueno y, sin embargo, los nematodos no crecieron como los controles.

Esta conclusión es muy relevante pues ratifica la necesidad de incluir análisis

ecotoxicológicos en monitoreos rutinarios puesto que de lo contrario, se podría estar

sobreestimando la calidad de las muestras de agua.

En segundo lugar, se observó un efecto tóxico drástico en el crecimiento del

nematodo durante noviembre y diciembre, probablemente asociado no sólo con la

variabilidad ambiental, sino también con un aumento en el uso antrópico del agua en

esos meses. Los análisis estadísticos multivariados confirmaron que los estudios

152

tradicionales de calidad del agua no predicen estos efectos sobre los organismos vivos.

Si bien el ICA es una herramienta bien adoptada para evaluar el estado del recurso

hídrico, también revela que la batería de parámetros fisicoquímicos y bacteriológicos

con los que se construye, exhibe serias limitaciones a la hora de comprender la situación

toxicológica del agua. Esto puede ser debido al hecho de que el ICA está sesgado a los

parámetros normalizados que no deben superar los límites de regulación, pero no

considera otros compuestos no regulados. De manera general, son herramientas que nos

dan información sobre la calidad del agua, pero a la luz de los resultados queda

demostrado que no son suficientes para evaluar el estado toxicológico o predecir la

presencia de posibles contaminantes y sus interacciones.

La evaluación ecotoxicológica de un cuerpo de agua debe ser abordada

interdisciplinarmente. Los resultados de esta tesis indican que los ensayos

ecotoxicológicos son herramientas que permiten evaluar diversas sustancias y también

el efecto de muestras ambientales simples o complejas sobre las respuestas de los

sistemas biológicos. Más aún, a través de este trabajo se ponderó la importancia de su

uso en los monitoreos tradicionales de agua. El hecho de haber encontrado resultados

similares en dos cuencas hidrogeográficas distintas y con dos realidades

socioeconómicas diferentes, es muy relevante. Este tipo de ensayos pueden

complementar los análisis tradicionales, alertando sobre los sitios cuyas aguas puedan

ser tóxicas para ciertos organismos. De hecho, en este estudio la respuesta de C. elegans

fue particularmente útil para detectar toxicidad en ambas cuencas, incluso cuando los

parámetros del agua cumplían con los requisitos reglamentarios y la calidad de la misma

se presentaba como adecuada. La mera cuantificación de contaminantes o índices de

calidad de aguas aporta solo información parcial, si bien muy valiosa. En este sentido, el

bioensayo de crecimiento relativo de C. elegans como parámetro rápido y sensible, es

153

una herramienta toxicológica prometedora ya que ha sido demostrado que puede

determinar el impacto de dosis bajas de un contaminante o de una mezcla compleja

presente en las muestras de agua, que de otra manera podría pasar desapercibida.

En consecuencia, se concluye que la visión integral de la calidad de agua viene

dada por el análisis conjunto de parámetros fisicoquímicos y ecotoxicológicos que

permite establecer una relación entre los elementos presentes en los cursos de agua y su

impacto sobre la biota acuática y la salud del hombre. De esta manera se proporciona

una evaluación más realista de los riesgos ambientales y sanitarios asociados a las

crecientes interacciones de las actividades humanas con los ecosistemas. Esta

información integral podrá constituir un aporte para futuros diseños de planes de

estudio, caracterización y monitoreo a fin que pueda ser utilizada por diferentes

organismos gubernamentales para la gestión de recursos hídricos y protección de la

salud del hombre (Ouyang et al., 2016). Asimismo se podrá avanzar en la formulación

de protocolos de evaluación integral de la calidad de agua, poniendo esta herramienta a

disposición de la autoridad pertinente (como pueda ser la Dirección General de

Irrigación). Esto cobra además mucha importancia en sitios donde las partidas

presupuestarias destinadas a monitoreo y evaluación de la calidad del agua son

limitadas. Atendiendo al ámbito internacional esta es la línea que se está siguiendo

actualmente, de hecho en la Directiva Marco del Agua Europea se han establecido un

conjunto de lineamientos para la gestión sostenible e integrada de los recursos hídricos,

en el que la información ambiental sensible de datos biológicos y ecológicos desempeña

un papel fundamental (EC, 2000). Otras organizaciones ambientales tales como la Red

de Agua de Canadá y la Ley de Agua Limpia de la USEPA han desarrollado

legislaciones que garantizan la seguridad y gobernabilidad del agua basadas en estudios

integrados (Bakker & Cook, 2011; USEPA, 2015). Esta perspectiva global en la gestión

154

de los recursos hídricos contribuirá a la toma de decisiones para proteger el ambiente y

la salud de la población.

Perspectivas futuras:

En la cuenca de Pergamino actualmente se está trabajando (el laboratorio de

nematología aplicada de la cátedra de Bioquímica de la Facultad de Agronomía,

Universidad de Buenos Aires) en la identificación de otros contaminantes y la

realización de análisis microbiológicos para complementar el análisis actual de

evaluación del impacto sobre el agua. Se prevé investigar si en las situaciones de campo

se observa variación en la expresión génica debida a estrés oxidativo causado por

contaminantes ambientales.

En la provincia de Mendoza se va a continuar con los monitoreos de las cuencas

de los ríos Tunuyán y Mendoza. El análisis de las muestras de agua se aborda desde los

parámetros fisicoquímicos y bacteriológicos incluyéndose ahora también el bioensayo

aquí presentado, para un análisis más completo.

Se está trabajando (el laboratorio de nematología aplicada de la cátedra de

Bioquímica de la Facultad de Agronomía, Universidad de Buenos Aires, junto con

técnicos del Instituto Nacional del Agua) en el desarrollo de un ICA que combine los

parámetros rutinarios que se vienen utilizando hasta ahora en los monitoreos

tradicionales pero que tenga integrado como un parámetro más los datos de crecimiento

relativo del nematodo, con el fin de determinar el estado real de la calidad del agua.

Se propone avanzar en el uso de esta herramienta como método estandarizado

para la evaluación integral de calidad de aguas en diferentes regiones agrícolas e

industriales del país, aprovechando que en muchos territorios las cámaras de

productores cuentan con servicios privados de monitoreo de calidad del agua y el

ambiente. Por tanto, incorporar esta tecnología podría ser de mucho interés para estas

155

organizaciones. El avance en esta línea de investigación podría significar aportes al

establecimiento de directrices de control y monitoreo en una futura Ley Nacional de

Aguas, como está previsto en los Principios Rectores 6 y 7.

A partir de ahora queda una línea de trabajo abierta para llevar a cabo

experimentos con muestras de agua que procedan de diferentes puntos ambientales,

susceptibles de contener glifosato. Esto podría hacerse para otros contaminantes

también; de manera que se puedan establecer protocolos para la determinación de la

contaminación basados en la detección de actividad de la catalasa u otros genes de

respuesta a estrés oxidativo. La identificación de esos genes puede ser útil en un futuro

para el desarrollo de biomarcadores o genes sensores de contaminación en muestras

ambientales de agua.

156

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180

APÉNDICES

181

Apéndice 1. Normativa internacional en materia de agroquímicos.

Normativa con consecuencias operativas directas en el manejo de plaguicidas

Codex Alimentarius, Comité del Codex sobre Residuos de Plaguicidas.

Protocolo de Montreal: Tratado para la protección de la capa de ozono, reduciendo la producción y consumo de numerosas sustancias.

Convenio de Basilea: Trata sobre el control de los movimientos transfronterizos de los desechos peligrosos y su eliminación.

Convenio de Rotterdam: Procedimiento de consentimiento fundamentado previo, aplicado a ciertos plaguicidas y productos químicos peligrosos objeto de

comercio internacional (1998).

Convenio de Estocolmo: Contaminantes orgánicos persistentes (2001).

Normativa que proporciona un contexto de política general sobre manejo de plaguicidas

Convenio sobre la Seguridad en la utilización de los Productos Químicos en el Trabajo (1990).

Declaración de Río sobre el Ambiente y el Desarrollo, proclamada por la Conferencia de las Naciones Unidas sobre el Ambiente y el Desarrollo (1992).

Programa 21: Programa de Acción Mundial para el desarrollo sostenible (cap. 14: Fomento de la Agricultura y del Desarrollo Rural Sostenibles; cap. 19:

Gestión ecológicamente racional de los productos químicos tóxicos, incluida la prevención del tráfico internacional ilícito de productos tóxicos y peligrosos)

(1992).

Convenio sobre la Diversidad Biológica (1992).

Convenio sobre la Prevención de Accidentes Industriales Mayores (1993).

Declaración de Roma sobre la Seguridad Alimentaria Mundial y Plan de Acción de la Cumbre Mundial sobre la Alimentación (1996).

Declaración Mundial de la Salud (1998).

182

Apéndice 2. Normativa nacional ambiental. Uso y comercialización de plaguicidas.

Normativa Nacional

Legislación básica vigente

Ley General del Ambiente No25.675

Decreto Ley Nº 3489/58: Establece el control de la Secretaría de Agricultura

para la venta de productos químicos o biológicos y sus coadyuvantes,

destinados a tratamientos de los enemigos animales y vegetales de las plantas

cultivadas. Fija la obligación de registro bajo la condición que estipule la

reglamentación.

Resolución Nº 871/2010: Establece definiciones y requisitos de inscripción de

los productos denominados Línea Jardín.

Decreto Nº 5769/59: Reglamenta el Decreto Ley anterior. Indica los productos

que se considerarán como especialidades de terapéutica vegetal. Fija los

requisitos para la inscripción de empresas, marbetes, envases. Crea el Registro

Nacional de Terapéutica Vegetal.

Resolución Aduana 2013/93: Solicitud de autorizaciones de importación al

IASCAV (SENASA) de todos los productos que se identifican por sus

posiciones arancelarias.

Resolución SENASA N° 45/2001: Crea el Registro de Productos

Fitosanitarios Destinados Exclusivamente para la Exportación, en el ámbito

de la Coordinación de Agroquímicos y Biológicos de la Dirección de

Agroquímicos, Productos Farmacológicos y Veterinarios.

Resolución SENASA121/2011: Registro de Packs de Productos Fitosanitarios

y/o Fertilizantes.

Resolución IASCAV (SENASA) 359/96: Establece lista de expertos

toxicólogos y ecotoxicólogos. Fija los requisitos para su habilitación.

Resolución SENASA 500/2003: Sistema Federal de Fiscalización de

Agroquímicos y Biológicos (SIFFAB).

Resolución SENASA 816/2006: Normas para el etiquetado de los productos

fitosanitarios formulados de uso agrícola.

Resolución MINAGRI 7/2013. Creación de un Comité asesor en bioinsumos

de uso agropecuario (CABUA)

Resolución SAGyP No 34/93: Actualización de requisitos de inscripción de

productos de terapéutica vegetal. Impurezas: definición; obligatoriedad de

declaración.

183

Resolución SENASA 783/2005: Procedimiento de inscripción de un técnico concentrado (TK) en el Registro Nacional de Terapéutica Vegetal que lleva la

dirección de agroquímicos, productos farmacéuticos y veterinarios. A los efectos dispuestos en el artículo 1º de la presente resolución, defínase TK como: el

producto obtenido de un proceso de elaboración y que resulta compuesto por: el ingrediente activo, disolventes apropiados e impurezas asociadas al proceso de

síntesis, pudiendo contener pequeñas cantidades de aditivos necesarios. El producto no debe contener tensioactivos.

Resolución SAGyP 350/99: Se aprueba el nuevo texto del “Manual de

Procedimientos, Criterios de Alcances para el Registro de Productos

Fitosanitarios en la República Argentina”.

Resolución SAGyP 1140/94: Incorpora a los usuarios con obligatoriedad de

registro.

Disposición de orden federal 11/85: Reglamenta las características de los

envases de plaguicidas.

Resolución SAGyP 440/98: Se aprueba el “Manual de Procedimientos,

Criterios de Alcances para el Registro de Productos Fitosanitarios en la

República Argentina”. Solo vigente el anexo II en lo que refiere a la

confidencialidad de la información y el estado de productos bajo patente.

Resolución SENASA 532/2011. Prohíbase la elaboración, importación,

exportación, fraccionamiento, comercialización y uso de diversas sustancias

activas, para uso agropecuario.

Resolución SENASA 369/2013. Créase el Sistema de Trazabilidad de

Productos Fitosanitarios y Veterinarios.

Resolución SENASA 821/2011. Aprueba el listado de coadyuvantes de

formulación, no permitidos en productos de uso agrícola sujetos a inscripción

en el Registro Nacional de Terapéutica Vegetal.

Resolución SENASA 299/2013. Créase el Sistema Federal Integrado de

Registros de Aplicadores de Productos Fitosanitarios.

Normas que fijan Límites Máximos de Residuos y establecen prohibiciones

Ley del Poder Ejecutivo Nacional 17751/68: Prohibición de plaguicidas en

base a dieldrin, heptacloro y sus sinónimos y de hidrocarburos clorados.

Ley del Poder Ejecutivo Nacional 20418/73: Establece las Tolerancias y

Límites Administrativos de Residuos de plaguicidas en productos y

subproductos de la agricultura y la ganadería.

Ley del Poder Ejecutivo Nacional 18796/89: Determinación de residuos de

plaguicidas.

Resolución SENASA 934/2010. Requisitos que deben cumplir los productos y

subproductos agropecuarios para consumo interno. Además fija los límites

máximos de residuos de los productos fitosanitarios.

Ley del Poder Ejecutivo Nacional 18073/69: Prohibición de sustancias

capaces de afectar la salud humana y animal (dieldrin, endrin, heptacloro y

HCH) para el tratamiento de praderas naturales y artificiales. Establece los

LMR de plaguicidas en productos y subproductos agropecuarios.

Disposición S.N.S.V. 79/78: Prohibición de aplicación de insecticidas

formulados con dieldrin, endrin, heptacloro, clordano, HCH, metoxicloro,

canfenoclorado y DDT en ciertos cultivos.

184

Disposición de orden federal 48/72: Prohibición de gorgojicidas

organoclorados, Prohibición de insecticidas organoclorados, en granos y

subproductos para alimentación animal.

Resolución SAGPyA 750/2000: Prohíbase la producción, importación,

fraccionamiento, comercialización y uso de las sustancias activas HCB

(hexaclorobenceno), canfeclor, metoxicloro, dinocap, fenil acetato de

mercurio, talio y sus compuestos, y pentaclorofenol y sus sales, así como

también los productos fitosanitarios formulados en base a estos.

Resolución 1030/92: Prohibición total de heptacloro.

Disposición de orden federal 03/83: Prohibición del tratamiento con

plaguicidas fumigantes a granos, productos y subproductos de cereales y

oleaginosas, durante la carga de camiones o vagones y su tránsito hacia

destino. Modificaciones en marbetes.

Resolución 606/93: Prohibición total metilparathión, etilparathión.

Resolución SAGPyA 20/95: Fija límites máximos de presencia de residuos en

productos y subproductos vegetales.

Resolución 10/91: Prohibición de uso en cultivos hortícolas y frutícolas de

principios activos: monocrotofos, metil-paratión, etil-parathion, metil-azinfos,

etil-azinfos. Prohibición de uso en perales, manzanos y durazneros de

principios activos etion, carbofuran y disulfoton. Prohibición de heptacloro

como polvo mojable o suspendible. Prohibición de hexaclorobenceno como

terápico de semillas.

Listado de principios activos prohibidos y/o restringidos

Dentro de este listado, encontramos la prohibición total del uso de Endosulfan (Resolución SENASA Nº 511/2012).

Otras normas

El Instituto Argentino de Racionalización de Materiales (IRAM) ha desarrollado normas que tienden a un racional control de calidad de las

formulaciones de plaguicidas

Norma IRAM 12.151: Formulaciones de plaguicidas. Plan sistemático de control. Calificación de resultados de análisis y clasificación en categorías.

Norma IRAM 12150: Formulaciones de plaguicidas aplicables en medio acuoso. Método biológico de laboratorio para ensayar su toxicidad simulando

aplicaciones de alto volumen.

Norma IRAM 12074: Plaguicidas, formulaciones armonizadas.

185

Apéndice 3. Normativa nacional e internacional de calidad de aguas para la construcción

del ICA de la región pampeana

Normativa de

aguas

T°C pH Cl-

mg L-1

Cu2+

mg L-1

NO3-

mg L-1

SO42-

mg L-1

Zn2-

mg L-1

CrTot

mg L-1

Cd

mg L-1

Mn

mg L-1

FeTot

mg L-1

Glif.

µg L-1

Decreto 831/93

Ley 24.051

Protección de la

vida acuática.

Aguas

superficiales.

<0

,002

<0

,03

<0

,002

<0

,000

2

<0

,1

ACUMAR. Uso

de agua IV.

Protección de la

vida acuática.

Aguas

superficiales

<3

0

<0

,002

Res. Nº 42/06.

Autoridad de

aguas de la

provincia de

Buenos Aires.

6,5

-9

<6

25

<6

25

EPA. Criterio

nacional

recomendado de

calidad de agua-

protección de la

vida acuática.

Exposición

crónica.

6,5

-9

<2

30

/<8

60

<0

,12

<0

,074

<0

,000

72

<1

CCME.

Directrices de

calidad de aguas

para la

protección de la

vida acuática.

Exposición

crónica.

6,5

-9

<1

20

/<6

40

<1

3

<0

,03

<0

,001

<0

,000

09

<0

,3

<0

,08

186

Decreto Nº

2126/71 Ley

18.284 para agua

potable (Código

alimentario

argentino).

6,5

-8,5

<3

50

<1

<4

5

<4

00

<5

<0

,05

<0

,005

<0

,1

<0

,3

Glif. = glifosato. * Criterio de salinización: CE (µS/cm) <1500 moderada salina. Exposición crónica o

aguda (en rojo).

187

Declaro que el material incluido en esta tesis, es a mi mejor saber y entender, original

producto de mi propio trabajo (salvo en la medida en que se identifique explícitamente

las contribuciones de otros) y que este material no lo he presentado, en forma parcial o

total, como una tesis en esta u otra institución.

Copyright © 2017 por Araceli M. Clavijo Lara. Todos los derechos reservados.