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INTRODUCCION

Electroforesis De Ácidos Nucleicos En Geles De Agarosa

“Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida”, la electroforesis es el movimiento de partículas cargadas en un campo eléctrico. A diferencia de las proteínas, las cuales pueden tener una carga positiva o negativa, los ácidos nucleicos están cargados de forma negativa debido a su esqueleto de grupos fosfato. Por lo tanto, en una electroforesis, los ácidos nucleicos migrarán hacia el polo positivo, es decir, el ánodo. Además de la poliacrilamida, la agarosa puede ser utilizada como soporte para la corrida electroforética. La agarosa es un polisacárido extraído de algas marinas que tiene la propiedad de mantenerse en estado sólido a temperatura ambiente pero que a altas temperaturas se torna líquida. Esta característica permite una fácil preparación de una matriz porosa para ser usada en electroforesis: simplemente se pesa la cantidad de agarosa requerida, se disuelve en un amortiguador adecuado, se calienta y se “chorrea” sobre un molde particular. Una ventaja que posee la agarosa sobre la acrilamida es que no es un compuesto tóxico y además permite el análisis de ácidos nucleicos con pesos moleculares muy variados. Sin embargo, su poder de resolución es menor que el de los geles de poliacrilamida. La concentración de agarosa típicamente utilizada para electroforesis está entre el 0.5 % y el 2%. La concentración a usar se escoge según el tamaño del ácido nucleico a analizar. Esto porque la concentración de agarosa define el tamaño de los poros de la matriz, a mayor concentración, menor el tamaño de los poros y viceversa. Durante la electroforesis, los ácidos nucleicos lineales con un alto peso molecular migrarán al ánodo más lentamente que ácidos nucleicos lineales con un menor peso molecular. La razón de esto es que los ácidos nucleicos de alto peso tardan más tiempo en atravesar los poros de agarosa. En el caso de ácidos nucleicos no linealizados, como plásmidos circulares en conformación nativa, la migración no solo dependerá del peso molecular sino también de otros aspectos como el grado de superenrrollamiento que ésteposeea. Generalmente en una preparación de plásmido se pueden observar distintas conformaciones de la misma molécula, la forma superenrrollada, la forma semirelajada y una relajada. Dependiendo de las condiciones externas como pH y salinidad se pueden observar todas las formas o solo una (s).

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MARCO TEORICO

Electroforesis De Ácidos Nucleicos En Geles Agarosa

La electroforesis en gel es un método que se emplea para separar macromoléculas en función del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades físicas. El término electroforesis describe la migración de las partículas cargadas bajo la influencia de un campo eléctrico. «Electro» se refiere a la electricidad y «foresis», del griego phoros, significa «trasladar». Así pues, la electroforesis en gel es una técnica consistente en aplicar corriente eléctrica a las moléculas para que atraviesen una placa de gel. La fuerza motriz de la electroforesis es la tensión eléctrica aplicada a los electrodos en ambos extremos del gel. Las propiedades de una molécula determinan la velocidad con que un campo eléctrico puede desplazarla a través de un medio gelatinoso. Muchas macromoléculas biológicas importantes (por ejemplo, los aminoácidos, los péptidos, las proteínas, los nucleótidos y los ácidos nucleicos) poseen grupos ionizables y, a un pH determinado, existen en solución como especies cargadas eléctricamente, sean cationes (+) o aniones (-). Según la naturaleza de la carga neta, las partículas cargadas migrarán hacia el cátodo o hacia el ánodo. Así, por ejemplo, cuando se aplica un campo eléctrico a un gel con pH neutro, los grupos fosfato del ADN cargados negativamente lo harán migrar hacia el ánodo (Westermeier, 1997). La electroforesis en gel de agarosa es un método normalizado que se utiliza para separar, identificar y purificar fragmentos de ADN. Se trata de una técnica sencilla y rápida que permite diferenciar fragmentos de ADN que no pueden separarse adecuadamente con otros procedimientos. Por otra parte, el ADN puede localizarse en el gel tiñendo con una concentración baja de bromuro de etidio, que es un agente intercalante fluorescente que se utiliza como colorante. En las siguientes secciones se presentan los principios físicos, los componentes (matriz de gel, tampón, tampón de carga y marcador) y los procedimientos para preparar la electroforesis en gel de agarosa (Sambrook et al., 1989). a electroforesis en gel es una técnica que se emplea para separar los ácidos nucleicos y las proteínas. La separación de las macromoléculas depende de dos variables: carga y masa. Cuando una muestra biológica, como por ejemplo el ADN, se mezcla en una solución tampón y se aplica a un gel, esas dos variables actúan conjuntamente. La corriente eléctrica de un electrodo repélele las moléculas, al tiempo que el otro electrodo las atrae. La fuerza de fricción del material de gel actúa como «tamiz molecular», separando las moléculas en función de su tamaño. Durante la electroforesis, las macromoléculas son empujadas a través de los poros, de pendiendo su tasa de migración por el campo eléctrico de los siguientes factores: •fuerza del campo •tamaño y forma de las moléculas

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•hidrofobicidad relativa de las muestras •fuerza iónica y temperatura del tampón en que se desplazan las moléculas. Para tener una idea cabal del proceso de separación de las partículas cargadas en la electroforesis en gel, conviene tener presentes las simples ecuaciones referidas a esta técnica. Cuando se aplica tensión a los electrodos se genera un gradiente de potencial (E), que puede expresarse con la siguiente ecuación: E = V/d donde V, medida en voltios, es la tensión aplicada y de la distancia en cm entre los electrodos. Al aplicarse el gradiente de potencial (E) se genera una fuerza (F) en una molécula cargada, que puede expresarse con la siguiente ecuación: F = Eq donde q corresponde a la carga en culombios que lleva la molécula. Esta es la fuerza, medida en Newton, que empuja la molécula cargada hacia el electrodo. Existe asimismo una resistencia de fricción que ralentiza el desplazamiento de las moléculas cargadas. Esta fuerza de fricción es función de los siguientes factores: •tamaño hidrodinámico de la molécula •forma de la molécula •tamaño de poro del medio en que tiene lugar la electroforesis •viscosidad del tampón. La velocidad v de una molécula cargada en un campo eléctrico depende del gradiente de potencial, la carga y la fuerza de fricción de la molécula, y puede expresarse con la siguiente ecuación: v = Eq / f donde f es el coeficiente de fricción. La movilidad electroforética (M) de un ión puede entonces determinarse dividiendo la velocidad del ión por el gradiente de potencial: M = v / E Además, de la ecuación se infiere que la movilidad electroforética M expresarse de modo equivalente como la carga de la molécula (q) dividida por el coeficiente de fricción (f): M = q / f Cuando se aplica una diferencia de potencial, las moléculas que poseen distintas cargas globales comenzarán a separarse debido a sus diferentes movilidades electroforéticas. La movilidad electroforética es un parámetro significativo y característico de las moléculas o partículas cargadas y depende del valor de pK del grupo cargado y del tamaño de la molécula o partícula. Incluso las moléculas con cargas semejantes empezarán a separarse si sus tamaños moleculares son distintos por cuanto estarán sometidas a fuerzas de fricción diferentes. El ADN bicatenario lineal migra por las matrices de gel a velocidades inversamente proporcionales al log10del número de pares de bases. Las moléculas más grandes migran más despacio debido a la mayor resistencia de fricción y a la menor eficacia del desplazamiento a través de los poros del gel. La corriente que atraviesa la solución entre los electrodos es conducida principalmente por los iones del tampón, si bien una pequeña proporción lo es por los iones de la muestra. La relación entre intensidad I, tensión V y resistencia R se expresa según la ley de Ohm: R = V / I .Esta ecuación muestra que, para una resistencia R dada, es posible acelerar la separación electroforética aumentando la tensión V aplicada, lo cual dará lugar al correspondiente incremento de la intensidad de la corriente I. La distancia migrada será proporcional a la intensidad y al tiempo. Con todo, el aumento de tensión (V)y el incremento correspondiente de intensidad

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(I) ocasionaría uno de los principales problemas que plantea la mayor parte de las formas de electroforesis, a saber, la generación de calor. Este fenómeno queda ilustrado con la siguiente ecuación, en la que la potencia (W, medida en vatios) generada durante la electroforesis equivale al producto de la resistencia multiplicado por el cuadrado de la intensidad: W = I2R Dado que la mayor parte de la potencia producida en el proceso electroforético se disipa en forma de calor, pueden producirse los siguientes efectos perjudiciales: •aumento de la tasa de difusión de los iones de la muestra y del tampón, con el consiguiente ensanchamiento de las muestras separadas •formación de corrientes de convección, con la consiguiente mezcla de las muestras separadas.•inestabilidad térmica de las muestras, que son bastante sensibles al calor (por ejemplo, desnaturalización del ADN) •disminución de la viscosidad del tampón y, por ende, reducción de la resistencia del medio.

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PROCEDIMIENTOS

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1. Tape los extremos de la bandeja con cinta aislante, colóquela en una superficie plana y horizontal.

2. Prepare suficiente tampón TBE 0.5x (150 ml) para llenar el tanque electroforético. Asegúrese que sea el mismo utilizado para preparar el gel.

3. Lleve la agarosa a ebullición; dejar enfriar a 60 °C; agregar el bromuro de etidio (concentración final de 0.5 µg/ml), mezcle bien.

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4. Colocar el peine de 0.5 – 1.0 mm arriba del fondo de la bandeja y vierta la agarosa. Dejar solidificar a temperatura ambiente. El gel debe tener de 3 a 5 mm de grosor.

5. Una vez solidificado retire la cinta aislante, sumergir el gel en el tanque electroforético y retirar el peine.

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6. Agregue suficiente tampón TBE 0.5x para cubrir el gel aproximadamente 1mm.

7. Prepare la muestra de ADN a analizar agregándoles el buffer de cargada.

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8. Utilizando una micropipeta, aplique despacio en cada uno de los diferentes pocillos del gel sumergido 10 µl de las muestras preparadas. En los extremos colocar los marcadores de peso molecular y de concentración.

9. Tape el tanque electroforético y colocar los electrodos de manera que el ADN migre hacia el ánodo (terminal roja). Aplique un voltaje de 1 – 5 v/cm. Para los minigeles se aplican 100V por 30 minutos. El azul de bromofenol en la solución de cargada marca el frente de la electroforesis.

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10.Desconecte la fuente de tención. Saque el gel de la bandeja y obsérvelo con el transiluminador de UV. Use gafas protectoras. Fotografié el gel.

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DATOSInvestigue otros protocolos de electroforesis

Electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida. Análisis de proteínas de hojas de Arabidopsis thaliana.

PROTOCOLO A REALIZAR

Preparación del gel de poliacrilamida

En la presente práctica se van a preparar mini-geles de 0,75 mm de espesor. Las cantidades indicadas para la preparación de las soluciones en el anexo corresponden a la preparación de dos geles. Cada uno de ellos consta de un gel concentrador de aproximadamente 2 cm de longitud que contiene los pocillos para cargar las muestras, y un gel separador de aproximadamente 6 cm. En la figura 4, se ilustra el montaje del sistema de electroforesis, la preparación de los geles y el procedimiento a seguir.

1. Se prepara el sistema de electroforesis mini-gel. 2. Preparación del gel separador al 13%. 3. Se mezcla en un matraz (capacidad aproximada de 100 mL) los componentes con

cuidado, utilizando una pipeta Pasteur, se añade la mezcla en el interior del molde hasta una altura aproximada de 2 cm del borde superior de la placa mayor, de forma que quede suficiente espacio para el gel concentrador (se debe calcular 1 cm más de la longitud de los pocillos del peine) A continuación, usando una pipeta limpia, se cubre la superficie del gel con isobutanol, isopropanol o agua destilada. Esto previene el contacto del oxígeno con el gel que inhibe la reacción de polimerización. La polimerización del gel debe de ocurrir en unos 30 minutos.

4. Preparación del gel concentrador al 3%.Se elimina el alcohol que cubre el gel separador, y se lava la parte superior del gel 2-3 veces con agua destilada para eliminar cualquier residuo de acrilamida no polimerizada. Se seca el líquido restante en la parte de superior del gel con papel de filtro con cuidado de no dañar el gel.

Preparación de las muestras

En el tiempo de espera durante la polimerización se preparan las muestras que se van a cargar en el gel. Con ayuda de una micropipeta P-20 se toman 20 µl de extracto proteico de Arabidopsis preparado en tampón de carga (ver anexo) en un tubo eppendorf. No se olvide preparar un tubo eppendorf con las proteínas estándar de peso molecular conocido. Se fijan las tapas de los tubos y se calientan en un termobloque a 100ºC durante 5 minutos.

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Se centrifugan 15 segundos a máxima velocidad para concentrar el volumen en el fondo del tubo.

Electroforesis

1. Se insertan las placas con los geles polimerizados en la unidad de electroforesis Se prepara el tampón de electroforesis a partir de la solución concentrada (ver anexo) y se añade en los reservorios interior y exterior. Se retiran, si las hubiera, las burbujas de aire y restos de acrilamida del interior de los pocillos, introduciendo tampón de electroforesis en los mismos.3

2. Se aplican las muestras con ayuda de una micropipeta P-20 (hasta 20 µl) en los pocillos, en un orden predeterminado y previamente. No se olvide añadir, en un carril, la solución de proteínas estándar, de peso molecular conocido.

3. Se conectan los electrodos a la cubeta de electroforesis y a la fuente de alimentación y se aplica corriente eléctrica. La corriente eléctrica recomendada para geles de 0,75 mm de grosor es un voltaje constante de 100-200V.

4. La duración aproximada del proceso es de 40-45 minutos. Una vez acabada la electroforesis, cuando el frente de azul de bromofenol alcanza la parte inferior del gel, se desconecta la fuente de alimentación, retirándose los electrodos y sacando los geles de la cubeta de electroforesis. Estos se depositan en la mesa de trabajo.

5. Se sacan los geles de acrilamida del interior del molde, separando cuidadosamente con ayuda de una espátula ambos cristales Se elimina el gel concentrador y se hace una muesca al gel en una de las esquinas para orientar la posición de las muestras (por ejemplo en la esquina inferior contraria al patrón de proteínas).

6. Tinción del gel con azul de coomassieLas bandas de proteínas, una vez terminada la electroforesis, se visualizan tiñendo los geles con una solución de azul de coomasie. La tinción se realiza con agitación suave durante, al menos, 30 min.7.

7. Se trasfiere el gel de la placa de vidrio a un recipiente que contiene la solución de tinción de coomassie . Se deja el gel en agitación suave con suficiente volumen de esta solución a temperatura ambiente durante 1 hora.

8. Se elimina la solución de tinción con una pipeta y se conserva para futuras tinciones. 9. Se añade solución decolorante y se incuba en agitación para eliminar el exceso de

coloración hasta que sólo queden teñidas de azul las proteínas, cambiando la solución decolorante tantas veces como sea necesario. El gel puede estar en esta solución toda la noche pero se pueden empezar a observar las proteínas en 20 minutos.

10.Se elimina la solución de desteñido y se añade agua destilada (o acético al 10%). Los geles pueden conservarse de esta forma durante largos periodos de tiempo de forma casi indefinida a 4ºC.

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¿Qué otras aplicaciones puede tener la electroforesis?

Las enormes aplicaciones de electroforesis son más evidentes en la industria de la salud o médica, incluyendo los antibióticos y el análisis de la vacuna. El análisis de las proteínas y ADN son también importantes aplicaciones de la electroforesis. Aparte de permitir a los investigadores localizar y ver las diferencias en el código genético de las especies en la tierra, el análisis de ADN electroforético también proporciona una herramienta fiable en investigaciones forenses.

Explique la función del gel de agarosa en la electroforesis

La electroforesis en gel es una técnica que se emplea para separar los ácidos nucleicos y las proteínas. La separación de las macromoléculas depende de dos variables: carga y masa. Cuando una muestra biológica, como por ejemplo el ADN, se mezcla en una solución tampón y se aplica a un gel, esas dos variables actúan conjuntamente.La agarosa, coloide natural que se extrae de las algas, es un polisacárido lineal (con un peso molecular medio de ~12 000 Da) formado por la repetición de la unidad básica, la agarobiosa, que comprende unidades alternadas de galactosa y 3,6-anhidrogalactosa. La agarosa es muy frágil y las manipulaciones pueden destruirla con facilidad. Los geles de agarosa poseen grandes «poros» y se emplean fundamentalmente para separar las moléculas grandes con un peso molecular de más de 200 kD. Los geles de agarosa permiten una electroforesis rápida, pero con una resolución limitada por cuanto las bandas que se forman en los geles tienen tendencia a ser difusas y a esparcirse. Ello obedece al tamaño de los poros y no puede controlarse. Los geles de agarosa se obtienen por suspensión de agarosa seca en polvo en un tampón acuoso, tras lo cual se hace hervir la mezcla hasta que la agarosa se funde y se convierte en una solución transparente. A continuación, se vierte esta solución en un molde para gel y se deja enfriar a temperatura ambiente hasta que se forma un gel rígido. Al endurecerse, la agarosa forma una matriz cuya densidad viene determinada por su concentración.

¿Para qué se utiliza la solución tampón TBE?

El TBE se utilizaba inicialmente a una concentración de trabajo de 1x en el caso de la electroforesis en gel de agarosa. No obstante, una solución de trabajo de 0,5x proporciona un poder más que suficiente y en la actualidad prácticamente toda las electroforesis en gel de agarosa se practican utilizando esta concentración.

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BIBLIOGRAFIA http://gmocrl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi

%C3%B3n5.pdf

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales. Electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida. Análisis de proteínas de hojas de Arabidopsis thaliana.http://www.uco.es/dptos/bioquimicabiolmol/pdfs/16%20ELECTROFORESIS%20GELES%20PAA.pdf.

http://www.ehowenespanol.com/lista-aplicaciones-electroforesis-sobre_117270/