ELECTROFORESIS - Inicio · * Electroforesis de proteínas: • Papel, almidón, agar, acetato de...
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Q U Í M I C A B I O L Ó G I C A .
D E P A R T A M E N T O D E B Q C A .
F C N Y C S .
U N P S J B
2 0 1 7
ELECTROFORESIS
¿ Que es la electroforesis?
¿Qué permite analizar?
¿ Que factores influyen ?
Separar y analizar moléculas: proteínas ADN/ARN
... en función de su diferente movilidad al aplicar un campo eléctrico (dependerá de su carga eléctrica)
* Moléc. (+) polo (-) o cátodo * Moléc. (-) polo (+) o ánodo
ELECTROFORESIS LIBRE moléculas en disolución o suspensión: poco resolutiva
ELECTROFORESIS DE ZONA SOPORTE que retiene las moléculas: elevado poder de resolución
cátodo ánodo
ánodo
cátodo
SOPORTE
pH bajo:
carga neta positiva
pI: carga neta nula
pH alto: carga neta
negativa
EQUIPO ELECTROFORÉTICO
- +
muestra
muestra
+
-
fuente de alimentación
fuente de alimentación
cable
cable
cubeta
cubeta
tampón
tampón
gel
gel
electrodo electrodo
cátodo ánodo
electrodo cátodo
ánodo
* Fuente de alimentación
* Cubeta
* Tampón de electroforesis
* Soporte electroforético (gel)
* Dos electrodos ánodo (+) cátodo (-)
Componentes:
(E. horizontal)
(E. vertical)
FACTORES QUE AFECTAN A LA ELECTROFORESIS
1_ Campo eléctrico
*Diferencia de potencial (V-voltios): bajo voltaje (10-500 V)
alto voltaje (500-10000 V) *Intensidad (A-amperios): flujo de carga eléctrica depende de V y de R (Ley de Ohm V=RxI)
*Resistencia (R): determinada por el soporte y tampón electroforesis *Temperatura: efecto Joule : El aumento de temperatura generado puede dañar el soporte, el equipo electroforético y desnaturalización de las proteinas refrigerantes
2_ Muestra
*Carga o densidad de carga: carga eléctrica/masa de la molécula
*Tamaño *Forma: formas globulares avanzan más
3_ Tampón de electroforesis
*pH: determina el grado de solvatación y la carga de las moléculas
generalmente es ligeramente básico moléculas (-) *Fuerza iónica: generalmente 0.05 o 0.1 M para que no interfiera 4_ Soporte
SOPORTE ELECTROFORÉTICO
No restrictivo (Tipo I): Tamaño poro >>> moléculas, no opone impedimento a su paso separación sólo por CARGA
* Electroforesis de proteínas: • Papel, almidón, agar, acetato de
celulosa
Gel poroso
Características Gel poroso (entramado tridimensional interno) Tiene que permitir el paso de moléculas Material inerte: NO puede estar cargado y no debe adsorber las moléculas de la muestra
Tipos de Soporte
Restrictivo (Tipo II): Tamaño poro ≈ moléculas, opone resistencia a su paso separación por tamaño (tamizado molecular)
* Electroforesis de proteínas: • Separación por CARGA y TAMAÑO
• Acrilamida
* Electroforesis de DNA/RNA: • Separación sólo por TAMAÑO
• Agarosa, acrilamida
EN ACETATO DE CELULOSA: PROTEINOGRAMA
+ -
Campo eléctrico (DV)
Soporte: (no restrictivo) Tiras de acetato de celulosa
Electroforesis horizontal
1. Aplicación de la muestra 2. Electroforesis 3. Detección por tinción: Azul de Coomassie Negro amido 4. Densitometría / Espectrofotometría
Aplicaciones diagnósticas en serología (separación proteínas séricas).
muestra
Avance de las proteínas
EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE)
Electroforesis vertical
Soporte: (restrictivo) Gel de Poliacrilamida * Polimerización de dos componentes: Acrilamida + Bisacrilamida * Variación de la concentración variación del tamaño de poro [poliacrilamida] tamaño poro
1. Preparación del gel 2. Montaje de la cubeta 3. Aplicación de la muestra 4. Electroforesis 5. Detección por tinción: Azul de Coomassie Sales de plata
Aplicaciones: * Separar proteínas * Determinar peso molecular de una proteína * Separar proteínas oligoméricas * Separar proteínas en función de su pI * Separar proteínas de mezclas muy complejas * Ver si hay una proteína en concreto
EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE)
SDS-PAGE
Electroforesis 2D
Western Blot
Electroenfoque
Ventajas: * Gran poder de separación por CARGA y por TAMAÑO * Químicamente inertes * Transparentes (permite densitometría) * Estables (pH, fuerza iónica, temperatura) * Versatilidad en cuanto al tamaño de poro y entramado uniforme
SDS-PAGE Condiciones de la PAGE: * No desnaturalizantes: separamos por CARGA y TAMAÑO PAGE
S-S S-S
- - - - -
- - -
- - - -
-
- -
+ SDS + DTT
25 kDa
S-S
+ SDS - - -
-
- - - -
- -
- - -
- - - -
-
- - - -
- -
- - -
- -
-
- - 44 kDa
S-S S-S
50 kDa
* Desnaturalizantes: separamos sólo por TAMAÑO SDS-PAGE
Agentes desnaturalizantes: SDS (dodecilsulfato sódico), urea,
reductores (DTT, b-mercaptoetanol)...
• SDS: detergente aniónico (-), dota a todas las proteínas de carga (-) todas migrarán hacia el ánodo (+), separándose sólo por tamaño
SDS-PAGE: determinación del peso molecular
Marcadores de peso molecular: * Mezcla de diferentes proteínas pre-teñidas de las que conocemos el peso molecular. * Por comparación podemos averiguar el PM de nuestra proteína.
A trabajar se ha dicho……………… ajo Práctico
Electroforesis en tiras de acetato de celulosa
Separar mediante electroforesis las proteínas contenidas en el suero.
Electroforesis en gel de poliacrilamida
Calcular gráficamente la masa molecular aparente de proteínas por comparación con proteínas patrones en un grafico de distancia vs Log PM aparente.
Electroforesis en tiras de acetato de celulosa
Tipo de electroforesis …………..
Soporte: acetato de celulosa ( conservadas en metanol). Muestra: suero humano. pH de trabajo: 8, 5 Buffer: Veronal Sódico. Siembra: con aplicador , en ¿ cátodo o ánodo? Voltaje: 2mA por tira. Tiempo de corrida: 45 minutos. Revelado: Amidoschwart o Ponceau. Solución decolorante: metanol, agua y acido acético ( 47,5:47,5: 5). Disolución de cada banda: Acido Acético al 80 %. Cuantificación espectrofotométrica a 495 nm.
Electroforesis en gel de poliacrilamida