Las Recomendaciones de la OIE para la Validación aportan información detallada y ejemplos que

respaldan la norma de validación de la OIE publicada como Capítulo 1.1.5 del Manual Terrestre, o

como Capítulo 1.1.2 del Manual Acuático. El Término “Norma de Validación de la OIE” de esta

Capítulo hace referencia a estos capítulos.

Para el diagnóstico de enfermedades infecciosas tanto en varias especies animales y como en el

hombre se están utilizando cada vez más pruebas de detección de ácido nucleico (NAD). Los

métodos más frecuentes son la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), de la cual existen

distintas variantes, y los métodos de amplificación isotérmica (como la amplificación isotérmica

mediada por bucle). Además, están apareciendo chips de ADN de fase líquida o de fase sólida que

son nuevas herramientas de diagnóstico basadas en la biotecnología. Las técnicas de

amplificación que se utilizan en estas pruebas les confieren una sensibilidad analítica alta. Los

productos de la reacción de amplificación pueden detectarse de muchas formas distintas, como por

ejemplo, por visualización en geles de agarosa, utilizando sondas marcadas (como las sondas

TagMan), mediante detección de la acumulación de los productos en tiempo real o utilizando chips

donde se captura sondas específicas en una matriz de superficie sólida o en perlas (Lauerman,

2004; Viljoen et al., 2005). Pueden ejecutarse al mismo tiempo distintas PCR para detectar varios

analitos en un mismo tubo o para combinar analitos y controles que generen distintos productos de

la amplificación, todos en un solo recipiente de reacción. Aunque ello tiene evidentes ventajas,

debe procederse con mucho cuidado durante la optimización para asegurarse de que no se

comprometa el rendimiento diagnóstico de la prueba. De forma similar, puede crearse una PCR de

múltiples resultados empleando un conjunto de cebadores, pero utilizando sondas marcadas que

se unan a distintas secuencias diana en función de la especie o cepa que detecte la PCR (Wakeley

et al., 2005; 2006).

Las técnicas de amplificación para la NAD suelen basarse en el principio de que hay una

amplificación exponencial de la secuencia específica que se pretende detectar en la reacción. Ello

aporta una NAD con sensibilidad y especificidad analíticas altas. Debido a este característico nivel

alto de sensibilidad logrado con la NAD, debe procederse con cuidado y, de hecho, deben

emprenderse pasos preventivos especiales para impedir la contaminación de la NAD por

amplicones en los análisis de las siguientes muestras. Es más probable que ello suponga un

problema cuando en el laboratorio se abren los tubos de reacción para un posterior procesado, por

ejemplo para analizar geles o para llevar a cabo pruebas anidadas. Para evitar tal contaminación,

deben aplicarse estrictos protocolos de laboratorio que incluyan salas o cabinas independientes

para cada fase de las pruebas, cambios de batas y guantes de laboratorio y rigurosos programas

de limpieza (Viljoen et al., 2005; Subcommittee of Animal Health Laboratory Standards). Por estos

motivos, las pruebas que se basan en sistemas de tubo cerrado en general son más adecuadas

para el diagnóstico (Sawyer et al., 2006). Como ocurre con todas las pruebas, es importante utilizar

protocolos adecuados para demostrar que la prueba está ofreciendo el rendimiento diagnóstico

esperable. Es necesario conocer sin duda la procedencia de las muestras que se utilicen en el

desarrollo de la prueba, y el desarrollo debe realizarse en el contexto de un sistema de calidad que

permita asegurar unos niveles adecuados de formación, mantenimiento y seguimiento del equipo,

etc. (Burkhardt, 2000).

Lo primero a tener en cuenta al desarrollar una prueba es la necesidad de definir claramente el propósito y aplicación concreta de la prueba en cuestión, y de saber cómo se aplicará, porque de ello dependerán muchas decisiones que se tomen a lo largo de la fase de desarrollo. Por ejemplo, podría desarrollarse una prueba de cribado para detectar todos los subtipos o variantes de influenza aviar (IA) en las aves, para lo cual sería necesaria una prueba inclusiva que reaccionara ampliamente, o bien puede desarrollarse una prueba para determinar el tipo de hemaglutinina, en cuyo caso será necesaria una prueba más específica. En algunas pruebas, el requisito es detectar un grupo de virus, como en el caso de las PCR que detectan todos los pestivirus, útiles para detectar los virus de la diarrea vírica bovina (DVB), la

enfermedad de la frontera (EF) y la peste porcina clásica (PPC). En otras pruebas, el requisito podría ser la detección de un solo agente patógeno, o a veces incluso permitir un enfoque DIVA (es decir, que distinguiera entre animales infectados y vacunados). Un ejemplo de este tipo de método es la PCR en tiempo real que se ha publicado recientemente para el virus de la PPC, que se desarrolló para la distinguir genéticamente entre el jabalí infectado de forma natural y el vacunado (Liu et al., 2009).

Es importante que las pruebas se desarrollen en laboratorios en los que se apliquen rigurosas normas de garantía y control de calidad (véase el Capítulo 1.1.3 Gestión de la calidad en los laboratorios de pruebas veterinarias del Manual Terrestre). Los datos de validación del rendimiento y la exactitud

diagnóstica de la prueba que se determinan durante la fase de desarrollo y validación deben ser robustos, porque constituyen la base para la interpretación del estado de la población respecto a la enfermedad y las consecuentes acciones a emprender cuando la prueba se utiliza de forma rutinaria.

Elección de la muestra (véase el Capítulo 1.1.1 Recogida, presentación y almacenamiento de muestras para el diagnóstico del Manual Terrestre).

En la mayoría de enfermedades, es probable que las muestras necesarias para las pruebas de NAD sean similares a las que se utilizan para los métodos actuales de detección, como el cultivo o el aislamiento vírico. Por ejemplo, en la detección mediante RT-PCR en tiempo real y el aislamiento vírico de la IA se utilizan las mismas muestras. Recientemente, se ha demostrado que el hisopado de cortes frescos de muestras de órganos es un enfoque práctico que sustituye a la laboriosa homogenización de las muestras de órganos. De forma similar, existe una tendencia a utilizar muestras como la saliva, que pueden obtenerse mediante métodos no invasivos, para detectar el síndrome disgenésico y respiratorio porcino (SDRP) en el cerdo (Prickett et al., 2008) o muestras de leche de tanque para determinar el estado del rebaño respecto a la DVB. Antes de escoger muestras combinadas, como la leche de tanque, los responsables de desarrollar una prueba deben tener en cuenta y evaluar las implicaciones que tendrá la dilución del analito en cuestión en la sensibilidad diagnóstica, y añadirlas al plan de validación (véase abajo).

Es importante conocer la biología del agente patógeno en cuestión y con qué dispositivos se obtendrá la muestra. Como en el caso de la IA, cada subtipo o variante de los virus tienen distintos puntos de preferencia en las aves hospedadoras. Por ejemplo, las muestras cloacales son adecuadas para ciertos subtipos, mientras que las bucales zona aceptables para otros. Por lo tanto, una prueba que vaya a utilizarse en un programa de vigilancia debe especificar los puntos de muestreo, y debe

Propósito de la prueba:

¿Es la prueba de cribado, confirmativa o para ambos fines?

¿Sirve la prueba para detectar un grupo de agentes patógenos?

¿Sirve la prueba para detectar un solo agente patógeno?

¿Sirve la prueba para distinguir entre animales vacunados y animales infectados?

What kinds of samples will be used from the target population?

What are the predilection sites for the agent in the host?

What sample collection, storage and transport methods are anticipated and what are the possible effects on results?

Will samples be single or pooled?

Will samples in the validation panel be representative of the target population?

validarse con ambos tipos de muestra. Otro factor importante es la matriz en la cual reside el analito en el hospedador. En las muestras cloacales es más probable encontrar inhibidores de la PCR que en las muestras bucales. Otro posible factor de confusión es el tipo de hisopo que se utiliza para obtener las muestras; algunos contienen materiales que inhiben las PCR. Así pues, es muy importante especificar claramente qué muestra se prefiere y describir detalladamente los hisopos a utilizar y el protocolo de hisopado, incluidos los tampones y los medios de transporte de elección, así como las condiciones de almacenamiento.

También debe tenerse en cuenta si las muestras van a analizarse individualmente o de forma combinada, y si las combinaciones deben ser de distintas muestras de un mismo animal o de diferentes animales. Todas las estrategias de combinación deben definirse con detalle y estar validadas antes de su aplicación. Por último, si la población de destino es “aves”, el estudio de validación deberá cubrir una gran población representativa de distintas especies para demostrar que la prueba es ampliamente aplicable, aunque se concentre en las especies más prevalentes o en las que se utilizan como centinelas de la infección.

En el caso de las actividades de vigilancia, pueden analizarse primero grandes cantidades de muestras mediante una prueba de cribado. En el ejemplo anterior de la IA, la prueba de cribado descrita debe detectar todos los subtipos o variantes conocidos de influenza A, de una región concreta o de todo el mundo. La prueba debe ser muy sensible, para que no pase por alto muestras realmente positivas, y debe tener especificidad analítica (ser inclusiva) para poder detectar todos los virus del grupo de la influenza A.

La influenza A es una enfermedad de perfil alto. En el caso de que una prueba nueva dé muchos falsos positivos que no puedan confirmarse por ningún otro medio, será difícil determinar el estado de las aves respecto a la infección. Por lo tanto, es fundamental excluir los agentes íntimamente relacionados que no sean de interés en cuanto al propósito previsto para la prueba.

Para seguir con el ejemplo del cribado respecto a la IA, también es importante que la prueba produzca resultados rápidos, de tal modo que puedan aplicarse cuanto antes las medidas de control de la enfermedad. Así pues, para la detección de la influenza aviar, lo lógico sería elegir una PCR en tiempo real utilizando sondas TaqMan o una prueba de campo. En el caso de una prueba de cribado respecto a la IA, es probable que los cebadores y las sondas se basen en el gen de la Matriz (M) que se sabe que se encuentra en todas las cepas de influenza de tipo A. En función de la idoneidad para el propósito previsto, los científicos pueden optar por desarrollar otra prueba que se utilice junto con la de cribado para determinar qué cepa concreta de IA se encuentra en la muestra y si la cepa es altamente patógena, porque ello influye en gran medida en los requisitos de notificación y en las medidas de control que a continuación podrían establecerse. Algunos métodos analíticos podrían calificarse como herramientas analíticas secundarias que se aplican al analito detectado en las pruebas primarias, y podrían utilizarse para caracterizar con mayor detalle el producto que se ha detectado en la prueba de cribado (véase la Norma de Validación de la OIE, Sección B.1.4).

Un ejemplo de este tipo de método analítico sería el análisis de secuencias de la matriz del amplicón obtenido mediante PCR que se ha detectado durante la prueba de cribado respecto a la IA. Para desarrollar pruebas confirmativas pareadas, como las de PCR en tiempo real, que detecten otros genes, como los de la hemaglutinina o la neuraminidasa en los virus de IA con el fin de identificar el subtipo o el fatotipo, sería necesario someterlas también a todos los pasos de desarrollo, optimización y validación. Recientemente, en el Centro Colaborador de la OIE para el Diagnóstico de Enfermedades Infecciosas por Biotecnología, de Upsala, Suecia, se ha desarrollado una PCR novedosa basada en plexo y cebadores. Esta prueba permite la determinación simple y rápida de distintos fatotipos de virus de ARN. Por ejemplo, pueden detectarse virus de la influenza aviar y de la enfermedad de Newcastle y evaluarse con un

¿Se va a utilizar la prueba solo en una zona concreta o bien en todo el mundo?

¿Es suficientemente sensible y el objetivo a analizar es lo bastante inclusive para no pasar por alto muestras positivas?

Debe tenerse en cuenta la influenza de una proporción alta de falsos positivos que no pueden confirmarse

¿Es posible y/o necesaria una rapidez de los resultados?

¿Se utilizarán las pruebas (una herramienta analítica) para determinar/confirmar el fatotipo (cepa) del agente patógeno?

¿Tendrá la determinación de la cepa un peso importante en la acción emprendida?

equipo de bajo coste (máquina de PCR) y en muy poco tiempo (menos de tres horas), en laboratorios equipados de forma sencilla o incluso a pie de explotación, en condiciones de campo, durante un brote (Leijon et al., 2011; Yacoub et al., 2012). Ello indica un desarrollo y simplificación muy rápidos en el ámbito de las pruebas de NAD para el diagnóstico en condiciones de campo o a pie de explotación.

El método debe diseñarse cuidadosamente para cumplir el propósito definido inicialmente. Los factores importantes a tener en cuenta son la aplicación, los tipos y las cantidades de muestras a analizar. Ello, a su vez, comporta planteamientos de tipo logístico y práctico respecto a la prueba candidata, como si se llevará a cabo en un laboratorio, con o sin automatización para lograr una alta capacidad de procesado de muestras por unidad de tiempo, o en condiciones de campo empleando una prueba a pie de explotación. Debe aprovecharse toda la información disponible, como publicaciones, secuencias depositadas en bases de datos y datos de secuencia internos. Existen programas informáticos sofisticados que sirven para optimizar el diseño de cebadores y sondas; un primer paso consiste en el cálculo informático de secuencias probables para su uso en la prueba.

Antes de emprender la validación de un prototipo de prueba recientemente desarrollado, debe llevarse a cabo un estudio de viabilidad empleando un grupo pequeño de unas seis u ocho muestras bien caracterizadas para comprobar si el sistema es viable. Este grupo de muestras debe consistir en muestras representativas de todo el intervalo de funcionamiento de la prueba, es decir, debe haber al menos dos muestras negativas, al menos dos muestras débilmente positivas y, a ser posible, muestras que se sitúen en la parte central del intervalo. Lo ideal es que estas muestras procedan de distintos animales. La prueba debe ofrecer la máxima separación posible entre los resultados analíticos de las muestras fuertemente positivas y de las negativas de este grupo. Llegados a este punto, tal vez sea útil analizar una serie de diluciones (analito diluido en la matriz), con el fin de evaluar la sensibilidad analítica relativa si la prueba es una posible sustituta de otro método en el que la sensibilidad sea un criterio importante (véase el Capítulo 3.6.8 Comparabilidad entre pruebas tras pequeños cambios en un método analítico validado).

El objetivo de esta fase es definir y optimizar el método que se aplicará para llevar a cabo la prueba en futuros análisis rutinarios. Ello incluye la descripción de instalaciones adecuadas para ejecutar la prueba. Es importante tener en cuenta tanto el método de extracción de la muestra exigido para preparar muestras para la

prueba como el procedimiento analítico. En cualquier PCR es necesario definir protocolos de sala limpia para minimizar la contaminación. Si se prevén grandes cantidades de muestras, puede resultar fundamental elegir un procedimiento de extracción automatizada (Jungkind, 2001).

Normalmente es necesario evaluar varias metodologías analíticas distintas y variar las concentraciones de los reactivos, las adiciones de molde y los tiempos de reacción para optimizar la extracción y la prueba. Es importante cambiar solo una variable cada vez o bien utilizar un diseño y análisis multifactorial (véase la Norma de Validación de la OIE, Sección A.2.5 sobre Robustez). Es importante determinar qué factores tienen solo un intervalo estrecho de actividad óptima, puesto que estos son puntos cruciales en el procedimiento analítico y pueden afectar a la robustez de la prueba.

¿Se ha evaluado la prueba primero en un grupo pequeño de muestras (seis a ocho muestras) para evaluar la viabilidad del enfoque?

¿Ha habido Buena separación entre los resultados del análisis de muestras negativas y de muestras positivas?

¿Se ha preparado una prueba preliminar con una serie de diluciones en la matriz para evaluar la sensibilidad analítica relativa preliminar?

¿Cuál es la ubicación óptima? Una sala o cabina limpias para minimizar la contaminación

¿Cuál es el método óptimo de extracción de muestras para prepararlas? ¿Se realiza manualmente o por automatización?

¿Se ha comprobado si las concentraciones de reactivos dan una reactividad óptima?

¿Se ha optimizado la extracción?

¿Cuáles son las adiciones de molde y los tiempos de reacción para optimizar la prueba?

¿Qué factores tienen un intervalo óptimo de funcionamiento estrecho? - ¿Está este intervalo definido?

En general, las fases de la prueba son relativamente sencillas de optimizar, pero hay que tener cuidado de garantizar una extracción robusta del ácido nucleico, y todos los reactivos de la prueba, y de que los pasos del procedimiento se optimicen y sean adecuados para la aplicación sistemática de la prueba en el laboratorio (Burkhardt, 2000).

Los controles para la PCR son muchos y variados. Es importante incluir los controles adecuados para comprobar que la prueba está rindiendo como era esperable. Los controles que deben tenerse en cuenta son los siguientes:

Este control permite comprobar que la especie de destino se ha muestreado adecuadamente. En el ejemplo de la prueba de cribado respecto a la IA, el control verifica que el hisopo con la muestra ha estado en contacto con una especie de destino y que la muestra contiene ácido nucleico de “ave”, que está disponible para su extracción mediante el protocolo definido. Una posible diana para este control es un gen de mantenimiento como el de la beta actina, que está presente en la especie hospedadora de destino. Es algo relativamente sencillo si la especie hospedadora es solo una, como por ejemplo, el pollo, pero será más difícil hallar una diana adecuada para todas las muestras de “ave”. Este tipo de control puede no ser necesario si una muestra se añade directamente al proceso de extracción, como un trozo de tejido o sangre, pero se recomienda para muestras “indirectas” como las que se obtienen mediante hisopo; en este caso, debe utilizarse el control respecto a la especie hospedadora en cada muestra analizada.

Este control revela si se ha producido contaminación de la muestra, dando lugar a un producto amplificado cuando no debería haber producto amplificado, como en el caso de las muestras que no contienen la sustancia a detectar. Debe tenerse en cuenta el número y posición de los controles sin molde. En general, se distribuyen aleatoriamente varios controles sin molde (en alrededor de un 5% de los pocillos) durante la prueba o por la placa cuando se utilizan formatos de placas de 96 y de 386 pocillos.

Este control positivo, que tiene una actividad de ciclo umbral (Ct) de la PCR en tiempo real situada dentro del intervalo de funcionamiento definido para la prueba, se utiliza en cada placa. Una buena opción para este control podría ser un plásmido que contenga la secuencia diana, que puede utilizarse para comprobar si el nivel de amplificación de la prueba es el esperable. No obstante, no permite evaluar la eficacia del proceso de extracción, que requiere una muestra de campo conocida o su equivalente (como una muestra de una infección experimental).

Este control es necesario para detectar posibles inhibidores de la PCR. Si un control de la inhibición da un resultado negativo, este permite deducir que la muestra contiene sustancias inhibitorias y que un resultado negativo en la prueba no podrá interpretarse como “negativo” porque la prueba no ha funcionado correctamente. Ciertas muestras, como las heces o el semen, a menudo contienen inhibidores, mientras que ello puede ser menos problemático cuando se analizan muestras de sangre o microorganismos procedentes de cultivo (Ballagi-Pordány & Belák, 1996). Los datos que se obtienen durante el proceso de validación relativo al rendimiento diagnóstico de la prueba, a partir de las matrices de muestra previstas, permitirán tomar una decisión, basada en el riesgo, acerca de si debe incluirse un control de la inhibición para cada muestra o si es improbable que el sistema analítico resulte afectado por la inhibición. Si las sustancias inhibitorias son un problema importante, deberá incluirse un control de la inhibición para cada muestra analizada.

¿Se han tenido en cuenta tanto las ventajas como los inconvenientes de incluir un control interno?

¿Está claramente especificado en el protocolo de la prueba el propósito y la aplicación del control de la inhibición?

¿Se han incluido todos los controles necesarios para demostrar que la prueba está rindiendo como era esperable?

¿Control del molde?

¿Control de la inhibición?

¿Control de muestra positiva?

En el caso de pruebas de ARN - ¿Control de la transcripción inversa?

Existe un considerable debate acerca de cuál es el control de la inhibición más adecuado y efectivo. Se ofrecen los siguientes ejemplos:

i) Una diana artificial, como un segmento de ADN incluido en un plásmido, que se añade a la muestra extraída y se amplifica con los mismos cebadores que la diana de la prueba, pero que tiene diferente tamaño o contiene una secuencia interna distinta, de tal modo que es identificada como control interno cuando se aplica el método de detección (Sawyer et al., 2006). La ventaja de este enfoque es que utiliza los mismos cebadores que se utilizan en la prueba, y el control puede añadirse a concentraciones precisas. Dado que la diana para la prueba es la misma que para el control, la competición por el cebador y las dNTP puede reducir el rendimiento analítico de la prueba. Durante la optimización de la prueba debe procederse con cuidado, de tal modo que la sensibilidad analítica de la prueba no quede afectada negativamente. Otro inconveniente es que, como componente añadido, este control solo verifica la fase analítica de la prueba y no actúa como control para la fase de extracción.

ii) Una estrategia alternativa para un control de inhibición es amplificar un gen de mantenimiento o estructural, como el de la β-actina, que siempre está presente en el tejido analizado, y por tanto, en la muestra. Si el gen de mantenimiento se ha inhibido por sustancias de la muestra, se deduce que la amplificación del gen que se pretende encontrar con la prueba también podría estar inhibido. Pero esta conclusión no siempre está justificada. Los genes de mantenimiento a menudo se encuentran en abundancia, de tal modo que a veces pueden detectarse incluso en presencia de sustancias inhibitorias, mientras que la amplificación de cantidades más bajas de las secuencias que se pretende encontrar con la prueba podría resultar inhibida. En este caso, el gen de mantenimiento amplificado y detectado no sería un control suficiente para los inhibidores, lo cual daría lugar al riesgo de deducir que el resultado de la prueba es un falso negativo. No obstante, si se conoce el alto riesgo que se corre con los genes de mantenimiento, que están presentes en la muestra de forma natural, estos genes pueden constituir un control útil de los inhibidores durante toda la prueba, incluidos el muestreo, el almacenamiento y la extracción.

En general, para los métodos de NAD, los cultivos puros, la sangre y la mayoría de tejidos son las muestras de elección porque la extracción y la recuperación de ácido nucleico amplificable en general funciona bien. Las muestras fecales, el semen y el tejido autolisado pueden comportar más dificultades porque en general contienen más inhibidores para las pruebas de NAD. Es fundamental disponer de un procedimiento de extracción de la muestra robusto y repetible, que sea adecuado para las cantidades de muestras que se van a manipular (automatizado, si es necesario), así como utilizar controles de inhibición cuando sea necesarios (véase el apartado anterior).

El intervalo de funcionamiento de la prueba debe determinarse diluyendo una muestra fuertemente positiva y representando en un gráfico el intervalo de resultados obtenidos frente a cantidades conocidas de ácido nucleico (concentración, dilución, número de copias genómicas, etc.). Esta muestra de referencia debe estar en la misma matriz que la muestra problema, es decir, no es correcto determinar el intervalo de funcionamiento de una muestra diluida en tampón si la matriz habitual es la sangre.

Una prueba debe tolerar pequeños cambios en las concentraciones de los reactivos y/o ligeras variaciones en los tiempos y temperaturas de procesado que se utilizan en cada fase, con el fin de poder implementarse eficazmente y aportar resultados reproducibles cuando se utilice en varios laboratorios. Ello puede evaluarse durante la optimización de la prueba, cuando se determinan los pasos críticos del procedimiento, los reactivos y el equipo. Estos factores, que cuando no se respetan causan una variabilidad inaceptable, deben estar bien descritos en el protocolo de la prueba para que se garanticen unos procesos especialmente rigurosos para llevarlos a cabo. Se trata de un proceso laborioso, cuyo seguimiento de la precisión y exactitud en último término se realiza mediante muestras de control interno y externo de la calidad que se analizan con la prueba.

Para determinar el intervalo de funcionamiento de la prueba, ¿se diluyeron las muestras en la matriz para la cual está diseñada la prueba?

¿Cumple el intervalo de funcionamiento de la prueba con las normas esperables para tal prueba?

Teóricamente, deben utilizarse patrones de referencia internacional o nacional para calibrar la prueba. No obstante, no siempre se dispone de dichos patrones, de tal modo que podría ser necesario crear un patrón de referencia interno (véase el Capítulo 3.6.6 de la OIE). Debe crearse un/os patrón/es de trabajo que se pueda incluir en todas las ejecuciones de la prueba, dividirse en alícuotas y almacenarse en cantidades suficientes para poder utilizarlo en cada ejecución del proceso de validación y para su uso rutinario una vez terminada la validación. El/los patrón/es de trabajo podrían ser múltiples alícuotas de una muestra determinada, que pueda/n utilizarse en cada ejecución de la prueba. También podría consistir en un plásmido que contenga la secuencia de interés, añadido en pequeñas cantidades a la matriz de la muestra. El uso de este último sistema permite que quien desarrolla la prueba determine el número de copias de genoma que se puede detectar con la prueba. En algunos casos, los resultados de la muestra problema se “normalizan” por comparación con la/s muestra/s de patrón de trabajo que se incluyen en cada ejecución de la prueba. Ello permite una comparación directa entre los datos obtenidos en distintas ejecuciones (Huggett et al., 2005; y Norma de Validación de la OIE).

Una vez desarrollado y optimizado el protocolo de la prueba, debe fijarse y mantenerse constante mientras se evalúa a lo largo de las distintas etapas de la fase de validación y durante su uso rutinario. Los pequeños cambios realizados en una prueba validada se someten a estudios de comparación para documentar que la prueba sigue rindiendo como se había definido inicialmente (Capítulo 3.6.8 de la OIE: véase la nota 1 a pie de página).

La repetibilidad de la prueba es el grado de acuerdo entre resultados (de una misma ejecución o entre ejecuciones) obtenidos con el mismo método analítico y en un mismo laboratorio. Normalmente, se escoge y analiza un pequeño grupo de tres (preferiblemente cinco) muestras que cubran todo el intervalo de funcionamiento de la prueba, utilizando todo el procedimiento analítico (incluida la extracción de ácido nucleico). La variación dentro de una misma prueba (intra-prueba) se determina analizando múltiples (al menos cinco) réplicas de cada muestra de este grupo en una sola ejecución de la prueba. Las variaciones entre ejecuciones (inter-prueba) se determinan analizando estas muestras en varios días distintos, con los mismos operarios y realizando al menos 20 ejecuciones. El grupo de muestras destinado a determinar la repetibilidad debe analizarse tratando todas las muestras y cada una de sus réplicas exactamente como muestras de diagnóstico individuales, sometiéndolas a todos los pasos, desde la preparación de la muestra hasta el análisis de datos. En consecuencia, cada réplica de cada muestra se someterá a una extracción independiente. Ello permite determinar la repetibilidad, tanto de una ejecución de la prueba como entre ejecuciones que se realicen como se hará en el futuro cuando la prueba se utilice para el diagnóstico. Es importante que haya muy poca variación en la repetibilidad, sobre todo cerca del umbral/es de corte que establece/n los valores positivos, dudosos y negativos, porque una variabilidad más alta puede dar lugar a malinterpretación (véase el Capítulo 3.6.4 Incertidumbre de la medición).

La repetibilidad puede expresarse como un coeficiente de variación (véase el Capítulo 3.6.5 Enfoques estadísticos de la validación). La prueba debe diseñarse de tal modo que el punto de decisión (umbral)

se sitúe en la parte más alta de la curva de ciclos umbrales de la PCR en tiempo real. Si se logra, la repetibilidad será óptima en el punto crítico de la prueba. (Se obtienen CV más altos en los extremos claramente negativos y fuertemente positivos del intervalo de funcionamiento de la prueba pero influyen poco en la interpretación de los resultados).

¿Se ha determinado la repetibilidad para una misma prueba y entre pruebas?

¿Se encuentra la repetibilidad dentro del intervalo aceptable de valores del coeficiente de variación (CV)?

¿Se ha calibrado la prueba respecto a patrones de referencia externos?

Si no se dispone de patrones de referencia externos, ¿se ha creado un patrón de referencia interno?

¿Se han preparado patrones de referencia de trabajo en cantidades suficientes para utilizar en todos los estudios de desarrollo y de validación?

En función del propósito previsto para una prueba, se determina su especificidad analítica mediante la/s secuencia/s genética/s seleccionada/s del/los microorganismo/s que la prueba detecte. La prueba puede diseñarse para ser muy selectiva, con una especificidad analítica para una sola secuencia genética que sepa que no se encuentra en los demás microorganismos o cepas del microorganismo que la prueba detecta. Este tipo de prueba se dice que implica exclusividad y constituye una prueba confirmativa de ASp alta.

Como alternativa, la prueba puede diseñarse para detectar una secuencia genética conservada que sea común a varias cepas de una especie determinada, o a varias especies de un género. Este tipo de prueba tiene una ASp que implica exclusividad, haciéndola útil como prueba de cribado. En el caso de una prueba de cribado inclusiva, la especificidad analítica debe determinarse analizando todos los linajes, cepas, especies, etc., que se espera que la prueba detecte. A continuación, debe comprobarse su capacidad de excluir microorganismos relacionados, como cepas no patógenas que no sean de interés para el propósito previsto para la prueba candidata.

En el ejemplo de una prueba de cribado respecto a la IA, la prueba debe evaluarse utilizando todas las cepas del virus de la IA bien caracterizadas de las que se disponga, para asegurarse de que todas las cepas de varias zonas geográficas y hospedadores se van a detectar (es decir, para demostrar inclusividad). Se suele proceder empleando cepas/cultivos o ácido nucleico extraído procedentes de laboratorio. En el caso de la IA, existen distintos linajes del virus, como el asiático, el europeo o el norteamericano. Es importante tener en cuenta cómo se utilizará la prueba y en qué zonas geográficas. Ello ayudará a determinar si es necesario evaluar solo algunos o bien todos estos linajes.

Este importante requisito se pone rápidamente de manifiesto con las pruebas de fatotipificación de virus de ARN rápidas y sencillas que se han desarrollado recientemente, y que se comprobaron con una gran colección de virus de la IA y la enfermedad de Newcastle procedentes tanto de oriente como de occidente (Leijon et al., 2011; Yacoub et al., 2012) a partir de colaboración entre distintos Centros Colaboradores de la OIE. Otro factor importante es que los virus pueden cambiar rápidamente y las mutaciones resultantes pueden hacer que la prueba diagnóstica se vuelva subóptima. Un ejemplo de ello es la aparición de una cepa pandémica de la Influenza A H1N1 en 2009 y el brote levemente patógeno de IA H7N9 del sur de China de 2013. La sensibilidad analítica de la PCR para el gen M tradicional resultó perturbada para esta cepa porque la secuencia que hacía que la prueba fuera específica había mutado. En la mayoría de países se han introducido nuevos cebadores y se han utilizado como prueba nueva, o bien en combinación con los cebadores tradicionales del gen M a modo de prueba combinada.

La potencia discriminatoria de la prueba debe comprobarse analizando microorganismos relacionados con el virus de la IA. Estos serían agentes patógenos que causen síndromes clínicos similares, como la enfermedad de Newcastle, la bursitis infecciosa, etc., y otros microorganismos que puedan hallarse en la muestra analizada (es decir, para demostrar exclusividad).

Para evaluar la sensibilidad analítica, también denominada límite de detección, se suelen aplicar dos enfoques. El primero consiste en utilizar una serie de diluciones del agente patógeno que se pretende detectar (en este caso, virus de la IA) diluido en la matriz de la muestra y no en tampón. La serie de diluciones suele analizarse empleando la prueba en proceso de validación y un método estándar. En el caso de la IA, el método estándar podría ser el aislamiento del virus u otro método estándar interno de detección. Este enfoque da una medida comparativa de los dos métodos (véase el Capítulo 3.6.5). El segundo enfoque consiste en utilizar un constructo de plásmido que contenga la secuencia diana y analizarlo en una serie de diluciones en la matriz de la muestra. De esta manera, puede estimarse el número de copias del genoma detectable mediante el método analítico.

En algunas ocasiones, no es posible terminar un ejercicio de validación completo por escasez de muestras de las que se sepa si contienen o no el analito (por ejemplo, en el caso de enfermedades

¿Se ha analizado un grupo de la máxima cantidad posible de cepas bien caracterizadas del agente patógeno que se pretende detectar, incluidas cepas de varias zonas geográficas y de varios hospedadores?

¿Se han analizado microorganismos y agentes patógenos relacionados que causen síndromes clínicos similares?

¿Ha dado la prueba nueva un rendimiento satisfactorio en comparación con un método estándar?

¿Es la reproducibilidad preliminar aceptable?

¿Merece la prueba que se inicien los estudios de validación completa (Etapas 2.4)?

exóticas) o bien, cuando surge una situación de emergencia, porque la prueba tiene que utilizarse antes de que haya sido totalmente validada. Puede conseguirse un reconocimiento provisional siempre que los resultados de la Etapa 1 del proceso de validación sean favorables respecte a los resultados de un método analítico de estándar o a un método establecido conocido y, preferiblemente, publicado. Otra opción para un método estándar es el que se utiliza rutinariamente en el laboratorio. Es importante tener en cuenta que cada método identifica unas entidades morfológicas o funcionales del microorganismo. Por lo tanto, es posible que un método estándar basado en el cultivo y una técnica nueva de NAD den resultados discrepantes (véase en la Sección B.2, Etapa 2, abajo, una explicación sobre la resolución de discrepancias). La elección del grupo de muestras para la evaluación también es muy importante y debe ser lo más extenso posible (véase el Capítulo 3.6.6 Elección y uso de tipos y grupos de muestras de referencia). Si para la evaluación solo se dispone de un pequeño grupo de muestras, merece la pena determinar si la prueba supera las expectativas de reproducibilidad, es decir, resiste las exigencias de uso en otros laboratorios. Ello requiere que ambos laboratorios utilicen el mismo protocolo, y los mismos reactivos y grupo de muestras, así como un equipo similar (si no idéntico).

Si la falta de muestras impide pasar a la siguiente etapa de la fase de validación (Rendimiento Diagnóstico de la prueba), es aceptable utilizar una prueba de NAD que haya sido aceptada provisionalmente tras una exhaustiva validación mediante la Fase 1 de validación (véase la Norma de Validación de la OIE, Sección B.2.6). La aceptación de una validación provisional depende por completo de que la prueba haya sido aprobada por las autoridades locales, o por acuerdos bilaterales entre países.

Las herramientas analíticas, diseñadas para proporcionar información para caracterizar muestras que se detectan con una prueba de cribado, solo requieren la validación de sus características de rendimiento analítico. Así pues, en estos casos no existe el requisito de determinar la sensibilidad y la especificidad diagnóstica. Algunos ejemplos de estos enfoques son las pruebas de tipificación mediante PCR que se usan para determinar si una cepa de influenza A cuya matriz da un resultado positivo es H5 o H7, o los métodos con que se determina la resistencia a los antibióticos que solo se aplican a cultivos bacterianos. Una tecnología basada en el ácido nucleico que se utiliza para estas pruebas incluye métodos basados en chips de ADN, que introducen sus propios desafíos debido a la gran cantidad de datos generados para cada muestra analizada. Antes de implementar tales pruebas, es necesario tener en cuenta cómo puede lograrse este análisis. Un enfoque más sencillo consiste en comparar los resultados de una herramienta analítica nueva con los de una prueba estándar y permitir su uso siempre que los resultados de la técnica nueva sean comparativamente mejores que los de la técnica pre-existente (Anjum et al., 2007; Batchelor et al., 2008).

La sensibilidad diagnóstica (DSe) y la especificidad diagnóstica (DSp) constituyen los indicadores de rendimiento principales de una prueba de diagnóstico. Cuando se determinan estos valores, es fundamental escoger suficientes muestras que representen a la población de destino de la prueba que se está evaluando. Puede ser difícil obtener cantidades grandes de muestras (sobre todo positivas) en el caso de ciertas enfermedades exóticas, y negativas en el caso de las enfermedades endémicas. En tales casos, cuando se dispone de pocas muestras, la cantidad de error permisible en las estimaciones de la DSe y la DSp necesariamente será alto (véase la Norma de Validación de la OIE, Sección B.2, Tabla 1). Si puede utilizarse un diseño de muestreo adecuado y pueden utilizarse métodos analíticos independientes diferentes para analizar las muestras, es posible obtener estimaciones de la DSe y la DSp utilizando métodos bayesianos (modelos de clase latente) (Véase el Capítulo 3.6.5). A menudo, las muestras de referencia negativas se obtienen de animales que viven en regiones donde la enfermedad no está, mientras que las muestras positivas suelen obtenerse de animales con signos clínicos que han sido confirmadas en el laboratorio. Ello puede dar lugar a estimaciones excesivamente optimistas de la DSe y la DSp porque las muestras no representan todo el espectro del proceso de la enfermedad, es decir, no se incluyen los animales no clínicos, que pueden tener cargas de agente patógeno muy distintas a las de los animales que sufren un cuadro de la enfermedad fulminante o crónico.

Las muestras a menudo se clasifican empleando métodos analíticos actuales, como el aislamiento vírico (VI) o el cultivo bacteriano. No obstante, ello puede ser problemático cuando se validan pruebas moleculares nuevas, porque la base de ambos sistemas

El valor umbral (Ct) es el resultado escogido para distinguir entre negativo y positivo en una escala continua de valores analíticos.

Indeterminado, intermedio, sospechoso, límite, zona gris o ambiguo son términos que se utilizan indistintamente para un intervalo de valores analíticos que se encuentra entre los umbrales de positividad y negatividad.

analíticos es distinta. Por ejemplo, un resultado positivo en un cultivo bacteriano es la presencia de un microorganismo viable, mientas que los métodos basados en ácido nucleico detectan secuencias genómicas de microorganismos tanto vivos como muertos siempre que en la muestra siga habiendo ácido nucleico. Los métodos de VI pueden ser especialmente susceptibles a los inhibidores y contaminantes presentes en la matriz de la muestra, lo cual comporta la subestimación de los “positivos verdaderos”. Ello puede dar lugar a aparentes discrepancias cuando las muestras dan positivo al emplear la prueba molecular nueva y negativo con los métodos tradicionales. Las estrategias para resolver estas anomalías, aunque no sean las únicas, consisten en la secuenciación (que permite demostrar que el agente patógeno de interés estaba en una muestra determinada) o el análisis mediante otra prueba molecular.

Para calcular las estimaciones de DSe y la DSp de la prueba candidata, los resultados de la prueba deben reducirse antes a categorías (positivo, negativo o indeterminado). Ello se logra insertando uno o dos puntos de corte o valores umbral (límites de decisión) en la escala continua de resultados de la prueba. Por ejemplo, en algunas circunstancias es adecuado utilizar un valor umbral para una PCR en tiempo real en la región de 35 Ct, que significa que las muestras que produzcan un valor de Ct más alto se clasificarán como negativas o inconcluyentes. No obstante, en otra PCR es posible que cualquier muestra que simplemente registre un Ct se clasifique como positiva. Al plantear el uso de un valor umbral, deben tenerse en cuenta el rendimiento de una determinada PCR en tiempo real, los datos de validación comparativos, la aplicación definitiva de los resultados generados y la posible información veterinaria relevante.

La reproducibilidad es una medida del grado de coincidencia entre los resultados obtenidos en distintos laboratorios empleando el mismo protocolo, un equipo similar (preferiblemente el mismo) y el mismo grupo de muestras. Teóricamente, el grupo de muestras debería consistir en 20–30 muestras que incluyan algunas que están presentes por cuadruplicado. El grupo debe consistir en muestras que abarquen todo el intervalo dinámico de la prueba, y varias de ellas deben tener una actividad cercana, por ambos lados, al/los valor/es de corte de la prueba. El grupo de muestras que se utilice para determinar la repetibilidad podría utilizarse también para esta evaluación, pero aumentando las cantidades de réplicas. Se puede estimar la precisión de los datos tanto de repetibilidad como de reproducibilidad (véase el Capítulo 3.6.4 para una explicación más detallada de este tema y su aplicación). En el Capítulo 3.6.4 se aporta más información sobre la elección y uso de grupos de muestras de referencia.

Las mejores prácticas para implementar el programa son generales para todo tipo de pruebas (véase la Norma de Validación de la OIE). En el caso de las pruebas de NAD, una ventaja inherente es la posibilidad de una secuenciación genómica de seguimiento para resolver aparentes falsos positivos. Las pruebas basadas en PCR se suelen validar con cantidades similares de muestras positivas y negativas. No obstante, en los programas de vigilancia suelen aplicarse resultados analíticos para afirmar la ausencia de la enfermedad en cuestión en lugares donde la prevalencia de la enfermedad es muy baja y a menudo se acerca a cero. En tales circunstancias, los falsos positivos pueden ser un importante problema incluso cuando la especificidad diagnóstica de una determinada prueba es alta. Si la DSp de una prueba es del 99,5%, significa que uno de cada 200 resultados positivos será falso si la prevalencia es cercana a cero. Si se analiza una cantidad grande de muestras de una población de prevalencia cero o muy baja, estos falsos positivos pueden superar considerablemente en número a los verdaderos positivos (véase la Norma de Validación de la OIE, Sección B.4.2 para una explicación más detallada de los valores predictivos de los resultados de las pruebas como función de la prevalencia de la enfermedad). En el caso de las pruebas de NAD que se utilizan en tales circunstancias, sería una buena práctica confirmar los resultados positivos de la PCR mediante secuenciación.

El seguimiento de la repetibilidad mediante representación gráfica de los valores de Ct obtenidos con muestras control de patrón de trabajo permite comprobar si la prueba está dando el rendimiento esperado. Asimismo, la participación en programas de comprobación de la competencia organizados por proveedores externos de muestras de garantía de calidad indica cuál es la reproducibilidad actual y también permite comparar la exactitud de la prueba si se incluye un/os patrón/es de referencia en cada ejecución para la “normalización” de los datos. Algunos laboratorios también vuelven a analizar

una parte (normalmente un 1–5% en función de la capacidad de procesado de muestras por unidad de tiempo) de muestras retenidas para comprobar si la prueba está rindiendo siempre del mismo modo en todas las ejecuciones.

Con el tiempo, tal vez sea necesario modificar la prueba debido a un cambio en el analito que se pretende detectar, como por ejemplo, cuando la prueba para la influenza aviar va a aplicarse en otra parte del mundo o cuando han emergido nuevas cepas o linajes de un virus (véase la Sección B.1.2, arriba, sobre la evolución del nuevo linaje pandémico de H1N1). Los virus de ARN evolucionan rápidamente y pueden producirse mutaciones puntuales, de tal modo que es aconsejable confirmar con regularidad las secuencias de nucleótidos de los puntos del cebador y la sonda para asegurarse de que siguen sido adecuadas.

Con el tiempo, es probable que sea necesario aplicar modificaciones a una prueba. Los cambios de equipo o de protocolo de extracción, así como la automatización de determinadas etapas, requerirán solo una mínima comparación entre la prueba validada inicialmente y la versión modificada (el Capítulo 3.6.8). Pero si los resultados de la versión modificada se sitúan fuera del intervalo de funcionamiento o no cumplen las expectativas de rendimiento de la prueba original, puede ser necesaria una revalidación.

Es importante asignar número propios de identificación a todos los lotes de reactivos y registrar los componentes que se utilizan para cada prueba. Los componentes más críticos de las PCR son las sondas, los cebadores y las enzimas. Deben analizarse lotes actuales y nuevos de los reactivos críticos paralelamente antes de la introducción de estos últimos. No obstante, en el caso de otros reactivos, como los tampones o los nucleótidos, suele ser suficiente con realizar un seguimiento de los lotes para disponer de datos en caso de que deban solucionarse posibles problemas.

En algunos casos, es posible que la aplicación de la prueba tenga que ampliarse más allá del ámbito previsto inicialmente. Algunos ejemplos son la inclusión de otra especie hospedadora o de una población de animales de una zona geográfica distinta. En tales casos, es importante revalidar la prueba debido a los nuevos aspectos biológicos y a sus muchas variables relacionadas. Los detalles concretos dependerán del grado de cambio. Aplicar la prueba a una nueva zona geográfica podría significar que las características analíticas de la prueba siguen siendo válidas pero que los criterios de diagnóstico tienen que redefinirse. Por otra parte, es posible que se realicen modificaciones en las secuencias de cebador o sonda de una PCR para que pueda detectar nuevas cepas. En tal caso, será necesario comprobar cómo se comportan los nuevos reactivos en cuanto a exactitud analítica y diagnóstica en comparación con la versión previa de la prueba.

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