ELABORACIÓN Y PROPUESTA DE VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ...
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ELABORACIÓN Y PROPUESTA DE VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO PARA LA DETERMINACIÓN DE LÍMITES DE ETILENGLICOL Y DIETILENGLICOL EN SORBITOL SOLUCIÓN 70% POR CROMATOGRAFÍA DE GASES EN LA INDUSTRIA FARMACÉUTICA ANGLOPHARMA S.A. CAMILO ANDRES ZABALETA VANEGAS UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA BOGOTÁ, COLOMBIA 2021
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ELABORACIÓN Y PROPUESTA DE VALIDACIÓN DE UN MÉTODO
ANALÍTICO PARA LA DETERMINACIÓN DE LÍMITES DE ETILENGLICOL
Y DIETILENGLICOL EN SORBITOL SOLUCIÓN 70% POR
CROMATOGRAFÍA DE GASES EN LA INDUSTRIA FARMACÉUTICA
ANGLOPHARMA S.A.
CAMILO ANDRES ZABALETA VANEGAS
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA
BOGOTÁ, COLOMBIA
2021
ELABORACIÓN Y PROPUESTA DE VALIDACIÓN DE UN MÉTODO
ANALÍTICO PARA LA DETERMINACIÓN DE LÍMITES DE ETILENGLICOL
Y DIETILENGLICOL EN SORBITOL SOLUCIÓN 70% POR
CROMATOGRAFÍA DE GASES EN LA INDUSTRIA FARMACÉUTICA
ANGLOPHARMA S.A.
CAMILO ANDRES ZABALETA VANEGAS
Director
LUIS EDUARDO PEÑA PRIETO
DOCENTE UNIVERSIDAD DISTRITAL
Codirector
JOAN SEBASTIAN MELO ORDUZ
COORDINADOR DE LABORATORIO ANGLOPHARMA S.A.
Trabajo de grado para optar por el título de:
Licenciado en química
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA
BOGOTÁ, COLOMBIA
2021
CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................... 7
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ...................................................... 8
3. OBJETIVOS ............................................................................................. 8
3.1 OBJETIVO GENERAL ........................................................................... 8
3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS ................................................................. 9
4. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN .................................................... 9
5. MARCO TEÓRICO ................................................................................ 11
5.1 ANALITO ............................................................................................. 18
5.2 ESPECIFICIDAD ................................................................................. 18
5.3. ESTÁNDAR DE REFERENCIA ....................................................... 18
5.4. EXACTITUD .................................................................................... 18
5.5. LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN ........................................................ 18
5.6. LÍMITE DE DETECCIÓN ................................................................. 19
5.7. LINEALIDAD .................................................................................... 19
5.8. PLACEBO ........................................................................................ 19
5.9. PRECISIÓN ..................................................................................... 19
5.10. PRECISIÓN INTERMEDIA ........................................................... 20
5.11. RANGO ........................................................................................ 20
5.12. REPETIBILIDAD ........................................................................... 20
5.13. REPRODUCIBILIDAD .................................................................. 20
5.14. ROBUSTEZ .................................................................................. 20
6. RECURSOS MATERIALES Y EQUIPOS .............................................. 25
MATERIALES ............................................................................................ 25
EQUIPOS .................................................................................................. 25
REACTIVOS Y ESTÁNDARES ................................................................. 25
7. METODOLOGÍA .................................................................................... 26
7.1 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES Y MUESTRAS ............................ 26
7.1.1 PREPARACIÓN SOLUCIÓN MADRE DEL ESTÁNDAR .............. 26
7.1.2 PREPARACIÓN SOLUCIÓN DEL ESTÁNDAR ............................ 26
7.1.3 SOLUCIÓN DE LA MUESTRA ..................................................... 26
7.1.4. SOLUCIÓN DEL ESTANDAR PARA ENRIQUECER .................. 27
7.1.5. SOLUCIÓN DE LA MUESTRA ENRIQUECIDA .......................... 27
7.2. APTITUD DEL SISTEMA ................................................................. 27
7.3. EXACTITUD .................................................................................... 27
7.3.1 PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA DETERMINAR
EXACTITUD .......................................................................................... 27
7.4. SELECTIVIDAD Y ESPECIFICIDAD ............................................... 28
7.4.1. SOLUCIÓN MADRE DEL ESTANDAR PARA ESPECIFICIDAD . 30
7.4.2. SOLUCIÓN DE LA MUESTRA PARA ESPECIFICIDAD ............. 30
7.4.3. SOLUCIÓN DE LA MUESTRA ENRRIQUECIDA PARA
ESPECIFICIDAD ................................................................................... 30
7.5. LINEALIDAD DEL MÉTODO ........................................................... 31
7.6. ROBUSTEZ ..................................................................................... 32
8. RESULTADOS ...................................................................................... 33
8.1. APTITUD DEL SISTEMA .................................................................... 33
8.2 EXACTITUD .................................................................................... 36
8.2.1. Extracción .................................................................................... 36
9. CONCLUSIONES ..................................................................................... 42
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................. 43
TABLA DE FIGURAS Y TABLAS
Figura 1. Aplicaciones del sorbitol a nivel industrial ...................................... 12
Figura 2. Estructura química del etilenglicol. ................................................ 13
Figura 3. Estructura química del dietilenglicol. .............................................. 13
Figura 4. Metabolización hepática de etilenglicol .......................................... 15
Figura 5. Proceso de validación de distintos aspectos con sus respectivos
parámetros a evaluar, para medicamentos, según el INVIMA ...................... 17
Figura 6. Correlación de datos ...................................................................... 40
Tabla 1. Preparación de soluciones para evaluar el porcentaje de recuperación
...................................................................................................................... 28
Tabla 2. Preparación de muestras para la evaluación de la especificidad .... 28
Tabla 3. Tratamiento soluciones para evaluar el parámetro de linealidad del
sistema ......................................................................................................... 31
Tabla 4. Tratamiento soluciones para la evaluación del parámetro de linealidad
del método .................................................................................................... 31
Tabla 5. Ensayos de robustez para la metodología de análisis de límite de
etilenglicol y dietilenglicol .............................................................................. 32
Tabla 6. Criterios de aceptación para validación del método. ....................... 33
Tabla 7. Condiciones experimentales para metodología analítica de
determinación del límite de dietilenglicol y etilenglicol .................................. 34
Tabla 8. Rampa de temperatura para el horno de la columna ...................... 34
Tabla 9. Criterios de aceptación para la aptitud del sistema ......................... 35
Tabla 10. Resultados idoneidad del sistema ................................................ 35
Tabla 11. Preparación de soluciones para evaluar el porcentaje de
recuperación ................................................................................................. 36
Tabla 12. Respuesta del estándar ................................................................ 37
Tabla 13. Calculo de porcentajes de recuperación de etilenglicol ................ 38
Tabla 14. Cálculo de porcentajes de recuperación de dietilenglicol.............. 38
ELABORACIÓN Y PROPUESTA DE VALIDACIÓN DE UN MÉTODO
ANALÍTICO PARA LA DETERMINACIÓN DE LÍMITES DE ETILENGLICOL Y
DIETILENGLICOL EN SORBITOL SOLUCIÓN 70% POR
CROMATOGRAFÍA DE GASES EN LA INDUSTRIA FARMACÉUTICA
ANGLOPHARMA S.A.
Zabaleta Vanegas Camilo Andrés [email protected]
Universidad Distrital Francisco José de Caldas
RESUMEN:
En este trabajo se describe la implementación y propuesta de validación de
una metodología para la determinación de límites de etilenglicol y dietilenglicol
en una solución de sorbitol al 70%. Se desarrolló un protocolo de validación
proponiendo una metodología por cromatografía gaseosa con detector de
ionización por llama (FID), donde se utilizó una mezcla de hidrogeno, nitrógeno
y makeup gas (35:40:350) como gas transportador. El programa de
temperatura comienza en 70 ºC, con una rampa a razón de 50 ºC/min hasta
260 ºC. Se utilizó una columna capilar de sílice fundida 0,32mm x 30 m; capa
de 1,8 µm de fase G46 (624). Se estableció un flujo en la columna de 3,0
mL/min, la temperatura del inyector y la del detector fueron establecidas a 300
ºC.
La metodología implementada se estableció tomando como referencia la
monografía citada en la farmacopea americana USP 43-NF 38 para la
evaluación del límite de dietilenglicol (DEG) y etilenglicol (EG) en sorbitol
solución. Dada la aclaración de que, al ser un análisis de límites, según el ente
regulatorio (INVIMA) se deben realizar los análisis de especificidad y límite de
detección, sin embargo, en este protocolo se establecen los criterios de
desempeño y otras pruebas a evaluar para el desarrollo de la propuesta de
validación. Como principales criterios de aceptación y requisitos se evaluaron:
aptitud del sistema, exactitud, especificidad y robustez. De los cuales, la
robustez no dio cumplimiento según los parámetros establecidos, tampoco fue
posible realizar la determinación de la precisión intermedia y la linealidad del
método, debido a factores como disposición del equipo, falta de tiempo,
espacio e insumos.
En el estudio de especificidad se demostró que no hubo interferencias en la
determinación de (EG) y (DEG) una vez que las muestras fueron sometidas a
condiciones de estrés. Se obtuvieron porcentajes de recuperación elevados
en el estudio de exactitud (99,8 a 100,4%) para etilenglicol, y (99,7 a 100,1%)
para dietilenglicol.
PALABRAS CLAVE
Validación, exactitud, idoneidad del sistema, polioles, cromatografía de gases,
límite de detección, etilenglicol, dietilenglicol.
1. INTRODUCCIÓN
El sorbitol es un azúcar polialcohol “poliol” conocido popularmente como
alcohol dulce, este se emplea como edulcorante, aditivo o espesante en la
fabricación de diversos productos alimentarios sin azúcar. Por sus
características físicas, además de conceder un sabor dulce, es un excelente
agente humectante. El sorbitol contiene aproximadamente el 60% de la
dulzura de la sacarosa y es considerado como edulcorante nutritivo porque
proporciona energía dietética: aportando 2,6 kilocalorías por cada gramo,
frente a las 4 kilocalorías en promedio que aportan los azucares como la
sacarosa (GODSWILL C. A., 2017). Este edulcorante produce un efecto suave
en la boca, con un sabor fresco y apetitoso, razón por la cual se emplea en la
industria farmacéutica para la elaboración de jarabes, ya que, además de
aportar dulzor es un excelente agente espesante. Una de sus propiedades es
que no es cariogénico y puede ser beneficioso para las personas diabéticas.
El sorbitol actualmente se produce comercialmente mediante la hidrogenación
de la glucosa y está disponible tanto de manera líquida como en forma
cristalina.
Sin embargo, es una materia prima bastante vigilada por distintos entes,
debido a que la Organización Mundial de la Salud (OMS) a mediados de los
años 90’s hizo público un informe acerca de numerosos casos de
envenenamiento presentados por productos farmacéuticos con alto contenido
de dietilenglicol (DEG) y etilenglicol (EG) en países como Haití, Argentina,
Bangladesh, India y Nigeria. A raíz de estos acontecimientos el Departamento
de Alimentación y Drogas de los Estados Unidos (FDA), hizo la recomendación
a todas las entidades e industrias dedicadas a la producción de medicamentos
y alimentos, el análisis de identidad de todas las materias primas de tipo
polioles utilizadas en la elaboración de medicamentos en su totalidad de los
lotes y todos los contenedores debido al DEG y el EG (Rosabal - Cordoví,
2014)
Dando cumplimiento a esta directriz la industria farmacéutica Anglopharma
S.A. ubicada en la ciudad de Bogotá D.C. Empresa líder en la fabricación de
medicamentos a nivel nacional, que cuenta con diversas certificaciones
INVIMA como buenas prácticas de manufactura (BPM) y buenas prácticas de
laboratorio (BPL), quiere implementar o establecer dentro de su amplia gama
de análisis fisicoquímicos, la determinación del contenido de dietilenglicol y
etilenglicol como impurezas en las materias primas utilizadas para uso
farmacéutico en Colombia, en este caso específico, la materia prima sorbitol.
Hay varias formas de determinar tales impurezas: Se puede identificar por
técnicas analíticas como: Espectroscopia infrarroja por transformada de
Fourier (FTIR), cromatografía en capa fina (TLC), cromatografía de capa fina
de alto rendimiento ò por sus siglas en ingles HPTLC y cromatografía de
gases-espectrometría de masas (GC / MS).
La cromatografía de gases es una de la más utilizada para la determinación
de estas impurezas altamente tóxicas que no deben estar presentes en las
materias primas o por lo menos que se encuentren en muy bajo porcentaje. Es
una técnica rápida, muy sensible y selectiva. Es por eso que la presente
investigación se propone como objetivo desarrollar y validar una metodología
analítica para la determinación del DEG y el EG en sorbitol solución 70%.
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La pregunta problema que orienta este trabajo es:
¿Cuáles son los parámetros más óptimos para elaborar una metodología
experimental en una propuesta de validación de un método analítico para la
determinación de límites de etilenglicol y dietilenglicol en una solución de
sorbitol 70% por medio de cromatografía de gases en la industria farmacéutica
Anglopharma S.A?
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GENERAL
Definir la metodología experimental apta para la propuesta de validación de la
determinación del límite de dietilenglicol y etilenglicol mediante cromatografía
de gases (GC) en la materia prima sorbitol solución al 70%.
3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
Definir los parámetros instrumentales y experimentales para la
determinación del límite de dietilenglicol y etilenglicol, mediante GC.
Establecer las características de desempeño y las pruebas a evaluar
para el desarrollo de la validación.
Detallar los criterios de aceptación y requisitos que se deben cumplir
para dar la metodología de análisis por validar.
4. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN
Desde el objeto de esta investigación, se desea elaborar y validar un método
analítico para la determinación de límites de etilenglicol y dietilenglicol en
sorbitol solución 70% por cromatografía de gases.
Desde las diversas investigaciones en torno a la determinación de etilenglicol
(EG) y dietilenglicol (DEG) en soluciones de sorbitol, no se encuentran
investigaciones o artículos de referencia directamente. Lo más cercano que se
encontró, fue la determinación de estas impurezas en la universidad de
Granma, en Santiago de Cuba, se realizó una validación de una metodología
analítica para la determinación de dietilenglicol y etilenglicol como impurezas
en glicerina y propilenglicol, también empleando la cromatografía de gases
acoplada a un detector de ionización por llama y empleando hidrogeno como
gas carrier. El programa de temperatura fue de 100 °C/min, “rampa a razón de
7,5 ºC/min hasta 200 ºC. Se utilizó una columna Restek 624” El estándar de
flujo fue dimetilsulfóxido y la temperatura del inyector y la del detector fueron
establecidas a 220 ºC y 250 ºC, respectivamente (Rosabal - Cordoví, 2014)
Por otra parte, se encuentran diversos artículos sobre intoxicación por
dietilenglicol y etilenglicol, con algunos casos clínicos de estudio. Por ejemplo,
un artículo de la Facultad de Medicina Pontificia Universidad Católica de Chile
titulado como Intoxicación por etilenglicol, fisiopatología y enfrentamiento
clínico, en este artículo mencionan, en primera medida, narran la historia del
alcohol en el desarrollo del hombre, sus beneficios y sus contras.
Posteriormente hablan de unos “alcoholes tóxicos” como los llaman ellos, y
mencionan como ejemplos; metanol, etilenglicol, dietilenglicol, propilenglicol e
isopropanol. También, en el artículo se encuentra la incidencia en Estados
Unidos de envenenamiento por cualquier sustancia es de 17,6 por 1.000
habitantes; de éstos, 5,3% se debe a un alcohol tóxico. Posteriormente,
describen las principales características físicas y químicas del etilenglicol, su
farmacocinética y los efectos sistémicos de la intoxicación. Por último, realizan
la caracterización de un cuadro clínico de 4 etapas, en las cuales se menciona
lo que ocurre en las primeras 12 horas, de 12 a 36 horas, de 2 a 3 días y de
una semana después de la ingesta de etilenglicol. (SEPÚLVEDA, SELAMÉ,
ROESSLER, TAGLE, & VALDIVIESO, 2019).
Un artículo, similar al de la universidad católica de Chile, se encontró por parte
de los autores JR Cacelín-Garza y RS Cacelín-Miranda, en la Universidad
Popular Autónoma del Estado de Puebla, en este, por su parte, exponen lo
que es un caso clínico de: “Paciente masculino de 90 años de edad, originario
y residente del estado de Tlaxcala, jornalero. Con alcoholismo positivo desde
los 25 años de edad a base de bebidas fermentadas, llegando frecuentemente
a la embriaguez” en este artículo se muestran los resultados de exámenes de
laboratorio y gasometrías, para posteriormente realizar el análisis de la
toxicinética del EG la cuál es abordada por medio de las rutas metabólicas
ocurridas en el organismo. Gracias a este análisis, identifican cuatro estadios
de la intoxicación y los síntomas en cada estadio. Por ultimo exponen tres
formas de tratamiento para la intoxicación, eligiendo la administración de
etanol, debido a que, según ellos: “Los estudios detallados de la oxidación
enzimática del etilenglicol demostraron que el alcohol etílico, el sustrato
natural, es un potente inhibidor de la oxidación del EG. Entonces, las bajas
concentraciones de alcohol etílico previenen la oxidación de grandes
cantidades de etilenglicol” (Cacelin & Cacelin, 2017).
Por otra parte, en la universidad Autónoma de Barcelona, se encontró una
tesis doctoral que se titula; Intoxicación por dietilenglicol (DEG) en productos
de uso medicinal: Análisis de episodios en el periodo de 1990 al 2015. En este
amplio recorrido histórico, se abordaron distintos aspectos, el primero fue el
hablar de la primera intoxicación masiva por DEG, ocurrida por la preparación
de sulfanilamida en DEG, este jarabe fue el causante de muchas muertes en
Estados Unidos. Posterior a esto, la autora de la tesis habla sobre las
propiedades físicas y químicas del dietilenglicol. Su toxicinética, las
manifestaciones clínicas y los diagnósticos y tratamientos. Posteriormente,
aborda toda la parte legislativa sobre la regulación y reglamentación del DEG
a nivel global, y en concreto realiza el análisis y la revisión de las medidas
legislativas y sus respectivas acciones en todo el mundo, y en ciertos países
en específico; Nigeria, Bangladesh, Argentina, Venezuela, India, Francia,
China, Panamá, Estados Unidos y Europa. Finalmente menciona algunas
implicaciones a futuro y las limitaciones de su estudio (Figueirinha Moital,
2017).
5. MARCO TEÓRICO
Los métodos analíticos son los más empleados en la industria farmacéutica,
debido a que se basan en la determinación de analitos, componentes activos
e impurezas, y depende el caso, es posible su respectiva cuantificación. Para
tener certeza de la funcionalidad del método, se somete a un proceso de
validación. Este proceso puede ser de tres tipos; prospectivo, retrospectivo o
de revalidación. Independientemente del tipo de validación que se desee
emplear, lo que busca es que el método sea muy confiable a partir de cumplir
con un número de parámetros, entre los más conocidos encontramos:
Repetitividad, reproducibilidad, entre otras. Cuando un método cumple con
ciertos rangos en estos parámetros, se afirma que el método esta validado
(Miriam Díaz de Armas, 1998).
En este trabajo se busca elaborar y proponer la validación de un método
analítico para determinar los límites de etilenglicol y dietilenglicol en una
solución de sorbitol, por ende, se expone a continuación cierta información de
cada uno de los compuestos mencionados anteriormente.
El sorbitol es un polialcohol con fórmula molecular C6H14O6, fue descubierto
por el francés Jean Baptiste Boussingault, un científico que trabajó
arduamente en américa, realizando varias expediciones en Colombia,
Venezuela y el Ecuador (Ramos, 1998). Él encontró en los frutos y bayas de
una especie conocida como Sorbus aucuparia L. Actualmente se obtiene por
reducción mediante hidrogenación catalítica del monosacárido más común, la
glucosa (Jordan Gonzaga Andrade B. Silva, 2019).
A continuación, en la figura 1 se muestra en forma de esquema, diversas
aplicaciones del sorbitol en la industria, además de sus principales derivados.
Figura 1. Aplicaciones del sorbitol a nivel industrial
Recuperado de: Jordan Gonzaga Andrade B. Silva, 2019
Como se evidencia en la figura 1, el sorbitol tiene una amplia variedad de usos,
por ejemplo, se emplea como humectante para mantener diversos productos
con un grado de humedad apropiado, por lo general, este uso de le da en la
elaboración de alimentos, fármacos y productos químicos. Funciona a su vez
como emulsionante en la fabricación de pasteles y dulces para impedir que se
separen la fase acuosa y la fase grasa en estos alimentos (O'Sullivan, 2011).
ETILENGLICOL Y DIETILENGLICOL
El etilenglicol es un compuesto químico orgánico que pertenece al grupo de
los dioles. Un diol o glicol es un compuesto químico que contiene dos grupos
hidroxilo (grupos -OH). La estructura del etilenglicol se aprecia en la figura 2.
El etilenglicol es una sustancia líquida, espesa que se fabrica a partir de la
hidratación del óxido de etileno. No tiene olor, pero posee sabor dulce. Se usa
en productos para fabricar anticongelantes y en soluciones para deshelar
automóviles, aviones y embarcaciones (ATSDR, 2010).
Algunos productos en los que se usa etilenglicol son (ATSDR, 2010):
Anticongelante
Líquido para frenos hidráulicos
Tinturas usadas en almohadillas para estampar
Tintas para bolígrafos y talleres de imprenta
Por otra parte, el dietilenglicol es un líquido viscoso, incoloro e inodoro de
sabor dulce. Es higroscópico, miscible en agua, alcohol, etilenglicol, etc. Posee
una densidad de 1,118. El punto de ebullición es 244-245 °C. Su estructura
química se evidencia en la figura 3 (Figueirinha Moital, 2017)
Figura 3. Estructura química del dietilenglicol.
Recuperado de: (Figueirinha Moital, 2017)
Figura 2. Estructura química del etilenglicol. Recuperado de: https://bit.ly/38CTQQR
Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), se presentaron distintos
episodios de envenenamiento con productos farmacéuticos contaminados con
dietilenglicol (DEG) y el etilenglicol (EG) entre 1995 y 1998 en distintas
ciudades del mundo. A raíz de estos sucesos, entidades como el
Departamento de Alimentación y Drogas de los Estados Unidos (FDA)
exige realizar análisis de presencia de dietilenglicol (DEG) y el etilenglicol
(EG) en glicerina, propilenglicol y sorbitol utilizados en la elaboración de
distintos medicamentos (Rosabal - Cordoví, 2014)
Esta intoxicación se da, debido a que ciertos alcoholes se convierten en ácidos
carboxílicos tóxicos, como el metanol y el etilenglicol, son alcoholes que se
convierten a través de intermedios de aldehído en ácido fórmico y en ácido
oxálico, respectivamente. Ácidos que son considerablemente tóxicos Por esta
razón, el envenenamiento con metanol y etilenglicol es comúnmente tratado
con etanol, que según Leda Giannuzzi, en su libro, toxicología general y
aplicada: “el etanol inhibe competitivamente la oxidación de metanol y
etilenglicol por ADH y ALDH. El potente inhibidor de ADH, el 4-metilpirazol
(fomepizol) también se usa para tratar el envenenamiento por metanol y
etilenglicol” (Giannuzzi, 2014).
A su vez, cuando el etilenglicol es degradado en el cuerpo, forma ciertas
sustancias químicas en forma de cristales, los cuales se cumulan en los
riñones afectando su funcionalidad. (ATSDR, 2010).
Por otra parte, la ingesta de etilenglicol tiene efectos tóxicos y sólo si es
ingerido en cantidades suficientes en una sola exposición. Según la
toxicinética, establecida por Cacelin Garza y Cacelin Miranda, en su artículo
sobre intoxicación por etilenglicol, de forma textual indican que el etilenglicol:
“Es absorbido rápida y completamente después de su ingesta por el aparato
gastrointestinal y alcanza concentraciones pico entre 30 y 60 minutos después
de su ingesta,5 con concentraciones máximas que se alcanzan de una a cuatro
horas.2,6 La vida media es de 2.5-4.5 horas, puede prolongarse hasta 17 horas
en presencia de concentraciones terapéuticas de etanol (100-200 mg/dL)”
(Cacelin & Cacelin, 2017). En la figura 4 se evidencia la Metabolización
hepática de etilenglicol.
Figura 4. Metabolización hepática de etilenglicol
Recuperado de: (SEPÚLVEDA, SELAMÉ, ROESSLER, TAGLE, & VALDIVIESO, 2019)
Por su parte, se sabe que el dietilenglicol se absorbe y se distribuye en riñones,
el cerebro, el hígado, el bazo, y el tejido adiposo . Los riñones reciben la mayor
parte de DEG. La toxicinética del dietilenglicol, abordada por JM, Marraffa en
la enciclopedia de Toxicología, tercera edición, indica, de forma textual, lo
siguiente: el DEG se metaboliza por la alcohol deshidrogenasa (ADH) a ácido
2-hidroxietoxiacético (HEAA) y ácido diglicólico (DEGA). Recientemente se
identificó que el ácido diglicólico es el principal metabolito nefrotóxico en la
intoxicación por DEG. El DEG parece seguir una cinética de primer orden y
tiene una vida media de 3,6 h (Encyclopedia of Toxicology, 2014).
Para realizar esta determinación se emplea la cromatografía de gases, según
la literatura, se podrían emplear distintos métodos de separación, como lo son
la cromatografía infrarroja (FTIR), de capa fina (CF), de alta resolución (HPLC)
o de gases (GC). En cromatografía de gases la muestra se volatiliza y se
inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La fase móvil
corresponde a un gas inerte, el cual, no reacciona ni mantiene ningún tipo de
interacción con la muestra. Su única función es la de transportar el analito a
través de la columna. Una gran ventaja d esta cromatografía son sus
detectores, como ionización de llama o espectrometría de masas, entre otros.
La cromatografía de gases debe ser empleada, cuando los componentes de
la mezcla problema son volátiles o semivolátiles y térmicamente estables a
temperaturas de hasta 350-400ºC, debido a las altas temperaturas que se
manejan en el sistema. En esta cromatografía se emplean dos tipos de
columnas, unas conocidas como empaquetadas y otras conocidas como
capilares. Se diferencian porque en una columna empaquetada, la fase
estacionaria se empaqueta en la cavidad de la columna mientras que, en una
columna capilar, la fase estacionaria recubre la superficie interna de la cavidad
de la columna. Estas columnas varían desde 2 a 50 metros de longitud y por
lo general, están construidas en acero inoxidable, vidrio, sílice fundida o teflón.
La temperatura de la columna es una variable importante para un trabajo
preciso, por ello se introduce en el interior de un horno de temperatura
controlada. La temperatura óptima de la columna depende del punto de
ebullición de la muestra y del grado de separación requerido (LINDE, 2019).
Por último, se aborda toda la concepción teórica sobre validación, los
parámetros a determinar, y algunas características específicas para nuestra
validación.
Según la norma ISO 9001 del 2015, la validación se define como: “La
validación de procesos, en muy pocas palabras, es el acto de controlar un
proceso llevando a cabo las pruebas necesarias para garantizar que el
proceso realice lo encomendado de acuerdo con los requisitos que se le
habían asignado.” Por su lado, desde la ISO 9000, se define como
"Confirmación, mediante evidencia objetiva, clara y veraz sobre el
cumplimiento de requisitos para una utilización o aplicación específica
prevista” (ISO 9000, 2015).
La validación es básicamente el proceso necesario para definir y confirmar un
método analítico y su respectiva viabilidad. Se puede interpretar a su vez, el
proceso de validación como el rendimiento de un método. Por lo general, se
usan diversos tipos de validación, como: validación primaria y validación
secundaria, esta última corresponde al proceso de verificación o revalidación
(Eurachem, 2014).
En términos generales, la validación es un proceso que nos permite confiar en
los resultados de un análisis. Debido a que este análisis, aporta diversos
índices de confiabilidad y veracidad de lo que estamos determinando con una
evidencia documental fuertemente justificada.
Para que una validación sea formal y aceptada, debe cumplir con una serie de
parámetros a evaluar, dependiendo la norma por la que se rija y el analito en
cuestión. Por ejemplo, en la figura 5 se evidencia el proceso de validación de
distintos aspectos con sus respectivos parámetros a evaluar, para
medicamentos, según el INVIMA (INVIMA, 2014).
Figura 5. Proceso de validación de distintos aspectos con sus respectivos parámetros a evaluar, para medicamentos, según el INVIMA
Recuperado de: INVIMA, 2014
Como se evidencia en la figura 5 se mencionan algunos parámetros para una
validación, parámetros hay diversos en una validación, sin embargo, depende
del método a validar y de las legislaciones que respaldan la respectiva
validación según la industria.
Entre los principales parámetros a determinar en una validación de un método
analítico tenemos que determinar en primera medida, el tipo de método;
cualitativo o cuantitativo. Según la literatura, en el caso de un método
cualitativo se determinan; límite de detección, especificidad y precisión para la
repetibilidad y reproducibilidad. Por otra parte, en términos de métodos
cuantitativos, los parámetros a determinar, además de los mencionados en
métodos cualitativos son: linealidad y rango de trabajo, exactitud para la
repetibilidad y reproducibilidad, incertidumbre, límites de detección y
cuantificación, entre otros. En este proyecto se realiza una validación de un
análisis cuantitativo, por ende, se procede a definir cada uno de los parámetros
a tener en cuenta para su respectiva validación. Para este fin, se toman las
definiciones del protocolo de validación para metodología analítica de la
empresa ANGLOPHARMA, para posteriormente realizar una profundización
de los parámetros a evaluar en este proyecto de validación.
5.1 ANALITO
Se le denomina a la sustancia objeto de estudio (ANGLOPHARMA,
2019).
5.2 ESPECIFICIDAD
Es la capacidad de determinar inequívocamente el analito en presencia
de productos de degradación, impurezas, componentes de la matriz, u
otros interferentes que puedan estar presentes en el análisis (ICH,
2005)
5.3. ESTÁNDAR DE REFERENCIA
Es una sustancia de la cual se conocen sus propiedades y se aceptan
sus cualidades como apropiadas para un uso específico, sin necesidad
de comparar contra otra sustancia (MINSALUD, 2013).
5.4. EXACTITUD
Es la característica que expresa la cercanía entre un resultado obtenido
y el valor aceptado o el valor de referencia, comúnmente se puede
expresar matemáticamente como el porcentaje de recuperación de una
muestra o como el porcentaje de error (ICH, 2005).
5.5. LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN
Es la mínima cantidad de analito que se puede determinar
cuantitativamente de manera confiable, precisa y exacta (ICH, 2005).
5.6. LÍMITE DE DETECCIÓN
Es la mínima cantidad de analito que se puede determinar
cualitativamente de manera confiable, sin que se pueda confundir con
el ruido instrumental (ICH, 2005) en otras palabras se confirma
simplemente que la cantidad de analito se encuentra entre los límites
sea por encima o por debajo del nivel.
5.7. LINEALIDAD
Es la capacidad de una metodología o equipo para obtener resultados
directamente proporcionales a la característica medida en una muestra
del analito (ICH, 2005).
5.8. PLACEBO
Se le denomina a la matriz del producto estudiado, este contiene todos
los componentes con excepción del analito (ANGLOPHARMA, 2019).
5.9. PRECISIÓN
Se define como la cercanía que hay entre los valores obtenidos de la
medición una propiedad en varias muestras de un analito, realizada bajo
las mismas condiciones experimentales; la precisión se puede medir en
tres niveles: repetibilidad, precisión intermedia y reproducibilidad,
comúnmente se expresa como la desviación estándar o la desviación
estándar relativa de los resultados obtenidos (ICH, 2005).
5.10. PRECISIÓN INTERMEDIA
Es la determinación de la precisión de los datos obtenidos
intralaboratorio, bajo las mismas condiciones experimentales, pero con
cambios en las condiciones operativas, es decir, el análisis se realiza
en diferentes días, con diferentes analistas o diferentes equipos, entre
otras características operativas (ICH, 2005).
5.11. RANGO
Se le denomina a los valores máximo y mínimo de una magnitud medida
entre los que se puede determinar y demostrar la idoneidad,
confiabilidad, linealidad, precisión y exactitud de los resultados
obtenidos; se denomina también como intervalo (ICH, 2005).
5.12. REPETIBILIDAD
Expresa la precisión que hay entre los resultados obtenidos del análisis
de diferentes muestras bajo las mismas condiciones experimentales y
las mismas condiciones operativas (ICH, 2005).
5.13. REPRODUCIBILIDAD
Se define como la precisión que hay entre los resultados obtenidos
entre diferentes laboratorios, se denomina también precisión Inter
laboratorios (ICH, 2005).
5.14. ROBUSTEZ
Es la capacidad que tiene una metodología o equipo para obtener
resultados precisos y exactos, luego de realizar modificaciones
deliberadas a los parámetros y ajustes experimentales; los parámetros
que varíen y afecten la precisión o la exactitud en alto grado, se
consideran críticos y se deben mantener bajo control (ICH, 2005).
Entre otros aspectos que se deben tener en cuenta para una validación
encontramos; la idoneidad del sistema o aptitud del sistema, que es una serie
de ensayos que se realizan para asegurar que la metodología de análisis
cumple con los criterios de aceptación establecidos en la validación de la
metodología, se usa para asegurar el desempeño aceptable de la metodología
durante el transcurso de la misma (MINSALUD, 2013). Por otra parte, se deben
llevar una serie de documentos que describan los detalles de un estudio de
validación, estos se conocen como protocolos de validación. Estos incluyen
antecedentes importantes, la explicación del fundamento lógico y el objetivo
del estudio, también ofrecen una descripción completa de los procedimientos
que deben seguirse, fijan los parámetros que se miden y describen como se
analizan los resultados, a la vez que facilitan criterios de aceptación
determinados con anterioridad para extraer las conclusiones. Por último, un
documento que no puede faltar en una validación es el informe de validación,
en donde se reúnen y sintetizan los registros, resultados y la evaluación de un
programa de validación finalizado. Puede contener, además, propuestas para
el mejoramiento de los procesos y/o equipos (INVIMA, 2018).
Para esta metodología, se pretende determinar los siguientes parámetros:
Aptitud del sistema cromatográfico:
Se basa en evaluar como un sistema integrado al equipo, el sistema
electrónico, los análisis y las muestras a analizar (ICH, 2005). A menos
que se especifique algo diferente en el caso específico, se emplean
cinco inyecciones del analito para determinar la desviación estándar y
expresarla en términos de aptitud del sistema (USP 31, 2008). Para la
determinación de dietilenglicol y etilenglicol debe ser la resolución ≥ 30
entre los picos de dietilenglicol y etilenglicol y RSD, % ≤ 2,0 para los picos
de dietilenglicol y etilenglicol.
Especificidad y selectividad:
Estos dos términos se toman como sinónimos bajo esta validación, en
la literatura se encuentra especificado que se emplea la especificidad
en la USP 31 o selectividad en la ICH. Por ende, los dos términos son
empleados para referirse a la capacidad de un método para determinar
exacta y específicamente el analito de interés en presencia de otros
componentes (INSTITUTO NACIONAL DE SALUD, 2014). Las pruebas
de identificación deben poder identificar compuestos similares o
relacionados (ICH, 2005).
Linealidad (del sistema y del método):
Se define como la capacidad del método para proporcionar resultados
que son directamente proporcionales a la concentración del analito en
la muestra dentro de un rango establecido. Cabe resaltar, que estos
resultados pueden ser tratados matemáticamente para establecer esta
linealidad (INSTITUTO NACIONAL DE SALUD, 2014).
Se debe evaluar una relación lineal en todos los resultados del método
analítico, a la vez, de expresar los resultados bajo las mismas unidades,
según corresponda la metodología (diluciones, pesajes, etc.). Por lo
general la linealidad se expresa mediante un gráfico en términos de
concentración o contenido de analito. A su vez, los resultados deben
ser evaluados de forma estadística para evidenciar la respectiva
correlación. La forma más común es la regresión lineal del gráfico y
posteriormente emplear el método de mínimos cuadrados. Por ultimo
cabe resaltar que al establecer el parámetro de linealidad se aconseja
contar con mínimo cinco concentraciones (USP 31, 2008).
Exactitud:
La exactitud expresa la proximidad entre una medición y el valor real,
esta medida enuncia el grado de concordancia entre los resultados del
análisis correspondiente. Según la literatura de la PAHO, se logra
determinar la exactitud de cinco formas distintas mencionadas a
continuación; La primera es realizar una prueba de un estándar de
Referencia, la segunda se realiza a partir de una mezcla con excipientes
(placebo con una cantidad agregada conocida), la tercera se determina
del agregado de estándar (muestra con cantidad agregada conocida),
la cuarta corresponde a deducir a partir de los datos de especificidad y
linealidad la exactitud y por último, la quinta se basa en la comparación
con un método reconocido como exacto (método de referencia) (PAHO,
2002).
Por otra parte, según el Instituto nacional de salud, existen dos formas
únicamente, la primera corresponde al caso de disponer materiales de
referencia certificados. Por ende, el valor de exactitud se toma de lo
citado en el certificado. La segunda forma es comparar los resultados
con un método de referencia validado, del que se tengan valores de
exactitud demostrados. Para este caso, el valor verdadero es el que se
obtiene con dicho método de referencia y se compara con el valor
hallado con el método alternativo que se quiere validar (INSTITUTO
NACIONAL DE SALUD, 2014). Por ende, en esta validación se realiza
la determinación de exactitud a partir del segundo método mencionada
anteriormente, en donde se inyecta cinco veces la solución estándar a
la concentración de trabajo (0,08 mg/mL para cada compuesto),
posteriormente se prepara una solución de la muestra a tres
concentraciones diferentes a partir de una solución de la muestra
enriquecida. Por último, se debe calcular el contenido de cada
compuesto. Para el contenido de dietilenglicol, con la siguiente
ecuación:
% 𝑅𝑒𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 á𝑟𝑒𝑎𝑠 𝑝𝑎𝑟𝑎 𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜 = (𝑟𝑢
𝑟𝑠) 𝑥 100
Donde: ru: Respuesta del pico del compuesto (etilenglicol o dietilenglicol) en la
solución muestra rs: Respuesta del pico del compuesto (etilenglicol o dietilenglicol) en la
solución estándar
Cs: Concentración de ER compuesto (etilenglicol o dietilenglicol) en la
solución estándar (mg/mL)
Cu: Concentración nominal del compuesto (etilenglicol o dietilenglicol) en la
solución muestra (mg/mL)
Se debe tener en cuenta que el criterio de aceptación es de 90% al
110% para el dietilenglicol y etilenglicol.
Posteriormente se calcula la media de los porcentajes de recuperación,
la desviación estándar y la desviación estándar relativa. En este caso,
el criterio de aceptación es:
Para la desviación estándar relativa global y para la determinación del
contenido de ambos compuestos (etilenglicol y dietilenglicol) debe ser ≤
6,0%.
Precisión:
En términos estadísticos se relaciona con la desviación estándar, ya
que es la medida del grado de concordancia entre los resultados de los
análisis realizados a una muestra, por lo general se expresa en
porcentaje (%).
Por ende, determina la proximidad entre los valores obtenidos en
distintas mediciones del mismo analito.
Para hablar de precisión por lo general se emplean los términos
repetibilidad y reproducibilidad; la repetibilidad hace referencia a las
pruebas desarrolladas bajo condiciones lo más constantes posibles y
durante un intervalo corto de tiempo (resultados de pruebas
independientes obtenidos con el mismo método, con la misma muestra,
en el mismo laboratorio, con el mismo equipo y realizados por el mismo
operador). Mientras que la reproducibilidad se refiere a pruebas
desarrolladas bajo condiciones de reproducibilidad (con el mismo
método en muestras idénticas, pero en diferentes laboratorios, con
diferentes operadores y usando equipos diferentes) (UNODC, 2010).
Para este caso específico, es importante abordad otra definición:
Precisión intermedia, este tipo de precisión, tiene como objetivo
determinar la variación en el método, si se realizan distintos análisis a
la misma muestra, en diferente laboratorio, o en un mismo laboratorio
pero con distintos analistas, o en días diferentes (INSTITUTO
NACIONAL DE SALUD, 2014). En nuestra metodología, para la
determinación de la precisión intermedia se realiza la valoración de tres
muestras, analizando cada muestra por duplicado, y analizado un
estándar por quintuplicado; cada valoración debe ser realizada por dos
analistas diferentes, en dos días de análisis diferentes. Al valorar cada
una de las muestras, se determina el promedio, la desviación estándar
y la desviación estándar relativa por cada ensayo (analista 1- día 1,
analista 2 - día 1, analista 1- día 2, analista 2 - día 2), por último, se
procede a calcular la desviación estándar relativa del conjunto de datos.
Robustez:
Las pruebas de robustez buscan determinar la capacidad del método
analítico de no verse afectado por pequeñas variaciones en algunos
parámetros. Por esta razón, garantiza la confiabilidad del método a
pesar de estas variaciones y durante su uso normal (USP 31, 2008).
Por ende, las pruebas de robustez incluyen algunos cambios en el
método analítico original y validan si estas variables tienen efectos
positivos o negativos sobre el método. Por lo general se enfoca en la
exactitud y precisión del método a partir de dichos cambios en
comparación con el método analítico normal.
En este caso, es de gran importancia determinar la robustez, debido a
que es la capacidad que tiene una metodología o equipo para obtener
resultados precisos y exactos, luego de realizar modificaciones
deliberadas a los parámetros y ajustes experimentales; los parámetros
que varíen y afecten la precisión o la exactitud en alto grado, se
consideran críticos y se deben mantener bajo control (ICH, 2005).
6. RECURSOS MATERIALES Y EQUIPOS
MATERIALES
Balones aforados de 20 mL
Balones aforados de 25 mL
Balones aforados de 50 mL
Balones aforados de 100 mL
Pipetas aforadas de 1 mL
Pipetas aforadas de 5 mL
Columna capilar de sílice fundida 0,32mm x 30 m; capa de 0,25 µm de
fase G46
Membranas de 0,45 µm x 13 mm de nailon
Micropipeta de 100 a 1000 µL
1 mortero con pistilo
60 viales para cromatografía de gases
EQUIPOS
Cromatógrafo de gases equipado con detector (FID).
Balanza analítica
Vortex
ultrasonido
Cabina de extracción
REACTIVOS Y ESTÁNDARES
Acetona
Ácido clorhídrico 37%
Peróxido de hidrogeno
Hidróxido de sodio
Estándar de referencia (ER) dietilenglicol
Estándar de referencia (ER) etilenglicol
Agua tipo I
7. METODOLOGÍA
La metodología descrita a continuación para evaluar el límite de dietilenglicol
y etilenglicol en la materia prima de sorbitol al 70%, se realiza teniendo en
cuenta la monografía referenciada en la USP 43-NF 38 para la evaluación del
límite de dietilenglicol y etilenglicol en sorbitol solución.
Para garantizar la confiabilidad de los resultados y que la propuesta de
validación sea adecuada, se establecen los siguientes requisitos:
Calificación del personal en el uso de los equipos y de los métodos a
validar.
Calibración de los instrumentos de medición y las medidas de
capacidad de vidrio utilizado.
Utilización de reactivos apropiados y soluciones de trabajo valoradas.
Observación de las medidas de seguridad.
7.1 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES Y MUESTRAS
7.1.1 PREPARACIÓN SOLUCIÓN MADRE DEL ESTÁNDAR
Pesar exactamente 16 mg del estándar de dietilenglicol y 16 mg del estándar
de etilenglicol, transferir cuantitativamente en un balón aforado de 20 mL,
adicionar 10 mL de diluente y agitar en vortex hasta disolver de manera
completa; posteriormente llevar a volumen con diluente y homogenizar
(concentración: 0,8 mg/mL dietilenglicol y 0,8 mg/mL de etilenglicol).
7.1.2 PREPARACIÓN SOLUCIÓN DEL ESTÁNDAR
Tomar una alícuota de 5 mL de la solución madre del estándar y transferir a
un balón volumétrico de 50 mL, completar a volumen con diluente,
homogenizar y pasar a través de un filtro de membrana de nailon de 0,45 µm
x 13 mm (concentración: 0,08 mg/mL de dietilenglicol y 0,08 mg/mL de
etilenglicol).
7.1.3 SOLUCIÓN DE LA MUESTRA
Pesar con exactitud 2,0 g de solución de sorbitol a un balón aforado de 25 mL,
adicionar 1,0 mL de diluente al balón y agitar en vortex durante 3 min, adicionar
el volumen restante de diluente para aforar en tres porciones iguales, y agitar
en vortex por 3 min luego de cada adición de la porción de diluente, filtrar el
sobrenadante obtenido a través de un filtro de nailon de 0,45 µm x 13 mm,
desechar los primeros 2 mL del filtrado y recoger el restante para el análisis.
7.1.4. SOLUCIÓN DEL ESTANDAR PARA ENRIQUECER
Tomar una alícuota de 1 mL de la solución madre del estándar y transferir a
un balón de 100 mL, completar a volumen con diluente y homogenizar.
7.1.5. SOLUCIÓN DE LA MUESTRA ENRIQUECIDA
Pesar con exactitud 2,0 g de solución de sorbitol a un balón aforado de 25 mL,
transferir una alícuota de 250 µL de la solución de estándar para enriquecer y
adicionar 1,0 mL de diluente al balón, agitar en vortex durante 3 min; adicionar
el volumen restante de diluente para aforar en tres porciones iguales, y agitar
en vortex por 3 min luego de cada adición de la porción de diluente, filtrar el
sobrenadante obtenido a través de un filtro de nailon de 0,45 µm x 13 mm,
desechar los primeros 2 mL del filtrado y recoger el restante para el análisis.
7.2. APTITUD DEL SISTEMA
Inyectar consecutivamente cinco (5) veces, 1,0µL de la solución de estándar y
evaluar los parámetros de idoneidad del sistema cromatográfico a evaluar.
7.3. EXACTITUD
7.3.1 PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA DETERMINAR EXACTITUD
Inyectar 5 veces la solución estándar a la concentración de trabajo (0,08
mg/mL etilenglicol y 0,08 mg/mL dietilenglicol), posteriormente preparar una
solución de la muestra a tres niveles de concentración diferentes (0,05%,
0,10% y 0,15%), a partir de la solución de la muestra enriquecida (numeral
7.1.5) variando la alícuota de solución de estándar para enriquecer, como se
describe en la tabla 1.
Tabla 1. Preparación de soluciones para evaluar el porcentaje de recuperación
Porcentaje, %
Concentración dietilenglicol,
mg/mL
Concentración etilenglicol,
mg/mL
Alícuota solución de
estándar enriquecido
(µL)
Volumen final (mL)
0,05 0,004 0,004 125 25
0,10 0,008 0,008 250 25
0,15 0,012 0,012 500 25 Recuperado de: Elaboración propia
7.4. SELECTIVIDAD Y ESPECIFICIDAD
A partir de la solución madre del estándar para la especificidad, solución de la
muestra para especificidad y solución de la muestra enriquecida para
especificidad (numeral 7.4.1., 7.4.2. y 7.4.3. respectivamente), preparar las
soluciones como se indica en la tabla 2, para cada una de las pruebas de
degradación, cada muestra se debe inyectar por duplicado; posteriormente
inyectar diluente.
Tabla 2. Preparación de muestras para la evaluación de la especificidad
Prueba de
degradación
Agente Metodología
Termólisis 60 C
→ Tomar una alícuota de 10 mL de cada una de
las matrices a analizar y transferir a un matraz
volumétrico de 20mL, preparar cada matriz por
separado.
→ Colocar a reflujo a 60°C en un baño maría
durante 1 hora.
→ Completar a volumen con diluente.
→ Filtrar la solución a través de una membrana con
tamaño de poro de 0,45µm tipo nailon de 13 mm
de diámetro.
Fotolisis Luz UV (254
nm)
→ Tomar una alícuota de 10 mL de cada una de
las matrices a analizar y transferir a un matraz
volumétrico de 20mL, preparar cada matriz por
separado.
Prueba de
degradación
Agente Metodología
→ Completar a volumen con diluente.
→ Colocar bajo el efecto de la luz UV-254nm
durante 12 horas.
→ Filtrar la solución a través de una membrana con
tamaño de poro de 0,45µm tipo nailon de 13 mm
de diámetro.
Hidrolisis ácida HCl 1N
→ Tomar una alícuota de 10 mL de cada una de
las matrices a analizar y transferir a un matraz
volumétrico de 20mL, preparar cada matriz por
separado.
→ Adicionar 2 mL de HCl 1N
→ Colocar a reflujo a 60°C en un Baño maría
durante 30 minutos
→ Neutralizar con NaOH 1N y completar a volumen
con diluente.
→ Filtrar la solución a través de una membrana con
tamaño de poro de 0,45µm tipo nailon de 13 mm
de diámetro.
Hidrolisis básica NaOH 1N
→ Tomar una alícuota de 10 mL de cada una de
las matrices a analizar y transferir a un matraz
volumétrico de 20mL, preparar cada matriz por
separado.
→ Adicionar 2 mL de NaOH 1N.
→ Colocar a reflujo a 60°C en un Baño maría
durante 30 minutos
→ Neutralizar con HCl 1N y completar a volumen
con diluente.
→ Filtrar la solución a través de una membrana con
tamaño de poro de 0,45µm tipo nailon de 13 mm
de diámetro.
Oxidación H2O2 4%
→ Tomar una alícuota de 10 mL de cada una de
las matrices a analizar y transferir a un matraz
volumétrico de 20mL, preparar cada matriz por
separado.
→ Adicionar 2mL de H2O2 4%.
→ Colocar a reflujo a 60°C en un Baño maría
durante 30 minutos
→ Una vez terminado el tratamiento dejar enfriar y
completar a volumen con diluente.
→ Filtrar la solución a través de una membrana con
tamaño de poro de 0,45µm tipo nailon de 13 mm
de diámetro.
Recuperado de: Elaboración propia
7.4.1. SOLUCIÓN MADRE DEL ESTANDAR PARA ESPECIFICIDAD
Pesar exactamente 16 mg del estándar de dietilenglicol y 16 mg del estándar
de etilenglicol, transferir cuantitativamente en un balón aforado de 100 mL,
adicionar 10 mL de diluente y agitar en vortex hasta disolver de manera
completa; posteriormente llevar a volumen con diluente y homogenizar.
7.4.2. SOLUCIÓN DE LA MUESTRA PARA ESPECIFICIDAD
Pesar con exactitud 4,0 g de la solución de sorbitol a un balón aforado de 25
mL, adicionar 1,0 mL de diluente al balón, agitar en vortex durante 3 min;
adicionar el volumen restante de diluente para aforar en tres porciones iguales,
y agitar en vortex por 3 min luego de cada adición de la porción de diluente,
retirar con cuidado el sobrenadante para analizar.
7.4.3. SOLUCIÓN DE LA MUESTRA ENRRIQUECIDA PARA
ESPECIFICIDAD
Pesar con exactitud 4,0 g de la solución de sorbitol a un balón aforado de 25
mL transferir una alícuota de 250 µL de la solución de estándar para enriquecer
y adicionar 1,0 mL de diluente al balón, agitar en vortex durante 3 min;
adicionar el volumen restante de diluente para aforar en tres porciones iguales,
y agitar en vortex por 3 min luego de cada adición de la porción de diluente,
retirar con cuidado el sobrenadante para analizar.
- SOLUCIÓN 1
- SOLUCIÓN 2
- SOLUCIÓN 3
- SOLUCIÓN 4
- SOLUCIÓN 5
A partir de la solución del estándar para enriquecer, preparar las soluciones
indicadas en la tabla 3, para cada concentración, posteriormente aforar con
diluente, homogenizar y filtrar cada una de las muestras a través de una
membrana de 0,45 µm tipo nailon de 13 mm de diámetro antes de inyectar al
cromatógrafo.
Tabla 3. Tratamiento soluciones para evaluar el parámetro de linealidad del sistema
Porcentaje,
% Solución
Concentración
dietilenglicol
(mg/mL)
Concentración
etilenglicol
(mg/mL)
Alícuota
solución
madre de la
muestra (mL)
Volumen
final
(mL)
50 1 0,004 0,004 0.,250 50
75 2 0,006 0,006 0.375 50
100 3 0,008 0,008 0,500 50
125 4 0,010 0,010 0,625 50
150 5 0,012 0,012 0,750 50
Recuperado de: Elaboración propia
7.5. LINEALIDAD DEL MÉTODO
Inyectar en su orden y por triplicado, 1,0 µL de cada una de las siguientes
soluciones, realizando los pasos de preparación indicados a continuación:
- SOLUCIÓN 6
- SOLUCIÓN 7
- SOLUCIÓN 8
- SOLUCIÓN 9
- SOLUCIÓN 10
A partir de la preparación de solución de la muestra enriquecida, variar el
volumen en cada una de las soluciones para variar la concentración de
etilenglicol y dietilenglicol como se indica en la tabla 4, posteriormente aforar
con diluente, homogenizar y filtrar cada una de las muestras a través de una
membrana de 0,45µm tipo nailon de 13 mm de diámetro antes de inyectar al
cromatógrafo.
Tabla 4. Tratamiento soluciones para la evaluación del parámetro de linealidad del
método
Porcentaje Solución
Concentración
dietilenglicol
(mg/mL)
Concentración
etilenglicol
(mg/mL)
Alícuota
solución
madre de la
muestra (mL)
Volumen
final
(mL)
50 6 0,004 0,004 2 20
75 7 0,006 0,006 3 20
100 8 0,008 0,008 4 20
125 9 0,010 0,010 5 20
150 10 0,012 0,012 6 20
Recuperado de: Elaboración propia
7.6. ROBUSTEZ
A partir de la muestra enriquecida, realizar los ensayos para la robustez,
cambiando las condiciones que se enlistan en la tabla 5. Inyectar por triplicado
la muestra para cada uno de los ensayos a realizar, valorar frente a un
estándar inyectado cinco veces.
Tabla 5. Ensayos de robustez para la metodología de análisis de límite de etilenglicol y
dietilenglicol
VARIABLES Optimo Criterio
menor (x) Criterio
Mayor (X)
A Rampa de temperatura en el horno de
la columna 50 °C/min 40°C/min 60°C/min
B Flujo 3 mL/min 2 mL/min 4 mL/min
Ensayos
Número A (°C/min) B (mL/min)
1 40 3
2 50 2
3 50 3
4 60 3
5 50 4
6 50 3
Recuperado de: Elaboración propia
En la tabla 6, se encuentra consignados los criterios de aceptación para la
validación de un método. Estos datos son importantes para realizar una
caracterización entre valores obtenidos y rangos de aceptación.
Tabla 6. Criterios de aceptación para validación del método.
Característica analítica Criterio de aceptación
Aptitud del sistema
cromatográfico
Resolución ≥ 30 entre los picos de dietilenglicol y etilenglicol
RSD ≤ 2,0 % para los picos de dietilenglicol y etilenglicol en la solución estándar
Especificidad y Selectividad
Al inyectar las siguientes soluciones no deben aparecer picos de interferentes que
afecten o modifiquen el tiempo de retención correspondiente a dietilenglicol y
etilenglicol, en caso de presentarse un pico debido a un compuesto de
degradación, la resolución referente al pico de dietilenglicol o etilenglicol debe ser
mayor a 10
Tratamientos de degradación
Hidrólisis ácida con HCl 1N
Hidrólisis básica con NaOH 1N
Termólisis a 60 °C
Fotolisis
Oxidación con H2O2 4%
Exactitud RSD ≤ 6,0 %
Robustez → Las variaciones en las variables de la metodología de análisis no son
significativas en los resultados expresados en la robustez del método.
Recuperado de: Elaboración propia
8. RESULTADOS
8.1. APTITUD DEL SISTEMA
Es una serie de ensayos que se deben realizar para asegurar que la
metodología de análisis propuesta de cumplimiento con los criterios de
aceptación establecidos para la propuesta de validación de la metodología, se
usa para asegurar el desempeño óptimo de la metodología durante el
transcurso de la misma.
Como primer paso para obtener resultados óptimos, veraces y confiables se
estableció la selección de los parámetros apropiados de acuerdo con la
clasificación del método analítico y el tipo de validación a realizar (validación
de técnica interna), por ende, lo fue primordial establecer las condiciones
cromatografías apropiadas, las cuales se determinaron teniendo en cuenta los
siguientes parámetros:
La respuesta en la señal del equipo.
La separación de los picos de interés
La temperatura máxima que soporta la columna
El flujo del gas trasportador
El gas de arrastre utilizado
Las proporciones de los gases a utilizar
La rampa de temperatura a utilizar
El modo de inyección
Se determinó que las mejores condiciones instrumentales para llevar a cabo
la metodología propuesta fueron las consignadas en la tabla 7 (condiciones
experimentales para metodología analítica de determinación del límite de
dietilenglicol y etilenglicol) y tabla 8 (rampa de temperatura para el horno de la
columna).
Tabla 7. Condiciones experimentales para metodología analítica de determinación del límite de dietilenglicol y etilenglicol
Parámetro valor
Columna Columna capilar de sílice fundida 0,32mm x 30 m; capa de
0,25 µm de fase G46
Detector Ionización de llama (FID)
Temperatura del detector 300 °C
Temperatura puerto del inyector
300 °C
Temperatura horno de la columna
Ver tabla
Gas de arrastre H2: Nitrogeno:Make up gas
Flujo 3,0 mL/min
Volumen de inyección 1,0 µL
Modo de inyección Dividida (Split)
Relación Split 10:1
Diluente Acetona : agua (96:4)
Recuperado de: Elaboración propia
Tabla 8. Rampa de temperatura para el horno de la columna
Temperatura inicial (°C)
Rampa de temperatura
(°C/min)
Temperatura final (°C)
Tiempo de espera a la temperatura
final (min)
70 -- 70 2
70 50 260 5
Recuperado de: Elaboración propia
Bajo estos parámetros de condiciones y temperatura, se logró cumplir los
principales criterios de aceptación para la aptitud del sistema, hallados en la
tabla 9.
Tabla 9. Criterios de aceptación para la aptitud del sistema
Parámetro Valor
Resolución ≥ 30 entre los picos de dietilenglicol y etilenglicol
RSD, % ≤ 2,0 para los picos de dietilenglicol y etilenglicol
Recuperado de: Elaboración propia
Finalmente, en la tabla 10, se registran los resultados de idoneidad del sistema
en donde se determina el cumplimiento en la respuesta y la resolución, con
sus respectivos valores.
Tabla 10. Resultados idoneidad del sistema
Rep Respuesta tR, min
Resolución
ETILENGLICOL (EG)
EG DEG EG DEG
DIETILENGLICOL(DEG)
1 2535 1022 3,702 5,058 43,27
2 2553 1037 3,702 5,060 47,67
3 2577 1013 3,705 5,062 46,37
4 2546 1031 3,705 5,062 44,65
5 2533 1022 3,703 5,062 48,48
6 2510 1027 3,705 5,063 47,00
Promedio 2542,333 1025,333 NA NA 46,24
Desv. Est. 22,42914 8,31063 NA NA NA
RSD, % 0,88222 0,81053 NA NA NA
Concepto CUMPLE N.A. CUMPLE
Recuperado de: Elaboración propia
Como se evidencia en la tabla 10, se obtuvo una desviación estándar relativa
de 0,88222% y 0,81053% para etilenglicol y dietilenglicol respectivamente y
una resolución promedio de 46,24 entre los picos de etilenglicol y dietilenglicol
dando cumplimiento a los criterios de aceptación con RSD menor al 2% y una
resolución mayor o igual a 30.
Una vez se establecieron las condiciones adecuadas para llevar a cabo la
metodología propuesta, se procedió a evaluar los parámetros de exactitud,
especificidad-selectividad y robustez del método.
8.2 EXACTITUD
El ensayo de exactitud da cuenta de la proximidad entre el resultado obtenido
por un método y el valor real. Este parámetro expresa la proximidad de la
media de una serie de resultados obtenidos con el método al valor real.
Generalmente, se expresa respecto del error, definido como la diferencia entre
el resultado de medida y el valor real. Para efectos de este trabajo, este
parámetro se evaluó por medio de ensayos de recuperación.
8.2.1. Extracción
Se pesaron 2,0 g de solución de sorbitol en un balón aforado de 25 mL, se
adiciona 1,0 mL de diluente al balón y se agita en Vortex durante 3 min, y se
deja en ultrasonido por otros 2 min, transfiriendo una alícuota de 1,250 mL de
la solución de estándar, luego se adiciono el volumen restante de diluente para
aforar en tres porciones iguales, y se agito nuevamente en Vortex por 3 min
luego de cada adición de la porción de diluente, se filtra el sobrenadante
obtenido a través de un filtro de 0,45 µm, se desechan los primeros 2 mL del
filtrado y se recoge el restante para el análisis.
A partir de esta solución, se preparó una solución de la muestra a tres niveles
de concentración diferentes (0,05%, 0,10% y 0,15%).
Con este parámetro se buscó expresar la cercanía entre los resultados
obtenidos y el valor de referencia, logrando así calcular el porcentaje de
recuperación de la muestra.
Los criterios de aceptación para el análisis de la exactitud se encuentran en la
tabla 11:
Tabla 11. Preparación de soluciones para evaluar el porcentaje de recuperación Recuperado de: Elaboración propia
Preparación del estándar
Masa, mg 16,00
Dilución 1, mL 20,00
Alícuota 1, mL 5,00
Dilución 2, mL 50,00
Alícuota 2, mL 1,00
Dilución 3, mL 1,00
Concentración mg/mL 0,08
Bajo estos parámetros se debe verificar que los porcentajes de recuperación
obtenidos deben encontrarse dentro del 100% +/- 4S donde S es la mayor
desviación estándar obtenida. A su vez, que al graficar la respuesta del ensayo
(cantidad total encontrada) contra la cantidad de analito adicionada, la
pendiente debe ser mayor o igual a 0,95 y el intercepto debe ser igual a la
concentración inicial.
De esta forma, se procedió a inyectar 5 veces la solución estándar a la
concentración de trabajo (0,08 mg/mL etilenglicol y 0,08 mg/mL dietilenglicol)
y por duplicado cada una de las soluciones de muestra a las concentraciones
establecidas (0,05%,0,10% y 0,15%) obteniendo los resultados de la tabla 12:
Tabla 12. Respuesta del estándar
Respuesta del estándar
Rep. Respuesta
ETILENGLICOL DIETILENGLICOL
1 2120 1050
2 2035 1037
3 2050 1042
4 2115 1045
5 2107 1038
Promedio 20,854 1042,4
Desviación est. 39,79070 5,31977
RSD, % 1,90806 0,51033
Recuperado de: Elaboración propia
Como se evidencia en la tabla 12, al inyectar la solución estándar 5 veces se
obtuvo una respuesta promedio y una desviación estándar relativa de cada
uno de los principios activos. Evidenciando que se cumple con los criterios de
aceptación para la aptitud del sistema y que además es un análisis
reproducible entre inyecciones de la misma muestra al obtener desviaciones
estándar relativas menores al 2%.
A continuación, se presentan los cálculos de porcentajes de recuperación de
etilenglicol y dietilenglicol en las tablas 13 y 14 respectivamente.
Tabla 13. Cálculo de porcentajes de recuperación de etilenglicol
Recuperado de: Elaboración propia
Tabla 14. Cálculo de porcentajes de recuperación de dietilenglicol
Recuperado de: Elaboración propia
Al analizar cada preparación de las muestras a las concentraciones
establecidas (0,05%,0,10% y 0,15%) y al inyectar cada una por duplicado se
logra evidenciar que tanto el pico de etilenglicol como el de dietilenglicol
presentan respuestas promedio que comparadas contra las inyecciones
analizadas de la solución estándar son acordes al resultado esperado.
CUMPLE
Contenido de principio activo en las muestras, % 90 ≤ X ≤ 110 Concepto para las muestras CUMPLE
Criterio de aceptación RSD ≤ 2 Concepto RSD de muestras CUMPLE Concepto para RSD global
0,01200 312,26 0,01198 99,820,30150%
1 0,01200 312,81 0,012000,0120 0,12
100,00
2
2 0,00800 209,2 0,00803 100,32
0,00804 100,46100%
1 0,00800 209,5
0,00400 104,9 0,00402 100,60Desviación
estándar0,30
0,0080 0,10
RSD%
100,27
50%1 0,00400 104,7 0,00402
0,0040 0,13100,41
2
Cálculo de porcentajes de recuperación
Nivel de
concentraciónRep
Contenido
agregado
mg/mL
RespuestaContenido
obtenido mg/mLPromedio RSD,% Recuperación % Promedio
recuperación
Cálculo de porcentajes de recuperación
Nivel de
concentraciónRep
Contenido
agregado
mg/mL
RespuestaContenido
obtenido mg/mLPromedio RSD,% Recuperación % Promedio
recuperación
50%1 0,00400 52,12 0,00400
2
0,170,0080 0,05
RSD%
99,92
0,0040 0,14100,00
0,00400 52,22 0,00401 100,19Desviación
estándar0,00798 99,75
100%1 0,00800 103,98
2 0,00800 104,05 0,00799 99,82
150%1 0,01200 156,36 0,01200
2 0,01200 155,99 0,01197 99,760,170,0120 0,17
100,00
CUMPLE
Contenido de principio activo en las muestras, % 90 ≤ X ≤ 110 Concepto para las muestras CUMPLE
Criterio de aceptación RSD ≤ 2 Concepto RSD de muestras CUMPLE Concepto para RSD global
El contenido de activo obtenido en cada muestra fue calculado con la siguiente
formula:
𝐶𝐴 =𝑅𝑢
𝑅𝑠× [ ] 𝑆𝑇𝐷
Donde:
𝑪𝑨: contenido de activo.
Ru: respuesta del pico en la solución muestra.
Rs: respuesta promedio del pico en la solución estándar.
[ ] 𝑺𝑻𝑫: Concentración de la solución estándar.
El porcentaje de analito recuperado se calculó mediante la siguiente fórmula:
%𝑅 =𝐶𝑅
𝐶𝑇× 100%
Donde:
%𝑹: Porcentaje de recuperación.
𝑪𝑹: Contenido real de analito obtenido.
𝑪𝑻: Contenido agregado de analito.
Obteniendo un porcentaje promedio de recuperación de 100,27% y 99,92%
para etilenglicol y dietilenglicol respectivamente, también se obtiene un RSD
global de 0,30% para etilenglicol y 0,17% para dietilenglicol. Estos valores son
menores a 6% como lo establece el criterio de aceptación.
Los resultados obtenidos fueron analizados mediante una gráfica de
correlación entre la cantidad de analito de la muestra y la cantidad de analito
sobre agregado. Se observa una escasa dispersión de los datos obtenidos del
ensayo de recuperación (Figura 6).
Figura 6. Correlación de datos. Recuperado de: Elaboración propia
En la gráfica de la figura 6 se muestra la correlación de datos obtenidos entre
la respuesta de la cantidad total encontrada contra la cantidad de analito
adicionada, la pendiente que se obtuvo fue de 0,9975, y un R2 de 1. Este valor,
se encuentra dentro de los criterios de aceptación para este parámetro.
8.3 ESPECIFICIDAD
Se determinó el análisis de este parámetro con el fin de determinar los analitos
en presencia de productos de degradación, impurezas, componentes de la
matriz, u otros interferentes que puedan estar presentes en el análisis.
Mediante el análisis de selectividad se sometieron las muestras preparadas a
diversos tratamientos de degradación, realizando una hidrólisis acida, una
hidrólisis básica, una degradación por temperatura a 60ºc (termólisis), una
degradación bajo luz ultravioleta por 12 horas (fotolisis) y una degradación por
oxidación con peróxido de hidrogeno. Luego de inyectar cada una de estas
soluciones por duplicado y una muestra de diluente como blanco. Se demostró
que no hubo interferencias en la determinación de (EG) y (DEG) una vez que
las muestras fueron sometidas a condiciones de degradación.
Concepto CUMPLE
Valor de coeficiente de correlación obtenido, Rexp 0,999994963
Valor de coeficiente de determinación obtenido, R2exp
0,999989926
Cirterio de aceptación R2 ≥ 0,995
y = 0,9975x + 1E-05R² = 1
0,00000
0,00200
0,00400
0,00600
0,00800
0,01000
0,01200
0,01400
0,00000 0,00200 0,00400 0,00600 0,00800 0,01000 0,01200 0,01400
Correlacion de datos obtenidos
8.4 ROBUSTEZ
Siendo la robustez una medida de la capacidad que tiene un método analítico
de permanecer inalterado por pequeñas variaciones en el procedimiento del
método. El objetivo de la robustez fue describir bajo qué condiciones, que
fueron establecidas anteriormente, se pueden obtener resultados confiables,
de manera que la metodología propuesta funcione.
Un método es más robusto en cuanto menos depende de una metodología
estricta, para este caso, la robustez se evaluó teniendo en consideración
factores como la temperatura, el flujo de trabajo y las proporciones de los
gases de arrastre utilizados.
Al evaluar la metodología haciendo cambios en las proporciones de los gases
de arrastre se determinó que el método no es robusto cuando la proporción de
hidrogeno es baja, debido a que el detector (FID) al necesitar una chispa, esta
proporción no le es suficiente para encenderse y por lo tanto el equipo no da
la señal necesaria para llevar a cabo el ensayo. Cabe aclarar, que ninguno de
los otros cambios dio un resultado satisfactorio en términos de robustez.
Para el ajuste del flujo de gas de arrastre por minuto, el flujo de 2.0mL/min no
presenta una robustez para el método, puesto que realizando el ensayo con
este flujo no se cumplen con los requisitos de aptitud. Al realizar el ensayo con
un flujo de 4.0mL/min se ven resultados óptimos en términos de aptitud del
sistema obteniendo una resolución de 39 entre los picos de etilenglicol y
dietilenglicol.
Por otro lado, el cambio de la rampa de temperatura también dio buenos
resultados puesto que ninguno afecto el análisis, con los dos ajustes se obtuvo
los mismos resultados para la aptitud del sistema.
RECOMENDACIONES
Al ser este trabajo de grado una propuesta de una metodología para la
validación del análisis de límite de etilenglicol y dietilenglicol en sorbitol
solución 70%. No se evaluaron todos los parámetros estipulados para concluir
la metodología analítica propuesta como validada, debido a factores como
tiempo, disposición del equipo y personal calificado para manipular el equipo.
Sin embargo, se obtuvieron buenos resultados con los ensayos realizados
tales como una nueva metodología alterna a la que propone la farmacopea
americana la cual rige vigencia en nuestro país. Logrando utilizar como gas de
arrastre (aire, nitrógeno e hidrogeno) en lugar de helio reduciendo así costos
y tiempo de análisis, aumentando la eficiencia y optimizando el proceso en el
laboratorio.
Para el límite de detección, si bien tuvo una respuesta positiva por parte del
equipo, se recomienda trabajar la metodología con las concentraciones de las
muestras y estándares preparados a concentraciones más altas para obtener
una mejor reproducibilidad entre inyecciones.
Se deja propuesto el plan de trabajo para que ANGLOPHARMA S.A. como
empresa tenga la iniciativa de concluir la validación de la metodología
propuesta.
9. CONCLUSIONES
9.1. La metodología propuesta para determinar los límites de etilenglicol y
dietilenglicol utilizando la cromatografía de gases con detector de ionización a
la llama es selectiva y específica, presenta buena linealidad en el rango de
concentraciones estudiadas para la exactitud y los porcentajes de
recuperación del ensayo están dentro de los criterios de aceptación.
9.2 Se determinó el límite de detección como la mínima cantidad de analito
que se puede determinar cualitativamente de manera confiable, sin que se
pueda confundir con el ruido instrumental, obteniendo como resultado una
buena deviación estándar relativa en el análisis de la aptitud del sistema.
9.3 Se concluye que la metodología propuesta no es robusta para el parámetro
de las proporciones de gas de arrastre, pero si lo es cuando se hace la
variación en la rampa de temperatura y flujo de trabajo.
9.4 Se desarrolló un método de fácil manejo y aplicación, rápido, de bajo costo,
realizable en laboratorios de baja y mediana complejidad con confiabilidad
aceptable.
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